Грызуны с гуманизированным il-7
Изобретение относится к области биохимии, в частности к генетически модифицированному грызуну, который продуцирует человеческий или гуманизированный белок IL-7. Также раскрыта нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий или гуманизированный белок IL-7, ES-клетка, указанного грызуна, клетка, которая содержит гуманизированный ген IL-7, ткань, которая содержит гуманизированный ген IL-7. Также раскрыт способ получения указанного генетически модифицированного грызуна. Изобретение позволяет получать человеческий или гуманизированный белок IL-7. 6 н. и 15 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 3 пр.
Область техники
Настоящее изобретение относится к животным, не являющимся человеком (например, млекопитающие, например грызуны, такие как мыши, крысы и хомяки), которые содержат генетическую модификацию с заменой в эндогенном локусе последовательности гена интерлейкина-7 (IL-7) нечеловеческого происхождения последовательностью гена человеческого IL-7. Также изобретение относится к грызунам и другим не являющимся человеком животным, у которых происходит экспрессия человеческого IL-7 или гуманизированного IL-7 в локусе под контролем эндогенных регуляторных последовательностей нечеловеческого происхождения или в эндогенном локусе IL-7 нечеловеческого происхождения, который содержит эндогенные регуляторные последовательности нечеловеческого происхождения.
Уровень техники
В данной области техники известны трансгенные мыши, которые имеют случайным образом вставленные трансгены, которые содержат последовательность человеческого IL-7. Однако, большинство, если не все, из таких трансгенных мышей не оптимальны по тому или другому аспекту. Например, большинство мышей, трансгенных по человеческому IL-7, характеризуются аномальными уровнями и/или соотношениями некоторых клеток, включая Т-клетки, что, скорее всего, обусловлено нарушениями регуляции развития иммунных клеток, например развития Т-клеток.
В данной области техники сохраняется потребность в животных, не являющихся человеком, которые содержат последовательности, кодирующие человеческий IL-7, где данные последовательности, кодирующие человеческий IL-7, находятся в эндогенном локусе IL-7 нечеловеческого происхождения, а также в животных, не являющихся человеком, которые экспрессируют человеческий IL-7 под контролем эндогенных регуляторных элементов нечеловеческого происхождения. В данной области техники существует потребность в животных, не являющихся человеком, которые экспрессируют человеческий IL-7 настолько физиологически релевантным для животного, не являющегося человеком, образом, насколько это возможно. В данной области техники существует потребность в животных, не являющихся человеком, которые экспрессируют человеческий IL-7, у которых отсутствует существенное отклонение от нормы в периферических Т-клетках и/или в соотношениях подтипов Т-клеток.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к генетически модифицированным животным, не являющимся человеком, а также к генетически модифицированным клеткам, тканям и нуклеиновым кислотам нечеловеческого происхождения, которые содержат геномную последовательность человеческого IL-7 в эндогенном локусе IL-7 нечеловеческого происхождения. Животные, не являющиеся человеком, экспрессируют гуманизированный белок IL-7 в модифицированном локусе, регулируемом одной или более эндогенными регуляторными последовательностями нечеловеческого происхождения модифицированного эндогенного локуса IL-7. В различных вариантах осуществления не являющиеся человеком животные представляют собой грызунов, например, мышей, крыс, хомяков и т.п. В определенном варианте осуществления грызун представляет собой мышь или крысу.
В различных вариантах осуществления и объектах настоящего изобретения не являющиеся человеком животные содержат модифицированный ген IL-7 в зародышевой линии животного, не являющегося человеком, в модифицированном эндогенном локусе IL-7, причем данный модифицированный эндогенный локус IL-7 содержит гуманизацию по меньшей мере участка эндогенного гена IL-7. В различных вариантах осуществления мыши являются гетерозиготными или гомозиготными в отношении модифицированного локуса IL-7. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет животное, не являющееся человеком, у которого отсутствует первый эндогенный аллель IL-7 и которое содержит гуманизацию второго эндогенного аллеля IL-7. В различных вариантах осуществления и объектах настоящего изобретения гуманизация представляет собой гуманизацию одного или более экзонов и/или интронов. В различных вариантах осуществления и объектах настоящего изобретения предложены не являющиеся человеком животные, имеющие модифицированный локус IL-7, причем в модифицированном животном сохраняются одна или обе из эндогенной 5'-нетранслируемой области нечеловеческого происхождения и эндогенной 3'-нетранслируемой области нечеловеческого происхождения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения не являющиеся человеком животные по настоящему изобретению содержат 5-нетранслируемую область, содержащуюся в последовательности SEQ ID NO: 1 В некоторых вариантах осуществления изобретения не являющиеся человеком животные по настоящему изобретению содержат 3'-нетранслируемую область, содержащуюся в последовательности SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления не являющиеся человеком животные по настоящему изобретению содержат 5'-нетранслируемую область, содержащуюся в последовательности SEQ ID NO: 1, и 3'-нетранслируемую область, содержащуюся в последовательности SEQ ID NO: 2.
В некоторых вариантах осуществления изобретения не являющиеся человеком животные по настоящему изобретению содержат 5-нетранслируемую область, которая представляет собой SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления изобретения не являющиеся человеком животные по настоящему изобретению содержат 3'-нетранслируемую область, которая представляет собой SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения не являющиеся человеком животные по настоящему изобретению содержат 5-нетранслируемую область, которая представляет собой SEQ ID NO: 1, и 3'-нетранслируемую область, которая представляет собой SEQ ID NO: 2.
В некоторых вариантах осуществления изобретения гуманизированный ген IL-7 по настоящему изобретению имеет последовательность, которая по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентична непрерывной последовательности, содержащей экзоны 2-6 человеческого гена IL-7. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения человеческий ген IL-7 по настоящему изобретению содержит последовательность SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления изобретения гуманизированный ген IL-7 по настоящему изобретению имеет последовательность, которая отражает гуманизацию, как представлено на фигуре 1.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения генетически модифицированный грызун содержит замену в эндогенном локусе IL-7 грызуна эндогенной геномной последовательности IL-7 грызуна на геномную последовательность человеческого IL-7.
В одном варианте осуществления генетически модифицированный грызун содержит первую регуляторную последовательность грызуна, расположенную выше по цепи (по отношению к направлению транскрипции гена IL-7) относительно геномной последовательности человеческого IL-7, и вторую регуляторную последовательность грызуна, расположенную ниже по цепи относительно геномной последовательности человеческого IL-7. В одном варианте осуществления первая регуляторная последовательность грызуна содержит промотор и/или энхансер из грызуна и вторая регуляторная последовательность грызуна содержит 3'-нетранслируемую область (3'-untranslated region, 3'-UTR).
В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь и содержит эндогенный локус мышиного гена IL-7, имеющий мышиный экзон 1 и человеческие экзоны 2, 3, 4, 5 и 6. В одном варианте осуществления эндогенный локус мышиного гена IL-7 содержит, по направлению от верхней части до нижней части относительно направления транскрипции, мышиный экзон 1, по меньшей мере, участок первого мышиного интрона и граничащий с ним человеческий геномный фрагмент, содержащий человеческие экзоны от человеческого экзона 2 до человеческого экзона 6. В одном варианте осуществления мышь дополнительно содержит прилегающую последовательность эндогенной мышиной ДНК, содержащую полный эндогенный вышележащий (относительно направления транскрипции гена IL-7) мышиный промотор IL-7 и регуляторную область, причем непрерывная мышиная ДНК находится выше по цепи относительно человеческого геномного фрагмента; и дополнительно содержит прилегающую последовательность эндогенной мышиной 3'-UTR-ДНК, расположенную ниже по цепи относительно человеческого геномного фрагмента.
В одном варианте осуществления мышь содержит мышиную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и их комбинации. В определенном варианте осуществления мышь содержит мышиную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложена генетически модифицированная мышь, которая содержит замену, в мышином эндогенном локусе, IL-7 эндогенной геномной последовательности мышиного IL-7 на геномную последовательность человеческого IL-7 с целью образования модифицированного локуса, причем геномная последовательность человеческого IL-7 содержит по меньшей мере один человеческий экзон и модифицированный локус содержит мышиную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и их комбинации.
В одном варианте осуществления замена содержит человеческий геномный фрагмент, содержащий экзоны от 2-го до 6-го, и данный человеческий геномный фрагмент соединен с мышиным экзоном 1 с образованием модифицированного эндогенного локуса мышиного IL-7, причем модифицированный мышиный локус IL-7 содержит мышиную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и их комбинации.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен генетически модифицированный грызун, содержащий ген IL-7, который содержит экзон 1 грызуна и по меньшей мере участок интрона 1 грызуна и последовательность экзонов 2, 3, 4, 5 и 6 человеческого IL-7 из гена человеческого IL-7, причем данный грызун содержит последовательность, выбранную из вышележащей (относительно направления транскрипции) регуляторной последовательности гена IL-7 грызуна, 3'-UTR IL-7 грызуна и их комбинации.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложена генетически модифицированная мышь, которая содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и их комбинации; причем у данной мыши отсутствует эндогенная последовательность, кодирующая экзоны от 2-го до 5-го мышиного белка IL-7, и данная мышь содержит нуклеотидную последовательность в эндогенном мышином локусе IL-7, где данная нуклеотидная последовательность кодирует экзоны 2, 3, 4, 5 и 6 человеческого IL-7.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен генетически модифицированный грызун, который экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-7 из эндогенного локуса IL-7 грызуна, причем данный локус модифицируют с целью экспрессии по меньшей мере одного экзона человеческого IL-7. В одном варианте осуществления локус IL-7 грызуна модифицирован с целью экспрессии человеческого или гуманизированного белка IL-7, кодируемого последовательностью, содержащей по меньшей мере два экзона человеческого IL-7. В одном варианте осуществления локус IL-7 грызуна модифицирован с целью экспрессии человеческого или гуманизированного белка IL-7, кодируемого последовательностью, содержащей по меньшей мере три экзона человеческого IL-7. В одном варианте осуществления локус IL-7 грызуна модифицирован с целью экспрессии человеческого или гуманизированного белка IL-7, кодируемого последовательностью, содержащей по меньшей мере экзоны 2, 3, 4, 5 и 6 (то есть от 2-го до 6-го) человеческого IL-7. В одном варианте осуществления локус IL-7 грызуна модифицирован с целью экспрессии человеческого белка IL-7. Некоторые определенные объекты настоящего изобретения относятся к локусу IL-7 грызуна, модифицированному с целью экспрессии человеческого белка IL-7, последовательность которого отражает белок, кодируемый локусом, как показано на фигуре 1. Некоторые определенные объекты настоящего изобретения относятся к локусу IL-7 грызуна, модифицированному с целью экспрессии человеческого белка IL-7, содержащего последовательность, кодируемую экзонами 2-6 человеческого гена IL-7. Некоторые определенные объекты настоящего изобретения относятся к локусу IL-7 грызуна, модифицированному с целью экспрессии человеческого белка IL-7, содержащего последовательность, кодируемую экзонами 2-6 человеческого гена IL-7, как изложено в SEQ ID NO: 3.
8 одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен генетически модифицированный грызун, который экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-7 из эндогенного локуса IL-7 грызуна, который модифицирован, чтобы содержать, по меньшей мере, экзоны от 2-го до 6-го человеческого IL-7 вместо экзонов от 2-го по 5-го из IL-7 грызуна.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен генетически модифицированный грызун, который экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-7 из гуманизированного эндогенного локуса IL-7 грызуна, содержащего кодирующую область гуманизированного эндогенного IL-7 грызуна, причем гуманизированный эндогенный локус IL-7 грызуна содержит все эндогенные регуляторные элементы из грызуна, которые присутствуют впереди (относительно точки начала транскрипции у грызуна дикого типа) кодирующей области IL-7 грызуна дикого типа и позади (относительно точки начала транскрипции у грызуна дикого типа) кодирующей области IL-7 грызуна дикого типа.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен генетически модифицированный грызун, который экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-7 из гуманизированного локуса IL-7 грызуна, причем данный локус содержит регуляторные области грызуна, расположенные выше и ниже по цепи относительно нуклеотидной последовательности, кодирующей человеческий или гуманизированный белок IL-7, причем человеческий или гуманизированный белок IL-7 экспрессируется с паттерном экспрессии, который является приблизительно таким же, что и паттерн экспрессии белка IL-7 грызуна в грызуне дикого типа. В одном варианте осуществления уровень экспрессии человеческого или гуманизированного IL-7 в сыворотке является приблизительно таким же, что и уровень экспрессии белка IL-7 грызуна в сыворотке у грызуна дикого типа.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен генетически модифицированный грызун, который экспрессирует гуманизированный белок IL-7, причем популяция лимфоцитов данного грызуна характеризуется популяцией В-клеток, численность которой является приблизительно такой же, что и популяция В-клеток у соответствующей по возрасту мыши дикого типа. В одном варианте осуществления модифицированный грызун характеризуется популяцией зрелых В-клеток, численность которой является приблизительно такой же, что и численность популяции зрелых В-клеток у соответствующей по возрасту мыши дикого типа. В одном варианте осуществления гуманизированный белок IL-7 идентичен человеческому белку IL-7. В одном варианте осуществления гуманизированный белок IL-7 содержит человеческую последовательность, закодированную, по меньшей мере, экзонами от 2-го до 6-го из человеческого гена IL-7.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен генетически модифицированный грызун, который экспрессирует гуманизированный белок IL-7, причем популяция лимфоцитов данного грызуна характеризуется популяцией Т-клеток, численность которой является приблизительно такой же, что и численность популяции Т-клеток у соответствующей по возрасту мыши дикого типа. В одном из вариантов осуществления модифицированный грызун демонстрирует популяцию зрелых Т-клеток, численность которой является приблизительно такой же, что и численность популяции зрелых Т-клеток у соответствующей по возрасту мыши дикого типа. В одном из вариантов осуществления модифицированный грызун демонстрирует популяцию периферийных Т-клеток, численность которой является приблизительно такой же, что и численность популяции периферийных Т-клеток у соответствующей по возрасту мыши дикого типа. В одном варианте осуществления гуманизированный белок IL-7 идентичен человеческому белку IL-7. В одном варианте осуществления гуманизированный белок IL-7 содержит человеческую последовательность, закодированную, по меньшей мере, экзонами от 2-го до 6-го из человеческого гена IL-7.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен генетически модифицированный грызун, который экспрессирует гуманизированный белок IL-7, причем популяция лимфоцитов данного грызуна характеризуется популяцией Т-клеток, который проявляет соотношение CD4:CD8, которое приблизительно равно соотношению CD4:CD8 в популяции Т-клеток у соответствующей по возрасту мыши дикого типа. В одном варианте осуществления гуманизированный белок IL-7 идентичен человеческому белку IL-7. В одном варианте осуществления гуманизированный белок IL-7 содержит человеческую последовательность, закодированную, по меньшей мере, экзонами от 2-го до 6-го из человеческого гена IL-7.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен генетически модифицированный грызун, который экспрессирует гуманизированный белок IL-7, причем данный грызун обладает свойством, выбранным из: отсутствие склонности к развитию хронического колита; отсутствие сверхэкспрессии IL-7 в лимфоцитах слизистой оболочки толстого кишечника; нормальная экспрессия, или экспрессия дикого типа, IL-7 в лимфоцитах слизистой оболочки толстого кишечника; отсутствие тяжелого дерматита; отсутствие дерматита, характеризующегося массивной кожной инфильтрацией с накоплением мононуклеарных клеток; демонстрация соотношения CD4:CD8 в популяции Т-клеток, которое приблизительно равно соотношению CD4:CD8 в популяции Т-клеток у соответствующей по возрасту мыши дикого типа; демонстрация паттерна экспрессии человеческого IL-7, который является приблизительно таким же, что и паттерн экспрессии белка IL-7 грызуна у грызуна дикого типа; и комбинация этих характеристик.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен генетически модифицированный грызун, который экспрессирует гуманизированный белок IL-7, причем у данного грызуна отсутствует склонность к развитию хронического колита.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен генетически модифицированный грызун, который экспрессирует гуманизированный белок IL-7, причем данный грызун не демонстрирует сверхэкспрессию IL-7 в лимфоцитах слизистой оболочки толстого кишечника.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен генетически модифицированный грызун, который экспрессирует гуманизированный белок IL-7, причем у данного грызуна не проявляется дерматит, характеризующийся массивной кожной инфильтрацией с накоплением мононуклеарных клеток.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен генетически модифицированный грызун, который экспрессирует гуманизированный белок IL-7, причем у данного грызуна не проявляется лимфопролиферация в дерму.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен генетически модифицированный грызун, который экспрессирует гуманизированный белок IL-7, причем частота проявления В и/или Т-клеточных лимфом у данного грызуна не выше, чем у соответствующей по возрасту мыши дикого типа.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложена генетически модифицированная мышь, которая экспрессирует гуманизированный белок IL-7 или человеческий белок IL-7, причем данная мышь не более склонна, чем мышь дикого типа, к развитию патологии, выбранной из колита, хронического колита, острого дерматита, патологической и/или массивной инфильтрации дермы мононуклеарными клетками, лимфопролиферации дермы, В-клеточных лимфом, Т-клеточных лимфом, уменьшения числа зрелых В и/или Т-клеток, уменьшения числа периферических В и/или Т-клеток, аномальных количеств CD4+ Т-клеток, аномальных количеств CD8+ Т-клеток и их комбинации.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложена генетически модифицированная мышь, которая экспрессирует человеческий белок IL-7, последовательность которого отражает замену последовательности мышиного гена IL-7 последовательностью человеческого гена IL-7, причем последовательность человеческого гена IL-7 содержит экзоны 2-6 человеческого гена IL-7. Некоторые определенные объекты настоящего изобретения относятся к замене последовательности, содержащей экзоны 2-5 мышиного гена IL-7. Некоторые определенные объекты настоящего изобретения относятся к человеческому гену IL-7, который содержит SEQ ID NO: 3. Некоторые определенные объекты настоящего изобретения относятся к экспрессии человеческого белка IL-7, которая находится под контролем мышиных регуляторных элементов.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложена генетически модифицированная мышь, которая не экспрессирует мышиный белок IL-7 в детектируемых количествах. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложен геном мыши, как описано здесь, который содержит полную или частичную делецию мышиного гена IL-7. Некоторые определенные объекты настоящего изобретения относятся к геному мыши, как описано здесь, который содержит делецию эндогенной последовательности гена IL-7, соответствующей экзонам 2-5.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложено генетически модифицированное животное, не являющееся человеком, содержащее, в своей зародышевой линии, замену по меньшей мере одного экзона IL-7 нечеловеческого происхождения на по меньшей мере один человеческий экзон IL-7 с целью образования гена, кодирующего человеческий или гуманизированный IL-7, причем данная замена происходит в эндогенном локусе IL-7 нечеловеческого происхождения, где ген, кодирующий человеческий или гуманизированный IL-7, находится под контролем эндогенных регуляторных элементов нечеловеческого происхождения.
В одном варианте осуществления генетически модифицированное животное, не являющееся человеком, представляет собой грызуна. В одном варианте осуществления грызун выбран из крысы и мыши.
В одном варианте осуществления ген, кодирующий человеческий или гуманизированный IL-7, содержит человеческие экзоны, выбранные из группы, состоящей из человеческого экзона 1, человеческого экзона 2, человеческого экзона 3, человеческого экзона 4, человеческого экзона 5, человеческого экзона 6 и их комбинации. В одном варианте осуществления ген, кодирующий человеческий или гуманизированный IL-7, содержит не более чем пять человеческих экзонов.
В одном варианте осуществления генетически модифицированное животное, не являющееся человеком, представляет собой грызуна, который является мышью, и модифицированный локус содержит замену мышиных экзонов 2, 3, 4 и 5 человеческим геномным сегментом, содержащим экзоны 2, 3, 4, 5 и 6 человеческого IL-7.
В одном варианте осуществления ген, кодирующий человеческий или гуманизированный IL-7, содержит кДНК, кодирующую человеческий или гуманизированный белок IL-7.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения генетически модифицированное животное, не являющееся человеком, содержащее, в своей зародышевой линии, трансген, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую ген человеческого или гуманизированного IL-7, причем ген человеческого или гуманизированного IL-7 фланкирован с обеих сторон эндогенными регуляторными последовательностями нечеловеческого происхождения.
В одном варианте осуществления генетически модифицированное животное, не являющееся человеком, представляет собой грызуна. В одном варианте осуществления грызун выбран из группы, состоящей из мыши, крысы и хомяка.
В одном варианте осуществления генетически модифицированное животное, не являющееся человеком, содержит человеческий экзон, выбранный из группы, состоящей из человеческого экзона 1, человеческого экзона 2, человеческого экзона 3, человеческого экзона 4, человеческого экзона 5, человеческого экзона 6 и их комбинации. В одном варианте осуществления ген человеческого или гуманизированного IL-7 содержит по меньшей мере пять человеческих экзонов.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен гуманизированный локус IL-7, содержащий экзон 1 нечеловеческого происхождения, человеческий экзон 2, человеческий экзон 3, человеческий экзон 4, человеческий экзон 5 и человеческий экзон 6. В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения гуманизированный локус IL-7 дополнительно содержит 5'- и 3'-нетранслируемые области нечеловеческого происхождения, фланкирующие экзон 1 нечеловеческого происхождения и человеческий экзон 6. В некоторых определенных вариантах осуществления гуманизированный локус человеческого IL-7 содержит человеческую 3'-нетранслируемую область или участок ее, которая граничит с 3'-нетранслируемой областью нечеловеческого происхождения. В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения гуманизированный локус IL-7 содержит 5-нетранслируемую область нечеловеческого происхождения или участок ее, а также экзон 1 нечеловеческого происхождения, который граничит с человеческим экзоном 2. В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения гуманизированный локус IL-7, который содержит структуру, представленную на фигуре 1.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен гуманизированный локус IL-7, содержащий человеческие экзоны 2-6 человеческого гена IL-7, функционально связанные с регуляторными последовательностями IL-7 нечеловеческого происхождения. В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения гуманизированный локус IL-7 по настоящему изобретению содержит экзон 1 IL-7 нечеловеческого происхождения. В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения гуманизированный локус IL-7 по настоящему изобретению содержит экзон 1 IL-7 нечеловеческого происхождения и интрон 1 IL-7 нечеловеческого происхождения. В некоторых определенных вариантах осуществления гуманизированный локус IL-7 по настоящему изобретению содержит человеческую 3'-нетранслируемую область или участок ее, которая граничит с 3'-нетранслируемой областью нечеловеческого происхождения или участком ее. В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения гуманизированный локус IL-7 по настоящему изобретению содержит 5'-нетранслируемую область нечеловеческого происхождения или участок ее, а также экзон 1 нечеловеческого происхождения, который граничит с человеческим экзоном 2.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложен гуманизированный локус IL-7, содержащий последовательность, которая кодирует белок IL-7, который является по существу человеческим. В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения гуманизированный локус IL-7 по настоящему изобретению содержит последовательность, которая по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична последовательности SEQ ID NO: 3. В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения гуманизированный локус IL-7 по настоящему изобретению содержит SEQ ID NO: 3. В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения белок IL-7 по настоящему изобретению кодируется последовательностью, которая по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична последовательности SEQ ID NO: 3. В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения белок IL-7 по настоящему изобретению кодируется последовательностью SEQ ID NO: 3.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложен способ получения животного, не являющегося человеком, с геном, кодирующим человеческий или гуманизированный IL-7, содержащим модификацию зародышевой линии животного, не являющегося человеком, с целью включить в себя ген, кодирующий человеческий или гуманизированный IL-7, фланкированный с обеих сторон эндогенными регуляторными последовательностями IL-7 нечеловеческого происхождения.
В одном варианте осуществления способа по изобретению модификация имеется в эндогенном локусе IL-7 нечеловеческого происхождения.
В одном варианте осуществления способа животное, не являющееся человеком, представляет собой грызуна. В одном варианте осуществления грызун выбран из группы, состоящей из мыши, крысы и хомяка.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложено генетически модифицированное животное, не являющееся человеком, которое генетически модифицировано с целью экспрессии человеческого IL-7 с паттерном экспрессии, который представляет собой такой же паттерн экспрессии, что и наблюдаемый для являющегося человеком животного дикого типа того же рода и вида. В одном варианте осуществления животное, не являющееся человеком, представляет собой грызуна. В конкретном варианте осуществления грызун выбран из мыши и крысы.
В одном варианте осуществления уровень человеческого IL-7, экспрессируемого в животном, не являющегося человеком, приблизительно такой же, что и уровень IL-7 нечеловеческого происхождения у соответствующей мыши дикого типа. В одном варианте осуществления животное, не являющееся человеком, представляет собой грызуна. В конкретном варианте осуществления грызун выбран из мыши и крысы.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложена конструкция ДНК, содержащая в направлении от 5' к 3' по отношению к направлению транскрипции нуклеотидную последовательность, гомологичную некодирующей 5'-последовательности мышиного IL-7, человеческий геномный фрагмент, кодирующий человеческий белок IL-7, но не содержащий человеческую регуляторную последовательность выше или ниже по цепи относительно последовательности, кодирующей человеческий белок IL-7, и нуклеотидную последовательность, гомологичную некодирующей 3'-последовательности мышиного IL-7.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложена конструкция ДНК, содержащая в направлении от 5' к 3' по отношению к направлению транскрипции нуклеотидную последовательность, которая содержит область гомологии к последовательности экзона 1 мышиного IL-7, человеческий геномный фрагмент, кодирующий человеческий белок IL-7, но не содержащий человеческую регуляторную последовательность выше или ниже по цепи относительно последовательности, кодирующей человеческий белок IL-7, и нуклеотидную последовательность, гомологичную некодирующей 3'-последовательности мышиного IL-7.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен генетически модифицированный грызун, причем данный грызун содержит конструкцию ДНК, как описано здесь.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложено применение конструкции ДНК, описанной здесь, для создания грызуна или клетки грызуна, экспрессирующей человеческий белок IL-7. В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения грызун или клетка грызуна не экспрессирует в детектируемых количествах белок IL-7 грызуна.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложена генетически модифицированная клетка грызуна, причем данная клетка грызуна содержит замену в эндогенном локусе IL-7 грызуна последовательности гена, кодирующей IL-7 грызуна, человеческой геномной последовательностью, кодирующей человеческий IL-7. В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения выполнена замена при помощи конструкции ДНК, описанной здесь. В некоторых конфетных вариантах осуществления настоящего изобретения клетка грызуна представляет собой клетку крысы. В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения клетка грызуна представляет собой клетку мыши.
В одном варианте осуществления человеческая геномная последовательность содержит непрерывную человеческую нуклеотидную последовательность, охватывающую экзоны от экзона 2 человеческого IL-7 до экзона 6 человеческого IL-7.
В одном варианте осуществления генетически модифицированный грызун содержит промотор мышиного IL-7 в эндогенном локусе IL-7 грызуна.
В одном варианте осуществления клетка выбрана из плюрипотентной клетки, индуцированной плюрипотентной клетки, тотипотентной клетки, ES-клетки и яйцеклетки.
В одном варианте осуществления клетка секретирует человеческий IL-7. В одном варианте осуществления клетка, которая секретирует человеческий IL-7, выбрана из эпителиальной клетки (например, кишечной эпителиальной клетки), гепатоцита, кератиноцита, дендритной клетки и фолликулярной дендритной клетки. В одном варианте осуществления клетка грызуна представляет собой дендритную клетку костного мозга. В одном варианте осуществления клетка, которая секретирует человеческий IL-7, представляет собой стромальную клетку тимуса; в конкретном варианте осуществления стромальная клетка тимуса представляет собой эпителиальную клетку коркового вещества.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложен эмбрион грызуна, причем данный эмбрион содержит по меньшей мере одну донорную клетку грызуна (например, ES-клетка, плюрипотентная клетка, тотипотентная клетка и т.д.), содержащую замену эндогенной нуклеотидной последовательности, кодирующей IL-7 грызуна, последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей человеческий IL-7 в эндогенном локусе IL-7 грызуна. В одном варианте осуществления донорная клетка представляет собой мышиную ES-клетку и эмбрион представляет собой хозяйский мышиный эмбрион, который является эмбрионом на стадии, предшествующей моруле, морулой или бластоцистом.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложена ткань грызуна, которая содержит ген гуманизированного IL-7 в эндогенном локусе IL-7 грызуна, причем ткань грызуна выбрана из ткани тимуса, селезенки, эпидермальной ткани и ткани кишечника.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложена генетически модифицированная мышь, которая содержит последовательность ДНК, которая кодирует человеческий IL-7, причем данная мышь не экспрессирует мышиный IL-7 и демонстрирует Т-клеточную популяцию, которая имеет приблизительно такую же численность, что и Т-клеточная популяция мыши дикого типа.
В одном варианте осуществления мышь характеризуется популяцией периферических Т-клеток, которая имеет приблизительно такой же размер, что и популяция периферических Т-клеток мыши дикого типа.
В одном варианте осуществления популяция Т-клеток представляет собой популяцию мышиных Т-клеток.
В одном варианте осуществления мышь не более склонна, чем мышь дикого типа, к развитию опухоли В-клеток, содержащей про-В или пре-В-клетку.
В одном из вариантов осуществления мышь не более склонна, чем мышь дикого типа, к развитию лимфоидной опухоли.
В одном варианте осуществления у мыши не обнаруживается лимфопролиферативное расстройство при отсутствии известного возбудителя лимфопролиферативных заболеваний.
В одном варианте осуществления у мыши не обнаруживается патологическая инфильтрация Т-клеток в кожном слое. В одном варианте осуществления у мыши не проявляется симптом алопеции (облысения).
В одном варианте осуществления распределение по размерам большинства Т-клеток генетически модифицированной мыши приблизительно такое же, что и у соответствующей по возрасту мыши дикого типа. В конкретном варианте осуществления у генетически модифицированной мыши не обнаруживается увеличение Т-клетки.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложен грызун, который экспрессирует гуманизированный или человеческий белок IL-7 в эндогенном модифицированном локусе IL-7 грызуна, причем сывороточная концентрация человеческого IL-7 в грызуне является физиологически нормальной.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложен гуманизированный грызун, который экспрессирует гуманизированный ген IL-7 в сыворотке грызуна в физиологически нормальной концентрации.
В одном варианте осуществления грызун выбран из мыши и крысы.
В одном варианте осуществления физиологически нормальная сывороточная концентрация человеческого IL-7 составляет менее 10 пикограмм/мл. В одном варианте осуществления физиологически нормальная сывороточная концентрация человеческого IL-7 составляет менее 5 пикограмм/мл. В одном варианте осуществления физиологически нормальная сывороточная концентрация человеческого IL-7 в грызуне составляет от около 2 пикограмм/мл до около 4 пикограмм/мл. В одном варианте осуществления физиологически нормальная сывороточная концентрация человеческого IL-7 в сыворотке грызуна составляет от около 2,4 пикограмм/мл до около 3,2 пикограмм/мл.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложен способ получения человеческого белка IL-7, включающий встраивание в зародышевую линию животного, не являющегося человеком, гена, кодирующего человеческий или гуманизированный IL-7 под контролем эндогенных регуляторных элементов нечеловеческого происхождения, производство в животном, не являющемся человеком, человеческого или гуманизированного IL-7 и выделение из животного, не являющегося человеком (например, млекопитающего, например, грызуна, такого как, например, мышь или крыса или хомяк), человеческого или гуманизированного IL-7.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложен способ получения человеческого белка IL-7, включающий выделение из животного, не являющегося человеком, как описано в данном документе (например, млекопитающего, например, грызуна, такого как, например, мышь или крыса или хомяк).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложен способ получения животного, не являющегося человеком, которое содержит в своей зародышевой линии ген человеческого или гуманизированного IL-7, причем способ включает встраивание в зародышевую линию животного, не являющегося человеком, нуклеотидной последовательности, кодирующей человеческий или гуманизированный IL-7, или ее фрагмента, причем данная нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий или гуманизированный IL-7, или ее фрагмент находится под регуляторным контролем эндогенных регуляторных элементов нечеловеческого происхождения. В одном варианте осуществления ген человеческого или гуманизированного IL-7 находится в эндогенном локусе IL-7 нечеловеческого происхождения (то есть вставлен между предшествующими и последующими относительно точки начала транскрипции регуляторными элементами нечеловеческого происхождения в эндогенном локусе IL-7 нечеловеческого происхождения, причем нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий или гуманизированный IL-7, или ее фрагмент заменяет существующую последовательность дикого типа, кодирующую IL-7 нечеловеческого происхождения, полностью или частично). В одном варианте осуществления животное, не являющееся человеком, представляет собой млекопитающее, например, грызуна. В одном варианте осуществления грызун выбран из мыши, крысы и хомяка.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложен способ получения животного, не являющегося человеком, которое содержит ген человеческого или гуманизированного IL-7, причем способ включает встраивание конструкции ДНК, содержащей экзоны 2-6 человеческого гена IL-7, в эндогенный ген IL-7 нечеловеческого происхождения клетки животного, не являющегося человеком.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложен способ выделения из животного, не являющегося человеком, Т-клетки, которая была подвергнута воздействию человеческого или гуманизированного белка IL-7, содержащему стадию выделения Т-клетки из животного, не являющегося человеком, как описано здесь. В одном варианте осуществления животное, не являющееся человеком, представляет собой мышь или крысу. В одном варианте осуществления Т-клетка представляет собой Т-клетку нечеловеческого происхождения, например, Т-клетку грызуна, например, Т-клетку мыши или крысы. В одном варианте осуществления Т-клетка выбрана из Т-клетки в тимусе и периферической Т-клетки.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложен способ идентификации агента, который является антагонистом человеческого IL-7, причем способ включает стадию введения агента генетически модифицированному грызуну, как описано здесь, стадию определения воздействия агента на опосредованную человеческим IL-7 функцию в грызуне и идентификацию агента в качестве антагониста IL-7, если он противодействует функции человеческого IL-7 в генетически модифицированном грызуне.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложено применение генетически модифицированного грызуна, как описано в данном документе, для идентификации агента, который является антагонистом человеческого IL-7, причем способ включает введение агента генетически модифицированному грызуну, определение воздействия агента на опосредованную человеческим IL-7 функцию в грызуне и идентификацию агента в качестве антагониста IL-7, если он противодействует функции человеческого IL-7 в генетически модифицированном грызуне.
В одном варианте осуществления агент содержит вариабельный домен иммуноглобулина, который связывает IL-7. В одном варианте осуществления агент специфически связывается с человеческим IL-7, но не с IL-7 грызуна. В одном варианте осуществления агент представляет собой антитело.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен способ определения того, не уменьшает ли агент IL-7-опосредованную популяцию периферических Т-клеток, причем способ включает стадию введения генетически модифицированному грызуну, описанного в данном документе, антагониста IL-7 в течение определенного периода времени, измерение численности популяции периферических Т-клеток грызуна в одном или нескольких периодах времени после введения и определение, не уменьшает ли антагонист IL-7 популяцию периферических Т-клеток.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложено применение генетически модифицированного грызуна, описанного в данном документе, для определения того, не уменьшает ли агент IL-7-опосредованную популяцию периферических Т-клеток, содержащему введение генетически модифицированному грызуну, как описано здесь, антагониста IL-7 в течение определенного периода времени, измерение численности популяции периферических Т-клеток грызуна в одном или нескольких периодах времени после введения и определение, не уменьшает ли антагонист IL-7 популяцию периферических Т-клеток.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложено генетически модифицированное животное, не являющееся человеком, которое является гетерозиготным по гену, кодирующему человеческий или гуманизированный IL-7. В одном варианте осуществления животное, не являющееся человеком, не в состоянии экспрессировать эндогенный белок IL-7. В конкретном варианте осуществления животное, не являющееся человеком, содержит нокаут обоих эндогенных аллелей IL-7.
Каждый из объектов и вариантов осуществления, описанных выше и ниже, могут быть использованы вместе, если не указано иное, и если иное не ясно из контекста.
Краткое описание чертежей
На фигуре 1 представлено (не в масштабе) схематическое изображение локуса гена IL7 мыши дикого типа (в верхней части) и гуманизированного эндогенного мышиного локуса IL-7 (в нижней части). Незакрашенные символы обозначают человеческую последовательность; закрашенные символы обозначают мышиную последовательность; затененные участки обозначают нетранслируемые области; пунктирная область обозначает другую последовательность.
На фигуре 2 графически представлена концентрация человеческого IL-7 в сыворотке крови мыши дикого типа, которая имеет генетический фон из 75% С57 В6 и 25% 129/SvJ (75/25 WT), и мыши, гетерозиготной по гуманизированному эндогенному локусу IL-7, как описано здесь (5148 Het).
Подробное описание
В различных вариантах осуществления описаны животные, не являющиеся человеком, которые содержат генетическую модификацию(и), описанную в данном документе. Генетически модифицированное животное, не являющееся человеком, может быть выбрано из группы, состоящей из мыши, крысы, кролика, свиньи, коровы (например, коровы, быка, буйвола), оленя, овцы, козы, курицы, кошки, собаки, хорька, примата (например, мартышка, макака). Для животных, не являющихся человеком, если подходящие генетически модифицируемые ES-клетки не являются легко доступными, используются другие методы для получения животного, не являющегося человеком, содержащего генетическую модификацию. Такие способы включают, например, модификацию генома клетки, не являющейся ES-клеткой (например, фибробласта или индуцированной плюрипотентной клетки), и использование ядерного переноса для переноса модифицированного генома в подходящую клетку, например, яйцеклетку, и оплодотворение модифицированной клетки (например, модифицированного ооцита) в не являющемся человеком животном при подходящих условиях с образованием эмбриона.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения животное, не являющееся человеком представляет собой млекопитающее. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения животное, не являющееся человеком, представляет собой небольшое млекопитающее, например, из надсемейства Dipodoidea или Muroidea. В одном варианте осуществления генетически модифицированное животное представляет собой грызуна. В одном варианте осуществления грызун выбран из мыши, крысы и хомяка. В одном варианте осуществления грызун выбран из надсемейства Muroidea. В одном варианте осуществления генетически модифицированное животное происходит из семейства, выбранного из Calomyscidae (например, мышевидные хомячки), Cricetidae (например, хомяк, New World крысы и мыши, полевки), Muridae (истинные мыши и крысы, песчанки, иглистые (колючие) мыши, хохлатые крысы), Nesomyidae (лазающие мыши, скальные мыши, крысы с хвостом, Мадагаскарские крысы и мыши), Platacanthomyidae (например, колючие сони), и Spalacidae (например, кротовые крысы, бамбуковые крысы и цокоры). В конкретном варианте осуществления генетически модифицированный грызун выбран из истинной мыши или крысы (семейство Muridae), песчанки, колючей мыши и хохлатой крысы. В одном варианте осуществления генетически модифицированная мышь происходит от члена семейства Muridae. В одном варианте осуществления животное представляет собой грызуна. В конкретном варианте осуществления грызун выбран из мыши и крысы. В одном варианте осуществления животное, не являющееся человеком, представляет собой мышь.
В различных вариантах осуществления животное, не являющееся человеком, представляет собой грызуна, который является мышью штамма C57BL, выбранного из C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BU6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr и C57BL/Ola. В другом варианте осуществления мышь представляет собой штамм 129, выбранный из группы, состоящей из штамма, который представляет собой 129Р1, 129Р2, 129РЗ, 129X1, 129S1 (например, 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129Т1, 129Т2 (см., например, Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, см. также, Auerbach et al (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). В конкретном варианте осуществления генетически модифицированная мышь представляет собой помесь из вышеупомянутого штамма 129 и вышеупомянутого штамма C57BL/6. В другом конкретном варианте осуществления мышь представляет собой помесь вышеупомянутых 129 штаммов или помесь вышеупомянутых BL/6 штаммов. В конкретном варианте осуществления штамм 129 смеси является штаммом 129S6 (129/SvEvTac). В другом варианте осуществления мышь относится к штамму BALB, например, штамму BALB/C. В одном варианте осуществления мышь представляет собой помесь из штамма BALB и другого вышеупомянутого штамма.
В одном варианте осуществления животное, не являющееся человеком, представляет собой крысу. В одном варианте осуществления крыса выбрана из крысы Wistar, штамма LEA, штамма Sprague Dawley, штамма Fischer, F344, F6, и Dark Agouti (Темный агути). В одном варианте осуществления крысиный штамм представляет собой помесь двух или более штаммов, выбранных из группы, состоящей из Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 и Dark Agouti.
В настоящем изобретении предложены генетически модифицированные животные, не являющиеся человеком, которые содержат замену последовательности гена IL-7 нечеловеческого происхождения последовательностью человеческого гена IL-7. В настоящем изобретении предложены грызуны, которые содержат гуманизацию гена IL-7 в эндогенном локусе IL-7 грызуна. В настоящем изобретении предложены способы получения грызунов, например, мышей, которые содержат замену эндогенного гена IL-7 или его фрагмента (например, фрагмента, содержащего один или более экзонов) гуманизированным геном IL-7 или его фрагментом (например, фрагментом, содержащим один или более экзонов) в эндогенном локусе IL-7. В настоящем изобретении предложены клетки, ткани и мыши, которые содержат гуманизированный ген, а также клетки, ткани и мыши, которые экспрессируют человеческий IL-7 из эндогенного локуса IL-7 нечеловеческого происхождения. Служащие примерами фланкирующие геномные последовательности гуманизированного гена IL-7 по настоящему изобретению предоставлены в SEQ ID NO: 1 (фланкирующая 5-последовательность) и в SEQ ID NO: 2 (фланкирующая 3'-последовательность). Пример человеческого гена IL-7 по настоящему изобретению предоставлен в SEQ ID NO: 3.
IL-7 представляет собой цитокин, который имеет существенное значение для развития незрелых В- и Т-клеток и, в некоторой степени, зрелых Т-клеток; у IL-7-нокаутных мышей проявляется серьезное истощение зрелых В- и Т-клеток (von Freeden-Jeffry U. et al. (1995) Lymphopenia in interleukin (IL)-7 gene-deleted mice identifies IL-7 as a nonredundant cytokine, J. Exp.Med. 181:1519-1526). Истощение, по-видимому, обусловлено блокированием перехода между про-В- и пре-В-клетками, а также блокированием пролиферации Т-клеток (а не блокированием Т-клеточной дифференцировки; соотношения типов Т-клеток у мышей IL-7 КО близки к нормальным значениям), что приводит к подавлению популяции Т-клеток и зрелых В-клеток (Id.). IL-7 продуцируется эпителиальными клетками в тимусе и кишечнике, в кератиноцитах, печени и дендритных клетках, но не нормальными лимфоцитами (рассмотрено, например, у Fry T.J. and Mackall, C.L. (2002) lnterleukin-7: from bench to clinic, Blood 99(11):3892-3904).
Проще говоря, IL-7 увеличивает количество Т-клеток и улучшает функцию Т-клеток (см, например, Morrissey, J.J. (1991) Administration of IL-7 to normal mice stimulates B-lymphopoiesis and peripheral lymphadenopathy, J. Immunol. 147:561-568; Faltynek, C.R. et al. (1992) Administration of human recombinant IL-7 to normal and irradiated mice increases the numbers of lymphocytes and some immature cells of the myeloid lineage, J. Immunol. 149:1276-1282; Risdon, G.J. et al. (1994) Proliferative and cytotoxic responses of human cord blood Τ lymphocytes following allegenic stimulation, Cell. Immunol. 154:14-24). Функциональное улучшение Т-клеток может быть достигнуто короткой продолжительностью воздействия IL-7, в то время как увеличение числа Т-клеток отражает пролиферативный эффект, который достигается воздействием большей продолжительности (Geiselhart, L.A. et al. (2001) IL-7 Administration Alters the CD4:CD8 Ratio Increases Τ Cell Numbers, and Increases Τ Cell Function in the Absence of Activation, J. Immunol. 166:3019-3027; см. также, Tan J.T. et al. (2001) IL-7 is critical for homeostatic proliferation and survival of naive Τ cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98(15):8732-8737).
IL-7 является необходимым для регуляции Т-клеток как на ранней, так и на поздней стадии. IL-7 не экспрессируется Т-клетками, которые должны столкнуться с IL-7, который высвобождается клетками не из тимуса в периферических органах, и, который, как полагают, отвечает за пролиферацию и поддержание периферических Т-клеток (обзор, например, у Guimond, M (2005) Cytokine Signals in T-Cell Homeostasis, J. Immunother. 28(4):289-294). "Голодание" по IL-7 приводит к тяжелым нарушениям развития Т-клеток и выживанию наивных Т-клеток. IL-7 также представляется необходимым для выживания зрелых Т-клеток; зрелые Т-клетки, приобретенные посредством адаптивного переноса IL-7-дефицитным мышам, входят в апоптоз, если у мышей отсутствует ген IL-7, но не в мышах, которые экспрессируют IL-7 и которые не имеют гена IL-7R (Schluns, K.S. et al. (2000) lnterleukin-7 mediates the homeostasis of naïve and memory CD8 Τ cells in vivo, Nat. Immunol. 1(5):426-432). Потеря функции IL-7 приводит к SCID-подобному фенотипу у мышей (Puel, A. and Leonard, W.J. (2000) Mutations in the gene for the IL-7 receptor result in T(-)B(+)NK(+) severe combined immunodeficiency disease, Curr. Opin. Immunol. 12:468-473), предположительно из-за атрофии и гибели Т-клеток, вызванной медленными темпами роста, скорее всего, опосредованными гликолитической недостаточностью в отсутствие стимула IL-7 (Jacobs, S.R. et al. (2010) IL-7 Is Essential for Homeostatic Control of Τ Cell Metabolism In Vivo, J. Immunol. 184:3461-3469).
Человеческий ген IL-7 содержит 6 экзонов, размеры которых превосходят 33 кб, и находится на хромосоме 8 в 8q12-13. Мышиный IL-7 содержит 5 экзонов (в мыши нет аналога человеческому экзону 5) и на около 80% гомологичен человеческому гену; анализ некодирующих последовательностей человеческого и мышиного генов выявил незначительное число узнаваемых регуляторных мотивов, ответственных за транскрипцию и регуляцию экспрессии генов (Lupton, S.D. et al. (1990) Characterization of the Human and Murine IL-7 Genes, J. Immunol. 144(9):3592-3601), позволяя предположить, что регуляция экспрессии IL-7 может быть сложной. Тем не менее, мышиные (ВАС) фрагменты, содержащие ген-репортер в локусе hlL-7, были экспрессированы в мышах с успешным определением паттернов экспрессии IL-7 у мышей (см, например, Avies, N.L. et al. (2009) Characterization of the thymic IL-7 niche in vivo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106(5):1512-1517; Mazzucchelli, R.I. (2009) Visualization and Identification of IL-7 Producing Cells in Reporter Mice, PLoS ONE 4(11):e7637; Repas, J.F. et al. (2009) IL7-hCD25 and IL7-Cre ВАС transgenic mouse lines: new tools for analysis of IL-7 expressing cells, Genesis 47:281-287). По меньшей мере в одном случае, для замены на основе ВАС экзона IL-7 репортером потребовался целый локус IL-7 размером в 43 кб, а также 96 кб 5’-фланкирующей последовательности и 17 кб 3'-фланкирующей последовательности в надежде на точное воспроизведение экспрессии IL-7 у мышей дикого типа (Repass, J.F. et al. (2009)). В любом случае, данные из различных исследований по экспрессии репортера, запускаемой предполагаемыми регуляторными элементами IL-7, несколько отличаются друг от друга и от более ранних наблюдений, что позволяет поддержать вывод о том, что регуляция IL-7, возможно, не была точно воспроизведена в данных репортерных мышах (данные по IL-7-репортерным трансгенным мышам обозреваются у Kim, G.Y. et al. (2011) Seeing Is Believing: Illuminating the Source of In Vivo lnterleukin-7, Immune Network 11(1): 1-10). Человеческий IL-7 функционирует в мышиных клетках, но мышиный IL-7 не функционален в человеческих клетках.
У трансгенных мышей, которые экспрессируют неправильно или плохо регулируемый человеческий IL-7, обнаруживается целый комплекс патологий или синдромов. У мышей, трансгенных по мышиной кДНК IL-7 под контролем энхансера тяжелой цепи, энхансера легкой цепи к и промотора легкой цепи мышиного lg (для целевой экспрессии в лимфоидном компартменте), обнаруживаются значительно выросшие количества предшественников В-клеток и общее распространение всех субпопуляций тимоцитов в тимусе и периферических Т-клетках (Samaridis, J. et al. (1991) Development of lymphocytes in interleukin 7-transgenic mice, Eur. J. Immunol. 21:453-460).
У трансгенных мышей, которые экспрессируют IL-7 из мышиной кДНК под контролем промотора SRα, развивается целый комплекс патологий, включая хронический колит, который гистопатологически имитирует хронический колит у человека и характеризуется, по меньшей мере, временной сверхэкспрессией IL-7 в лимфоцитах слизистой оболочки толстой кишки (но не в эпителиальных клетках толстой кишки) и его очевидным накоплением в слизи бокаловидных клеток слизистой оболочки толстой кишки (Watanabe, M. et al. (1998) Interleukin 7 Transgenic Mice Develop Chronic Colitis with Decreased Interleukin 7 Protein Accumulation in the Colonic Mucosa, J. Exp Med. 187(3):389-402; Takebe, Y. et al. (1988) sR alpha promoter: an efficient and versatile mammalian cDNA expression system composed of the simian virus 40 early promoter and the R-U5 segment of human T-cell leukemia virus type 1 long terminal repeat, Mol. Cell Biol. 8(1):466-472). Конститутивная экспрессия мышиного IL-7, запускаемая тем же промотором в трансгенных мышах, также приводит к острому дерматиту, характеризующемуся грубыми деформациями и массивной кожной инфильтрацией мононуклеарных клеток, которые являются, в основном, TCRγ∂ клетками (Uehira, M. et al. The development of dermatitis infiltrated by γ∂ Τ cells in IL-7 transgenic mice, Intl. Immunol. 5(12):1619-1627). У трансгенных мышей с экспрессией кДНК мышиного IL-7, запускаемой промотором и энхансером мышиной тяжелой цепи, также обнаруживается дерматит и лимфопролиферация в дерму, но сообщалось о TCRαβ-клетках и клетках, которые экспрессируют Thy-1, CD3, и CD5, но не имеют CD4 и CD8 (CD4+/CD8+ тимоциты из таких трансгенных мышей практически отсутствуют); у данных мышей также развиваются В- и Т-клеточные лимфомы, по-видимому, связанные с длительной лимфопролиферацией, наблюдаемой у таких мышей (см. Rich, В.Е. et al. (1993) Cutaneous lymphoproliferation and lymphomas in interleukin 7 transgenic mice, J. Exp. Med. 177:305-316).
Нарушение регуляции гена IL-7 связана с различными патологическими состояниями. Мыши, экспрессирующие трансгенный мышиный IL-7 под контролем промотора Еα МНС класса II, сильно подвержены лимфоидным опухолям (см., например, Fisher, A.G. et al. (1995) Lymphoproliferative disorders in IL-7 transgenic mice: expansion of immature В cells which retain macrophage potential, Int. Immunol. 7(3):414-423; см., также, Ceredig, R. eе al. (1999) Effect of deregulated IL-7 transgene expression on В lymphocyte development in mice expressing mutated pre-B cell receptors, Eur. J. Immunol. 29(9):2797-2807). Размеры Т-клеток также больше в трансгенных мышах, и наблюдается экспансия поликлональных Т-клеток (преимущественно CD8+, что указывает на нарушенную регуляцию у данных мышей) (Mertsching, Ε. et al. IL-7 transgenic mice: analysis of the role of IL-7 in the differentiation of thymocytes in vivo and in vitro, Intl. Immunol. 7(3):401-414). Другие трансгенные мыши, которые сверхэкспрессируют mIL-7 (с превышением в около 25-50 раз) под контролем промотора Еα МНС класса II, выглядят очень здоровыми (но в отношении низкой частоты опухолей В-клеток) и демонстрируют 10-20-кратное увеличение числа Т-клеток по сравнению с мышами дикого типа, характеризуясь большим числом CD8+ клеток, которые являются также CD44hi и CD122hi (Kieper W.C. et al. (2002) Overexpression of Interleukin (IL)-7 Leads to IL-15-independent Generation of Memory Phenotype CD8+ Τ Cells, J. Exp. Med. 195(12): 1533-1539).
У мышей, которые конститутивно экспрессируют мышиный IL-7 из кДНК под контролем промотора Еα МНС класса II, избирательно распространяются IL-7-отзывчивые ранние В-клетки, и они являются хорошим источником опухолей, содержащих про-В- и пре-В-клетки. У мышей, которые экспрессируют IL-7 под контролем человеческого промотора К14, развивается лимфопролиферативный ответ, который приводит к Т-клеточным инфильтратам кожи, напоминающим алопецию.
У мышей, трансгенных по IL-7R, обнаруживают большие уменьшения числа двойных негативных (CD4-CD8-) клеток-предшественников в тимусе, предположительно, из-за истощения IL-7 большим числом двойных позитивных тимоцитов в трансгенных мышах, что дает основание предполагать, что уровни IL-7 должны тонко контролироваться, чтобы содействовать нормальному развитию тимоцитов (см, например, Malek, T.R. (2004) IL-7: a limited resource during thymopoiesis, Blood, 104(13):2842).
Со времени клонирования человеческого IL-7 было известно, что человеческий IL-7 может индуцировать пролиферацию мышиных пре-В-клеток (Goodwin, R.G. et al. (1989) Human interleukin 7: Molecular cloning and growth factor activity on human and murine B-lineage lines, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:302-306). Хотя мышиный IL-7 и экспрессировался в некоторых лейкемических клетках при хронической лимфоцитарной лейкемии, экспрессия мышиного IL-7 в опухолевых клетках, имплантированных в мышей, вызывала воспаление и снижала онкогенность, кроме того, парадоксальным образом, мыши, трансгенные по IL-7, склонны к лимфомам (обзор у Foss, H.-D. et al. (1995) Frequent Expression of IL-7 Gene Transcripts in Tumor Cells of Classical Hodgkin's Disease, Am. J. Pathol. 146(1):33-39). Таким образом, желательно получить мышей, которые экспрессируют человеческий IL-7 (но не мышиный IL-7) из эндогенных мышиных IL-7-локусов физиологически соответствующим образом, в частности, но не ограничиваясь ими, мышей, которые содержат человеческие или мышиные опухоли, например, лимфоцитарные опухоли.
Мыши, которые экспрессируют человеческий IL-7 физиологически соответствующим образом, также могут использоваться для оценки противоопухолевых свойств предполагаемых терапевтических средств (включая человеческий IL-7 и его аналоги) в ксенотрансплантатных моделях человеческих солидных опухолей на мышах. Например, мыши SCID, которым имплантировали аденокарциному НТ29 толстой кишки человека и которых тестировали при различных условиях (например, удаление нативных Т-клеток и добавление человеческих Т-клеток; добавление рекомбинантного человеческого IL-7 и т.п.) (см. Murphy, W.J. et al. (1993) Antitumor Effects of lnterleukin-7 and Adoptive Immunotherapy on Human Colon Carcinoma Xenografts, J. Clin. Invest. 92:1918-1924). Данное исследование показало, что введение человеческого IL-7 с человеческими Т-клетками привело к значительно более длительной выживаемости, чем в отсутствие человеческого IL-7 (Id.).
Таким образом, мыши, которые экспрессируют человеческий IL-7, в частности, мыши, которые способны поддерживать ксенотрансплантат (например, опухоль человека), такие как, например, иммунодефицитные мыши, имеют конкретное и устоявшееся применение. Передача сигналов IL-7, как было показано, является необходимой для развития и выживания человеческого Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза (Т-ОЛЛ) in vitro and in vivo. (Touw, I. et al. (1990) lnterleukin-7 is a growth factor of precursor В and Τ acute lymphoblastic leukemia. Blood 75, 2097-2101). Т-ОЛЛ представляет собой агрессивный гематологический рак с плохим прогнозом; понимание механизмов, движущих пролиферацию и выживание Т-ОЛЛ-клеток, остается относительно бедным из-за отсутствия ксенотрансплантатных моделей, которые могут поддерживать рост in vivo полученных от пациента опухолей. Таким образом, иммунодефицитное животное, экспрессирующее человеческий IL-7, может служить неоценимой in vivo системой для тестирования фармацевтических композиций против таких злокачественных новообразований, связанных с Т-клетками, например, для тестирования эффективности фармацевтической композиции по отношению к целевой IL-7-опосредованной передаче сигнала в мыши, которая экспрессирует человеческий IL-7 и имеет имплантированную опухоль, происходящую из Т-клеток, причем для развития и выживания такой опухоли требуется передача сигнала посредством IL-7.
Примеры
Пример 1. Гуманизация мышиного локуса IL-7
Мышиные ES-клетки были модифицированы для замены последовательностей мышиного гена IL-7 последовательностями человеческого гена IL-7 в эндогенном локусе мышиного IL-7, под контролем мышиных регуляторных элементов IL-7, с помощью генно-инженерной технологии VELOCIGENE®, с целью получения гуманизированного локуса, как показано на Фигуре 1.
Нацеливающая конструкция. Бактериальную гомологичную рекомбинацию (БГР) выполняют для построения большого нацеливающего вектора (large targeting vector (LTVEC)), содержащего ген человеческого IL-7 для нацеливавания на мышиный локус IL-7 с использованием стандартных методик БГР (см, например, Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659). Линейные фрагменты генерируют лигированием ПЦР-сгенерированных гомологичных боксов с клонированными кассетами с последующим выделением из геля продуктов лигирования и электропорацией в БГР-компетентные бактерии, несущие целевую бактериальную искусственную хромосому (bacterial artificial chromosome (ВАС)). Мышиная ВАС bMQ-271g18 используется в качестве источника мышиной последовательности; человеческая ВАС RP11-625K1 используется в качестве источника человеческой последовательности. После стадии селекции правильно рекомбинированные клоны идентифицируют с помощью ПЦР через новые соединяющие участки и рестрикционным анализом. Был изготовлен большой нацеливающий вектор (LTVEC), содержащий плечи гомологии и последовательности гена человеческого IL-7. ES-клетки мыши подвергали электропорации с конструкциями LTVEC, выращивали на селективной среде и использовали в качестве доноров ES-клеток для получения мышей с гуманизированным IL-7.
Мышиный ген IL-7 (мышиный ген Gene ID: 96561; Ref Seq transcript: NM_008371.4) модифицируют удалением экзонов со 2 по 5 (координаты удаления NCBIM37:ch3:7604650-7573021; минус-цепь) и заменой их экзонами со 2 по 6 (координаты замены GRCh37Lch*:79711168-79644608; минус-цепь) человеческого IL-7 (Entrez Gene ID: 6023; Ref Seq transcript NM_000880.3). Человеческая геномная последовательность IL-7 приведена в SEQ ID NO: 3 (NC#166E2F2). Мышиный геномный локус IL-7 известен и описан в виде последовательности размером в 41351 т.н. под номером доступа NC0000696 (включено в качестве ссылки); соответствующие 5'- и 3'-последовательности геномного локуса мышиного IL-7 предоставлены в SEQ ID NO: 1 (5-фланкирующая) и SEQ ID NO: 2 (3'-фланкирующая).
LTVEC, содержащий гуманизированный ген IL-7, имел вышележащее (относительно точки начала транскрипции) мышиное нацеливающее плечо в 48 кб, фланкированное выше (относительно точки начала транскрипции) сайтом Notl, и нижележащее (относительно точки начала транскрипции) мышиное нацеливающее плечо в 77 кб, фланкированное ниже (относительно точки начала транскрипции) сайтом Notl. LTVEC линеаризовали с помощью Notl для электропорации.
После построения LTVEC была получена нуклеотидная последовательность LTVEC через 5'-соединяющий участок мышь/человек, которая включала, в направлении от 5' (мышь) до 3' (человек), следующую последовательность с нуклеотидами соединяющего участка мышь/человек в скобках: 5' - TGCAAGCACC AAAAAGGTGA ССАСАСТТСА CATTGGCGAT CGC(GG)GTTTC TATCTGAGGA TGTGAATTTA TTTACAGA - 3' (SED ID NO: 4).
Была определена нуклеотидная последовательность LTVEC через соединяющий участок человеческой инсерции и 5-конца кассеты (см. Фигуру 1), и она включала в себя следующую последовательность, имеющую, в направлении от 5' к 3', человеческую последовательность/сайт рестрикции/loxp/ последовательность кассеты с человеческой последовательностью/сайт рестрикции с нуклеотидами соединяющего участка в скобках: 5'- GTTATGTGCT GATGGGCTTT ATTTGATCTA CAGAAGATGC TCTGGTGACA CCCTCAGTGT GTGTTGGTAA CACCTTCCTG (CC)TCGAGATA ACTTCGTATA ATGTATGCTA TACGAAGTTA TATGCATGGC CTCCGCGCCG GGTTTTGGCG СС - 3' (SEQ ID NO: 5).
Была определена нуклеотидная последовательность LTVEC через соединяющий участок конца кассеты и начала мышиной последовательности, и она включала в себя следующую последовательность, имеющую, в направлении от 5' к 3', последовательность кассеты/сайт рестрикции/мышиную последовательность с нуклеотидами соединяющего участка в скобках: 5'- GTATGCTATA CGAAGTTATG CTAGTAACTA TAACGGTCCT AAGGTAGCGA GCTAG(CC)CAA TTGCGTACTT TGGATAGTGT СТСТТТТТАА CCTAAATGAC СТТТАТТААС ACTGTCAGGT ТСССТТАСТС TCGAGAGTGT TCATTGCTGC ACT - 3' (SEQ ID NO: 6).
После электропорации ES-клетки выполняют анализ на детектирование потери нативного аллеля (см, например, Valenzuela et al. (2003)) для эндогенного IL-7 с целью обнаружения потери последовательности из-за нацеливания. Пары праймеров, размеры фрагментов и зонды TAQMAN™ таковы, как показано в таблице 1. С1-зонд связывается с геномной последовательностью мышиного IL-7 (NC0000696) в nts 9,635-9,664; С2-зонд связывается с геномной последовательностью мышиного IL-7 (NC0000696) в nts 39,793-39,825. Для усиления анализа на аллель С3-зонд связывается с геномной последовательностью человеческого IL-7 (NC#166E2F2) в nts 29,214-29,242.
Пример 2. Мыши с гуманизированным IL-7
Создание мышей с гуманизированным IL-7. ES-клетки мыши-донора, содержащие гуманизированный локус IL-7, вводят в мышиные эмбрионы на ранней стадии развития методом VELOCIMOUSE® (Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses, Nat Biotechnol 25:91-99). Были получены четыре мыши поколения F0, полностью происходящие из донорных ES-клеток, которые были гетерозиготными по гуманизации эндогенного мышиного локуса IL-7. Мышей F0 скрещивают для получения гомозиготности по отношению к гуманизации. Гомозиготных мышей генотипируют для подтверждения гомозиготности. Все исследования на мышах были под контролем и утверждены Институциональным комитетом по содержанию и использованию животных (Regeneron's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)).
Пример 3. Экспрессия человеческого IL-7 в мыши
У мышей, гуманизированных по гену IL-7, и у их негуманизированных контрольных однопометников брали кровь и измеряли сывороточную концентрацию человеческого IL-7 с помощью набора для иммуноанализа QuantikineHS Human IL-7 Immunoassay kit от R&D Systems, Inc. Данные проанализировали с использованием Microsoft Excel и представили в графическом виде с использованием программного обеспечения статистического анализа Prism. Мыши, гетерозиготные по гуманизированному локусу IL-7 (обозначены как МАID 5148 het), экспрессировали человеческий IL-7 в сыворотке в физиологически релевантной концентрации. Этим они отличались от трансгенных мышей с человеческим IL-7, несущих трансдуцированный лентивиральным вектором человеческий IL-7 в мышах с двойным нокаутом, сыворотка которых характеризуется нефизиологическими и потенциально весьма вредными высокими уровнями человеческого IL-7 (от 10 до 100 пикограмм/мл) (O'Connell, R.M. et al. (2010) Lentiviral Vector Delivery of Human lnterleukin-7 (hlL-7) to Human Immune System (HIS) Mice Expands Τ Lymphocyte Populations, PLoS ONE 5(8):e12009). В противоположность этому, в сыворотке мышей, гетерозиготных по гуманизированному эндогенному локусу IL-7, обнаруживалось от около 2,4 до около 3,2 пг/мл IL-7 (Фигура 2), что соответствует нормальным, или физиологически релевантным, уровням IL-7.
1. Генетически модифицированный грызун, который продуцирует человеческий или гуманизированный белок IL-7, при этом в геноме грызуна содержится гуманизированный ген IL-7, причем гуманизированный ген IL-7 содержит экзоны 2, 3, 4, 5 и 6 человеческого IL-7 и находится под контролем эндогенных 5'-регуляторных элементов IL-7 грызуна, при этом грызун представляет собой мышь или крысу.
2. Грызун по п. 1, у которого гуманизированный ген IL-7 находится в эндогенном локусе IL-7 грызуна и получен за счет замены эндогенной геномной последовательности IL-7 грызуна нуклеотидной последовательностью, содержащей экзоны 2, 3, 4, 5 и 6 человеческого IL-7.
3. Грызун по п. 1 или 2, при этом грызун представляет собой крысу.
4. Грызун по п. 1 или 2, при этом грызун представляет собой мышь.
5. Грызун по п. 4, у которого гуманизированный ген IL-7 содержит экзон 1 мышиного IL-7 и экзоны 2, 3, 4, 5 и 6 человеческого IL-7.
6. Грызун по п. 1 или 2, у которого гуманизированный ген IL-7 содержит кДНК, кодирующую человеческий белок IL-7.
7. Грызун по любому из пп. 1, 2 или 5, при этом грызун не экспрессирует эндогенный белок IL-7 грызуна.
8. Способ получения генетически модифицированного грызуна, включающий модификацию зародышевой линии грызуна с целью включения гуманизированного гена IL-7, причем гуманизированный ген IL-7 содержит по меньшей мере экзоны 2, 3, 4, 5 и 6 человеческого IL-7 и находится под контролем эндогенных 5'-регуляторных элементов IL-7 грузына, при этом грызун представляет собой мышь или крысу.
9. Способ по п. 8, в котором модификация находится в эндогенном локусе IL-7 грызуна и содержит замену эндогенной геномной последовательности IL-7 грызуна нуклеотидной последовательностью, содержащей экзоны 2, 3, 4, 5 и 6 человеческого IL-7.
10. Способ по п. 8 или 9, в котором модификацию осуществляют в геноме эмбриональной стволовой (ES) клетки грызуна, и полученную ES-клетку используют для получения генетически модифицированного грызуна.
11. Способ по п. 8 или 9, в котором грызун представляет собой крысу.
12. Способ по п. 8 или 9, в котором грызун представляет собой мышь.
13. Способ по п. 12, в котором гуманизированный ген IL-7 содержит экзон 1 мышиного IL-7 и экзоны 2, 3, 4, 5 и 6 человеческого IL-7.
14. Способ по п. 8 или 9, в котором гуманизированный ген IL-7 содержит кДНК, кодирующую человеческий белок IL-7.
15. Способ по любому из пп. 8, 9 или 13, в котором грызун не экспрессирует эндогенный белок IL-7 грызуна.
16. Нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий или гуманизированный белок IL-7, содержащая гуманизированный ген IL-7, при этом гуманизированный ген IL-7 включает экзон 1 IL-7 грызуна, экзон 2 человеческого IL-7, экзон 3 человеческого IL-7, экзон 4 человеческого IL-7, экзон 5 человеческого IL-7 и экзон 6 человеческого IL-7, при этом грызун относится к виду мыши или крысы.
17. Нуклеиновая кислота по п. 16, в которой гуманизированный ген IL-7 дополнительно содержит 5-регуляторную последовательность IL-7 грызуна, функционально связанную с экзоном 1 IL-7 грызуна.
18. ES-клетка грызуна для получения грызуна, который продуцирует человеческий или гуманизированный белок IL-7, при этом в геноме ES-клетки грызуна содержится гуманизированный ген IL-7, причем гуманизированный ген IL-7 содержит экзоны 2, 3, 4, 5 и 6 человеческого IL-7 и находится под контролем эндогенных 5'-регуляторных элементов IL-7 грызуна, и при этом ES-клетка грызуна представляет собой ES-клетку мыши или крысы.
19. ES-клетка грызуна по п. 18, при этом гуманизированный ген IL-7 находится в эндогенном локусе IL-7 грызуна и получен за счет замены эндогенной геномной пследовательности IL-7 грызуна нуклеотидной последовательностью, содержащей экзоны 2, 3, 4, 5 и 6 человеческого IL-7.
20. Клетка, которая содержит гуманизированный ген IL-7 и продуцирует человеческий или гуманизированный белок IL-7, при этом клетка выделена из генетически модифицированного грызуна по любому из пп. 1-7, и геном укзанной клетки содержит гуманизированный ген IL-7, который содержит по меньшей мере экзоны 2, 3, 4, 5 и 6 человеческого IL-7 и находится под контролем эндогенных 5'-регуляторных элементов IL-7 грызуна.
21. Ткань, которая содержит гуманизированный ген IL-7 и продуцирует человеческий или гуманизированный белок IL-7, при этом ткань выделена из генетически модифицированного грызуна по любому из пп. 1-7, и геном клеток в укзанной ткани содержит гуманизированный ген IL-7, который содержит по меньшей мере экзоны 2, 3, 4, 5 и 6 человеческого IL-7 и находится под контролем эндогенных 5'-регуляторных элементов IL-7 грызуна.
