Способ получения r-бруцеллёзной сыворотки на кроликах
Владельцы патента RU 2659948:
Федеральное государственное бюджетное научноеучреждение "Омский аграрный научный центр" (ФГБНУ "Омский АНЦ") (RU)
Изобретение относится к ветеринарии и диагностике инфекционных болезней, а именно бруцеллеза. Предложен способ получения R-бруцеллезной сыворотки на кроликах. Он включает однократное подкожное введение смеси антигена (100 млн КОЕ/мл инактивированной культуры штамма В.abortus 16/4) с адъювантом MONTANIDE™ ISA 61 VG, пробное крововзятие на 16-20 день и с 21 по 35 день после гипериммунизации - трех-четырехкратное взятие крови от каждого кролика, из расчета 16-20 мл крови на 1 кг живой массы или тотальное обескровливание (производственное кровопускание). После крововзятия емкость с кровью ставят в термостат при 37°С на 3-4 часа для отделения сыворотки, затем помещают в холодильник при 2-8°С на двое суток для отстаивания сыворотки. Сыворотку от каждого животного сливают в стерильные сосуды, добавляют мертиолат натрия. Затем пробу сыворотки крови подвергают проверке на стерильность, активность и специфичность. Она должна быть стерильной и иметь титр: в пробирочной РА - 1:640-1:1280, в пластинчатой РА - 1:30-1:60 соответственно. Сыворотку консервируют и фасуют. Техническим результатом является снижение трудоемкости процесса, эпидемическая безопасность и увеличение получаемой сыворотки в 2-3 раза. 3 табл.
Изобретение относится к ветеринарии, к диагностике инфекционных болезней, а именно индикации и дифференциации возбудителей бруцеллеза.
Бруцеллез - инфекционная болезнь животных, представляющая большую опасность и для людей.
Возбудители бруцеллеза обладают различной степенью диссоциации и агглютинабельностью, порой полной утратой S-агглютинабельности. Индикация таких культур бруцелл затруднена. В этой связи актуальным является получение эффективной R-бруцеллезной диагностической агглютинирующей сыворотки. Известно, что для индикации и дифференциации возбудителей бруцеллеза в бактериологической диагностике необходима R-бруцеллезная агглютинирующая сыворотка. От уровня ее чувствительности зависит надежность индикации и видовой дифференциации бруцелл. Причем для практики важны простота и безопасность ее получения.
Наиболее близким является способ получения R-бруцеллезной сыворотки на кроликах, включающий 4-кратную внутривенную иммунизацию кроликов живой культурой B.abortus16/4, обескровливание животных через 5-7 дней после последнего введения [1].
Недостатками этого способа являются: трудоемкость процесса (внутривенная иммунизация, кратность введения), эпидемическая опасность, связанная с использованием живой культуры бруцелл вида abortus, небольшой объем выхода конечного продукта за счет получения сыворотки от животного-продуцента только при однократном взятии крови.
Техническим результатом предлагаемого способа изготовления R-бруцеллезной сыворотки является снижение трудоемкости процесса ее изготовления и эпидемической опасности, увеличения выхода конечного продукта.
Техническое решение достигается тем, что способ получения R-бруцеллезной сыворотки на кроликах включает подкожно однократно иммунизацию кроликов суспензией в объеме 1 мл, представляющую собой смесь: антигена (100 млн КОЕ/мл инактивированной культуры штамма В. abortus 16/4) с адъювантом MONTANIDE™ ISA 61 VG, на 16-20 день проводят пробное крововзятие, а на 21-35 дни осуществляют трехкратное четырехкратное взятие крови и обескровливание, сыворотку отстаивают, проверяют на стерильность и активность, сыворотка должна иметь титр: в пробирочной РА - 1:640-1:1280, в пластинчатой РА - 1:30-1:60 соответственно, консервируют и фасуют.
Предлагаемый способ получения R-бруцеллезной сыворотки позволяет снизить трудоемкость производственного процесса за счет однократного подкожного введения антигена кроликам, максимально повысить противоэпидемическую безопасность этого процесса за счет использования инактивированной культуры бруцелл штамма В.abortus 16/4. Использование адъюванта MONTANIDE™ ISA 61 VG в смеси с инактивированной культурой бруцелл штамма В.abortus 16/4 позволит стимулировать получение высоких титров антител и повысить количество получаемой сыворотки, минимум в два раза за счет взятия крови от каждого животного-продуцента минимум трех-четырехкратно.
Для иммунизации кроликов использовали инактивированную культуру бруцелл штамма В.abortus 16/4 в дозе 100 млн КОЕ/мл в смеси с адъювантом MONTANIDE™ ISA 61 VG.
В качестве адъюванта применяли французский препарат MONTANIDE™ ISA 61 VG, производитель - фирма «SEPPIC». Готовый к использованию масляный адъювант для ветеринарных вакцин для производства эмульсий «вода-в-масле» содержит особое обогащенное светлое минеральное масло и высокоочищенное ПАВ, полученное из маннитола и очищенной олеиновой кислоты растительного происхождения. Препарат MONTANIDE™ ISA 61 VG не содержит компонентов животного происхождения. Рецептуры вакцин с MONTANIDE™ ISA 61 VG вызывают сильный и продолжительный иммунный ответ. По сравнению с традиционными масляными эмульсиями суспензия с MONTANIDE™ ISA 61 VG является устойчивой, стабильной и легковводимой. Для приготовления 100,0 г вакцины обычно необходимо: MONTANIDE™ ISA 61 VG - 60,0 г и водной антигенной среды - 40,0 г, т.е. в соотношении 40 и 60% соответственно. Стабильные эмульсии получаются путем смешивания водной антигенной среды в MONTANIDE™ ISA 61 VG, при комнатной температуре или ниже, при интенсивном перемешивании [3].
В качестве антигена использовали штамм В.abortus 16/4. Используемый штамм В.abortus 16/4 должен отвечать паспортным данным. Его высевают на одну из питательных сред: эритрит агар, МППГГА. После 2-3-суточного роста бактериальную массу штамма В.abortus 16/4 смывают с поверхности питательной среды фенолизированным физиологическим раствором. Полученную взвесь бруцелл доводят до необходимой концентрации по оптическому стандарту мутности (производитель ФГБУ НЦЭСМП МЗ РФ), сливают через двойной стерильный марлевый фильтр в стерильные колбы и обезвреживают прогреванием на водяной бане при температуре 80°С в течение 60 минут, периодически помешивая. Проверяют на чистоту и стерильность бактериальной массы путем засева на питательные среды [2]. Взвесь штамма В.abortus 16/4, используемой в качестве антигена при гипериммунизации кроликов, должна быть стерильной.
При комнатной температуре интенсивно перемешивают на магнитной мешалке 4 мл взвеси убитой культуры штамма В.abortus 16/4 с добавлением 6 мл адъюванта MONTANIDE™ ISA 61 VG (для получения 10 мл суспензии).
В качестве животных-продуцентов использовали кроликов.
Заявленный результат достигается следующим образом:
Кроликам однократно подкожно вводят 1мл суспензии, представляющей собой смесь антигена (100 млн КОЕ/мл инактивированной культуры штамма В.abortus 16/4) с адъювантом MONTANIDE™ ISA 61 VG). На 16-20 день проводят пробное крововзятие. При условии положительной пластинчатой и пробирочной РА с R-антигеном и живыми культурами в R-форме с полученной R сывороткой в разведении не ниже 1:30 осуществляют взятие крови (из ушной вены) в сроки с 21 по 35 день после гипериммунизации, из расчета 16-20 мл крови на 1 кг живой массы. Проводят тотальное взятие крови (производственное кровопускание). Кровь отдельно от каждого кролика берут с соблюдением правил асептики и антисептики в отдельную стерильную емкость. После крововзятия емкость с кровью ставят в термостат при 37°С на 3-4 часа для отделения сыворотки, затем помещают в холодильник при 2-8°С на двое суток для отстаивания сыворотки. Сыворотку от каждого кролика сливают отдельно в стерильные сосуды, обезвреживают добавлением мертиолата натрия до конечной концентрации 1:10000 [5] и фасуют.
Контроль активности и специфичности полученной сыворотки осуществляют в пластинчатой и пробирочной РА с R- и S-антигенами и живыми культурами бруцелл в S- и R-форме. Сыворотка считается качественной, если пластинчатая РА с антигенами и живыми культурами бруцелл в R-.форме будет положительной в разведениях не ниже 1:30 при отрицательном результате РБП и пластинчатой агглютинации с живыми культурами бруцелл в S-форме в разведении 1:10. В пробирочной РА с R-антигеном титр сыворотки должен быть не ниже 1:640, при отрицательном результате РА с единым бруцеллезным антигеном для РА, РСК и РДСК в разведении 1:10. Постановку и учет реакций проводят согласно Наставлению по диагностике бруцеллеза животных [4].
Пробу сыворотки крови отдельно из каждой емкости подвергают проверке на стерильность путем высевов на МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом и среду Сабуро.
При условии стерильности и получении положительных результатов серологических реакций сыворотку смешивают в одну емкость для составления серии, консервируют (например, в качестве консерванта мертиолатом натрия в конечной концентрации 1:10000) и расфасовывают.
Пример 1. Определение оптимальной дозы антигена при гипериммунизации кроликов для получения R-бруцеллезной сыворотки (таблица 1)
В целях определения оптимальной дозы антигена при гипериммунизации кроликов инактивированной культурой В.abortus 16/4 в смеси с адъювантом MONTANIDE™ ISA 61 VG для получения R-бруцеллезной сыворотки были использованы 3 схемы гипериммунизации кроликов (таблица 1). Для чего из здоровых кроликов, предварительно проверенных на бруцеллез серологическими методами, с отрицательными результатами, сформировали три группы (по 3 кролика в каждой) и гипериммунизировали:
1-я группа - животным ввели однократно подкожно инактивированную культуру В.abortus 16/4 в дозе 50 млн КОЕ/мл в смеси с адъювантом MONTANIDE™ ISA 61 VG;
2-я группа - животным ввели однократно подкожно инактивированную культуру В.abortus 16/4 в дозе 100 млн КОЕ/мл в смеси с адъювантом MONTANIDE™ ISA 61 VG;
3-я группа - животным ввели однократно подкожно инактивированную культуру В.abortus 16/4 в дозе 200 млн КОЕ/мл в смеси с адъювантом MONTANIDE™ ISA 61 VG.
Результат РА с сыворотками крови, полученными от кроликов на 21 день после их сенсибилизации (таблица 1). В первой группе РА была положительной в разведении: пробирочной - 1:320, в пластинчатой - 1:20 соответственно; во второй группе была положительной в разведении: пробирочной РА - 1:1280, в пластинчатой -1:60 соответственно; в третьей группе была положительной в разведении: пробирочной РА - 1:1280, в пластинчатой РА - 1:60 соответственно, при отрицательном результате РБП, пластинчатой агглютинации с живыми культурами бруцелл в S-форме в разведении 1:10 и отрицательном результате РА с единым бруцеллезным антигеном для РА, РСК и РДСК в разведении 1:10 во всех группах. По результатам исследования оптимальной схемой гипериммунизации кроликов можно признать схему №2. При ее применении получены высокие титры антител на 21 день после сенсибилизации.
Пример 2. Определение оптимальной схемы гипериммунизации кроликов для получения R-бруцеллезной сыворотки (таблица 2)
В опыте изучили сравнительную эффективность трех схем получения R-бруцеллезной диагностической сыворотки. Для чего из здоровых кроликов, предварительно проверенных на бруцеллез серологическими методами, сформировали три группы (по 3 кролика в каждой):
1-я группа - животным ввели трехкратно с интервалом 7 дней подкожно (п/кожно) инактивированную культуру В.abortus 16/4 в общей дозе 46,5 млрд КОЕ/мл;
2-я группа - животным ввели четырехкратно с интервалом 7 дней внутривенно живую культуру В.abortus 16/4 в общей дозе 90,5 млрд КОЕ/мл.
3-я группа - животным ввели однократно подкожно инактивированную культуру В.abortus 16/4 в дозе 100 млн КОЕ/мл в смеси с адъювантом MONTANIDE™ ISA 61 VG в объеме 1 мл.
Кровь от животных в целях получения сыворотки брали на 14, 21, 28, 35 дни после введения антигенов.
Таким образом, из приведенных в таблице данных очевидно, что оптимальной является схема получения R-бруцеллезной диагностической сыворотки, испытанная на животных третьей группы, в которой использовалась однократная подкожная гипериммунизация суспензией инактивированной культуры бруцелл В.abortus 16/4 в смеси с масляным адъювантом MONTANIDE™ ISA 61 VG, который позволяет стимулировать получение высоких титров антител. Кроме эпидемической безопасности ее преимущества заключаются в ее высоких титрах при получении в отдаленные сроки после гипериммунизации, а значит, в возможности получения значительного объема сыворотки с высокой активностью за счет многократного (не менее 3-4 раз) взятия крови.
Пример 3. Изучение диагностической активности R-бруцеллезной диагностической сыворотки, полученной от кроликов, гипериммунизированных по разным схемам, через 6 месяцев хранения (таблица 3)
Установлено, что сыворотка, полученная от кроликов по схеме, предусматривающей однократную подкожную гипериммунизацию инактивированной культурой бруцелл В.abortus 16/4 в смеси с масляным адъювантом MONTANIDE™ ISA 61 VG, сохранила свою активность (РА в разведении не ниже 1:1280) в течение не менее 6 месяцев после ее получения из крови, взятой через 21, 28, 35 дней после гипериммунизации, в отличие от сыворотки, полученной при однократной внутривенной гипериммунизации живой культурой бруцелл В.abortus 16/4 без адъюванта, потерявшей активность в более ранние сроки - 28-35 дней.
Предлагаемый способ получения R-бруцеллезной сыворотки на кроликах позволяет снизить трудоемкость производственного процесса за счет однократного подкожного введения антигена кроликам, максимально повысить противоэпидемическую безопасность этого процесса за счет использования инактивированной культуры бруцелл штамма В.abortus 16/4. Использование адъюванта MONTANIDE™ ISA 61 VG в смеси с инактивированной культурой бруцелл штамма В.abortus 16/4 позволит стимулировать получение высоких титров антител и повысить количество получаемой сыворотки минимум в два раза за счет взятия крови от каждого животного-продуцента минимум трех-четырехкратно.
Литература
1. Дегтяренко Л.В., Косилов И.А., Ниязов У.Э., Шумилов К.В. Получение R-бруцеллезной сыворотки на кроликах / Профилактика и диагностика болезней животных. Сб.научных трудов. Новосибирск, 1983, с. 103-107.
2. Иванов Н.П. Бруцеллез животных и меры борьбы с ним / Под ред. Т.С. Сайдулдина. - Алматы, 2007. - 433 с.
3. Технический бюллетень MONTANIDE™ ISA 61 VG.
4. Наставление по диагностике бруцеллеза животных. Утв. Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ 29.09.2003 №13-5-02/0850.
5. СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)» от 28 ноября 2013 г.
Способ получения R-бруцеллезной сыворотки на кроликах, включающий иммунизацию культурой штамма В. abortus 16/4, крововзятие, получение сыворотки, сыворотку проверяют на стерильность и активность, отличающийся тем, что иммунизацию проводят подкожно однократно в объеме 1 мл, суспензией, представляющей собой смесь антигена (100 млн КОЕ/мл инактивированной культуры штамма В. abortus 16/4) с адъювантом MONTANIDE™ ISA 61 VG, на 16-20 день проводят пробное крововзятие, а на 21-35 дни осуществляют трех-четырехкратное взятие крови и обескровливают, сыворотка имеет титр: в пробирочной РА - 1:640-1:1280, в пластинчатой РА - 1:30-1:60 соответственно, сыворотку консервируют и фасуют.
