Ингибиторы т-клеточной активации

Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована для получения биспецифического слитого белка, предназначенного для заболевания, выбранного из аутоиммунного заболевания и отторжения трансплантата. Биспецифический слитый белок содержит лиганд, специфичный к CTLA-4, и лиганд, специфичный к комплексу pMHC, где лиганд, специфичный к CTLA-4, и лиганд, специфичный к комплексу pMHC, разделены посредством линкера. Использование данного биспецифического белка ингибирует иммунный ответ, ослабляя передачу сигнала посредством Т-клеток на ранней фазе активации Т-клеток. 2 н. и 17 з.п. ф-лы, 11 пр., 12 ил.

 

Перекрестная ссылка на родственную заявку

По данной заявке испрашивается приоритет следующей предварительной заявки США № 61/503282, которая подана 30 июня 2011 года, полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.

Предпосылки изобретения

Клеточная терапия с использованием свежевыделенных, размноженных ex vivo или in vitro индуцированных T-регуляторных клеток в моделях аутоиммунных заболеваний или трансплантатов органов, показала, что адоптивный перенос T-регуляторных клеток может восстанавливать баланс T-регуляторных клеток по отношению к эффекторным T-клеткам, тем самым управляя аутоиммунной реакцией, ассоциированной с этими заболеваниями (Allan et al., (2008) Immunol. Rev. 223:391-421; Jiang et al., Expert review of clinical immunology 2:387-392; Riley et al., (2009) Immunity 30:656-665; Tang et al., (2012) Journal of molecular cell biology 4:11-21). Однако использование адоптивного переноса в качестве терапевтической стратегии представляет некоторые проблемы, связанные с переносом в клинику. Число аутологических T-регуляторных клеток, которые можно выделять из периферической крови человеческого субъекта, является ограниченным, а экстенсивное размножение ex vivo T-регуляторных клеток может изменять их функциональность и/или чистоту. Поскольку выделенные T-регуляторные клетки являются поликлональными, они могут проявлять функцию подавления всего иммунитета, оказываемую на нецелевые эффекторные T-клетки. Важно, что пластичность T-регуляторных клеток представляет значительную проблему (Bluestone et al., (2009) Nat Rev Immunol 9:811-816; Zhou et al., (2009a) Curr Opin Immunol 21:281-285), поскольку адаптивно перенесенные T-регуляторные клетки могут утрачивать экспрессию Foxp3 и повторно дифференцироваться в клетки Th17 (Koenen et al., (2008) Blood 112:2340-2352.) или патогенные T-клетки памяти (Zhou et al., (2009b) Nat Immunol 10:1000-1007), что повышает риск усугубления аутоиммунной реакции или воспаления.

Терапевтические средства, которые индуцируют образование T-регуляторных клеток антигенспецифическим образом in situ, будут иметь преимущества над клеточной терапией адоптивными T-регуляторными клетками. Ассоциированный с цитотоксическими T-лимфоцитами антиген-4 (CTLA-4; CD152) представляет собой точно установленный негативный регулятор T-клеточного ответа и важен для поддержания T-клеточного гомеостаза и аутотолерантности. CTLA-4 гомологичен костимуляторной молекуле CD28 и имеет те же лиганды, CD80 (B7.1) и CD86 (B7.2), которые экспрессируются на поверхности антигенпредставляющих клеток (APC). Однако неодинаковое связывание CD80/CD86 на APC с CD28 и CTLA-4 на эффекторных T-клетках ведет к противоположным исходам, причем CD28 переключает T-клеточную активацию, и CTLA-4 вызывает T-клеточное ингибирование.

Поскольку экспрессия CD28 на T-клетках носит конститутивный характер, и индукция экспрессии CTLA-4 происходит только после T-клеточной активации, с пиком через 2-3 суток (Jago et al., (2004) Clinical & Experimental Immunology, 136: 463-471), экстенсивная T-клеточная активация возникает до вовлечения CTLA-4. Таким образом, основная роль CTLA-4 состоит в том, чтобы действовать в качестве ограничения экстенсивного T-клеточного ответа вместо того, чтобы ингибировать T-клеточную активацию. Однако раннее вовлечение CTLA-4 посредством его лиганда и последующее его соединение с T-клеточным рецептором (TCR) может преждевременно тормозить передачу сигнала TCR, что вызывает ингибирование и гипореактивность T-клеток, или анергию. Эта концепция подтверждена экспериментально с использованием различных способов, включая следующие: (i) сшивка активирующих T-клетки антител (анти-CD3/анти-CD28) с использованием агонистических антител против CTLA-4 посредством совместной иммобилизации на бусах или с помощью вторичного антитела (Blair et al., (1998) J. Immunol. 160: 12-15; Krummel and Allison, (1996) J Exp Med 183:2533-2540; Walunas et al., (1996) J. Exp. Med. 183:2541-2550); (ii) молекулярное конструирование связанного с поверхностью агонистического scFv против CTLA-4 на APC (Fife et al., (2006) J. Clin. Invest. 116(8):2252-61; Griffin et al., (2001) J. Immunol. Methods. 248(l-2):77-90; Griffin et al., (2000) J. Immunol. 164(9):4433-42); и (iii) химическая сшивка антител, которые распознают специфические антигены на APC, с агонистическим антителом против CTLA-4 (Li et al., (2007). J. Immunol. 179(8):5191-203; Rao et al., (2001) Clin. Immunol. 101(2): 136-45; Vasu et al., (2004) J. Immunol. 173(4):2866-76).

Восстановление баланса T-регуляторных клеток по отношению к эффекторным T-клеткам представляет собой многообещающее средство лечения аутоиммунных заболеваний. Однако клеточная терапия, включающая перенос T-регуляторных клеток, имеет определенные ограничения. Соответственно, крайне необходимы терапевтические средства, которые индуцируют образование T-регуляторных клеток (например, CTLA-4) антигенспецифическим образом, для лечения аутоиммунного заболевания.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к лигандам, которые сшивают вовлеченный лигандом антиген-4 цитотоксических T-лимфоцитов (CTLA-4) с T-клеточным рецептором (TCR) во время ранней фазы T-клеточной активации и тем самым ослабляют передачу сигнала TCR, что ведет к T-клеточному ингибированию. Для разработки средства, которое может ингибировать T-клеточную активацию, создали биспецифический слитый белок, содержащий фрагменты, которые избирательно связывают и активируют CTLA-4 и при этом связываются с TCR. В отличие от подходов известного уровня техники биспецифический слитый белок конструировали для того, чтобы сшивать MHC с CTLA-4; затем оба связываются с TCR, образуя тримолекулярный комплекс CTLA-4/MHCII/TCR в иммунных синапсах.

Сшивка вовлеченного лигандом антигена-4 цитотоксических T-лимфоцитов (CTLA-4) с TCR с использованием биспецифического слитого белка (BsB), содержащего мутантный CD80 мыши и антиген-3 активации лимфоцитов, в аллогенном MLR аттенуированном TCR передает сигнал и направляет дифференциацию T-клеток в направлении Foxp3⁺ T-регуляторных клеток. Как описано в настоящем документе, антиген-специфические T-регуляторные клетки также можно индуцировать в антиген-специфическом окружении. Лечение мышей с диабетом, не страдающих ожирением, (NOD) коротким курсом BsB умеренно задерживало начало аутоиммунного диабета 1 типа (T1D) при временном повышении T-регуляторных клеток в крови. Однако более длительный курс лечения NOD животных с использованием BsB значительно задерживало начало заболевания, а также снижало заболеваемость животных, предрасположенных к диабету. Гистопатологический анализ поджелудочной железы мышей, которых лечили BsB, у которых не развивался диабет, выявил присутствие T-регуляторных клеток, которые были смешаны с другими CD3⁺ T-клетками и не-T-клеточными лейкоцитами около островков. Этот периинсулит ассоциировали с минимальным инвазивным инсулитом без значительного разрушения инсулин-продуцирующих β-клеток. Таким образом, бифункциональные белки, способные вовлекать CTLA-4 и MHCII и опосредованно совместно связывать их с TCR, могут индуцировать антиген-специфические T-регуляторные клетки in vivo для того, чтобы защищать мышей от T1D или других аутоиммунных заболеваний.

В частности, изобретение описывает биспецифические слитые белки, которые сшивают CTLA-4 с комплексом pMHCII. Например, описан биспецифический слитый белок, который содержит мутантный CD80 мыши (CD80w88a) и антиген-3 активации лимфоцитов (LAG-3), который конструируют для того, чтобы параллельно вовлекать CTLA-4 и сшивать его с TCR через pMHCII. В первом аспекте, следовательно, предоставлено биспецифическое биологическое средство, которое содержит лиганд, специфичный к CTLA-4, и лиганд, специфичный к комплексу pMHC.

В одном из аспектов изобретение относится к биспецифическому биологическому средству, которое содержит лиганд, специфичный к CTLA-4, и лиганд, специфичный к комплексу pMHC. Биспецифическое биологическое средство в соответствии с изобретением способно сшивать CTLA-4, присутствующий на T-клетках, с комплексом пептид-MHC (pMHC) на антигенпредставляющих клетках (APC). Комплекс пептид-MHC связывает когнатный T-клеточный рецептор (TCR) на T-клетках, что обозначает, что биспецифическое биологическое средство в соответствии с изобретением дает начало тройному комплексу CTLA-4/MHC/TCR.

В различных вариантах осуществления аспектов, обозначенных в настоящем документе, лиганд, специфичный к CTLA-4, выбирают из антитела, специфичного к CTLA-4, и CD80 (B7-1) или CD86 (B7-2). В конкретном варианте осуществления антитело, специфичное к CTLA-4, и CD80 (B7-1) или CD86 (B7-2) представляет собой агонистическое антитело. Антитела, специфичные к CTLA-4, можно конструировать, и CD80 и CD86 представляют собой природные лиганды для CTLA-4. В одном из аспектов используют CD80 или его мутант, поскольку CD80 предпочтительно связывается с CTLA-4 по отношению к CD28 и, таким образом, способствует T-клеточной инактивации, в противоположность активации.

В различных вариантах осуществления аспектов, обозначенных в настоящем документе, лиганд, специфичный к комплексу pMHC, можно выбирать из анти-MHC антитела и LAG-3. Полипептид LAG-3 представляет собой природный лиганд для белка MHCII. В одном из вариантов осуществления MHC представляет собой MHC-II (который взаимодействует CD4⁺ T-клетками). В другом варианте осуществления MHC представляет собой MHC-I, который взаимодействует с CD8⁺ T-клетками.

В биспецифическом биологическом средстве в соответствии с изобретением, лиганд, специфичный к CTLA-4, и лиганд, специфичный к комплексу pMHC, предпочтительно разделены посредством линкера. Линкер может принимать форму одного или нескольких из полиаминокислотной последовательности и Fc-домена антитела. Подходящая полиаминокислотная последовательность представляет собой G9 (Gly-9).

В различных вариантах осуществления аспектов, обозначенных в настоящем документе, лиганд, специфичный к CTLA-4, представляет собой CD80 или его мутант, в который вводят мутации для повышения специфичности к CTLA-4 по отношению к CD28. В одном из вариантов осуществления мутировавший CD80 содержит одну или несколько мутаций, выбранных из W88A, K75G, K75V, S112G, R126S, R126D, G127L, S193A и S204A, использую нумерацию последовательности в предшественнике CD80 мыши, или их аналоги CD80 человека (W84A, K71G, K71V, S109G, R123S, R123D, G124L, S190A и S201A) и дополнительно R63A, M81A, N97A, E196A.

В одном из вариантов осуществления биспецифическое биологическое средство содержит CD80, который содержит мутацию W84A (человек) или W88A (мышь).

В конкретном варианте осуществления лиганд, специфичный к комплексу MHCII, представляет собой LAG-3. Предпочтительно, в LAG-3 вводят мутации для повышения специфичности к pMHCII. Например, LAG-3 содержит одну или несколько мутаций, выбранных из R73E, R75A, R75E и R76E (Huard et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94(11): 5744-5749. В одном из вариантов осуществления LAG-3 содержит мутацию R75E.

Предпочтительное связывание биспецифического слитого белка с CTLA-4 по отношению к CD28 достигали с использованием мутантного CD80 (CD80w88a), который содержит аланин вместо триптофана в аминокислоте 88 (нумерация по CD80 мыши), в качестве лиганда. CD80w88a связывает CTLA-4, но проявляет минимальную аффинность к CD28 (Wu et al., (1997), J. Exp. Med. 185:1327-1335).

Ген-3 активации лимфоцитов (LAG-3), природный лиганд MHCII, был выбран в качестве другого связывающего компонента биспецифического слитого белка (Baixeras et al., (1992) J. Exp. Med. 176:327-337; Triebel et al., (1990) J. Exp. Med. 171:1393-1405). Авторы настоящего изобретения показали, что слитый белок с такой двойной функциональностью эффективно ингибирует T-клеточную активацию и стимулирует продукцию противовоспалительных цитокинов IL-10 и TGF-β. Что более важно, этот биспецифический слитый белок также направляет дифференциацию T-клеток в высоко супрессорные Foxp3⁺ T-регуляторные клетки. Этого не происходит, когда взамен использовали точно установленный костимуляторный ингибитор CTLA-4Ig (Bluestone et al., (2006) Immunity 24:233-238; Linsley and Nadler (2009) Immunol. Rev. 229:307-321). Следовательно, раннее вовлечение CTLA-4 и сшивка CTLA-4 с TCR во время T-клеточной активации может оказывать активное влияние на дифференциацию T-клеток. Такие биспецифические слитые белки могут, таким образом, представлять новый класс биологических средств, которые можно использовать для управления чрезмерными T-клеточными ответами при аутоиммунных заболеваниях.

Во втором аспекте изобретения предоставлено применение биспецифического биологического средства, которое содержит лиганд, специфичный к CTLA-4, и лиганд, специфичный к комплексу pMHC, согласно первому аспекту изобретения, для толеризации T-клетки посредством приведения указанных T-клеток в контакт с антигенпредставляющими клетками, которые представляют пептид, полученный из указанного антигена, в комплексе с молекулой MHC и указанным биспецифическим биологическим средством.

В третьем аспекте предоставлено применение биспецифического биологического средства, которое содержит лиганд, специфичный к CTLA-4, и лиганд, специфичный к комплексу pMHC, согласно первому аспекту изобретения, в лечении заболевания, выбранного из аутоиммунного заболевания и отторжения трансплантата.

Например, аутоиммунное заболевание представляет собой диабет 1 типа (T1D), системную красную волчанку (SLE), ревматоидный артрит (RA) и воспалительное заболевание кишечника (IBD) (включая язвенный колит (UC) и болезнь Крона (CD)), рассеянный склероз (MS), склеродермию и другие заболевания и нарушения, такие как PV (пузырчатка обыкновенная), псориаз, атопический дерматит, глютеновая болезнь, хроническое обструктивное заболевание легких, тиреоидит Хашимото, базедова болезнь, синдром Шегрена, синдром Гийена-Барре, синдром Гудпасчера, болезнь Аддисона, гранулематоз Вегенера, первичный склероз желчных путей, склерозирующий холангит, аутоиммунный гепатит, ревматическая полимиалгия, феномен Рейно, височный артериит, гигантоклеточный артериит, аутоиммунная гемолитическая анемия, пернициозная анемия, узелковый полиартериит, болезнь Бехчета, первичный биллиарный цирроз, увеит, миокардит, ревматическая лихорадка, анкилозирующий спондилит, гломерулонефрит, саркоидоз, дерматомиозит, миастения гравис, полимиозит, очаговая алопеция и витилиго.

В четвертом аспекте предоставлен способ толеризации T-клеток к антигену, который включает приведение указанных T-клеток в контакт с антигенпредставляющими клетками, которые представляют пептид, полученный из указанного антигена, в комплексе с молекулой MHC и биспецифическим биологическим средством согласно первому аспекту изобретения.

В пятом аспекте предоставлен способ лечения субъекта, страдающего от состояния, выбранного из аутоиммунного заболевания и отторжения трансплантата, включающий стадии введения нуждающемуся в этом субъекту биспецифического биологического средства, содержащего лиганд, специфичный к CTLA-4, и лиганд, специфичный к комплексу pMHC, согласно первому аспекту изобретения.

Например, аутоиммунное заболевание представляет собой диабет 1 типа (T1D).

Описание фигур

Фиг.1. Конструкции BsB и BsBΔ. (A) Схематические изображения слитых белков BsB (биспецифические биологические средства) и BsBΔ. (B) Схематическое изображение pMHCII, TCR и костимуляторных молекул в иммунном синапсе, а также предложенная схема для BsB-опосредованной сшивки CTLA-4 с TCR через тримолекулярный комплекс CTLA-4/MHCII/TCR. Слитый белок вовлекает CTLA-4 и опосредованно лигирует TCR через связывание с MHCII в иммунном синапсе. Две сплошные стороны треугольника обозначают сшивку MHCII и CTLA-4, а также MHCII и TCR; штриховая сторона обозначает лигирование CTLA-4 с TCR. Пунктирная линия обозначает ингибирование передачи сигнала TCR посредством BsB-вовлеченного CTLA-4. (C). Схематическое изображение, которое показывает, что действие BsBΔ схоже с таковым BsB, за исключением того, что он нестабильно лигирует TCR.

Фиг.2. Ингибирование аллогенной T-клеточной активации посредством BsB в реакции смешанной культуры лимфоцитов. Наивные T-клетки мышей C57BL/6 и обработанные LPS и облученные APC BALB/c смешивали с тестовыми конструкциями в течение 2 суток. Затем среды для культивирования собирали и анализировали на IL-2. Только BsB и CTLA-4Ig ингибировали T-клеточную активацию, на что указывает сниженное количество IL-2 в средах. Фигура представляет более пяти независимых, но схожих исследований.

Фиг.3. Индукция Foxp3⁺ T-регуляторных клеток и образование IL-10 и TGF-β посредством BsB. (A) Аллогенные реакции смешанных культур лимфоцитов устанавливали, как описано в легенде к фиг.2, с использованием наивных CD4⁺CD62L^hiCD25^-GFP" клеток, которые выделяли у мышей с введенным Foxp3-EGFP в присутствии тестовых конструкций. Через пять суток после активации CD4⁺ T-клетки анализировали на экспрессию GFP посредством проточной цитометрии. T-регуляторные клетки отбирали как GFP⁺ и CD25⁺ клетки. Только обработка BsB вела к экспрессии GFP, что указывает на индукцию Foxp3⁺ T-регуляторных клеток (средний левый график). Среды для культивирования собирали для анализа цитокинов (правые графики), который выявлял повышенные уровни IL-10 и TGF-β в присутствии BsB. Данные репрезентативно отражают множество независимых, но схожих исследований. (B) Необходимость аутокринного TGF-β для индукции T-регуляторных клеток показана посредством полного блокирования индукции T-регуляторных клеток в присутствии блокирующего антитела к TGF-β, тогда как контрольное Ab не оказывало заметного влияния на индукцию T-регуляторных клеток.

Фиг.4. BsB-опосредованная индукция антиген-специфических T-регуляторных клеток in vitro. (A) Индукция Ova_233-339-специфичных T-регуляторных клеток in vitro. Наивные T-клетки OT-II смешивали с активированными LPS и облученными сингенными APC в присутствии 0,5 мкг/мл пептида Ova_233-239. Затем контрольный mIgG2a, BsB и BsB плюс антитело против TGF-β (aTGF-β) добавляли и проводили тестирование, как показано (левые графики). Клетки культивировали в течение 5 суток и затем метили антителами против CD25 и против Foxp3 перед анализом посредством проточной цитометрии. Уровни IL-2, IL-10 и TGF-β в средах для культивирования анализировали посредством ELISA (правые графики). (B) Мониторинг пролиферации индуцированных T-регуляторных клеток. Исследования проводили, как в A, за исключением того, что наивные T-клетки OT-II предварительно метили CFSE перед смешиванием с APC. Клетки сортировали по флуоресцентным каналам Foxp3 и CFSE.

Фиг.5. Функция подавления BsB-индуцированных T-регуляторных клеток. (A) BsB- или TGF-β-индуцированные T-регуляторные клетки очищали посредством проточной цитометрии и смешивали с меченными CFSE наивными реактивными T-клетками, полученными от мышей C57BL/6 в указанных соотношениях в трансвеллах (залитые столбцы) или обычных культуральных лунках (заштрихованные столбцы). Обработанные LPS аллогенные APC от BALB/c добавляли для стимуляции T-клеточной активации. Результаты (среднее + стандартное отклонение) отражают процентную долю пролиферирующих реактивных T-клеток (реактивные T-клетки), основываясь на разведении CFSE без T-регуляторных клеток (только реактивные T-клетки + APC), принятом за 100%. (B) Антитела против IL-10 и против TGF-β добавляли в клетки в обычные культуральные лунки при соотношении реактивных T-клеток и T-регуляторных клеток 1:1 для определения вклада цитокинов в T-клеточную пролиферацию. Антитела против TGF-β частично ингибировали функцию подавления TGF-β-индуцированных T-регуляторных клеток (левый график), но не влияли на BsB-индуцированные T-регуляторные клетки (правый график). Фигура представляет более трех независимых, но схожих исследования.

Фиг.6. Понижающая регуляция фосфорилирования AKT и mTOR посредством BsB. Наивные T-клетки культивировали в круглодонных 96-луночных планшетах, совместно покрытых антителами против CD3, против CD28 и BsB, IgG (mIgG) мыши или PD-L1 (mPD-L1) мыши в течение 18 ч. Клетки, которые полагали неактивированными, культивировали в лунках, покрытых только IgG. Затем осуществляли мониторинг состояния фосфорилирования AKT и mTOR посредством проточной цитометрии после окрашивания флуоресцентно меченными антителами к фосфорилированным AKT и mTOR. MFI обозначает среднюю интенсивность флуоресценции. На этой фигуре представлен один из трех независимых экспериментов.

Фиг.7. Постоянная экспрессия Foxp3 в T-регуляторных клетках в ответ на непрерывную стимуляцию с использованием BsB. Круглодонные 96-луночные планшеты совместно покрывали антителами против CD3, против CD28 и BsB или IgG мыши. Наивные T-клетки от мышей с введенным Foxp3-EGFP культивировали в течение 5 суток для того, чтобы индуцировать T-регуляторные клетки (левые графики), которые затем очищали от обработанных BsB клеток (красный квадрат) и повторно стимулировали в другом раунде культивирования в совместно покрытых лунках, как указано выше, в течение 5 суток, до анализа GFP⁺ клеток посредством проточной цитометрии. Повторное культивирование очищенных T-регуляторных клеток с использованием контрольного IgG мыши в течение 5 суток вело к утрате экспрессии Foxp3⁺ в ~60% клеток (правый верхний квадрант верхнего правого графика), тогда как менее чем 7% T-регуляторных клеток, которые повторно культивировали с BsB, утратили экспрессию Foxp3⁺ (верхний правый квадрант нижнего правого графика). На этой фигуре представлен один из трех независимых экспериментов.

Фиг.8. Фармакокинетика BsB in vivo и биохимический анализ. (A) Фармакокинетический профиль BsB у мышей. Нормальным мышам C57BL/6 (n=5) дозировали интраперитонеально 20 мг/кг BsB. Образцы крови собирали в различные указанные моменты времени, и уровни BsB определяли с использованием ELISA. (B) Сравнение связывания BsB и IgG2a мыши с FcRn. FcRn иммобилизовали на чипе Biacore. BsB или контрольное IgG2a мыши загружали на чип в различных концентрациях и затем регистрировали сигналы.

Фиг.9. Анализ аспарагин-связанного гликозилирования на BsB. Аминокислотную последовательность BsB отправляли на сервер NetNGlyc 1.0 для предсказания Asn-связанных участков гликозилирования. Предсказывали всего 10 Asn-связанных участков гликозилирования (обозначены N); другие аминокислоты представлены точками. также получали моносахаридную композицию BsB для определения композиции гликанов фукозы (Fuc), N-ацетилглюкозамина (GlcNAc), галактозы (Gal), маннозы (Man), сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовая кислота). Отношение сиаловой кислоты к галактозе, равное 0,68, указывает на то, что приблизительно треть остатков галактозы доступна для связывания с асиалогликопротеиновым рецептором.

Фиг.10. Лечение не страдающих диабетом (NOD) мышей с использованием BsB задерживало начало диабета 1 типа (T1D) в рамках парадигмы позднего профилактического лечения. (A) Уровни Foxp3⁺ T-регуляторных клеток в крови обработанных BsB NOD (сплошные круги, n=15) и обработанных физиологическим раствором контрольных NOD мышей (сплошные треугольники, n=14). Имело место умеренное, но значимое повышение числа T-регуляторных клеток у обработанных BsB животных относительно того, что отмечали у контрольных животных. (B) Кумулятивные заболеваемости манифестным диабетом у NOD животных, которых лечили с использованием BsB (заполненные круги) или физиологическим раствором (заполненные треугольники).

Фиг.11. Лечение NOD мышей с использованием BsB задерживало начало T1D в рамках парадигмы раннего профилактического лечения. (A) Уровни Foxp3⁺ T-регуляторных клеток в крови мышей, которых лечили с использованием BsB (сплошные круги, n=10), физиологическим раствором (сплошные треугольники, n=10), CTLA-4Ig (сплошные квадраты, n=10) и IgG2a мыши (пустые квадраты, n=10). Не обнаруживали повышение числа Foxp3⁺ T-регуляторных клеток после двух недель лечения с использованием BsB по сравнению с контрольными животными, которые лечили физиологическим раствором или mIgG2a. Однако лечение с использованием CTLA-4Ig вело к статистически значимому снижению числа Foxp3⁺ T-регуляторных клеток в крови. (B) Кумулятивные заболеваемости манифестного диабета у животных, которых лечили с использованием BsB, или контрольных животных. Лечение с использованием BsB вело к значительной задержке начала T1D по сравнению с контрольными группами, которые лечили физиологическим раствором или IgG2a мыши, до возраста 24 недели (p=0,04). Однако не отмечали значительной разницы между группами в конце исследования. Данные представляют одно из двух отдельных исследований со схожими результатами, где в каждой группе присутствовало всего 26 NOD мышей.

Фиг.12. Длительное лечение NOD мышей с использованием BsB значительно задерживало начало T1D у NOD мышей. (A) Кумулятивные заболеваемости манифестным диабетом у мышей, получавших лечение с использованием BsB (n=16) и не получавших лечение (n=16). Лечение с использованием BsB значительно снижало заболеваемость T1D по сравнению с теми, которых лечили физиологическим раствором (p<0,01). (B) Гистопатологический анализ тканей поджелудочной железы от животных, которых лечили физиологическим раствором или BsB. Изображения a-c представляют срезы от мышей, которых лечили физиологическим раствором, которые оставались не страдающими диабетом, с использованием H&E, антитела к инсулину, или антитела против CD3 и бокса Forkhead P3 (Foxp3), соответственно. Схожие наблюдения отмечали у NOD мышей, которых лечили с использованием BsB, которые оставались не заболевшими. На любом из срезов не отмечали свидетельства инфильтрации или инсулита; может присутствовать некоторое количество Foxp3⁺ T-регуляторных клеток (стрелки на изображении c). Изображения d-f представляют срезы поджелудочной железы от NOD животных с диабетом. Инвазивный инсулит был ясно виден, а инсулин-продуцирующие β-клетки были полностью разрушены (e). Также обнаруживали некоторые CD3⁺ T-клеточные инфильтрации, наряду с некоторыми T-регуляторными клетками и множеством не-T-клеточными лейкоцитами с голубыми ядрами (f). На изображениях g-i показаны островки, демонстрирующие характерный периинсулит, у животных, которых лечили с использованием BsB и которые остались не страдающими диабетом. Лейкоцитарные инфильтрации отмечали, но они были ограничены периферией островков. Кроме того, заметные разрушения инсулин-продуцирующих β-клеток отсутствовали. Большинство лейкоцитов на периферии не являлось T-клетками (голубые ядра). Увеличенная вкладка (изображение j, которое представляет красный квадрат на i) показывает, что Foxp3⁺ T-регуляторные клетки (стрелка с желтым кончиком) были смешаны с другими CD3⁺ T-клетками и не-T-клеточными лейкоцитами (голубые ядра) на периферии островков. Изображения получали с использованием объектива 40×; вкладку получали с использованием объектива 60×, которую затем дополнительно увеличивали 3× цифровым способом.

Подробное описание изобретения

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, в каком их обыкновенно понимает специалист в той области, к которой относится это изобретение. Какие-либо способы и материалы с функцией, подобной или эквивалентной той, которая описана в настоящем документе, можно использовать при практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения. Далее описаны способы, устройства и материалы, подходящие для такого использования. Все публикации, цитируемые в настоящем документе, включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме с целью описания и раскрытия технологий, реактивов и инструментов, о которых сообщается в публикациях и которые можно использовать применительно к изобретению.

Способы по настоящей заявке в целом осуществляют согласно стандартным способам, хорошо известным специалистам в данной области, и как описано в различных общих и более специфических источниках, которые цитированы и раскрыты на всем протяжении данного описания, если не указано иное. Такие способы полностью описаны в литературе. См., например, Gennaro, A.R., ed. (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-е издание, Mack Publishing Co.; Hardman, J.G., Limbird, L.E., and Gilman, A.G., eds. (2001) The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10-е издание, McGraw-Hill Co.; Colowick, S. et al., eds., Methods In Enzymology, Academic Press, Inc.; Weir, D.M., and Blackwell, C. C, eds. (1986) Handbook of Experimental Immunology, тома I-IV, Blackwell Scientific Publications; Maniatis, T. et al., eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, тома I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al., eds. (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 4-е издание, John Wiley & Sons; Ream et al., eds. (1998) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, Academic Press; Newton, C.R., and Graham, A., eds. (1997) PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2-е издание, Springer-Verlag.

Термин «антитело», если не указано иное, используют, чтобы отослать к целым антителам, а также антигенсвязывающим фрагментам таких антител. Например, термин охватывает четырехцепочечные молекулы IgG, а также фрагменты антител.

Как используется в настоящем документе, термин «фрагменты антител» относится к частям интактного полноразмерного антитела, таким как антигенсвязывающая или вариабельная область интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab)2 и Fv; диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител (например, scFv); фрагменты полиспецифических антител, таких как биспецифические, триспецифические и полиспецифические антитела (например, диатела, триатела, тетратела); слитые белки иммуноглобулинов со связывающими доменами; камелизованные антитела; миниантитела; хетатирующие рекомбинантные антитела; триотела или диатела; интраантитела; нанотела; иммунофармацевтические средства на основе модульных белков малого размера (SMIP), содержащие V_HH антитела; и какие-либо другие полипептиды, сформированные из фрагментов антител, например, как дополнительно описано ниже.

Антитела могут относиться к любому классу, например, IgG, IgA или IgM; и к любому подклассу, например, IgG1 или IgG4. Различные классы и подклассы иммуноглобулинов имеют различные свойства, которые могут быть полезны в различных применениях.

Специфичность в контексте настоящего изобретения требует того, чтобы заявленное антитело было способно избирательно связывать свой определенный когнатный антиген, который представляет собой или CTLA-4 или комплекс pMHC.

Встречающиеся в природе иммуноглобулины имеют обыкновенную коровую структуру, в которой две идентичные легкие цепи (приблизительно 24 кДа) и две идентичные тяжелые цепи (приблизительно 55 или 70 кДа) образуют тетрамер. Аминоконцевая часть каждой цепи известна как вариабельная (V) область, и ее можно отличать от более консервативных константных (C) областей остальной части каждой цепи. В вариабельной области легкой цепи (также называемой доменом V_L) присутствует C-концевая часть, известная как J-область. В вариабельной области тяжелой цепи (также называемой доменом V_H) присутствует D-область в дополнение к J-области. Большинство вариаций аминокислотных последовательностей в иммуноглобулинах ограничено тремя отдельными местоположениями в V-областях, известными как гипервариабельные области или определяющие комплементарность области (CDR), которые непосредственно участвуют в связывании антигена. Если идти от аминоконца, эти области обозначают CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно. CDR остаются на месте за счет более консервативных каркасных областей (FR). Если идти от аминоконца, эти области обозначают FR1, FR2, FR3 и FR4, соответственно. Местоположения областей CDR и FR и система нумерации определены авторами Kabat et al. (Kabat, E.A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, пятое издание, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, и более новые версии публикации можно найти в сети.

Гуманизированное моноклональное антитело, как обозначают в настоящем документе, представляет собой антитело, которое состоит из каркаса антитела человека, в которой встроены CDR из не принадлежащего человеку антитела. Процедуры для конструирования и получения гуманизированных антител хорошо известны в данной области и описаны, например, в Cabilly et al., патенте США № 4816567; Cabilly et al., европейской патентной заявке 0 125 023; Boss et al., патенте США № 4816397; Boss et al., европейской патентной заявке 0120694; Neuberger, M.S. et al., WO 86/01533; Neuberger, M.S. et al., европейской патентной заявке 0194276 B1; Winter, патенте США № 5225539; Winter, европейской патентной заявке 0239400; Padlan, E.A. et al., европейской патентной заявке 0519596. Дополнительные подробности об антителах, гуманизированных антителах, сконструированных антителах человека и способах их получения можно найти в Kontermann, R. and Dtibel, S. eds. (2001, 2010) Antibody Engineering, 2-е издание, Springer-Verlag, New York, NY, 2001.

Константные области можно извлекать из любых константных областей антител человека. Типично, гены вариабельной области клонируют в экспрессирующие векторы с сохранением рамки считывания генов константной области, чтобы экспрессировать тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов. Такие экспрессирующие векторы можно переносить в антителопродуцирующие клетки-хозяева для синтеза антител.

Необходимые вариабельные и константные области антител можно получать из баз данных о последовательностях. Например, последовательности иммуноглобулинов доступны в базе данных IMGT/LIGM (Giudicelli et al., (2006) Nucleic Acids Res. 34:(suppl. 1):D781-D784) или VBase (vbase.mrccpe.cam.ac.uk).

«Нуклеиновые кислоты», как обозначают в настоящем документе, типично включают молекулы ДНК, которые кодируют антитела по изобретению. Предпочтительными являются экспрессирующие векторы, которые подходят для экспрессии генов антител в клетке-хозяине. Экспрессирующие векторы и клетки-хозяева для экспрессии генов антител известны в данной области; см., например, Morrow, K.J. (2008) Genetic Engineering & Biotechnology News. (June 15, 2008) 28(12) и Backliwal, G., et al. (2008) Nucleic Acids Res. 36(15): e96-e96.

«CD80», как используется в настоящем документе, относится к антигену млекопитающего CD80, а также к его мутантам, которые обладают повышенной авидностью или специфичностью связывания с CTLA-4. См. Linsley et al., (1994) Immunity 1:793-801, и Wu et al., (1997) J. Exp. Med. 185(7):1327-1335, которые включены в настоящий документ посредством ссылки. CD80 млекопитающих можно выбирать из CD80 грызунов, таких как мышь, или человека.

«CD86», как используется в настоящем документе, относится к антигену CD86 млекопитающего, а также к его мутантам, которые имеют повышенную авидность или специфичность связывания с CTLA-4. См. Linsley et al., (1994) Immunity 1:793-801, которая включена в настоящий документ посредством ссылки. CD86 млекопитающего можно выбирать из CD86 грызунов, таких как мышь, или человека.

«CTLA-4», как используется в настоящем документе, относится к ассоциированному с цитотоксическими лимфоцитами антигену-4 млекопитающего (CTLA-4). Последовательность CTLA-4 человека можно найти в GenBank, номер доступа AAH74893.1, GI:49904741. CTLA-4 млекопитающего можно выбирать из CTLA-4 грызунов, таких как мышь, или человека.

«LAG-3», как используется в настоящем документе, относится к антигену 3 активации лимфоцитов млекопитающих (LAG-3). Последовательность LAG-3 человека можно найти в Huard et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 94:5744-5749, включенной в настоящий документ посредством ссылки. LAG-3 млекопитающего можно выбирать из LAG-3 грызунов, таких как мышь, или человека.

«MHC» представляет собой комплекс, вовлеченный в представление пептидов, полученных из антигенов, посредством антигенпредставляющих клеток, который распознается посредством TCR. В определенном аспекте, MHC представляет собой MHCII, который представляет антиген CD4⁺ T-хелперным клеткам. См., например, Wucherpfennig et al., CSH Perspect. Biol. 2(4): a005140, электронная публикация 17 марта 2010 года.

Биспецифическое биологическое средство, которое можно обозначать как биспецифический лиганд, представляет собой лиганд, который способен связывать или быть связанным двумя мишенями одновременно. Биспецифические антитела известны в данной области и дополнительно описаны ниже. В контексте настоящего изобретения две мишени представляют собой молекулу CTLA-4 на T-клетке и комплекс пептид-MHC на APC. Биспецифическое биологическое средство в соответствии с изобретением может сшивать две мишени; посредством связывания pMHC с TCR в иммунном синапсе, соответствующим образом, сшивает молекулу CTLA-4 с TCR. «Биологическое средство», в целом, представляет собой биологическое терапевтическое средство или средство, которое можно использовать, inter alia, для терапевтических, диагностических и/или исследовательских целей.

Линкер представляет собой какую-либо аминокислотную последовательность, которая соединяет и разделяет два полипептидных домена в белке. В контексте биспецифического лиганда по изобретению, линкер представляет собой последовательность, которая соединяет лиганд CTLA-4 с лигандом MHC. Примерные линкеры представляют собой последовательности аминокислот, такие как полиглицин, например, Gly-9. Альтернативный линкер представляет собой Fc-область антитела. Такой линкер разносит два домена лигандов приблизительно на 120Å.

Лиганд в соответствии с изобретением может включать антитело и неантительные лиганды в какой-либо комбинации. Например, лиганд CTLA-4 может представлять собой антитело против CTLA-4, и лиганд MHC может представлять собой LAG-3. Альтернативно, CD80 можно использовать в качестве лиганда CTLA-4, в комбинации с LAG-3 или антителом против MHC. Оба лиганда могут представлять собой антитела, или оба могут представлять собой природные лиганды, CD80 и LAG-3.

Ассоциированный с цитотоксическими лимфоцитами антиген-4 (CTLA-4)

Ассоциированный с цитотоксическими T-лимфоцитами антиген-4 (CTLA-4), также известный как CD152, представляет собой негативный регулятор T-клеточного ответа, который играет важную роль в поддержании T-клеточного гомеостаза и в индукции аутотолерантности (Karandikar et al., (1996) J Exp Med 184:783-788; Krummel and Allison, (1995) J Exp Med 182:459-465; Linsley and Golstein, (1996) Curr Biol 6:398-400; Walunas and Bluestone, (1998) J Immunol 160:3855-3860; Walunas et al., (1994) J Immunol 160:3855-3860). Мыши с дефицитом по CTLA-4 развивают полиорганные аутоиммунные заболевания и типично не выдерживают болезни в возрасте 4 недель (Tivol et al., (1995) Immunity 3:541-547; Waterhouse et al., (1995) Science 270:985-988). Молекулярные механизмы, через которые CTLA-4 модулирует T-клеточную активность, являются многогранными, и полагают, что они возникают либо свойственным образом на стандартных T-клетках, либо под влиянием внешних факторов посредством T-регуляторных клеток (T-регуляторные клетки) (Ise et al., (2010) Nat Immunol 11:129-135; Jain et al., (2010) Proc Natl Acad Sci USA 107:1524-1528; Paterson and Sharpe, (2010) Nat Immunol 11:109-111).

Эти механизмы включают конкуренцию с CD28 за связывание лиганда (Linsley et al., (1994) Immunity 1:793-801), что индуцирует образование толерогенного фермента индоламин-2,3-диоксигеназы в APC (Grohmann et al., (2002) Nat Immunol 3:1097-1101; Onodera et al., (2009) J Immunol 183:5608-5614), и вытеснение CD28 из иммунологического синапса (Pentcheva-Hoang et al., (2004) Immunity 21:401-413). CTLA-4 гомологичен костимуляторной молекуле CD28 и имеет те же лиганды, CD80 (B7.1) и CD86 (B7.2), которые экспрессируются на поверхности антигенпредставляющих клеток (APC). Однако, дифференциальное связывание CD80/CD86 на APC с CD28 и CTLA-4 на эффекторных T-клетках ведет к противоположным исходам, причем CD28 запускает T-клеточную активацию, и CTLA-4 вызывает T-клеточное ингибирование. Вовлечение CTLA-4 посредством его лигандов (CD80/86) на APC также стимулирует рекрутирование фосфатаз SHP-1 (Guntermann and Alexander, (2002) J Immunol 168:4420-4429) и PP2A (Baroja et al., (2002) J Immunol 168:5070-5078; Chuang et al., (2000) Immunity 13:313-322) вблизи TCR на T-клетках, подвергающихся активации. Последующее дефосфорилирование ключевых молекул передачи сигнала, ассоциированных с TCR, ведет к терминации T-клеточной активации (Griffin et al., (2000) J Immunol 164:4433-4442). Кроме того, вмешательства, которые содействуют раннему вовлечению CTLA-4 с его лигандами и сшивке с TCR, ведут к преждевременному ослаблению ключевых сигнатур передачи сигнала и последующему ингибированию T-клеточной активации, что ведет к гипореактивности T-клеток или анергии (Blair et al., (1998) Immunol 160:12-15; Griffin et al., (2000) J Immunol 164:4433-4442; Krummel and Allison, (1996) J Exp Med 182:459-465; Walunas et al., (1996) J Exp Med 183:2541-2550).

Чтобы содействовать сшивке CTLA-4 с TCR во время ранней фазы T-клеточной активации, создавали биспецифический слитый белок (обозначаемый как «BsB»), содержащий мутантный CD80 (CD80w88a) и ген-3 активации лимфоцитов (LAG-3). BsB конструировали для того, чтобы параллельно вовлекать CTLA-4 и MHCII в иммунном синапсе и тем самым опосредованно сшивать его с TCR через когнатное образование пары MHCII с TCR (Karman et al., (2012) J Biol Chem epub 2012 Feb 15). Показано, что BsB эффективен в аллогенной MLR при ингибировании T-клеточной активации. К удивлению, BsB также индуцировал образование IL-10 и TGF-β и способствовал дифференциации T-клеток, подвергающихся активации, в T-регуляторные клетки. IL-10 может проявлять широкие иммуносупрессорные свойства за счет своей способности управлять активацией макрофагов и дендритных клеток (DC), а также обеспечивать саморегуляцию клеток Th1 (Ohata et al., (2007) Arthritis Rheum 56:2947-2956). TGF-β может действовать в качестве ингибитора дифференциации T-клеток (Kehrl et al., (1986) J Exp Med 163:1037-1050), активации макрофагов (Tsunawaki et al., (1988) Nature 334:260-262; Wahl et al., (1990) Ann N Y Acad Sci 593:188-196) и созревания дендритных клеток (Steinman et al., (2003) Annu Rev Immunol 21:685-711). В дополнение к их противовоспалительным функциям, IL-10 и TGF-β также предположительно могут влиять на функцию T-регуляторных клеток. Например, показано, что IL-10 индуцирует продуцирующие IL-10 клетки Th1 (Roncarolo et al., (2006) Immunol Rev 212:28-50) и действует на Foxp3⁺ T-регуляторные клетки, поддерживая экспрессию Foxp3 и тем самым распространяя их функцию подавления (Murai et al., (2009) Nat Immunol 10:1178-1184). Аналогичным образом, сообщалось, что TGF-β необходим для индукции T-регуляторных клеток (Chen et al., (2003) J Exp Med 198:1875-1886; Zheng et al., (2002) J Immunol 169:4183-4189) и в поддержании их функции подавления посредством содействия экспрессии Foxp3 (Marie et al., (2005) J Exp Med 201:1061-1067).

T-регуляторные клетки

T-регуляторные клетки представляют собой функционально отличную субпопуляцию T-клеток, способных контролировать иммунный ответ на свои и чужие антигены. Дефицит T-регуляторных клеток ведет к повышенному иммунному ответу и появлению аутоиммунных заболеваний (Sakaguchi et al., (1995) J Immunol 155:1151-1164). Экстенсивные исследования установили роль этих специализированных T-клеток в управлении всеми аспектами иммунного ответа, в частности, в возникновении аутотолерантности. Не ограничиваясь конкретной теорией, эти находки указывают на то, что средства, способные стимулировать образование T-регуляторных клеток in situ или адоптивный перенос T-регуляторных клеток, можно использовать для лечения аутоиммунных заболеваний. В действительности, показана эффективность клеточной терапии T-регуляторными клетками с использованием свежевыделенных или размноженных ex vivo T-регуляторных клеток при лечении диабета 1 типа на животных моделях (T1D) (Tang et al., (2004) J Exp Med 199:1455-1465; Tarbell et al., (2007) J Exp Med 204:191-201) и реакции «трансплантат против хозяина» (Anderson et al., (2004); Taylor et al., (2002) Blood 99:3493-3499; Zhao et al., (2008) Blood 112:2129-2138). Вместо выделения и размножения Foxp3⁺CD4⁺CD25⁺ T-регуляторных клеток (часто обозначаемых как естественные T-регуляторные клетки или nTreg) из периферической крови или лимфатических узлов, T-регуляторные клетки можно индуцировать из наивных CD4⁺CD25^- T-клеток в контексте TCR активации и при сопутствующем присутствии TGF-β. Эти T-регуляторные клетки часто обозначают как адаптивные T-регуляторные клетки или индуцированные T-регуляторные клетки (индуцированные T-регуляторные клетки). Также они являются Foxp3⁺ и предположительно проявляют в равной мере потентные функции подавления, как естественные T-регуляторные клетки (Chen et al., (2003) J Exp Med 198:1875-1886; Yamagiwa et al., (2001) J Immunol 166:7282-7289; Zheng et al., (2002) J Immunol 169:4183-4189). Показано, что адоптивные переносы адаптивных T-регуляторных клеток или индуцированных T-регуляторных клеток эффективно дают защиту против аутоиммунного заболевания коллаген-индуцированного артрита в животной модели (Gonzalez-Rey et al., (2006) Arthritis Rheum 54:864-876). Однако становится более очевидным, что антиген-специфические T-регуляторные клетки обладают свойством значительно более сильного терапевтического средства, чем поликлональные T-регуляторные клетки, с репертуаром, охватывающим все TCR (Masteller et al., (2005) J Immunol 175:3053-3059; Tang et al., (2004) J Exp Med 199:1455-1465; Tarbell et al., (2007) J Exp Med 204:191-201), при меньших побочных эффектах, оказываемых на подавление всего иммунитета. По этой причине, авторы настоящего изобретения решили оценивать относительное качество BsB в отношении образования антиген-специфических T-регуляторных клеток в антиген-специфической обстановке T-клеточной активации in vitro. Кроме того, авторы настоящего изобретения тестировали его потенциал для лечения аутоиммунного диабета у не страдающих ожирением мышей с диабетом (NOD).

Диабет 1 типа

Диабет 1 типа (T1D) представляет собой аутоиммунное заболевание, обусловленное тканеспецифическим разрушением инсулин-продуцирующих β-клеток поджелудочной железы с последующим развитием гипергликемии. Не страдающие ожирением мыши с диабетом (NOD) (в частности, самки мышей) самопроизвольно развивают аутореактивные T-клетки в направлении собственных специфичных антигенов островков (например, инсулин и декарбоксилаза глутаминовой кислоты 65). Согласованно с другими лимфоцитами, эти аутореактивные T-клетки инициируют развитие периинсулита между 3 и 4 неделями от рождения с последующим инвазивным инсулитом через 9 недель и самопроизвольным манифестным диабетом между 12 и 35 неделями (Anderson and Bluestone, (2005) Annu Rev Immunol 23:447-485). Мыши NOD имеют многие сходства с заболеванием у человеческих субъектов, такие как образование специфичных к поджелудочной железе аутоантител и активация аутореактивных CD4⁺ и CD8⁺ T-клеток. На восприимчивость этих мышей к аутоиммунным реакциями, как у человека, влияют гены главного комплекса гистосовместимости (MHC), CTLA-4 и LAG-3. Мыши NOD несут уникальный гаплотип главного комплекса гистосовместимости (MHC) (H-2^g7), который, как сообщают, обладает наивысшим риском восприимчивости к заболеванию (McDevitt et al., (1996) Hormone and metabolic research 28:287-288; Wicker et al., (1995) Annu Rev Immunol 13:179-200). У мышей NOD (Ueda et al., (2003) Nature 423:506-511) и у человека (Qu et al., (2009) Genes and immunity 10 Suppl 1:S27-32) также отмечали полиморфизм CTLA-4, а дефицит LAG-3 на фоне NOD ускоряет начало T1D со 100% пенетрантностью (Bettini et al., (2011) J Immunol 187:3493-3498). Поскольку BsB вовлекает все эти мишени, терапевтическое качество BsB тестировали на этой мышиной модели T1D.

Антитела

Данное изобретение относится к антигенсвязывающим фрагментам антител, изложенных в формуле изобретения. Как используется в настоящем документе, термин «фрагменты» относится к частям интактного полноразмерного антитела, таким как область связывания антигена или вариабельная область интактного антитела. Примеры фрагментов антител изложены выше.

Термин «фрагменты», как используется в настоящем документе, относится к фрагментам, способным связывать точно определенные мишени, молекулу CTLA-4 или комплекс pMHC. У этих фрагментов может отсутствовать Fc фрагмент интактного антитела, они могут быстрее выводиться из циркуляции и могут обладать меньшим неспецифическим связыванием с тканями, чем интактное антитело. Эти фрагменты можно получать из интактных антител с использованием хорошо известных способов, например, посредством протеолитического расщепления ферментами, такими как папаин (для получения фрагментов Fab) или пепсин (для получения фрагментов F(ab)₂), или экспрессии таких фрагментов посредством рекомбинантной технологии.

Антитела и фрагменты также охватывают одноцепочечные фрагменты антител (scFv), которые связываются с молекулой CTLA-4 или комплексом pMHC. scFv содержит вариабельную область тяжелой цепи (V_H) антитела, функционально связанную с вариабельной областью легкой цепи (V_L) антитела, где вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи, вместе или по отдельности, образуют сайт связывания, который связывает молекулу CTLA-4 или комплекс pMHC. scFv может содержать область V_H на аминоконце и область V_L на карбоксиконце. Альтернативно, scFv может содержать область V_L на аминоконце и область V_H на карбоксиконце. Кроме того, несмотря на то, что два домена фрагмента Fv, V_L и V_H, кодируют отдельные гены, их можно соединять, используя рекомбинантные способы, посредством синтетического линкера, который позволяет получать их в виде одной белковой цепи, в которой области V_L и V_H образуют пары для того, чтобы формировать одновалентные молекулы (известные как одноцепочечные Fv (scFv)). scFv может необязательно дополнительно содержать полипептидный линкер между вариабельной областью тяжелой цепи и вариабельной областью легкой цепи.

Антитела и фрагмента также охватывают фрагменты доменных антител (dAb), как описано в Ward, E.S. et al. (1989) Nature 341:544-546, которые состоят из домена V_H.

Антитела и фрагменты также охватывают антитела из тяжелых цепей (HCAb). Эти антитела могут явно формировать антигенсвязывающие области с использованием только вариабельной области тяжелой цепи в том отношении, что эти функциональные антитела представляют собой димеры только тяжелых цепей (называемые как «антитела из тяжелых цепей» или «HCAb»). Соответственно, антитела и фрагменты могут представлять собой антитела из тяжелых цепей (HCAb), которые специфически связываются с мишенями CTLA-4 или pMHC.

Антитела и фрагменты также охватывают антитела, которые представляют собой SMIP или слитые белки иммуноглобулинов со связывающими доменами со специфичностью к мишеням CTLA-4 или pMHC. Эти конструкции представляют собой одноцепочечные полипептиды, которые содержат антигенсвязывающие домены, слитые с доменами иммуноглобулинов, необходимыми для осуществления эффекторных функций антитела (см. WO 2005/017148).

Антитела и фрагменты также охватывают диатела. Они представляют собой двухвалентные антитела, домены V_H и V_L которых экспрессируют на одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который слишком короток для того, чтобы сделать возможным образование пары между двумя доменами одной и той же цепи. Это заставляет домены образовывать пару с комплементарными доменами другой цепи и тем самым создает два участка связывания антигена (см., например, WO 93/11161). Диатела могут быть биспецифическими или моноспецифическими.

Антитела или фрагменты этих антител в соответствии с изобретением не обладают перекрестной реактивностью с какой-либо мишенью, отличной от предполагаемых мишеней CTLA-4 или pMHC.

Сами антитела и их фрагменты могут быть биспецифическими. Например, биспецифические антитела могут походить на простые антитела (или фрагменты антител), но иметь два различных антигенсвязывающих участка (вариабельные области). Биспецифические антитела можно получать с помощью различных способов, таких как химические способы, способы «polydoma» или способы рекомбинантной ДНК. Биспецифические антитела могут иметь специфичности связывания для по меньшей мере двух различных эпитопов, например, по одному эпитопу на каждой из мишеней CTLA-4 и pMHC.

Биспецифические антитела, содержащие комплементарные пары областей V_H и V_L, известны в данной области. Эти биспецифические антитела содержат две пары V_H и V_L, каждая пара V_HV_L связывается с одним антигеном или эпитопом. Такие биспецифические антитела включают межвидовые гибридомы (Milstein, C. and Cuello, A.C., (1983) Nature 305 (5934): 537-40), миниантитела (Hu et al., (1996) Cancer Res. 56:3055-3061), диатела (Holliger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; WO 94/13804), хелатирующие рекомбинантные антитела (CRAb) (Neri et al., (1995) J. Mol. Biol. 246,367-373), биспецифические scFv (например, Atwell et al., (1996) Mol. Immunol. 33:1301-1312), стабилизированные антитела «выпуклости в отверстия» (Carter et al., (1997) Protein Sci. 6:781-788). В каждом случае каждый вид антитела содержит два участка связывания антигена, каждому подходит комплементарная пара доменов V_H и V_L. Каждое антитело тем самым способно связывать два различных антигена или эпитопа одновременно, при этом связывание с каждым антигеном или эпитопом опосредовано доменом V_H и комплементарным ему доменом V_L.

Описаны естественные аутоантитела, обладающие полиреактивностью (Casali and Notkins (1989) Ann. Rev. Immunol. 7: 515-531), которые реагируют по меньшей мере с двумя (обычно более) различными антигенами или эпитопами, которые структурно не связаны. Также показано, что отбор из случайного репертуара пептидов с использованием технологии фагового дисплея на моноклональном антителе позволяет идентифицировать спектр пептидных последовательностей, которые имеют антигенсвязывающий участок. Некоторые последовательности являются близкородственными и имеют консенсусную последовательность, тогда как другие очень сильно отличаются и называются мимеотопами (Lane and Stephen (1993) Current Opinion in Immunology 5:268-271). Следовательно, ясно, что сайт связывания антитела, содержащего ассоциированные и комплементарные домены V_H и V_L, обладает потенциалом связываться с многими различными антигенами из огромного спектра известных антигенов.

В WO 03/002609 (Domantis) описано получение антител с двойной специфичностью, в котором каждая пара V_HV_L обладает двойной специфичностью, т.е. способна связывать два эпитопа на одном и том же или различных антигенах. Конформация может быть открытой или закрытой; в открытой конформации, два эпитопа могут быть связаны одновременно, а в закрытой конформации связывание с первым эпитопом предотвращает или ограничивает связывание со вторым.

Неиммуноглобулиновые белки с множеством специфичностей связывания известны в природе; например, многие факторы транскрипции связываются как с ДНК, так и с другими белковыми молекулами. Однако способы отбора связывающих пептидов известного уровня техники позволяют отбирать только пептиды с одной, а не двойной или множественной специфичностью.

Ранее различные команды исследователей привязывали полипептиды остатками цистеина к синтетическим молекулярным структурам (Kemp, D.S. and McNamara, P.E., (1985) J. Org. Chem. Timmerman, P. et al., (2005) ChemBioChem. 6(5):821-4). Meloen и сотрудники использовали трис(бромметил)бензол и родственные молекулы для быстрого и количественного закольцовывания множества пептидный петель на синтетических каркасах для структурной мимикрии поверхностей белков (Timmerman, P. et al., (2005) ibid). Способы создания соединений возможных лекарственных средств, где указанные соединения создают посредством связывания содержащих цистеин полипептидов с молекулярным каркасом, например, такие как трис(бромметил)бензол, раскрыты в WO 2004/077062 и WO 2006/078161. Отбор таких молекул с использованием технологии дисплеев описан в WO 2009/098450. Варианты осуществления с двойной специфичностью дополнительно описаны в WO 2010/089117.

Лиганд, такой как антитело или его фрагмент, можно модифицировать для повышения его время полужизни в сыворотке, например, посредством добавления молекул, таких как PEG или другие водорастворимые полимеры, включая полисахаридные полимеры, чтобы повышать время полужизни. В одном из вариантов осуществления Fc-область антитела можно добавлять к биспецифическому линкеру в соответствии с изобретением, чтобы повышать время полужизни в циркуляции.

Получение антител

Получение антител можно осуществлять посредством какого-либо способа, известного в данной области, включая трансгенные организмы, такие как козий (см. Pollock et al. (1999) J. Immunol. Methods 231:147-157), куриный (см. Morrow, KJJ (2000) Genet. Eng. News 20:1-55), мышиный (см. Pollock et al. ibid) или растительный (см. Doran PM (2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11:199-204; Ma, JK-C (1998) Nat.Med. 4:601-606; Baez, J. et al. (2000) BioPharm. l3:50-54; Stoger, E. et al. (2000) Plant Mol. Biol. 42:583-590). Антитела также можно получать посредством химического синтеза; однако экспрессия генов, кодирующих антитела, в клетках-хозяевах является предпочтительной.

Полинуклеотид, кодирующий антитело, выделяют и вставляют в реплицируемую конструкцию или вектор, такой как плазмида, для дальнейшего размножения или экспрессии в клетке-хозяине. В данной области доступны конструкции или векторы (например, экспрессирующие векторы), подходящие для экспрессии гуманизированного иммуноглобулина в соответствии с изобретением. Доступны различные векторы, включая векторы, которые содержатся в одной копии или во множестве копий в клетке-хозяине или которые встраиваются в хромосому(-ы) клетки-хозяина. Конструкции или векторы можно вводить в подходящую клетку-хозяина, и клетки, которые экспрессируют гуманизированный иммуноглобулин, можно получать и поддерживать в культуре. Один вектор или множество векторов можно использовать для экспрессии гуманизированного иммуноглобулина.

Полинуклеотиды, кодирующие антитела, легко выделять и секвенировать с использованием стандартных процедур (например, олигонуклеотидных зондов). Векторы, которые можно использовать, включают плазмиду, вирус, фаг, транспозоны, минихромосомы, среди которых плазмиды представляют собой типичный вариант осуществления. В целом такие векторы дополнительно включают сигнальную последовательность, участок начала репликации, один или несколько маркерных генов, энхансерный элемент, промотор и последовательности терминации транскрипции, функционально связанные с полинуклеотидом легкой и/или тяжелой цепи с тем, чтобы содействовать экспрессии. Полинуклеотиды, которые кодируют легкую и тяжелую цепи, можно вставлять в отдельные векторы и вводить (например, посредством трансформации, трансфекции, электропорации или трансдукции) в одну и ту же клетку-хозяина параллельно или последовательно, или, если желательно, как тяжелую цепь, так и легкую цепь можно вставлять в один и тот же вектор перед таким введением.

Промотор может быть предусмотрен для экспрессии в подходящей клетке-хозяине. Промоторы могут быть конститутивными или индуцибельными. Например, промотор может быть так функционально связан с нуклеиновой кислотой, кодирующей гуманизированный иммуноглобулин или цепь иммуноглобулина, что он направляет экспрессию кодируемого полипептида. Доступно множество подходящих промоторов для прокариотических и эукариотических организмов-хозяев. Прокариотические промоторы включают промоторы lac, tac, T3, T7 для E. coli; 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, например, енолазы, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, гексокиназы, пируватдекарбоксилазы, фосфофруктокиназы, глюкозо-6-фосфатизомеразы, 3-фосфоглицератмутазы и глюкокиназы. Эукариотические промоторы включают индуцибельные промоторы дрожжей, например, алкогольдегидрогеназы-2, изоцитохрома C, кислой фосфатазы, металлотионеина и ферментов, отвечающих за метаболизм азота или использование мальтозы/галактозы; промоторы РНК полимеразы II, включая вирусные промоторы, например, вируса полиомы, вируса оспы кур и аденовирусов (например, аденовируса 2), вируса папилломы крупного рогатого скота, вируса саркомы птиц, цитомегаловируса (в частности, предранний промотор гена), ретровируса, вируса гепатита B, актина, промотор вируса саркомы Рауса (RSV) и ранний или поздний промотор вируса обезьян 40 и невирусные промоторы, такие как EF-1α (Mizushima and Nagata (1990) Nucleic Acids Res. 18(17):5322). Специалисты в данной области способны выбирать подходящий промотор для экспрессии гуманизированного антитела или его части по изобретению.

Где это применимо, например, для экспрессии в клетках высших эукариотов, дополнительные энхансерные элементы могут содержаться вместо тех, которые найдены в промоторах, описанных выше, или вместе с ними. Подходящие энхансерные последовательности млекопитающих включают энхансерные элементы из глобина, эластазы, альбумина, фетопротеина, металлотионина и инсулина. Альтернативно, можно использовать энхансерный элемент из вируса эукариотических клеток, такой как энхансер SV40, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы, энхансер бакуловируса или локус IgG2a мыши (см. WO 04/009823). Хотя такие энхансеры типично расположены в векторе, в сайте выше по направлению считывания относительно промотора, они также могут располагаться в другом месте, например, внутри нетранслируемой области или ниже по направлению считывания относительно сигнала полиаденилирования. Выбор и расположение энхансера могут быть основаны на совместимости с клеткой-хозяином, используемой для экспрессии.

Кроме того, векторы (например, экспрессирующие векторы) типично содержат селективный маркер для отбора клеток-хозяев, несущих вектор и, в случае реплицируемого вектора, участок начала репликации. Гены, кодирующие продукты, которые придают устойчивость к антибиотикам или лекарственным средствам, представляют собой обычные селективные маркеры, и их можно использовать в прокариотических (например, ген β-лактамазы (устойчивость к ампициллину), ген Tet (устойчивость к тетрациклину)) и эукариотических клетках (например, гены устойчивости к неомицину (G418 или генетицин), gpt (микофеноловая кислота), ампициллину или гигромицину). Маркерные гены дигидрофолатредуктазы делают возможным отбор с использованием метотрексата в различных организмах-хозяевах. Гены, кодирующие продукты генов ауксотрофных маркеров организма-хозяина (например, LEU2, URA3, HIS3), часто используют в качестве селективных маркеров в дрожжах. Также предусмотрено использование вирусных (например, бакуловирусных) или фаговых векторов и векторов, которые способны встраиваться в геном клетки-хозяина, такие как ретровирусные векторы.

В эукариотических системах сигналы полиаденилирования и терминации функционально связаны с полинуклеотидом, кодирующим антитело по данному изобретению. Такие сигналы типично расположены ближе к 3'-концу от открытой рамки считывания. В системах млекопитающих неограничивающие примеры сигналов полиаденилирования/терминации включают те, что получены из гормонов роста, генов фактора элонгации-1α и вирусных (например, SV40) генов или ретровирусных длинных концевых повторов. В дрожжевых системах неограничивающие примеры сигналов полиаденилирования/терминации включают те, что получают из генов фосфоглицераткиназы (PGK) и алкогольдегидрогеназы-1 (ADH). В прокариотических системах сигналы полиаденилирования типично не нужны, и в них вместо этого используют более короткие и более определенные терминаторные последовательности. Выбор последовательностей полиаденилирования/терминации может быть основан на совместимости с клеткой-хозяином, используемой для экспрессии. В дополнение к изложенному выше, другие признаки, которые можно использовать для увеличения выхода, включают хроматин-ремоделирующие элементы, интроны и модификации кодонов, специфичные для клетки-хозяина. Использование кодонов антитела по данному изобретению можно модифицировать для того, чтобы сделать использование кодонов клеткой-хозяином более эффективным для увеличения транскрипции и/или выхода продукта (например, Hoekema, A. et al. (1987) Mol Cell Biol. 7(8):2914-24). Выбор кодонов может быть основан на совместимости с клеткой-хозяином, используемой для экспрессии.

Изобретение, таким образом, относится к выделенным молекулам нуклеиновой кислоты, которые кодируют гуманизированные иммуноглобулины по данному изобретению или их тяжелые или легкие цепи. Изобретение также относится к выделенным молекулам нуклеиновой кислоты, которые кодируют антигенсвязывающие части иммуноглобулинов и их цепи.

Антитела в соответствии с данным изобретением можно получать, например, посредством экспрессии одной или нескольких рекомбинантных нуклеиновых кислот, которые кодируют антитела, в подходящей клетке-хозяине. Клетку-хозяина можно получать с использованием любых подходящих способов. Например, экспрессионные конструкции (например, один или несколько векторов, например, экспрессирующий вектор клетки млекопитающего), описанные в настоящем документе, можно вводить в подходящую клетку-хозяина, и получаемую клетку можно поддерживать (например, в культуре, в животном, в растении) в условиях, подходящих для экспрессии конструкции(-ий) или вектора(-ов). Подходящие клетки-хозяева могут представлять собой прокариотические, включая бактериальные клетки, такие как E. coli (например, штамм DH5a™ (Invitrogen, Carlsbad, CA), клетки PerC6 (Crucell, Leiden, NL), B. subtilis и/или другие подходящие бактерии; эукариотические клетки, такие как грибковые или дрожжевые клетки (например, Pichia pastoris, Aspergillus sp., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa), или другие клетки низших эукариотов, и клетки высших эукариотов, такие как клетки насекомых (например, клетки S2 Drosophila Schnieder, клетки насекомых Sf9 (WO 94/126087 (O'Connor), клетки насекомых TN5BI-4 (HIGH FIVE™) (Invitrogen), млекопитающих (например, клетки COS, такие как COS-I (№ доступа ATCC CRL-1650) и COS-7 (№ доступа ATCC CRL-1651), CHO (например, № доступа ATCC CRL-9096), CHO DG44 (Urlaub, G. and Chasin, LA., (1980) Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 77(7):4216-4220), 293 (№ доступа ATCC CRL-1573), HeLa (№ доступа ATCC CCL-2), CVI (№ доступа ATCC CCL-70), WOP (Dailey, L., et al., (1985) J. Virol., 54:739-749), 3T3, 293T (Pear, W.S., et al, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:8392-8396), клетки NSO, клетки SP2/0, клетки HuT 78 и т.п., или растений (например, табака, ряски и водорослей). См., например, Ausubel, F.M. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc. (1993). В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин не представляет собой часть многоклеточного организма (например, растения или животного), например, она представляет собой выделенную клетку-хозяина или часть клеточной культуры.

Клетки-хозяева можно культивировать во вращающихся колбах, встряхиваемых колбах, вращающихся флаконах, волновых биореакторах (например, System 1000 из wavebiotech.com) или системах полых волокон, но предпочтительным для получения в большом масштабе является использование биореакторов в перемешиваемых баках или биореакторов в виде мешков (например, Wave Biotech, Somerset, New Jersey USA), в частности, для суспензионных культур. Типично биореакторы в перемешиваемых баках адаптируют для аэрации с использованием например, барботеров, дефлекторов или импеллеров с низким сдвиговым усилием. Для барботажных колонок и аэролифтных биореакторов можно использовать прямую аэрацию пузырьками воздуха или кислорода. Когда клетки-хозяева культивируют в среде для культивирования без сыворотки, в среду можно добавлять защищающее клетки средство, такое как плюроник F-68, чтобы помогать предотвращать повреждение клеток в результате процесса аэрации. В зависимости от характеристик клетки-хозяина, можно использовать микроносители в качестве субстратов для роста для зависящих от закрепления клеточных линий, или клетки можно адаптировать к суспензионной культуре. При культивировании клеток-хозяев, в частности, клеток-хозяев позвоночных, можно использовать различные режимы работы, такие как порционный, порционный с подпиткой, повторный порционный способ (см. Drapeau et al (1994) Cytotechnology 15: 103-109), расширенный порционный способ или перфузионная культура. Несмотря на то, что рекомбинантно трансформированные клетки-хозяева млекопитающих можно культивировать в содержащих сыворотку средах, такие среды содержат эмбриональную телячью сыворотку (FCS), предпочтительно такие клетки-хозяева культивировать в среде без сыворотки, например, раскрытой в Keen et al (1995) Cytotechnology 17:153-163, или коммерчески доступных средах, таких как ProCHO-CDM или UltraCHO™ (Cambrex NJ, USA), при необходимости, с добавлением источника энергии, такого как глюкоза, и синтетических факторов роста, таких как рекомбинантный инсулин. Бессывороточное культивирование клеток-хозяев может требовать того, чтобы эти клетки адаптировать к росту в условиях без сыворотки. Один подход к адаптации состоит в культивировании таких клеток-хозяев в содержащих сыворотку средах и повторно заменять 80% среды для культивирования на бессывороточные среды с тем, чтобы обучать клетки-хозяева для того, чтобы адаптировать к условиям без сыворотки (см. например, Scharfenberg K. et al (1995) в Animal Cell Technology Developments Towards the 21st Century (Beuvery E.C. et al eds), стр. 619-623, Kluwer Academic publishers).

Антитела в соответствии с изобретением можно секретировать в среду и собирать и очищать от нее с использованием различных способов, чтобы обеспечить степень очистки, подходящую для предполагаемого использования. Например, использование терапевтических антител по изобретению для лечения пациентов-людей типично предписывает по меньшей мере 95% чистоту, как определяют посредством восстанавливающего SDS-PAGE, более типично 98% или 99% чистоту, по сравнению со средами для культивирования, содержащим терапевтические антитела. В первом случае клеточный детрит из среды для культивирования типично удаляют с использованием центрифугирования с последующей стадией осветления супернатанта с использованием, например, микрофильтрования, ультрафильтрования и/или глубокого фильтрования. Альтернативно, антитело можно собирать посредством микрофильтрования, ультрафильтрования или глубокого фильтрования без предшествующего центрифугирования. Доступны различные другие способы, такие как диализ и электрофорез в геле, и хроматографические способы, такие как гидроксиапатитная (HA), аффинная хроматография (необязательно содержит систему аффинного мечения, такую как полигистидин) и/или хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC) (см. US 5429746). В одном из вариантов осуществления антитела по изобретению после различных стадий осветления захватывают с использованием белка A или аффинной хроматографии на белке G с последующими дополнительными стадиями хроматографии, такими как ионообменная и/или HA хроматография, анионообменная или катионообменная, эксклюзионная хроматография и преципитация сульфатом аммония. Типично, также используют различные стадии удаления вирусов (например, нанофильтрование с использованием, например, фильтра DV-20). После этих различных стадий предоставляют очищенный препарат, содержащий по меньшей мере 100 мг/мл или более, например, 100 мг/мл или более антитела по изобретению, и, следовательно, формируют вариант осуществления изобретения. Концентрацию до 100 мг/мл или более можно создавать посредством ультрацентрифугирования. Такие препараты по существу не содержат агрегированные формы антител по изобретению.

Бактериальные системы особенно подходят для экспрессии фрагментов антител. Такие фрагменты локализованы внутриклеточно или внутри периплазмы. Нерастворимые периплазматические белки можно экстрагировать и повторно укладывать для того, чтобы формировать активные белки согласно способам, известным специалистам в данной области, см. Sanchez et al. (1999) J. Biotechnol. 72:13-20; Cupit, PM et al. (1999) Lett. Appl. Microbiol. 29:273-277.

Настоящее изобретение также относится к клеткам, содержащим нуклеиновую кислоту, например, вектор, по изобретению (например, экспрессирующий вектор). Например, нуклеиновую кислоту (т.е., одну или несколько нуклеиновых кислот), кодирующую тяжелые и легкие цепи гуманизированного иммуноглобулина в соответствии с изобретением, или конструкцию (т.е., одну или несколько конструкций, например, один или несколько векторов), содержащую такую нуклеиновую кислоту(-ы), можно вводить в подходящую клетку-хозяина посредством способа, подходящего для выбранной клетки-хозяина (например, трансформация, трансфекция, электропорация, инфекция), при этом нуклеиновая кислота(-ы) является или становится функционально связанной с одним или несколькими элементами, управляющими экспрессией (например, в векторе, в конструкции, создаваемой посредством процессов в клетке, встроенной в геном клетки-хозяина). Клетки-хозяева можно поддерживать в условиях, подходящих для экспрессии (например, в присутствии индуктора, подходящих сред с добавлением подходящих солей, факторов роста, антибиотиков, пищевых добавок и т.д.), посредством чего получают кодируемый полипептид(-ы). При желании, кодированное гуманизированное антитело можно выделять, например, из клеток-хозяев, среды для культивирования или молока. Этот процесс охватывает экспрессию в клетке-хозяине (например, клетке молочной железы) трансгенного животного или растения (например, табака) (см. например, WO 92/03918).

Лиганды CD80

Разработка и конструирование лигандов CD80 направлены на максимизацию специфичности лиганда к CTLA-4 в сравнении с CD28. Последовательность CD80, известная в данной области, приведена, например, в Wu et al., 1997. CD80 содержит внеклеточный домен Ig-V, похожий на вариабельный, и внутриклеточный домен IgC, похожий на константный. В предпочтительном варианте осуществления внеклеточный домен CD80 используют в качестве лиганда. Например, см. SEQ ID NO: 15, в частности остатки 1-241.

Мутации можно выполнять в CD80 человека, для того чтобы повышать аффинность связывания и для того чтобы повышать избирательность к CTLA4 по сравнению с CD28. См., например, Wu et al., 1997.

Можно создавать мутанты, отличные от W84A, включая K71G, K71V, S109G, R123S, R123D, G124L, S190A, S201A, R63A, M81A, N97A, E196A. См. Peach et al., JBC 1995. 270(6): 21181-21187. Оценку аффинности связывания мутантов как с CTLA-4, так и с CD28, можно осуществлять посредством сайт-направленного мутагенеза с последующей экспрессией мутантных полипептидов и определением Kd посредством поверхностного плазмонного резонанса с использованием чипов CTLA-4 и CD28 Biacore. См., например. Guo et al., (1995) J. Exp. Med. 181:1345-55.

Можно выбирать мутанты, которые имеют благоприятные профили связывания и избирательности, и затем оценивать в анализах на основе клеток. Например, проточную цитометрию можно использовать для оценки эффекта дикого типа или мутантного CD80, которым трансфицируют клетки.

Лиганды LAG-3

В данной области описан LAG-3, и охарактеризован сайт связывания с протеином MHCII. См. Huard et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(11): 5744-9. LAG-3 имеет четыре внеклеточных Ig-подобных домена, и в эти домены можно вводить мутации для оптимизирования связывания с MHCII.

Эффективность мутаций можно анализировать, как описано выше в отношении лигандов CD80.

В одном из аспектов лиганд в соответствии с изобретением использует только домены 1 и 2 (D1 и D2) из четырех Ig-подобных доменов LAG-3. Полагают, что эти домены отвечают за взаимодействие с белком MHCII.

Конструкции биспецифических лигандов

Конструкция биспецифического лиганда повторяет общую формулу «лиганд-линкер-лиганд». Биспецифические антитела известны в данной области и описаны выше.

Конструирование биспецифических лигандов предпочтительно включает конструирование и экспрессию подходящего гена, кодирующего желаемый полипептид. Другие способы конструирования включают смешивание двух полипептидов в условиях, которые делают возможным образование ковалентных, ионных или гидрофобных связей. В предпочтительных вариантах осуществления они включают ковалентное связывание полипептидов. Когда конструируют биспецифическую молекулу, которая содержит три компонента, такие как лиганд CTLA-4, линкер и лиганд MHC, два из трех можно комбинировать, связывать вместе, а третий полипептид впоследствии добавлять к продукту слияния, и связывать для того, чтобы создавать продукт слияния, который содержит все три полипептида.

Полипептиды в соответствии с настоящим изобретением можно получать посредством любого желательного способа, включая химический синтез, выделение из биологических образцов и экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей такой полипептид. Нуклеиновые кислоты, в свою очередь, можно синтезировать или выделять из биологических источников и, при желании, модифицировать посредством сайт-специфического мутагенеза.

Изобретение, таким образом, относится к векторам, которые кодируют биспецифический лиганд в соответствии с изобретением, или его фрагмент. Вектор может представлять собой, например, фаг, плазмиду, вирусный или ретровирусный вектор.

Нуклеиновые кислоты в соответствии с изобретением могут представлять собой часть вектора, содержащего селективный маркер для размножения в организме-хозяине. В целом, плазмидный вектор вводят в преципитате, таком как преципитат фосфатом кальция, или в комплексе с заряженным липидом.

Если вектор представляет собой вирус, его можно упаковывать in vitro с использованием подходящей упаковывающей клеточной линии и затем трансдуцировать в клетки-хозяева.

Вставку нуклеиновой кислоты функционально связывают с подходящим промотором, таким как промотор фага лямбда PL, промоторы lac E. coli, trp, phoA и tac, ранний и поздний промоторы SV40 и промоторы ретровирусных LTR. Другие подходящие промоторы известны специалистам в данной области. Экспрессионные конструкции дополнительно содержат сайты инициации транскрипции, терминации и, в транскрибируемой области, участок связывания рибосомы для трансляции. Кодирующая часть транскриптов, экспрессируемых с помощью конструкций, предпочтительно содержит инициирующий трансляцию кодон в начале и терминирующий кодон (UAA, UGA или UAG), соответствующим образом расположенный на конце полипептида, подлежащего трансляции.

Как показано, экспрессирующие векторы предпочтительно содержат по меньшей мере один селективный маркер. Такие маркеры включают дигидрофолатредуктазу, G418 или устойчивость к неомицину для культуры эукариотических клеток и гены устойчивости к тетрациклину, канамицину или ампициллину для культивирования в E. coli и других бактериях. Репрезентативные примеры подходящих организмов-хозяев включают, но не ограничиваясь этим, бактериальные клетки, такие как клетки E. coli, Streptomyces и Salmonella typhimurium; грибковые клетки, такие как дрожжевые клетки (например, Saccharomyces cerevisiae или Pichia pastoris); клетки насекомых, такие как клетки S2 Drosophila и Sf9 Spodoptera; клетки животных, такие как клетки CHO, COS, HEK293 и клетки меланомы Боуэса; и растительные клетки.

Подходящие среды для культивирования и условия для описанных выше клеток-хозяев известны в данной области и доступны на коммерческой основе.

Векторы, предпочтительные для использования в бактериях, среди прочего, включают pQE70, pQE60 и pQE-9, доступные от QIAGEN, Inc.; векторы pBluescript, векторы Phagescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, доступные в Stratagene Cloning Systems, Inc.; и ptrc99a, pKK2233, pKK233-3, pDR540, pRIT5, доступные от Pharmacia Biotech, Inc. Среди предпочтительных эукариотических векторов pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI и pSG, доступные от Stratagene; и pSVK3, pBPV, pMSG и pSVL, доступные от Pharmacia. Векторы, предпочтительные для использования в экспрессии в клетках млекопитающего, среди прочего включают вектор pSG5, pCMV^∙SPORT6, pcDNA, pCEP4, pREP4, pCI, pSI и pBICEP-CMV. Предпочтительные экспрессирующие векторы для использования в дрожжевых системах включают, но не ограничиваясь этим, pYES2, pYDI, pTEFI/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalph, pPIC9, pPIC3.5, pHILD2, pHIL-SI, pPIC3.5K, pPIC9K и PA0815 (все доступны от Invitrogen, Carlsbad, CA).

Введение конструкции в клетку-хозяина можно осуществлять посредством трансфекции с фосфатом кальция, опосредованной DEAE-декстраном трансфекции, опосредованной катионными липидами трансфекции, электропорации, трансдукции, инфекции или других способов. Такие способы описаны во многих стандартных лабораторных руководствах, таких как Sambrook et al., которое упомянуто выше. Полипептид в соответствии с изобретением можно извлекать и очищать от культуры рекомбинантных клеток посредством общеизвестных способов, включая преципитацию сульфатом аммония или этанолом, экстрагирование кислотой, анионо- или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, хроматографию гидрофобного взаимодействия, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксиапатите и лектиновую хроматографию. Наиболее предпочтительно для очистки используют высокоэффективную жидкостную хроматографию («ВЭЖХ»).

Полипептиды в соответствии с настоящим изобретением также можно извлекать из биологических источников, включая текучие среды организма, ткани и клетки, в частности, клетки, полученные из опухолевой ткани или предполагаемых опухолевых тканей субъекта.

Кроме того, полипептиды в соответствии с изобретением можно синтезировать химически с применением известных в данной области способов (например, см. Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman & Co., N. Y., и Hunkapiller et al., (1984) Nature, 310:105-111). Например, полипептид, содержащий весь биспецифический лиганд в соответствии с изобретением или его часть, можно синтезировать с использованием пептидного синтезатора.

Биспецифические лиганды в соответствии с изобретением описаны в деталях в SEQ ID, приложенных к нему. SEQ ID NO: 1 и 2 предоставляют заменяющую последовательность ДНК и последовательность белка мыши для биспецифических лигандов, в которых лиганд CTLA-4 CD80w88a образует пару с лигандом MHC LAG-3, отделенным Fc-областью IGg2a и последовательностью Gly-9 (G9). Последовательность концевой гистидировой метки (H6) предусмотрена на C-конце. SEQ ID NO: 3 и 4 предоставляют заменяющую последовательность ДНК и последовательность белка мыши для тех же конструкций, что и SEQ ID NO: 1 и 2, за исключением того, что Fc-область IgG2a размещена ближе к C-концу по отношению к полипептиду LAG-3, так что пептиды CD80 и LAG-3 отделяет только G9. Два расположения, с Fc-областью между лигандами или ближе к C-концу по отношению к ним, обозначают как конструкции гена 1 и гена 2, соответственно.

SEQ ID NO: 5 и 6 предоставляют последовательности ДНК и белка человека, в которых сохранена последовательность дикого типа. Не вводили никаких мутаций, ни в CD80, ни в LAG-3.

В SEQ ID NO: 7 и 8 в CD80 человека введена мутация W84A (эквивалент W88A у мыши) и в LAG-3 введена мутация R75E. Остальные SEQ ID NO (7-14) описывают другие мутации в последовательностях CD80 и LAG-3.

Терапевтические применения

Супрессия T-клеточной активности является желаемой во многих ситуациях, в которых иммуносупрессия обоснована и/или возникает аутоиммунное состояние. Соответственно, нацеленное воздействие на взаимодействие CTLA4/MHC показано при лечении заболеваний, в которых имеет место неподходящий или нежелательный иммунный ответ, таких как воспаление, аутоиммунная реакция и состояния, в которые вовлечены такие механизмы. В одном из вариантов осуществления такое заболевание или нарушение является аутоиммунным и/или воспалительным заболеванием. Примеры таких аутоиммунных и/или воспалительных заболеваний изложены выше.

В одном из вариантов осуществления такое заболевание или нарушение представляет собой диабет 1 типа (T1D).

В другом варианте осуществления лиганды в соответствии с изобретением используют для того, чтобы содействовать трансплантации посредством иммуносупрессии субъекта. Такое использование облегчает реакцию «трансплантат против хозяина». Для описания существующего лечения для реакции «трансплантат против хозяина» см. Svennilson, (2005) Bone Marrow Transplantation 35:S65-S67 и цитируемые в ней ссылки. Предпочтительно, антитела по изобретению можно использовать в комбинации с другим доступным лечением.

В отношении лечения аутоиммунных заболеваний, комбинированное лечение может включать введение лиганда по настоящему изобретению вместе с лекарственным средством, которое вместе с лигандом содержит эффективное количество для предотвращения или лечения таких аутоиммунных заболеваний. Где указанным аутоиммунным заболеванием является диабет 1 типа, комбинированное лечение может охватывать одно или несколько из средств, которые способствуют росту β-клеток поджелудочной железы или улучают трансплантацию β-клеток, такие как факторы роста или выживаемости β-клеток или иммуномодулирующие антитела. Когда указанное аутоиммунное заболевание представляет собой ревматоидный артрит, указанное комбинированное лечение может охватывать одно или несколько из метотрексата, антитела против TNF-α, слитого белка TNF-α рецептор-Ig, антитела против IL-6, против IL17, против IL-15 или против IL-21, нестероидного противовоспалительного средства (NSAID), или модифицирующего заболевание противоревматического лекарственного средства (DMARD). Например, дополнительное средство может представлять собой биологическое средство, такое как средство против TNF (например, Энбрел®, инфликсимаб (Ремикейд® и адалимумаб (Хумира®) или ритуксимаб (Ритуксан®). Когда указанное аутоиммунное заболевание представляет собой отторжение гематопоэтического трансплантата, можно вводить гематопоэтический фактор(-ы) роста (такие как эритропоэтин, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-11, тромбопоэтин и т.д.) или противомикробное средство(-а) (такое как антибиотик, противовирусные, противогрибковые лекарственные средства). Когда указанное аутоиммунное заболевание представляет собой псориаз, дополнительное средство может представлять собой одно или несколько из дегтя и его производных, терапии, кортикостероидов, циклоспорина A, аналогов витамина D, метотрексата, ингибиторов p38 митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK), а также биологические средства, такие как средства против TNF-α и Ритуксан®. Когда указанное аутоиммунное заболевание представляет собой воспалительное заболевание кишечника (IBD), такое как, например, болезнь Крона или язвенный колит, дополнительное средство может представлять собой одно или несколько из аминосалицилатов, кортикостероидов, иммуномодуляторов, антибиотиков или биологических средств, таких как Ремикейд® и Хумира®.

Комбинированное лечение можно осуществлять любым образом, какой сочтет необходимым или удобным специалист в данной области, и в целях этого описания не предусмотрены ограничения в отношении порядка, количества, повторения или относительного количества соединений, подлежащих использованию в комбинации. Соответственно, антитела в соответствии с настоящим изобретением для использования в терапии можно составлять в фармацевтические композиции. Настоящее изобретение также связано с фармацевтическими композициями, содержащими пептиды в соответствии с настоящим изобретением.

Фармацевтические композиции

В предпочтительном варианте осуществления предусмотрена фармацевтическая композиция, которая содержит биспецифический лиганд в соответствии с изобретением или лиганд или лиганды, которые можно идентифицировать с помощью способа анализа, как определено в предыдущем аспекте изобретения. Лиганды могут представлять собой иммуноглобулины, пептиды, нуклеиновые кислоты или низкомолекулярные соединения, как рассмотрено в настоящем документе. Их обозначают в дальнейшем описании как «соединения».

Фармацевтическая композиция в соответствии с изобретением представляет собой композицию веществ, которая содержит соединение или соединения, способные модулировать T-клеточную активность, в качестве активного ингредиента. Типично, соединение представлено в форме любой фармацевтически приемлемой соли, или, например, где это применимо, аналога, в форме свободного основания, таутомера, рацемической смеси энантиомеров или их комбинации. Предусмотрено, что активные ингредиенты фармацевтической композиции, которые содержат активный ингредиент в соответствии с изобретением, проявляют превосходную терапевтическую активность, например, при лечении реакции «трансплантат против хозяина», когда их вводят в количестве, которое зависит от конкретного случая.

В другом варианте осуществления одно или несколько соединений по изобретению можно использовать в комбинации с любым принятым в данной области соединением, о котором известно, что оно подходит для лечения конкретного показания при лечении какого-либо из указанных выше состояний. Соответственно, одно или несколько соединений по изобретению можно комбинировать с одним или несколькими принятыми в данной области соединениями, о которых известно, что они подходят для лечения приведенных выше показаний таким образом, что удобную единую композицию можно вводить субъекту. Схему дозирования можно корректировать для обеспечения оптимального терапевтического ответа.

Например, несколько разделенных доз можно вводить каждые сутки или дозу можно пропорционально уменьшать, как того требуют запросы терапевтической ситуации.

Активный ингредиент можно вводить удобным образом, например, с помощью перорального, внутривенного (в случае растворимости в воде), внутримышечного, подкожного, интраназального, внутрикожного или суппозиторного пути или имплантации (например, с использованием молекул с медленным высвобождением).

В зависимости от пути введения может быть необходимо покрывать активный ингредиент материалом для защиты указанных ингредиентов от действия ферментов, кислот и других естественных условий, которые могут инактивировать указанный ингредиент.

Для введения активного ингредиента посредством введения, отличного от парентерального, его следует покрывать или вводить с материалом для предотвращения его инактивации. Например, активный ингредиент можно вводить в адъюванте, совместно вводимом с ингибиторами ферментов или в липосомах. Адъювант используют в его самом широком значении, и он включает любое иммуностимулирующее соединение, такое как интерферон. Адъюванты, рассматриваемые в настоящем документе, включают резорцины, неионные поверхностно-активные средства, такие как полиоксиэтиленолеиловый эфир и н-гексадецилполиэтиленовый эфир. Ингибиторы ферментов включают трипсин поджелудочной железы.

Липосомы включают CGF эмульсии вода-в-масле-в-воде, а также стандартные липосомы.

Активный ингредиент также можно вводить парентерально или интраперитонеально.

Дисперсии также можно получать в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях, а также в маслах. При обычных условиях хранения и использования эти препараты содержат консервант для предотвращения роста микроорганизмов.

Фармацевтические формы, подходящие для инъекционного использования, включают стерильные водные растворы (в случае растворимости в воде) или дисперсии и стерильные порошки для получения инъецируемых стерильных растворов или дисперсий для немедленного введения. Во всех случаях форма должна быть стерильной и должна быть текучей до такой степени, чтобы легко проходить через иглу. Она должна быть стабильна в условиях изготовления и хранения, и ее следует предохранять против контаминирующего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, многоатомный спирт (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), их подходящие смеси и растительные масла. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, посредством покрытия, такого как лецитин, посредством поддержания требуемого размера частицы в случае дисперсии и посредством поверхностно-активных веществ.

Предотвращение действия микроорганизмов можно осуществлять посредством различных антибактериальных и противогрибковых средств, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимеросала и т.п. В определенных случаях предпочтительно могут содержать изотонические средства, например, сахара или хлорид натрия. Пролонгированную абсорбцию инъецируемых композиций можно осуществлять посредством использования в композициях средств, задерживающих абсорбцию, например, моностеарат алюминия и желатин.

Стерильные инъецируемые растворы получают посредством введения активного ингредиента в требуемом количестве в подходящий растворитель с множеством других ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием. В целом, дисперсии получают посредством введения стерилизованного активного ингредиента в стерильный наполнитель, который содержит основную среду дисперсии и требуемые ингредиенты, отличные от перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъецируемых растворов, предпочтительные способы получения представляют собой вакуумную сушку и способ лиофилизации, который дает порошок активного ингредиента плюс любого дополнительного желаемого ингредиента из его предварительно стерилизованного фильтрованием раствора.

Как используется в настоящем документе, «фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель» включает любой и все растворители, среды дисперсий, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические и задерживающие абсорбцию средства и т.п. Использование таких сред и средств для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области. За исключением случаев, когда какие-либо стандартные среды или средства несовместимы с активным ингредиентом, предусмотрено их использование в терапевтических композициях. Дополнительные активные ингредиенты также можно встраивать в композиции.

В частности, благоприятно составлять парентеральные композиции в единичной дозированной форме для простоты введения и однородности дозы. Единичная дозированная форма, как используется в настоящем документе, относится к физически раздельным единицам, предназначенным в качестве единичных доз для субъектов млекопитающих, подлежащих лечению; каждая единица содержит предварительно определяемое количество активного материала, вычисляемое для того, чтобы вызывать желаемый терапевтический эффект, в связи с требуемым фармацевтическим носителем. Описание новых единичных дозированных форм по изобретению продиктовано и непосредственно зависит от (a) уникальных характеристик активного материала и конкретного терапевтического эффекта, который должен быть достигнут, и (b) ограничениями, накладываемыми областью компаундирования, например, активным материалом для лечения заболевания у живых субъектов, имеющих патологическое состояние, в котором здоровье организма ослаблено.

Важнейшие активные ингредиенты компаундируют для удобного и эффективного введения в эффективном количестве с использованием подходящего фармацевтически приемлемого носителя в единичной дозированной форме. В случае композиций, содержащих добавочные активные ингредиенты, дозы определяют исходя из обычной дозы и способа введения указанных ингредиентов.

Для содействия доставке пептидных соединений, включая антитела, в клетки, пептиды можно модифицировать для повышения их способности пересекать клеточную мембрану. Например, в US 5149782 раскрыто использование фузогенных пептидов, пептидов, образующих ионные каналы, мембранных пептидов, длинноцепочечных жирных кислот и других смешивающихся с мембранами средств для повышения переноса белка через клеточную мембрану. Эти и другие способы также описаны в WO 97/37016 и US 5108921, которые включены в настоящий документ посредством ссылки.

В дополнительном аспекте предусмотрен активный ингредиент по изобретению, как определено ранее в настоящем документе, для применения в лечении заболевания либо отдельно, либо в комбинации с принятыми в данной области соединениями, о которых известно, что они подходят для лечения конкретного показания. Следовательно, предусмотрено применение активного ингредиента по изобретению для изготовления лекарственного средства для лечения заболевания, ассоциированного с аберрантным иммунным ответом.

Кроме того, предусмотрен способ лечения состояния, ассоциированного с аберрантным иммунным ответом, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества лиганда, идентифицируемого с использованием способа анализа, как описано выше.

Изобретение дополнительно описано, лишь в иллюстративных целях, в следующих примерах.

Примеры

Пример 1

Разработка биспецифического слитого белка, который вовлекает CTLA-4 и сшивает его с TCR через MHCII

Для того чтобы генерировать биспецифический слитый белок, который избирательно и агонистически вовлекает CTLA-4 и одновременно связывает его с TCR, мутантный CD80 (CD80w88a, называемый далее как CD80wa), который связывает CTLA-4, но имеет минимальную аффинность к CD28 (Wu et al., 1997), сливали с LAG-3, природным лигандом MHCII (Baixeras et al., 1992; Triebel et al., 1990). CD80wa соединяли с LAG-3 с использованием линкера, состоящего из девяти глицинов, которые в свою очередь прикрепляли к Fc части IgG2a мыши, чтобы предположительно повышать его время полужизни в циркуляции (фиг.1A). В ответ на лиганд этой конфигурации, ожидали, что вовлечение CTLA-4 и лигирование с TCR будет происходить опосредованно, через формирование тримолекулярного комплекса (CTLA-4/MHCII/TTCR) в иммунных синапсах во время ранней T-клеточной активации (фиг.1B). В принципе, вне контекста иммунного синапса, связывание биспецифического слитого белка либо с CTLA-4, либо с MHCII отдельно или с обоими CTLA-4 и MHCII не должно приводить к ингибированию T-клеточной активности. Вовлечение CTLA-4 посредством CD80wa разрабатывали для того, чтобы запускать передачу сигнала CTLA-4 через рекрутирование фосфатаз к цитоплазматическому хвосту CTLA-4. Между тем, связывание LAG-3 с MHCII предназначали для того, чтобы приблизить CTLA-4 к когнатному TCR, который связывает комплекс pMHCII в иммунном синапсе (фиг.1B). Ожидали, что комбинация этих двух событий связывания будет доставлять ингибирующий сигнал в TCR. Также конструировали контрольный слитый белок, содержащий CD80wa и Fc IgG2a (фиг.1A), который не должен быть способным сшивать CTLA-4 с TCR (фиг.1C), поскольку у него отсутствует LAG-3.

Тестовые и контрольные слитые белки экспрессировали в клетках яичника китайского хомячка и очищали аффинной хроматографией на колонке с белком G. Агрегаты удаляли с использованием эксклюзионной хроматографии. Тестовый биспецифический слитый белок (CD80wa-LAG-3-Fc) обозначают как BsB (нуклеотидная последовательность: SEQ ID NO: 3; аминокислотная последовательность: SEQ ID NO: 4), и контрольная конструкция (CD80wa-Fc) известна как BsBΔ (нуклеотидная последовательность: SEQ ID NO: 16; аминокислотная последовательность: SEQ ID NO: 17). Как ожидали, оба слитых белка выглядели как димеры на невосстанавливающих гелях SDS-PAGE (BsB, 200 кДа; BsBΔ 140 кДа) и как мономеры (BsB, 100 кДа; BsBΔ 70 кДа) на восстанавливающих гелях SDS-PAGE. Их идентичность дополнительно подтверждали посредством Вестерн-блоттинга с использованием антител против LAG-3 и CD80.

Пример 2

BsB ингибирует T-клеточную активацию в аллогенной реакции смешанной культуры лимфоцитов

Относительную способность BsB и BsBΔ ингибировать T-клеточную активацию оценивали в аллогенной реакции смешанной культуры лимфоцитов посредством измерения образования IL-2. Наивные CD4⁺CD25^- CD62L^highCD44^low T-клетки, которые выделяли у мышей BALB/c, смешивали с APC, выделенными у мышей C57BL/6, в присутствии или в отсутствие BsB или BsBΔ. Мышиные IgG2a и CTLA-4Ig, ингибитор костимуляции, который связывается с CD80/86 и блокирует их связывание с CD28, включали в виде отрицательного и положительного контролей, соответственно. Включение BsB, но не BsBΔ, в реакцию смешанной культуры лимфоцитов ингибировало образование IL-2, хотя и не в той же степени, в какой этого достигали посредством CTLA-4Ig (фиг.2). Это различие являлось вероятным результатом BsB-опосредованного T-клеточного ингибирования, возникающего позже, чем CTLA-4Ig-опосредованное ингибирование. Более конкретно, для BsB, ингибирование возникало только после повышения регуляции CTLA-4 после T-клеточной активации. Неспособность BsBΔ снижать образование IL-2, убедительно говорит о том, что вовлечение только CTLA-4 является недостаточным для предотвращения T-клеточной активации, поскольку необходимо конкурентное сшивание с TCR. Для исключения возможности того, что LAG-3 часть BsB играет роль в T-клеточном ингибировании, в этом анализе тестировали LAG-3Ig, и верифицировали неспособность ингибировать T-клеточную активацию.

Пример 3

BsB направляет дифференциацию T-клеток в T-регуляторные клетки

Показано, что ранняя терминация передачи сигнала TCR посредством устранения антигенной стимуляции, ингибирования передачи сигнала mTOR, субоптимальной стимуляции TCR из-за низкоаффинного антигена или слабая костимуляция во время T-клеточной активации индуцирует экспрессию Foxp3⁺ и отклонение дифференциации T-клеток в направлении фенотипа T-регуляторных клеток (Delgoffe et al., (2009) Immunity 30:832-844; Haxhinasto et al., (2008) J. Exp. Med. 205:565-574; Sauer et al., (2008) Pwc. Natl. Acad. Sci. USA 105:7797-7802). Поскольку BsB усиливает раннее вовлечение TCR посредством индуцированного активацией CTLA-4 с последующим ослаблением передачи сигнала TCR, также оценивали его способность создавать Foxp3⁺ T-регуляторные клетки. Наивные CD4⁺CD62L^highGFP" T-клетки, получаемые от мышей с введенным Foxp3-EGFP (Haribhai et al., (2007) J. Immunol 178:2961-2972), смешивали с обработанными LPS аллогенными APC в присутствии BsB или BsBΔ. Анализ проточной цитометрии клеток после пяти суток культивирования выявлял большое число CD4⁺CD25⁺GFP⁺ T-клеток среди обработанных BsB клеток (фиг.3A, средний левый график), но не среди клеток, которые обрабатывали с использованием IgG2a мыши (фиг.3A, верхний левый график) или BsBΔ контроля (фиг.3A, нижний левый график), что указывает на то, что эти CD4⁺CD25⁺GFP⁺ T-клетки представляли собой Foxp3⁺ T-регуляторные клетки. Для того чтобы подтверждать эту находку, среды клеточных культур собирали и анализировали на характерные цитокины T-регуляторных клеток, IL-10 и TGF-β (Cools et al., (2008) J. Cell Mol. Med. 12:690-700). Большие количества IL-10 и TFG-β обнаруживали в средах обработанных BsB клеток (фиг.3A, левые графики), но не в средах клеток, обработанных с использованием BsBΔ или mIgG2a. К удивлению, CTLA-4Ig не индуцирует образование GFP⁺ T-регуляторных клеток или образование IL-10 и TGF-β. Не ограничиваясь конкретной теорией, механизм, посредством которого CTLA-4Ig уменьшает T-клеточный ответ, отличается от такового у BsB. LAG-3Ig отдельно или в комбинации с BsBΔ также был не способен индуцировать образование GFP⁺ T-регуляторных клеток, указывая на то, что BsB-опосредованная сшивка CTLA-4 с TCR была необходима для индукции T-регуляторных клеток.

Пример 4

Индукция T-регуляторных клеток посредством BsB требует самостоятельно стимулируемого TGF-β

Конкурентное обнаружение повышенных уровней IL-10 и TGF-β после обработки с использованием BsB повышало вероятность того, что цитокины, в частности, TGF-β, играют роль в облегчении образования T-регуляторных клеток (фиг.3A). Чтобы разобраться с этим, среды для культивирования собирали в течение периода в пять суток и анализировали на содержание цитокинов и Foxp3⁺ T-регуляторных клеток. Повышенные уровни IL-10 и TGF-β обнаруживали уже на 2 сутки после обработки, и Foxp3⁺ T-регуляторные клетки обнаруживали после 3 суток. Не ограничиваясь конкретной теорией, эндогенное образование TGF-β, которое предположительно стимулировали с помощью BsB, участвует в дифференциации T-регуляторных клеток. Добавление антитела против TGF-β (клон 1D11), но не изотипического контрольного IgG (клон 13C4), в анализ индукции T-регуляторных клеток полностью блокировало появление Foxp3⁺ T-регуляторных клеток (фиг.3B). Не ограничиваясь конкретной теорией, раннее вовлечение CTLA-4 и его последующая сшивка с TCR посредством BsB стимулировало образование эндогенного TGF-β, который в свою очередь способствовал дифференциации T-регуляторных клеток. Предварительно сообщалось о том, что сшивка CTLA-4 и TCR индуцирует образование TGF-β (Chen et al., (1998) J. Exp. Med. 188:1849-1857), несмотря на то, что дифференциацию T-регуляторных клеток не оценивали в этом исследовании.

T-регуляторные клетки показывали существенный терапевтический потенциал при модулировании манифестации заболевания в нескольких животных моделях аутоиммунных заболеваний. Однако подчеркнута важность специфичности индуцированных T-регуляторных клеток против значимых антигенов. Неантиген-специфические T-регуляторные клетки, которые не будут активированы против конкретных аутоантигенов в контексте аутоантиген-специфических реактивных T-клеток, предположительно не являются функционально иммуносупрессорными. Таким образом, подходы, которые облегчают образование больших количеств антиген-специфических T-регуляторных клеток крайне желательны для лечения этих заболеваний. Кроме того, стратегии, которые облегчают de novo индукцию антиген-специфических T-регуляторных клеток in situ (например, в островках поджелудочной железы для T1D или в собственной пластинке для язвенного колита или болезни Крона), являются предпочтительными по сравнению с использованием адоптивного переноса дифференцированных или размноженных in vitro T-регуляторных клеток.

Пример 5

BsB-индуцированные T-регуляторные клетки являются функционально супрессорными зависимым от межклеточного контакта образом

Для того чтобы оценить, являются ли BsB-индуцированные T-регуляторные клетки функционально супрессорными, BsB-индуцированные T-регуляторные клетки и TGF-β-индуцированные T-регуляторные клетки, которые служили в качестве контроля, очищали с использованием активируемой флуоресценцией сортировки клеток (FACS) и смешивали с меченными CFSE сингенными реактивными T-клетками в различных соотношениях и аллогенными APC. Клетки совместно культивировали в течение трех суток либо в трансвеллах, либо в обычных культуральных лунках, после чего пролиферацию реактивных T-клеток анализировали с использованием проточной цитометрии. Как резюмировано на фиг.5A, как BsB-индуцированные, так и TGF-β-индуцированные T-регуляторные клетки, которые культивировали в обычных культуральных лунках, почти полностью ингибировали пролиферацию реактивных T-клеток. Сила супрессорной активности BsB-индуцированных T-регуляторных клеток сравнима с таковой TGF-β-индуцированных T-регуляторных клеток. В отличие от этого, T-регуляторные клетки, образуемые посредством либо BsB, либо TGF-β, незначительно ингибировали пролиферацию реактивных T-клеток, когда T-клетки отделяли от T-регуляторных клеток в трансвелле. Не ограничиваясь конкретной теорией, супрессорная активность T-регуляторных клеток зависела от межклеточного контакта и не была опосредована секретируемыми цитокинами или другими факторами. В поддержку этой точки зрения, включение антитела к IL-10 (клон JES5-2A5) в обычную культуральную лунку не влияло на супрессорную активность либо BsB-индуцированных, либо TGF-β-индуцированных T-регуляторных клеток (фиг.5B). Добавление антитела к TGF-β1D11 также не оказывало влияния на супрессорную активность BsB-индуцированных T-регуляторных клеток, несмотря на то, что оно частично снижало супрессию TGF-β-индуцированными T-регуляторными клетками (фиг.5B).

Пример 6

BsB направляет дифференциацию T-клеток OT-II в антиген-специфические T-регуляторные клетки

Поскольку обнаружено, что бифункциональный слитый белок, содержащий CD80wa и LAG3 (BsB), который сшивает CTLA-4 с TCR (через MHCII), может индуцировать образование Foxp3⁺ T-регуляторных клеток в аллогенной MLR, исследовали потенциал BsB вызывать образование антиген-специфических T-регуляторных клеток. Чтобы исследовать это предположение, наивные T-клетки OT-II выделяли у трансгенных мышей, несущих трансгены, кодирующие TCR (α- и β-субъединицы), специфичный к пептиду овальбумину курицы (323-339) (Barnden et al., 1998), и смешивали с сингенными APC в присутствии Ova_323-339. После 5 суток культивирования, значительно более высокие количества Foxp3⁺ T-регуляторных клеток обнаруживали в T-клетках OT-II, которые обрабатывали с использованием BsB (фиг.4A, средний левый график), чем с использованием контроля mIgG (фиг.4A, верхний левый график) или посредством CTLA-4Ig (данные не представлены). Эту индукцию T-регуляторных клеток ингибировали посредством включения антитела против TGF-β в культуры (фиг.4A, нижний левый график). Не ограничиваясь конкретной теорией, дифференциацию опосредовал эндогенно продуцируемый TGF-β аутокринным или паракринным образом. Происходило снижение уровней IL-2, и при этом происходило повышение уровней IL-10 и TGF-β в средах обработанных BsB клеток (фиг.4A, правые графики).

Для осуществления мониторинга пролиферативной активности индуцированных T-регуляторных клеток, клетки OT-II предварительно нагружали флуоресцентной меткой, CFSE. Как показано на фиг.4B, BsB-индуцированные Foxp3⁺ T-регуляторные клетки определяли как пролиферативные, если на это указывало ослабление сигнала CFSE. Как ожидали, добавление CTLA-4Ig, костимуляторного ингибитора, снижало T-клеточную пролиферацию. Таким образом, BsB способен ингибировать T-клеточную активацию и индуцировать образование T-регуляторных клеток как в аллогенной MLR, так и в антиген-специфическом окружении.

Пример 7

Индукция T-регуляторных клеток с использованием BsB может вызывать ослабление пути передачи сигнала AKT/mTOR

В недавних сообщениях указано, что пути передачи сигнала AKT и mTOR играют важные роли в определении судьбы T-клетки. Присутствие конститутивно активного AKT в T-клетках ослабляет дифференциацию T-регуляторных клеток зависимым от рапамицина образом (Haxhinasto et al., 2008), указывая на то, что пути передачи сигнала AKT и mTOR пересекаются для того, чтобы оказывать влияние на судьбу T-регуляторной клетки. Кроме того, T-клетки с дефицитом по mTOR, дифференцируются в T-регуляторные клетки легче, чем нормальные контрольные T-клетки (Delgoffe et al., (2009) Immunity 30:832-844). Также сообщали об обязательной роли коингибиторных молекул PD-1/PD-L1 в контроле развития адаптивных T-регуляторных клеток посредством антагонистического действия на AKT/mTOR (Francisco et al., (2009) J. Exp. Med. 206:3015-3029). Для того чтобы определить, вовлечены ли эти пути также в BsB-опосредованную индукцию T-регуляторных клеток, антитела против CD3 и против CD28 иммобилизовали совместно с BsB, mIgG или PD-L1 на 96-луночных планшетах, в которые высевали наивные T-клетки. Через восемнадцать часов после активации клетки окрашивали флуоресцентно меченными антителами против фосфорилированных AKT и mTOR и анализировали с помощью проточной цитометрии. Фосфорилирование как AKT, так и mTOR ослабляли посредством совместной иммобилизации BsB и PD-L1 (фиг.6). Не ограничиваясь конкретной теорией, события передачи сигнала, опосредованные CTLA-4 и ингибиторными молекулами PD-L1, могут сходиться в некоторой точке на пути передачи сигнала AKT/mTOR во время T-клеточной активации для регулировки дифференциации T-регуляторных клеток.

Пример 8

Воздействие BsB поддерживает экспрессию Foxp3⁺ в индуцированных T-регуляторных клетках.

Индуцированные in vitro T-регуляторные клетки, в отличие от полностью коммитированных естественных T-регуляторных клеток, по сообщениям, менее стабильны и могут утрачивать экспрессию Foxp3⁺ после продолжения культивирования в отсутствие начального индуктора (например, TGF-β или ретиноевая кислота) (Selvaraj and Geiger, (2007) J. Immunol. 178:7667-7677). В данном исследовании, BsB-индуцированные T-регуляторные клетки показывали схожую нестабильность, причем некоторые клетки утрачивали экспрессию Foxp3 после повторения культивирования (фиг.7). Для того чтобы тестировать, может ли повторная стимуляция посредством BsB продлевать экспрессию Foxp3, T-регуляторные клетки сначала индуцировали посредством покрытия 96-луночныю планшетов антителами против CD3/против CD28 и BsB. Затем очищенные T-регуляторные клетки подвергали дополнительному раунду культивирования в присутствии или в отсутствие BsB. Повторная стимуляция очищенных T-регуляторных клеток с использованием BsB делала возможным поддержание большой популяции (~93% от всех T-регуляторных клеток) Foxp3⁺ T-регуляторных клеток (фиг.7, нижний правый график), по сравнению с ~40% экспрессией Foxp3 в ответ на контрольное IgG (фиг.7, верхний правый график).

Пример 9

Фармакокинетика BsB у мышей

Перед тестированием терапевтической полезности BsB в животных моделях аутоиммунных заболеваний, определяли его фармакокинетический профиль, чтобы помочь разработать режим дозирования in vivo. Интраперитонеальная инъекция BsB мышам C57BL/6 вела к поддающемуся измерению росту циркулирующих уровней с последующим быстрым клиренсом и оцененным временем полужизни в плазме (t_1/2) ~12 ч (фиг.8A). Этот профиль не ожидали, поскольку фармакокинетика Fc-содержащих слитых белков или антител типично является более пролонгированной. Поскольку связывание антител с неонатальным Fc-рецептором (FcRn) в первую очередь отвечает за пролонгированные времена полужизни (Roopenian and Akilesh, 2007), сравнивали относительные способности BsB и контрольного IgG2a мыши связываться с FcRn. На фиг.8B показано, что характеристики связывания обоих белков с FcRn являются очень схожими, что указывает на то, что дефект связывания BsB с FcRn маловероятно является причиной его быстрого клиренса из циркуляции.

Другое возможное объяснение быстрого клиренса BsB может заключаться в его накоплении не на клетках-мишенях за счет углеводных рецепторов. Примеры таких рецепторов включают асиалогликопротеиновый рецептор (ASGPR) на гепатоцитах (Weigel, 1994) и маннозный рецептор на макрофагах и клетках эндотелия ретикулоэндотелиальной системы (Pontow et al., 1992). Анализ BsB с использованием сервера NetNGlyc позволяет предполагать, что он имеет потенциал нести вплоть до 10 аспарагин-связанных олигосахаридных боковых цепей на одном мономере (фиг.9). Анализ моносахаридного состава показал, что BsB содержал приблизительно 37 остатков маннозы, и все предсказанные аспарагин-связанные участки гликозилирования могли быть использованы, поскольку каждый из этих аспарагин-связанных олигосахаридных гликанов содержит структуру кор-манноза с тремя остатками маннозы (всего 30 остатков маннозы). Кроме того, также может существовать небольшое количество олигосахаридов с высоким содержанием маннозы для того, чтобы учесть дополнительные остатки маннозы. В действительности, значительные количества недосиалированных три- и тетра-антенных аспарагин-связанных, а также некоторые олигосахариды с высоким содержанием маннозы идентифицировали посредством масс-спектрометрии перметилированных гликанов, освобожденных из белка.

Это предположение также находится в соответствии с молекулярной массой BsB 100 кДа, как показано посредством анализа SDS-PAGE, в противоположность вычисленной массе BsB 80 кДа. Дополнительное присутствие олигосахаридов вносило вклад в разницу (20 кДа) в молекулярной массе. Кроме того, BsB демонстрировал отношение сиаловых кислот к галактозе, равное 0,68 (фиг.9), указывая на то, что гликаны сиалированы не полностью. Не ограничиваясь конкретной теорией, углевод-опосредованный клиренс BsB с помощью ASGPR вносил вклад в его быстрый клиренс из циркуляции.

Пример 10

Короткий курс лечения с использованием BsB задерживал начало аутоиммунного диабета у NOD мышей

Поскольку EC₅₀ BsB для индукции T-регуляторных клеток in vitro оценивали равным приблизительно 100 нМ, а его время полужизни в циркуляции было коротким (t_1/2 ~12 ч), BsB тестировали у NOD мышей в рамках парадигмы поздней профилактики. NOD мышам вводили BsB через короткие интервалы (через день в течение 4 недель), когда они были в возрасте между 9 и 12 неделями. В этом возрасте, аутореактивные T-клетки и инсулит уже заметны, но мыши еще не развили манифестный диабет. Как показано на фиг.10A, NOD мыши, которых лечили в течение 2 недель с использованием BsB, демонстрировали умеренное, но статистически значимое повышение (25%) числа Foxp3⁺ T-регуляторных клеток в крови по сравнению с контролями, которых лечили физиологическим раствором. Однако это повышение T-регуляторных клеток было временным, поскольку разницу в числе T-регуляторных клеток после 4 недель лечения или в более поздние моменты времени обнаружить было не возможно. Схожее временное увеличение T-регуляторных клеток в лимфоидных органах отмечали ранее после лечения NOD мышей антителом против CD3 (Nishio et al., 2010). Не ограничиваясь конкретной теорией, BsB-индуцированные T-регуляторные клетки могут возвращаться в состояние Foxp3^- T-клеток после прекращения лечения. Также может происходить их рекрутирование конкретными тканями-мишенями (например, поджелудочной железой) для того, чтобы выполнять свою функцию. В любом случае, этот короткий курс лечения с использованием BsB в рамках парадигмы позднего профилактического лечения, похоже, умеренно задерживал начало заболевания и снижал число мышей, демонстрирующих явный T1D (фиг.10B).

Отмеченный умеренный ответ может быть обусловлен присутствием активного инсулита у NOD мышей в возрасте 9 недель перед началом терапии. Показано, что воспалительное окружение способствует превращению активирующих T-клеток в Th17 клетки и подавляет их превращение в T-регуляторные клетки. Также показано, что воспалительные цитокины, такие как IL-6 или IL-4, ингибируют превращение T-регуляторных клеток и способствуют утрате экспрессии Foxp3⁺ в T-регуляторных клетках (Caretto et al., 2010; Kastner et al., 2010; Koenen et al., 2008). Для того, чтобы обойти эти проблемы, NOD мышей лечили, начиная с более раннего возраста (возраст 4 недели) перед явной индукцией аутореактивных T-клеток и инсулита. CTLA-4Ig также включали в качестве положительного контроля в этом исследовании, поскольку Bluestone и коллеги (Lenschow et al., 1995) продемонстрировали эффекты от использования этого средства в этой модели; mIgG2a использовали в качестве отрицательного контроля в дополнение к физиологическому раствору. В отличие от результатов на более взрослых мышах (фиг.10A), число Foxp3⁺ T-регуляторных клеток в периферической крови более молодых NOD мышей, которых лечили в течение 2 недель с использованием BsB, не возрастало по сравнению введенным физиологическим раствором или mIgG (фиг.11A). Не ограничиваясь конкретной теорией, это может быть обусловлено тем, что число аутореактивных T-клеток у NOD мышей в возрасте 4 недель (в отличие от мышей в возрасте 9-12 недель, которых использовали в более раннем исследовании) было очень низким. Число индуцированных антиген-специфических T-регуляторных клеток, вероятно, слишком мало, чтобы регистрировать за пределами базальных уровней, присутствующих у животных. Значительно более низкую заболеваемость T1D отмечали у NOD мышей, которым вводили BsB, по сравнению с контролями, которых лечили физиологическим раствором, до возраста в 24 недели (фиг.11B). Однако этот эффект уменьшался в более поздние моменты времени.

В соответствии с сообщением о NOD мышах, которым вводили CTLA-4Ig (Salomon et al., 2000), уровни T-регуляторных клеток в крови (фиг.11A) значительно снижались, предположительно по причине эффектов CTLA-4Ig, оказываемых на передачу сигнала CD28/B7 (Tang et al., 2003). Лечение с использованием CTLA-4Ig также усиливало заболевание, причем мыши демонстрировали более раннее начало заболевания (фиг.11B) и более высокую пенетрантность заболевания по сравнению с контролями, которых лечили физиологическим раствором и mIgG (фиг.11B). Причина несоответствия между этим находками и тем, о чем сообщали Bluestone и коллеги (Lenschow et al., 1995), не ясна, но может быть обусловлена различиями в используемых CTLA-4Ig или применяемом режиме дозирования. В данных исследованиях использовали дозу CTLA-4Ig человека 10 мг/кг (Orencia) вместо CTLA-4Ig мыши 2,5 мг/кг, которую использовали Bluestone и коллеги. Кроме того, лечение с использованием BsB не продлевали далее 7 недель. Не ограничиваясь конкретной теорией, использование более высокой дозы CTLA-4Ig давало более полное блокирование костимуляторного сигнала, необходимого для гомеостаза T-регуляторных клеток.

Пример 11

Более длительный курс лечения с использованием BsB значительно задерживал начало и снижал заболеваемость аутоиммунным диабетом у NOD мышей

Возможные причины наблюдаемого умеренного эффекта BsB при обращении к заболеванию у NOD мышей в более ранних исследованиях включают проведение относительно короткого курса лечения, умеренную способность BsB индуцировать образование T-регуляторных клеток (EC₅₀>100 нМ) и короткое время полужизни в циркуляции BsB, что могло ограничивать его экспозицию. Поскольку способность BsB и время полужизни в циркуляции свойственны молекуле и, следовательно, не подвержены быстрому изменению, тестировали более длительный курс лечения. С этой целью NOD мышей лечили с использованием BsB в течение 10 недель вместо 4 недель, начиная, когда мыши были в возрасте 4 недель. Как показано на фиг.12A, NOD мыши, которых лечили в течение 10 недель с использованием BsB, проявляли значительную задержку начала T1D. Важно, что в возрасте 35 недель только ~13% NOD мышей, которых лечили с использованием BsB, развивали T1D по сравнению с более чем 70% в контролях, которых лечили физиологическим раствором. Таким образом, длительное лечение NOD мышей с использованием BsB, похоже, защищало животных от развития аутоиммунного диабета.

В завершении исследования (когда мыши были в возрасте 35 недель), животных умерщвляли, и их поджелудочные железы брали для гистопатологического анализа. Смежные серийные срезы окрашивали H&E для общей оценки островков, изучали с использованием антитела против инсулина для обнаружения присутствия инсулина в β-клетках, и выполняли двойное окрашивание антителами против CD3 и против Foxp3 для определения местоположения T-клеток и T-регуляторных клеток.

Из-за генетической гетерогенности NOD мышей небольшое число животных, которых не лечили, не развивало заболевание в возрасте 35 недель. Анализ островков этих животных без диабета (из когорты, которую лечили физиологическим раствором) показал, что β-клетки были интактными без очевидных свидетельств лимфоцитарной инфильтрации или инсулита, (фиг.12B, изображения a-c). Несколько Foxp3⁺ T-регуляторных клеток присутствовали в островках этих мышей (стрелки на изображении c). В отличие от этого, островки от NOD мышей с диабетом (из когорты, которую лечили физиологическим раствором) обнаруживали присутствие инвазивного инсулита (фиг.12B, изображение d) и полное разрушение β-клеток (изображение e). В дополнение к CD3⁺ T-клеткам и Foxp3⁺ T-регуляторным клеткам, также видно большое число не-T-клеточных лимфоцитов (фиг.12B, изображение f). Схожие гистопатологические находки отмечали у соответствующих мышей, которых лечили BsB, которые оставались не больными в конце исследования или которые развивали T1D во время исследования. Интересно, что в ~50% островков NOD мышей, которых лечили с использованием BsB, которые оставались без диабета, отмечали свидетельства периинсулита (фиг.12B, изображение g); однако, β-клетки были хорошо сохранены (фиг.12B, изображение h). Окрашивание антителами указывало, что клетки на периферии островков содержат в первую очередь CD3⁺ T-клетки и T-регуляторные клетки. (фиг.12B, изображение i). Увеличение фрагмента изображения (красный квадрат на фиг.12B, изображение i) ясно показывает присутствие множества Foxp3⁺ T-регуляторных клеток (желтые стрелки на фиг.12B, изображение j), которые перемешаны с не Foxp3⁺, но CD3⁺ T-клетками (стрелки с черными наконечниками на фиг.12B, изображение j), а также не-T-клеточных моноцитов (голубые ядра). Развитие периинсулита отмечали у молодых (возраст 4-10 недель) NOD мышей (Anderson and Bluestone, 2005) и у более взрослых мышей, которых лечили другими эффективными терапевтическими средствами, которые задерживали или обращали новое начало T1D у NOD мышей (Chatenoud et al., 1994; Daniel et al., 2011; Simon et al., 2008; Vergani et al., 2010). Таким образом, более длительный курс лечения NOD мышей с использованием BsB защищал животных от развития инвазивного инсулита и явного T1D. Не ограничиваясь конкретной теорией, это опосредовано, по меньшей мере отчасти, de novo и возможно in situ индукцией специфических к антигенам островков T-регуляторных клеток.

Сшивка CTLA-4 и TCR через MHCII с использованием нового биспецифического слитого белка (BsB) эффективно индуцировало образование антиген-специфических T-регуляторных клеток, а также противовоспалительных цитокинов, IL-10 и TGF-β. Предыдущие исследования показывали, что T-регуляторные клетки имеют ключевое значение для формирования иммунологической толерантности и что антиген-специфические T-регуляторные клетки более эффективны в животных моделях аутоиммунных заболеваний. BsB дополнительно оценивали в животных моделях аутоиммунных заболеваний, таких как T1D. Не ограничиваясь конкретной теорией, предполагали, что, если BsB способствовал индукции антиген-специфических T-регуляторных клеток во время ранней фазы активации аутореактивных T-клеток у NOD мышей, он может задерживать начало или останавливать прогрессирование заболевания посредством превращения аутореактивных T-клеток, которые подвергаются активации, в T-регуляторные клетки.

Несмотря на то, что BsB проявляет умеренную силу (из-за его умеренной аффинности к MHC-II и TCR) и короткое время полужизни в циркуляции (которое ограничивало его экспозицию), короткий курс лечения воспроизводимо задерживал начало T1D у NOD мышей, которых лечили в раннем возрасте (в возрасте 4-6 недель) и когда они были старше (возраст 9-12 недель). Однако, наблюдаемые эффекты были умеренными и непостоянными. Более длительный курс лечения (10 недель) NOD мышей (в возрасте между 4 и 13 неделями) с использованием BsB значительно задерживал начало заболевания и заболеваемость животных, развивающих T1D. Не ограничиваясь конкретной теорией, этот эффект обеспечивало образование индуцированных T-регуляторных клеток de novo, которые либо образовывались локально (например, в поджелудочной железе или дренирующих поджелудочную железу лимфатических узла), либо удаленно, которые затем подвергались рекрутированию в поджелудочной железе для защиты островков от разрушения посредством аутореактивных T-клеток и других не-T-клеточных лейкоцитов. Иммуногистохимическое окрашивание срезов тканей поджелудочной железы мышей в возрасте 35 недель, которых лечили с использованием BsB и которые оставались без диабета, ясно указывало на повышение числа Foxp3⁺ T-регуляторных клеток на периферии островков. Визуально они выглядели как предотвращающие вхождение CD3⁺ T-клеток и не-T-клеточных лимфоцитов в островки. Этот феномен наблюдали в ~50% островков NOD мышей, которых лечили с использованием BsB и которые оставались без диабета в конце исследования, и ни в одном из островков животных с диабетом в контрольной группе. Островки нескольких мышей без диабета в контрольной группе оставались без лимфоцитарной инфильтрации и без инсулита. Известно, что по причине генетической гетерогенности NOD мышей, некоторые животные в когорте этого размера никогда не развивали диабет в пределах этого временного интервала. У остальных ~50% животных без диабета в группе, которую лечили с использованием BsB, островки также не имели лимфоцитарной инфильтрации и инсулита. Возможности для небольного состояния этих мышей включают лечение с использованием BsB и генетические предпосылки.

В соответствии с гистопатологическими находками, небольшое, но статистически значимое повышение числа Foxp3⁺ T-регуляторных клеток обнаруживали в крови животных, которых лечили с использованием BsB, (лечили в возрасте 9-12 недель) по сравнению с контролями, которых не лечили. Это увеличение не выражено у мышей, которых начинали лечить в более раннем возрасте (в возрасте 4 недель). Не ограничиваясь конкретной теорией, это может быть обусловлено тем, что больше аутореактивных T-клеток подвергалось активации в возрасте 9 недель, чем в возрасте 4 недель. Низкие уровни аутореактивных T-клеток у мышей в возрасте 4 недель могли препятствовать обнаружению индуцированных T-регуляторных клеток после этого в существующей среде T-регуляторных клеток. В природе повышение T-регуляторных клеток также носит временный характер. В качестве схожего наблюдения у животных, которых подвергали терапии антителами против CD3 (Nishio et al., 2010), отмечено, что, возможно, индуцированные T-регуляторные клетки были нестабильны и утрачивали экспрессию Foxp3. Более вероятно, что происходил рекрутинг T-регуляторных клеток из циркуляции в пораженные ткани-мишени. В отличие от этого, NOD мыши, которых лечили с использованием CTLA-4Ig, проявляли значительное снижение числа циркулирующих T-регуляторных клеток. Лечение также ухудшало заболевание, о чем свидетельствует ускоренное начало заболевания и более высокая заболеваемость животных, демонстрирующих явное заболевание. Это соответствует предыдущим сообщениям, в которых показано, что костимуляторный путь вовлечен в гомеостаз T-регуляторных клеток и что отсутствие костимуляции снижает образование T-регуляторных клеток. Блокирование или нокаут CD80 или CD86 у NOD мышей также ведет к более раннему началу T1D (Salomon et al., 2000; Tang et al., 2003).

Возникновение периинсулита типично наблюдают в поджелудочной железе NOD мышей в возрасте между 4 и 9 неделями. Без контроля возникает инвазивный инсулит, что ведет к полному разрушению β-клеток и развитию манифестного диабета в возрасте между 12 и 35 неделями. Поджелудочные железы NOD мышей без диабета, которых лечили в течение 10 недель с использованием BsB и анализировали в возрасте 35 недель, демонстрировали свидетельства периинсулита, который казался приостановленным в своем развитии. Не отмечали никаких указаний на инвазивный инсулит или чрезмерное разрушение инсулин-продуцирующих β-клеток. Имеют место другие сообщения о различных терапевтических вмешательствах, которые аналогичным образом задерживали или предотвращали заболевание у NOD мышей (Shoda et al., 2005). Здесь результаты наиболее близки к тем, о которых сообщали Lee et al. (2010), которые показали, что перенос диабетогенных CD4⁺CD25^- BDC2.5 T-клеток, обедненных CD4⁺CD25⁺ T-регуляторными клетками, самкам NOD/SCID мышей ускорял развитие инвазивного инсулита по сравнению с мышами, которым вводили все CD4⁺ T-клетки, содержащие CD4⁺CD25⁺ T-регуляторные клетки. При инвазивном инсулите главным образом преобладает инфильтрация дендритных клеток (DC), а не BDC2.5 T-клеток per se. На основе своего исследования авторы предполагали, что T-регуляторные клетки регулировали инвазивность DC в островки посредством модулирования, по меньшей мере отчасти, хемотаксиса DC в ответ на хемокины CCL19 и CCL21, секретируемые островками. Паттерны иммуногистохимического окрашивания для Foxp3⁺ T-регуляторных клеток, CD3⁺ T-клеток и не-T-клеточных лейкоцитов, отмеченные в срезах поджелудочной железы NOD мышей без диабета, которых лечили с использованием BsB, находятся в соответствии с их находками (фиг.12B). Не ограничиваясь конкретной теорией, T-регуляторные клетки, образуемые NOD мышами в ответ на BsB, вероятно способствуют остановке миграции аутореактивных T-клеток и не-T-клеточных лимфоцитов в островки. Более длительный курс лечения с использованием BsB более эффективен, поскольку это создает более надежную и постоянную индукцию T-регуляторных клеток. Эта непрерывная стимуляция индуцированных T-регуляторных клеток с использованием BsB в клеточных культурах, которая продлевала экспрессию Foxp3⁺ в T-регуляторных клетках, поддерживает эту точку зрения (Karman et al., 2012).

Клеточная терапия с использованием свежевыделенных, размноженных ex vivo или индуцированных in vitro T-регуляторных клеток в животных моделях аутоиммунных заболеваний или трансплантатов органов показала, что адоптивный перенос T-регуляторных клеток может восстанавливать баланс T-регуляторных клеток по отношению к эффекторным T-клеткам, тем самым контролируя бурную аутоиммунную реакцию, ассоциированную с этими заболеваниями (Allan et al., 2008; Jiang et al., 2006; Riley et al., 2009; Tang et al., 2012). Однако использование адоптивного переноса в качестве терапевтической стратегии представляет некоторые трудности, связанные с переносом в клинику. Во-первых, число аутологических T-регуляторных клеток, которые можно выделять из периферической крови субъекта-человека, ограничено. Таким образом, часто необходимо экстенсивное размножение T-регуляторных клеток ex vivo, что может изменять их функциональность и чистоту. Во-вторых, поскольку выделенные T-регуляторные клетки являются поликлональными, они могут проявлять функцию подавления всего иммунитета на нецелевых эффекторных T-клетках. В-третьих, что наиболее важно, пластичность T-регуляторных клеток представляет собой значительную проблему (Bluestone et al., 2009; Zhou et al., 2009a). Показано, что адаптивно переносимые T-регуляторные клетки могут утрачивать экспрессию Foxp3 и повторно дифференцироваться в клетки Th17 (Koenen et al., 2008) или патогенные T-клетки памяти (Zhou et al., 2009b), что повышает риск ухудшения аутоиммунной реакции или воспаления. Следовательно, терапевтическое средство, которое индуцирует образование T-регуляторных клеток антиген-специфическим образом in situ, является более благоприятным, чем адоптивная клеточная терапия T-регуляторными клетками. Результаты, представленные в настоящем документе, демонстрируют полезность и эффективность такого средства (BsB), которое сшивает CTLA-4 с MHCII в контексте модели T1D на мышах. Комбинированная демонстрация образования IL-10, TGF-β и T-регуляторных клеток в ответ на лечение с использованием BsB, а также эффективность в модели T1D на NOD мышах, обладает потенциалом предоставить новую терапевтическую концепцию. BsB также предлагает дополнительные преимущества по сравнению с другими иммуномодуляторами в том отношении, что он не влияет на покоящиеся T-клетки или другие лимфоциты. Количества и процентные доли CD4⁺ T-клетки и CD19⁺ B-клеток на периферии остается тем же во всех исследованиях NOD, которые проводили авторы настоящего изобретения. Не ограничиваясь конкретной теорией, этот подход эффективен для задержки или остановки прогрессирования заболевания. Разработка вариантов BsB, которые более эффективны и которые имеют более благоприятный фармакокинетический профиль, должна подтвердить эти исследования. Таким образом, эту концепцию также можно применять в отношении управления другими иммунно-опосредованными заболеваниями.

Результаты, приведенные в настоящем документе, получали с использованием следующих способов и материалов, если не указано иное.

Животные. Самок дикого типа C57BL/6 (H-2^b), BALB/c(H-2^d), трансгенных мышей OT-II, экспрессирующих α-цепь и β-цепь T-клеточного рецептора мыши, специфичного к овальбумину курицы 323-339(Ova_323-339) на генетическом фоне C57BL/6, и самок не страдающих ожирением (NOD/LtJ) мышей с диабетом приобретали в The Jackson Laboratory. Животных содержали на объекте, не содержащем патогенов, а исследования проводили в соответствии с руководствами, выпущенными U.S. Department of Health and Human Services (публикация NIH № 86-23) и Genzyme's Institutional Animal Care and Use committee.

Антитела и реактивы. Антитела против CD3 мыши функциональной марки или флуоресцентно меченные (клон 145-2C11), CD25, инсулин и антитела Foxp3⁺ приобретали в eBioscience или BD Biosciences. CTLA-4-Fc мыши и CTLA-4Ig человека (Orencia) приобретали в R&D Systems, Inc. и Bristol-Myers Squibb, соответственно. Изотипический контроль IgG2a мыши получали в BioXCell Inc. CFSE, эмбриональную телячью сыворотку с ультранизким содержанием Ig (FBS) и другие среды для клеточных культур получали из Invitrogen. Пептид Ova_323-339 курицы получали из New England Peptide.

Конструирование и получение биспецифического слитого белка BsB. Конструирование и экспрессия биспецифического слитого белка (BsB), содержащего внеклеточные домены CD80w88a и LAG-3, а также Fc IgG2a мыши (CD80wa-LAG-3-Fc, BsB), были описаны ранее (Karman et al., 2012).

Анализы Biacore и анализ моносахаридного состава. Biacore использовали для сравнения связывания BsB и mIgG2a с неонатальным Fc-рецептором мыши (FcRn). В кратком изложении, на чипе CM5 иммобилизовали ~1430 RU FcRn-HPC4 мыши с использованием химической реакции с аминами. Каждый образец серийно разводили 1:2 до конечных концентраций от 200 до 6,25 нМ в PBSP (PBS с 0,005% поверхностно-активным веществом P-20), pH 6,0 и впрыскивали на 3 мин дважды, с последующим промыванием в течение 3 мин в буфере для диссоциации. Поверхность регенерировали 10 мМ боратом натрия и 1M NaCl, pH 8,5. Моносахаридный состав углеводов BsB анализировали согласно протоколу, описанному авторами Zhou et al. (Zhou et al., 2011).

Выделение наивных T-клеток. Наивные T-клетки из селезенки и лимфатических узлов старых самок BALB/c или мышей OT-II в возрасте 8-12 недель очищали посредством магнитного разделения с последующей активируемой флуоресценцией сортировкой клеток. Сначала проводили негативный отбор клеток посредством магнитного разделения клеток (Miltenyi Biotech) и затем сортировали как CD4⁺CD25^- CD62L^hiCD44^low клетки до чистоты более 98%.

Анализ антиген-специфической индукции T-регуляторных клеток. Анализ в окружении аллогенной MLR осуществляли, как предварительно сообщалось (Karman et al., 2012). Для антиген-специфической T-клеточной активации 10⁵ наивных T-клеток OT-II смешивали в круглодонных 96-луночных планшетах с 10⁵ облученных сингенных APC в присутствии Ova_323-329 с концентрацией растворимого антитела против CD28 0,5 мкг/мл и 1 мкг/мл (клон 37.51, eBioscience). Тестовые конструкции, IgG2a мыши или CTLA-4Ig мыши добавляли в культивируемые клетки в насыщающей концентрации 100 мкг/мл. Клетки культивировали в течение 5 суток для индуцирования образования T-регуляторных клеток и анализировали посредством проточной цитометрии. Среды собирали для анализа IL-2, IL-10 и TGF-β с использованием наборов ELISA по инструкциям производителей. Для оценки T-клеточной пролиферации очищенные наивные T-клетки OT-II метили 5 мкΜ CFSE в течение 5 мин при 37°C. Затем их промывали для удаления несвязанного CFSE, и использовали в анализах индукции T-регуляторных клеток, как описано выше. Клетки культивировали в течение 5 суток для того, чтобы позволить им делиться перед анализом посредством проточной цитометрии. Для обнаружения Foxp3⁺ в T-клетках окрашивали поверхностные маркеры клеток, как описано выше, с последующей пермеабилизацией с использованием буфера Fix/Perm (eBioscience) и окрашивания PE-Cy7, конъюгированным с антителом против Foxp3 (клон FJK-16s, eBioscience).

Фармакокинетические измерения BsB у мышей. Фармакокинетику BsB определяли у мышей C57BL/6 в возрасте 8 недель. 20 мг/кг BsB вводили мышам посредством интраперитонеальной инъекции. Кровь брали посредством кровопускания из подкожной вены через 1 ч, 5 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч после введения. Уровни BsB в каждый момент времени измеряли с использованием анализа ELISA. В кратком изложении, 96-луночные планшеты покрывали 100 мкл (1 мкг/мл) антитела против CD80 мыши в PBS и инкубировали в течение ночи при 4°C. Планшеты блокировали 5% эмбриональной телячьей сывороткой в течение 1 ч, после чего их промывали 4 раза в PBS. Затем 100 мкл образцов крови в различных разведениях добавляли в лунки. Планшеты инкубировали в течение 2 ч при мягком встряхивании при комнатной температуре и промывали 4 раза в PBS. Биотинилированное антитело против LAG-3 мыши (1 мкг/мл) добавляли и инкубировали в течение 2 ч. Планшеты промывали 4 раза в PBS, после чего добавляли стрептавидин-HRP. После 30 мин планшеты промывали 6 раз в PBS и проявляли для колориметрического измерения. Очищенный BsB, разведенный в разбавителе для анализа в различных концентрациях, использовали в качестве стандартов.

Лечение NOD мышей с использованием BsB. В коротком курсе лечения самок NOD мышей в возрасте 4 недель лечили физиологическим раствором, 20 мг/кг BsB, 20 мг/кг IgG2a мыши или 10 мг/кг CTLA-4Ig человека (Orencia) три раза в неделю посредством интраперитонеальных инъекций в течение периода 2,5 недели. Для модели поздней профилактики NOD мышей в возрасте 9-12 недель лечили физиологическим раствором или 20 мг/кг BsB, как указано выше, в течение 4 недель. Для более длительного курса лечения NOD мышей лечили с использованием BsB или физиологического раствора, как указано выше, в течение 10 недель в возрасте от 4 недель до 13 недель. Осуществляли мониторинг неголодовочных уровней глюкозы в крови еженедельно, начиная с возраста в 8 недель. Мышей считали больными с диабетом, когда их показания глюкозы превышали 300 мг/дл для трех последовательных показаний. Foxp3⁺ T-регуляторные клетки в периферической крови исследовали после двух недель лечения посредством проточной цитометрии. В кратком изложении, 50 мкл цельной крови блокировали немечеными антителами против FcγRIIb и FcγRIII (клон 93, eBioscience) в течение 20 мин. Впоследствии клетки окрашивали флуоресцентно меченным антителом против CD4 в течение 30 мин и затем промывали. Красные клетки крови лизировали с использованием FACS Lysing Solution (BD Biosciences) в течение 5 мин. После промывания клетки фиксировали, пермиабилизировали и окрашивали FITC-меченным антителом против Foxp3 в течение 30 мин, как описано выше. Поджелудочные железы разрезали пополам, причем одну половину фиксировали в нейтральном буфере с формалином, а другую помещали в соединение OCT и затем замораживали на сухом льду.

Статистический анализ. Кумулятивные заболеваемости NOD мышей, демонстрирующих T1D и гипергликемию после лечения с использованием BsB, или контролей сравнивали с использованием логарифмического рангового критерия (Кокса-Мантела) в Prism 5 (Graphpad, город и штат). Значение p<0,05 считали статистически значимым.

Гистопатологический анализ. Поджелудочные железы, фиксированные в нейтральном буфере с формалином, окрашивали на CD3, Foxp3⁺ клетки с использованием автоматизированного процессора. Тканевые срезы депарафинизировали с использованием ксилола-этанола, антигены извлекали посредством инкубации в течение 25 мин в цитратном буфере и затем блокировали сывороткой. Срезы инкубировали с антителом против CD3 в течение 45 мин, за чем следовало антитело козы против полимера кроличьей пероксидазы хрена в течение 20 мин. Визуализацию хромогена CD3 получали посредством инкубации с 3,3'-диаминобензидинтетрагидрохлоридом в течение 2-4 мин. Для обнаружения Foxp3⁺, срезы повторно блокировали сывороткой, с последующей экспозицией антителом против Foxp3 в течение 45 мин. Затем срезы инкубировали с антителом кролика против IgG крысы в течение 30 мин, за чем следовало антитело козы против полимера щелочной фосфатазы кролика. Визуализацию хромогена осуществляли с использованием быстрого красного (Fast Red) в течение 10 мин. Осуществляли контрастное окрашивание тканевых срезов с использованием гематоксилина в течение 2 мин и промывание 3 раза в 0,05% Tween-20/Tris буферном физиологическом растворе между стадиями. Смежные серийные срезы окрашивали с использованием антитела против инсулина, как описано выше. Фотографии делали с помощью флуоресцентного микроскопа Nikon Eclipse E800 с прикрепленной цифровой камерой из Diagnostic Inc., и изображения получали с использованием программного обеспечения Spot Advanced.

Последовательности

Обозначения

CD80w88a = лиганд CTLA-4

IgG2a = Fc-область IgG2

G9 = Gly 9

Lag-3 = лиганд MHC

H6 = His 6

SEQ ID NO: 1:

CTLA-4 BsB (Gene1) = CD80w88a мыши (а.о.1-235)-IgG2a(а.о.241-474)-G9-Lag-3(а.о.25-260)-H6

Нуклеотидная последовательность заменяющей конструкции мыши (Ген 1):

SEQ ID NO: 2:

CTLA-4 BsB (Ген 1) = CD80w88a мыши (а.о.1-235)-IgG2a(а.о.241-474)-G9-Lag-3(а.о.25-260)-H6

Транслируемая белковая последовательность заменяющей конструкции мыши (Ген 1):

SEQ ID NO: 3:

CTLA-4 BsB (Ген 2) = CD80w88a мыши (а.о.1-235)-G9-Lag-3 (а.о.25-260)-IgG2a (а.о.241-474)

Нуклеотидная последовательность заменяющей конструкции мыши (Ген 2):

SEQ ID NO: 4:

CTLA-4 BsB (Ген 2) = CD80w88a мыши (а.о.1-235)-G9-Lag-3(а.о.25-260)-IgG2a(а.о.241-474)

Транслируемая белковая последовательность заменяющей конструкции мыши (Ген 2):

SEQ ID NO: 5:

Конструкция с нуклеотидной последовательностью дикого типа CTLA-4 BsB человека = (CD80 человека (а.о.1-234)-G9-Lag-3(а.о.27-262)-IgG1a(а.о.240-471)

SEQ ID NO: 6:

Транслируемая белковая последовательность конструкции с CTLA-4 BsB человека дикого типа = (CD80 человека (а.о.1-234)-G9-Lag-3(а.о.27-262)-IgG1a(а.о.240-471)

SEQ ID NO: 7:

Нуклеотидная последовательность варианта 1 конструкции CTLA-4 BsB человека = (CD80W84A/S190A человека (а.о.1-234)-G9-Lag-3R316/75E(а.о.27-262)-IgG1aN596/297Q(а.о.240-471)

SEQ ID NO: 8:

Транслируемая белковая последовательность варианта 1 конструкции CTLA-4 BsB человека = (CD80W84A/S190A человека (а.о.1-234)-G9-Lag-3R316/75E(а.о.27-262)-IgG1aN596/297Q(а.о.240-471)

SEQ ID NO: 9:

Нуклеотидная последовательность варианта 2 конструкции CTLA-4 BsB человека = (CD80W84A/S190AS201A человека (а.о.1-234)-G9-Lag-3R316/75E(а.о.27-262)-IgG1aN596/297Q(а.о.240-471)

SEQ ID NO: 10:

Транслируемая белковая последовательность варианта 2 конструкции CTLA-4 BsB человека = (CD80W84A/S190AS201A человека (а.о.1-234)-G9-Lag-3R316/75E(а.о.27-262)-IgG1aN596/297Q(а.о.240-471)

SEQ ID NO: 11:

Нуклеотидная последовательность варианта 3 конструкции CTLA-4 BsB человека = (CD80E196A/5190A человека (а.о.1-234)-G9-Lag-3R316/75E(а.о.27-262)-IgG1aN596/297Q(а.о.240-471)

SEQ ID NO: 12:

Транслируемая белковая последовательность варианта 3 конструкции CTLA-4 BsB человека = (CD80E196A/S190A человека (а.о.1-234)-G9-Lag-3R316/75E(а.о.27-262)-IgG1aN596/297Q(а.о.240-471)

SEQ ID NO: 13:

Нуклеотидная последовательность варианта 4 конструкции CTLA-4 BsB человека = (CD80E196A/S190AS201A человека (а.о.1-234)-G9-Lag-3R316/75E(а.о.27-262)-IgG1aN596/297Q(а.о.240-471)

SEQ ID NO: 14:

Транслируемая белковая последовательность варианта 4 конструкции CTLA-4 BsB человека = (CD80E196A/S190AS201A человека (а.о.1-234)-G9-Lag-3R316/75E(а.о.27-262)-IgG1aN596/297Q(а.о.240-471)

SEQ ID NO: 15

CD80 человека

SEQ ID NO: 16

ДНК BsBΔ (CD80wa-Fc) = CD80w88a мыши (а.о.1-235)-IgG2a(а.о.241-474)

Нуклеотидная последовательность заменяющей конструкции мыши (BsBΔ; CD80wa-Fc):

SEQ ID NO: 17

Белок BsBΔ (CD80wa-Fc) = CD80w88a мыши (а.о.1-235)-IgG2a(а.о.241-474)

Транслируемая белковая последовательность заменяющей конструкции мыши (BsBΔ; CD80wa-Fc):

Другие варианты осуществления

Из приведенного выше описания очевидно, что вариации и модификации можно создавать в изобретении, описанном в настоящем документе, чтобы адаптировать его к различным использованиям и условиям. Такие варианты осуществления также входят в объем следующей формулы изобретения.

Перечисление списка элементов в каком-либо определении переменной в настоящем документе включает определения этой переменной в качестве какого-либо одного элемента или комбинации (или подкомбинации) перечисленных элементов. Перечисление варианта осуществления в настоящем документе включает этот вариант осуществления в качестве какого-либо одного варианта осуществления или в комбинации с какими-либо другими вариантами осуществления или их частями.

Все патенты и публикации, упомянутые в этом описании, включены в настоящий документ посредством ссылки в той же степени, как если бы было конкретно и по отдельности указано, что каждый независимый патент и публикация включены по ссылке.

Литература

В настоящем документе цитируются следующие документы.

1. Биспецифический слитый белок, который содержит лиганд, специфичный к CTLA-4, и лиганд, специфичный к комплексу pMHC, где лиганд, специфичный к CTLA-4, и лиганд, специфичный к комплексу pMHC, разделены посредством линкера.

2. Биспецифический слитый белок по п. 1, где лиганд, специфичный к CTLA-4, выбирают из CD80 (B7-1) или CD86 (B7-2) или антитела, специфичного к CTLA-4.

3. Биспецифический слитый белок по п. 1 или 2, где лиганд, специфичный к комплексу pMHC, выбирают из анти-MHC антитела и LAG-3.

4. Биспецифический слитый белок по п. 1 или 2, где линкер представляет собой одно или несколько из полиаминокислотной последовательности и Fc-домена антитела.

5. Биспецифический слитый белок по п. 4, где полиаминокислотная последовательность представляет собой G9 (Gly-9).

6. Биспецифический слитый белок по п. 2, где лиганд, специфичный к CTLA-4, представляет собой CD80.

7. Биспецифический слитый белок по п. 6, где CD80 мутирован для повышения специфичности к CTLA-4.

8. Биспецифический слитый белок по п. 7, где CD80 представляет собой CD80 человека, который содержит по меньшей мере одну из мутаций W84A, K71G, K71V, S109G, R123S, R123D, G124L, S190A, S201A, R63A, M81A, N97A и E196A.

9. Биспецифический слитый белок по п. 8, где CD80 содержит мутацию W84A или E196A CD80 человека.

10. Биспецифический слитый белок по п. 3, где лиганд, специфичный к комплексу MHC, представляет собой LAG-3.

11. Биспецифический слитый белок по п. 10, где LAG-3 мутирован для повышения специфичности к pMHCII.

12. Биспецифический слитый белок по п. 11, где LAG-3 представляет собой LAG-3 человека, который содержит по меньшей мере одну из мутаций R73E, R75A, R75E и R76E.

13. Биспецифический слитый белок по п. 12, где LAG-3 содержит мутацию R75A или R75E.

14. Биспецифический слитый белок по п. 1, где слитый белок содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14.

15. Применение биспецифического слитого белка по любому из пп. 1-14 для производства лекарственного средства для толеризации T-клетки.

16. Применение по п. 15, где лекарственное средство предназначено для лечения заболевания, выбранного из аутоиммунного заболевания и отторжения трансплантата.

17. Применение по п. 15 или 16, где биспецифический слитый белок вводят в комбинации с иммуносупрессором или модулятором.

18. Применение по любому из пп. 15-17, где аутоиммунное заболевание выбирают из диабета 1 типа (T1D), системной красной волчанки (SLE), ревматоидного артрита (RA), воспалительного заболевания кишечника (IBD), язвенного колита (UC), болезни Крона (CD), рассеянного склероза (MS), склеродермии, пузырчатки обыкновенной (PV), псориаза, атопического дерматита, глютеновой болезни, хронического обструктивного заболевания легких, тиреоидита Хашимото, базедовой болезни, синдрома Шегрена, синдрома Гийена-Барре, синдрома Гудпасчера, болезни Аддисона, гранулематоза Вегенера, первичного склероза желчных путей, склерозирующего холангита, аутоиммунного гепатита, ревматической полимиалгии, феномена Рейно, височного артериита, гигантоклеточного артериита, аутоиммунной гемолитической анемии, пернициозной анемии, узелкового полиартериита, болезни Бехчета, первичного биллиарного цирроза, увеита, миокардита, ревматической лихорадки, анкилозирующего спондилита, гломерулонефрита, саркоидоза, дерматомиозита, миастении гравис, полимиозита, очаговой алопеции и витилиго.

19. Применение по п. 18, где аутоиммунное заболевание представляет собой диабет 1 типа (T1D).