Способ получения минерализованных композитных микроскаффолдов для регенерации костной ткани

Группа изобретений относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой способ получения минерализованного композитного микроскаффолда для регенерации костной ткани и применение минерализованного микроскаффолда, полученного данным способом. При этом способ включает стадии подготовки водного раствора фиброина шелка, подготовки водного раствора желатина, формирования скаффолда из смеси растворов фиброина шелка и желатина (7:3) с добавлением 1% ДМСО, криоизмелчения скаффолда с использованием диспергатора, сортировки полученных фрагментов микроскаффолда и получение минерализованных микроскаффолдов путем погружения их в раствор, содержащий 684 мМ NaCl, 9,5 мМ CaCl₂, 3,5 мМ MgCl₂, 21 мМ NaHCO₃ и 4 мМ Na₂HPO₄, рН 4,0, и последующего погружения в раствор, содержащий 684 мМ NaCl, 9,5 мМ CaCl₂, 0,7 мМ MgCl₂, 10,5 мМ NaHCO₃ и 4 мМ Na₂HPO₄, рН 4,0 с дальнейшим высушиванием полученного продукта. Изобретения позволяют получать минерализованные композитные микроскаффолды, обладающие усиленной стимуляцией остеогенеза в отсутствие каких-либо индукторов, а также усиленной реорганизацией актинового цитоскелета, необходимой для успешной адгезии и дифференцировки остеобластов при упрощении технологии. 2 н.п. ф-лы, 1 табл., 3 ил., 3 пр.

 

Область техники

Группа изобретений относится к медицине, а именно к способу получения минерализованных композитных микроскаффолдов на основе фиброина шелка, желатина и гидроксиапатита, которые могут быть использованы в частности для регенерации костной ткани.

Уровень техники

Костные трансплантаты используются для усиления и стимулирования образования новой костной ткани в таких случаях, как: заживление переломов костей или пораженных суставов, восстановление и регенерация костей, поврежденных в результате травм или инфекций, улучшение регенерации костной ткани вокруг хирургически имплантированных устройств, таких как искусственные суставы, пластины и винты, используемые для выравнивания костей. Широкая сфера применения таких устройств подтверждается тем, что ежегодно по всему миру для ортопедических процедур используется 2,2 миллиона костных имплантов.

Разработка имплантата, точно имитирующего костную ткань включает в себя конструирование модели кости, что требует понимания биологии и физиологических процессов, происходящих в костной ткани. Кость можно рассматривать как открытый клеточный композитный материал, состоящий из остеогенных клеток, внеклеточного матрикса, белков, факторов роста, минеральных соединений кальция в виде гидроксиапатита кальция и комплекса кровеносных сосудов. Клетки, входящие в состав костной ткани, составляют около 10% от общего объема кости и включают в себя клетки-предшественники мезенхимального происхождения (остеобласты и остеоциты), а также клетки костной резорбции из системы гемопоэза, к которым относятся остеокласты. Преостеобласты являются клетками-предшественниками костной ткани, они расположены в надкостнице, эндосте и гаверсовых каналах, происходят от мезенхимальных стволовых клеток и дифференцируются под действием факторов роста, таких как, например, костные морфогенетические белки (BMP), 17 трансформирующий фактор роста бета (TGF-β), фактор роста фибробластов (FGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF) и интерлейкины, посредством миграции в специфические сайты, где происходит их пролиферация и дифференцировка в остеобласты. Формирование костной ткани происходит в три этапа: (1) пролиферация клеток, (2) созревание матрицы и (3) минерализация матрицы. На этапе пролиферации синтезируются белки внеклеточного матрикса, которые секретируются остеобластами наружу, формируя неминерализованную костную матрицу или остеоид. Затем, на этапе созревания матрицы, происходит сшивка белков остеоида, при этом образуется более прочная и стабильная структура. Сшитые фибриллы коллагена I типа, основного компонента остеоида, становятся основанием, на которое осаждаются неорганические минеральные соединения, формируя минерализованную костную матрицу. В конце этой стадии, остеобласты могут либо встроиться в костную ткань в виде остеоцитов, либо превратиться в неактивные остеобласты, покрывающие зрелую кость, либо пойти по пути программируемой гибели клеток (т.е., апоптоз) [P.Jayakumar and L. Di Silvio. Osteoblasts in bone tissue engineering // Proc. Inst. Mech. Eng. H. 2010. V. 224 (12). P. 1415-1440]. Остеоциты, встроенные в костный матрикс, являются наиболее распространенным типом клеток кости, они формируют сеть, соединяясь друг с другом с помощью длинных цитоплазматических ответвлений, которые расположены в крошечных канальцах. Считается, что с помощью этой сети, которая также включает остеокласты, они функционируют как сенсоры напряжения и деформации, что очень важно для поддержания структуры костной ткани [T.A. Franz-Odendaal, B.K. Hall and P.E. Witten. Buried alive: how osteoblasts become osteocytes // Dev. Dyn. 2006. V. 235 (1). P. 176-190]. Остеокласты - большие, многоядерные клетки, которые крепятся к костной матрице и солюбилизируют ее минеральную составляющую путем ацидофикации. Этот процесс жестко регулируется с помощью совместной паракринной секреции сигнальных молекул остеокластами и остеобластами в процессе, называемом ремоделированием костной ткани. Во внеклеточном матриксе белки обладают способностью самосборки и состоят преимущественно из коллагенов и неколлагеновых белков, которые включают в себя гликопротеины, протеогликаны и факторы роста. Коллагены составляют до 90% от общей массы белков внеклеточного матрикса, и в основном представляют собой коллаген I типа (97%), в меньшей степени - 18 коллагены типов III, V, XI и XIII. Неколлагеновые белки образуют дополнительные 10% костной массы [C.Gentili and R.Cancedda. Cartilage and bone extracellular matrix // Curr. Pharm. Des. 2009. V. 15 (12). P. 1334-1348]. Гликопротеины включают в себя щелочную фосфатазу (ALP), остеопонтин (OPN), костный сиалопротеин (BSP) и остеокальцин (OCN), которые модулируют процесс минерализации, а также остеонектин, который регулирует диаметр фибрилл коллагена. Кости представляет собой резервуар кальция, содержащий 99% кальция в организме. Костное минеральное вещество в основном (на 85%) представлено в виде гидроксиапатитов (Са10(РО4)6(ОН)2) с включениями карбоната кальция (10%), фторида кальция (2-3%) и фторида магния (2-3%). Природные гидроксиапатиты содержат карбонат-ионы в качестве заместителей фосфатных и гидроксильных групп структуры гидроксиапатита. Гидроксиапатиты представляют собой кристаллы диаметром около 20 нм. Повышение прочности и жесткости костей наблюдается вдоль их продольной оси [N.Sasaki, N.Matsushima, T.Ikawa, H.Yamamura and A.Fukuda. Orientation of bone mineral and its role in the anisotropic mechanical properties of bone-transverse anisotropy // J. Biomech. 1989. V. 22 (2). P. 157-1646]. Это связано с тем, что коллаген и минеральные кристаллы обычно ориентированы вместе и именно в этом направлении, причем минеральная составляющая придает кости механическую прочность, а фибриллы коллагена обеспечивают гибкость.

В настоящее время для создания костных имплантатов используются материалы следующих групп.

Натуральные полимеры

Инженерия костной ткани сконцентрирована на конструировании трехмерных скаффолдов, имитирующих остеогенный внеклеточный матрикс, способствующий формированию новых костей и при этом деградирующий после завершения образования новой кости. Натуральные полимеры обладают рядом привлекательных свойств для конструирования трехмерных каркасов, таких как биосовместимость и способность к биодеградации. Что важно, управление пористостью, зарядом и механической прочностью может осуществляться за счет изменения концентрации полимеров, условий полимеризации, либо за счет введения различных функциональных групп. На биоактивность можно также влиять путем добавления реагентов, протеинов, пептидов или клеток [S.-H.Lee and H.Shin. Matrices and scaffolds for delivery of bioactive molecules in bone and cartilage tissue engineering // Adv. Drug Deliv. Rev. 2007. V. 59 (4)-(5). Р. 339-359]. Наиболее широко изученными природными полимерами, используемыми в инженерии костей, являются: коллаген/желатин, хитозан, шелк, альгинат, гиалуроновая кислота и пептиды [C.E. Semino. Self-assembling peptides: from bio-inspired materials to bone regeneration // J. Dent. Res. 2008. V. 87 (7). Р. 606-616].

Коллаген: будучи одним из основных компонентов кости, коллаген (и желатин) - идеальный кандидат для проектирования трехмерных каркасов. По своей сути являясь биосовместимым и биодеградируемым, он стимулирует пролиферацию и дифференциацию клеток, как внеклеточный матрикс. Однако, обладает недостаточными механическими свойствами [B.A. Harley, J.H. Leung, E.C.C.M.Silva and L.J. Gibson. Mechanical characterization of collagen-glycosaminoglycan scaffolds // Acta Biomater. 2007. V. 3 (4). Р. 463-474].

Хитозан: среди природных полимеров хитозан - отличный материал для конструирования трехмерных каркасов. Он биосовместимый, биоразлагаемый, а также обладает антибактериальными, ранозаживляющими и биоадгезивными свойствами [A.R. Costa-Pinto, R.L. Reis and N.M. Neves. Scaffolds based bone tissue engineering: the role of chitosan // Tissue Eng. Part B. Rev. 2011. V. 17 (5). Р. 331-347].

Альгинат: также является привлекательным полимером для конструирования трехмерных каркасов, используемых для регенерации тканей. Он растворим в воде, образует гель при комнатной температуре в присутствии двухвалентных катионов, что позволяет формировать из альгината трехмерные гели [D., K.Barnhart, E.Saito, R.Vanderby, S.J. Hollister and W.L. Murphy. Controlled nucleation of hydroxyapatite on alginate scaffolds for stem cell-based bone tissue engineering // J. Biomed. Mater. Res. A. 2010. V. 95(1). Р. 222-234].

Гиалуроновая кислота тоже зарекомендовала себя в качестве потенциального каркасного материала. Это вещество широко распространено в природе, гидрофильно, неиммуногенно и, кроме того, было обнаружено в цитоплазме предшественников костных клеток [P.Pavasant, T.M. Shizari and C.B. Underhill. Distribution of hyaluronan in the epiphysial growth plate: turnover by CD44-expressing osteoprogenitor cells // J. Cell Sci. Pt 1. 1994. V. 107. P. 2669-2677]. Этот биополимер также используется в комбинации с другими материалами, факторами и препаратами для усиления остеогенного эффекта [M.S. Bae, D.H. Yang, J.B. Lee, D.N. Heo, Y.-D. Kwon, I.C. Youn, K.Choi, J.H. Hong, G.T. Kim, Y.S. Choi, E.H. Hwang and I.K. Kwon. Photo-cured hyaluronic acid-based hydrogels containing simvastatin as a bone tissue regeneration scaffold // Biomaterials. 2011. V. 32 (32). P. 8161-8171].

Пептидные гидрогели: самособирающиеся пептидные гидрогели - новый класс материалов, исследуемый в настоящее время для применения в тканевой инженерии. Их можно легко модифицировать с целью придания им определенной биоактивности, а их структурные единицы биосовместимы и биоразлагаемы. Такие гидрогели состоят из самокомплементарных амфифильных пептидов и, образуя гель, они обеспечивают трехмерную структуру, имеющую много сходств с внеклеточным матриксом [T.C. Holmes. Novel peptide-based biomaterial scaffolds for tissue engineering // Trends Biotechnol. 2002. V. 20 (1). Р. 16-21].

Шелк: фиброин шелка - природный биополимер, также нашедший широкое применение в тканевой инженерии. Этот материал обладает впечатляющими механическими свойствами, устойчивостью, биосовместимостью, морфологической гибкостью, при этом деградируется управляемым протеолизом. В настоящий момент считается одним из наиболее перспективных биополимеров для создания скаффолдов для регенеративной медицины [C.Vepari and D.L. Kaplan. Silk as a biomaterial // Prog. Polym. Sci. 2007. V. 32. Р. 991-1007].

Синтетические полимеры

Полиэфиры: алифатические полиэфиры, такие как полигликолевая кислота, полимолочная кислота, поликапролактон, - наиболее широко используются в тканевой инженерии. Продукты их деградации являются естественными метаболитами и легко выводятся из организма человека. Трехмерные матриксы из таких материалов можно получить разнообразными методиками, а изменение молярных соотношений этих полимеров способно повлиять на механические свойства и скорость деградации материала [D.-X.Wang, Y.He, L.Bi, Z.-H. Qu, J.-W. Zou, Z.Pan, J.-J. Fan, L.Chen, X.Dong, X.-N. Liu, G.-X. Pei and J.-D. Ding, Enhancing the bioactivity of Poly(lacticco-glycolic acid) scaffold with a nano-hydroxyapatite coating for the treatment of segmental bone defect in a rabbit model // Int. J. Nanomedicine. 2013. V. 8. P. 1855-1865]. Сополимеры: в целом, сополимеры весьма привлекательны для тканевой инженерии, ввиду того, что их физико-химическими свойствами легко управлять. Динамика формирования гелей, плотность сшивки, механические свойства, скорость деградации - всем этим можно управлять, меняя молекулярные массы компонентов, структуры блоков, способы сшивки и вводя легко разрушаемые связи [J.L. Drury and D.J. Mooney. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications // Biomaterials. 2003. V. 24 (24). P. 4337-4351].

Керамика.

В течение последних четырех десятилетий керамика использовалась в медицинских целях для реконструирования, замены поврежденных частей тела, а также для восстановления скелета. Такой материал получил название биокерамика; она подразделяется на биоинертную и биоактивную, последняя делится на поглощающую и непоглощающую [J.E. Lemons. Ceramics: past, present and future // Bone. 1996. V.19 (1 Suppl). P. 121S-128S].

Биостекло обладает такими достоинствами, как: контролируемая скорость деградации, прекрасная остеокондуктивность, биоактивность и способность доставлять клетки, однако уступает по механическим свойствам, таким как прочность и жесткость [Q.Fu, E.Saiz, M.N. Rahaman and A.P. Tomsia. Bioactive glass scaffolds for bone tissue engineering: state of the art and future perspectives // Mater. Sci. Eng. C. Mater. Biol. Appl. 2011. V. 31 (7). Р. 1245-1256].

Более перспективным является использование композитных матриксов, обладающих широкой функциональностью, например, поверхностной активностью и биоактивностью, механической прочностью и способностью доставлять препараты и факторы роста. Они обладают преимуществом по сравнению с другими материалами за счет эффекта синергии получаемых на выходе свойств [M.M. Erol, V., P.Newby, X.Chatzistavrou, J.A. Roether, L.Hupa and A.R. Boccaccini. Copper-releasing, boron-containing bioactive glass-based scaffolds coated with alginate for bone tissue engineering // Acta Biomater. 2012. V. 8 (2). Р. 792-801]. В общем случае, композитные каркасы получают, используя различные типы матрицы с дисперсной фазой, например, полимер/керамика, керамика/металл, полимер/металл [Y.Liu, J.Lim and S.-H. Teoh. Review: development of clinically relevant scaffolds for vascularised bone tissue engineering // Biotechnol. Adv. 2012. V.31 (5). Р. 688-705].

Биокерамика (гидроксиапатит, трифосфат кальция и биоактивные стекла) рассматривается как перспективный материал для тканевой инженерии кости. Поскольку указанные соединения присутствуют в костной ткани они характеризуются хорошей биосовместимостью и остеоиндуктивными свойствами. Но применение биокерамики в чистом виде ограничивается плохими механическими свойства, в частности, хрупкостью. Идеальный скаффолд для регенерации фрагментов костей должен имитировать структуру костной ткани. Способность костных имплантатов поддерживать регенерацию тканей определяется их способностью привлекать остеогенные клетки, такие как остеобласты, остеоциты, а также мезенхимальные стволовые клетки (МСК), стимулировать рост клеток на поверхности матрикса и стимулировать в процессе формирования кости дифференцировку МСК в преостеобласты. Биомедицинские свойства фиброина шелка, такие как биосовместимость, хорошая проницаемость для воды и кислорода, нетоксичность, морфологическая гибкость позволяет рассматривать его в качестве перспективного материала для изготовления имплантатов для тканевой инженерии. Различными исследовательскими группами показано, что трансплантаты на основе фиброина успешно поддерживают регенерацию кишечника, восстановление нервной и костной ткани [Vepari С, Kaplan DL. Prog Polym Sci. 2007]. Показано, что скаффолд из фиброина шелка усиливает образование микрокапилляров вокруг и внутри матрикса при восстановлении костной ткани [Unger et al. J. Biomaterials. 2010]. В исследованиях регенерации костной ткани показали важность минерализации фиброинового скаффолда или использование его в виде композитного материала с фосфатами кальция или с гидроксиапатитом кальция. Композитный скаффолд с трифосфатом кальция имеет улучшенную пористую структуру и значительно увеличивает экспрессию остеогенных маркеров (ALP, коллагена 1 типа и остеокальцина) по сравнению с чистым фиброином. В другом исследовании было показано, что минерализация скаффолдов гидроксиапатитом повышает остеокондуктивную активность и механические свойства скаффолдов [Bhumiratana et al., G. Biomaterials. 2011]. Сравнительный анализ регенерации с использованием децеллюляризованной губчатой кости и минерализованного фиброинового скаффолда показал, что через определенное время восстанавливается костная ткань, увеличивается количество трабекул и расстояния между ними. Данные показатели при этом соответствовали децилляризованной кости в скаффолдах с 3,1% и 4,6% гидроксиаппатита. Остеогенные свойства субстратов могут модулироваться за счет растворимых остеогенных факторов. Таким фактором является BMP (костный морфогенетический белок). Опыты на животных и широкое клиническое применение рекомбинантных BMP продемонстрировали их эффективность в качестве активного стимулятора остеогенеза [Reddi et al., Biochem. Soc. Trans. 2000]. В настоящее время общепризнанным технологическим принципом применения BMP является его соединение с биодеградируемыми носителями, в качестве которых могут быть использованы природные полимеры. Перспективным системами для направленной доставки биологически активных веществ, стимулирующих регенерацию являются контейнеры из биоразлагаемых полимеров бактериального происхождения - полиоксиалканоатов (ПОА). Наличие высокопродуктивного бактериального штамма-продуцента ПОА и оригинальных технологий и высокотехнологичного оборудования для инкапсулирования лекарственных веществ позволяет в промышленных масштабах создавать контейнеры для биостимуляторов остеогенеза (например, ростовой фактор ВМР-2) и лекарственных веществ.

Из уровня техники известен многофункциональный биодеградируемый композит, выполненный на основе сополимера лактида и гликолида, применяемый в частности для регенерации костной ткани (см. патент ЕР 1646410 B1, BIORETEC OY [FI]). Данный композит может быть произведен в форме кости, хряща или мягкой ткани. В состав композита может быть включен активный агент, стимулирующий регенерацию ткани. Достоинством данного продукта, присущем также предлагаемому изобретению, является возможность включения в имплантат активных агентов. Недостатком, как было указано выше, является использование полилактогликолида, ухудшающего биологические свойства полученного продукта.

Также в уровне техники выявлены биоразлагаемые костно-хрящевые имплантаты различной формы, различного размера, содержащие пористую верхнюю и нижнюю части, разделенные барьером, непроницаемым для оказывающих вредное воздействие на регенерацию хряща агентам (US 2009164014 A1, ARTIMPLANT АВ [SE]). Имплантат или его верхняя часть могут иметь симметричную форму или форму параллелепипеда и содержат упругий полимерный материал, такой, как полиуретан мочевина. Имплантаты также могут быть выполнены в виде листового материала, из которого можно вырезать объект заданной формы. Анализируя преимущество предлагаемого изобретения, стоит отметить, что фиброин шелка обладает лучшей биосовместимостью по сравнению с полиуретан мочевиной, а его минерализация приводит к повышению остеокондуктивной активности и механических свойств имплантатов.

Патент ЕА000309 В1, действующий на территории РФ, раскрывает способ получения рассасываемого материала для замещения кости, содержащий низкокристаллический гидроксиапатит (ЭТЕКС КОРПОРЕЙШН (US)). Недостатком данного способа является применение гидроксиапатита в чистом виде, что приводит к ухудшению механических свойств имплантата.

На территории Российской Федерации также действует патент на гель для регенерации костной ткани, включающий полиэтиленгликоль в виде геля и дистиллированную воду, отличающийся тем, что он дополнительно содержит композицию ортофосфатов кальция. Достоинством данного изобретения является возможность его доставки в костный дефект закрытым способом. К недостаткам можно отнести, что данный способ не позволяет создавать трансплантата необходимой формы.

Еще один патент раскрывает способ получения трехмерных матриц для тканеподобных структур из клеток животного происхождения (RU 2396342). Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения трехмерных матриц для тканеподобных структур из клеток животного происхождения. Данный способ предусматривает ковалентное связывание гистонов с поверхностью предварительно активированных биосовместимых полимерных микросфер из кристаллизованного декстрана. Затем проводят осаждение центрифугированием микросфер с ковалентно связанными гистонами. Полученный слой микросфер на поверхности субстрата с нанесенными на него клетками используют в качестве основы для получения тканеподобных клеточных структур. Представленное изобретение позволяет повысить надежность структуры и стабильность белкового слоя трехмерной матрицы, а также упростить и удешевить способ получения трехмерных матриц для тканеподобных структур из клеток животного происхождения, но обладает одним существенным недостатком, а именно, модификацию проводят природными катионными белками -гистонами из ткани тимуса телят, что повышает риск возникновения инфекционных заболеваний и/или иммунной реакции организма в ответ на трансплантацию и, как следствие, отторжение имплантата.

Еще одним примером носителя для осуществления восстановительных процессов после повреждения является следующее изобретение «Биокомпозит для обеспечения восстановительных процессов после повреждения у млекопитающего, способ его получения (варианты) и применения», RU 2519326. Предложенный биокомпозит содержит носитель, по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, содержащую гены, кодирующие VEGF и/или SDF-1, и клетки, обеспечивающие репаративную регенерацию. Предложены способы получения вышеуказанного биокомпозита и набор для его приготовления. Предложены также способ обеспечения заживления повреждения у млекопитающего и способ доставки нуклеиновой кислоты. Предложенная группа изобретений обеспечивает эффективную регенерацию тканей после повреждения у млекопитающего за счет использования трехкомпонентного биокомпозита, состоящего из носителя, по меньшей мере, одной нуклеиновой кислоты и клеток, обеспечивающих репаративную регенерацию. Данное изобретение обладает значительными преимуществами, но при этом есть явные недостатки, в том числе данный способ является более сложным, т.к. включает стадии, осуществляемые методами молекулярной биологии, скорее всего, имеет более высокую стоимость по сравнению заявляемым, а также хранение такой многокомпонентной сложной системы предполагает строгие специфические условия.

Наиболее близким аналогом предлагаемого изобретения является продукция компании INION OY (FI), включающая пластины, сетки, винты для фиксации костных отломков, а также синтетический заменитель костного трансплантата для заполнения костных дефектов, не требующих стабилизации костной структуры, выполненная из полилактогликолида, раскрытая в патентных документах WO 2004108180 А1, WO 2008099190 А2. Данные изделия стимулируют костные клетки на этапе использования их как временного каркаса. Высокая пористость обеспечивает приток жидкости, клеток и питательных веществ к месту регенерации. Основным недостатком полилактогликолида как материала является локальное закисление продуктами его распада - молочной и гликолевых кислот, вследствие чего развивается асептическое воспаление и замедляются процессы остеогенеза. Предлагаемое изобретение лишено вышеуказанного недостатка.

Раскрытие изобретения

Задачей группы изобретений является разработка способа получения минерализованных композитных микроскаффолдов.

Поставленная задача решается способом получения минерализованного композитного микроскаффолда, включающего следующие стадии:

а) подготовку водного раствора фиброина шелка, путем растворения фиброина в смеси CaCl₂:C₂H₅OH:Н₂О при молярном соотношении компонентов смеси, обеспечивающем растворение в ней фиброина, в течение 5-7 часов при нагревании до 70°С±5°С и последующего диализа против воды, доведение полученного раствора водой до концентрации 20-30 мг/мл, при этом фиброина берут в количестве 100-150 мг/мл смеси;

б) подготовку водного раствора желатина, путем растворения сухого желатина в воде из расчета 20-30 мг/мл;

в) формирование композитного скаффолда путем заморозки в течение 6-8 суток при температуре - 18-25°С смеси растворов, полученных на стадиях а) и б), смешанных в объемном соотношении 7:3 с добавлением 0,8-1,2 об% ДМСО и последующей разморозки и обработки 96% этанолом для формирования β - складчатой структуры;

г) получение композитных микроскаффолдов путем криоизмелчения скаффолда, полученного на стадии в, в 96% этаноле с использованием диспергатора и сортировки полученных фрагментов скаффолда с получением микроскаффолдов размером 100-250 мкм;

д) получение минерализованных композитных микроскаффолдов путем погружения полученных на этапе г) микроскаффолдов сначала в водный раствор, содержащий 684 мМ NaCl, 9,5 мМ CaCl₂, 3,5 мМ MgCl₂, 21 мМ NaHCO₃ и 4 мМ Na₂HPO₄, рН 4,0, на 6-14 часов и затем погружение в водный раствор, содержащий 684 мМ NaCl, 9,5 мМ CaCl₂, 0,7 мМ MgCl₂, 10,5 мМ NaHCO₃ и 4 мМ Na₂HPO₄, рН 4,0, на 1-3 суток с последующим высушиванием полученного продукта.

Предпочтительно смесь CaCl₂:C₂H₅OH:H₂O берут в молярном соотношении компонентов 1:2:8.

Предпочтительно для формирования β - складчатой структуры обработку размороженного скаффолда 96% этанолом осуществляют не менее 10 часов.

Предпочтительно когда сортировку полученных фрагментов скаффолда осуществляют посредством последовательного пропускания суспензии микроскаффолдов через сита с диаметром отверстий 500, 250 и 100 мкм.

Поставленная задача также решается применением минерализованного композитного микроскаффолда, полученного вышеуказанным способом для восстановления костной ткани.

Техническим результатом, достигаемым заявляемой группой изобретений является усиление стимуляции остеогенеза в отсутствие каких-либо индукторов при упрощении технологии. Кроме того, невысокая стоимость сырья, используемого для реализации способа, в сочетании с уникальными свойствами позволит создать доступный конкурентоспособный продукт и занять лидирующие позиции в данной области, т.к. изделия на основе фиброина превосходят по биосовместимости существующие на рынке имплантаты для регенерации костной ткани, которые представлены в основном ксеноматериалами и изделиями из полилактогликолидов. Кроме того, важным техническим результатом, достигаемым заявляемой группой изобретений, является усиление стимуляции остеогенеза в отсутствие каких-либо индукторов, а также индукция реорганизации актинового цитоскелета, необходимой для успешной адгезии и дифференцировки остеобластов.

Основным преимуществом шелка по сравнению с другими природными биополимерами являются его отличные механические свойства. Другие важные преимущества шелка как материала для регенерации тканей: хорошая биосовместимость, возможность получения водных растворов, способность к биологическому разложению, термостабильность, присутствие легкодоступных химических групп для функциональных модификаций, возможность газовой стерилизации и устойчивость к радиации [Yahong Zhao, et al. // J. Biomedical Science and Engineering, 2011, V. 4, Р. 397-402].

В предлагаемом изобретении может использоваться фиброин шелка каркасной нити пауков, фиброин шелка тутового шелкопряда и других видов шелкопрядов, фиброин рекомбинантного шелка, а также искусственные аналоги шелка.

Группа изобретений также относится к минерализованным композитным микроскаффолдам для лечения и/или регенерации костной ткани, полученным вышеуказанным способом.

Минерализованные композитные микроскаффолды по настоящему изобретению могут применяться для регенерации костной ткани, в частности ретикулофиброзной и пластинчатой.

Кость является специализированной соединительной тканью и состоит из кальцинированного внеклеточного матрикса, содержащего коллаген типа I и гидроксиапатит в качестве основных компонентов. Т.о., средство для лечения и/или регенерации костных тканей должно не только обеспечивать прочность, но и являться источником гидроксиапатита. В этом контексте минерализация композитных микроскаффолдов на основе фиброина шелка может обеспечить преимущества ввиду его высокой прочности, а также хорошей биосовместимости.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется чертежами.

На фиг. 1 показана структура поверхности неминерализованных (А, В) и минерализованных (Б, Г) композитных микроскаффолдов на основе фиброина и желатина. Изображения получены методом сканирующей электронной микроскопии.

На фиг. 2 представлена структура актинового цитоскелета и оценка уровня экспрессии щелочной фосфатазы. (А-В) - актиновый цитоскелет остеобластоподобных клеток MG-63 в 2D-условиях при культивировании на стекле (А) и 3D-условиях (Б-В) при культивировании на композитных микроскаффолдов (Б) и минерализованных композитных микроскаффолдов (В). Актин выявлен с помощью фаллоидина, меченного флуоресцеинизотиоционатом. Представлена горизонтальная проекция серии оптических срезов на глубину 75 мкм с интервалом 0.13 мкм. Объектив CFI S Fluor × 100/1.30 Oil.

На фиг. 3 показана гистограмма оценки уровня экспрессии щелочной фосфатазы. А - Уровень ALP (М±m, n=6), нормированный на количество клеток по сигналу после окрашивания желтой солью тетразолия (МТТ) при культивировании на минерализованных композитных микроскаффолдов "ФЖ+" и неминерализованных "ФЖ-" композитных микроскаффолдов. Б - Уровень щелочной фосфатазы на 4 сутки культивирования в 2D условиях (пластик) и 3D - на композитных микроскаффолдах. В качестве положительного контроля использован индуктор остеогенеза - дексаметазон.

Осуществление изобретения.

Получение водного раствора фиброина шелка осуществляли с использованием Нитей хирургических нестерильных 100% натуральный шелк, произведенных по ГОСТ 396-84 (Соответствие упаковки и маркировки ГОСТу 396-84, наличие сертификата соответствия №0302120, гарантии производителя, срок годности, условия хранения по ГОСТ 396-84, сертификат соответствия), растворяя навеску в смеси dH₂O, кальция хлористого (х.ч., о.с.ч., ГОСТ 450-77; Соответствие упаковки и маркировки ГОСТу 3885-73, наличие гарантии производителя, срок годности, внешний вид) и спирта этилового ректификованного 96% (ГОСТ 5962-67). Для получения композита готовили смесь водных растворов полимеров, используя раствор фиброина и водный раствор желатина (ГОСТу 23058-89). Формирование макроносителей для дальнейшего криоизмельчения с целью получения микроносителей проводили путем заморозки смеси водного раствора фиброина и водного раствора желатина с добавлением 1% ДМСО (х.ч., ТУ 2635-114-44493179-08). Криоизмельчение сформированных макроносителей выполняли с помощью диспергатора).

Все перечисленные выше процедуры осуществлялись с использованием следующего оборудования: Система очистки воды Elix 70, «Millipore» (Франция, система включает: картридж предварительной очистки Progard TL, картридж обратного осмоса, модуль Elix; производительность 70 л/час при температуре 7-30°С, рабочее давление 0,7-1,0 МПа, 220 В, 50 Гц, габариты (ШГВ): 662×441×733 мм, 56 кг); Резервуар для сбора очищенной воды SDS 200, «Millipore» (Франция, объем 200 л), Весы электронные RV 1502, «OHAUS» (США, (1500,00±0,01) г, 220 В, 50 Гц); Шкаф вытяжной 1200 ШВМкв (Россия, ООО «ЛаМО» макс. мощность подключаемых приборов 3,5 кВт, 220 В, габариты (ШГВ): 1280×750×2400 мм); Холодильник бытовой Атлант МХМ 1707-02 (Минск, Белоруссия, емкость камеры холодильника 175 л, температура от 0°С до 10°С, емкость мороз, камеры 115 л, температура минус 18 до минус 24°С, 220 В, 50 Гц); Диспергатор Bosch MSM 66150 ERGOMIXX (Словения, мощность 600 Вт, 220 В, погружной, турборежим, габариты (ВГШ): 210×620×550, вес: 1.15 кг); Центрифуга MiniSpin, «Eppindorf», (Германия, скорость вращения 13 400 об/мин, ротор F-45-12-11, 12×1,5/2 мл, 220 В, 70 Вт, габариты (ВГШ): 122×240×226 мм, 4,3 кг); Баня водяная BWT-U/20, Biosan (Латвия, ванна из н/ж стали объем 20 л. Диапазон регулирования температуры от 30°С до 100°С, точность поддержания температуры ±0,1°С, внутренняя циркуляция, внутр. размеры ванны: 300×320×140 мм, габариты: 345×550×290 мм, 11 кг, 220 В, 50 Гц, 1 кВт).

Для минерализации композитных микроскаффолдов использовали комерчески доступные реагенты степени чистоты х.ч. или о.с.ч. Минерализацию выполняли путем погружения полученных микроскаффолдов сначала в водный раствор, содержащий 684 мМ NaCl, 9,5 мМ CaCl₂, 3,5 мМ MgCl₂, 21 мМ NaHCO₃ и 4 мМ Na₂HPO₄, рН 4,0, на 6-14 часов и затем погружение в водный раствор, содержащий 684 мМ NaCl, 9,5 мМ CaCl₂, 0,7 мМ MgCl₂, 10,5 мМ NaHCO₃ и 4 мМ Na₂HPO₄, рН 4,0, на 1-3 суток с последующим высушиванием полученного продукта.

Ниже приведены примеры конкретного выполнения, которые не ограничивают сущность заявляемой группы изобретений.

Пример 1. Получение минерализованных композитных микроскаффолдов.

Фиброин растворяют в смеси CaCl₂:С₂Н₅ОН:H₂O (молярное соотношение 1:2:8) в течение 5 часов при температуре 70°С и диализуют против дистиллированной воды, проводя 4 смены диализа. Полученный раствор, содержащий фиброин и желатин, центрифугируют 10 минут при 13400 g, определяют концентрацию фиброина в супернатанте по ОД280, доводят концентрацию дистиллированной водой до 20 мг/мл и используют для формирования композитных скаффолдов. Желатин растворяют в дистиллированной воде из расчета 20 мг/мл и используют для формирования композитных скаффолдов. Смешивают полученные растворы фиброина и желатина в соотношении 7:3, добавляют 1% ДМСО, переносят в форму для формирования скаффолда и замораживают при -20°С 7 дней. Полученные композитные скаффолды в течение 120 минут обрабатывают 96%-ным этанолом.

Полученные композитные микроскаффолды замораживают в дистиллированной воде и криоизмельчают с использованием деспиргатора. Полученные фрагменты композитных микроскаффолдов сортируют путем последовательного пропускания через сита с диаметром отверстий 500 мкм, 250 мкм и 100 мкм. композитные микроскаффолды погружают на 6 часов или на ночь в раствор А, содержащий 684 мМ NaCl, 9,5 мМ CaCl₂, 3,5 мМ MgCl₂, 21 мМ NaHCO₃ и 4 мМ Na₂HPO₄, рН 4,0. Затем переносили в раствор Б следующего состава: 684 мМ NaCl, 9,5 мМ CaCl₂, 0,7 мМ MgCl₂, 10,5 мМ NaHCO₃ и 4 мМ Na₂HPO₄, рН 4,0, на 1 или 3 суток.

Содержание минерального компонента в составе экспериментальных образцов разрабатываемых изделий для ускорения заживления и регенерации костной ткани определяли по формуле, приведенной ниже:

Содержание минерального компонента, %=(масса минерализованных образцов -масса исходная/масса минерализованных образцов) × 100%

Полученные результаты представлены в таблице 1.

Представленные в Таблице 1 данные указывают на высокое содержание минерального компонента в составе полученного матрикса.

Полученные экспериментальные образцы подвергают испытаниям на стабильность в водных растворах, полученные результаты сравнивают с неминерализованными микроскаффолдами на основе фиброина шелка и желатина. Как минерализованные композитные микроскаффолды, так и неминерализованные микроскаффолда на основе фиброина шелка и желатина оставались стабильными при физиологических условиях в течение 3-х месяцев. Это является очень важным свойством изделий, так как разрушение и изменение базовой структуры и физических свойств имплантата в водной среде может сделать невозможным его применение для работы in vivo. Изделия не обладают какими-либо значительными гигроскопичными свойствами и не набухают, что позволяет им сохранить заданные при изготовлении параметры.

Пример 2. Исследование биологических свойств минерализованных композитных микроскаффолдов.

Данное исследование проведено на линии MG-63 остеобластоподобных клеток человека, способных дифференцироваться в остеобласты в ответ на воздействия индукторов остеогенеза. В качестве контроля использовали неминерализованные композитные микроскаффолды на основе фиброина шелка и желатина.

В первый день культивирования в 20-условиях клетки MG-63 представляли собой распластанные клетки с выраженными актиновыми стресс-фибриллами, вытянутыми на всю длину (рис. 2А). В отличие от этого, при культивировании на композитных микроскаффолдах (контроль) цитоскелет клеток MG-63 был реорганизован: наблюдалось образование кортикального и глобулярного актина, при этом формирование стресс-фибрилл было существенно снижено (рис. 2Б).

На минерализованных композитных микроскаффолдах реорганизация цитоскелета была более выражена по сравнению с контролем: стресс-фибриллы практически отсутствовали, актин был представлен в основном глобулярной формой (рис. 2В).

Пример 3. Определение уровня щелочной фосфатазы.

Фермент щелочная фосфатаза является маркером остеогенеза, и повышение ее уровня указывает на усиление остеогенеза.

Экспрессию в 2D- и 3D-условиях сравнили с экспрессией, индуцированной 10^-8 М дексаметазона, являющегося индуктором остеогенеза (рис. 2В). Культивирование в 3D-условиях на композитных микроскаффолдах способствовало повышению уровня щелочной фосфатазы, что указывает на способность фрагментов 3D скаффолдов к стимулированию остеогенеза даже в отсутствие индукторов. При индукции дексаметазоном различия в уровнях щелочной фосфатазы при культивировании в 2D- и 3D-условиях не были выявлены. Минерализация композитных микроскаффолдов усиливала их остеогенный эффект. Через 24 ч культивирования клеток MG-63 на минерализованных композитных микроскаффолдах уровень сигнала, отражающий активность щелочной фосфатазы, был почти в три раза выше, чем при их культивировании на неминерализованных композитных микроскаффолдах.

Таким образом, приведенный пример показывает преимущества предлагаемых минерализованных композитных микроскаффолдов над прототипом в отношении реорганизации актинового цитоскелета и усиления стимуляции остеогенеза в отсутствие каких-либо индукторов, что позволяет успешно применять их для регенерации костной ткани, в частности лечения травм, устранения дефектов, сращения переломов, ортопедической косметологии.

1. Способ получения минерализованного композитного микроскаффолда для регенерации костной ткани, включающий следующие стадии:

а) подготовку водного раствора фиброина шелка путем растворения фиброина в смеси CaCl₂:C₂H₅OH:H₂O при молярном соотношении компонентов 1:2:8 в течение 5-7 часов при нагревании до 70°C±5°C и последующего диализа против воды, доведение полученного раствора водой до концентрации 20-30 мг/мл, при этом фиброина берут в количестве 100-150 мг/мл смеси;

б) подготовку водного раствора желатина путем растворения сухого желатина в воде из расчета 20-30 мг/мл;

в) формирование композитного скаффолда путем заморозки в течение 6-8 суток при температуре –(18-25)°C смеси растворов, полученных на стадиях а) и б), смешанных в объемном соотношении 7:3 с добавлением 0,8-1,2 об.% ДМСО, и последующей разморозки и обработки 96% этанолом не менее 10 часов для формирования β-складчатой структуры;

г) получение композитных микроскаффолдов путем криоизмелчения скаффолда, полученного на стадии в), в 96% этаноле с использованием диспергатора и сортировки полученных фрагментов скаффолда с получением микроскаффолдов размером 100-250 мкм;

д) получение минерализованных композитных микроскаффолдов путем погружения полученных на этапе г) микроскаффолдов сначала в водный раствор, содержащий 684 мМ NaCl, 9,5 мМ CaCl₂, 3,5 мМ MgCl₂, 21 мМ NaHCO₃ и 4 мМ Na₂HPO₄, рН 4,0, на 6-14 часов и затем погружения в водный раствор, содержащий 684 мМ NaCl, 9,5 мМ CaCl₂, 0,7 мМ MgCl₂, 10,5 мМ NaHCO₃ и 4 мМ Na₂HPO₄, рН 4,0, на 1-3 суток с последующим высушиванием полученного продукта.

2. Применение минерализованного композитного микроскаффолда, полученного способом по п. 1, для восстановления костной ткани.