Способ определения индекса фрагментации днк сперматозоидов у животных-производителей
Владельцы патента RU 2657609:
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" ФГБУ "ВГНКИ" (RU)
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина" (ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К.И. Скрябина) (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии и предназначено для определения индекса фрагментации ДНК сперматозоидов у животных-производителей. Осуществляют подготовку мазка спермопробы к окрашиванию и приготовление красителя смешиванием раствора лимонной кислоты, гидрофосфата натрия и 1%-го акридин оранжевого. Погружают образец в краситель. Выполняют микроскопию. Подсчитывают сперматозоиды с фрагментированной ДНК и нормальных, при этом сперматозоиды с фрагментированной ДНК окрашиваются в красный, желтый или оранжевый цвета, нормальные - в зеленый цвет. При выявлении индекса фрагментации более 30% спермопроба выбраковывается и не допускается для искусственного осеменения животных. Изобретение обеспечивает простой, доступный способ определения индекса фрагментации ДНК.
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для определения индекса фрагментации ДНК сперматозоидов в замороженной сперме животных-производителей.
Данный метод является технологически современным анализом маркеров апоптоза и играет важную роль в регуляции фертильности, которую нужно учитывать как при естественном осеменении, так и при искусственном осеменении сельскохозяйственных животных.
Фрагментация ДНК в сперматозоидах характеризуется двухцепочечными и одноцепочечными разрывами молекулы ДНК. Это связано с дефицитом содержания в хромосомах специальных транспортных белков-протаминов, защищающих ДНК от внешних повреждений. Фрагментация ДНК сперматозоидов оказывает влияние не только на фертильность, но и на ранние этапы эмбрионального развития плода, особенно на формирование бластоцисты в предимплантационный период эмбрионального развития (т.е. до нидации зародыша к стенке матки).
Заявленный способ позволяет определить степень повреждения нитей ДНК (измерения количества разрывов ДНК) в сперматозоидах.
Исследование структуры хроматина проводят с помощью окрашивания ДНК флюрохромами. Окрашивание клеток флуоресцентными красителями, т.е. ДНК флюрохромами, происходит благодаря способности флюрохрома избирательно окрашивать двуспиральные нуклеиновые кислоты в самом сперматозоиде. Окрашивание сперматозоидов осуществляют акридиновым оранжевым.
Уровень техники, аналоги. Существует аналогичный метод в медицине, описанный в руководстве ВОЗ «Руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека» пятое издание 2012 г., с. 164, но в ветеринарной медицине аналогов нет. Особенность заявленного изобретения заключается в том, что способ позволяет определить индекс фрагментации ДНК у животных-производителей.
В настоящее время стандартным методом для исследования фрагментации ДНК в сперматозоидах является определение структуры хроматина по Эвенсону (SCSA: Sperm Chromatin Staicture Assay; Evenson et al., 1980; 2000; Evenson and Jost, 1994). Исследование структуры хроматина проводят с помощью окрашивания ДНК флюрохромами. Окрашивание клеток флуоресцентными красителями, т.е. ДНК флюрохромами, происходит благодаря способности флюрохрома избирательно окрашивать двуспиральные нуклеиновые кислоты в самом сперматозоиде. Данный метод выбран нами в качестве ближайшего аналога.
Метод SCSA, хотя и является надежным и высоко воспроизводимым, является дорогим методом, трудным для выполнения и не очень подходящим для рутинных лабораторных исследований (De Jonge, 2002). По этой причине качество ДНК сперматозоидов до сих пор широко не определяется, несмотря на то, что подтверждено его клиническое значение при изучении бесплодия.
Техническим результатом заявленного изобретения является возможность определения индекса фрагментации ДНК, простота, доступная стоимость, минимальные манипуляции с клетками.
Технический результат заявленного изобретения достигается за счет того, что спермопробу размораживают, подготавливают мазок к исследованию, фиксируют мазок спиртовым раствором уксусной кислоты в течение 1 часа в холодильной камере при постоянной температуре +5°С. Приготавливают краситель смешиванием 40 мл раствора лимонной кислоты, 2,5 мл раствора гидрофосфата натрия и 10 мл 1%-ного акридин оранжевого. Образцы погружают в краситель на 5-7 мин, далее мазок подсушивают на воздухе в течение 1-2 мин, микроскопируют. Проводят отдельный подсчет сперматозоидов с фрагментированной ДНК и нормальных, при этом сперматозоиды с фрагментированной ДНК окрашиваются в красный, желтый или оранжевый цвета, нормальные - в зеленый цвет. Количество сперматозоидов с фрагментированными участками ДНК IFn, % вычисляют по формуле , где С+ - количество сперматозоидов, окрашенных в красный, желтый и оранжевые цвета, шт; С- - количество сперматозоидов, окрашенных в зеленый цвет, шт. За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов не менее чем трех измерений, при выявлении индекса фрагментации более 30% спермопроба выбраковывается и не допускается для искусственного осеменения животных.
Заявленный способ основан на метахроматических свойствах красителя, который изменяет флюоресценцию от зеленого до красного. Он заключается в окрашивании клеток ДНК флюрохромом, после - индуцированной слабой кислотой. Клетки флюоресцируют зеленым при связывании красителя с нормальной двунитевой молекулы ДНК и красным при взаимодействии с однонитевыми ДНК и РНК. При индексе фрагментации ДНК более 30% сперматозоидов уровень фертильности семени значительно снижается.
Осуществление изобретения.
Проводят размораживание спермопробы, подготавливают мазок спермопробы к исследованию.
Капля спермы должна быть небольшой и соразмерна так, чтобы весь мазок помещался на стекле, не доходя 1-1,5 см до его края. После приготовления мазки следует быстро высушить на воздухе до исчезновения влажного блеска. Фиксацию мазка производят спиртовым раствором уксусной кислоты (1 часть уксусной кислоты ледяной и 3 части 96%-ного этилового спирта) в течение 1 часа в холодильной камере при постоянной температуре +5°C.
Приготовление красителя.
В мерной колбе вместимостью 100 см3 смешивают 40 мл раствора лимонной кислоты, 2,5 мл раствора гидрофосфата натрия и 10 мл 1%-го акридин оранжевого.
Срок хранения раствора в темном месте при комнатной температуре - не более 5 дней.
Проведение анализа.
Погружаем образец в краситель на 5-7 мин. Споласкиваем дистиллированной водой 2-3 мин. Мазок подсушиваем на воздухе в течение 1-2 мин. Затем микроскопируем с использованием УФ-фильтра со спектром длины волны 530 нм при увеличении 300×, 600×. Необходимо исследовать 100 сперматозоидов, посчитывая отдельно сперматозоиды с фрагментированной ДНК и нормальные, подсчет проводится визуально. Сперматозоиды с фрагментированной ДНК окрашиваются в красный, желтый или оранжевый цвета, нормальные - в зеленый цвет.
Проводим учет результатов.
Количество сперматозоидов с фрагментированными участками ДНК IFn, % вычисляют по формуле
,
где С+ - количество сперматозоидов, окрашенных в красный, желтый и оранжевые цвета, шт;
С- - количество сперматозоидов, окрашенных в зеленый цвет, шт.
За окончательный результат, округленный до третьего десятичного знака, принимают среднеарифметическое значение результатов не менее чем трех измерений, выполненных в условиях повторяемости по ГОСТ ИСО 5725-1. Допускаемые расхождения между результатами определений не должны превышать 10%.
При выявлении индекса фрагментации более 30% спермопроба выбраковывается и не допускается для искусственного осеменения животных.
Источники информации
1. ГОСТ 32277-2013 Средства воспроизводства. Сперма. Методы испытаний физических свойств и биологического, биохимического, морфологического анализов.
2. Иолчиев Б.С, Багиров В.А, Кленовицкий П.М., Кононов В.П., Таджиева А.В. Индекс фрагментации ДНК хроматина сперматозоидов при оценке качества семени у быков-производителей. Сельскохозяйственная биология №4, 2012 г.
3. С.А. Руднева, Е.Е. Брагина, Е.А. Арифулин, Т.М. Сорокина, Л.В. Шилейко, С.А. Ермолева, Л.Ф. Курило, В.Б. Черных. Фрагментация ДНК в сперматозоидах и ее взаимосвязь с нарушением сперматогенеза. 2014 г.
Способ определения индекса фрагментации ДНК сперматозоидов у животных-производителей, включающий размораживание спермопробы, подготовку мазка спермопробы к исследованию, фиксацию мазка спиртовым раствором уксусной кислоты в течение 1 часа в холодильной камере при постоянной температуре, приготовление красителя смешиванием 40 мл раствора лимонной кислоты, 2,5 мл раствора гидрофосфата натрия и 10 мл 1%-го акридин оранжевого, погружение образца в краситель, микроскопию, отдельный подсчет сперматозоидов с фрагментированной ДНК и нормальных, при этом сперматозоиды с фрагментированной ДНК окрашиваются в красный, желтый или оранжевый цвета, нормальные - в зеленый цвет, количество сперматозоидов с фрагментированными участками ДНК IFn, % вычисляют по формуле 
, где С+ - количество сперматозоидов, окрашенных в красный, желтый и оранжевые цвета, шт; С- - количество сперматозоидов, окрашенных в зеленый цвет, шт., при этом за окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов не менее чем трех измерений, при выявлении индекса фрагментации более 30% спермопроба выбраковывается и не допускается для искусственного осеменения животных.
