Способ диагностики болезни виллебранда (субтип 2n)

Изобретение относится к области медицины, в частности к исследованию крови, и может быть использовано для диагностики болезни Виллебранда. Способ диагностики болезни Виллебранда (субтип 2N) заключается в том, что для выявления указанного субтипа используется тромбоэластография до и после двухкратной инфузии концентрата фактора Виллебранда (ФВ) в дозе 40-50 МЕ/кг, а диагностику осуществляют определением показателя Ratio как отношение времени рекальцификации крови (при записи тромбоэластограммы) до двухкратной инфузии ко времени рекальцификации крови после двукратной инфузии концентрата ФВ, и при значении показателя Ratio больше 1,3 диагностируют болезнь Виллебранда (субтип 2N). 2 ил., 1 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, в частности исследованию крови, и может быть использовано для диагностики болезни Виллебранда (БВ).

В основе клинических проявлений БВ лежат рецидивы кровотечений разных локализаций вследствие недостаточности фактора Виллебранда (ФВ).

БВ разделяют на три типа, кроме того, второй тип этой патологии принято разделять на несколько субтипов [Colman R.W., Hirsh J., Marder V.J. Hemostasis and Thrombosis: Basic Principles and Clinical Practice, 3rd ed. Philadelfia, J.B. Lippincott. 1994. - P. 3-18; Мамаев A.H. Коагулопатии. - M.: Геотар-Медиа. 2012. - 264 с.]. Наиболее проблемным для диагностики является субтип 2N, поскольку этот вариант проявляется существенным снижением коагуляционного фактора VIII (FVIII:C), что затрудняет его дифференциацию от гемофилии у лиц мужского пола.

Известен способ диагностики БВ, основанный на определении ристоцетин-кофакторной активности ФВ в плазме крови [Мамаев А.Н. Практическая гемостазиология. - М.: Практическая медицина, 2014. - 240 с.]. Однако известный способ пригоден для обнаружения 3-го типа БВ, но не пригоден для диагностики субтипа 2N, поскольку в большинстве случаев он не выявляет этот вариант заболевания.

Наиболее близким по достигаемому положительному результату (прототипом) является способ диагностики БВ, заключающийся в том, что для обнаружения 2N субтипа заболевания используют информацию о нарушении выраженности специфического связывания молекул ФВ с антителами к FVVIII:C [Casanato A., Pontara Е., Zerbinati P. et al. The evaluation of factor VIII binding activity of von Willebrand factor by means of an ELISA method: significance and practical implications. Am J Clin Pathol. 1998; 109. - Р. 347-352]. Однако недостатком известного способа является необходимость использования специального оборудования и дорогостоящих реактивов для осуществления иммуноферментного анализа.

Авторы предлагают способ, в котором технический результат достигается тем, что диагностика БВ (субтипа 2N) осуществляется при помощи тромбоэластографии и двух инфузий концентрата ФВ, который не содержит в своем составе FVIII:C. После двухкратной инфузий концентрата ФВ в кровь больного с субтипом 2N БВ происходит нормализация показателей тромбоэластограммы за счет восстановления FVIII:C, а у других пациентов, имеющих коагулопатию иного генеза (в том числе гемофилию), подобного восстановления не происходит.

Техническим результатом заявляемого способа является простота его выполнения за счет использования широко распространенного метода исследования - тромбоэластографии, отсутствие необходимости использования дорогостоящих реагентов импортного производства для иммуноферментного анализа, отсутствие необходимости этапа приготовления бедной тромбоцитами плазмы для исследования (нет необходимости центрифугировать кровь, т.к. используется цитратная кровь), а также расширение диагностических возможностей технологии тромбоэластографии.

Способ осуществляют следующим образом.

У пациента с подозрением на наличие субтипа 2N БВ (например, пациенту с неуточненным снижением FVIII:C) в день обращения следует выполнить тромбоэластографию цитратной крови (результат рекальцификации маркируют СТ1), после этого дважды (в день обращения и через 24 часа после первой внутривенной инфузий) применяют (внутривенно, струйно) высокоочищенный концентрат ФВ в дозе 40-50 МЕ/кг. Через 48 часов после первого введения высокоочищенного концентрата ФВ повторно определяют тромбоэластографию цитратной крови (результат рекальцификации маркируют СТ2) и рассчитывают отношение Ratio. При показателе Ratio более 1,3 диагностируют наличие у пациента БВ (субтип 2Т).

Реактивы и оборудование:

1. Вакуумные пробирки для забора крови, содержащие в качестве антикоагулянта 3,2% (0,109 моль/л) цитрат натрия (например, VACUETT®, производитель Greiner Bio-One, Австрия), соотношение кровь+цитрат соответствует 9+1.

2. Тромбоэластограф «Rotem» (или аналогичные). В качестве реагента для определения времени рекальцификации при записи тромбоэластографии необходимо использовать Кальция хлорид (концентрированный раствор; 5,4%), 10 мл - во флаконе, производитель ООО фирма «Технология-Стандарт» (Барнаул), каталожный номер 022.

3. Концентрат фактора Виллебранда, который не содержит в своем составе FVIII:C, например WILFACTIN (LFB BIOMEDICAMTNTS) или аналогичные.

4. Дозаторы лабораторные на 0,02 и переменного объема 0,1-1,0 мл.

5. Вода дистиллированная.

6. Перчатки медицинские диагностические одноразовые.

Приготовление исследуемых образцов крови, концентрата ФВ, раствора кальция хлорида:

Приготовление исследуемой крови. Забор крови осуществляется дважды. Первый раз до введения концентрата ФВ, второй раз через 48 часов после первого введения концентрата ФВ. Оба раза кровь получают из локтевой вены иглой без жгута при помощи вакуумной пробирки для забора крови VACUETTE, содержащей в качестве антикоагулянта 3,2% (0,109 моль/л) цитрат натрия. Для определения времени рекальцификации при выполнении тромбоэластографии нет необходимости центрифугировать кровь. Исследование рекальцификации необходимо выполнить не позднее 4-х часов после забора крови.

Приготовление раствора для определения рекальцификации. Для приготовления рабочего раствора кальция хлорида в день исследования концентрированный раствор кальция хлорида развести дистиллированной водой в 1,33 раза (1 объем концентрированного раствора + 0,33 объема воды), например 1,0 мл концентрированного раствора смешать с 0,33 мл дистиллированной воды. Так получают 4,16% рабочий раствор кальция хлорида для записи тромбоэластограммы.

Приготовление раствора концентрата ФВ. Флаконы растворителя и лиофильно высушенного концентрата ФВ прогреть до комнатной температуры. Удалить защитные крышки с флаконов лиофилизата ФВ и растворителя, продезинфицировать резиновые пробки флаконов одной из дезинфицирующих салфеток. Короткий конец двухконцевой иглы освободить от пластиковой упаковки, проткнуть им в центре пробку флакона с растворителем и надавить вниз до упора. Перевернуть флакон с растворителем вместе с иглой, освободить длинный конец двухконцевой иглы от пластиковой упаковки, проткнуть им в центре пробку флакона с лиофилизатом и надавить вниз до упора. Вакуум во флаконе с лиофилизатом втянет воду. Пустой флакон от растворителя отделить вместе с иглой от флакона с лиофилизатом. Препарат быстро растворится, для этого флакон необходимо слегка покачивать.

Ход определения:

1. Определение времени рекальцификации крови при помощи тромбоэластографии до инфузий концентрата ФВ (СТ1).

Для определения показателя СТ1 используют образец крови, полученный в день обращения (до введения концентрата ФВ). После включения прибора ROTEM® необходимо оставить его на 20 мин для достижения рабочей температуры, программное обеспечение при этом запускается автоматически. В меню «измерение» нужно выбрать первый канал нажатием соответствующего пункта меню или клавишей F1. Добавить 0,3 мл крови в измерительную кювету тромбоэластографа. Добавить дозатором 0,02 мл рабочего раствора кальция хлорида, нажать кнопку СТАРТ и поместить кювету для измерения на соответствующий держатель №1. После этого на экране вместо формы введения демографических данных появляется график тромбоэластограммы. Дождаться записи графика тромбоэластограммы и вычисления расчетных показателей. Полученный показатель СТ обозначить как СТ1.

2. Внутривенное введение раствора концентрата ФВ.

Внутривенное введение раствора концентрата фактора Виллебранда проводится дважды медленно (2 мл в течение минуты) при помощи шприца. Доза 40-50 МЕ/кг массы тела. Первый раз внутривенная инфузия концентрата ФВ (40-50 МЕ/кг) выполняется в день обращения после определения показателя СТ1, второй раз (40-50 МЕ/кг) через 24 часа после первого введения концентрата.

3. Определение времени рекальцификации при помощи тромбоэластографии после двукратной инфузий концентрата ФВ (СТ2). Для определения показателя СТ2 используют образец крови, полученный после двухкратной инфузий концентрата ФВ (т.е. через 48 часов после первой инъекции концентрата ФВ). После включения прибора ROTEM® необходимо оставить его на 20 мин для достижения рабочей температуры, программное обеспечение при этом запускается автоматически. В меню «измерение» нужно выбрать первый канал нажатием соответствующего пункта меню или клавишей F1. Добавить 0,3 мл крови в измерительную кювету тромбоэластографа. Добавить дозатором 0,02 мл рабочего раствора кальция хлорида, нажать кнопку СТАРТ и поместить кювету для измерения на соответствующий держатель №1. После этого на экране вместо формы введения демографических данных появляется график тромбоэластограммы. Дождаться записи графика тромбоэластограммы и вычисления расчетных показателей. Полученный показатель СТ обозначить как СТ2.

Оценка полученных результатов:

Определяют отношение Ratio исследуемого больного по формуле:

;

где Ratio - математическое отношение показателя времени рекальцификации крови (при записи тромбоэластограммы) до и после двухкратной инфузий концентрата ФВ;

СТ1 - показатель рекальцификации крови (при записи тромбоэластограммы) до инфузий концентрата ФВ;

СТ2 - показатель рекальцификации крови (при записи тромбоэластограммы) после двухкратной инфузий концентрата ФВ;

При отсутствии у пациента субтипа 2N БВ время рекальцификации существенно не изменится, показатель Ratio будет менее 1,3. У больных с болезнью Виллебранда (субтип 2N) при введении концентрата фактора Виллебранда значительно уменьшится время рекальцификации при записи тромбоэластграфии за счет нормализации FVIII:C, поэтому показатель Ratio будет более 1,3.

Результаты теста считаются положительными, если R более 1,3.

Специфичность и воспроизводимость способа

Введенный внутривенно высокоочищенный или рекомбинантный концентрат ФВ сам по себе не способен изменить параметры тромбоэластограммы (например, при гемофилии), поскольку ФВ прямо не участвует в коагуляции. Однако появление в крови у больного с субтипом 2N БВ после двукратной инфузий нормального ФВ восстановит отсутствующий FVIII:C в течение суток. Именно поэтому заявляемый способ высоко специфичен, т.к. в применяемом концентрате нет FVIII:C, а восстановление FVIII:C идет за счет прекращения его разрушения в течение двух суток после применения концентрата ФВ.

Кроме того, выполнение заявляемого способа не требует применения импортных реагентов для иммуноферментного анализа, он отличается простотой и широкой доступностью за счет использования распространенного метода исследования - тромбоэласторафии. Позитивными эффектами заявляемого способа является отсутствие необходимости этапа приготовления бедной тромбоцитами плазмы для исследования (нет необходимости центрифугировать кровь, т.к. используется цитратная кровь), а также расширение диагностических возможностей технологии тромбоэластографии.

Для оценки воспроизводимости способа использовали определение коэффициента вариации (в %) при многократном исследовании одних и тех же образцов нормальной плазмы и плазмы больных с БВ. Заявляемый способ показал хорошую воспроизводимость. Коэффициент вариации (KB) не превышал 8%.

Апробация предлагаемого способа

Апробацию заявляемого способа диагностики провели на больных с геморрагическим синдромом. Диагностировали БВ (2N субтип) у трех больных. У одного мужчины (Ratio - 1,9) и двух женщин (Ratio - 1,7 и 1,8). При этом мужчина, имеющий снижение FVIII:C и нормальную ристомициновую агрегацию тромбоцитов, ранее наблюдался у гематолога по поводу гемофилии А. Применение разработанного способа позволило скорректировать неправильный диагноз у этого больного.

Пример практического использования способа

Больной Е. обратился к гематологу Алтайского гематологического центра по поводу системной кровоточивости. Кожный геморрагический синдром в виде экхимозов у пациента с раннего детства. В возрасте 1 года была гематома в области спины при падении, эпизод длительного кровотечения после экстракции зуба в возрасте 7 лет, проводилась заместительная трансфузионная терапия СЗП. Ранее при обследовании был установлен диагноз: Гемофилия А, легкое течение. Наследственность: у деда по материнской линии были геморрагии (со слов родственников, медицинские документы не представлены), умер в 45 лет от геморрагического инсульта.

Общее состояние удовлетворительное. Больной в сознании, ориентирован. На вопросы отвечает правильно. Вес 702 кг. Кожные покровы и слизистые обычной окраски. Дыхание везикулярное, хрипов нет, ЧДД-17 в мин. Тоны сердца приглушены, ритм правильный, ЧСС 86 в мин, АД 120/70. Живот мягкий, безболезненный, печень и селезенка не увеличены. Отеков нет.

Из представленной информации (Фиг. 1), следует, что у пациента имеется коагулопатия, обусловленная недостаточностью FVIII:C. Подобные результаты исследования системы гемостаза наблюдаются при гемофилии и при субтипе 2N болезни Виллебранда.

В соответствии с регламентом предлагаемого способа пациенту проведены две инфузии концентрата ФВ в дозе 42 МЕ/кг массы тела (в день обращения 3000 ME в/в и через 24 часа 3000 МБ в/в). Повторно исследование гемостаза проведено через 48 часов после первой инфузий (Фиг. 2).

В результате применения предлагаемого способа у пациента показатель Ratio превышает 1,3 за счет нормализации времени рекальцификации, что свидетельствует о наличии у больного БВ (субтипа 2N).

Способ диагностики болезни Виллебранда (субтип 2N), основанный на изучении показателей системы гемостаза, отличающийся тем, что для выявления указанного субтипа используется тромбоэластография до и после двухкратной инфузии концентрата фактора Виллебранда в дозе 40-50 МЕ/кг, а диагностику осуществляют определением показателя Ratio как отношение времени рекальцификации крови (при записи тромбоэластограммы) до двухкратной инфузии ко времени рекальцификации крови после двукратной инфузии концентрата ФВ, и при значении показателя Ratio больше 1,3 результаты способа считают положительными.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к медицинской технике. Испытательное устройство для исследования крови или компонентов крови содержит первую часть и вторую часть, содержащие взаимодействующие первый и второй соединительные элементы для соединения первой части со второй частью, и абсорбирующий и/или адсорбирующий элемент для абсорбирования и/или адсорбирования образца.

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной клинической диагностике, и может быть использовано для проведения лабораторных анализов динамики изменения скорости оседания эритроцитов, а также в исследовательских целях.
Изобретение относится к медицине и представляет собой способ оценки эффективности антикоагулянтной терапии у больных с фибрилляцией предсердий (ФП), перенесших инсульт, отличающийся тем, что перед назначением антикоагулянтной терапии новыми пероральными антикоагулянтами (НПОАК) у пациента проводят взятие крови из периферической вены, 10 мкл которой помещают в камеру Горяева с зеркальным напылением и анализируют с помощью лазерного фазово-интерференционного микроскопа, измеряя фазовую высоту 40-50 эритроцитов в пробе; определяют среднюю максимальную dY1 и среднюю минимальную dY2 фазовую высоту эритроцитов, рассчитывают коэффициент оксигенации эритроцитов dY2/dY1; значения dY2/dY1 от 0,085 до 0,2 считают нормальными; значения dY2/dY1<0,085 и значения dY2/dY1>0,2 свидетельствуют о нарушении реологических свойств крови; через 17 недель после начала терапии НПОАК исследование повторяют; достижение или сохранение значений dY2/dY1 от 0,085 до 0,2 считают признаком эффективности терапии, а значения dY2/dY1<0,085 и значения dY2/dY1>0,2 свидетельствуют о ее неэффективности.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для оптимизации выявления тромбофилии у женщин с рецидивирующими репродуктивными потерями.

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине, к лабораторным способам исследования в физиологии и гематологии. Способ определения М-холинореактивности эритроцитов крови включает забор крови (0,2 мл) у человека или животного, подготовку раствора атропина с концентрацией 0,4 мг/мл, инкубацию образца крови в гипоосмотической среде в отсутствии (контрольная проба) и присутствии атропина в конечной концентрации 15×10-6 мг/мл (опытная проба), определение оптической плотности надосадочной жидкости проб, расчет значения M-холинореактивности эритроцитов как процента, на который гемолиз в опытных пробах ниже, чем в контрольных.

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии и иммунологии, и может быть использовано для выявления нарушения у детей иммунологической реактивности в условиях избыточной экспозиции стронцием.

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической фармакологии, и предназначено для количественного определения амантадина в плазме крови. Для количественного определения амантадина в плазме крови осуществляют анализ крови методом хромато-масс-спектрометрии.
Изобретение относится к медицине, а именно к оториноларингологии, и может быть использовано для прогнозирования прогрессирующего течения сенсоневральной тугоухости (СНТ).

Группа изобретений относится к области определения частоты проведения анализа газового состава артериальной крови. Способ определения частоты проведения анализа газового состава артериальной крови (ABG) содержит этапы, на которых: принимают предыдущие результаты ABG-анализа; определяют исходное время для следующего ABG-анализа на основе предыдущих результатов ABG-анализа и правила из набора правил; принимают данные мониторинга; определяют уточненное время для следующего ABG-анализа на основе исходного времени для следующего ABG-анализа и данных мониторинга; и извлекают параметры степени насыщения крови кислородом на основе данных мониторинга.

Группа изобретений относится к обнаружению аналита в физиологических текучих средах. Способ определения концентрации глюкозы в крови осуществляют с помощью системы измерения глюкозы, которая включает тест-полоску и измерительный прибор, причем измерительный прибор имеет микроконтроллер, запрограммированный для приложения множества тестовых напряжений к тест-полоске и измерения выходного переходного токового сигнала, который является результатом электрохимической реакции в камере для анализа тест-полоски, причем способ включает: вставку тест-полоски в разъем порта для установки полоски измерительного прибора для соединения по меньшей мере двух электродов тест-полоски с цепью измерения полоски; запуск последовательности анализа после нанесения пробы; приложение первого напряжения в течение первого промежутка времени и измерение первого выходного значения тока; переключение первого напряжения на второе напряжение, отличное от первого напряжения; изменение второго напряжения на третье напряжение, отличное от второго напряжения; измерение второго выходного значения тока переходного токового сигнала с электродов после изменения со второго напряжения на третье напряжение; оценку третьего тока, близкого к выходному значению установившегося тока переходного токового сигнала, после установки третьего напряжения на электродах; вычисление концентрации глюкозы в крови на основе первого, второго и третьего выходных значений тока переходных токовых сигналов с помощью заданного соотношения.
Изобретение относится к медицине, а именно к трансфузиологии, и предназначается для использования в лечебных учреждениях при прогнозировании потребности в аллогенных эритроцитсодержащих компонентах крови в интраоперационном и раннем послеоперационном периодах при хирургической коррекции клапанной патологии у взрослых пациентов.

Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ прогнозирования частоты обострений при хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ). Используют результаты теста с оценкой расстояния, пройденного пациентом за 6 минут, проводят оценку по шкалам влияния, симптомов и активности, рассчитывают количество выкуриваемых пачек сигарет в год, устанавливают факт курения на момент обследования, осуществляют орофарингеальный мазок с задней стенки глотки с выделением ДНК и секвенированием по V3-V4 участкам бактериального гена 16S рРНК определяют количество операционных таксономических единиц семейства Propionibacteriaceae, семейства Acidaminobacteraceae, рода Bradyrhizobium, рода Treponema, рода Ruminococcus, вида Rothia mucilaginosa, вида Brevundimonas diminuta, вида Pseudomonas viridiflava, вида Acinetobacter schindleri, рода Sphingopyxis alaskensis.

Изобретение относится к клинической медицине, а именно к анестезиологии и реанимации, как способ прогнозирования развития артериальной гипотонии у беременных юного возраста при спинномозговой анестезии во время операции кесарево сечение.
Изобретение относится к медицине, а именно к трансфузиологии, и предназначается для использования в лечебных учреждениях при прогнозировании потребности в аллогенных эритроцитсодержащих компонентах крови в интраоперационном и раннем послеоперационном периодах при плановых кардиохирургических вмешательствах у взрослых пациентов.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования наличия хромосомных аномалий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества в программе экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии, клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики болезни Парксинсона. Для этого проводят забор периферической крови, выделяют однородную фракцию CD45+ клеток с лизированием выделенной клеточной фракции.

Изобретение относится к области биотехнологии и предназначено для определения индекса фрагментации ДНК сперматозоидов у животных-производителей. Осуществляют подготовку мазка спермопробы к окрашиванию и приготовление красителя смешиванием раствора лимонной кислоты, гидрофосфата натрия и 1%-го акридин оранжевого.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis. Способ детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis, включает иммунологический анализ специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis белка, где внеклеточную секрецию указанного белка осуществляют посредством термической обработки биологического образца, содержащего комплекс Mycobacterium tuberculosis, при 45-50°C в течение от 15 до 60 минут.
Изобретение относится к медицине, а именно к профболезням, и может быть использовано для предотвращения заболевания шахтера антракосиликозом. Для этого в забое проводят отбор углепородных проб по сечению забоя бороздами, измеряют запыленность рудничного воздуха во время работы горной машины по разрушению углепородного массива, дополнительно отбирают пробы воздуха в рабочей зоне машины и устанавливают в нем дисперсный состав кремниевой пыли, при этом опасность заболевания шахтера антракосиликозом устанавливают по стажу работы в запыленном кремниевыми частицами воздухе и количеству поглощенной его легкими опасной для здоровья тонкодисперсной кремниевой пыли.
Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и может быть использовано для прогнозирования осложнений дентальной имплантации. Для этого при подготовке пациента к дентальной имплантации в его слюне определяют содержание конечных продуктов перекисного окисления липидов и при их значении более 0,015 прогнозируют неблагоприятный результат дентальной имплантации.
Изобретение относится к иммунологии, вирусологии, биотехнологии и лабораторной диагностике в медицине и может быть использовано для диагностики параметров врожденного иммунитета и при различных заболеваниях инфекционной (вирусной, бактериальной, грибковой) и неинфекционной (аллергической, аутоиммунной, онкологической) этиологии. Способ определения продукции интерферонов как параметров врожденного иммунитета, характеризующийся использованием культуры клеток млекопитающего, чувствительной к ИФН, инфицированной вирусом VSV, отличается тем, что в качестве культуры клеток млекопитающего используют культуру клеток эпителия почечных канальцев зеленой мартышки (Vero), производят количественное определение продукции интерферонов I и II типов, основанное на оценке 50% защиты монослоя бессывороточной линии клеток эпителия почечных канальцев зеленой мартышки (Vero) от индуцированного тест-вирусом везикулярного стоматита (VSV) цитодеструктивного эффекта; способ включает введение проб индивидуума в лунки с чувствительной к ИФН клеточной культуре Vero и последующей обработкой тест-вирусом VSV. 7 з.п. ф-лы.
Наверх