Антиметастатическое средство
Владельцы патента RU 2657814:
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" (Томский НИМЦ) (RU)
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Сибирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России) (RU)
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к антиметастатическому средству. Применение жидкого экстракта рябины обыкновенной (Sorbus aucuparia L.), полученного экстрагированием листьев рябины, измельченных до размера частиц диаметром 0,3-0,5 см, 40% этиловым спиртом при температуре 75°С в течение 60 минут, в качестве антиметастатического и повышающего противометастатическое действие циклофосфана средства. Вышеописанное средство расширяет арсенал средств растительного происхождения, обладающих более выраженным ингибирующим действием на развитие метастазов и повышающих антиметастатическое действие цитостатиков. 1 табл., 2 пр.
Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и может быть использовано для подавления процесса метастазирования и повышения антиметастатической активности цитостатических препаратов при лечении онкологических пациентов.
Метастазирование является основной причиной смерти онкологических больных. Эффективно действующие на метастатические клетки опухоли лекарственные средства отсутствуют. В основном при генерализованном опухолевом процессе применяется химиотерапия, возможности которой ограничены наличием у цитостатических средств большого количества побочных эффектов. Актуальным является поиск препаратов, ингибирующих процесс диссеминации и повышающих антиметастатическое действие цитостатиков.
Известно противометастатическое средство, содержащее вытяжку из надземной части (травы) аконита байкальского (Aconitum baikalense Steinb.), содержит алкалоиды, в связи с чем его применение может сопровождаться токсическими эффектами [3].
Известно средство из плодов Sorbus aucuparia L., обладающее противоопухолевой активностью и повышающее антиметастатическое действие циклофосфана [4].
Наиболее близким по фармакологическим эффектам к заявляемому средству является экстракт родиолы розовой жидкий [1]. Однако экстракт родиолы противопоказан больным с таким сопутствующим заболеванием, как гипертоническая болезнь [2].
Новый технический результат - расширение арсенала средств растительного происхождения, обладающих более выраженным ингибирующим действием на развитие метастазов и повышающих антиметастатическое действие цитостатиков.
Для достижения нового технического результата применяют жидкий экстракт листьев рябины обыкновенной (Sorbus aucuparia L.), полученный экстрагированием листьев рябины, измельченных до размера частиц диаметром 0,3-0,5 см, 40% этиловым спиртом при температуре 75°С в течение 60 минут, в качестве антиметастатического и повышающего противометастатическое действие циклофосфана средства.
Жидкий экстракт листьев рябины обыкновенной (Sorbus aucuparia L.) получают методом динамической дробной мацерации.
Для получения экстракта используют лабораторный реактор с паровой рубашкой («Radleys», Германия), подключенный к погруженному циркуляционному блоку регулирования температуры «MO1» («Термэкс», Россия), верхнеприводной мешалке RZR 2020 («Heidolph», Германия) и шариковому холодильнику. Листья рябины измельчают до размера частиц диаметром 0,3-0,5 см. Навеску листьев помещают в реактор, добавляют 40%-ный спирт этиловый. Экстрагируют при температуре 75°С в течение 60 минут. Полученным извлечением экстрагируют и новую порцию сырья.
Готовый экстракт отстаивают при температуре не выше +10°С не менее 2 суток до получения прозрачной жидкости, затем фильтруют и хранят при температуре не выше +5°С, в защищенном от света месте.
Стандартизацию готового экстракта проводят по органолептическим показателям (цвет, запах, вкус), сухому остатку и содержанию действующих веществ [5]. Экстракт на 40%-ном спирте этиловом представляет собой буро-зеленую жидкость, со специфическим запахом кисловато-горького вкуса.
Сухой остаток жидкого экстракта листьев рябины обыкновенной определяли с помощью весового влагомера MS-70 («AND», Япония). Сухой остаток исследуемого экстракта составляет 0,04418±0,0015 г/мл.
Для стандартизации жидкого экстракта по содержанию действующих веществ использовали принцип сквозной стандартизации: лекарственное растительное сырье - субстанция - лекарственная форма. Результаты собственного химического анализа листьев рябины обыкновенной показали, что основным действующим веществом сырья является сумма фенолокислот, флавоноидов, в том числе антоцианов. Поэтому, учитывая результаты химического анализа, экстракт стандартизовали по содержанию данных групп веществ.
Для определения суммы фенолокислот и антоцианов в экстракте использовали разработанные нами методы прямой спектрофотометрии [6, 7, 8]. Для определения суммы флавоноидов использовали метод дифференциальной спектрофотометрии [5]. Установлено: содержание суммы фенолокислот в 40%-ном экстракте листьев рябины обыкновенной, в пересчете на хлорогеновую кислоту, составляет 17,86±0,12%; суммы флавоноидов в пересчете на рутин -3,70±0,11%, суммы антоцианов, в пересчете на цианид-3-о-глюкозид - 5,94±0,04%.
Новым в предлагаемом изобретении является свойство жидкого спиртового экстракта листьев рябины обыкновенной (Sorbus aucuparia L.) проявлять антиметастатическую активность и повышать противометастатическое действие циклофосфана.
Новое свойство явным образом не вытекает из уровня техники в данной области, не очевидно для специалиста и не обнаружено в патентной и научно-медицинской литературе. Предлагаемое в качестве изобретения средство может быть использовано в клинической онкологии.
Предлагаемое изобретение соответствует условиям патентоспособности «Новизна», «Изобретательский уровень» и «Промышленная применимость».
Данное средство прошло экспериментальное исследование на кафедре фармакогнозии с курсами ботаника и экологии ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России и в лаборатории онкофармакологии НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ.
Для выявления фармакологического действия жидкого спиртового экстракта листьев рябины обыкновенной были проведены эксперименты на мышах-самках линии C57BL/6 с карциномой легких Льюис и раком легкого-67.
При проведении экспериментов животные были распределены на группы:
1. Контроль - животные с опухолью, которым зондом в желудок вводили по 0,2 мл дистиллированной воды в течение 10-11 сут, начиная с 7 сут после перевивки. На 11-12 сут после перевивки опухоли животным однократно внутрибрюшинно вводили по 0,1 мл физиологического раствора.
2. Циклофосфан - животные с опухолью, которым зондом в желудок вводили по 0,2 мл дистиллированной воды в течение 10-11 сут, начиная с 7 сут после перевивки. На 11-12 сут после перевивки опухоли мышам вводили однократно внутрибрюшинно ЦФ в дозе 125 мг/кг в 0,1 мл воды для инъекций.
3. Экстракт листьев рябины обыкновенной (1 мл/кг) - животные с опухолью, которым вводили зондом в желудок экстракт листьев рябины обыкновенной в дозе 1 мл/кг в течение 10-11 сут, начиная с 7 сут после перевивки опухоли. На 11-12 сут после перевивки опухоли животным однократно внутрибрюшинно вводили по 0,1 мл физиологического раствора.
4. ЦФ + экстракт листьев рябины обыкновенной (1 мл/кг) - животные с опухолью, которым вводили зондом в желудок экстракт листьев рябины обыкновенной в дозе 1 мл/кг в течение 10-11 сут, начиная с 7 сут после перевивки. На 11-12 сут после перевивки опухоли мышам вводили однократно внутрибрюшинно ЦФ в дозе 125 мг/кг в 0,1 мл воды для инъекций.
5. Экстракт листьев рябины обыкновенной (5 мл/кг) - животные с опухолью, которым вводили зондом в желудок экстракт листьев рябины обыкновенной в дозе 5 мл/кг в течение 10-11 сут, начиная с 7 сут после перевивки опухоли.
На 11-12 сут после перевивки опухоли животным однократно внутрибрюшинно вводили по 0,1 мл физиологического раствора.
6. ЦФ + экстракт листьев рябины обыкновенной (5 мл/кг) - животные с опухолью, которым вводили зондом в желудок экстракт листьев рябины обыкновенной в дозе 5 мл/кг в течение 10-11 сут, начиная с 7 сут после перевивки. На 11-12 сут после перевивки опухоли мышам вводили однократно внутрибрюшинно ЦФ в дозе 125 мг/кг в 0,1 мл воды для инъекций.
По окончании экспериментов (на 21 сут) животных умерщвляли, соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденные Министерством здравоохранения РФ. Проводили вскрытие животных, ревизию внутренних органов, выделение опухоли, подсчет метастазов. Эффективность проведенных курсов лечения оценивали по противоопухолевому и противометастатическому действию препаратов, определяя массу опухоли, процент торможения ее роста, частоту метастазирования, количество и площадь метастазов в легких, индекс ингибирования метастазирования (%) [9, 10].
Обработку полученных результатов проводили с использованием непараметрических критериев Вилкоксона-Манна-Уитни (u) и углового преобразования Фишера (ϕ). Различия считали достоверными при Р<0,05 [11].
Пример 1.
В эксперименте на мышах-самках линии C57BL/6 с карциномой легких Льюис обнаружено, что у мышей, получавших экстракт листьев рябины обыкновенной в дозе 1 мл/кг, уменьшение количества метастазов (в 1,3 раза) и их площади (в 3,0 раза) носило характер тенденции, тогда как у животных, которым вводили экстракт листьев рябины обыкновенной в дозе 5 мл/кг, количество метастазов в легких оказалось достоверно меньше (в 2,3 раза, Р<0,01), площадь метастазов снизилась в 6,8 раза (Р<0,01), частота метастазирования составила 75% против 100% в контроле, высоким оказался и индекс ингибирования метастазирования (68%) (таблица).
При комбинированном использовании циклофосфана и экстракта листьев рябины в дозе 5 мл/кг достоверно меньше оказались все показатели процесса диссеминации: частота метастазирования составила 63% против 100%, количество метастазов снизилось в 7,4 раза, их площадь оказалась в 12,7 раза меньше этих показателей у получавших только цитостатик животных, индекс ингибирования метастазирования составил 95%. Если же совместно с циклофосфаном вводили экстракт листьев рябины в дозе 1 мл/кг, метастазы в легких мышей полностью отсутствовали (таблица).
Пример 2.
В эксперименте на мышах-самках линии C57BL/6 с раком легкого-67 выявлено ингибирующее влияние экстракта листьев рябины, вводимого в дозах 1 и 5 мл/кг, на процесс диссеминации: количество метастазов в легких уменьшилось в 1,4 и 1,9 раза (Р<0,05), а их площадь - в 2,7 и 4,4 раза (Р<0,05) относительно этих данных у контрольных мышей, ИИМ составил 31% и 53% (таблица).
При добавлении в схему химиотерапии экстракта листьев рябины обыкновенной в обеих изучаемых дозах достоверно меньше оказались все показатели процесса метастазирования. Так, единичные метастазы в легких отмечены у 20% и 10% мышей, получавших циклофосфан совместно с экстрактом в дозах 1 и 5 мл/кг, ИИМ составил 99% (таблица).
Таким образом, в экспериментах на мышах с карциномой легких Льюис и раком легкого-67 выявлено антиметастатическое действие экстракта листьев рябины обыкновенной, а также его способность проявлять антиметастатическую активность и повышать противометастатическую активность циклофосфана.
Список источников информации, принятых во внимание при составлении описания:
1. Пат. 2023446 Российская Федерация, МПК А61К 35/78. Антиметастатическое средство/ Ярёменко К.В., Дементьева Л.А., Саратиков А.С.: заявитель и патентообладатель: Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра РАМН (RU). - №4082815/14; заявл. 13.05.1993; опубл. 30.11.1994.
2. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М., 2014. - С. 130.
3. Пат. 2189832 Российская Федерация, МПК А61К 35/78. Средство, обладающее противометастатической активностью/ Пашинский В.Г., Семенов В.Г., Семенов А.А., Поветьева Т.Н., Погодаева Н.Н., Жапова Цымжит: заявитель и патентообладатель: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра СО РАМН (RU), №2001121507/14; заявл. 31.07.2001; опубл. 27.09.2002.
4. Пат. 2578457 Российская Федерация, МПК A61K 36/73, А61Р 35/00. Средство, обладающее противоопухолевой и антиметастатической активностью, повышающее противометастатическое действие циклофосфана / Разина Т.Г., Зуева Е.П., Калинкина Г.И., Исайкина Н.В., Андреева В.Ю., Рыбалкина О.Ю., Крылова С.Г., Амосова Е.Н., Лопатина К.А., Сафонова Е.А., Галиулина А.В.: заявитель и патентообладатель: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга" (RU). - №2015103700/15, заявл. 04.02.2015; опубл. 27.03.2016.
5. Государственная фармакопея СССР. Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. - 11-е изд., доп. М., 1989. - С. 160-161.
Примечание: в таблице перед уровнем значимости Р указаны номера сравниваемых групп
Применение жидкого экстракта рябины обыкновенной (Sorbus aucuparia L.), полученного экстрагированием листьев рябины, измельченных до размера частиц диаметром 0,3-0,5 см, 40%-ным этиловым спиртом при температуре 75°C в течение 60 минут, в качестве антиметастатического и повышающего противометастатическое действие циклофосфана средства.
