Системы и способы анализа кормов для животных
Изобретение относится к способу анализа корма для животных. Способ включает переваривание образца корма для животных in vitro с использованием по меньшей мере одного пищеварительного фермента с получением ферментированного корма для животных, содержащего по меньшей мере один остаточный компонент, исследование указанного ферментированного корма для животных методом спектроскопии в ближней инфракрасной области с получением спектральных данных; сравнение указанных спектральных данных с компьютерной моделью с получением прогностической концентрации указанного по меньшей мере одного остаточного компонента указанного ферментированного корма для животных. Изобретение позволяет оценить влияние ферментативной активности корма на энергетическую ценность, усваиваемую энергию и на усвояемость фосфора и сахара, а также определить наличие ферментной добавки в корме. 8 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 1 пр.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к системам и способам анализа кормов для животных. В частности, согласно настоящему изобретению предложены системы и способы для in vitro анализа влияния кормов для животных на обмен питательных веществ и энергии.
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка, поданная 11 февраля 2014 г. как международная заявка, испрашивает приоритет на основании заявки на патент США №61/787842, поданной 15 марта 2013 г., и заявки на патент США №14/109359, поданной 17 декабря 2013, содержание которых полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Большинство кормов для животных в первую очередь предназначены для удовлетворения по меньшей мере минимальной потребности животных в питательных веществах.
В течение последних 20-50 лет сельскохозяйственные животные (крупный рогатый скот, свиньи, домашняя птица, рыба и др.) отбирались по определенным признакам, таким как скорость роста, содержание жира и эффективность обмена веществ. Поэтому подход к изготовлению кормов для животных в течение последних 50 лет претерпел изменения. Теперь для питания животных не используются любые доступные корма или другие источники пищи. Напротив, питательная ценность рациона и стоимость кормов тщательно контролируются. Очень часто ведут наблюдение за животными на определенных рационах, определяя показатели продуктивности животных и качества продукции, при этом питательные компоненты корма подбирают таким образом, чтобы обеспечить его максимальную питательную ценность и оптимальные показатели продуктивности животных.
Существует необходимость анализа кормов на содержание питательных веществ с целью установить, удовлетворяет ли данный корм потребность конкретного вида животных в энергии и питательных веществах. Предпочтительные способы анализа должны быть эффективными, точными и экономичными.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к системам и способам анализа кормов для животных. В частности, согласно настоящему изобретению предложены системы и способы анализа in vitro влияния кормов для животных на обмен питательных веществ и энергии.
Например, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ анализа кормов для животных, включающий: а) переваривание образца in vitro с получением ферментированного (переваренного, усвоенного) животного корма; б) спектроскопический анализ ферментированного корма (например, методом спектроскопии в ближней инфракрасной области) с получением спектральных данных; и в) изучение полученных спектральных данных и идентификация пиков в спектрах соединений, содержащихся в корме. В некоторых вариантах реализации изобретения спектральные данные используют также для определения остаточных компонентов корма после переваривания in vitro и их количества. В некоторых вариантах реализации изобретения определение остаточных компонентов включает определение одного или нескольких из следующих компонентов: фосфор, белки, углеводы или энергетическая ценность корма. В некоторых вариантах реализации изобретения корм для животных содержит фермент (например, пищеварительный фермент или фермент, участвующий в переваривании корма). В качестве ферментов, помимо прочего, можно использовать протеазы, протеазы грибов, целлюлазы, ксиланазы, фитазы, кислая фосфатаза, бета-глюканаза, пектиназа или α-амилаза. В некоторых вариантах реализации изобретения идентификацию пиков используют для изучения влияния фермента на усвояемость и/или биодоступность корма. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения идентификация включает использование компьютера и программного обеспечения, при этом программное обеспечение использует полученную информацию о пиках для качественного и количественного определения соединений.
В еще одном варианте реализации настоящего изобретения предложена система, включающая: а) аппарат для переваривания, предназначенный для переваривания образцов корма in vitro с получением ферментированного корма; б) спектрометр, используемый для получения спектров ферментированного корма; и в) компьютер и программное обеспечение для идентификации и количественной оценки пиков полученного спектра. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения данное программное обеспечение используют для изучения влияния указанного фермента на усвояемость корма.
Дополнительные варианты реализации предложены в настоящей заявке.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1 представляет собой схему способов, описанных в вариантах реализации настоящего изобретения.
На Фиг. 2 показаны примеры спектров в ближней инфракрасной области.
На Фиг. 3 отражена точность иллюстративной модели на основе вариантов реализации настоящего изобретения.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Термин "масс./масс." в настоящей заявке обозначает количество указанного соединения в композиции в весовом соотношении. Например, если корм содержит 0,02% масс./масс. биологически активной добавки, это означает, что масса биологически активной добавки составляет 0,02% общей массы корма (например, 200 г биологически активной композиции, предложенной в настоящей заявке, в 907200 г корма для животных).
Термин "водоросль" или "водоросли" в настоящей заявке используется для обозначения любого одноклеточного или многоклеточного организма, культивируемого на средах, содержащих разбавленную, средней концентрации или концентрированную морскую воду, или обитающего в природных морских водах, и способного размножаться в условиях культивирования или ферментации.
Термин "мука из водорослей" в настоящей заявке относится к подготовке материала водорослей.
Термин "консервант" в настоящей заявке используется для обозначения соединения, которое продлевает срок хранения пищевых и непищевых продуктов, предотвращая или замедляя появление неприятного вкуса или запаха, изменение цвета, текстуры или внешнего вида и снижение питательной ценности или безопасности продукта.
Консервант необязательно должен оказывать необратимое летальное действие, приводящее к полному или частичному разрушению клеток микроорганизмов или ограничению их жизнеспособности. Такой необратимый эффект, иногда называемый "бактерицидным", оказывают стерилизаторы, дезинфицирующие средства, спорициды, противовирусные и противотуберкулезные средства. Напротив, консервант оказывает обратимое ингибирующее или бактериостатическое действие, так что при его удалении из корма микроорганизмы могут возобновить свою активность. Главное отличие консервантов от дезинфицирующих средств заключается в механизме воздействия (консерванты сдерживают рост микроорганизмов, не убивая их) и продолжительности воздействия (консерванты действуют в течение нескольких дней или месяцев, дезинфицирующие средства действуют в течение не более чем нескольких минут).
Термины "экстракт Aspergillus niger", "грибной экстракт", "экстракт продукта ферментации Aspergillus niger" и "экстракт продукта ферментации грибов" в настоящей заявке используются для обозначения продукта ферментации грибной культуры. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения для ферментации используют грибы рода Aspergillus. В некоторых вариантах реализации продукт ферментации грибов содержит по меньшей мере один фермент. В некоторых вариантах реализации ферментативная активность образца включает протеазную активность. Продукт ферментации грибов может также обладать другой ферментативной или неферментативной активностью, иметь другие свойства и содержать другие компоненты. Такие активности, свойства или компоненты включают, помимо прочего, целлюлозолитическую активность, вторичные метаболиты, антибиотическую активность, ростостимулирующую активность и способность стимулировать пищеварение, в частности, в желудочно-кишечном тракте сельскохозяйственных животных.
Термины "очищенный", "очищать", "очистка" в настоящей заявке относятся к удалению определенных компонентов из образца. Например, клеточные стенки дрожжей или экстракты клеточных стенок дрожжей очищают путем удаления компонентов, отличных от компонентов клеточных стенок дрожжей (например, плазматических мембран и/или внутриклеточных компонентов дрожжевых клеток); очистку также проводят путем удаления примесей или других агентов, отличных от клеточных стенок дрожжей. Удаление компонентов, отличных от компонентов клеточных стенок дрожжей, и/или примесей, отличных от компонентов клеточных стенок дрожжей, позволяет увеличить процент содержания клеточных стенок дрожжей или их компонентов в образце.
Термин "in vivo" в настоящей заявке используется для обозначения исследований и/или экспериментов, проводимых с использованием живых организмов, то есть непосредственно в тканях организма.
Термин "in vitro" в настоящей заявке используется для обозначения среды, искусственно созданной вне живого организма, и биологических процессов или реакций, в нормальных условиях протекающих в организме, но искусственно перенесенных в данную среду. В качестве сред in vitro используют, помимо прочего, пробирки и клеточные культуры.
Термин "аналит" в настоящей заявке используется для обозначения атома, молекулы, группы атомов и/или молекул, соединения или химического компонента. Аналит сам по себе не подлежит измерению; только его аспекты или свойства (физические, химические, биологические и др.) могут быть определены с использованием какого-либо аналитического метода, такого как, например, высокоэффективная жидкостная хроматография. Например, невозможно измерить "стул" (аналит-компонент) сам по себе, однако можно измерить его высоту, ширину и т.д.
Термин "биодоступность" в настоящей заявке используется для обозначения доли соединения или компонента, доступной для усвоения организмом и достигающей системного кровотока. При внутривенном введении соединения или компонента его биодоступность составляет 100%. Однако при введении другими способами (например, перорально) биодоступность ниже из-за неполного поглощения соединения или компонента и пресистемного метаболизма. В отношении питательных веществ термин "биодоступность" используют для обозначения скорости всасывания и степени усвоения вещества. Например, различные формы одного питательного вещества могут иметь различную биодоступность.
Термины "абсорбировать" и "всасывать" в настоящей заявке обозначают процесс, в ходе которого материал поглощает или всасывает какое-либо вещество. Например, термин "абсорбция" может относиться к всасыванию или ассимиляции веществ клетками или тканями и органами путем диффузии или осмоса (например, всасыванию питательных веществ пищеварительной системой или проникновению лекарственного средства в кровоток).
Термин "адсорбция" в настоящей заявке обозначает процесс, в ходе которого какое-либо вещество поглощается другим твердым или жидким веществом (связывающим агентом и/или адсорбентом) и/или аккумулируется на его поверхности (таким образом, образуя пленку молекул или атомов (адсорбат)).
Термин "переваривать" в настоящей заявке используется для обозначения процесса преобразования пищи, кормов или других органических соединений в усваиваемую форму; к их размягчению или разложению под действием тепла и влаги или химического воздействия.
Термин "пищеварительная система" в настоящей заявке обозначает систему, в которой протекает или может протекать процесс пищеварения (включая желудочно-кишечный тракт).
Термин "корма" в настоящей заявке используется для обозначения материала(ов), употребляемых животными в пищу и удовлетворяющих потребность в энергии и/или питательных веществах. Примерами кормов являются, помимо прочего, полнорационные корма, фураж, гранулированные корма, концентраты, премиксы, пищевые отходы, зерновые корма, дробина, меласса, пищевые волокна, грубые растительные корма, солома, сено, злаковые корма, ядра семян и зерен, листья, мука, гидролизаты и кормовые добавки.
Термины "кормовая добавка", "биологически активная добавка", "композиция биологически активной добавки" в настоящей заявке используются для обозначения кормового продукта, представляющего собой биологически активную или питательную добавку, включенную в рацион, например, путем добавления в корма. Примеры композиций биологически активных добавок описаны в настоящей заявке.
Термин "омега-3 жирные кислоты" в настоящей заявке относится к полиненасыщенным жирным кислотам, имеющим двойную связь между третьим и четвертым атомами углерода, считая от метилового конца цепи. Примерами омега-3 жирных кислот, помимо прочих, являются 5,8,11,14,17-эйкозапентаеновая кислота (ЭПК), 4,7,10,13,16,19-докозагексаеновая кислота (ДТК) и 7,10,13,16,19-докозапентаеновая кислота (ДПК).
Термин "животное" в настоящей заявке относится к организмам царства животных (Animalia). К данным организмам относятся, помимо прочего, сельскохозяйственные животные, одомашненные животные, домашние животные, морские, пресноводные животные и дикие животные.
Термин "токсичный" в настоящей заявке используется для обозначения любых неблагоприятных, повреждающих, вредных и других негативных воздействий на объекты, клетки или ткани по сравнению с состоянием данной клетки или ткани до начала введения или воздействия токсина/токсического вещества.
Термин "кислота" в настоящей заявке относится к любому химическому соединению, способному отдавать протон(ы) и/или присоединять электрон(ы). К кислотам, помимо прочего, относятся соляная, бромоводородная, серная, азотная, хлорная, фумаровая, малеиновая, фосфорная, гликолевая, молочная, салициловая, янтарная, п-толуолсульфоновая, винная, уксусная, лимонная, метансульфоновая, этансульфоновая, муравьиная, бензойная, малоновая, сульфоновая, нафталин-2-сульфоновая, бензолсульфоновая и другие кислоты. Другие кислоты, такие как, например, щавелевая кислота, не являются фармацевтически приемлемыми, однако могут использоваться для получения солей, служащих промежуточными продуктами реакций получения соединений, предложенных настоящим изобретением, и фармацевтически приемлемых солей присоединения кислот.
Термин "основание" в настоящей заявке используется для обозначения любого химического соединения, способного принимать протон(ы) и/или отдавать электрон(ы) или гидроксид-ионы. К основаниям, помимо прочего, относятся гидроксиды щелочных металлов (например, натрия), щелочноземельных металлов (например, магния), аммиак и соединения формулы NW4+, где W обозначает C1-4 алкил или другую подобную группу.
Термин "соль" в настоящей заявке относится к соединениям, получаемым из органических или неорганических кислот и оснований. К солям, помимо прочего, относятся ацетаты, адипинаты, альгинаты, аспарагинаты, бензоаты, бензолсульфонаты, бисульфаты (гидросульфаты), бутираты, цитраты, камфораты, камфорсульфонаты, циклопентанпропионаты, диглюконаты, додецил сульфаты, этансульфонаты, фумараты, флюкогептаноаты, глицерофосфаты, гемисульфаты, гептаноаты, гексаноаты, хлориды, бромиды, йодиды, 2-гидроксиэтансульфонаты, лактаты, малеаты, метансульфонаты, нафталин-2-сульфонаты, никотинаты, оксалаты, пальмоаты, пектинаты, персульфаты (пероксосульфаты), фенилпропионаты, пикраты, пивалаты, пропионаты, сукцинаты, тартраты, тиоцианаты, тозилаты, ундеканоаты и другие. Другими примерами солей являются анионы соединений, описанных в настоящей заявке, связанные с подходящими им катионами, такими как Na+, NH4+ и NW4+, где W обозначает C1-4 алкил) и другими подобными ионами.
Термин "антивспенивающий агент" в настоящей заявке используется для обозначения добавки, используемой для предотвращения образования пены или для удаления уже образовавшейся пены. Термин "антивспенивающий агент", или "антивспениватель", или "пеногаситель" относится к добавке, снижающей поверхностное натяжение раствора или среды или эмульсии или бульона в аппарате для ферментации за счет перемешивания и аэрации, таким образом, препятствуя образованию пены или разрушая ее. Чаще всего в качестве антивспенивающих агентов используют нерастворимые масла, диметилполисилоксаны и другие силиконы, некоторые спирты, такие как стеарилдеканол и октадеканол, сульфонаты, стеараты и гликоли.
Термин "клетка" в настоящей заявке относится к автономной самовоспроизводящейся единице, которая может представлять собой функционально независимую единицу жизни (в случае одноклеточных организмов, например, дрожжей) или быть составной частью многоклеточного организма (например, растения или животного), при этом выполняя какие-либо специальные функции, необходимые для поддержания жизнедеятельности организма в целом. Существует два различных типа клеток: прокариотические и эукариотические.
Термин "эукариоты" в настоящей заявке используется для обозначения организмов, клетки которых отличаются сложно организованной структурой компонентов, окруженных мембранами. "Эукариоты" следует отличать от "прокариот". Термин "прокариоты" в настоящей заявке относится к организмам, не имеющим ядра и других мембранных органелл. Термин "эукариоты" относится ко всем организмам, состоящим из клеток, обладающих типичными свойствами эукариотических клеток, такими как наличие оформленного ядра, окруженного ядерной мембраной и содержащего хромосомы, наличие мембранных органелл и другие признаки, характерные для эукариотических организмов. Таким образом, к эукариотам относятся, помимо прочего, грибы, простейшие и животные.
Термин "концентрация" в настоящей заявке используется для обозначения количества вещества в пределах определенной единицы пространства. Концентрацию обычно выражают через массу на единицу объема. Для получения разбавленного раствора необходимо добавить большее количество растворителя или уменьшить количество растворенного вещества (например, путем селективного испарения, распылительной сушки, лиофилизации; например, концентрированного экстракта клеточных стенок дрожжей или модифицированного экстракта клеточных стенок дрожжей). Напротив, для того, чтобы повысить концентрацию раствора, необходимо добавить большее количество растворимого вещества или уменьшить количество растворителя.
Термин "слой" в настоящей заявке используется для обозначения обычно горизонтального слоя осадка, образовавшегося в слое материала и представляющего собой напластованную часть или сегмент, полученные после разделения путем центрифугирования в соответствии с плотностными характеристиками материала.
Термин "сбор материала" в настоящей заявке относится к процессу получения и объединения материала (например, объединения веществ, полученных в ходе производства дрожжей).
Термин "сушка" в настоящей заявке используется для обозначения распылительной сушки, лиофилизации, атмосферной сушки, вакуумной сушки и других процессов, предназначенных для частичного или полного удаления жидкости из образца.
Термин "распылительная сушка" в настоящей заявке относится к широко применяемому способу сушки материалов, содержащих жидкие вещества, который включает использование нагретого газа для испарения жидкости с целью ее частичного или полного удаления из образца. Другими словами, данный метод включает распыление высушиваемого материала в поток сухого нагретого воздуха.
Термины "лиофилизация", "лиофильная сушка", и "сублимационная сушка" в настоящей заявке используются для обозначения способа удаления из материала растворителя путем замораживания с последующей сублимацией (возгонкой). Это достигается путем замораживания материала с доведением до эвтектической температуры и последующим нагреванием до температуры сублимации. Управление количеством подводимого тепла обеспечивает сушку замороженного материала без потерь на десублимацию. При практическом применении данного метода процесс ускоряют и контролируют путем создания условий пониженного давления.
Термин "сухой подвижный порошок" в настоящей заявке используется для обозначения сухого свободно текущего порошка, например, порошка, который не содержит комков, мешающих его пересыпанию из контейнера, пакета, сосуда и т.п.
Термин "измельчение" в настоящей заявке обозначает уменьшение размера частиц путем дробления, раздавливания или истирания.
Термин "промывка" в настоящей заявке относится к удалению или вымыванию (например, любым типом вещества (дистиллированной водой, буферным раствором или растворителем) или смесью веществ) примесей или других нежелательных растворенных веществ из образца (например, экстракт клеточных стенок дрожжей можно промыть для удаления компонентов клеточных стенок недрожжевых клеток).
Термин "фермент" в настоящей заявке используется для обозначения белка или белкового соединения, состоящего из цепочек с уникальной аминокислотной последовательностью, образующих определенную трехмерную структуру, определяющую уникальные свойства соединения, и оказывающего каталитическое действие или участвующего в определенных химических реакциях с превращением определенного набора реагентов (называемых субстратами) в определенные продукты.
Термины "пептид", "полипептид" и "белок" в настоящей заявке относятся к первичной структуре, т.е. последовательности аминокислот, соединенных ковалентной "пептидной связью". Пептиды обычно состоят из небольшого числа аминокислот, чаще всего из 5-20 аминокислот и короче, чем белки. Термин "полипептид" объединяет пептиды и белки. Пептиды, полипептиды и белки могут быть синтетическими, рекомбинантными или природными. Синтетические пептиды получают искусственным путем in vitro (т.е. они не образуются in vivo).
Термин "протеаза" в настоящей заявке используется для обозначения любого из множества ферментов, катализирующих гидролитическое расщепление белков с образованием пептидов или аминокислот (включая эндопептидазы и экзопептидазы).
Термин "лизис" в настоящей заявке используется для обозначения процесса разрушения клеточной мембраны и клеточной стенки дрожжей с последующим высвобождением внутриклеточных компонентов. В настоящей заявке под причинами лизиса понимаются физические, механические, ферментативные (включая автолиз и гидролиз) и осмотические (включая "спиртовой шок" и гидролиз) воздействия.
Термин "автолиз" в настоящей заявке относится к разрушению части или целой клетки под действием соединений, образованных самой клеткой, таких как, например, ферменты.
Термин "гидролиз" в настоящей заявке используется для обозначения процесса расщепления соединения на составные части при добавлении воды (например, расщепления полимеров до более простых звеньев (например, крахмала до глюкозы)).
Термин "образец" в настоящей заявке используется в широком смысле для обозначения пробы или культуры, полученной из любого источника, в том числе биологических образцов и проб из окружающей среды. К биологическим образцам относятся жидкости, твердые вещества, газы и ткани, получаемые из организмов животных (в том числе человека). Примерами биологических образцов являются препараты крови, такие как плазма, сыворотка и т.п. К пробам из окружающей среды относятся образцы, полученные из различных природных сред, такие как поверхностные пробы, образцы почвы, воды, кристаллов и промышленные пробы.
Термин "комплекс" в настоящей заявке используется для обозначения любого объекта, образованного путем объединения двух или более отдельных объектов (например, объединения двух или более одинаковых или различных объектов (например, одинаковых или различных химических соединений). Объединение может происходить посредством ковалентной или нековалентной связи (например, посредством ван-дер-ваальсовых сил, электростатического, ионного, гидрофобного, дипольного взаимодействия и/или водородной связи (например, уретановые, амидные, сложные эфирные связи и их комбинации)).
Термин "антиоксидант" в настоящей заявке используется для обозначения молекул, способных замедлить или предотвратить процесс окисления других молекул.
Термин "витамин E" в настоящей заявке используется в качестве общего названия для группы α-, β-, γ- и δ-токоферолов и соответствующих токотриенолов, которые являются жирорастворимыми витаминами и обладают антиоксидантными свойствами.
Термин "витамин C" в настоящей заявке относится к незаменимому питательному веществу для человека, многих видов приматов, некоторых других видов млекопитающих (в частности, морских свинок и рукокрылых), некоторых видов птиц и рыб.
Термин "аскорбат" в настоящей заявке используется для обозначения иона аскорбиновой кислоты, играющего важнейшую роль в ряде важнейших метаболических процессов в растительных и животных организмах.
Термины "консервирующий агент" и "консервант" в настоящей заявке относятся к веществам, сохраняющим неизменным состав какого-либо продукта и предотвращающим его порчу или распад.
Термины "сельскохозяйственные животные", "виды сельскохозяйственных животных", "домашний скот" и "промышленно используемые животные" в настоящей заявке относятся к видам одомашненных животных, используемых человеком в сельском хозяйстве или аквакультуре для получения продуктов питания или шерсти, или в качестве рабочей силы.
Термин "TAC" в настоящей заявке обозначает общую антиоксидантную активность (total antioxidant capacity). "TAC" можно отнести к спектру антиоксидантной активности в отношении различных активных кислород- и азотсодержащих свободных радикалов. Существует несколько различных типов аналитических систем для определения общей антиоксидантной активности, таких как, например, аналитические системы Brunswick Laboratories (например, системы для определения неферментативных антиоксидантов, проявляющих активность в отношении пероксид-радикала (ROO), гидроксильного радикала (HO), синглетного кислорода (1O2) и пероксинитрита (ONOO-).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к системам и способам анализа кормов для животных. В частности, настоящее изобретение относится к системам и способам анализа in vitro влияния кормов для животных на обмен питательных веществ и энергии.
Существующие способы анализа влияния кормов на обмен питательных веществ и энергии включают методики, требующие предварительной подготовки продолжительностью до двух недель и использования нескольких отдельных единиц оборудования. Некоторые способы включают анализ продуктов пищеварения in vivo с помощью спектроскопии в ближней инфракрасной области. Модели, полученные с использованием подобных методик, позволяют лишь предсказать свойства исходного корма и не отражают влияния отдельных ферментов на улучшение показателей пищеварения. Данные способы не предполагают ни использования животных для изучения процессов пищеварения in vitro, ни продолжительной имитации пищеварения в искусственной среде. Большинство методик применимы только для одного вида корма. В настоящее время не предложено эффективных методов анализа, применимых для множества кормов и ферментов.
Поэтому согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен эффективный способ, позволяющий оценить влияние ферментативной активности корма (например, корма для животных) на энергетическую ценность и усваиваемую энергию и на усвояемость фосфора и сахара, а также определить наличие ферментной добавки в корме. Системы и способы, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для анализа множества кормов и определения множества компонентов, а также оперативно модифицированы без предварительных испытаний in vivo.
Варианты реализации настоящего изобретения описаны с помощью Фиг. 1 и Примера 1, представленных ниже. Пример 1 описывает создание базы данных и/или модели, отражающей (например, количественно) спектральные данные. Например, в некоторых вариантах реализации предложены способы, включающие использование переваривания in vitro с последующим анализом методом спектроскопии в ближней инфракрасной области и с использованием аналитического анализа. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения методом аналитического анализа определяют содержание белка, фосфора, углеводов и остаточной энергетической ценности после завершения процесса переваривания in vitro. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения для определения энергетической ценности образца используют бомбовый калориметр, для определения концентрации белка используют анализатор азота, для определения концентрации фосфора используют методы определения минералов (например, масс-спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой). Спектроскопию в ближней инфракрасной области используют для сканирования образцов. Результаты анализа множества образцов (например, 5 или более, 10 или более, 20 или более, 50 или более и т.д.) используют для установления корреляций между пиками спектрограммы и определенными компонентами ферментированного корма. Затем данные корреляции используют в создания моделей, предназначенных для определения и анализа спектров в ближней инфракрасной области. Полученные модели или базы данных затем используют для качественного и количественного определения пиков спектрограмм без предварительного полного аналитического анализа каждого образца.
I. Анализ кормов
Таким образом, системы и способы, предложенные согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, включают следующие стадии: а) образец корма ферментируют с использованием модели in vitro; б) полученный сухой остаток анализируют с использованием спектроскопии (например, спектроскопии в ближней инфракрасной области); и в) проводят качественное и количественное определение полученных пиков с помощью описанной выше базы данных/модели. Системы и способы, описанные в настоящей заявке, позволяют быстро и точно анализировать корма для животных, не прибегая к подробному аналитическому анализу. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения результаты анализа используют с целью прогнозировать влияние определенного фермента (например, пищеварительного фермента) на усвояемость (переваримость) данного состава корма.
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения переваривание in vitro проводят таким образом, чтобы максимально приблизить данный процесс к процессу пищеварения в организме животного, при этом получая достоверные результаты в регулируемых лабораторных условиях. Такое моделирование пищеварения необходимо для полного понимания влияния анализируемого компонента (например, фермента).
Настоящее изобретение не ограничивается применением какого-либо конкретного способа переваривания in vitro. Различные методы переваривания in vitro имитируют процесс пищеварения посредством использования ферментов, тепла, кислот и инкубации. Согласно некоторым вариантам реализации переваривание in vitro включает стадию, имитирующую желудочное пищеварение, с последующей за ней стадией, имитирующей кишечное пищеварение. Согласно некоторым вариантам реализации на стадии желудочного пищеварения используют пепсин, а на стадии кишечного пищеварения используют панкреатин. Настоящее изобретение не ограничивается каким-либо конкретным временным отрезком, pH или пищеварительным ферментом. Условия реакции можно изменять в зависимости от корма и необходимого уровня пищеварения. Примеры способов переваривания in vitro описаны в патентах США №6750035, 8357408 и 8067238, Boisen, S. (1990), A Model for Feed Evaluation Based on In vitro Digestible Dry Matter and Protein, In: In vitro Digestion for Pigs and Poultry (M.F. Fuller, editor), Oxford University Press, Oxford, c. 136-139; содержание данных источников полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения для анализа ферментированного корма используют спектроскопию в ближней инфракрасной области. С помощью устройства для спектроскопии в ближней инфракрасной области анализируют компонентный состав корма и определяют количественное содержание компонентов. Такой анализ позволяет точно смоделировать влияние конкретного фермента в организме животного.
Таким образом, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения системы и способы, описанные в настоящей заявке, используют для того, чтобы определить, стимулирует или замедляет ли пищеварение в организме животного конкретная кормовая добавка. Эти данные позволяют определить составы кормов, обеспечивающие максимальную биодоступность.
Системы и способы, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для анализа многих различных кормов, а также для исследования влияния множества ферментов на процесс пищеварения. Анализ кормов описанными способами не требует больших временных затрат, что позволяет его пользователям (например, фермерам) получать данные, соответствующие реальным условиям.
Системы и способы, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для изучения влияния множества различных ферментов. Комбинированные корма могут содержать различные компоненты, полученные из различных видов сырья.
II. Корма
Настоящее изобретение может быть использовано для анализа любого количества корма для животных и не ограничивается применением для анализа какого-либо конкретного корма. Под кормом для животных понимается любой корм, используемый исключительно для кормления сельскохозяйственных животных (например, крупного рогатого скота, коз, овец, лошадей, домашней птицы, буйволов, альпак, лам, ослов, мулов, кроликов и свиней). К кормам для животных относятся сено, солома, силос, прессованные и гранулированные корма, масла, полнорационные корма, ферменты, пророщенные зерновые и бобовые культуры. В 2006 году объем мирового производства кормов для животных составил 635 миллионов тонн при среднегодовом темпе роста около 2%. Спорным является вопрос о возможности использования сельскохозяйственных земель для выращивание кормовых культур взамен пищевых. Некоторые кормовые растения, такие как, например, кукуруза, могут также служить и пищевыми культурами, в то время как другие, например, трава (сено), являются чисто кормовыми.
Помимо удовлетворения энергетических потребностей, корма для животных служат источником питательных веществ, обеспечивающих защиту организма от окислительного стресса. Например, корма для животных часто содержат антиоксиданты, необходимые для поддержания иммунитета, здоровья и репродуктивной функции. Животные с высоким потенциалом антиоксидантной защиты (например, питающиеся кормами с высоким содержанием антиоксидантов) лучше справляются со стрессом и полностью раскрывают свой потенциал.
Согласно некоторым вариантам реализации предложены корма, содержащие селен. Настоящее изобретение не ограничивается применением какого-либо конкретного источника или вида селенсодержащего компонента. Напротив, для реализации настоящего изобретения могут использоваться различные виды и источники селенсодержащих компонентов, в том числе органические источники селена (например, дрожжи, обогащенные селеном, селенометионин и т.п.), а также неорганические источники селена (например, селенсодержащие соли (например, селенит натрия, селенат натрия, селенит кобальта, селенат кобальта, селеновая кислота, селенистая кислота, бромид селена, хлорид селена, гексафторид селена, оксид селена, оксибромид селена, оксихлорид селена, оксифторид селена, сульфиды селена, тетрабромид селена, тетрахлорид селена, тетрафторид селена, и др.). В одном из предпочтительных вариантов реализации в качестве селенсодержащего компонента используют Сел-Плекс (Alltech, Nicholasville, KY).
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения корма для животных содержат омега-3 жирные кислоты. Настоящее изобретение не ограничивается применением какой-либо конкретной омега-3 жирной кислоты. Напротив, для приготовления композиций биологически активных добавок, описанных в настоящей заявке, могут быть использованы различные омега-3 жирные кислоты, в том числе α-линолевая кислота (ALA), стеаридоновая кислота (STD), эйкозатриеновая кислота (ЕТЕ), эйкозатетраеновая кислота (ЕТА), эйкозапентаеновая кислота (ЕРА), докозапентаеновая кислота (DPА), докозагексаеновая кислота (DHA), тетракозапентаеновая кислота и тетракозагексаеновая (низиновая) кислота. В одном из предпочтительных вариантов реализации в качестве омега-3 жирной кислоты используют докозагексаеновую кислоту. Настоящее изобретение также не ограничивается применением какого-либо конкретного источника омега-3 жирных кислот. Напротив, могут быть использованы различные источники омега-3 жирных кислот, в том числе водоросли (например, мука из водорослей), крилевый жир, или какой-либо другой источник, содержащий омега-3 жирные кислоты. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения омега-3 жирную кислоту получают из природных источников (например, растительных или животных клеток). В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения омега-3 жирную кислоту синтезируют в искусственных условиях.
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения корма для животных содержат муку из водорослей. В некоторых вариантах реализации муку из водорослей получают с использованием организмов, образующих жирные кислоты в больших количествах. В некоторых вариантах реализации муку из водорослей получают с использованием видов, продуцирующих в большом количестве докозагексаеновую кислоту (DHA). В некоторых вариантах реализации используемый вид водорослей относится к классу лабиринтуломицетов (Labyrinthulomycetes; лабиринтуловые, траустохитриевые). В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения используют один или несколько видов водорослей из следующих: Thraustochytrium sp., Thraustochytrium striatum, Thraustochytrium roseum, Thraustochytrium aureum, Schizochytrium limacinum, Crypthecodinium cohnii и Aurantiochytrium sp. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения корма для животных содержат антиоксиданты. В некоторых вариантах реализации в качестве антиоксиданта используют аскорбиновую кислоту. Настоящее изобретение не ограничивается применением какого-либо конкретного источника или типа аскорбиновой кислоты (например, сахарных кислот с антиоксидантными свойствами). В некоторых вариантах реализации в качестве аскорбиновой кислоты используют витамин С. В некоторых вариантах реализации используют аскорбат (например, аскорбиновую кислоту, минеральные соли аскорбиновой кислоты, плоды шиповника, ацеролу и др.).
Для реализации настоящего изобретения могут быть использованы любые смеси для кормов для животных, известные из уровня техники, такие как, например, мука из жмыха семян рапса, хлопчатника, сои и кукурузы, при этом наиболее предпочтительным является использование муки из соевого и кукурузного жмыха. Биологически активную добавку, описанную в настоящей заявке, добавляют в кормовые смеси, однако и другие дополнительные ингредиенты могут быть добавлены в кормовые смеси. Возможными вариантами таких ингредиентов, добавляемых в кормовые смеси, являются простые сахара и сложные углеводы, такие как водорастворимые и нерастворимые моносахариды, дисахариды и полисахариды. В кормовые смеси могут быть добавлены аминокислоты, такие как аргинин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан, валин, тирозин-этил-гидрохлорид, аланин, аспарагиновая кислота, глутамат натрия, глицин, пролин, серии, цистеин-этил-гидрохлорид, а также их аналоги и соли. В кормовые смеси могут быть дополнительно добавлены витамины, такие как тиамина гидрохлорид, рибофлавин, пиридоксина гидрохлорид, никотиновая кислота, никотинамид, инозитол, холин хлорид, пантотенат кальция, биотин, фолиевая кислота, витамины A, B, K, D, E, и другие подобные соединения. Также в кормовые смеси могут быть добавлены микро- и макроэлементы и белковые ингредиенты, в том числе белки, полученные из мясной или рыбной муки, яиц или яичного порошка, рыбных гидролизатов, концентрата сывороточного белка, масел (например, соевого масла) или кукурузного крахмала, кальций, неорганические фосфаты, сульфат меди, соли и карбонат кальция. В кормовые смеси могут быть также добавлены любые лекарственные средства, известные из уровня техники, такие как, например, антибиотики.
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения корм для животных содержит один или более из нижеследующих компонентов: люцерна посевная, ячмень, лядвенец рогатый, капуста (например, капуста огородная, капуста кудрявая (браунколь), рапс (канола), брюква, турнепс) клевер (гибридный, луговой, подземный, ползучий), злаковые травы (например, райграс высокий, овсяница, костер, свинорой пальчатый (пальчатник), трехзубка), луговые травы (образующие смешанный злаковый травостой), ежа, райграс (плевел), тимофеевка), кукуруза сахарная (маис), просо, овес, сорго, соя, деревья (срезанные верхушки, используемые как "древесное сено") и пшеница.
В композиции кормов, описанные в настоящей заявке, может быть также добавлена одна или более инертная примесь (например, если необходимо понизить калорийность биологически активной добавки, используемой в рационе). Например, композиции биологически активных добавок и/или кормовых или пищевых продуктов, в которые вносят данные биологически активные добавки, могут также содержать дополнительные ингредиенты, такие как, например, травы, витамины, минералы, усилители вкуса и запаха, красители, подсластители (сахарозаменители), ароматизаторы, инертные ингредиенты, дегидроэпиандростерон (ДГЭА), горец многоцветковый (Fo-Ti, или Ho Shu Wu - лекарственное растение, широко используемое в традиционной медицине Азии), ункария опушенная (также известная как кошачий коготь - древнее лекарственное растение), зеленый чай (источник полифенолов), инозитол, бурые водоросли, темно-красная водоросль, биофлавоноиды, мальтодекстрин, крапива, никотиновая кислота, никотинамид, розмарин, селен, источники кремния (оксид кремния, силикагель, хвощи, и др.), спирулина, цинк, и другие ингредиенты. Такие дополнительные ингредиенты могут быть получены из природных источников или синтезированы в концентрированном виде.
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения биологически активную добавку смешивают и/или комбинируют с другими пищевыми или кормовыми продуктами (например, для получения животного корма), такими как, например, трехосновный фосфат или ацетат кальция, двухосновный фосфат калия, сульфат или оксид магния, пищевая соль (хлорид натрия), хлорид или ацетат калия, ортофосфат железа, никотинамид, сульфат или оксид цинка, пантотенат кальция, глюконат меди, рибофлавин, бета-каротин, пиридоксин гидрохлорид, тиамин мононитрат, фолиевая кислота, биотин, хлорид или пиколинат хрома, йодид калия, селенат натрия, молибдат натрия, филлохинон, витамин D3, цианокобаламин, селенит натрия, сульфат меди, витамин A, инозитол. Необходимые дозы витаминов и минералов можно установить, например, используя рекомендуемые суточные нормы потребления.
В других вариантах реализации настоящего изобретения биологически активные добавки или другие пищевые или кормовые продукты, с которыми смешивают и/или комбинируют данные биологически активные добавки (например, для получения животного корма), могут включать один или несколько пищевых ароматизаторов, таких как ацетальдегид (этаналь), ацетоин (ацетилметилкарбинол), анетол (парапропенил анизол), бензальдегид (бензойный альдегид), n-масляная (бутановая) кислота, д- или l-карвон (карвол), циннамаль (коричный альдегид), цитраль (2,6-диметил-2,6-октадиеналь, гераниаль или нераль), деканаль (дециловый альдегид, каприновый альдегид, альдегид C 10), этилацетат, этилбутират, этиловый эфир 3-метил-3-фенил-глицидовой кислоты (этилметилфенилглицидат, земляничный эфир, альдегид C 16), этилванилин, гераниол (3,7-диметил-2,6-октадиен-1-ол и 3,7-диметил-3,6-октадиен-1-ол), геранилацетат (гераниол ацетат), лимонен (D, L и DL-изомеры), линаоол (3,7-диметил-1,6-октадиен-3-ол), линалилацетат (бергамол), метилантранилат (метил-2-аминобензоат), пиперональ (3,4-метилендиоксибензальдегид, гелиотропин), ванилин, люцерна посевная (Medicago sativa L.), ямайский перец (Pimento officinalis), абельмош мускатный (Hibiscus abelmoschus), дягиль лекарственный (Angelica archangelica), ангостуровое дерево (Galipea officinalis), анис (Pimpinella anisum), бадьян настоящий, или анис звездчатый (Illicium verum), мелисса лекарственная (Melissa officinalis), базилик (Ocimum basilicum), лавр (Laurus nobilis), календула (Calendula officinalis), (Anthemis nobilis), кайенский перец (Capsicum frutescens), тмин (Carum carvi), кардамон (Elettaria cardamomum), кассия, или коричник китайский (Cinnamomum cassia), кайенский перец (Capsicum frutescens), сельдерей (Apium graveolens), кервель (Anthriscus cerefolium), шнитт-лук (Allium schoenoprasum), кориандр (Coriandrum sativum), кумин (Cuminum cyminum), бузина канадская (Sambucus canadensis), фенхель (Foeniculum vulgare), пажитник сенной, или пажитник греческий (Trigonella foenum graecum), имбирь (Zingiber officinale), шандра обыкновенная (Marrubium vulgare), хрен (Armoracia lapathifolia), иссоп лекарственный (Hyssopus officinalis), лаванда (Lavandula officinalis), мускатник душистый, или мускатный орех (Myristica fragrans), майоран (Majorana hortensis), горчица (Brassica nigra, Brassica juncea, Brassica hirta), мускатный орех (Myristica fragrans), овощной перец (Capsicum annuum), черный перец (Piper nigrum), мята перечная (Mentha piperita), мак опийный (Papayer somniferum), розмарин (Rosmarinus officinalis), шафран (Crocus sativus), шалфей (Salvia officinalis), чабер (Satureia hortensis, Satureia montana), кунжут (Sesamum indicum), мята колосистая (Mentha spicata), эстрагон (Artemisia dracunculus), тимьян (Thymus vulgaris, Thymus serpyllum), куркума длинная (Curcuma longa), ваниль (Vanilla planifolia), куркума цедоария (Curcuma zedoaria), сахароза, глюкоза, сахарин, сорбит, маннит, аспартам. Другие подходящие ароматизаторы описаны в таких источниках, как Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing, c. 1288-1300 (1990), и Furia and Pellanca, Fenaroli's Handbook of Flavor Ingredients, The Chemical Rubber Company, Cleveland, Ohio, (1971), которые известны специалистам в данной области техники.
В других вариантах реализации композиции содержат по меньшей мере один синтетический или натуральный пищевой краситель (например, экстракт аннато, астаксантин, порошок свеклы, синий ультрамарин, кантаксантин, карамель, каротеналь, бета-каротин, кармин, обжаренную муку из семян хлопчатника, глюконат железа, лактат железа, окрашенный экстракт винограда, экстракт кожуры винограда, оксид железа, фруктовый сок, овощной сок, муку из высушенных бархатцев, масло из семян моркови, масло зародышей кукурузы, паприку, экстракт паприки, рибофлавин, шафран, куркума и экстракт куркумы).
В других вариантах реализации композиции содержат по меньшей мере одну фитодобавку (например, изофлавоноилы сои, олигомерные проантоцианидины, индол-3-карбинол, сульфорафан, волокнистые лиганды, фитостеролы, феруловую кислоту, антоцианозиды, тритерпены, омега-3- и омега-6-жирные кислоты, жирные кислоты с сопряженными двойными связями, такие как сопряженная линолевая кислота и сопряженная леноленовая кислота, полиацетилен, хиноны, терпены, катехины, галлаты и кверцетин). К источникам фитодобавок относятся, помимо прочего, соевый лецитин, изофлавоны сои, зародыши коричневого риса, маточное молочко, прополис, сухой концентрат из ягод ацеролы, японский зеленый чай, экстракт виноградных косточек, экстракт кожица винограда, морковный сок, черника, мука из льняного семени, перга, гинкго билоба, масло энотеры, клевер луговой, корень лопуха, одуванчик, петрушка, плоды шиповника, расторопша пятнистая, имбирь, элеутерококк колючий, розмарин, куркумин, чеснок, ликопин, экстракт семян грейпфрута, шпинат и брокколи.
В других вариантах реализации композиции содержат по меньшей мере один витамин (например, витамин A, тиамин (B1), рибофлавин (B2), пиридоксин (B6), цианокобаламин (B12), биотин, ретиноевую кислоту (витамин D), витамин E, фолиевую кислоту и другие фолаты, витамин K, никотиновая кислота или пантотеновую кислоту). В некоторых вариантах реализации частицы соединений (компоненты) содержат по меньшей мере один минерал (например, натрий, калий, магний, кальций, фосфор, хлор, железо, цинк, марганец, фтор, медь, молибден, хром, или йод). В одном из наиболее предпочтительных вариантов реализации дозировка множества компонентов, в том числе витаминов и минералов, соответствует рекомендованной суточной норме потребления по данным министерства сельского хозяйства США. В других вариантах реализации частицы (компоненты) содержат по меньшей мере одну аминокислотную добавку, содержащую по меньшей мере одну аминокислоту (например, l-карнитин или триптофан).
В некоторых вариантах реализации композиции кормов содержат ферментные добавки. Ферментные добавки повышают усвояемость содержащихся в корме питательных веществ растительного происхождения. Моногастричные животные (имеющие однокамерный желудок; например, свиньи, домашняя птица) не имеют собственных ферментов для расщепления определенных соединений, таких как, например, некрахмальные полисахариды (NSP) и фитаты. Поэтому часть корма обычно не переваривается. Непереваренные компоненты проходят через кишечный тракт неусвоенными, таким образом, часть питательной ценности корма теряется; кроме того, непереваренные остатки корма создают дополнительную нагрузку на окружающую среду, что особенно важно в условиях ограниченных пространственных ресурсов. Использование ферментных добавок позволяет решить эту проблему и повысить степень усвоения питательных веществ. Примерами ферментов, которые могут быть использованы в качестве добавок, являются протеазы, протеазы грибов, целлюлазы, ксиланазы, фитазы, фосфатазы, бета-глюканаза, пектиназа и альфа-амилаза. Ферменты могут быть использованы в очищенной, частично очищенной или неочищенной форме. Ферменты могут быть получены из природных источников (например, ферменты грибов), синтетическим путем или из культур in vitro (например, рекомбинантные ферменты). В некоторых вариантах реализации используется протеаза (например, пепсин). В некоторых вариантах реализации используются ферменты и смеси ферментов промышленного производства (например, Allzyme SSF, Alltech, Nicholasville, KY).
В некоторых вариантах реализации в кормовые продукты, такие как композиции кормов для животных, могут быть добавлены антиоксиданты. Для предотвращения окисления могут быть использованы природные антиоксиданты, такие как бета-каротин, витамин C, или синтетические антиоксиданты, такие как бутилгидрокситолуол, бутилгидроксианизол, трет-бутилгидрохинон, пропилгаллат или этоксихин. Также могут быть добавлены соединения, действующие синергично с антиоксидантами, такие как, например, аскорбиновая кислота, лимонная кислота и фосфорная кислота. Количество антиоксидантов, которое необходимо добавить таким образом, зависит от ряда факторов, таких как состав продукта, условия транспортировки, способы упаковки и необходимый срок годности.
Композиции кормов, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для кормления любого животного. Примерами таких животных являются, помимо прочего, виды птиц, бычьих, свиней, лошадей, овец и коз, а также рыб, моллюсков, верблюдовых, кошачьих, псовых и грызунов. Таким образом, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения кормовой продукт, содержащий биологически активную добавку, описанную в настоящей заявке, используют для кормления любого моногастричного животного (т.е., животного, желудок которого имеют од ну камеру), к которым относятся,помимо прочего, сельскохозяйственные животные, такие как, например, различные виды свиней (например, боровы (т.е. кастрированные самцы), подсвинки (т.е. молодые самки до первой случки) и любые другие возрастные группы), куры (например, любые виды или типы кур, такие как бройлеры, гибридные виды и др.), индейки (птенцы (т.е. животные возрастом несколько недель после вылупления) и взрослые птицы), утки, фазаны, гуси, перепела, крупный рогатый скот, овцы, козы, лабораторные грызуны (крысы, мыши, хомячки и песчанки), пушные звери, такие как норка и лиса, виды животных, содержащихся в зоопарках, такие как обезьяны и гоминиды, а также любые другие виды птиц, морских или пресноводных животных, животных, содержащихся в неволе (например, в зоопарках) или домашних животных (например, собаки и кошки).
III. Системы
Согласно некоторым вариантам реализации предложены системы для анализа кормов для животных. В некоторых вариантах реализации данные системы содержат компоненты, применимые, необходимые или достаточные для проведения переваривания in vitro, получения и анализа спектральных данных с целью определить влияние кормовых добавок на переваривание и усвоение животного корма.
Например, в некоторых вариантах реализации системы включают реагенты и лабораторную посуду для проведения переваривания in vitro (например, ферменты, кислоту, компоненты для контроля температуры, сосуды для проведения реакций и др.). В некоторых вариантах реализации системы включают устройства и расходные материалы для спектроскопии в ближней инфракрасной области. В некоторых вариантах реализации системы включают компьютерные системы и программное обеспечение для анализа спектральных данных.
Согласно настоящему изобретению также предложены варианты реализации, связанные с применением компьютеров. В частности, согласно некоторым вариантам реализации предложены компьютерные программы для анализа и сравнения спектрограмм в ближней инфракрасной области, например, с библиотеками спектров, содержащими спектрограммы отдельных аналитов (например, с помощью способов, описанных в настоящей заявке).
Способы и системы, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы различным образом. В одном из вариантов реализации предложенные способы включают использование средств связи таких как, например, интернет. Некоторые варианты реализации настоящего изобретения описаны ниже. Следует понимать, что настоящее изобретение может быть реализовано с использованием различных видов аппаратного и программного обеспечения, встроенного программного обеспечения, процессоров, распределенных серверов (например, используемых для "облачных" вычислений), или их комбинаций. Применение способов и систем, описанных в настоящей заявке, может включать использование комбинации аппаратного и программного обеспечения. Программное обеспечение может быть представлено прикладными программами, хранящимися на внешних носителях, или отдельными программами, являющимися частью встроенного программного обеспечения на уровне пользователя (например, в виде апплета) или на уровне ревьюера (проверяющего) кода, причем ревьюер может быть расположен удаленно (например, на уровне провайдера услуг).
Например, во время или после ввода данных пользователем часть процесса обработки данных может происходить в операционной среде пользователя. Например, операционная среда пользователя может включать программы для создания определенных тестовых кодов для обозначения платформ и диагностических тестов или тестов для носителей, или и того, и другого; а также для обработки данных с использованием определенных флагов и/или создания конфигураций флагов и с передачей ответов в обработанной или частично обработанной форме в операционную среду ревьюера в форме тестовых кодов и конфигураций флагов, на основе которых в операционной среде ревьюера с использованием одного или нескольких алгоритмов выдается конечный результат и/или создается отчет.
Прикладная программа для выполнения алгоритмов, описанных в настоящей заявке, может быть загружена и запущена на устройстве с любой подходящей архитектурой. В целом, такое устройство включает компьютерную платформу, оснащенную аппаратным обеспечением, таким как центральный процессор (ЦП), оперативное запоминающее устройство (ОЗУ) и интерфейс(ы) ввода-вывода (I/O). Компьютерная платформа также включает операционную систему и коды микрокоманд. Различные процессы и функции, описанные в настоящей заявке, могут быть частью кода микрокоманд или частью прикладных программ (или их комбинацией), выполняющихся операционной системой. Кроме того, к компьютерной платформе могут быть подсоединены различные периферийные устройства, такие как, например, дополнительные внешние запоминающие устройства и устройства печати.
Как и любая компьютерная система, данная система обычно включает блок процессора. Блок процессора принимает данные, которые включают данные анализа (например, спектрограммы в ближней инфракрасной области) и готовые базы данных (например, экспериментально полученные спектральные данные множества образцов). Данные, полученные процессором, могут храниться в какой-либо базе данных (по меньшей мере временно) для последующего анализа.
Введенные или выводимые данные или их часть могут быть переданы в электронном виде; некоторые выводимые данные (например, отчеты) могут быть отправлены как в электронном виде, так и посредством телефонной связи (например, посредством факсимильной связи, т.е. с помощью устройства факсимильной связи, такого как факс-аппарат). Примерами устройств вывода данных являются дисплей, принтер, устройство факсимильной связи и др. Для передачи данных в электронном виде могут быть использованы электронная почта, интерактивное телевидение и др. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения вводимые данные или их часть и/или выводимые данные или их часть (например, данные качественного или количественного определения пиков) хранятся на сервере, где возможен доступ к этим данным, например, ограниченный доступ. При необходимости полученные данные могут быть доступны или переданы специалистам.
Система, необходимая для применения способов, описанных в настоящей заявке, обычно включает по меньшей мере один блок процессора (например, если способ применяют полностью с использованием одного устройства) или по меньшей мере два процессора, подключенных к общей сети (например, если спектральные данные вводит пользователь, после чего введенные данные передаются для анализа (например, для определения и оценки пиков спектрограмм) на другой процессор, расположенный удаленно, при чем первый и второй процессоры связаны общей сетью, например, через интрасеть или интернет). Система может также включать компонент(ы) пользовательского интерфейса для ввода данных и компоненты для проверки данных и создания отчетов (для ревьюера). Система может также дополнительно включать компонент(ы) сервера, базу(ы) данных для хранения различных данных (например, база данных для элементов отчетов или реляционная база данных (РБД), которая может включать данные, вводимые пользователем и выводимые данные). Примерами процессоров, которые могут быть использованы, являются наиболее распространенные процессоры для настольных компьютеров (например, IBM, Dell, Macintosh), портативных компьютеров, мейнфреймов, миникомпьютеров, портативных электронных устройств (например, планшетных компьютеров или смартфонов) или других компьютерных устройств.
В качестве устройств ввода могут быть использованы отдельные независимые персональные компьютеры, обладающие необходимыми компонентами и мощностью для работы приложений. Компоненты пользовательской среды обычно совместимы с любой операционной системой и включают элемент связи (например, модем Или другое устройство для связи компьютера с сетью), одно или несколько устройств ввода (например, клавиатуру, мышь, клавишную панель или другое устройство для ввода данных или команд), элемент памяти (например, жесткий диск или другой накопитель данных, доступный для чтения и записи) и устройство отображения (например, монитор, телевизионный экран, жидкокристаллический дисплей, светодиодный экран или другое устройство отображения, передающее информацию пользователю). Пользователь вводит входные сигналы для процессора с помощью устройства для ввода. Обычно пользовательский интерфейс представлен графическим интерфейсом пользователя (ГИП), разработанным для приложений веб-браузера.
Компонент(ы) сервера могут включать персональный компьютер, миникомпьютер или мейнфрейм (центральный процессор), или данные могут распределены по нескольким серверам (например, как в случае использования облачных приложений/сервисов). Компонент(ы) сервера предназначены для управления данными, обмена информацией между пользователями, управления сетями и обеспечения безопасности. Приложение и любые используемые базы данных могут храниться на одном или нескольких различных серверах. Настоящее изобретения также включает другие способы организации данных на уровне пользователя и сервер(ов), в том числе обработку данных на одном устройстве, например, мейнфрейме, использование набора устройств и другие возможные конфигурации. В целом, устройства пользователя и сервера(ов) функционируют совместно для реализации настоящего изобретения.
Используемая база(ы) данных обычно связана(ы) с компонентом сервера баз данных; для хранения баз данных может быть использован любой накопитель. Например, база данных может храниться на любом магнитном или оптическом запоминающем устройстве (например, CDROM, внутренний жесткий диск, ленточный накопитель). Базы данных могут быть локально подключены к компоненту сервера или расположены удаленно (с доступом через сеть, модем и т.п.). В качестве базы данных в описанных системах и способах может быть использована реляционная база данных. Реляционные базы данных отличаются, тем что данные в них организованы и доступны по отношению между элементами данных. Реляционная база данных обычно состоит из множества таблиц (объектов). Строки таблиц содержат записи (совокупности данных по отдельным элементам), столбцы представляют собой поля (содержащие атрибуты записей). В упрощенном виде, реляционная база данных представляет собой набор элементов данных, связанных между собой по меньшей мере одним общим полем.
При необходимости могут быть использованы дополнительные рабочие станции, снабженные компьютерами и принтерами, для ввода данных и, в некоторых вариантах реализации, для создания соответствующих отчетов. При необходимости для приложения может быть создан ярлык (например, на рабочем столе компьютера) для удобства ввода, передачи и анализа данных, создания отчетов и т.п.
ПРИМЕРЫ
Следующие примеры предлагаются для более полного понимания некоторых предпочтительных вариантов реализации и аспектов настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие настоящее изобретение.
Пример 1
Переваривание in vitro
Модель для изучения in vitro выделения фосфатов и сахара у свиней
Источник: Boisen S., A multienzyme assay for pigs, Chapter 10, A Model for Feed Evaluation Based on In vitro Digestible Dry Matter and Protein, In vitro Digestion for Pig and Poultry, 1990, M.F. Fuller
Реагенты:
A. 0,2 M HCl
B. 4 M HCl
C. 2 M HCl
D. 0,6 M NaOH: растворить 24 г гидроксила натрия (Fisher S318) в 900 мл деионизированной воды, затем довести до объема 1 л.
E. Пепсин (Sigma, Р7012): хранить при -20°C
F. Панкреатин (Sigma, Р3292): хранить при -20°C
G. 15% трихлоруксусная кислота (ТХУК): разбавить 15 г трихлоруксусной кислоты (Sigma, Т6399) деионизированной водой до объема 100 мл
H. 0,1 М ацетатный буфер, pH 6,0
a. Растворить 8,203 г ацетата натрия (Fisher, S210) в 900 мл деионизированной воды
b. Добавляя 1М HCL, довести до pH 6,0, затем довести до объема 1 л деионизированной водой
I. 0,2 М ацетатный буфер, pH 6,8
a) Растворить 16,406 г ацетата натрия (Fisher, S210) в 900 мл деионизированной воды
б) Довести до pH 6,8, затем довести до объема 1 л деионизированной водой
J. Раствор для проведения калориметрического анализа (приготовить непосредственно перед использованием)
a. 3 части серной кислоты
i. В мерную колбу поместить 90 мл деионизированной воды, добавить 5,52 мл концентрированной (18,1М) серной кислоты (S6014), довести до объема 100 мл
1. К 60 мл деионизированной воды добавить 40 мл 5 Н раствора серной кислоты
b. 1 часть 2,5% (масс./об.) молибдата аммония
i. Растворить 2,65 г аммония молибдата тетрагидрата (Sigma, А7302) в 80 мл деионизированной воды, довести до объема 100 мл
c. 1 часть 10%) (масс./об.) аскорбиновой кислоты
i. Растворить 10 г аскорбиновой кислоты (Fisher, ВР351) в 80 мл деионизированной воды, довести до объема 100 мл
K. Раствор 3,5-динитросалициловой кислоты (DNS): хранить в посуде из темного стекла не более 6 месяцев
a. Растворить 10 г динитросалициловой кислоты (Sigma, D0550) в 400 мл деионизированной воды
b. Растворить 16 г гидроксида натрия (Fisher, S318) в 150 мл деионизированной воды
c. При постоянном перемешивании медленно добавить раствора NaOH к раствору динитросалициловой кислоты
d. Выдерживать на водяной бане при температуре 50°C до полного растворения твердых компонентов
e. При постоянном помешивании добавить 300 г калия-натрия тартрата тетрагидрата (Sigma, 217255)
f. Довести до объема 1 л деионизированной водой
L. Стандартные растворы декстрозы: разбавить 1 г декстрозы (Fisher, D16) деионизированной водой до объема 100 мл. Из данного исходного раствора приготовить растворы декстрозы следующих концентраций:
M. Раствор 9 мМ фосфата калия (KH2PO4) - для калибровки
a. Растворить 1,22 г KH2PO4 (Fisher Sp361) в 800 мл деионизированной воды, затем довести до объема 1 л
N. Стандартные растворы фосфатов: на основе исходного раствора 9 мМ фосфата приготовить растворы фосфата следующих концентраций:
Методика
Экстракция корма с использованием твердофазной ферментации (SSF)
1. 1 г пшеничных отрубей для SSF поместить в колбу объемом 125 мл с крышкой, добавить 100 мл деионизированной воды
2. Перемешивать при 250 об/мин в течение 1 ч
3. Разбавить
a. 1:500 (1 мл SSF/4 мл 0,1М натрий-ацетатного буфера
Стадия 1 - желудочное пищеварение
1. Измельчить корм, просеять полученную измельченную массу через сито (1×1 мм)
2. Поместить 2 г измельченного корма в колбу объемом 250 мл
a. Экстрагировать SSF в течение 50 мин, добавить 50 мл 0,1М ацетата натрия, затем при постоянном перемешивании добавить 20 мл 0,2М HCl
b. Если корм не содержит ферментной добавки, добавить 1 мл фермента и 49 мл ацетата натрия
3. Довести pH до 3 4М соляной кислотой (около 10 капель), затем довести до pH 2 с помощью 2,2М соляной кислоты (около 10 капель)
4. Добавить раствор пепсина (10 мг пепсина/мл деионизированной воды, готовить непосредственно перед использованием), затем добавить 1,0 мл раствора хлорамфеникола (5 мг хлорамфеникола (Sigma, С0378)/1 мл спирта, готовить непосредственно перед использованием)
a. Пример: Пепсин = 130 мг/13 мл деионизированной воды (6 флаконов + 1 мл)
b. Пример: Хлорамфеникол = 32,5 мг/6,5 мл спирта (6 флаконов + 0,5 мл)
5. Закрыть колбы, встряхнуть растворы, поместить в водяную баню с устройством для перемешивания (55 об/мин) на 6 ч (необходимо использовать колбы с грузом, чтобы обеспечить полное погружение)
а. Перемешивать раствор каждый час для полного смешения компонентов
Стадия 2 - кишечное пищеварение (тонкий кишечник)
1. Медленно, при постоянном помешивании добавить 20 мл 0,2М натрий-ацетатного буфера и 10 мл 0,6М NaOH
2. Довести pH до 6,8 раствором 0,6М NaOH (20-25 капель)
3. Добавить 2 мл раствора панкреатина (50 мг/1 мл деионизированной воды + 2 мл; смешивать в стакане с магнитной мешалкой, готовить непосредственно перед использованием)
4. Перемешать раствор и поместить в водяную баню с устройством для перемешивания (55 об/мин) на 18 ч при 39°C
5. Перемешать раствор, перелить в пробирку для центрифуги (Falcon), центрифугировать при 14000 об/мин в течение 20 мин
Модель для изучения выделения фосфатов:
Источник: Kim T.W., Lei X.G. (2005), An Improved Method for a Rapid Determination of Phytase in Animal Feed, J. Animal science, 83: 1062-1067
1. После инкубации с помощью пипетки перенести 1 мл стоп-реагента (15% ТХУК) в 1 мл супернатанта непосредственно перед завершением центрифугирования (в двух повторностях), затем перемешать с помощью вихревой мешалки
2. Центрифугировать при 2000 об/мин в течение 10 мин
а. Во время центрифугирования можно приготовить реагент для проведения калориметрического анализа
3. В чистых пробирках смешать 0,2 мл супернатанта и 1,8 мл воды, очищенной с помощью системы для очистки воды Nanopure (удельное электрическое сопротивление 18MΩ⋅см). Затем добавить к 1,8 аналогично очищенной воды по 0,2 мл каждого стандартного раствора фосфата и перемешать с помощью вихревой мешалки. При добавлении супернатанта нагреть один экземпляр каждого раствора перед добавлением в пробирки.
4. Добавить 2,0 мл свежеприготовленного реагента для проведения калориметрического анализа в каждую пробирку, хорошо перемешать с помощью вихревой мешалки
5. Выдержать образцы на водяной бане при 50°C в течение 15 мин.
6. Оставить образцы охлаждаться до комнатной температуры. После охлаждения поместить термометр в водяную баню (20-25°C).
7. Измерить оптическую плотность образцов при длине волны 820 нм.
a. Сравнить среднюю оптическую плотность образцов со стандартной и рассчитать содержание фосфатов (мг/кг корма)
b. При расчете конечного результата необходимо учесть степень разбавления
Модель для изучения выделения редуцирующих сахаров:
Источник: Miller (1959), Use of Dintrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar, Anal. Chem. 31, 426-428
1. Если это необходимо, разбавить 1 мл супернатанта деионизированной водой
2. Поместить 1 мл супернатанта в стеклянную пробирку и смешать с 1 мл воды (в двух повторностях)
3. С помощью пипетки добавить к 1 мл воды по 1 мл каждого стандартного раствора декстрозы
4. В каждую пробирку добавить по 3 мл раствора DNS, затем немедленно перемешать с помощью вихревой мешалки и поместить в кипящую водяную баню на 5 мин
5. Поместить пробирки в водяную баню со льдом на 2-3 мин, затем оставить остывать до комнатной температуры. Поместить термометр в водяную баню (20-25°С).
6. Измерить оптическую плотность образцов при длине волны 540 нм.
а) Сравнить среднюю оптическую плотность образцов со стандартной и рассчитать содержание редуцирующих сахаров (г/кг корма)
б) При расчете конечного результата необходимо учесть степень разбавления
Определение коэффициента разведения раствора фермента:
1. Определить коэффициент разведения
2. Разбавить раствор деионизированной водой до 1:100 (1 г/100 мл)
3. Перемешать в колбе с пептоном при комнатной температуре (250 об/мин)
4. Продолжить разведение в пробирках объемом 15 мл
5. Повторить стадию 1.3
Конечным продуктом переваривания in vitro является смесь ферментированного животного корма и жидких компонентов, добавленных в ходе процесса. Данную смесь фильтруют с помощью фильтровальной бумаги Р8 и воронки Бюхнера для отделения твердых компонентов. В жидкой фазе смеси анализировали содержание фосфора с использованием масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой; твердую фазу смеси лиофилизировали. Полученный лиофилизат представляет собой сухой остаток смеси. Сухой остаток исследуют методом спектроскопии в ближней инфракрасной области для калибровки. Часть сухого остатка используют для определения содержания белка методом озоления. Другую часть используют для определения уровня общей энергии с помощью бомбового калориметра. Таблица 1 представляет собой пример набора данных анализа образца корма, ферментированного in vitro.
Была построена модель с использованием данных, полученных методом спектроскопии в ближней инфракрасной области, и справочных данных, полученных другими методами, используемых для сравнения. Спектральные данные содержат данные о пиках, соответствующих определенным связям в структуре соединения (например, спектрограммы белков содержат специфичные пики). Затем данные о пиках сравнивают со справочными данными, и на основе полученных спектров и значений создают прогностическую модель для конкретного компонента корма (например, фермента). На Фиг. 2 представлен пример спектра в ближней инфракрасной области. Фиг. 3 демонстрирует точность определения концентрации белка в корме методом спектроскопии в ближней инфракрасной области.
Содержание всех статей и патентов, упомянутых в настоящей заявке, включено в настоящую заявку посредством ссылок. Возможны различные модификации и вариации композиций и способов, описанных в настоящей заявке, очевидные специалистам в данной области техники и не выходящие за пределы объема и сущности данного изобретения. Несмотря на то, что настоящее изобретения было описано со ссылкой на некоторые предпочтительные варианты его реализации, следует понимать, что настоящее изобретения не ограничивается указанными вариантами реализации. Напротив, для специалистов в данной области техники должно быть очевидно, что возможны различные варианты описанных способов реализации изобретения, не выходящие за рамки объема настоящего изобретения.
1. Способ анализа корма для животных, включающий следующие стадии:
a) переваривание образца корма для животных in vitro с использованием по меньшей мере одного пищеварительного фермента с получением ферментированного корма для животных, содержащего по меньшей мере один остаточный компонент;
b) исследование указанного ферментированного корма для животных методом спектроскопии в ближней инфракрасной области с получением спектральных данных; и
c) сравнение указанных спектральных данных с компьютерной моделью с получением прогностической концентрации указанного по меньшей мере одного остаточного компонента указанного ферментированного корма для животных.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве по меньшей мере одного пищеварительного фермента используют пепсин или панкреатин, или оба этих фермента.
3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что переваривание указанного образца корма для животных дополнительно включает разделение указанного ферментированного образца на сухое вещество и жидкость, при этом исследование указанного ферментированного корма для животных включает исследование указанного сухого вещества.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что перед исследованием указанного сухого вещества проводят его сушку.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один остаточный компонент выбран из группы, состоящей из белка, фосфора, общей энергии и углеводов.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный образец корма для животных содержит добавку.
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что указанная добавка содержит фермент.
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает определение влияния указанной добавки на усвояемость корма для животных путем сравнения указанной прогнозируемой концентрации указанного по меньшей мере одного остаточного компонента в указанном образце ферментированного корма для животных, содержащего указанную добавку, с прогнозируемой концентрацией указанного по меньшей мере одного остаточного компонента в образце корма для животных, не содержащего добавку.
9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что сравнение спектральных данных проводят с использованием способа, реализуемого с помощью компьютера, включающего получение спектральных данных для указанного ферментированного образца и сравнение указанных спектральных данных с компьютерной моделью с получением прогнозируемой концентрации указанного по меньшей мере одного остаточного компонента.
