Экстракт семян сои, способ его получения, композиция экстракта семян сои, способ стимуляции пролиферации нейронов, лечения заболеваний головного мозга и лечения нейродегенеративных заболеваний (варианты)

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к экстракту для стимуляции пролиферации нейронов и/или лечения заболеваний головного мозга и/или нейродегенеративных заболеваний. Экстракт семян сои для стимуляции пролиферации нейронов и/или лечения заболеваний головного мозга и/или нейродегенеративных заболеваний, который приготовляют из семян сои и экстрагирующего раствора в виде воды или спиртового раствора, содержащего спирт в концентрации меньше чем 90 мас.%, посредством экстрагирования семян сои экстрагирующим раствором при барометрическом давлении меньше чем 1 атм и при температуре ниже чем 60°С, с получением неочищенного экстракта, при этом отношение веса к объему семян сои и экстрагирующего раствора составляет от 1:1 до 1:30, и удаления твердой фазы из неочищенного экстракта с получением жидкой фракции. Композиция экстракта семян сои для стимуляции пролиферации нейронов и/или лечения заболеваний головного мозга и/или нейродегенеративных заболеваний. Способ получения экстракта семян сои. Применение экстракта семян сои в производстве лекарственного средства при стимуляции пролиферации нейронов и/или лечении заболеваний головного мозга и/или нейродегенеративных заболеваний. Применение композиции экстракта семян сои в производстве лекарственного средства при стимуляции пролиферации нейронов и/или лечении заболеваний головного мозга и/или нейродегенеративных заболеваний. Вышеописанный экстракт эффективен для стимуляции пролиферации нейронов и/или лечения заболеваний головного мозга и/или нейродегенеративных заболеваний. 5 н. и 10 з.п. ф-лы, 27 ил., 17 табл.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к экстракту семян сои, способу его получения и использованию экстракта семян сои для стимуляции заживления ран, стимуляции пролиферации нейронов и/или лечения заболеваний головного мозга и/или нейродегенеративных заболеваний, лечения рака молочной железы, уменьшения побочных эффектов лекарственных препаратов, воздействующих на репликацию ДНК и/или РНК, а также усиления фармакологических эффектов лекарственных препаратов, воздействующих на репликацию ДНК и/или РНК.

Уровень техники

Соя культурная (Glycine max (L.) Merr.), включающая сою и черную сою, является одним из важнейших источников масла и белков в мире. Например, сою перерабатывают для получения пищевого масла, которое используется в качестве салатного масла, или для производства маргарина и шортенинга. Соевое масло также может использоваться для производства лакокрасочных материалов, линолеума, промасленной ткани, типографских красок, мылов, инсектицидов и дезинфицирующих средств. Кроме того, фосфолипиды лецитина, получаемые из побочных продуктов масляной промышленности, могут использоваться в качестве смачивающих средств и стабилизаторов в производстве пищевых продуктов, косметических средств, лекарственных средств, кож, лакокрасочных материалов, пластмасс, мылов и поверхностно-активных веществ. Соевая мука представляет собой корм для скота с очень высоким содержанием белков. Кроме того, соевый белок можно использовать в производстве синтетических волокон, клеев, текстильных замасливателей, водонепроницаемых материалов, огнетушащих пен и т.п.

Установлено, что в медицинском применении соя оказывает действие при ряде заболеваний.

Сою можно использовать в качестве пищевой добавки для регуляции функций кишечника, сердца, почек, печени и желудка. Поскольку соевое масло в больших количествах содержит ненасыщенные жирные кислоты, его можно использовать для борьбы с гиперхолестеринемией. Медицинский лецитин из сои используется в качестве липотропного средства. Кроме того, из сои получают стигмастерол, известный как фактор снижения жесткости сосудов, и ситостерин, используемый в качестве замены диосгенина в некоторых гипотензивных препаратах. Было указано, что изофлавоны и фитоэстрогены, присутствующие в сое, оказывают профилактическое действие в отношении различных видов рака, включая рак молочной железы, предстательной железы и толстой кишки (Adlercreutz, Н.; Phyto-oestrogens and cancer. The Lancet Oncology, 2002, Vol. 3, p. 364-373). В других литературных публикациях указано, что для достижения профилактического эффекта в отношении развития рака молочной железы изофлавоны необходимо принимать с дозировкой по крайней мере 100 мг в сутки последовательно на протяжении месяца, и опубликованные данные свидетельствуют о том, что только при непрерывном приеме в высоких дозах изофлавоны оказывают противораковое действие (Lu LJ, Anderson КЕ, Grady JJ, Nagamani M.; Effects of soya consumption for one month on steroid hormones in premenopausal women: implications for breast cancer risk reduction. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 1996 Jan; 5 (1): 6370). Также было установлено, что употребление маргарина с содержанием фитостерина снижает общие концентрации холестерина и холестерина ЛПНП в плазме крови у пациентов средней возрастной группы (Matvienko, О.A., Lewis, D.S., Swanson, М., Aendt, В., Rainwater, D.L, Stewart, J., and Alekel, D.L; A single daily dose of soybean phytosterols in ground beef decreases serum total cholesterol and LDL cholesterol in young, mildly hypercholesterolemic men. Am J Clin Nutr., 2002, 76, p. 57 64).

Согласно опубликованным данным, некоторые экстракты сои оказывают фармакологическое действие. Раскрыта активность захвата радикалов 1,1-дифенил-2-пикрилгидразила (ДФПГ) 70% водно-ацетонового экстракта из семенной оболочки сорта коричневой сои Akita-Zairai (Takahata, Y., О.-Kameyama, М., Furuta, S., Takahashi, M., and Suda, I.; Highly polymerized procyanidins in brown soybean seed coat with a high radical-scavenging activity. J. Agric. Food Chem., 2001, 49, p. 5843 5847). Было установлено, что экстракт, полученный из экстрактов зародышей, сои, рисовых отрубей, кукушкиных слезок, кунжута, пшеницы, цитрона, экстракта зеленого чая и осоложенного риса, которые медленно обжаривают при температуре меньше 60°С и ферментируют с применением Aspergillus oryzae в течение 3 суток для преобразования каждого ингредиента в низкомолекулярные вещества, обладает антиоксидантным действием (Minamiyama, Y., Yoshikawa, Т., Tanigawa, Т., Takahashi, S., Naito, Y., Ichikawa, H., and Kondo, M.; Antioxidative effects of a processed grain food. J. Nutr. Sci. Vitaminol., 1994, 40, p.467 477). По опубликованным данным водный экстракт черной сои также оказывает действие при ацетаминофен-индуцированном повреждении печени, о чем свидетельствуют измерения уровней активности сывороточной глутамат-оксалат-трансаминазы (СГОТ) и сывороточной глутамат-пируват-трансаминазы (СГПТ) у крыс (Wu, S.-J., Wang, J.-S. and Chang, C.-H.; Evaluation of hepatoprotective activity of legumes. Phytomedicine, 2001, Vol. 8(3), p. 213 219).

Было установлено, что некоторые определенные экстракты сои можно применять в составе косметических или фармацевтических средств для лечения некоторых кожных заболеваний. Раскрыт экстракт сои, который содержит сфингомиелины и фосфолипиды в определенных отношениях, для применения в составе косметических средств для лечения сухой кожи (U.S. Patent Pub. No. US 2002/0009509 A1). Такой экстракт получают путем экстрагирования зрелых цельных соевых бобов или обезжиренной соевой муки с использованием алифатических спиртов или смеси этих спиртов с водой и последующей обработки алифатическими углеводородами и алифатическими кетонами. В связи с этим экстракт является жирорастворимым.

Было установлено, что лекарственное средство против угрей, ингибитор для косметической промышленности или косметическая композиция, содержащая один или несколько экстрактов растений, выбранных из сыворотки и экстракта Phellodendeon amurense Ruprecht, а также один или несколько экстрактов, выбранных из Scutellaria baicalensis Geoegi, Symphytum officinale Linne и Glycine max (L.) Merrill, являются эффективными в отношении профилактики или лечения кожных заболеваний, таких как угри или воспаленная растрескавшаяся кожа, вызванная угрями (JP Patent No. 2001097842).

Продукты ферментации сои микроорганизмами также применяются в качестве композиций, средств, пищевых продуктов, косметических и лекарственных средств, обеспечивающих защиту от активных форм кислорода (таких как в JP Patent No. 4139132).

Несмотря на публикации большого количества вариантов применения сои, различные области применения экстракта сои подлежат дальнейшей разработке.

Раскрытие изобретения

Изобретение относится к экстракту семян сои, способу его получения и использованию экстракта семян сои для стимуляции заживления ран, стимуляции пролиферации нейронов и/или лечения заболеваний головного мозга и/или нейродегенеративных заболеваний, лечения рака молочной железы, уменьшения побочных эффектов лекарственных препаратов, воздействующих на репликацию ДНК и/или РНК, а также усиления фармакологических эффектов лекарственных препаратов, воздействующих на репликацию ДНК и/или РНК.

Задачей изобретения является предложение композиции экстракта, включающей экстракт семян сои, при этом экстракт семян сои приготовлен с применением процесса, включающего следующие этапы:

(а) получение семян сои и экстрагирующего раствора, причем экстрагирующий раствор представляет собой воду или спиртовый раствор, содержащий спирт в концентрации ниже около 90 мас. %;

(б) экстрагирование семян сои с использованием экстрагирующего раствора при барометрическом давлении ниже около 1 атм и при температуре ниже 60°С для получения неочищенного экстракта;

(в) удаление твердой фазы из неочищенного экстракта для получения жидкой фракции.

Настоящее изобретение также предлагает способ получения композиции экстракта, как указано выше, включающий процесс получения экстракта семян сои, включающий следующие этапы:

(а) получение семян сои и экстрагирующего раствора, причем экстрагирующий раствор представляет собой воду или спиртовый раствор, содержащий спирт в концентрации ниже около 90 мас. %;

(б) экстрагирование семян сои с использованием экстрагирующего раствора при барометрическом давлении ниже около 1 атм и при температуре ниже 60°С для получения неочищенного экстракта;

(в) удаление твердой фазы из неочищенного экстракта для получения жидкой фракции.

Настоящее изобретение также предлагает использование композиции экстракта, как указано выше, в производстве лекарственного средства для стимуляции заживления ран.

Настоящее изобретение также предлагает использование композиции экстракта, как указано выше, в производстве лекарственного средства для стимуляции пролиферации нейронов и/или лечения заболеваний головного мозга и/или нейродегенеративных заболеваний.

Настоящее изобретение также предлагает использование композиции экстракта, как указано выше, для производства лекарственного средства для лечения рака молочной железы.

Настоящее изобретение также предлагает использование композиции экстракта, как указано выше, для производства лекарственного средства для уменьшения побочных эффектов лекарственных препаратов, воздействующих на репликацию ДНК и/или РНК, а также усиления фармакологических эффектов лекарственных препаратов, воздействующих на репликацию ДНК и/или РНК.

Вышеуказанное приготовление экстракта семян сои согласно настоящему изобретению может завершаться концентрацией жидкой фракции с получением концентрированной твердой фракции и может также завершаться сушкой концентрированной твердой фракции.

Композиция согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать паровую фракцию семян сои, которую получают из семян сои во втором экстрагирующем растворе в виде воды или спиртового раствора, содержащего спирт в концентрации меньше, чем 15 мас. % посредством экстрагирования семян сои вторым экстрагирующим раствором при барометрическом давлении меньше, чем 1 атм и при температуре ниже, чем приблизительно 110°С и отбором паровой фракции.

Вышеуказанный спиртовый раствор можно использовать в концентрации спирта меньше, чем приблизительно 5 мас. %.

Композиция согласно настоящему изобретению может содержать экстракт семян сои в количестве от приблизительно 0,001 мас. % до приблизительно 5 мас. % и паровую фракцию семян сои в количестве от приблизительно 95 мас. % до приблизительно 99,999 мас. %.

Вышеуказанная стимуляция заживления ран может сопровождаться стимуляцией миграции клеток кожи, в частном случае такой клеткой кожи может являться кератиноцит.

Одной из разновидностью ран, стимуливание которой можно достигать настоящим изобретением, может быть диабетическая рана (язва).

Вышеупомянутый нейрон может представлять собой клетку нейробластомы.

В качестве заболеваний головного мозга и/или нейродегенеративных заболеваний настоящее изобретение может лечить сосудистую деменцию, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, заболевание сосудов мозга, воспалительное повреждение головного мозга, повреждение головного мозга, связанное с воспалительной реакцией, поражение головного мозга, церебральная гематома, отек желудочка и дилатация желудочка.

Вышеуказанный рак молочной железы может представлять собой рак молочной железы с мутантным типом р53.

Вышеуказанными препаратами, воздействующими на репликацию ДНК и/или РНК, при применении настоящего изобретения могут быть циклофосфамид, темозоломид, гексаметиламин, комплексы платины, блеомицин, винбластин, винкристин, паклитаксел, доцетаксел, антагонисты фолиевой кислоты, антагонисты пурина и антагонисты пиримидина.

Подробное описание настоящего изобретения приведено в следующих разделах. Другие характеристики, цели и преимущества настоящего изобретения приведены ниже.

Краткое описание чертежей

На Фиг. 1-3 изображены полученные с применением ионной хроматографии спектрограммы экстракта семян сои (GMA1) в соответствии с изобретением.

На Фиг. 4-6 изображены полученные с применением ионной хроматографии спектрограммы паровой фракции семян сои (GMC1) в соответствии с изобретением.

На Фиг. 7 изображена полученная с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) спектрограмма стандарта изофлавонов.

На Фиг. 8 изображена спектрограмма ВЭЖХ паровой фракции семян сои (GMC1).

На Фиг. 9 изображена спектрограмма ВЭЖХ композиции экстракта, содержащей 0,3 части по массе экстракта семян сои (GMA1) и 1 часть по массе паровой фракции семян сои (GMC1).

На Фиг. 10 изображено действие GMA1 и GMC1 при лечении диабетических ран. Для исследования, оказывают ли GMC1 и GMA1 благоприятное действие на закрытие раны, использовали стрептозоцин-индуцированную диабетическую крысиную модель. Для сравнения также использовали две группы, получавшие лечение основой для крема и CGS-21680. Результаты показывают, что 0,3% GMA1 и GMC1 эффективны в отношении закрытия раны по сравнению с основой для крема, а группа, получавшая лечение 0,3% GMA1, показывает незначительно лучший результат закрытия раны, чем GMC1.

На Фиг. 11 показано действие различных дозировок GMA1 в сочетании с GMC1 при лечении диабетических ран. Были выполнены эксперименты для исследования оптимального сочетания GMA1 и GMC1 при закрытии диабетических ран. Как показано на Фиг. 11, GMA1 использовали в сочетании CGMC1 в различных концентрациях: 0,009%, 0,045% и 0,09% соответственно. Для сравнения во все экспериментальные исследования были включены две группы, получавшие лечение основой для крема и CGS-21680. Результаты показывают, что для лечения ран комплексное действие уровней дозировки 0,009%, 0,045% и 0,09% GMA1 с GMC1 было эффективнее, чем действие GMC1 в отдельности. Было установлено, что наиболее эффективное комплексное лечение достигается при максимальной дозировке GMA1 (0,09%).

На Фиг. 12 показано действие комбинаций экстракта семян сои и паровой фракции семян сои на миграцию клеток НаСаТ.

На Фиг. 13 показан уровень жизнеспособности клеток IMR-32, обработанных GMA1. Данные приведены в виде средних значений ±СОС (стандартная ошибка среднего) для семи групп. Значения уровня жизнеспособности клеток IMR-32, обработанных 25 мг/мл GMA1 и положительным контролем, были значимо выше и значимо возрастали (GMA1-р=0,0008, положительный контроль-р=0,0246). Результаты показывают, что GMA1 стимулирует клеточный рост (*** р<0,001).

На Фиг. 14 показан уровень жизнеспособности клеток IMR-32, обработанных GMC1. Данные приведены в виде средних значений ± СОС для семи групп. Значения уровня жизнеспособности клеток IMR-32, обработанных 25 мг/мл GMC1 и положительным контролем, были значимо выше и значимо возрастали (GMC1-р=0,0255, положительный контроль - р=0,0246). Результаты показывают, что GMC1 стимулирует клеточный рост (***р<0,05).

На Фиг. 15 показан уровень жизнеспособности клеток IMR-32, обработанных GMA1 и GMC1 (GM). Данные приведены в виде средних значений ±СОС для семи групп. Значения уровня жизнеспособности клеток IMR-32, обработанных 25 мг/мл GM и положительным контролем, были значимо выше и значимо возрастали (GM-р=0,0059, положительный контроль - р=0,0246). Результаты показывают, что GM стимулирует клеточный рост (** р<0,01).

На Фиг. 16 показана схема радиального лабиринта.

На Фиг. 17 показаны траектории движения крыс с деменцией в радиальном лабиринте. Траектория движения крыс на 4 сутки свидетельствует о том, что группа AlCl3+N2 была способна добираться до расположения приманок благодаря памяти после обучения, а крысы из группы AlCl3 и группы AlCl3 + основа для крема не были на это способны.

На Фиг. 18 показана схема общего количества ошибок (ОКО) крыс с деменцией в тесте с радиальным лабиринтом. Значения ОКО группы AlCl3 и группы AlCl3 + основа для крема не показывают значимого различия (р>0,05), а значения ОКО на 4 сутки после лечения композицией экстракта, включающей экстракт семян сои и паровую фракцию семян сои, были значительно ниже, чем для группы AlCl3 (AlCl3+N2-р=0,0128). Это показывает, что композиция экстракта, включающая экстракт семян сои и паровую фракцию семян сои, оказывает действие на лечение деменции у крыс. Данные приведены в виде средних значений ± СОС. Для статистического анализа использовали критерий Стьюдента и дисперсионный анализ повторных измерений. При сравнении с группой AlCl3 и группой AlCl3 + основа для крема результаты с р<0,05 обозначены *, а с р<0,01 обозначены**, означая наличие значимого различия в статистике.

На Фиг. 19 показана схема ошибок долговременной (справочной) памяти (ОДП) крыс с деменцией в тесте с радиальным лабиринтом. Значения ОДП группы AlCl3 и группы AlCl3 + основа для крема не показывают значимого различия (р>0,05), а значения ОКО на 4 сутки после лечения композицией экстракта, включающей экстракт семян сои и паровую фракцию семян сои, были значительно ниже, чем для группы AlCl3 (р=0,0046). Это показывает, что композиция экстракта, включающая экстракт семян сои и паровую фракцию семян сои, оказывает действие на восстановление долговременной памяти у крыс. Данные приведены в виде средних значений ± СОС. Для статистического анализа использовали критерий Стьюдента и дисперсионный анализ повторных измерений. Результаты с р<0,05 обозначены *, а с р<0,01 обозначены**, означая наличие значимого различия в статистике.

На Фиг. 20 показана схема общего количества ошибок (ОКО) крыс с сосудистой деменцией, получавших лечение основой для крема (М), GMC1(M1), и GMC1+0,5%GMA1 (М3), в тесте с радиальным лабиринтом. Она показывает, что ОКО группы двустороннего лигирования сонной артерии (2VO) значимо выше, чем в группе плацебо (8 сутки, р=0,0013), что свидетельствует об успешной индукции сосудистой деменции у крыс путем двустороннего лигирования сонной артерии. Результаты показывают, что значения ОКО значимо улучшились по сравнению с группой 2VO после лечения М1 и М3 (8 сутки, М1-р=0,0019; М3-р=0,0355). Это свидетельствует о том, что М1 и М3 являются эффективными при лечении сосудистой деменции у крыс. Данные приведены в виде средних значений ± СОС. Для статистического анализа использовали критерий Стьюдента и дисперсионный анализ повторных измерений. Результаты с р<0,05 обозначены *, а с р<0,01 обозначены**, означая наличие значимого различия в статистике.

На Фиг. 21 показана схема ошибок долговременной (справочной) памяти (ОДП) крыс с сосудистой деменцией, получавших лечение основой для крема (М), GMC1(M1) и GMC1+0,5%GMA1 (М3) в тесте с радиальным лабиринтом. Она оказывает, что ОДП группы двустороннего лигирования сонной артерии (2VO) значимо выше, чем в группе плацебо (8 сутки, р=0,0016), что свидетельствует об успешной индукции сосудистой деменции у крыс путем двустороннего лигирования сонной артерии. Результаты показывают, что значения ОДП значимо улучшились по сравнению с группой 2VO после лечения М1 и М3 (8 сутки, М1-р=0,0029; М3-р=0,0171). Это свидетельствует о том, что М1 и М3 являются эффективными для улучшения ОДП при лечении сосудистой деменции у крыс. Данные приведены в виде средних значений ± СОС. Для статистического анализа использовали критерий Стьюдента и дисперсионный анализ повторных измерений. Результаты с р<0,05 обозначены *, а с р<0,01 обозначены**, означая наличие значимого различия в статистике.

На Фиг. 22 показана схема ошибок рабочей (кратковременной) памяти (ОРП) крыс с сосудистой деменцией, получавших лечение основой для крема (М), GMC1(M1), и GMC1+0,5%GMA1 (М3), в тесте с радиальным лабиринтом. Она показывает, что ОРП группы двустороннего лигирования сонной артерии (2VO) значимо выше, чем в группе плацебо (8 сутки, р=0,0111), что свидетельствует об успешной индукции сосудистой деменции у крыс путем двустороннего лигирования сонной артерии. Результаты показывают, что значения ОРП значимо улучшились по сравнению с группой 2VO после лечения М1 и М3 (8 сутки, М1-р=0,0111; М3-р=0,0139). Это свидетельствует о том, что М1 и М3 являются эффективными для улучшения ОРП при лечении сосудистой деменции у крыс. Данные приведены в виде средних значений ± СОС. Для статистического анализа использовали критерий Стьюдента и дисперсионный анализ повторных измерений. Результаты с р<0,05 обозначены *, а с р<0,01 обозначены**, означая наличие значимого различия в статистике.

На Фиг. 23 показаны траектории движения крыс с сосудистой деменцией (СД) в радиальном лабиринте. Траектория движения крыс с ВД на 8 сутки свидетельствует о том, что группа плацебо, группы GMC1 (М1) и GMC1+0,5%GMA1 (М3) способны добираться до расположения приманок благодаря памяти после обучения, тогда как группы 2VO и М на это не способны.

На Фиг. 24 показана статистическая диаграмма оценок степени повреждения головного мозга у крыс с сосудистой деменцией. Степень повреждения головного мозга в соответствии с изображениями КТ (компьютерной томографии) головного мозга крысы оценивали по шкале от 0 до 4. Результаты свидетельствуют о том, что тяжелые повреждения головного мозга в группе 2VO (р=0,0000) значимо снизились при лечении GMC1 (M1) и GMC1+0,5%GMA1 (М3) (М1-р=0,0030; М3-р=0,0238). Данные приведены в виде средних значений ± СОС. Для статистического анализа использовали критерий Стьюдента и дисперсионный анализ повторных измерений. Результаты с р<0,05 обозначены *, а с р<0,01 обозначены**, означая наличие значимого различия в статистике.

Оценка повреждения головного мозга по изображению КТ:

0 - очевидные патологии на срезах КТ отсутствуют

1 - небольшая область патологической плотности в тканях головного мозга

2 - области патологической плотности, которые занимают более 25% тканей головного мозга с одной стороны, или небольшие области патологической плотности в тканях головного мозга с обеих сторон

3 - области патологической плотности, которые занимают более 50% тканей головного мозга с одной стороны, смещение срединных структур или области патологической плотности, которые занимают более 25% тканей головного мозга с обеих сторон

4 - области патологической плотности, которые занимают более 50% тканей головного мозга с обеих сторон или выраженное смещение/деформация срединных структур.

На Фиг. 25 показана схема скорости развития опухоли у бестимусных мышей. У бестимусных мышей индуцировали опухоль, и мышей группировали с последующим нанесением композиции экстракта на участок опухоли и кожу всей спины с дозировкой 0,1 г/сутки после развития опухоли до определенного объема. Результаты показывают, что композиция экстракта способна снижать скорость развития опухоли по сравнению с контрольной группой опухоли.

На Фиг. 26 показана схема скорости развития опухоли у бестимусных мышей. У бестимусных мышей индуцировали опухоль, и мышей группировали с последующим нанесением GMC1 и GMA1 на участок опухоли и кожу всей спины с дозировкой 0,1 г/сутки после развития опухоли до определенного объема. Результаты показывают, что композиция экстракта способна снижать скорость развития опухоли по сравнению с контрольной группой опухоли.

На Фиг. 27 показана диаграмма скорости развития опухоли у бестимусных мышей. У бестимусных мышей индуцировали опухоль, и мышей группировали с последующим введением ЦФА (циклофосфамида) и нанесением GMC1 и GMA1 на участок опухоли и кожу всей спины с дозировкой 0,1 г/сутки после развития опухоли до определенного объема. Результаты показывают, что композиция экстракта способна снижать скорость развития опухоли по сравнению с контрольной группой ЦФА.

Осуществление изобретения

Задачей изобретения является предложение композиции экстракта, включающей экстракт семян сои, при этом экстракт семян сои приготовлен с применением процесса, включающего следующие этапы:

(а) получение семян сои и экстрагирующего раствора, причем экстрагирующий раствор представляет собой воду или спиртовый раствор, содержащий спирт в концентрации ниже около 90 мас. %;

(б) экстрагирование семян сои с использованием экстрагирующего раствора при барометрическом давлении ниже около 1 атм и при температуре ниже 60°С для получения неочищенного экстракта;

(в) удаление твердой фазы из неочищенного экстракта для получения жидкой фракции.

Настоящее изобретение будет более понятно со ссылкой на следующее подробное описание различных вариантов осуществления изобретения, примеров и иллюстраций химических структур и таблиц с соответствующими описаниями. Следует понимать, что, если иное не указано в пунктах формулы изобретения, изобретение не ограничивается конкретными способами получения, носителями или лекарственными формами, а также конкретными способами включения экстракта изобретения в препараты или композиции, предназначенные для местного, перорального или парентерального применения, поскольку, как должно быть известно специалисту в данной области техники, они могут изменяться. Также следует понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, предназначена для описания конкретных вариантов осуществления и не носит ограничивающий характер.

В настоящем описании используются следующие термины, которые, если не указано иное, имеют следующие значения:

В настоящем описании диапазоны часто выражены как от "приблизительно" одного конкретного значения и/или до "приблизительно" другого конкретного значения. Когда указан такой диапазон, вариант осуществления включает диапазон от одного конкретного значения и/или до другого конкретного значения. Аналогичным образом, когда значения выражены в качестве приближенных величин с использованием слова "приблизительно", следует понимать, что указанное конкретное значение составляет другой вариант осуществления. Следует также понимать, что крайние точки каждого из диапазонов являются значимыми как по отношению к, так и независимо от других крайних точек.

"Обязательный" или "обязательно" означает, что описанное последующее событие или обстоятельство может возникнуть или не возникнуть и что описание включает примеры, где возникает указанное событие или обстоятельство, и примеры, где оно не возникает. Например, фраза "необязательно содержащий средство" означает, что средство может как присутствовать в составе, так и отсутствовать.

Следует отметить, что в соответствии с использованием в описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают также множественное число, если контекст явно не требует иного. Таким образом, если иное не требуется в соответствии с контекстом, термины в единственном числе также включают множественное число, а термины во множественном числе включают единственное число.

Термин "пациент", используемый в настоящем документе, обозначает любое животный организм, предпочтительно млекопитающее и более предпочтительно человек. Примеры пациентов могут включать человека, обезьян, грызунов, морских свинок, кроликов, овец, свиней, коз, коров, лошадей, собак и кошек.

Термин "эффективное количество" активного ингредиента, используемый в настоящем документе, означает достаточное количество ингредиента для достижения желаемой регуляции желаемой функции. Как будет указано ниже, требуемое точное количество изменяется для отдельных пациентов в зависимости от состояния заболевания, физического состояния, возраста, пола, вида и веса тела пациента, конкретного состава и формы композиции и т.д. Для достижения оптимального терапевтического ответа возможна корректировка схемы приема. Например, ежесуточно можно вводить несколько разделенных доз, или дозу можно пропорционально снижать в соответствии с потребностями терапевтической ситуации. Таким образом, указать точное "эффективное количество" не представляется возможным. Однако соответствующее эффективное количество может определить специалист в данной области с использованием стандартных экспериментов.

Термин "лечение", используемый в настоящем документе означает улучшение, облегчение, замедление развития или достижение положительной динамики расстройства, заболевания или состояния, к которому относится данный термин, или одного или нескольких симптомов такого расстройства, заболевания или состояния.

Термин "носитель" или "наполнитель", используемый в настоящем документе, относится к любому веществу, не являющемуся лекарственным средством, используемому в качестве носителя и/или разбавителя, и/или адъювант или наполнителя для доставки лекарственного средства пациенту или добавления в лекарственную форму для улучшения его способности к обработке или хранению, или для обеспечения возможности или облегчения приготовления единицы дозирования композиции в виде отдельных изделий, таких как капсулы или таблетки, пригодные для перорального применения. Подходящие носители или наполнители хорошо известны специалистам в области производства фармацевтических композиций или пищевых продуктов. Носители или наполнители могут включать для наглядности и без ограничений буферы, разбавители, разрыхлители, связующие, клейкие вещества, смачивающие вещества, полимеры, смазывающие вещества, скользящие вещества, вещества, добавляемые для маскировки или подавления неприятного вкуса или запаха, вкусовые добавки, красители, ароматизаторы и вещества, добавляемые для улучшения внешнего вида композиции. Приемлемые носители или наполнители включают цитратный буфер, фосфатный буфер, ацетатный буфер, бикарбонатный буфер, стеариновую кислоту, стеарат магния, натриевые и кальциевые соли ортофосфорной и серной кислот, карбонат магния, тальк, желатин, гуммиарабик, альгинат натрия, пектин, декстрин, маннитол, сорбитол, лактозу, сахарозу, крахмалы, желатин, целлюлозные материалы (такие как сложные эфиры целлюлозы с алкановыми кислотами и сложные алкиловые эфиры целлюлозы), легкоплавкий воск, какао-масло, аминокислоты, мочевину, спирты, аскорбиновую кислоту, фосфолипиды, белки (например, сывороточный альбумин), этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТК), диметилсульфоксид (ДМСО), хлорид натрия или другие соли, липосомы, маннитол, сорбитол, глицерин или порошок, полимеры (такие как поливинилпирролидон, поливиниловый спирт и полиэтиленгликоли) и другие фармацевтически приемлемые материалы. Носитель не должен ухудшать фармакологическую активность лекарственного средства и должен быть нетоксичным при введении в дозах, достаточных для доставки терапевтического количества средства.

Композиция экстракта в соответствии с изобретением включает экстракт семян сои. В соответствии с настоящим изобретением в зависимости от цвета семенной оболочки соя может именоваться желтой соей, бесцветной соей, белой соей, лущеной соей, зеленой соей; предпочтительно желтой соей или черной соей. Соя в соответствии с изобретением принадлежит к семейству Fabaceae, роду Glycine; предпочтительно соя представляет собой Glycine max (L.) Merrill, Glycine formosana Hosokawa или Glycine soja auct. non Sieb. & Zucc.

Семена сои в соответствии с изобретением предпочтительно относятся к семенам, полученным путем удаления оболочки стручка. Как правило, плод сои - это стручок с волокном, и оболочка стручка закрывает семена. Оболочка стручка является очень твердой и водонепроницаемой, защищая расположенные внутри семена. Способ получения семян сои из плода сои, т.е. удаление оболочки стручка, известен специалистам в данной области.

Предпочтительно семя сои в соответствии с изобретением состоит из семенной оболочки, семядоли и гипокотиля.

Экстракт семян сои в соответствии с изобретением получают с использованием процесса, включающего следующие этапы:

(а) получение семян сои и экстрагирующего раствора, причем экстрагирующий раствор представляет собой воду или спиртовый раствор, содержащий спирт в концентрации ниже около 90 мас. %;

(б) экстрагирование семян сои с использованием экстрагирующего раствора при барометрическом давлении ниже около 1 атм и при температуре ниже 60°С для получения неочищенного экстракта;

(в) удаление твердой фазы из неочищенного экстракта для получения жидкой фракции.

Экстрагирующий раствор для экстрагирования семян сои в соответствии с изобретением представляет собой воду или спиртовый раствор, содержащий спирт в концентрации ниже около 90 мас. %. Предпочтительно спирт представляет собой спирт С1-С7. Термин "спирт С1-С7", используемый в настоящем документе, относится к линейному или разветвленному, замещенному или незамещенному, моно- или полифункциональному и насыщенному или ненасыщенному спирту; предпочтительно незамещенному монофункциональному и насыщенному спирту. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения спирт С1-С7 выбран из группы, включающей метанол, этанол, н-пропанол, изопропанол, н-бутанол, изобутанол, втор-бутанол, трет-бутанол, 1-пентанол, 2-пентанол, 3-пентанол, 2-метил-1-бутанол, 2-метил-2-бутанол, 3-метил-2-бутанол, 3-метил-1-бутанол, 2,2-диметил-1-пропанол, 1-гексанол, 2,4-гексадиен-1-ол, 2-метилциклопентанол, циклогексанол, 1-гептанол, 2-гептанол и циклогептиловый спирт. Более предпочтительно спирт С1-С7 представляет собой метанол или этанол; более предпочтительно спирт С1-С7 представляет собой этанол. Спирт С1-С7 может использоваться в отдельно или в комбинациях.

Спирт, используемый в настоящем документе, предпочтительно представляет собой спиртовый раствор с концентрацией ниже около 90% (по объему); предпочтительно от около 5% (по объему) до около 90% (по объему); более предпочтительно от около 30% (по объему) до около 85% (по объему); еще более предпочтительно от около 50% (по объему) до около 75% (по объему).

Процесс в соответствии с изобретением включает (б) экстрагирование семян сои с использованием экстрагирующего раствора при барометрическом давлении ниже около 1 атм и при температуре ниже 60°С для получения неочищенного экстракта. Способ экстрагирования части семени раствором хорошо известен специалистам в данной области. Например, неочищенный экстракт может быть получен разделением семян сои на части любым образом, таким как размалывание, перемешивание, истирание, резка или дробление, и пропиткой частей экстрагирующим раствором для экстрагирования. В изобретении могут быть применены способы измельчения семян, известные в данной области. В одном варианте осуществления изобретения семена сои перемалываются в порошок. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения семена сои пропитываются экстрагирующим раствором для экстрагирования; более предпочтительно семена сои пропитываются экстрагирующим раствором и подвергаются экстрагированию ультразвуковыми колебаниями.

В соответствии с процессом изобретения перед этапом (б) семена сои предпочтительно подвергаются сушке.

В соответствии с изобретением отношение (в/о) семян сои и экстрагирующего раствора не ограничивается конкретным значением. В одном предпочтительном варианте осуществления отношение (в/о) семян сои и экстрагирующего раствора составляет от около 1:1 до около 1:30; более предпочтительно от около 1:5 до около 1:20 и наиболее предпочтительно около 1:10.

Температура экстрагирования на этапе (б) в соответствии с изобретением ниже около 60°С; предпочтительно от около 25°С до около 55°С; более предпочтительно от около 30°С до около 50°С; еще более предпочтительно около 45°С.

В одном предпочтительном варианте осуществления этап экстрагирования (б) может быть повторен, и экстракт собирают путем объединения.

Процесс в соответствии с изобретением включает этап (в) удаления твердой фазы из неочищенного экстракта для получения жидкой фракции. Способ удаления твердой фазы для получения жидкой фракции хорошо известен специалистам в данной области, и примеры включают, но не ограничиваются, фильтрацию, центрифугирование или осаждение.

Предпочтительно процесс в соответствии с изобретением далее включает этап (г) концентрации жидкой фракции, полученной на этапе (в), для получения концентрированной твердой фракции. Способ концентрации хорошо известен специалистам в данной области, например, конденсатор с пониженным давлением.

Предпочтительно процесс в соответствии с изобретением далее включает этап (д) сушки концентрированной твердой фракции, полученной на этапе (г). Способ сушки хорошо известен специалистам в данной области, например, воздушная сушка или установка сублимационной сушки.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения экстракт семян сои подвергается анализу методом ионной хроматографии с использованием колонки CarboPac РА1 Analytical (4×250 мм). Подвижная фаза состоит из 87% воды и 13% 500 мМ NaOH; внутренний стандарт - моногидрат мальтозы. Изократическое элюирование применяется с низкой скоростью 1,0 мл/мин и циклом 0,5 секунды. В каждом цикле анализ выполняется с относительным потенциалом 0,1 В с 0,00 секунды до 0,2 секунды; 0,1 В при с 0,2 секунды до 0,4 секунды; -2,0 В с 0,41 до 0,42 секунды; 0,6 В в 0,43 секунды; -0,1 В с 0,44 секунды до 0,5 секунды, и полная продолжительность анализа составляет 55 минут.

Полученные спектрограммы приведены на Фиг. 1-3. Время пика приведено в таблице 1.

Предпочтительно композиция экстракта в соответствии с изобретением дополнительно может включать паровую фракцию семян сои, причем паровая фракция семян сои получена с использованием процесса, включающего следующие этапы:

(i) получение семян сои во втором экстрагирующем растворе, причем второй экстрагирующий раствор представляет собой воду или спиртовый раствор, содержащий спирт в концентрации ниже около 15 мас. %;

(ii) экстрагирование семян сои с использованием второго экстрагирующего раствора при барометрическом давлении ниже около 1 атм и при температуре ниже около 110°С и отбор паровой фракции.

Второй экстрагирующий раствор для получения паровой фракции семян сои в соответствии с изобретением представляет собой воду или спиртовый раствор, содержащий спирт с концентрацией ниже около 15 мас. %; предпочтительно воду. Вид спирта может быть одинаковым со спиртом экстрагирующего раствора для получения экстракта семян сои и в настоящем документе повторно не указывается.

Спирт второго экстрагирующего раствора представляет собой спиртовый раствор с концентрацией ниже около 15% (по объему), предпочтительно ниже около 10% (по объему); более предпочтительно ниже около 5% (по объему).

Процесс получения паровой фракции семян сои в соответствии с изобретением включает этап (ii) экстрагирование семян сои с использованием второго экстрагирующего раствора при барометрическом давлении ниже около 1 атм и при температуре ниже около 110°С и отбор паровой фракции. Может использоваться тот же способ экстрагирования, который используется для получения экстракта семян сои, при условии, что паровая фракция семян сои выпаривается при барометрическом давлении ниже около 1 атм и при температуре ниже около 110°C. Сбор паровой фракции возможен в жидком состоянии путем охлаждения пара.

В предпочтительном варианте осуществления процесс выпаривания семян сои осуществляется при заданном барометрическом давлении и температуре, а сбор указанной паровой фракции путем охлаждения пара может быть выполнен в ротационном испарителе, в котором пар направляется в конденсационную трубку с подачей холодной воды, а затем охлаждается при прохождении через конденсационную трубку для сбора паровой фракции в жидком состоянии. Манипуляции являются простыми, а затраты - низкими.

В соответствии с изобретением отношение веса к объему (в/о) семян сои и экстрагирующего раствора не ограничивается конкретным значением. В одном предпочтительном варианте осуществления отношение (в/о) семян сои и второго экстрагирующего раствора составляет от около 1:1 до около 1:30; более предпочтительно от около 1:5 до около 1:20 и наиболее предпочтительно около 1:10.

Температура экстрагирования на этапе (ii) в соответствии с изобретением ниже около 110°С; предпочтительно от около 60°С до около 110°С.

В одном предпочтительном варианте осуществления этап экстрагирования (ii) может быть повторен, и паровую фракцию семян сои собирают путем объединения.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения паровая фракция семян сои подвергается анализу методом ионной хроматографии с использованием колонки CarboPac РА1 Analytical (4×250 мм). Подвижная фаза состоит из 87% воды и 13% 500 мМ NaOH; внутренний стандарт - моногидрат мальтозы. Изократическое элюирование применяется с низкой скоростью 1,0 мл/мин и циклом 0,5 секунды. В каждом цикле анализ выполняется с относительным потенциалом 0,1 В с 0,00 секунды до 0,2 секунды; 0,1 В при с 0,2 секунды до 0,4 секунды; -2,0 В с 0,41 до 0,42 секунды; 0,6 В в 0,43 секунды; -0,1 В с 0,44 секунды до 0,5 секунды, и полная продолжительность анализа составляет 55 минут.

Полученные спектрограммы приведены на Фиг. 4-6. Время пика приведено в таблице 2.

В одном варианте осуществления изобретения содержание экстракта семян сои в расчете на массу композиции экстракта составляет от около 0,001 мас. % до около 10 мас. %; предпочтительно от около 0,01 мас. % до около 5 мас. %; более предпочтительно от около 0,001 мас. % до около 1,5 мас. %. В другом аспекте содержание паровой фракции семян сои в расчете на массу композиции экстракта составляет от около 0,04 мас. % до около 99,999 мас. %; предпочтительно от около 10 мас. % до около 99,9 мас. %; более предпочтительно от около 30 мас. % до около 99% массе.

Композиция экстракта в соответствии с изобретением предпочтительно представляет собой фармацевтическую композицию, пищевую композицию или косметическую композицию.

Фармацевтическая композиция в соответствии с изобретением предпочтительно применяется местно или системно любым способом, известным в данной области, включая, но не ограничиваясь, внутримышечным, внутрикожным, внутривенным, подкожным, внутрибрюшинным, интраназальным, пероральным, мукозальным или наружным путем. Соответствующий путь, лекарственная форма и схема введения могут быть определены специалистами в данной области. В настоящем изобретении фармацевтическая композиция может быть получена в различных формах в соответствии с соответствующим способом введения, таких как жидкий раствор, суспензия, эмульсия, сироп, таблетка, драже, капсула, состав с замедленным высвобождением, порошок, гранула, ампула, раствор для инъекций, раствор для вливания, набор, мазь, лосьон, жидкая мазь, крем или их комбинация. При необходимости она может быть стерилизована или смешана с любым фармацевтически приемлемым носителем или вспомогательным веществом, многие из которых известны специалистам в данной области.

Наружный способ, используемый в настоящем документе, также известен как местное введение, включая, но не ограничиваясь, введение путем инсуффляции и ингаляции. Примеры различных типов препаратов для местного введения включают мази, лосьоны, кремы, гели, пены, препараты для доставки посредством трансдермальных пластырей, порошки, спреи, аэрозоли, капсулы или кассеты для применения в ингаляторах или инсуфляторах или капли (напр., глазные капли или капли для носа), растворы/суспензии для распыления, суппозитории, вагинальные суппозитории, удерживающие клизмы и жевательные или рассасываемые таблетки или микросферы, липосомы или микрокапсулы.

Мази, кремы и гели могут быть приготовлены, например, на водной или масляной основе с добавлением подходящего загустителя и/или гелеобразователя, и/или растворителей. В связи с этим такие основания могут, например, включать воду и/или масло, такое как вазелиновое масло или растительное масло, такое как арахисовое масло или касторовое масло, или растворитель, такой как полиэтиленгликоль. Загустители и гелеобразователи, которые можно использовать в соответствии с характером основы, включают мягкий парафин, стеарат алюминия, цетостеариловый спирт, полиэтиленгликоли, ланолин, пчелиный воск, карбоксиполиметилен и производные целлюлозы, и/или моностеарат глицерина, и/или неионогенные эмульгаторы.

Лосьоны могут быть приготовлены на водной или масляной основе и в целом также содержат один или несколько эмульгаторов, стабилизаторов, диспергаторов или загустителей.

Порошки для наружного применения могут приготовлены с использованием любой подходящей основы порошка, например, талька, лактозы или крахмала. Капли могут быть приготовлены на водной или неводной основе и также содержать один или несколько диспергаторов, растворителей, суспендирующих средств или консервантов.

Композиции для местного введения в нос могут быть, например, приготовлены как водные растворы или суспензии или как аэрозоли в упаковках, находящихся под давлением, таких как дозирующий ингалятор, с применением подходящего сжиженного газа-вытеснителя. Аэрозольные композиции, подходящие для ингаляции, могут представлять собой суспензию или раствор. Аэрозольная композиция может дополнительно содержать дополнительные вспомогательные вещества, хорошо известные в данной области техники, такие как поверхностно-активные вещества, напр., олеиновая кислота или лецитин, и сорастворители, напр., этанол.

Средства местного применения могут быть введены путем одного или нескольких нанесений в сутки на пораженную область; преимущественно могут быть использованы окклюзионные повязки, превышающие по площади области кожи. С помощью адгезивной резервуарной системы можно добиться непрерывной или пролонгированной доставки.

Косметическая композиция в соответствии с изобретением может представлять собой водосодержащий состав, состоящий по существу из воды; она также может включать смесь воды и водорастворимого растворителя (растворимость в воде больше 50 мас. % при 25°С), например, низших одноатомных спиртов, содержащих от 1 до 5 атомов углерода, таких как этанол или изопропанол, гликолей, содержащих от 2 до 8 атомов углерода, таких как пропиленгликоль, этиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль или дипропиленгликоль, кетонов С3-С4 и альдегидов С2-С4 и глицерина. Такие водосодержащие составы приготавливают в виде водорастворимого геля или гидрогеля. В состав гидрогеля входит загуститель для загущения жидкого раствора. Примеры загустителей включают, но не ограничиваются, карбомеры, материалы на основе целлюлозы, камеди, альгин, агар, пектины, каррагинан, желатин, минеральные или модифицированные минеральные загустители, полиэтиленгликоль и многоатомные спирты, полиакриламид и другие полимерные загустители. Предпочтительно использовать загустители, которые обеспечивают стабильность и оптимальные вязкостные свойства композиции.

Косметическая композиция в соответствии с настоящим изобретением приготовлена в виде эмульсии или крема. Она может содержать эмульгирующие поверхностно-активные вещества. Эти поверхностно-активные вещества могут быть выбраны из анионогенных и неионогенных поверхностно-активных веществ. Можно сделать ссылку на документ Encyclopedia of Chemical Technology, Kirk-Othmer", volume 22, pp. 333-432, 3rd edition, 1979, Wiley для определения свойств и функций (эмульгирующих) поверхностно-активных веществ, в частности, на стр. 347-377 указанного источника в отношении анионогенных и неионогенных поверхностно-активных веществ.

Поверхностно-активные вещества, предпочтительно используемые в косметической композиции в соответствии с изобретением, выбраны из: неионогенных поверхностно-активных веществ - жирных кислот, жирных спиртов, полиэтоксилированных или полиглицеролированных жирных спиртов, таких как полиэтоксилированный стеариловый или цетилстеариловый спирт, сложных эфиров жирных кислот и сахарозы, сложных эфиров алкилглюкозы, в частности, полиоксиэтиленированных сложных эфиров жирных кислот и алкилглюкозы С1-С6, и их смесей; анионогенных поверхностно-активных веществ - жирных кислот С16-С30, нейтрализованных аминами, водным раствором аммиака или щелочными солями, и их смесей. Предпочтительно используются поверхностно-активные вещества, которые обеспечивают возможность получения эмульсии типа "масло в воде" или "воск в воде".

Косметическая композиция в соответствии с изобретением может далее включать эффективное количество физиологически приемлемого антиоксиданта, выбранного из группы, включающей бутилированный п-крезол, бутилированный монометиловый эфир гидрохинона и токоферола.

Косметическая композиция в соответствии с изобретением может далее включать натуральную или модифицированную аминокислоту, натуральное или модифицированное стериновое соединение, натуральный или модифицированный коллаген, белок шелка или соевый белок.

Косметическая композиция в соответствии с изобретением предпочтительно приготавливается для местного применения на кератиновые поверхности, такие как кожа, волосы, ресницы или ногти. Они могут находиться в любой форме, используемой для данного типа применения, в частности, в форме водного или масляного раствора, эмульсии типа "масло в воде" или "воск в воде", силиконовой эмульсии, микроэмульсии или наноэмульсии, водного или масляного геля, или жидкого, пастообразного или твердого безводного продукта.

Косметическая композиция в соответствии с изобретением может быть более или менее жидкой и иметь внешний вид белого или цветного крема, мази, молочка, лосьона, сыворотки, пасты, мусса или геля. Она может дополнительно наноситься на кожу в виде аэрозоля, пластыря или порошка. Она также может находиться в твердой форме, например, в форме палочки. Она может быть использована в качестве средства для ухода и/или в качестве косметического средства для кожи. В альтернативном варианте она может быть приготовлена в виде шампуней или кондиционеров.

Известным образом композиция изобретением может также содержать добавки и вспомогательные вещества, распространенные в косметической области, такие как гидрофильные или липофильные гелеобразователи, консерванты, растворители, ароматизаторы, наполнители, пигменты, поглотители запаха и красители.

Композиция может быть добавлена в стандартную пищевую композицию (т.е. годную к употреблению пищу или напиток или их предшественники) в процессе производства пищевой композиции. Композиция экстракта изобретения может быть добавлена практически во все пищевые композиции. Пищевые композиции, в которые может быть добавлена композиция экстракта изобретения, включают, но не ограничиваются, конфеты, мучные изделия, мороженое, молочные продукты, сладости, батончики, заменители пищи, блюда быстрого приготовления, супы, пасты, лапшу, консервы, замороженные пищевые продукты, обезвоженные пищевые продукты, охлажденные пищевые продукты, масла и жиры, детское питание или легкую пищу на хлебцах или их сочетания.

Настоящее изобретение также предлагает использование композиции экстракта, как указано выше, в производстве лекарственного средства для стимуляции заживления ран.

Изобретение предлагает способ стимуляции заживления ран у пациента, нуждающегося в такой стимуляции, включающий введение указанному пациенту эффективного количества композиции экстракта, как указано выше, и дополнительно фармацевтически приемлемого носителя или вспомогательного вещества.

Предпочтительно композиция экстракта в соответствии с изобретением стимулирует заживление раны посредством стимуляции миграции клеток кожи. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция экстракта способна стимулировать миграцию кератиноцитов, и клетка кожи предпочтительно представляет собой кератиноцит. В другом аспекте в животной модели в соответствии с применением композиция экстракта способна стимулировать заживление раны у пациента с диабетом, и рана предпочтительно представляет собой диабетическую рану.

В одном варианте осуществления изобретения композиция, включающая экстракт семян сои и паровую фракцию семян сои, оказывает значимый эффект (р<0,5) при закрытии раны по сравнению с основой для крема, а экстракт семян сои демонстрирует незначительно лучший исход закрытия раны, чем паровая фракция семян сои.

В другом варианте осуществления изобретения различные уровни дозы экстракта семян сои использованы в сочетании с паровой фракцией семян сои для исследования действия при лечении диабетических ран. Результаты демонстрируют, что для заживления раны комбинированный эффект экстракта семян сои и паровой фазы семян сои превосходит эффект паровой фракции семян сои в отдельности. Было установлено, что наиболее эффективное комплексное лечение достигается при максимальной дозировке экстракта семян сои.

В одном варианте осуществления изобретения экстракт семян сои и паровая фракция семян сои используются по отдельности или в комбинации для анализа эффектов стимуляции миграции кератиноцитов кожи. Результаты демонстрируют, что для стимуляции миграции кератиноцитов кожи комбинированный эффект экстракта семян сои и паровой фазы семян сои превосходит эффект паровой фракции семян сои в отдельности.

Настоящее изобретение также предлагает использование композиции экстракта, как указано выше, в производстве лекарственного средства для стимуляции пролиферации нейронов и/или лечения заболеваний головного мозга и/или нейродегенеративных заболеваний.

Изобретение также предлагает способ стимуляции пролиферации нейронов и/или лечения заболеваний головного мозга и/или нейродегенеративных заболеваний у пациента, нуждающегося в такой стимуляции и/или лечении, включающий введение указанному пациенту эффективного количества композиции экстракта, как указано выше, и дополнительно фармацевтически приемлемого носителя или вспомогательного вещества.

Предпочтительно нейрон представляет собой клетку центральной нервной системы; более предпочтительно нейрон головного мозга; еще более предпочтительно а клетку нейробластомы.

Заболевания головного мозга и/ил и нейродегенеративные заболевания в соответствии с изобретением предпочтительно выбраны из группы, включающей сосудистую деменцию, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, заболевание сосудов мозга, воспалительное повреждение головного мозга, повреждение головного мозга, связанное с воспалительной реакцией, поражения головного мозга, церебральную гематому, отек желудочка и дилатацию желудочка.

В одном варианте осуществления изобретения экстракт семян сои, паровая фракция семян сои и композиция экстракта, включающая экстракт семян сои и паровую фракцию семян сои, используется для лечения клеток нейробластомы человека. Результаты показывают, что уровень жизнеспособности клеток после лечения экстрактом семян сои, паровой фракцией семян сои и композицией экстракта, включающей экстракт семян сои, паровую фракцию семян сои, значимо вырос. В связи с этим экстракт семян сои, паровая фракция семян сои и композиция экстракта, включающая экстракт семян сои и паровую фракцию семян сои, оказывает действие на стимуляцию пролиферации нейронов.

В другом варианте осуществления изобретения в тесте с радиальным лабиринтом крысиной модели деменции после лечения композицией экстракта, включающей экстракт семян сои и паровую фракцию семян сои, общее количество ошибок и ошибок долговременной памяти было значительно ниже, чем в группе, не получавшей лечения. Это показывает, что композиция экстракта, включающая экстракт семян сои и паровую фракцию семян сои, оказывает действие на лечение деменции у крыс.

В другом варианте осуществления изобретения в тесте с радиальным лабиринтом крысиной модели деменции после лечения композицией экстракта, включающей экстракт семян сои и паровую фракцию семян сои, общее количество ошибок и ошибок долговременной памяти было значительно ниже, чем в группе, не получавшей лечения. Это показывает, что композиция экстракта, включающая экстракт семян сои и паровую фракцию семян сои, оказывает действие на лечение деменции у крыс.

В модели сосудистой деменции результаты показывают, что нарушение памяти, вызванное сосудистой деменцией, значительно улучшается после лечения композицией экстракта в соответствии с изобретением. Как паровая фракция семян сои, так и композиция экстракта, включающая экстракт семян сои и паровую фракцию семян сои, снижают ошибки рабочей памяти, ошибки долговременной памяти и общее количество ошибок. По сравнению с паровой фракцией семян сои в отдельности композиция экстракта, включающая экстракт семян сои и паровую фракцию семян сои, оказывает лучшее действие при лечении нарушения памяти, вызванного сосудистой деменцией.

Настоящее изобретение также предлагает использование композиции экстракта, как указано выше, для производства лекарственного средства для лечения рака молочной железы.

Изобретение также предлагает способ стимуляции лечения рака молочной железы у пациента, нуждающегося в таком лечении, включающий введение указанному пациенту эффективного количества композиции экстракта, как указано выше, и дополнительно фармацевтически приемлемого носителя или вспомогательного вещества.

Предпочтительно рак молочной железы представляет собой рак молочной железы с мутантным типом р53.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения мутантный тип р53 клеточной линии рака молочной железы используется для созданий животной модели для моделирования ситуации в первичном очаге в целях наблюдения развития опухоли у мышей. В случае моделирования введения человеку вводят в различных концентрациях композицию экстракта в соответствии с настоящим изобретением. Результаты показывают, что композиция экстракта в соответствии с изобретением оказывает действие на ингибирование скорости развития опухоли у опухоленесущих мышей.

Настоящее изобретение также предлагает использование композиции экстракта, как указано выше, для производства лекарственного средства для уменьшения побочных эффектов лекарственных препаратов, воздействующих на репликацию ДНК и/или РНК, а также усиления фармакологических эффектов лекарственных препаратов, воздействующих на репликацию ДНК и/или РНК.

Изобретение также предлагает способ уменьшения побочных эффектов лекарственных препаратов, воздействующих на репликацию ДНК и/или РНК, а также усиления фармакологических эффектов лекарственных препаратов, воздействующих на репликацию ДНК и/или РНК у пациента, нуждающегося в таком уменьшении, включающий введение указанному пациенту эффективного количества композиции экстракта, как указано выше, и дополнительно фармацевтически приемлемого носителя или вспомогательного вещества.

Термин "препарат, воздействующий на репликацию ДНК и/или РНК", используемый в настоящем документе, относится к лекарственным препаратам, которые убивают опухолевые клетки, препятствуя процессу репликации ДНК и/или РНК, имеющему ключевое значение при митозе. Предпочтительно препараты, воздействующие на репликацию ДНК и/или РНК, представляют собой циклофосфамид, темозоломид, гексаметиламин, комплексы платины, блеомицин, винбластин, винкристин, паклитаксел, доцетаксел, антагонисты фолиевой кислоты, антагонисты пурина или антагонисты пиримидина.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения клеточная линия рака молочной железы используется для созданий животной модели для моделирования ситуации в первичном очаге. По сравнению с опухоленесущими мышами, которым вводили циклофосфамид, композиция экстракта в соответствии с изобретением оказывает усиливающее действие на препарат для химиотерапии в отношении ингибирования скорости развития опухоли у опухоленесущих мышей. Композиция экстракта в соответствии с изобретением ингибирует развитие опухоли, оказывает усиливающее действие на препарат для химиотерапии в отношении снижения размеров опухоли и облегчает боль за счет снижения компрессии опухоли, улучшая таким образом качество жизни пациента.

Следующие примеры приведены для помощи квалифицированным специалистам в данной области техники, которые хотели бы практиковать настоящее изобретение.

ПРИМЕРЫ

Экстракт семян сои (GMA1)

Семена сои (Glycine max (L.)Merr.) измельчали в порошок и применяли раствор с содержанием этанола 70 мас. % или дистиллированную воду в качестве экстрагирующего раствора; отношение (в/о) семян сои и экстрагирующего раствора составляло около 1:10. Семена сои экстрагировали при барометрическом давлении около 1 атм и при температуре около 45°С для получения неочищенного экстракта. Твердую фазу удаляли из неочищенного экстракта для получения жидкой фракции. Жидкую фракцию далее концентрировали с применением концентратора с пониженным давлением для получения твердой фракции. Концентрированную твердую фракцию далее высушивали при 70°С.

Паровая фракция семян сои (GMC1)

Семена сои (Glycine max (L.) Merr.) измельчали в порошок и применяли раствор с содержанием этанола 2 мас. % или дистиллированную воду в качестве второго экстрагирующего раствора; отношение (в/о) семян сои и второго экстрагирующего раствора составляло около 1:10. Паровую фракцию получали путем выпаривания семян сои в ротационном испарителе (EYELA N-1000S, 1000S-W) при давлении ниже 1 атм и температуре 90°С и пропускания через конденсационную трубку с подачей холодной воды.

Анализ экстракта семян сои (GMA1) и паровой фракции семян сои (GMC1)

Полученные экстракт семян сои (GMA1) и паровую фракцию семян сои (GMC1) подвергали анализу методом ионной хроматографии с использованием колонки CarboPac РА1 Analytical (4×250 мм). Подвижная фаза состояла на 87% из воды и на 13% из 500 мМ NaOH; внутренний стандарт - моногидрат мальтозы. Изократическое элюирование применяли с низкой скоростью 1,0 мл/мин и циклом 0,5 секунды. В каждом цикле анализ выполняли с относительным потенциалом 0,1 В с 0,00 секунды до 0,2 секунды; 0,1 В с 0,2 секунды до 0,4 секунды; -2,0 В с 0,41 секунды до 0,42 секунды; 0,6 В в 0,43 секунды; -0,1 В с 0,44 секунды до 0,5 секунды, и полная продолжительность анализа составляла 55 минут.

Спектрограммы экстракта семян сои (GMA1) приведены на Фиг. 1-3. Время пика приведено в таблице 1.

Спектрограммы паровой фракции семян сои (GMC1) приведены на Фиг. 4-6. Время пика приведено в таблице 2.

Экстракт семян сои (GMA1) содержит очень малое количество изофлавонов, а паровая фракция семян сои (GMC1) не содержит изофлавоны

Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) использовали для анализа экстракта семян сои (GMA1) и паровой фракции семян сои (GMC1), содержащих изофлавоны.

Параметры ВЭЖХ перечислены ниже: Устройство: Hitachi HPLC серии СМ5000; насос: СМ5110; детектор: СМ5430 (DAD); система автоматической подачи: СМ5210; термостат колонки: СМ5310; программное обеспечение: OpenLab.

Колонка: ОФ С18, 4,6×250 мм, 5 мкм; длина волны детектирования: УФ-254 нм; расход: 0,8 мин/мл; температура термостата колонки: 30°С; градиент: как указано в таблице 3.

Спектрограмма ВЭЖХ стандарта изофлавонов приведена на Фиг. 7, а пики возникали при времени удерживания 18,853 минут и 24,693 минуты.

Спектрограмма ВЭЖХ паровой фракции семян сои (GMC1) приведена на Фиг. 8, и пики не возникали.

Спектрограмма ВЭЖХ мази, содержащей 0,3 части по массе экстракта семян сои (GMA1) и 1 часть по массе паровой фракции семян сои (GMC1), приведена на Фиг. 9, и пики возникали при времени удерживания 17,307 минут, 19,313 минут, 20,267 минут, 20,853 минут, 24,307 минут и 25,247 минут.

Сравнение Фиг. 7-9 показывает, что пики не возникают на спектрограмме ВЭЖХ паровой фракции семян сои (GMC1) на Фиг. 8, и соответственно паровая фракция семян сои (GMC1) не содержит изофлавоны; пики, соответствующие пикам абсорбции изофлавонов в области отпечатков пальцев, возникают в очень малых количествах на спектрограмме ВЭЖХ композиции экстракта, содержащей 0,3 части по массе экстракта семян сои (GMA1) и 1 часть по массе паровой фракции семян сои (GMC1), на Фиг. 9. После пересчета содержание дайдцина составляет 4,8 мкг/мл, а содержание генистина составляет 8,23 мкг/мл, и эти значения очень далеки от фармацевтически эффективного количества изофлавонов. В связи с этим экстракт семян сои (GMA1) содержит лишь очень малое количество изофлавонов, и их фармакологическое действие не проявляется в связи с очень малым количеством изофлавонов. Композиция экстракта для стимуляции заживления ран Материалы и методы:

Самцы крыс возрастом приблизительно 8 недель с весом тела в диапазоне от 250 г до 300 г были получены из центра National Laboratory Animal Center, Тайвань. Через 7 суток карантина отбирали крыс с весом тела более 350 г. Крыс маркировали щипцами для выщипа на ушах. Каждую клетку маркировали с присвоением номера клетки, номера исследования, пола и имени группы. Крыс держали по 2 в клетке в поликарбонатных клетках в виварии, аккредитованном AAALAC.

Поддерживали следующие условия окружающей среды: температура -21±2°С; влажность - 50±20%; светотемновой цикл - 12 часов света и 12 часов темноты. К корму для лабораторных грызунов 5001 (PMIR Nutrition International, Inc., MO, USA) предоставляли свободный доступ на протяжении всего периода исследования. К водопроводной воде предоставляли свободный доступ через поилки, закрепленные на клетках.

Методики проведения экспериментов:

Образцы (испытываемые препараты) приготавливали в соответствии с таблицей 4.

CGS-21680: специфический агонист рецептора аденозина подтипа A2A, приготовленный путем добавления 1,67 мг CGS-21680 в 248,4 г основы для крема.

Крысы с диабетом: крысам с весом тела более 300 г вводили одну дозу стрептозотоцина (СТЗ, 65 мг/кг) путем внутривенного введения. СТЗ-индуцированные крысы с высоким уровнем сахара в крови (более 300 мг/дл) в течение 2 месяцев отбирали для проведения испытаний закрытия раны.

Нанесение травм для крыс с диабетом: крыс с диабетом с весом тела меньше 300 г исключали, остальных рандомизировали с распределением по 6 группам. Затем крыс анестезировали пентобарбиталом и удаляли шерсть в операционном поле (в области спины). У каждой крысы иссекали три участка кожи (по всей толщине) в средней области спины (в 4, 6 и 8 см от средней точки между лопатками) с использованием круглого скальпеля.

Лекарственная терапия и измерения закрытия рамы: Раз в двое суток животных взвешивали и измеряли площадь ран для оценки закрытия раны. Лекарственные средства наносили на каждую рану два раза в сутки с закрытием раны марлей. На шею крыс надевали воротники для предотвращения расцарапывания ран животными. Для измерения закрытия ран делали снимки ран в 4, 6, 8, 10, 12 и 14 сутки. При выполнении снимков рядом с ранами размещали стандартную линейку. Перед анализом ран с использованием Image pro (Media cybernetics) длина была стандартизирована по стандартной линейке на снимке в целях исключения ошибок, связанных с различными расстояниями съемки.

Анализ данных и статистика: Три участка раны на спинах крыс анализировали с применением ПО Image pro. Исходными площадями ран являлись площади в нулевые сутки. Из исходных площадей ран вычитали площади ран в различные моменты времени и делили разность на исходные площади ран для получения процента закрытия ран. Среднее из трех процентных значений закрытия раны каждой крысы представляет закрытие раны каждой крысы. Данные были представлены как среднее значение ± стандартная ошибка (СОС). Р-значения результатов испытаний рассчитывали с использованием критерия Стьюдента в статистическом программном обеспечении (SYSTAT, Systat software Inc). Р<0,05 означают наличие значимого различия и обозначены *. Р<0,01 означают наличие очень значимого различия и обозначены **. Р<0,001 означают наличие исключительно значимого различия и обозначены ***.

Результат:

После лечения площади ран измеряли в различных временных точках и анализировали проценты закрытия ран с применением статистического программного обеспечения, приведенные в таблице 5 и на Фиг. 10. На 4 сутки проценты закрытия ран для групп основы для крема, CGS-21680, GMC1 и 0,3% GMA1 составляют - 83,33±6,60 (%), 21,87+5,61 (%), -11,44±4,34 (%) и -7,09±3,65 (%) соответственно. Все группы лечения показывали значимое отличие от группы основы для крема на протяжении всего периода эксперимента. На 8-10 сутки значения процента закрытия раны были наиболее выраженными в группах лечения GMC1 и 3% GMA1, изменяясь от -4,10+3,04 (%) до 40,15±6,47 (%) и от 21,21±5,52 (%) до 62,19±3,85 (%) соответственно. На 14 сутки значения процента закрытия раны GMC1 и 3% GMA1 значительно возрастали: 86,20±1,88 (%) и 91,21±2,23(%) соответственно, в том числе по сравнению с основой для крема 58,92+13,14 (%).

Результаты показали, что 0,3% GMA1 и GMC1 эффективны в отношении закрытия раны по сравнению с основой для крема, а группа, получавшая лечение 0,3% GMA1, показала незначительно лучший результат закрытия раны, чем GMC1.

Была исследована оптимальная комбинация GMA1 и GMC1 для стимуляции закрытия раны. Различные уровни дозы GMA1, 0,009%, 0,045% и 0,09% использовали в сочетании с GMC1. Для сравнения также были включены группы основы для крема и CGS-21680.

После лечения площади ран измеряли в различных временных точках и анализировали проценты закрытия ран с применением статистического программного обеспечения, приведенные в таблице 6 и на Фиг. 11. Как показано в таблице 6 и на Фиг. 11, при сравнении с группами основы для крема наблюдается повышение статистической значимости с увеличением уровней дозы GMA1 в группах комбинированного препарата 0,009%, 0,045% и 0,09% GMA1. Результаты показывают, что для лечения ран комплексное действие уровней дозировки 0,009%, 0,045% и 0,09% GMA1 с GMC1 было эффективнее, чем действие GMC1 в отдельности. Было установлено, что наиболее эффективное комплексное лечение достигается при максимальной дозировке GMA1 (0,09%).

Композиция экстракта для стимуляции миграции клеток кожи

Клетки НаСаТ (кератиноциты кожи человека) использовали для анализа действия композиции экстракта на стимуляцию миграции клеток кожи.

Использовали следующие образцы анализа миграции клеток кожи:

А1-0.3: содержащий 0,3 мкг/мл GMA1

A1-0.3-CSTC-2500X: содержащий 2500-кратно разбавленный GMC1 и 03 мкг/мл GMA1

Клеточная линия: НаСаТ

Среда: DMEM, содержащая 10% фетальную бычью сыворотку

Положительный контроль: CGS-21680

Культивирование клеток: клетки НаСаТ культивировали в среде DMЕМ, содержащей 10% фетальную бычью сыворотку при 37°С и 5% CO2, и субкультивировали два раза в неделю.

Анализ заживления ран: использовали набор для анализа миграции клеток Oris. Клетки помещали в 96-луночный планшет (4×104 клеток/лунка) с пробкой и культивировали в CO2-инкубаторе. После культивирования в течение ночи пробку извлекали для образования ран и добавляли новую среду или среду, содержащую испытываемые препараты или CGS-21680 (положительный контроль). После лечения в течение 0, 16 и 24 часов клетки наблюдали под оптическим микроскопом со 100-кратным увеличением и делали фотографии для контроля заживления ран.

Анализ: для количественного определения площади заживления ран использовали программное обеспечение image j. Площадь в 0 час была принята в качестве исходного размера раны. По истечении определенного периода времени площадь раны постепенно снижалась, а степень заживления раны количественно оценивали путем расчета площади раны по отношению к исходной площади в 0 час (степень заживления = разница между площадью во временной точке Т16 или Т24 и площадью в Т0/Т0) для оценки действия препаратов на активность миграции клеток НаСаТ.

Статистика: для каждой группы повторяли по крайней мере четыре раза. Данные были представлены как среднее значение ± стандартная ошибка (СОС). Значимость результатов испытаний рассчитывали по критерию Стьюдента.

Результат:

анализ миграции клеток НаСаТ использовали для сравнения действия GMC1 и GMA1 на стимуляцию заживления ран. Действие комбинации 2500-кратно разбавленного GMC1 и 0,3 мкг/мл GMA1 (A1-0.3-CSTC-2500X) превосходит действие А1-0.3 в отдельности в отношении стимуляции миграции клеток НаСаТ (Фиг. 12).

Композиция экстракта для стимуляции пролиферации нейронов

Материалы и методы:

Клеточная линия: клетки нейробластомы человека IMR-32 (приобретено в Food Industry Research and Development Institute, Тайвань)

Реактивы: DMEM/среда с высоким содержанием глюкозы HyClone™ (Thermo Scientific), фетальная бычья сыворотка (ФБС, Gibco®), фосфатно-солевой буфер HyClone® (ФСБ, Thermo Scientific), раствор антибиотиков и антигрибковых средств (пенициллин/стрептомицин/фунгизон 100х; Thermo Scientific), трипановый синий, 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолбромид (МТТ) и диметилсульфоксид (ДМСО, Sigma).

Оборудование: шкаф с ламинарным потоком (VERTICAL HF-4BH).

Культивирование клеток: клетки IMR-32 культивировали в DMEM/среде с высоким содержанием глюкозы (HyClone™) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки при 37°С в увлажненном воздухе с 5% CO2.

Клетки IMR-32 засевали в 96-луночный планшет с плотностью 5×104 со 100 мкл среды культивирования с добавлением 10% ФБС в течение 24 часов. После дозирования среду культивирования изменяли на 100 мкл среды с добавлением 5% ФБС для каждой группы добавляли 25 мг/мл GMC1, 25 мг/мл GMA1, GMC1+0,3% GMA1 (GM) или ФСБ (группа контроля) и 100 мкл среды с добавлением 10% ФБС (группа положительного контроля). Для каждой группы образцы помещали по крайней мере в семи повторностях в 96-луночный планшет и инкубировали в течение 72 часов для МТТ-теста.

МТТ-тест: чашки для культивирования извлекали из инкубатора и переносили в шкаф с ламинарным потоком. Среду заменяли на 100 мкл бессывороточной среды с 0,5 мг/мл реактива МТТ для каждой лунки и инкубировали в течение 30-60 минут. В каждую лунку добавляли равный объем ДМСО и встряхивали в течение 5 минут. Коэффициент поглощения измеряли при 570 нм в ИФА-ридере.

Анализ данных и статистика: результаты анализировали с применением программного обеспечения GraphPad Prism 6, для статистического анализа использовали критерий Стьюдента. Приведенные данные представляли процент жизнеспособности клеток ± СОС.

Результаты:

уровень жизнеспособности клеток приведен в таблицах 7-9 и на Фиг. 13-15. Уровень жизнеспособности клеток значимо повышался после обработки 25 мг/мл GMA1 (таблица 7 и Фиг. 13), 25 мг/мл GMC1 (таблица 8 и Фиг. 14) или GMC1+0,3% GMA1 (GM, таблица 9 и Фиг. 15) по сравнению с группой контроля ФСБ.

Композиция экстракта для лечения заболеваний головного мозга и/или нейродегенеративных заболеваний

(I) Индуцированная деменция:

Материалы и методы:

Самцы крыс возрастом приблизительно 6 недель с весом тела в диапазоне от 250 г до 300 г были получены из BioLASCO, Тайвань. Через 7 суток карантина отбирали крыс с весом тела более 300 г. Крыс маркировали путем нанесения татуировок на хвост. Каждую клетку маркировали с присвоением номера клетки, номера исследования, пола и имени группы. Крыс держали по 2 в клетке в поликарбонатных клетках в виварии.

Поддерживали следующие условия окружающей среды: температура -25±1°С; влажность - 60+5%; светотемновой цикл - 12 часов света и 12 часов темноты. К корму Altromin 1324 FORTI (Германия) предоставляли свободный доступ на протяжении всего периода исследования. К водопроводной воде предоставляли свободный доступ через поилки, закрепленные на клетках.

Группы приведены в таблице 10.

Индукция деменции:

Крыс возрастом восемь недель кормили с пероральным введением раз в сутки 15 мг/мл раствора AlCl3 с дозировкой 100 мг/кг на протяжении 11 недель для индуцирования мимических симптомов деменции. Крыс разделяли на группы, как указано в таблице 10, и испытываемые препараты местно наносили на область головы и шеи с втиранием в течение 30 секунд и на слизистую оболочку носа с 5 недели до 11 недели. Обучение начинали на 11 неделе, и способности памяти далее оценивали в радиальном лабиринте на 11 неделе. Крысы непрерывно получали с кормом AlCl3 в процессе лечения.

Радиальный лабиринт: Радиальный лабиринт является одним из наиболее распространенных способов измерения пространственного обучения и памяти у крыс. Радиальный лабиринт был разработан Олтоном в 1970-х гг. Он основан на принуждении голодных крыс к поиску пищи в конце каждого рукава, обучая их запоминать места нахождения пищи в лабиринте с течением времени. С его помощью возможно измерение рабочей памяти (именуемой кратковременной памятью) и справочной памяти (именуемой долговременной памятью) крыс одновременно. Радиальный лабиринт показан на Фиг. 16. Размеры: (А) 122 см; (В) 47 см; (С) 30 см; (D) 10 см; (Е) 20 см.

Крыс приучали к условиям опыта на протяжении 1 недели. Каждую крысу взвешивали и не давали корм на протяжении 24 часов. Перед экспериментом вес тела крыс поддерживали на уровне 80-85% от исходного веса тела; давали 60% от нормального рациона после ежесуточного обучения (два раза в сутки). В 1 сутки и 2 сутки приманки раскладывали по рукавам и центральной платформе. Четырех крыс одновременно помещали на центральную платформу и давали исследовать лабиринт в течение 10 минут. В 3 и 4 сутки приманки размещали в конце каждого рукава. Каждую крысу по отдельности помещали на центральную платформу и позволяли исследовать лабиринт, пока в нем не оставалось корма. Если крыса не съедала весь корм за 10 минут, обучение останавливали. В 5-14 сутки приманки размещали в конце четырех закрепленных рукавов. Каждую крысу помещали на центральную платформу и позволяли исследовать лабиринт, пока в четырех рукавах не оставалось корма. Если крыса не съедала весь корм за 10 минут, обучение останавливали. Записи для рукавов регистрировали и анализировали автоматически. Каждую крысу обучали по два раза каждые сутки с часовым перерывом между двумя сеансами обучения. Анализировали следующие три показателя:

А. Ошибки рабочей памяти (кратковременной памяти) (ОРП) - количество повторных входов в рукава с приманками.

Б. Ошибки справочной памяти (долговременной памяти) (ОДП) - количество повторных входов в рукава без приманок.

В. Общее количество ошибок (ОКО) - ОРП+ОДП

Эти три показателя определяют способности к обучению и памяти крыс и существенно возрастают в соответствии с уровнем повреждения головного мозга.

Анализ данных и статистика: Для статистического анализа использовали критерий Стьюдента и дисперсионный анализ повторных измерений. Данные приведены в виде средних значений ± СОС каждой группы. Данные группы AlCl3 сравнивали с показателями здоровой группы для расчета статистической значимости. Данные группы AlCl3 сравнивали с показателями группы AlCl3+N2 для расчета статистической значимости. Если р<0,05, результат обозначали *. Если р<0,01, результат обозначали **.

Результаты:

Было установлено, что индуцированная тяжелыми металлами деменция аналогична болезни Альцгеймера. В обоих случаях индуцируется образование белков-предшественников амилоида, что приводит к образованию сенильных бляшек и нейрофибриллярных клубков. В связи с этим нами были использованы крысы с индуцированной тяжелыми металлами деменцией в качестве животной модели для определения действия композиции экстракта, содержащей экстракт семян сои и паровую фракцию семян сои, в отношении заболеваний, аналогичных болезни Альцгеймера. Результаты показаны на Фиг. 17-19. Со ссылкой на Фиг. 17 траектория движения крыс на 17 сутки свидетельствует о том, что группа AlCl3+N2 была способна добираться до расположения приманок благодаря памяти после обучения, а крысы из группы AlCl3 и группы AlCl3 + основа для крема не были на это способны. Со ссылкой на Фиг. 18 значения ОКО группы AlCl3 и группы AlCl3 + основа для крема не показывают значимого различия (р>0,05), а значения ОКО на 4 сутки после лечения композицией экстракта, включающей экстракт семян сои и паровую фракцию семян сои, были значительно ниже, чем для группы AlCl3 (AlCl3+N2p=0,0128). Это показывает, что композиция экстракта, включающая экстракт семян сои и паровую фракцию семян сои, оказывает действие на лечение деменции у крыс. Со ссылкой на Фиг. 19 значения ОДП группы AlCl3 и группы AlCl3 + основа для крема не показывают значимого различия (р>0,05), а значения ОКО на 4 сутки после лечения композицией экстракта, включающей экстракт семян сои и паровую фракцию семян сои, были значительно ниже, чем для группы AlCl3 (р=0,0046). Это показывает, что композиция экстракта, включающая экстракт семян сои и паровую фракцию семян сои, оказывает действие на восстановление долговременной памяти у крыс. Результаты показывают, что количество ошибок группы AlCl3 значимо выше, чем для контрольной группы в тесте с радиальным лабиринтом, что свидетельствует об успешной индукции деменции у крыс с помощью AlCl3. Нарушение долговременной памяти также значимо улучшилось после лечения композицией экстракта, включающей экстракт семян сои и паровую фракцию семян сои. Это показывает, что композиция экстракта, включающая экстракт семян сои и паровую фракцию семян сои, оказывает действие на лечение деменции у крыс.

(II) Сосудистая деменция:

Материалы и методы:

Группы приведены в таблице 11.

Параметры крыс и вивария соответствовали описанным выше (I) для индуцированной деменции.

Крыс анестезировали смесью 1:1,5 кетамин-ромпун (0,1 мл/100 г, в/б) и фиксировали на хирургическом столике. Обе общие сонные артерии обнажали посредством срединного шейного разреза в задней части шеи и выполняли двустороннее лигирование шелковой хирургической нитью. Рамы ушивали и крыс помещали под теплый свет до восстановления.

Основу для крема (М), GMC1(M1) и GMC1+0,5%GMA1 (М3) местно наносили (2 г/крыса) на область головы и шеи с втиранием в течение 30 секунд, также на слизистую оболочку носа. Лечение продолжали в течение четырех недель, и память крыс измеряли с использованием радиального лабиринта на протяжении последних двух недель. Тест с радиальным лабиринтом соответствовал описанному выше (I) для индуцированной деменции.

Анализ данных и статистика: Для статистического анализа использовали критерий Стьюдента для одной выборки и двухфакторный дисперсионный анализ. Данные приведены в виде средних значений ± СОС каждой группы. Данные группы плацебо сравнивали с показателями группы 2VO для расчета статистической значимости. Получавшие лекарственный препарат группы сравнивали с группой 2VO для расчета статистической значимости. р<0,05 означают наличие значимого различия и обозначены *. р<0,01 означают наличие очень значимого различия и обозначены **. Результаты:

Количество ошибок в группе 2VO значимо выше, чем в группе плацебо (Фиг. 20-23), что свидетельствует об успешной индукции сосудистой деменции у крыс путем двустороннего лигирования сонной артерии, и нарушение памяти, вызванное сосудистой деменцией значительно улучшилось через две недели лечения М1 и М3. В соответствии с результатами компьютерной томографии головного мозга крыс с СД двусторонняя окклюзия обеих общих сонных артерий (2VO) вызывала отек, размягчение, гистолиз тканей головного мозг ил и даже образование тромбов, таким образом индуцируя деменцию. Повреждения головного мозга значимо снижались после лечения М1 и М3.

Композиция экстракта для лечения рака молочной железы и уменьшения побочных эффектов лекарственных препаратов, воздействующих на репликацию ДНК и/или РНК, а также усиления фармакологических эффектов лекарственных препаратов, воздействующих на репликацию ДНК и/или РНК

Материалы:

Клеточная линия и реактивы: MDA-MB-231 (приобретено в Food Industry Research and Development Institute, Тайвань); смесь пенициллин-стрептомицин-неомицин (100х), фетальная бычья сыворотка (ФБС) и среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко (DMEM), были приобретены в компании Gibco®; циклофосфамид (ЦФА, Endoxan®).

Виварий: Самки мышей возрастом приблизительно 6-8 недель BALB/cAnN.Cg-Foxn1nu/CrlNarl были получены из центра National Laboratory Animal Center, Тайвань. Поддерживали следующие условия окружающей среды: температура - 25±1°С; влажность - 60±5%; независимое кондиционирование воздуха; контролируемый световой цикл. К воде и корму предоставляли свободный доступ на протяжении всего периода исследования. Мышей содержали в соответствии со стандартной процедурой комитета по лабораторным животным.

Индукция опухоленесущих мышей: Клетки MDA-MB-231 (клетки рака молочной железы) культивировали до 5×106 клеток, клетки для введения самкам бестимусных мышей собирали с трипсином и ресуспендировали в растворе ФСБ для индукции опухоли. Опухоль у бестимусных мышей индуцировали путем подкожного введения 100 мкл клеточного раствора с последующим размещением в тех же клетках с нормальным рационом. Когда опухоль достигала размера около 300 мм3, мышей подвергали местному нанесению различных доз композиции экстракта и группировали в группу ЦФА и группу без ЦФА. Вес тела, аппетит, уровень сахара в крови и развитие размеров опухоли фиксировали раз в неделю для оценки внешнего вида нормального физиологического состояния бестимусных мышей в целях определения действия композиции экстракта.

Группировка опухоленесущих мышей и лечение: После достижения размера опухоли 300 мм3 мышей группировали, как указано в таблице 12. Препарат для химиотерапии (введение раз в неделю) вводили с композицией экстракта. Для группы лечения выполняли местное нанесение на участок опухоли, кожу вокруг опухоли и кожу всей спины с дозировкой 0,1 г/сутки. После лечения на протяжении 5 недель фиксировали вес тела, аппетит, уровень сахара в крови и развитие размера опухоли бестимусных мышей.

Клиническая оценка опухоленесущих мышей: Оценивали физиологическое состояние и размер опухоли опухоленесущих мышей, включая вес тела, аппетит, уровень сахара в крови и размер опухоли. Размер опухоли для оценки скорости развития опухоли рассчитывали следующим образом: объем опухоли (мм3)=ab2/2.

Результаты:

В модели опухоленесущих бестимусных мышей, индуцированных клетками рака молочной железы человека MDA-MB-231, после лечения композиции экстракта J1 и J2 демонстрируют эффективное ингибирование развития опухоли у бестимусных мышей (таблица 13 и Фиг. 25). При оценке физиологического состояния группы композиций экстракта демонстрируют улучшение аппетита и уровня сахара в крови.

В группе GMC1+0,5%GMA1 (БЕЗ ЦФА+L5) продемонстрировано, что композиция экстракта ингибирует развитие опухоли у бестимусных мышей (Фиг. 26).

По сравнению со здоровой группой оценивали физиологическое состояние и развитие опухоли группы с опухолью + препарат для химиотерапии (группа ЦФА), групп композиции экстракта + препарат для химиотерапии (ЦФА+L1 и ЦФА+L5). Со ссылкой на таблицу 14 и Фиг. 26 и 27 результаты групп ЦФА+L1 и ЦФА+L5 демонстрируют усиление действия препарата для химиотерапии в отношении уменьшения опухоли у опухоленесущих мышей, которым вводили препарат для химиотерапии, без отрицательного влияния на вес тела, среднее потребление корма и средний уровень сахара в крови (таблицы 15-17).

С клинической точки зрения одной из основных причин для отказа от противоопухолевой терапии является раковая боль, вызванная раком. Установлено, что раковая боль частично связана с опухолью, преимущественно она обусловлена воспалением и сдавлением нервов, вызванным инвазией опухоли во внутренние органы, периферические нервы и кости. Композиция экстракта может эффективно ингибировать развитие опухоли, а также частично подавлять раковую боль, вызванную раком, и полезна при лечении.

При том, что настоящее изобретение было описано в отношении конкретных вариантов осуществления, представленных выше, специалистам в данной области должен быть очевиден широкий ряд альтернативных вариантов изобретения, а также модификаций и изменений. Все такие альтернативные варианты, модификации и изменения также входят в объем настоящего изобретения.

1. Экстракт семян сои для стимуляции пролиферации нейронов и/или лечения заболеваний головного мозга и/или нейродегенеративных заболеваний, который приготовляют из семян сои и экстрагирующего раствора в виде воды или спиртового раствора, содержащего спирт в концентрации меньше чем 90 мас.%, посредством экстрагирования семян сои экстрагирующим раствором при барометрическом давлении меньше чем 1 атм и при температуре ниже чем 60°С, с получением неочищенного экстракта, при этом отношение веса к объему семян сои и экстрагирующего раствора составляет от 1:1 до 1:30, и удаления твердой фазы из неочищенного экстракта с получением жидкой фракции.

2. Экстракт по п. 1, приготовление которого завершают концентрацией жидкой фракции с получением концентрированной твердой фракции.

3. Экстракт по п. 2, в котором приготовление семян сои завершают сушкой концентрированной твердой фракции.

4. Композиция экстракта семян сои для стимуляции пролиферации нейронов и/или лечения заболеваний головного мозга и/или нейродегенеративных заболеваний, включающая экстракт семян сои по любому из пп. 1-3, которая дополнительно содержит паровую фракцию семян сои, которую получают из семян сои во втором экстрагирующем растворе в виде воды или спиртового раствора, содержащего спирт в концентрации меньше чем 15 мас.%, посредством экстрагирования семян сои вторым экстрагирующим раствором при барометрическом давлении меньше чем 1 атм и при температуре ниже чем 110°С и отбором паровой фракции, в котором отношение веса к объему семян сои и экстрагирующего раствора составляет от 1:1 до 1:30.

5. Композиция по п. 4, в которой спиртовый раствор используют в концентрации спирта меньше чем 5 мас.%.

6. Композиция по п. 4, которая содержит экстракт семян сои в количестве от 0,001 до 5 мас.% и паровую фракцию семян сои в количестве от 95 до 99,999 мас.%.

7. Способ получения экстракта семян сои по любому из пп. 1-3, включающий экстрагирование семян сои экстрагирующим раствором в виде воды или спиртового раствора, содержащего спирт в концентрации меньше чем 90 мас.%, при барометрическом давлении меньше чем 1 атм и при температуре ниже чем 60°С, с получением неочищенного экстракта, в котором отношение веса к объему семян сои и экстрагирующего раствора составляет от 1:1 до 1:30, и удаление твердой фазы из неочищенного экстракта с получением жидкой фракции.

8. Способ по п. 7, который завершают концентрацией жидкой фракции, с получением концентрированной твердой фракции.

9. Способ по п. 7, который завершают сушкой концентрированной твердой фракции.

10. Применение экстракта семян сои по любому из пп. 1-3 в производстве лекарственного средства при стимуляции пролиферации нейронов и/или лечении заболеваний головного мозга и/или нейродегенеративных заболеваний.

11. Применение по п. 10, в котором нейрон представляет собой клетку нейробластомы.

12. Применение по п. 10, в котором заболевания головного мозга и/или нейродегенеративные заболевания выбраны из группы, включающей сосудистую деменцию, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, заболевание сосудов мозга, воспалительное повреждение головного мозга, повреждение головного мозга, связанное с воспалительной реакцией, поражение головного мозга, церебральную гематому, отек желудочка и дилатацияю желудочка.

13. Применение композиции экстракта семян сои по любому из пп. 4-6 в производстве лекарственного средства при стимуляции пролиферации нейронов и/или лечении заболеваний головного мозга и/или нейродегенеративных заболеваний.

14. Применение по п. 13, в котором нейрон представляет собой клетку нейробластомы.

15. Применение по п. 13, в котором заболевания головного мозга и/или нейродегенеративные заболевания выбраны из группы, включающей сосудистую деменцию, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, заболевание сосудов мозга, воспалительное повреждение головного мозга, повреждение головного мозга, связанное с воспалительной реакцией, поражение головного мозга, церебральную гематом, отек желудочка и дилатацию желудочка.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения биологически активных веществ из грибов. Способ получения биологически активных веществ из грибов включает измельчение грибного сырья до частиц размером не более 0,2 мм, далее измельченное сырье замораживают при температуре 15-20˚С в течение не менее 2-х часов, замороженное сырье облучают потоком ускоренных электронов с энергией 2,5-5 МэВ и дозе 16-20 Мрад, полученных в импульсном линейном ускорителе, после смешивают обработанное грибное сырье с жидким экстрагентом и выдерживают смеси в течение времени, при температуре и давлении, достаточных для наибольшего выхода целевых биологически активных веществ из сырья и растворения их в жидком экстрагенте с последующим отделением целевого продукта от экстрагента.

Изобретение относится к химической переработке древесных отходов, в частности, к комплексной переработке коры лиственницы с получением ценных химических продуктов.

Изобретение относится к фармакологической промышленности, в частности к средству, обладающему противотуберкулезным действием. Средство, обладающее противотуберкулезным действием, представляет собой сухой экстракт, полученный путем измельчения кроющих листьев початков антоциановой диплоидной формы кукурузы, экстракции спиртом 96% на водяной бане до кипения и кипячения в течение 14-15 минут, выпаривания при температуре 55-60°С, разведения выпаренного остатка сначала дистиллированной водой при температуре 40-50°С, затем добавления хлороформа в пропорции 4/5 части воды и 1/5 части хлороформа, охлаждения до комнатной температуры и центрифугирования со скоростью 1500 оборотов в минуту в течение 15 минут с последующим отделением водной фракции и высушиванием ее.

Изобретение относится к технологии переработки растительного сырья, конкретно к способу получения биологически активных веществ и кормовой муки из древесной зелени различных пород.

Изобретение относится к технологии переработки растительного сырья, конкретно к способу получения биологически активных веществ и кормовой муки из древесной зелени различных пород.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к противовоспалительному средству. Противовоспалительное средство, представляющее собой настойку из высушенной и измельченной надземной части копеечника кустарникового, полученную методом перколяции с использованием в качестве экстрагента 70% этилового спирта, при соотношении сырье : экстрагент 1:10, при этом на стадии намачивания 10 г сырья заливают 11,29 мл 70%-го этилового спирта.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к средствам (варианты) и композиции, улучшающим вазодиалатирующую, антитромбическую, противовоспалительную функции эндотелия.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой способ получения экстракта Albizzia chinensis (Osbeck) Merr (альбиции китайской), включающий экстрагирование коры ствола Albizzia chinensis (Osbeck) Merr 80-95% EtOH в H2O с получением экстракта, при этом объемное/массовое отношение EtOH к коре ствола Albizzia chinensis составляет от 3:1 до 5:1; и очистку полученного экстракта с помощью колоночной хроматографии с полиамидным адсорбентом при элюировании последовательно 10-30% и 40-80% раствором EtOH в Н2О, при этом на стадии очистки указанный экстракт растворяют в 10-30% EtOH/H2O.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения биологически активных продуктов из пантов. Способ получения биологически активных продуктов из пантов характеризуется тем, что в качестве сырья используют свежесрезанные панты и кожу или консервированные основу и кожу, при этом сырье подвергают переработке, сначала путем ферментативного гидролиза каждого вида сырья отдельно под воздействием ультразвуковых колебаний, сначала под действием фермента СГ-50 и далее фермента папаина, гидролизаты каждого сырья после ферментативного гидролиза фильтруют, а жмыхи направляют на дальнейшую переработку, где каждый жмых отдельно подвергают спиртовой экстракции, после чего проводят фильтрацию и экстракты от каждого вида сырья объединяют с экстрактами, полученными после ферментативного гидролиза, а жмыхи по отдельности подвергают высокотемпературной водной экстракции, а после фильтрации каждого экстракта их объединяют с экстрактами от предыдущих стадий переработки, причем жмыхи от переработки основы панта сушат в вакууме и измельчают, а жмых от переработки кожи утилизируют, при определенных условиях.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к средству, обладающему антиоксидантным действием. Средство, обладающее антиоксидантным действием, полученное из корневищ куркумы длинной путем циркуляционной экстракции 100,0 г суховоздушного сырья с влажностью не более 8%, 96% этиловым спиртом, подкисленным 0,1 М раствором хлороводородной кислоты в соотношении: 1,0 мл раствора хлороводородной кислоты на 100,0 мл экстрагента, в течение 3,0 часов, с последующим сгущением извлечения на ротационном испарителе под вакуумом до остаточной влаги в продукте не более 25%.

Изобретение относится соединениям формулы I Технический результат: получены новые соединения, которые являются ингибиторами SYK и полезны для лечения аутоиммунных и воспалительных заболеваний.

Изобретение относится к соединениям общей формулы (I), общей формулы (II) или общей формулы (III): где R1, R2 выбираются независимо и представляют собой -Н, замещенный или незамещенный -C1-C6-алкил, причем заместители R1 и R2 вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, могут образовывать замещенный или незамещенный -C3-C12-циклоалкил; А выбирается независимо и представляет собой: или причем звездочкой указано место присоединения заместителей; B выбирается независимо и представляет собой: причем звездочкой указано место присоединения заместителей; каждый заместитель Rk выбирается независимо и представляет собой -Н, галоген; Q выбирается независимо и представляет собой -Н, -C(=O)-RL; RL выбирается независимо и представляет собой замещенный или незамещенный -C1-C6-алкил (значения остальных радикалов представлены в п.1 формулы изобретения), для лечения гиперпролиферативных заболеваний, связанных со злокачественной трансформацией клеток, экспрессирующих фермент карбоксилэстеразу hCE1, в частности острых лейкозов с транслокациями MLL-гена, гепатоклеточных карцином и аденокарцином легкого.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к гетероциклическому соединению формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли. Также изобретение относится к фармацевтической композиции на основе соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, их применению и способу лечения рака.

Настоящее изобретение относится к новому дейтерированному соединению хиназолинона формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, обладающим свойствами ингибитора PI3К.

Изобретение относится к новому соединению формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, которые обладают свойствами ингибиторов активности киназы Wee-1 и могут быть использованы при лечении или предотвращении онкологического заболевания, опосредованного действием киназы Wee-1.

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии, а именно к моноклональному антителу, которое связывается с клетками-трансфектантами C1R, модифицированными для экспрессии на их поверхности полипептида MICA, и содержащей его фармацевтической композиции.

Группа изобретений относится к области биотехнологии, в частности к вариантам антитела, которое специфически связывается с человеческим интерлейкином-6 (IL6), а также к композиции и комбинации для лечения заболевания, ассоциированного с IL6, и фармацевтической композиции для применения при лечении заболевания, ассоциированного с IL6, его содержащим.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению анти-HER2 антитела и конъюгата анти-HER2 антитела и низкомолекулярного медицинского средства, и может быть использовано в медицине.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено антитело против альфа-энолазы (ENO1), а также его scFv- и Fab-фрагмент.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к гетероциклическому соединению формулы (I), где R1 является группой -CF3; R2 является (C1-C6) алкильной группой; X является CH или N; R3 является атомом водорода или (C1-C6) алкильной группой; R4 является (C1-C6) алкильной группой; R5 является группой -CF3.

Настоящее изобретение относится к (6aR,9aS)-5,6a,7,8,9,9a-гексагидро-5-метил-3-(фениламино)-2-((4-(6-фторпиридин-2-ил)фенил)метил)-циклопента[4,5]имидазо[1,2-a]пиразоло[4,3-e]пиримидина-4(2H)-ону в форме кислотно-аддитивной соли монофосфата, в частности к кристаллам такой соли.
Наверх