Высокопроизводительная и высокомультиплексная визуализация при помощи программируемых зондов на основе нуклеиновых кислот

Изобретение относится к биотехнологии и предусматривает способы тестирования образца на наличие одной или нескольких мишеней. Способы включают приведение образца в контакт с одним или несколькими специфичными для мишени партнерами по связыванию, где каждый специфичный для мишени партнер по связыванию соединен с докинг-цепью и где специфичные для мишени партнеры по связыванию с разной специфичностью соединены с разными докинг-цепями, приведение образца в контакт с мечеными визуализирующими цепями с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна докинг-цепям, с получением меченых визуализирующих цепей, стабильно связанных с докинг-цепями, визуализацию образца и тушение сигнала от связанной меченой визуализирующей цепи или удаление связанных меченых визуализирующих цепей от докинг-цепей путем ферментативного расщепления, модификации или разрушения меченых визуализирующих цепей. Изобретения расширяют арсенал способов для визуализации представляющих интерес мишеней при высокой пространственной разрешающей способности. 3 н. и 47 з.п. ф-лы, 10 ил., 1 пр.

 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США № 61/951461, поданной 11 марта 2014 г., полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится в целом к области выявления и количественного определения анализируемых веществ (например, мишеней).

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Флуоресцентная микроскопия представляет собой мощный инструмент для исследования молекул, например, в биологической системе. Однако, количество разных молекул, которые можно различимо и одновременно визуализировать (т.е. мультиплексная способность), ограничено спектральным перекрытием флуорофоров.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предусматривает, помимо прочего, способы и композиции для выявления, визуализации и/или количественного определения представляющих интерес мишеней (например, биологических молекул). Некоторые способы, предусмотренные в данном документе, включают (1) приведение образца, подлежащего анализу (например, образца, предположительно содержащего одну или несколько представляющих интерес мишеней), в контакт с компонентами, которые специфически связываются с мишенями (при этом каждый компонент является партнером по связыванию для данной мишени), где каждый компонент конъюгирован с нуклеиновой кислотой (называемой в данном документе докинг-цепью), и где партнеры по связыванию с разной специфичностью конъюгированы с разными докинг-цепями, (2) необязательно удаление несвязанных партнеров по связыванию, (3) приведение образца в контакт с мечеными (например, флуоресцентно меченными) нуклеиновыми кислотами с нуклеотидной последовательностью, комплементарной одной докинг-цепи и, следовательно, специфичной для нее (такие меченые нуклеиновые кислоты называются в данном документе мечеными визуализирующими цепями), (4) необязательно удаление несвязанных визуализирующих цепей, (5) визуализацию образца целиком или частично для выявления расположения и количества связанных визуализирующих цепей, (6) тушение сигнала от меченой визуализирующей цепи в образце (например, путем обесцвечивания, в том числе фотообесцвечивания) и (7) повторение стадий (3)-(6) каждый раз с визуализирующей цепью с уникальной нуклеотидной последовательностью по отношению ко всем остальным визуализирующим цепям, применяемым в способе.

Визуализирующие цепи могут быть мечеными идентично, в том числе идентично флуоресцентно меченными. В других вариантах осуществления визуализирующие цепи с идентичными последовательностями могут быть идентично мечеными. Первый подход может быть более удобным, поскольку при его применении требуются одна длина волны возбуждения и детектор.

Таким образом, можно выявлять, визуализировать и/или количественно определять две или более мишени в образце, вне зависимости от их расположения в образце, в том числе вне зависимости от того, расположены ли они в образце настолько близко друг к другу, чтобы они были неразличимы, если сигнал от двух или более мишеней наблюдали одновременно. Таким образом, расстояние между двумя или более мишенями может быть меньше разрешающей способности по дальности системы визуализации, применяемой для выявления мишеней, и тем не менее с применением способов, предусмотренных в данном документе, будет возможным отличить две или более мишени друг от друга, что способствует тем самым более точному и надежному выявлению и количественному определению таких мишеней. В некоторых случаях разрешающая способность по дальности может составлять, например, приблизительно 50 нм.

Следует понимать, что перед проведением способа "содержание мишени" в образце может быть известным, или предполагаемым, или неизвестным и не предполагаемым. Партнеры по связыванию, которые приводят в контакт с образцом, могут связываться или не связываться с образцом в зависимости от того, присутствует или отсутствует мишень (например, если мишень присутствует, партнер по связыванию может связываться с образцом). Визуализирующие цепи, которые приводят в контакт с образцом, могут связываться или не связываться с образцом в зависимости от того, присутствует или отсутствует мишень (например, если мишень присутствует, визуализирующая цепь может связываться с соответствующей докинг-цепью, связанной с мишенью). "Связывание с образцом" означает, что партнер по связыванию или визуализирующая цепь связываются со своими соответствующими мишенью или докинг-цепью.

Партнеры по связыванию по своей природе могут представлять собой белки, такие как антитела или фрагменты антител. В случае партнера по связыванию, который представляет собой антитело или фрагмент антитела, докинг-цепи могут быть конъюгированы с их константными областями. Партнер по связыванию может представлять собой антитело, такое как моноклональное антитело, или он может представлять собой антигенсвязывающий фрагмент антитела, такой как антигенсвязывающий фрагмент моноклонального антитела. В некоторых вариантах осуществления партнер по связыванию представляет собой рецептор.

Партнер по связыванию может быть соединен с докинг-цепью посредством промежуточного линкера. В некоторых вариантах осуществления промежуточный линкер включает в себя биотин и/или стрептавидин.

Визуализирующие цепи могут быть флуоресцентно меченными (т.е. конъюгированными с флуорофором). Флуорофоры, конъюгированные с визуализирующими цепями с разными нуклеотидными последовательностями, могут быть идентичными друг другу, или они могут иметь такой профиль испускания, который перекрывается или не перекрывается с таковым у других флуорофоров. Флуоресцентно меченная визуализирующая цепь может содержать по меньшей мере один флуорофор.

В некоторых случаях флуоресцентно меченные визуализирующие нуклеиновые кислоты, такие как визуализирующие цепи, могут содержать 1, 2, 3 или более флуорофоров.

Образец может представлять собой клетку, популяцию клеток или клеточный лизат из клетки или популяции клеток. Мишень может представлять собой белок.

Поэтому следует понимать, что настоящее изобретение предусматривает способ выявления анализируемых веществ путем связывания анализируемых веществ с их соответствующими партнерами по связыванию и последовательного определения наличия таких партнеров по связыванию путем многократного связывания, выявления и тушения (например, путем обесцвечивания, такого как фотообесцвечивание) визуализирующих цепей, которые необязательно идентично мечены (например, идентично флуоресцентно мечены).

Соответственно, настоящее раскрытие предусматривает способ, включающий (1) приведение образца, тестируемого на наличие одной или нескольких мишеней, в контакт с одним или несколькими специфичными для мишени партнерами по связыванию, где каждый специфичный для мишени партнер по связыванию соединен с докинг-цепью, и где специфичные для мишени партнеры по связыванию с разной специфичностью соединены с разными докинг-цепями, (2) необязательно удаление несвязанных специфичных для мишени партнеров по связыванию, (3) приведение образца в контакт с мечеными визуализирующими цепями с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна докинг-цепи, (4) необязательно удаление несвязанных меченых визуализирующих цепей, (5) визуализацию образца с целью выявления расположения и количества связанных меченых визуализирующих цепей, (6) тушение сигнала от связанной меченой визуализирующей цепи и (7) повторение стадий (3)-(6) каждый раз с меченой визуализирующей цепью с уникальной нуклеотидной последовательностью по отношению ко всем остальным меченым визуализирующим цепям.

В некоторых вариантах осуществления на стадии (1) образец приводят в контакт с несколькими специфичными для мишени партнерами по связыванию.

В некоторых вариантах осуществления специфичный для мишени партнер по связыванию представляет собой антитело или фрагмент антитела.

В некоторых вариантах осуществления меченые визуализирующие цепи мечены идентично. В некоторых вариантах осуществления каждая из меченых визуализирующих цепей содержит отличную от других метку. В некоторых вариантах осуществления меченые визуализирующие цепи представляют собой флуоресцентно меченные визуализирующие цепи.

В некоторых вариантах осуществления одна или несколько мишеней представляют собой белки. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой клетку, клеточный лизат или тканевой лизат.

В некоторых вариантах осуществления образец визуализируют на стадии (5) с применением конфокальной или эпифлуоресцентной микроскопии.

В некоторых вариантах осуществления тушение сигнала на стадии (6) предусматривает фотообесцвечивание.

Настоящее раскрытие дополнительно предусматривает композицию, содержащую образец, связанный с несколькими распознающими мишень компонентами, такими как специфичные для мишени партнеры по связыванию, при этом каждый распознающий мишень компонент связан с нуклеиновой кислотой для докинга, такой как докинг-цепь, и по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту для докинга, стабильно связанную с меченой визуализирующей нуклеиновой кислотой, такой как визуализирующая цепь.

Настоящее раскрытие дополнительно предусматривает композицию, содержащую образец, связанный с несколькими специфичными для мишени партнерами по связыванию, при этом каждый партнер по связыванию связан с докинг-цепью, и по меньшей мере одну докинг-цепь, стабильно связанную с меченой визуализирующей цепью.

Настоящее раскрытие дополнительно предусматривает способ, включающий (1) приведение образца, тестируемого на наличие одной или нескольких мишеней, в контакт с одним или несколькими распознающими мишень компонентами, такими как специфичные для мишени партнеры по связыванию, где каждый распознающий мишень компонент соединен с нуклеиновой кислотой для докинга, такой как докинг-цепь, и где распознающие мишень компоненты с разной специфичностью соединены с разными нуклеиновыми кислотами для докинга, (2) необязательно удаление несвязанных распознающих мишень компонентов, (3) приведение образца в контакт с мечеными визуализирующими нуклеиновыми кислотами, такими как визуализирующие цепи, с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна нуклеиновой кислоте для докинга, (4) необязательно удаление несвязанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (5) визуализацию образца с целью выявления расположения и количества связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (6) удаление связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот от нуклеиновых кислот для докинга путем изменения температуры и/или условий буфера и (7) повторение стадий (3)-(6) каждый раз с меченой визуализирующей нуклеиновой кислотой с уникальной нуклеотидной последовательностью по отношению ко всем остальным меченым визуализирующим нуклеиновым кислотам. При таких условиях визуализирующая нуклеиновая кислота отделяется от нуклеиновой кислоты для докинга самопроизвольно.

Настоящее раскрытие дополнительно предусматривает способ, включающий (1) приведение образца, тестируемого на наличие одной или нескольких мишеней, в контакт с одним или несколькими специфичными для мишени партнерами по связыванию, где каждый специфичный для мишени партнер по связыванию соединен с нуклеиновой кислотой для докинга, и где специфичные для мишени партнеры по связыванию с разной специфичностью соединены с разными нуклеиновыми кислотами для докинга, (2) необязательно удаление несвязанных специфичных для мишени партнеров по связыванию, (3) приведение образца в контакт с мечеными визуализирующими нуклеиновыми кислотами с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна нуклеиновой кислоте для докинга, (4) необязательно удаление несвязанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (5) визуализацию образца с целью выявления расположения и количества связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (6) удаление связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот от нуклеиновых кислот для докинга путем изменения температуры и/или условий буфера и (7) повторение стадий (3)-(6) каждый раз с меченой визуализирующей нуклеиновой кислотой с уникальной нуклеотидной последовательностью по отношению ко всем остальным меченым визуализирующим нуклеиновым кислотам. При таких условиях визуализирующая нуклеиновая кислота отделяется от нуклеиновой кислоты для докинга самопроизвольно.

В некоторых вариантах осуществления меченые визуализирующие нуклеиновые кислоты удаляют от нуклеиновых кислот для докинга путем снижения концентрации соли, добавления денатуранта или повышения температуры. В некоторых вариантах осуществления соль представляет собой соль Mg++. В некоторых вариантах осуществления денатурант представляет собой формамид, мочевину или DMSO.

Настоящее раскрытие дополнительно предусматривает способ, включающий (1) приведение образца, тестируемого на наличие одной или нескольких мишеней, в контакт с одним или несколькими распознающими мишень компонентами, такими как специфичные для мишени партнеры по связыванию, где каждый распознающий мишень компонент соединен с нуклеиновой кислотой для докинга, такой как докинг-цепь, и где распознающие мишень компоненты с разной специфичностью соединены с разными нуклеиновыми кислотами для докинга, (2) необязательно удаление несвязанных распознающих мишень компонентов, (3) приведение образца в контакт с мечеными визуализирующими нуклеиновыми кислотами, такими как визуализирующие цепи, с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна нуклеиновой кислоте для докинга, (4) необязательно удаление несвязанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (5) визуализацию образца с целью выявления расположения и количества связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (6) удаление связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот от нуклеиновых кислот для докинга и (7) повторение стадий (3)-(6) каждый раз с меченой визуализирующей нуклеиновой кислотой с уникальной нуклеотидной последовательностью по отношению ко всем остальным меченым визуализирующим нуклеиновым кислотам.

Настоящее раскрытие дополнительно предусматривает способ, включающий (1) приведение образца, тестируемого на наличие одной или нескольких мишеней, в контакт с одним или несколькими специфичными для мишени партнерами по связыванию, где каждый специфичный для мишени партнер по связыванию соединен с нуклеиновой кислотой для докинга, и где специфичные для мишени партнеры по связыванию с разной специфичностью соединены с разными нуклеиновыми кислотами для докинга, (2) необязательно удаление несвязанных специфичных для мишени партнеров по связыванию, (3) приведение образца в контакт с мечеными визуализирующими нуклеиновыми кислотами с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна нуклеиновой кислоте для докинга, (4) необязательно удаление несвязанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (5) визуализацию образца с целью выявления расположения и количества связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (6) удаление связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот от нуклеиновых кислот для докинга и (7) повторение стадий (3)-(6) каждый раз с меченой визуализирующей нуклеиновой кислотой с уникальной нуклеотидной последовательностью по отношению ко всем остальным меченым визуализирующим нуклеиновым кислотам.

В некоторых вариантах осуществления на стадии (6) меченые визуализирующие нуклеиновые кислоты не удаляют от нуклеиновых кислот для докинга путем замещения цепи в присутствии конкурирующей нуклеиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления на стадии (6) меченые визуализирующие нуклеиновые кислоты удаляют от нуклеиновых кислот для докинга путем химического, фотохимического или ферментативного расщепления, модификации или разрушения меченых визуализирующих нуклеиновых кислот.

В некоторых вариантах осуществления, в которых меченая визуализирующая нуклеиновая кислота связана с соответствующей ей нуклеиновой кислотой для докинга, визуализирующая нуклеиновая кислота или нуклеиновая кислота для докинга не имеют одноцепочечного участка. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота для докинга не имеет последовательность зацепления. В некоторых вариантах осуществления визуализирующая нуклеиновая кислота не имеет последовательность зацепления.

В некоторых вариантах осуществления меченая визуализирующая нуклеиновая кислота не обладает свойством самогашения.

Настоящее раскрытие дополнительно предусматривает способ, включающий (1) приведение образца, тестируемого на наличие одной или нескольких мишеней, в контакт с одним или несколькими распознающими мишень компонентами, такими как специфичные для мишени партнеры по связыванию, где каждый распознающий мишень компонент соединен с нуклеиновой кислотой для докинга, такой как докинг-цепь, и где распознающие мишень компоненты с разной специфичностью соединены с разными нуклеиновыми кислотами для докинга, (2) необязательно удаление несвязанных распознающих мишень компонентов, (3) приведение образца в контакт с мечеными визуализирующими нуклеиновыми кислотами, такими как визуализирующие цепи, с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна нуклеиновой кислоте для докинга, (4) необязательно удаление несвязанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (5) визуализацию образца с целью выявления расположения и количества связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (6) инактивацию связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот путем удаления или модификации их испускающих сигнал компонентов без полного удаления визуализирующей нуклеиновой кислоты и (7) повторение стадий (3)-(6) каждый раз с мечеными визуализирующими нуклеиновыми кислотами с уникальной нуклеотидной последовательностью по отношению ко всем остальным меченым визуализирующим нуклеиновым кислотам.

Настоящее раскрытие дополнительно предусматривает способ, включающий (1) приведение образца, тестируемого на наличие одной или нескольких мишеней, в контакт с одним или несколькими специфичными для мишени партнерами по связыванию, где каждый специфичный для мишени партнер по связыванию соединен с нуклеиновой кислотой для докинга, и где специфичные для мишени партнеры по связыванию с разной специфичностью соединены с разными нуклеиновыми кислотами для докинга, (2) необязательно удаление несвязанных специфичных для мишени партнеров по связыванию, (3) приведение образца в контакт с мечеными визуализирующими нуклеиновыми кислотами с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна нуклеиновой кислоте для докинга, (4) необязательно удаление несвязанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (5) визуализацию образца с целью выявления расположения и количества связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (6) инактивацию связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот путем удаления или модификации их испускающих сигнал компонентов без полного удаления визуализирующей нуклеиновой кислоты и (7) повторение стадий (3)-(6) каждый раз с мечеными визуализирующими нуклеиновыми кислотами с уникальной нуклеотидной последовательностью по отношению ко всем остальным меченым визуализирующим нуклеиновым кислотам.

Различные варианты осуществления в равной степени применимы к вышеизложенным способам. Эти варианты осуществления являются следующими:

В некоторых вариантах осуществления на стадии (1) образец приводят в контакт с несколькими специфичными для мишени партнерами по связыванию. В некоторых вариантах осуществления специфичный для мишени партнер по связыванию представляет собой антитело или фрагмент антитела. В некоторых вариантах осуществления специфичный для мишени партнер по связыванию представляет собой природный или сконструированный лиганд, малую молекулу, аптамер, пептид или олигонуклеотид.

В некоторых вариантах осуществления меченые визуализирующие нуклеиновые кислоты мечены идентично. В некоторых вариантах осуществления каждая из меченых визуализирующих нуклеиновых кислот содержит отличную от других метку. В некоторых вариантах осуществления меченые визуализирующие нуклеиновые кислоты являются флуоресцентно меченными визуализирующими нуклеиновыми кислотами.

В некоторых вариантах осуществления одна или несколько мишеней представляют собой белки. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой клетку, клеточный лизат или тканевой лизат.

В некоторых вариантах осуществления образец визуализируют на стадии (5) с применением конфокальной или эпифлуоресцентной микроскопии.

В некоторых вариантах осуществления несвязанная нуклеиновая кислота для докинга является частично двухцепочечной. В некоторых вариантах осуществления несвязанная визуализирующая нуклеиновая кислота является частично двухцепочечной.

В некоторых вариантах осуществления визуализирующая нуклеиновая кислота представляет собой молекулярный маяк или имеет вторичную структуру со шпильками. В некоторых вариантах осуществления визуализирующая нуклеиновая кислота представляет собой молекулярный маяк или имеет вторичную структуру со шпильками, которая обладает свойством самогашения. В некоторых вариантах осуществления визуализирующая нуклеиновая кислота представляет собой полудуплекс. В некоторых вариантах осуществления полудуплекс обладает свойством самогашения. В некоторых вариантах осуществления визуализирующая нуклеиновая кислота связана с несколькими испускающими сигнал компонентами посредством дендримерной структуры или полимерной структуры. Визуализирующая нуклеиновая кислота может быть линейной или разветвленной.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота для докинга имеет вторичную структуру со шпильками.

Эти и другие варианты осуществления будут описаны в данном документе более подробно.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

ФИГ. 1 представляет собой схематическое изображение одного варианта осуществления высокопроизводительного и по своей сути масштабируемого мультиплексного подхода к визуализации, предусмотренного в настоящем раскрытии. Клетки визуализируют после гибридизации с зондом и затем подвергают фотообесцвечиванию перед последующим циклом визуализации.

ФИГ. 2 представляет собой схематическое изображение одного варианта осуществления высокопроизводительного и по своей сути масштабируемого мультиплексного подхода к визуализации, основанного на замене буфера с применением растворов с характеристиками легкой денатурации, такими как сниженная концентрация соли, повышенная концентрация формамида или более высокая температура.

ФИГ. 3 представляет собой схематическое изображение одного варианта осуществления инактивации визуализирующей цепи путем удаления визуализирующей цепи с применением способов, предусмотренных в настоящем раскрытии.

ФИГ. 4 представляет собой схематическое изображение одного варианта осуществления инактивации визуализирующей цепи путем инактивации флуорофора без удаления части визуализирующей цепи, представляющей собой нуклеиновую кислоту.

ФИГ. 5 представляет собой схематическое изображение одного варианта осуществления визуализирующей цепи по типу молекулярного маяка, обладающей свойством самогашения.

ФИГ. 6 представляет собой схематическое изображение одного варианта осуществления визуализирующей цепи в виде полудуплекса, обладающей свойством самогашения.

ФИГ. 7 представляет собой схематическое изображение одного варианта осуществления докинг-цепи, не являющейся одноцепочечной.

ФИГ. 8 представляет собой схематическое изображение одного варианта осуществления визуализирующей цепи, которая привлекает несколько копий испускающих сигнал компонентов к докинг-цепи.

ФИГ. 9 представляет собой схематическое изображение одного варианта осуществления визуализирующей цепи, не являющейся одноцепочечной.

ФИГ. 10 представляет собой график, на котором показаны прогнозируемые константы диссоциации 10 различных олигонуклеотидов с соответствующими обратно комплементарными цепями при 3 различных наборах условий. Последовательность a1: 5'-CATCTAAAGCC-3' (SEQ ID NO: 1); последовательность a2: 5'-GAATTTCCTCG-3' (SEQ ID NO: 2); последовательность a3: 5'-GTTTAATTGCG-3' (SEQ ID NO: 3); последовательность a4: 5'-ACAATTCTTCG-3' (SEQ ID NO: 4); последовательность a5: 5'-TTTCTTGCTTC-3' (SEQ ID NO: 5); последовательность a6: 5'-GCATTGTTACT-3' (SEQ ID NO: 6); последовательность a7: 5'-ATATACAAGCG-3' (SEQ ID NO: 7); последовательность a8: 5'-GCTGTCTATTG-3' (SEQ ID NO: 8); последовательность a9: 5'-TCTTTATGCTG-3' (SEQ ID NO: 9); последовательность a10: 5'-CAATCTCATCC-3' (SEQ ID NO: 10).

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предусматривает, помимо прочего, композиции и способы для мультиплексной флуоресцентной визуализации, например, в клеточной среде, с применением визуализирующих зондов на основе нуклеиновых кислот (например, визуализирующих зондов на основе ДНК). Способы, предусмотренные в данном документе, частично основаны на программируемости докинг-цепей и визуализирующих цепей нуклеиновых кислот. Это означает, например, что докинг-цепи и визуализирующие цепи могут быть сконструированы таким образом, что они связываются друг с другом при определенных условиях в течение определенного периода времени. Такая программируемость предоставляет возможность стабильного связывания визуализирующих цепей с докинг-цепями, как предусмотрено в данном документе. В целом, способы, предусмотренные в данном документе, направлены на идентификацию одной или нескольких мишеней (например, биологических молекул, таких как белок или нуклеиновая кислота) в конкретном образце (например, биологическом образце). В некоторых случаях неизвестно, присутствуют ли одна или несколько мишеней в образце. Таким образом, способы по настоящему раскрытию можно применять для определения наличия или отсутствия одной или нескольких мишеней в образце, который предположительно содержит мишень(мишени). В любом из аспектов и вариантов осуществления, предусмотренных в данном документе, образец может содержать или может предположительно содержать одну или несколько мишеней.

Таким образом, настоящее изобретение предусматривает способы для проведения высокопроизводительной и высокомультиплексной визуализации и выявления анализируемых веществ/мишеней с использованием программируемых зондов на основе нуклеиновых кислот (например, ДНК). Эти способы основаны на подходе по типу последовательной визуализации с использованием ортогональных визуализирующих цепей, которые могут стабильно присоединяться к комплементарной докинг-цепи, иммобилизованной на партнерах по связыванию, таких как антитела (ФИГ. 1). После гибридизации и визуализации с помощью визуализирующей цепи проводят стадию тушения (такую, как стадия фотообесцвечивания) с целью устранения и/или уменьшения флуоресценции от гибридизированных (связанных) визуализирующих цепей.

В другом варианте осуществления с целью устранения сигнала в способах используют более слабое связывание между докинг-цепями и визуализирующими цепями. Например, условия гибридизации можно изменять таким образом, что точка плавления дуплекса, который образуется между докинг-цепями или визуализирующими цепями, немного превышает комнатную температуру (например, 25°C) или температуру визуализации. Стадию мечения (т.е. стадию, на которой визуализирующие цепи связываются с соответствующими им докинг-цепями) и стадию визуализации проводят, как описано выше. В качестве примера, после визуализации первой мишени, образец подвергают денатурирующим условиям. Денатурирующие условия можно обеспечить на стадии замены буфера путем применения раствора, например, с более низкой концентрацией соли, присутствующим или имеющим повышенную концентрацию денатурантом, таким как формамид, или повышенной температурой (ФИГ. 2). Образец можно в альтернативном случае или дополнительно подвергать воздействию повышенной температуры. Вышеупомянутые повышения или понижения приведены по отношению к условиям, существующим на стадии мечения (т.е. когда визуализирующая цепь связывается с докинг-цепью). В случае замены буфера образец можно промывать, замену буфера можно повторять, образец можно промывать снова, и затем к образцу можно добавлять следующую визуализирующую цепь.

Для мультиплексирования в отношении одного и того же образца последовательно применяются различные резервуары ортогональных визуализирующих цепей после каждой стадии, например, фотообесцвечивания или других способов тушения сигнала или инактивации или удаления визуализирующей цепи, с целью потенциальной визуализации неограниченного числа мишеней. В отличие от традиционных подходов к визуализации, где мультиплексирование ограничено спектральным перекрытием цветовых каналов, способы, предусмотренные в данном документе, ограничены только количеством возможных ортогональных нуклеотидных последовательностей (докинг-цепей или, в альтернативном случае, визуализирующих цепей). Поскольку можно легко сконструировать большее количество ортогональных нуклеотидных последовательностей, этот подход имеет возможность по своей сути масштабируемого мультиплексирования благодаря применению всего одного флуорофора. Этот способ можно легко интегрировать со стандартными устройствами для микроскопии (например, конфокальными или эпифлуоресцентными микроскопами), что обеспечивает высокопроизводительный анализ образца.

Способы имеют применимость, например, для высокопроизводительных скрининговых анализов, таких как скрининговый анализ лекарственных средств. Этот подход к визуализации обеспечивает анализ больших популяций клеток (~ 1000-10000) или образцов тканей в ультрамультиплексном формате при визуализации с применением стандартного конфокального или эпифлуоресцентного микроскопа. Скрининг большого количества мишеней, таких как белки, в одном и том же образце высокопроизводительным способом обеспечит информацию о новых лекарственных средствах или модификаторах и при этом обеспечит информацию о гетерогенности клеток. Крупномасштабный скрининг образцов тканей с возможностями высокопроизводительной и ультрамультиплексной визуализации будет применимым в патологическом анализе, например, в больнице или другой организации, предоставляющей такого рода услуги.

Способы, предусмотренные в данном документе, можно также применять для идентификации абсолютного количества одной мишени (например, такой как конкретный белок) или количества одной мишени по отношению к одной или нескольким другим мишеням.

Дополнительно, способы, предусмотренные в данном документе, можно применять для идентификации расположения мишени в образце или по отношению к другим мишеням в образце.

Следовательно, настоящее раскрытие предусматривает способ, включающий (1) приведение образца в контакт одновременно с множеством распознающих мишень компонентов, меченных последовательностями, (2) введение визуализирующих нуклеиновых кислот, таких как визуализирующие цепи, распознающих благодаря комплементарности последовательностей подмножество нуклеиновых кислот для докинга, таких как докинг-цепи распознающих мишень компонентов, меченных последовательностями, (3) удаление или инактивацию визуализирующих нуклеиновых кислот или тушение сигнала от визуализирующих нуклеиновых кислот и (4) повторение стадии (2) и необязательно стадии (3) по меньшей мере один раз с целью визуализации и выявления одной или нескольких дополнительных нуклеиновых кислот для докинга.

Способ может необязательно включать мечение множества распознающих мишень компонентов нуклеиновыми кислотами для докинга, такими как докинг-цепи, с образованием распознающих мишень компонентов, меченных последовательностями.

Настоящее раскрытие дополнительно предусматривает способ, включающий (1) приведение образца, тестируемого на наличие одной или нескольких мишеней, в контакт с одним или несколькими специфичными для мишени партнерами по связыванию, где каждый специфичный для мишени партнер по связыванию соединен с докинг-цепью, и где специфичные для мишени партнеры по связыванию с разной специфичностью соединены с разными докинг-цепями, (2) необязательно удаление несвязанных специфичных для мишени партнеров по связыванию, (3) приведение образца в контакт с мечеными визуализирующими цепями с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна докинг-цепи, (4) необязательно удаление несвязанных меченых визуализирующих цепей, (5) визуализацию образца с целью выявления расположения и количества связанных меченых визуализирующих цепей, (6) тушение сигнала от связанной меченой визуализирующей цепи и (7) повторение стадий (3)-(6) каждый раз с меченой визуализирующей цепью с уникальной нуклеотидной последовательностью по отношению ко всем остальным меченым визуализирующим цепям.

Стадии (3)-(6) можно повторять один или несколько раз. Например, стадии (3)-(6) можно повторять 1-10 или более раз. В некоторых вариантах осуществления стадии (3)-(6) повторяют 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз.

Настоящее раскрытие дополнительно предусматривает способ, включающий (1) приведение образца, тестируемого на наличие одной или нескольких мишеней, в контакт с одним или несколькими распознающими мишень компонентами, такими как специфичные для мишени партнеры по связыванию, где каждый распознающий мишень компонент соединен с нуклеиновой кислотой для докинга, и где распознающие мишень компоненты с разной специфичностью соединены с разными нуклеиновыми кислотами для докинга, (2) необязательно удаление несвязанных распознающих мишень компонентов, (3) приведение образца в контакт с мечеными визуализирующими нуклеиновыми кислотами, такими как визуализирующие цепи, с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна нуклеиновой кислоте для докинга, (4) необязательно удаление несвязанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (5) визуализацию образца с целью выявления расположения и количества связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (6) удаление связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот от нуклеиновых кислот для докинга и (7) повторение стадий (3)-(6) каждый раз с меченой визуализирующей нуклеиновой кислотой с уникальной нуклеотидной последовательностью по отношению ко всем остальным меченым визуализирующим нуклеиновым кислотам.

Стадии (3)-(6) можно повторять один или несколько раз. Например, стадии (3)-(6) можно повторять 1-10 или более раз. В некоторых вариантах осуществления стадии (3)-(6) повторяют 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз.

Настоящее раскрытие дополнительно предусматривает способ, включающий (1) приведение образца, тестируемого на наличие одной или нескольких мишеней, в контакт с одним или несколькими распознающими мишень компонентами, такими как специфичные для мишени партнеры по связыванию, где каждый из распознающих мишень компонентов соединен с нуклеиновой кислотой для докинга, такой как докинг-цепь, и где распознающие мишень компоненты с разной специфичностью соединены с разными нуклеиновыми кислотами для докинга, (2) необязательно удаление несвязанных распознающих мишень компонентов, (3) приведение образца в контакт с мечеными визуализирующими нуклеиновыми кислотами, такими как визуализирующие цепи, с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна нуклеиновой кислоте для докинга, (4) необязательно удаление несвязанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (5) визуализацию образца с целью выявления расположения и количества связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, (6) инактивацию связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот путем удаления или модификации их испускающих сигнал компонентов без полного удаления визуализирующей нуклеиновой кислоты и (7) повторение стадий (3)-(6) каждый раз с меченой визуализирующей нуклеиновой кислотой с уникальной нуклеотидной последовательностью по отношению ко всем остальным меченым визуализирующим нуклеиновым кислотам.

Стадии (3)-(6) можно повторять один или несколько раз. Например, стадии (3)-(6) можно повторять 1-10 или более раз. В некоторых вариантах осуществления стадии (3)-(6) повторяют 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз.

В некоторых вариантах осуществления способы, предусмотренные в данном документе, включают стадию удаления визуализирующей нуклеиновой кислоты, такой как визуализирующая цепь, которая связана с нуклеиновыми кислотами для докинга, такими как докинг-цепь, с применением способа, отличного от замещения цепи.

В некоторых вариантах осуществления способы, предусмотренные в данном документе, включают стадию удаления визуализирующей нуклеиновой кислоты, такой как визуализирующая цепь, которая связана с нуклеиновой кислотой для докинга, такой как докинг-цепь, где визуализирующая нуклеиновая кислота испускает сигнал (т.е. такой сигнал, который не гасится) перед связыванием с нуклеиновой кислотой для докинга.

В некоторых вариантах осуществления способы, предусмотренные в данном документе, включают стадию удаления визуализирующей нуклеиновой кислоты, такой как визуализирующая цепь, которая связана с нуклеиновой кислотой для докинга, такой как докинг-цепь, где визуализирующую нуклеиновую кислоту удаляют с применением нуклеиновой кислоты, которая не содержит гаситель.

В каждом из вышеупомянутых способов нуклеиновая кислота для докинга, в том числе докинг-цепь, может представлять собой одноцепочечную нуклеиновую кислоту для докинга или докинг-цепь, или может представлять собой двухцепочечную нуклеиновую кислоту для докинга или докинг-цепь, или может представлять собой частично двухцепочечную нуклеиновую кислоту для докинга или докинг-цепь (например, содержащую одноцепочечный и двухцепочечный участок).

В некоторых вариантах осуществления, в которых применяют множество распознающих мишень компонентов, в том числе множество партнеров по связыванию, множество можно одновременно приводить в контакт с образцом и, следовательно, с представляющими интерес мишенями. Распознающие мишень компоненты, такие как партнеры по связыванию, не нуждаются в последовательном приведении в контакт с образцом, хотя их можно этому подвергнуть.

Эти различные способы обеспечивают высокопроизводительную визуализацию с помощью конфокальной микроскопии с вращающимся диском. Предполагается, что процесс одноцветной 3D-визуализации целых клеток будет занимать в среднем приблизительно 30 секунд. Способ обеспечивает визуализацию больших участков (например, до миллиметрового масштаба) с помощью совместимого 10X или 20X объектива. Можно достичь глубины визуализации приблизительно в 30-50 микрон. Способы, предусмотренные в данном документе, применяли для окрашивания, в числе прочих (данные не показаны), актина, Ki-67, клатрина, цитокератина.

Партнеры по связыванию

В способах используются партнеры по связыванию, конъюгированные с нуклеиновыми кислотами (например, нуклеиновыми кислотами для докинга, такими как докинг-цепи). В данном документе они могут называться конъюгатами партнер по связыванию-нуклеиновая кислота (ʺконъюгаты BP-NAʺ). Они также могут называться распознающими мишень компонентами, меченными последовательностями. Как используется в данном документе, ʺконъюгат партнер по связыванию-нуклеиновая кислотаʺ или ʺконъюгат BP-NAʺ относится к молекуле, соединенной (например, посредством N-гидроксисукцинимидного (NHS) линкера) с одноцепочечной докинг-цепью нуклеиновой кислоты (например, ДНК).

Партнер по связыванию конъюгата может представлять собой любой компонент (например, антитело или аптамер), имеющий сродство к представляющей интерес мишени (например, связывающийся с ней), такой как биологическая молекула (например, белок или нуклеиновая кислота). В некоторых вариантах осуществления партнер по связыванию представляет собой белок. Конъюгаты BP-NA, которые содержат белок (или пептид), соединенный с докинг-цепью, могут называться в данном документе ʺконъюгатами белок-нуклеиновая кислотаʺ или ʺконъюгатами белок-NAʺ. Примеры белков для применения в конъюгатах согласно настоящему изобретению включают, без ограничения, антитела (например, моноклональные антитела), антигенсвязывающие фрагменты антител (например, Fab-фрагменты), рецепторы, пептиды и пептидные аптамеры. В соответствии с настоящим изобретением можно применять других партнеров по связыванию. Например, в данном документе рассматриваются партнеры по связыванию, которые связываются с мишенями посредством электростатических (например, частицы со статическим электрическим зарядом), гидрофобных или магнитных (например, намагниченные частицы) взаимодействий.

Как используется в данном документе, ʺантителоʺ включает антитела полной длины и любой антигенсвязывающий фрагмент (например, ʺантигенсвязывающую частьʺ) или одну их цепь. Термин ʺантителоʺ включает, без ограничения, гликопротеин, содержащий по меньшей мере две тяжелых (H) цепи и две легких (L) цепи, соединенных между собой дисульфидными связями, или его антигенсвязывающую часть. Антитела могут быть поликлональными или моноклональными; ксеногенными, аллогенными или изогенными; или их модифицированными формами (например, гуманизированными, химерными).

Как используется в данном документе, ʺантигенсвязывающая частьʺ антитела относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность к специфическому связыванию с антигеном. Антигенсвязывающая функция антитела может выполняться фрагментами антитела полной длины. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином ʺантигенсвязывающая частьʺ антитела, включают (i) Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов V_H, V_L, C_L и C_H1; (ii) F(ab')2-фрагмент, бивалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов V_H и C_H1; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов V_H и V_L одного плеча антитела, (v) dAb-фрагмент (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989), который состоит из домена V_H; и (vi) выделенную область, определяющую комплементарность (CDR), или (vii) комбинацию двух или более выделенных CDR, которые могут быть необязательно соединены синтетическим линкером. Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, V_H и V_L, кодируются отдельными генами, они могут быть соединены с применением рекомбинантных способов синтетическим линкером, который обеспечивает возможность их получения в виде одной белковой цепи, в которой участки V_H и V_L попарно соединены с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечные Fv (scFv); см., например, Bird et al. Science 242:423-426, 1988; и Huston et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988). Такие одноцепочечные антитела также охватываются термином ʺантигенсвязывающая частьʺ антитела. Эти фрагменты антител получают с применением общепринятых методик, известных специалистам в данной области, и фрагменты подвергают скринингу в отношении полезности таким же образом, как и интактные антитела.

Как используется в данном документе, ʺрецепторыʺ относятся к клеточным молекулам (например, белкам), которые связываются с лигандами, такими как, например, пептиды или малые молекулы (например, низкомолекулярные (< 900 дальтон) органические или неорганические соединения).

Как используется в данном документе, ʺпептидный аптамерʺ относится к молекуле с вариабельной пептидной последовательностью, встроенной в константный каркасный белок (см., например, Baines IC, et al. Drug Discov. Today 11:334-341, 2006).

В некоторых вариантах осуществления молекула конъюгата BP-NA представляет собой нуклеиновую кислоту, такую как, например, аптамерная нуклеиновая кислота. Как используется в данном документе, ʺаптамерная нуклеиновая кислотаʺ относится к малым молекулам РНК или ДНК, которые могут образовывать вторичные и третичные структуры, способные к специфичному связыванию с белками или другими клеточными мишенями (см., например, Ni X, et al. Curr Med Chem. 18(27): 4206-4214, 2011). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления конъюгат BP-NA может представлять собой конъюгат аптамер-нуклеиновая кислота.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения для идентификации и мечения мишеней применяются распознающие мишень компоненты. Распознающие мишень компоненты представляют собой средства, которые специфически распознают представляющие интерес мишени в образце. Примеры распознающих мишень компонентов включают партнеров по связыванию, таких как перечисленные в данном документе. Распознающие мишень компоненты включают антитела, фрагменты антител и производные антител, такие как одноцепочечные антитела, домены одноцепочечного Fv, домены Fab, нанотела и т.п., пептиды, аптамеры и олигонуклеотиды (например, для выявления представляющих интерес нуклеиновых кислот в процедурах, таких как флуоресцентная гибридизация in situ или FISH).

Нуклеиновые кислоты для докинга, такие как докинг-цепи

Определенные варианты осуществления настоящего изобретения могут относится к нуклеиновым кислотам для докинга. Нуклеиновые кислоты для докинга включают докинг-цепи, описанные в данном документе. Нуклеиновые кислоты для докинга представляют собой линейные нуклеиновые кислоты, способные к связыванию с нуклеиновой кислотой с комплементарной последовательностью (такой, как визуализирующая нуклеиновая кислота). Нуклеиновая кислота для докинга может содержать ДНК, РНК или структуры, подобные нуклеиновым кислотам, с другими сахарофосфатными остовами (например, 2'-O-метил-РНК, 2'-фтор-РНК, LNA, XNA) или остовами, содержащими компоненты, отличные от сахарофосфатных (например, пептидную нуклеиновую кислоту и морфолино), или может состоять из них. Нуклеотидные основания могут включать встречающиеся в природе нуклеотидные основания, такие как аденин, тимин, гуанин, цитозин, инозин и их производные, а также не встречающиеся в природе нуклеотидные основания, такие как isoC, isoG, dP и dZ. Нуклеиновая кислота для докинга, не будучи связанной с комплементарной ей визуализирующей нуклеиновой кислотой, может быть одноцепочечной без стабильной вторичной структуры. В альтернативном случае нуклеиновая кислота для докинга может иметь вторичную структуру, такую как петля шпильки (ФИГ. 7, верхняя часть). Нуклеиновая кислота для докинга может быть частью многоцепочечного комплекса (ФИГ. 7, нижняя часть).

Как используется в данном документе, ʺдокинг-цепьʺ относится к одноцепочечной нуклеиновой кислоте (например, ДНК), способной к стабильному связыванию с комплементарными ей визуализирующими цепями. Стабильное связывание может проистекать из длины докинг-цепи (и, напротив, визуализирующей цепи) или может проистекать из определенных условий, при которых происходит гибридизация (например, концентрации соли, температуры и т.п.). В некоторых вариантах осуществления докинг-цепь имеет длину от приблизительно 20 до приблизительно 60 или более нуклеотидов. Докинг-цепь может быть способна к связыванию с одной или несколькими идентичными визуализирующими цепями (с идентичными последовательностями и идентично мечеными).

Визуализирующие нуклеиновые кислоты, такие как визуализирующие цепи

Определенные варианты осуществления настоящего изобретения могут относится к визуализирующим нуклеиновым кислотам. Визуализирующие нуклеиновые кислоты включают визуализирующие цепи, описанные в данном документе. Визуализирующие нуклеиновые кислоты представляют собой нуклеиновые кислоты, которые могут (1) взаимодействовать с нуклеиновой кислотой для докинга специфично к последовательности посредством комплементарности и (2) привлекать испускающий сигнал компонент или несколько копий испускающих сигнал компонентов посредством ковалентных или нековалентных взаимодействий. Визуализирующие нуклеиновые кислоты могут быть линейными или разветвленными, как описано в данном документе. Одна визуализирующая нуклеиновая кислота может привлекать несколько копий испускающего сигнал компонента посредством полимерной (ФИГ. 8, верхняя часть) или дендримерной структуры (ФИГ. 8, нижняя часть). Например, полимерную или дендримерную структуру можно синтезировать химическим путем с применением способов, таких как обсуждаемые в Nazemi A. et al. Chemistry of Bioconjugates: Synthesis, Characterization, and Biomedical Applications, опубликованной в режиме онлайн 13 февраля 2014 года) и литературных источниках, приведенных в ней. В альтернативном случае полимерную или дендримерную структуру можно образовать посредством гибридизации ДНК, как показано, например, в Dirks R. et al. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 2004;1010(43):15275-78; и в Um S.H. et al. Nat. Protocols 2006;1:995-1000, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки.

Визуализирующая нуклеиновая кислота может содержать ДНК, РНК или структуры, подобные нуклеиновым кислотам, с другими сахарофосфатными остовами (например, 2'-O-метил-РНК, 2'-фтор-РНК, LNA, XNA) или остовами, содержащими компоненты, отличные от сахарофосфатных (например, пептидную нуклеиновую кислоту и морфолино), или может состоять из них. Нуклеотидные основания могут включать встречающиеся в природе нуклеотидные основания, такие как аденин, тимин, гуанин, цитозин, инозин и их производные, а также не встречающиеся в природе нуклеотидные основания, такие как isoC, isoG, dP и dZ.

В некоторых вариантах осуществления визуализирующая нуклеиновая кислота имеет длину от приблизительно 30 до приблизительно 60 нуклеотидов или более, включая длину 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления визуализирующая нуклеиновая кислота имеет длину от 30 до 40, от 30 до 50, от 40 до 50, от 40 до 60 или от 50 до 60 нуклеотидов.

Визуализирующая нуклеиновая кислота, не будучи связанной с комплементарной ей нуклеиновой кислотой для докинга, может быть одноцепочечной без стабильной вторичной структуры. В альтернативном случае визуализирующая нуклеиновая кислота может иметь вторичную структуру, такую как петля шпильки (ФИГ. 9, верхняя часть). Визуализирующая нуклеиновая кислота может быть частью многоцепочечного комплекса (ФИГ. 9, нижняя часть).

В некоторых вариантах осуществления визуализирующая цепь может обладать свойством самогашения, что означает, что несвязанная визуализирующая нуклеиновая кислота может нести компонент-гаситель, который находится в непосредственной близости с испускающим сигнал компонентом, таким как флуорофор. Для достижения этого визуализирующую нуклеиновую кислоту можно сконструировать таким образом, чтобы она принимала структуру по типу молекулярного маяка (ФИГ. 5) либо структуру полудуплекса (ФИГ. 6).

Этот вариант, обладающий свойством самогашения, можно применять с целью уменьшения фонового сигнала и/или избегания стадии отмывки. Дополнительно или альтернативно, буфер для связывания и визуализации может содержать добавки, которые обычно применяемые в FISH, нозерн-блоттинге и Саузерн-блоттинге (например, отрицательно заряженные полимеры, такие как сульфат декстрана и гепарин) с целью уменьшения неспецифического связывания.

ʺИспускающий сигнал компонентʺ, как используется в данном документе, представляет собой компонент, который при определенных условиях испускает детектируемый сигнал, такой как фотон, излучение, позитрон, электромагнитная волна и ядерный магнитный резонанс.

Как используется в данном документе, ʺвизуализирующая цепьʺ представляет собой одноцепочечную нуклеиновую кислоту (например, ДНК), которая имеет длину от приблизительно 30 до приблизительно 60 нуклеотидов или более. Визуализирующая цепь согласно настоящему изобретению комплементарна докинг-цепи и стабильно связывается с докинг-цепью. Стабильное связывание означает, что визуализирующая цепь и докинг-цепь остаются связанными друг с другом на протяжении анализа или по меньшей мере в течение 30 минут, или по меньшей мере в течение 60 минут, или по меньшей мере в течение 2 часов, или дольше. Такое связывание может быть или может не быть обратимым или необратимым.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота для докинга считается стабильно связанной с визуализирующей нуклеиновой кислотой, такой как визуализирующая цепь, если нуклеиновые кислоты остаются связанными друг с другом в течение (или по меньшей мере в течение) 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут (мин). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота для докинга считается стабильно связанной с визуализирующей нуклеиновой кислотой, если нуклеиновые кислоты остаются связанными друг с другом в течение (или по меньшей мере в течение) от 30 до 60 мин, от 30 до 120 мин, от 40 до 60 мин, от 40 до 120 мин или от 60 до 120 мин. Такое связывание может быть или может не быть обратимым или может быть или может не быть необратимым.

Как используется в данном документе, ʺсвязываниеʺ относится к объединению по меньшей мере двух молекул вследствие, например, электростатических, гидрофобных, ионных взаимодействий и/или взаимодействий по типу водородных связей необязательно при физиологических условиях.

Две нуклеиновые кислоты или два домена нуклеиновых кислот являются ʺкомплементарнымиʺ друг другу, если они образуют пары оснований или связываются друг с другом с образованием двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты посредством уотсон-криковских взаимодействий.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению, такие как нуклеиновые кислоты для докинга и визуализирующие нуклеиновые кислоты, связываются друг с другом с ʺполной комплементарностьюʺ, что относится к 100% комплементарности (например, 5' - ATTCGC - 3' полностью комплементарна 5' - GCGAAT - 3').

Визуализирующие цепи согласно настоящему изобретению могут быть меченными детектируемой меткой (например, флуоресцентной меткой, и, следовательно, считаются ʺфлуоресцентно меченнымиʺ). Например, в некоторых вариантах осуществления визуализирующая цепь может содержать по меньшей мере один (т.е. один или несколько) флуорофор. Примеры флуорофоров для применения в соответствии с настоящим изобретением включают, без ограничения, производные ксантена (например, флуоресцеин, родамин, Oregon Green, эозин и техасский красный), производные цианина (например, цианин, индокарбоцианин, оксакарбоцианин, тиакарбоцианин и мероцианин), производные нафталина (например, дансил и производные продана), производные кумарина, производные оксадиазола (например, пиридилоксазол, нитробензоксадиазол и бензоксадиазол), производные пирена (например, Cascade Blue), производные оксазина (например, нильский красный, нильский синий, крезиловый фиолетовый и оксазин 170), производные акридина (например, профлавин, акридиновый оранжевый и акридиновый желтый), производные арилметина (например, аурамин, кристаллический фиолетовый и малахитовый зеленый) и производные тетрапирролов (например, порфин, фталоцианин и билирубин).

Визуализирующие нуклеиновые кислоты, в том числе визуализирующие цепи, могут быть ковалентно меченными детектируемыми метками, такими как перечисленные в данном документе или известные из уровня техники. В некоторых случаях визуализирующие нуклеиновые кислоты, в том числе визуализирующие цепи, могут содержать 2, 3, 4 или более детектируемых меток, таких как флуорофоры.

Ортогональные визуализирующие нуклеиновые кислоты, в том числе визуализирующие цепи, могут содержать разные метки (например, красный флуорофор, синий флуорофор или зеленый флуорофор), или они все могут содержать одинаковые метки (например, красные флуорофоры), даже если они отличаются по нуклеотидной последовательности.

Распознающие мишень компоненты, меченные последовательностями, такие как конъюгаты партнера по связыванию и докинг-цепи

Конъюгаты BP-NA (например, конъюгаты белок-нуклеиновая кислота) согласно настоящему изобретению могут в некоторых вариантах осуществления содержать промежуточный линкер, который соединяет (например, ковалентно или нековалентно) партнера по связыванию с докинг-цепью. Промежуточный линкер может содержать биотин и/или стрептавидин. Например, в некоторых вариантах осуществления каждое из антитела и докинг-цепи может быть биотинилированным (т.е. соединенным по меньшей мере с одной молекулой биотина) и соединенным с другим из них посредством связывания биотина с промежуточной молекулой стрептавидина. В соответствии с настоящим изобретением можно применять другие промежуточные линкеры. В некоторых вариантах осуществления, таких как те, в которых молекулой является нуклеиновая кислота, промежуточный линкер может не требоваться. Например, докинг-цепь конъюгата BP-NA может являться выступающим концом (например, 5′- или 3′-выступающим концом) молекулы нуклеиновой кислоты, такой как, например, аптамерная нуклеиновая кислота. Аналогичные подходы можно применять для получения распознающих мишень компонентов, меченных последовательностями, предусмотренных в данном документе.

В данном документе предусмотрены множества конъюгатов BP-NA (например, конъюгатов белок-нуклеиновая кислота) и визуализирующих цепей. Множество может представлять собой группу из одного и того же вида или разных видов. Множество конъюгатов BP-NA одного и того же вида может содержать конъюгаты, все из которых связываются с одной и той же мишенью (например, биологической молекулой) (например, одним и тем же эпитопом или участком/доменом). Напротив, множество разных видов конъюгатов BP-NA может содержать конъюгаты или подмножества конъюгатов, при этом каждый конъюгат или подмножество конъюгатов связывается с отличным от других эпитопом на одной и той же мишени или с отличной от других мишенью. Множество визуализирующих цепей одного и того же вида может содержать визуализирующие цепи с одинаковыми нуклеотидными последовательностями и одинаковыми флуоресцентными метками (например, Cy2, Cy3 или Cy4). Напротив, множество визуализирующих цепей разных видов может содержать визуализирующие цепи с разными нуклеотидными последовательностями (например, последовательностями ДНК) и разными флуоресцентными метками (например, Cy2, Cy3 или Cy4) или с разными нуклеотидными последовательностями и одинаковыми флуоресцентными метками (например, все с Cy2). Количество разных видов в указанном множестве конъюгатов BP-NА ограничено количеством партнеров по связыванию (например, антител) и количеством докинг-цепей с различными нуклеотидными последовательностями (и, следовательно, комплементарных визуализирующих цепей). В некоторых вариантах осуществления множество конъюгатов BP-NА (например, конъюгатов белок-нуклеиновая кислота) содержит по меньшей мере 10, 50, 100, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 10⁴, 50000, 10⁵, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹ конъюгатов BP-NА. Аналогично, в некоторых вариантах осуществления множество флуоресцентно меченных визуализирующих цепей содержит по меньшей мере 10, 50, 100, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 10⁴, 50000, 10⁵, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹ флуоресцентно меченных визуализирующих цепей. В некоторых вариантах осуществления множество может содержать от 1 до приблизительно 200 или более разных видов конъюгатов BP-NА и/или визуализирующих цепей. Например, множество может содержать по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200 или более разных видов. В некоторых вариантах осуществления множество может содержать менее чем от приблизительно 5 до приблизительно 200 разных видов конъюгатов BP-NА и/или визуализирующих цепей. Например, множество может содержать менее 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175 или 200 разных видов. Эти варианты осуществления применимы к распознающим мишень компонентам, меченным последовательностями, предусмотренным в данном документе.

Инактивация сигнала или визуализирующей нуклеиновой кислоты

Для достижения инактивации визуализирующей нуклеиновой кислоты в некоторых способах, предусмотренных в данном документе, визуализирующие нуклеиновые кислоты, в том числе визуализирующие цепи, можно удалять от распознающих мишень компонентов, в том числе партнеров по связыванию (ФИГ. 3), с помощью таких способов, как, без ограничения, повышение температуры; снижение концентрации противоионов (например, свободных Mg++); введение или повышение концентрации денатурантов (например, формамида, мочевины, DMSO и т.п.) и химическое, фотохимическое или ферментативное расщепление, модификация или разрушение визуализирующей цепи или любая их комбинация.

Для достижения инактивации визуализирующей нуклеиновой кислоты в некоторых способах, предусмотренных в данном документе, визуализирующие нуклеиновые кислоты, в том числе визуализирующие цепи, можно инактивировать посредством удаления и/или модификации испускающего сигнал компонента без полного удаления части визуализирующей нуклеиновой кислоты, представляющей собой нуклеиновую кислоту, от докинг-цепей. (ФИГ. 4.)

В качестве примера, удаление визуализирующей нуклеиновой кислоты можно обеспечить путем расщепления визуализирующей цепи на несколько частей. В некоторых вариантах осуществления визуализирующая нуклеиновая кислота содержит химически расщепляемый компонент, который можно расщепить путем введения химического соединения, которое действует на такой расщепляемый компонент. Примеры таких химически расщепляемых компонентов включают, без ограничения, аллильные группы, которые можно расщепить с помощью определенных реагентов на основе Pd (Ju J. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Dec 26;103(52):19635-40, включена в данный документ посредством ссылки); азидогруппы, которые можно расщепить с помощью определенных реагентов на основе фосфора, таких как TCEP (Guo J et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Jul 8;105(27):9145-50, включена в данный документ посредством ссылки); мостиковые фосфоротиолаты, которые можно расщепить с помощью реагентов на основе серебра (Mag M. et al. Nucleic Acids Res. 1991 Apr 11;19(7):1437-41, включена в данный документ посредством ссылки); дисульфидные связи, которые можно расщепить с помощью восстановителей, таких как DTT и TCEP; и рибозу, которую можно расщепить с помощью различных нуклеофильных реагентов, таких как гидроксид и имидазол.

В некоторых вариантах осуществления визуализирующая нуклеиновая кислота содержит фоторасщепляемый линкер, который можно расщепить фотохимически (например, путем воздействия UV-излучением). В некоторых вариантах осуществления визуализирующая нуклеиновая кислота содержит компонент, который можно расщепить с помощью фермента. Примеры таких ферментативно расщепляемых компонентов включают, без ограничения, рибонуклеотиды, которые можно расщепить с помощью различных РНКаз; дезоксиуридины, которые можно расщепить с помощью комбинаций ферментов, таких как USER (New England Biolabs); и сайты рестрикции, которые можно расщепить с помощью специфичных к последовательности ферментов, вносящих одноцепочечный разрыв, или ферментов рестрикции. В некоторых вариантах осуществления фермент рестрикции может расщеплять как визуализирующую нуклеиновую кислоту, так и нуклеиновую кислоту для докинга. В еще нескольких других вариантах осуществления удаление визуализирующей нуклеиновой кислоты можно обеспечить путем модификации визуализирующей нуклеиновой кислоты с получением формы, которая связывается с нуклеиновой кислотой для докинга с образованием дуплекса с пониженной стабильностью (или более низкой температурой плавления).

В качестве примера, визуализирующая нуклеиновая кислота содержит азобензол, который можно подвергнуть фотоизомеризации, где разные изомеры по-разному воздействуют на силу связывания визуализирующей нуклеиновой кислоты с нуклеиновой кислотой для докинга (Asanuma H. et al. Angew Chem Int Ed Engl. 2001 Jul 16;40(14):2671-2673, включена в данный документ посредством ссылки). В некоторых вариантах осуществления визуализирующая нуклеиновая кислота содержит дезоксиуридин, в котором урациловую группу можно расщепить с помощью урацил-ДНК-гликозилазы. После удаления урацила сила связывания визуализирующей цепи ослабевает.

В альтернативном случае удаления испускающего сигнал компонента можно достичь путем расщепления линкера между визуализирующей нуклеиновой кислотой и испускающим сигнал компонентом, если такой линкер существует. Для этих целей можно также применять химические соединения, описанные в данном документе.

Инактивации испускающего сигнал компонента можно достичь путем химической или фотохимической модификации испускающего сигнал компонента. Например, если испускающим сигнал компонентом является флуорофор, его можно обесцветить с помощью химических средств (таких как, например, пероксид водорода, Gerdes M. et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Jul 16;110(29):11982-87, включена в данный документ посредством ссылки) или подвергнуть фотообесцвечиванию (например, с применением мягкого многоволнового возбуждения, описанного в Schubert W. et al. Nat. Biotech. 2006;24:1270-78, включена в данный документ посредством ссылки).

Как будет понятно в данной области техники, ʺфотообесцвечиваниеʺ относится к такому фотохимическому изменению молекулы красителя или флуорофора, при котором она неспособна к флуоресценции. Это обусловлено расщеплением ковалентных связей или неспецифическими реакциями между флуорофором и окружающими молекулами. Потерю активности, обусловленную фотообесцвечиванием, можно в некоторых вариантах осуществления регулировать путем уменьшения интенсивности или продолжительности воздействия света, путем повышения концентрации флуорофоров, путем уменьшения частоты и, следовательно, энергии фотонов входного светового потока или путем использования более стойких флуорофоров, которые в меньшей степени подвержены обесцвечиванию (например, Alexа Fluor или DyLight Fluor). См., например, Ghauharali R. et al. Journal of Microscopy 2001;198: 88-100; и Eggeling C. et al. Analytical Chemistry 1998;70:2651-59.

Таким образом, фотообесцвечивание можно применять для удаления, модификации испускающего сигнал компонента или в некоторых случаях гашения сигнала от него. Фотообесцвечивание можно проводить путем воздействия на флуорофоры светом определенной длины волны с подходящей длиной волны, энергией и продолжительностью для непрерывного и необратимого тушения способности флуорофора к испусканию дополнительного сигнала. Методики фотообесцвечивания известны из уровня техники.

Было также обнаружено, что в отличие от антител, которые, как правило, могут связываться со своими мишенями в широком диапазоне температур ниже физиологической температуры (т.е. от 0°C до 37°C) и могут переносить незначительное изменение концентрации соли (т.е. концентрация моновалентного катиона составляет от 10 мМ до 1 M; двухвалентного катиона от 0 до 10 мМ), сродство гибридизации короткой нуклеиновой кислоты зависит от температуры и концентрации соли. Например, прогнозируемая константа диссоциации (с применением набора параметров, изложенных в литературном источнике PMID 15139820) между ssDNA 5'-CATCTAAAGCC-3' и обратно комплементарной ей цепью 5'-GGCTTTAGATG-3' составляет ~90 пM при 23°C при концентрации 500 мМ [Na+] и 10 мМ [Mg++]. Другими словами, при таких условиях связывание является очень сильным. Прогнозируемая константа диссоциации для этой пары ssDNA составляет до ~500 нM при 37°C при 150 мМ [Na+] и 0 мМ [Mg++]. Другими словами, при таких условиях связывание является довольно слабым. Константы диссоциации при этих двух наборах условий изменяются почти на 4 порядка величины, даже несмотря на то, что для большинства антител ожидается сильное связывание со своими мишенями при обоих наборах условий. Аналогичные тенденции наблюдаются и для других последовательностей ДНК (ФИГ. 10). В качестве дополнительного примера, условия визуализации могут представлять собой 23°C при 500 мМ [Na+] и 10 мМ [Mg++], а условия инактивации красителя могут представлять собой 37°C при 150 мМ [Na+] и 0 мМ [Mg++].

В некоторых вариантах осуществления анализируемый образец представляет собой культивируемые клетки, срезы тканей или другие образцы от живых организмов.

В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой диссоциированные клетки, иммобилизованные на твердой поверхности (например, на предметном стекле или покровном стекле), в том числе иммобилизованные по отдельности. Например, образец может представлять собой клетки в крови. Например, образец может содержать раковые клетки, циркулирующие в крови (также известные, как циркулирующие раковые клетки или CTC). Образец может представлять собой клетки, растущие в суспензии. Образец может представлять собой клетки, диссеминированные из твердой ткани.

Образец

ʺОбразецʺ может содержать клетки (или клетку), ткань или биологическую жидкость, такую как кровь (сыворотка и/или плазма), моча, сперма, лимфатическая жидкость, спинномозговая жидкость или амниотическая жидкость. Образец может быть получен из (происходить из) любого источника, включающего, без ограничения, людей, животных, бактерии, вирусы, микроорганизмы и растения. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой клеточный лизат или тканевой лизат. Образец может также содержать смеси материала из одного источника или разных источников. Образец может находиться в определенной пространственной области или объеме (например, в сетке на биочипе или в лунке в планшете или чашке). Образец в некоторых вариантах осуществления включает мишень(мишени), конъюгат(конъюгаты) BP-NА и визуализирующую(визуализирующие) цепь(цепи). Клетки могут представлять собой диссеминированные (или диссоциированные) клетки.

Мишень

ʺМишеньʺ представляет собой любой компонент, желаемый для наблюдения или количественного определения, и для которого существует партнер по связыванию. Мишень в некоторых вариантах осуществления может быть не встречающейся в природе. Мишень в некоторых вариантах осуществления может представлять собой биологическую молекулу. Как используется в данном документе, ʺбиологическая молекулаʺ представляет собой любую молекулу, вырабатываемую живым организмом, в том числе крупные макромолекулы, такие как белки, полисахариды, липиды и нуклеиновые кислоты (например, ДНК и РНК, такие как мРНК), а также малые молекулы, такие как первичные метаболиты, вторичные метаболиты и природные продукты. Примеры биологических молекул включают, без ограничения, ДНК, РНК, кДНК или ДНК-продукт РНК, подвергнутой обратной транскрипции, A23187 (кальцимицин, кальциевый ионофор), абамектин, абиетиновую кислоту, уксусную кислоту, ацетилхолин, актин, актиномицин D, аденозин, аденозиндифосфат (ADP), аденозинмонофосфат (AMP), аденозинтрифосфат (ATP), аденилатциклазу, адонит, адреналин, эпинефрин, адренокортикотропный гормон (ACTH), экворин, афлатоксин, агар, аламетицин, аланин, альбумины, альдостерон, алейрон, альфа-аманитин, аллантоин, аллетрин, α-аманатин, аминокислоту, амилазу, анаболический стероид, анетол, ангиотензиноген, анизомицин, антидиуретический гормон (ADH), арабинозу, аргинин, аскомицин, аскорбиновую кислоту (витамин C), аспарагин, аспарагиновую кислоту, асимметричный диметиларгинин, предсердный натрийуретический пептид (ANP), ауксин, авидин, азадирактин A - C35H44O16, бактериоцин, биуверицин, бикукуллин, билирубин, биополимер, биотин (витамин H), брефелдин A, брассинолид, бруцин, кадаверин, кофеин, кальциферол (витамин D), кальцитонин, кальмодулин, кальмодулин, кальретикулин, камфору - (C10H16O), каннабинол, капсаицин, карбогидразу, углевод, карнитин, каррагинан, казеин, каспазу, целлюлазу, целлюлозу - (C6H10O5), церуленин, бромид цетримония (цетримид) - C19H42BrN, хелеритрин, хромомицин A3, шаперонин, хитин, α-хлоралозу, хлорофилл, холецистокинин (CCK), холестерин, холин, хондроитинсульфат, коричный альдегид, цитраль, лимонную кислоту, цитринин, цитронеллаль, цитронеллол, цитруллин, кобаламин (витамин B12), кофермент, кофермент Q, колхицин, коллаген, кониин, кортикостероид, кортикостерон, кортикотропин-высвобождающий гормон (CRH), кортизол, креатин, креатинкиназу, кристаллин, α-циклодекстрин, циклодекстрингликозилтрансферазу, циклопамин, циклопиазоновую кислоту, цистеин, цистин, цитидин, цитохалазин, цитохалазин E, цитохром, цитохром c, цитохром c-оксидазу, цитохром c-пероксидазу, цитокин, цитозин - C4H5N3O, дезоксихолевую кислоту, DON (дезоксиниваленол), дезоксирибофуранозу, дезоксирибозу, дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), декстран, декстрин, ДНК, дофамин, фермент, эфедрин, эпинефрин - C9H13NO3, эруковую кислоту - CH3(CH2)7CH=CH(CH2)11COOH, эритрит, эритропоэтин (EPO), эстрадиол, эвгенол, жирную кислоту, фибрин, фибронектин, фолиевую кислоту (витамин M), фолликулостимулирующий гормон (FSH), формальдегид, муравьиную кислоту, Formnoci, фруктозу, фумонизин B1, гамма-глобулин, галактозу, гамма-глобулин, гамма-аминомасляную кислоту, гамма-бутиролактон, гамма-гидроксибутират (GHB), гастрин, желатин, гераниол, глобулин, глюкагон, глюкозамин, глюкозу - C6H12O6, глюкозооксидазу, глютен, глутаминовую кислоту, глутамин, глутатион, глютен, глицерин (глицерол), глицин, гликоген, гликолевую кислоту, гликопротеин, гонадотропин-высвобождающий гормон (GnRH), гранзим, зеленый флуоресцентный белок, гормон роста, гормон, высвобождающий гормон роста (GHRH), ГТФазу, гуанин, гуанозин, гуанозинтрифосфат (+GTP), гаптоглобин, гематоксилин, гем, гемэритрин, гемоцианин, гемоглобин, гемопротеин, гепарансульфат, липопротеин высокой плотности, HDL, гистамин, гистидин, гистон, гистонметилтрансферазу, HLA-антиген, гомоцистеин, гормон, хорионический гонадотропин человека (hCG), гормон роста человека, гиалуронат, гиалуронидазу, пероксид водорода, 5-гидроксиметилцитозин, гидроксипролин, 5-гидрокситриптамин, краситель индиго, индол, инозин, инозит, инсулин, инсулиноподобный фактор роста, интегральный мембранный белок, интегразу, интегрин, интеин, интерферон, инулин, иономицин, ионон, изолейцин, железосерный кластер, K252a, K252b, KT5720, KT5823, кератин, киназу, лактазу, молочную кислоту, лактозу, ланолин, лауриновую кислоту, лептин, лептомицин B, лейцин, лигнин, лимонен, линалоол, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, липазу, липид, белок, заякоренный липидом, липоамид, липопротеин, липопротеин низкой плотности, LDL, лютеинизирующий гормон (LH), ликопин, лизин, лизоцим, яблочную кислоту, мальтозу, мелатонин, мембранный белок, металлопротеин, металлотионеин, метионин, мимозин, митрамицин A, митомицин C, мономер, микофеноловую кислоту, миоглобин, миозин, природные фенолы, нуклеиновую кислоту, охратоксин A, эстрогены, олигопептид, олигомицин, орцин, орексин, орнитин, щавелевую кислоту, оксидазу, окситоцин, p53, PABA, паклитаксел, пальмитиновую кислоту, пантотеновую кислоту (витамин B5), паратиреоидный гормон (PTH), парапротеин, пардаксин, партенолид, патулин, паксиллин, пенициллиновую кислоту, пенициллин, пенитрем A, пептидазу, пепсин, пептид, перимицин, периферический мембранный белок, перозамин, фенэтиламин, фенилаланин, фосфаген, фосфатазу, фосфолипид, фенилаланин, фитиновую кислоту, растительные гормоны, полипептид, полифенолы, полисахариды, порфирин, прион, прогестерон, пролактин (PRL), пролин, пропионовую кислоту, протамин, протеазу, белок, протеиноид, путресцин, пиретрин, пиридоксин или пиридоксамин (витамин B6), пирролизин, пировиноградную кислоту, хинон, радицикол, раффинозу, ренин, ретиналь, ретинол (витамин A), родопсин (зрительный пурпур), рибофлавин (витамин B2), рибофуранозу, рибозу, рибозим, рицин, РНК - рибонуклеиновую кислоту, RuBisCO, сафрол, салициловый альдегид, салициловую кислоту, сальвинорин A - C23H28O8, сапонин, секретин, селеноцистеин, селенометионин, селенопротеин, серин, сериновую киназу, серотонин, скатол, частицу узнавания сигнала, соматостатин, сорбиновую кислоту, сквален, стауроспорин, стеариновую кислоту, стеригматоцистин, стерол, стрихнин, сахарозу (сахар), сахара (в целом), супероксид, токсин T2, дубильную кислоту, таннин, винную кислоту, таурин, тетродотоксин, тауматин, топоизомеразу, тирозинкиназу, таурин, тестостерон, тетрагидроканнабинол (THC), тетродотоксин, тапсигаргин, тауматин, тиамин (витамин B1) -C12H17ClN4OS•HCl, треонин, тромбопоэтин, тимидин, тимин, триасцин C, тиреостимулирующий гормон (TSH), тиреотропин-высвобождающий гормон (TRH), тироксин (T4), токоферол (витамин E), топоизомеразу, трийодтиронин (T3), трансмембранный рецептор, трихостатин A, трофический гормон, трипсин, триптофан, тубулин, туникамицин, тирозин, убиквитин, урацил, мочевину, уреазу, мочевую кислоту - C5H4N4O3, уридин, валин, валиномицин, ванабины, вазопрессин, веррукулоген, витамины (в целом), витамин A (ретинол), витамин B, витамин B1 (тиамин), витамин B2 (рибофлавин), витамин B3 (ниацин или никотиновую кислоту), витамин B4 (аденин), витамин B5 (пантотеновую кислоту), витамин B6 (пиридоксин или пиридоксамин), витамин B12 (кобаламин), витамин C (аскорбиновую кислоту), витамин D (кальциферол), витамин E (токоферол), витамин F, витамин H (биотин), витамин K (нафтохинон), витамин M (фолиевую кислоту), вортманнин и ксилозу.

В некоторых вариантах осуществления мишень может представлять собой белок-мишень, такой как, например, белки клеточной среды (например, внутриклеточные или мембранные белки). Примеры белков включают, без ограничения, фибриллярные белки, такие как белки цитоскелета (например, актин, arp2/3, коронин, дистрофин, FtsZ, кератин, миозин, небулин, спектрин, тау-белок, титин, тропомиозин, тубулин и коллаген) и белки внеклеточного матрикса (например, коллаген, эластин, f-спондин, пикачурин и фибронектин); глобулярные белки, такие как белки плазмы (например, сывороточный амилоидный Р-компонент и сывороточный альбумин), факторы свертывания крови (например, белки системы комплемента, C1-ингибитор и C3-конвертазу, фактор VIII, фактор XIII, фибрин, белок C, белок S, белок Z, белок Z-зависимый ингибитор протеаз, тромбин, фактор фон Виллебранда) и белки острой фазы, такие как C-реактивный белок; гемопротеины; белки клеточной адгезии (например, кадгерин, эпендимин, интегрин, Ncam и селектин); белки трансмембранного транспорта (например, CFTR, гликофорин D и скрамблазу), такие как ионные каналы (например, лиганд-управляемые ионные каналы, такие как никотиновые ацетилхолиновые рецепторы и GABAa-рецепторы, и потенциалзависимые ионные каналы, такие как калиевые, кальциевые и натриевые каналы), белки синпорта/антипорта (например, переносчик глюкозы); гормоны и факторы роста (например, эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), пептидные гормоны, такие как инсулин, инсулиноподобный фактор роста и окситоцин, и стероидные гормоны, такие как андрогены, эстрогены и прогестероны); рецепторы, так как трансмембранные рецепторы (например, рецептор, сопряженный с G-белком, родопсин) и внутриклеточные рецепторы (например, рецептор эстрогена); ДНК-связывающие белки (например, гистоны, протамины, белок Ci); регуляторы транскрипции (например, c-Myc, FOXP2, FOXP3, MyoD и P53); белки иммунной системы (например, иммуноглобулины, антигены главного комплекса гистосовместимости и T-клеточные рецепторы); белки запаса/транспорта питательных веществ (например, ферритин); белки-шапероны и ферменты.

В некоторых вариантах осуществления мишень может представлять собой нуклеиновую кислоту-мишень, такую как, например, нуклеиновые кислоты клеточной среды. Как используется в данном документе по отношению к мишеням, докинг-цепям и визуализирующим цепям, ʺнуклеиновая кислотаʺ относится к полимерной форме нуклеотидов, таких как дезоксирибонуклеотиды или рибонуклеотиды или их аналоги, любой длины. Например, нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК, РНК или ДНК-продукт РНК, подвергнутой обратной транскрипции. Неограничивающие примеры нуклеиновых кислот включают кодирующие или некодирующие участки гена или фрагмента гена, локусы (локус), определенные с помощью анализа групп сцепления, экзоны, интроны, матричную РНК (мРНК), транспортную РНК, рибосомальную РНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные нуклеиновые кислоты, разветвленные нуклеиновые кислоты, плазмиды, векторы, выделенную ДНК с любой последовательностью, выделенную РНК с любой последовательностью, зонды на основе нуклеиновых кислот и праймеры. Другие примеры нуклеиновых кислот включают, без ограничения, кДНК, аптамеры, пептидные нуклеиновые кислоты (ʺPNAʺ), ДНК, образованная 2'-5'-связями (синтетическое вещество с укороченным остовом, имеющее расстояние между соседними парами оснований, соответствующее А-конформации ДНК; ДНК, образованная 2'-5'-связями, обычно не гибридизируется с ДНК в B-форме, но легко гибридизируется с РНК), закрытые нуклеиновые кислоты (ʺLNAʺ) и нуклеиновые кислоты с модифицированными остовами (например, формы встречающихся в природе нуклеиновых кислот с модификацией оснований или сахарного остатка). Нуклеиновая кислота может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов (ʺаналогичныеʺ формы пуринов и пиримидинов хорошо известны из уровня техники). Модификации структуры нуклеотида при наличии таковых можно вносить до или после сборки полимера. Нуклеиновая кислота может представлять собой одноцепочечную, двухцепочечную, частично одноцепочечную или частично двухцепочечную ДНК или РНК.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота (например, нуклеиновая кислота-мишень) является встречающейся в природе. Как используется в данном документе ʺвстречающийся в природеʺ относится к нуклеиновой кислоте, которая присутствует в организмах или вирусах, существующих в природе, при отсутствии вмешательства человека. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота встречается в природе в организме или вирусе. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота представляет собой геномную ДНК, матричную РНК, рибосомальную РНК, микроРНК, премикроРНК, промикроРНК, вирусную ДНК, вирусную РНК или РНК, взаимодействующую с Piwi. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота-мишень не является синтетической ДНК-наноструктурой (например, двухмерной (2-D) или трехмерной (3-D) ДНК-наноструктурой, которая содержит две или более нуклеиновых кислот, гибридизированных между собой посредством уотсон-криковских взаимодействий с образованием 2-D- или 3-D-наноструктуры).

Докинг-цепи и визуализирующие цепи нуклеиновых кислот, описанные в данном документе, могут представлять собой любую из нуклеиновых кислот, описанных выше (например, ДНК, РНК, модифицированные нуклеиновые кислоты, аналоги нуклеиновых кислот, встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты, синтетические нуклеиновые кислоты).

Композиции

В данном документе предусмотрены композиции, которые содержат по меньшей мере один или по меньшей мере два (например, множество) конъюгата BP-NА (например, конъюгат(конъюгаты) белок-нуклеиновая кислота) согласно настоящему изобретению. Конъюгаты BP-NА могут быть связаны с представляющей интерес мишенью (например, биологической молекулой) и/или стабильно связаны с комплементарной флуоресцентно меченной визуализирующей цепью. Композиция может содержать множество конъюгатов BP-NА одного и того же вида или разных видов. В некоторых вариантах осуществления композиция может содержать по меньшей мере 10, 50, 100, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 10⁴, 50000, 10⁵, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹ конъюгатов BP-NА. В некоторых вариантах осуществления композиция может содержать по меньшей мере 10, 50, 100, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 10⁴, 50000, 10⁵, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹ комплементарных флуоресцентно меченных визуализирующих цепей. В некоторых вариантах осуществления композиция может содержать от 1 до приблизительно 200 или более разных видов конъюгатов BP-NА и/или визуализирующих цепей. Например, композиция может содержать по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200 или более разных видов. В некоторых вариантах осуществления композиция может содержать менее чем от приблизительно 5 до приблизительно 200 разных видов конъюгатов BP-NА и/или визуализирующих цепей. Например, композиция может содержать менее 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175 или 200 разных видов.

Следует понимать, что количество комплементарных флуоресцентно меченных визуализирующих цепей в композиции может быть меньшим, чем количество конъюгатов BP-NА в композиции, равным ему или большим его.

Наборы

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает наборы, содержащие один или несколько компонентов согласно настоящему изобретению. Наборы могут содержать, например, конъюгат BP-NА и/или флуоресцентно меченные визуализирующие цепи. Наборы могут также содержать компоненты для получения конъюгата BP-NА или для мечения визуализирующей цепи. Например, наборы могут содержать партнера по связыванию (например, антитело), докинг-цепи и промежуточные линкеры, такие как, например, молекулы биотина и стрептавидина, и/или визуализирующие цепи. Наборы можно применять для любых целей, очевидных специалистам в данной области, включая описанные выше.

Наборы могут также содержать и другие реагенты, например, буферы для проведения реакций гибридизации. Набор может также содержать инструкции по применению компонентов набора и/или по получению и/или применению конъюгатов BP-NА и/или меченых визуализирующих цепей.

Пути применения

Конъюгаты BP-NА (например, конъюгаты белок-нуклеиновая кислота или конъюгаты антитело-нуклеиновая кислота) согласно настоящему изобретению можно применять, помимо прочего, в любом анализе, в котором применяют существующие технологии выявления мишени.

Как правило, анализы включают анализы на выявление, в том числе диагностические анализы, прогностические анализы, анализы для контроля за пациентом, скрининговые анализы, анализы на выявление средств биологической войны, криминалистические анализы, пренатальные геномные диагностические анализы и т.п. Анализ может представлять собой анализ in vitro или анализ in vivo. Настоящее изобретение предоставляет преимущество в том, что можно одновременно проанализировать много различных мишеней из одного образца с применением способов согласно настоящему изобретению, даже в том случае, когда такие мишени пространственно неразделимы (и, следовательно, пространственно неразличимы), с применением способов визуализации из предшествующего уровня техники. Это позволяет, например, проводить несколько диагностических тестов на одном образце.

Конъюгаты BP-NА можно также применять для простого наблюдения области или участка.

Способы согласно настоящему изобретению можно применять для анализа образцов, полученных или происходящих от пациента, чтобы определить, присутствуют ли клетки патологического типа в образце, и/или определить стадию заболевания. Например, образец крови можно проанализировать согласно любому из способов, описанных в данном документе, с целью определения наличия и/или количества маркеров клеток ракового типа в образце, тем самым диагностируя рак или определяя его стадию.

В альтернативном случае способы, описанные в данном документе, можно применять для диагностики инфекций, вызываемых патогенами, например, инфекций, вызываемых внутриклеточными бактериями и вирусами, путем определения наличия и/или количества маркеров соответственно бактерии или вируса в образце. Таким образом, мишени, выявляемые с помощью композиций и способов согласно настоящему изобретению, могут являться маркерами пациента (такими, как маркер рака) либо маркерами инфекции, вызываемой чужеродным агентом, такими как бактериальные или вирусные маркеры.

Способы количественной визуализации согласно настоящему изобретению можно применять, например, для количественного определения мишеней (например, биологических молекул-мишеней), обилие которых свидетельствует о биологическом статусе или болезненном состоянии (например, маркеров крови, экспрессия которых повышается или понижается по причине болезненного состояния).

Дополнительно, композиции и способы согласно настоящему изобретению можно применять для получения прогностической информации, которая способствует определению курса лечения для пациента. Например, количество конкретного маркера опухоли можно точно подсчитать даже в небольшом образце от пациента. Для определенных заболеваний, таких как рак молочной железы, сверхэкспрессия определенных белков, таких как Her2-neu, указывает на необходимость более интенсивного курса лечения.

Способы согласно настоящему изобретению можно также применять для определения эффекта пертурбации, в том числе химических соединений, мутаций, изменений температуры, гормонов роста, факторов роста, болезни или изменения условий культивирования, в отношении различных мишеней, идентифицируя, таким образом, мишени, наличие, отсутствие или уровни которых свидетельствуют о конкретных биологических статусах. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение применяют для исследования и обнаружения компонентов и путей, связанных с болезненными состояниями. Например, сравнение количеств мишеней, присутствующих в патологической ткани и "нормальной" ткани, позволяет исследовать важные мишени, вовлеченные в заболевание, идентифицируя, таким образом, мишени для изыскания/скрининга новых лекарственных средств-кандидатов, которые можно применять для лечения заболевания.

Анализируемый образец может представлять собой биологический образец, такой как кровь, мокрота, лимфа, слизь, фекальная масса, моча и т.п. Образец может представлять собой образец из окружающей среды, такой как образец воды, образец воздуха, образец пищевого продукта и т.п. Анализ можно проводить с одним или несколькими иммобилизованными компонентами реакции связывания. Таким образом, мишени или конъюгаты BP-NA могут быть иммобилизованными. Анализ можно проводить с одним или несколькими неиммобилизованными компонентами реакции связывания. Анализы могут включать выявление ряда мишеней в образце по существу в одно и то же время ввиду потенциала мультиплексирования, предоставляемого конъюгатами BP-NA и флуоресцентно меченными визуализирующими цепями согласно настоящему изобретению. В качестве примера, анализ можно применять для выявления конкретного типа клеток (например, по специфическим рецепторам клеточной поверхности) и конкретной генетической мутации в этом конкретном типе клеток. Таким образом, в качестве примера, конечный пользователь может быть способен определить, сколько клеток конкретного типа несут представляющую интерес мутацию.

Различные варианты осуществления

Настоящее изобретение предусматривает разнообразные варианты осуществления, в том числе, без ограничения, следующие пронумерованные варианты осуществления:

1. Способ, включающий

(1) приведение образца, тестируемого на наличие одной или нескольких мишеней, в контакт с одним или несколькими специфичными для мишени партнерами по связыванию, где каждый специфичный для мишени партнер по связыванию соединен с докинг-цепью и где специфичные для мишени партнеры по связыванию с разной специфичностью соединены с разными докинг-цепями,

(2) необязательно удаление несвязанных специфичных для мишени партнеров по связыванию,

(3) приведение образца в контакт с мечеными визуализирующими цепями с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна докинг-цепи,

(4) необязательно удаление несвязанных меченых визуализирующих цепей,

(5) визуализацию образца с целью выявления расположения и количества связанных меченых визуализирующих цепей,

(6) тушение сигнала от связанной меченой визуализирующей цепи, и

(7) повторение стадий (3)-(6) каждый раз с меченой визуализирующей цепью с уникальной нуклеотидной последовательностью по отношению ко всем остальным меченым визуализирующим цепям.

2. Способ согласно варианту осуществления 1, где на стадии (1) образец приводят в контакт с несколькими специфичными для мишени партнерами по связыванию.

3. Способ согласно варианту осуществления 1 или 2, где специфичный для мишени партнер по связыванию представляет собой антитело или фрагмент антитела.

4. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-3, где меченые визуализирующие цепи мечены идентично.

5. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-3, где каждая из меченых визуализирующих цепей содержит отличную от других метку.

6. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-5, где меченые визуализирующие цепи представляют собой флуоресцентно меченные визуализирующие цепи.

7. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-6, где одна или несколько мишеней представляют собой белки.

8. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-7, где образец представляет собой клетку, клеточный лизат или тканевой лизат.

9. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-8, где образец визуализируют на стадии (5) с применением конфокальной или эпифлуоресцентной микроскопии.

10. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-9, где тушение сигнала на стадии (6) предусматривает фотообесцвечивание.

11. Композиция, содержащая

образец, связанный с несколькими специфичными для мишени партнерами по связыванию, при этом каждый партнер по связыванию связан с докинг-цепью, и

по меньшей мере одну докинг-цепь, стабильно связанную с меченой визуализирующей цепью.

12. Способ, включающий

(1) приведение образца, тестируемого на наличие одной или нескольких мишеней, в контакт с одним или несколькими специфичными для мишени партнерами по связыванию, где каждый специфичный для мишени партнер по связыванию соединен с нуклеиновой кислотой для докинга и где специфичные для мишени партнеры по связыванию с разной специфичностью соединены с разными нуклеиновыми кислотами для докинга,

(2) необязательно удаление несвязанных специфичных для мишени партнеров по связыванию,

(3) приведение образца в контакт с мечеными визуализирующими нуклеиновыми кислотами с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна нуклеиновой кислоте для докинга,

(4) необязательно удаление несвязанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот,

(5) визуализацию образца с целью выявления расположения и количества связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот,

(6) удаление связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот от нуклеиновых кислот для докинга и

(7) повторение стадий (3)-(6) каждый раз с меченой визуализирующей нуклеиновой кислотой с уникальной нуклеотидной последовательностью по отношению ко всем остальным меченым визуализирующим нуклеиновым кислотам.

13. Способ согласно варианту осуществления 12, где на стадии (1) образец приводят в контакт с несколькими специфичными для мишени партнерами по связыванию.

14. Способ согласно варианту осуществления 12 или 13, где специфичный для мишени партнер по связыванию представляет собой антитело или фрагмент антитела.

15. Способ согласно варианту осуществления 12 или 13, где специфичный для мишени партнер по связыванию представляет собой природный или сконструированный лиганд, малую молекулу, аптамер, пептид или олигонуклеотид.

16. Способ согласно любому из вариантов осуществления 12-15, где меченые визуализирующие нуклеиновые кислоты мечены идентично.

17. Способ согласно любому из вариантов осуществления 12-15, где каждая из меченых визуализирующих нуклеиновых кислот содержит отличную от других метку.

18. Способ согласно любому из вариантов осуществления 12-17, где меченые визуализирующие нуклеиновые кислоты представляют собой флуоресцентно меченные визуализирующие нуклеиновые кислоты.

19. Способ согласно любому из вариантов осуществления 12-18, где одна или несколько мишеней представляют собой белки.

20. Способ согласно любому из вариантов осуществления 12-19, где образец представляет собой клетку, клеточный лизат или тканевой лизат.

21. Способ согласно любому из вариантов осуществления 12-20, где образец визуализируют на стадии (5) с применением конфокальной или эпифлуоресцентной микроскопии.

22. Способ согласно любому из вариантов осуществления 12-21, где меченые визуализирующие нуклеиновые кислоты удаляют от нуклеиновых кислот для докинга путем снижения концентрации соли, добавления денатуранта или повышения температуры.

23. Способ согласно варианту осуществления 22, где соль представляет собой соль Mg++.

24. Способ согласно варианту осуществления 22, где денатурант представляет собой формамид, мочевину или DMSO.

25. Способ согласно любому из вариантов осуществления 12-21, где меченые визуализирующие нуклеиновые кислоты не удаляют от нуклеиновых кислот для докинга путем замещения цепи в присутствии конкурирующей нуклеиновой кислоты.

26. Способ согласно любому из вариантов осуществления 12-21, где меченые визуализирующие нуклеиновые кислоты удаляют от нуклеиновых кислот для докинга путем химического, фотохимического или ферментативного расщепления, модификации или разрушения меченых визуализирующих нуклеиновых кислот.

27. Способ согласно любому из вариантов осуществления 12-21, где в тех случаях, когда меченая визуализирующая нуклеиновая кислота связана с соответствующей ей нуклеиновой кислотой для докинга, визуализирующая нуклеиновая кислота или нуклеиновая кислота для докинга не имеют одноцепочечного участка.

28. Способ согласно любому из вариантов осуществления 12-21, где меченая визуализирующая нуклеиновая кислота не обладает свойством самогашения.

29. Способ согласно любому из вариантов осуществления 12-28, где несвязанная нуклеиновая кислота для докинга является частично двухцепочечной.

30. Способ согласно любому из вариантов осуществления 12-28, где несвязанная визуализирующая нуклеиновая кислота является частично двухцепочечной.

31. Способ согласно любому из вариантов осуществления 12-28, где визуализирующая нуклеиновая кислота представляет собой молекулярный маяк или имеет вторичную структуру со шпильками.

32. Способ согласно любому из вариантов осуществления 12-27 и 29-31, где визуализирующая нуклеиновая кислота представляет собой молекулярный маяк или имеет вторичную структуру со шпильками, которая обладает свойством самогашения.

33. Способ согласно любому из вариантов осуществления 12-28, где визуализирующая нуклеиновая кислота представляет собой полудуплекс.

34. Способ согласно варианту осуществления 33, где полудуплекс обладает свойством самогашения.

35. Способ согласно любому из вариантов осуществления 12-34, где нуклеиновая кислота для докинга имеет вторичную структуру со шпильками.

36. Способ согласно любому из вариантов осуществления 12-35, где визуализирующая нуклеиновая кислота связана с несколькими испускающими сигнал компонентами посредством дендримерной структуры или полимерной структуры.

34. Способ, включающий

(1) приведение образца, тестируемого на наличие одной или нескольких мишеней, в контакт с одним или несколькими специфичными для мишени партнерами по связыванию, где каждый специфичный для мишени партнер по связыванию соединен с нуклеиновой кислотой для докинга и где специфичные для мишени партнеры по связыванию с разной специфичностью соединены с разными нуклеиновыми кислотами для докинга,

(2) необязательно удаление несвязанных специфичных для мишени партнеров по связыванию,

(3) приведение образца в контакт с мечеными визуализирующими нуклеиновыми кислотами с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна нуклеиновой кислоте для докинга,

(4) необязательно удаление несвязанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот,

(5) визуализацию образца с целью выявления расположения и количества связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот,

(6) инактивацию связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот путем удаления или модификации их испускающих сигнал компонентов без полного удаления визуализирующей нуклеиновой кислоты и

(7) повторение стадий (3)-(6) каждый раз с мечеными визуализирующими нуклеиновыми кислотами с уникальной нуклеотидной последовательностью по отношению ко всем остальным меченым визуализирующим нуклеиновым кислотам.

35. Способ согласно варианту осуществления 34, где на стадии (1) образец приводят в контакт с несколькими специфичными для мишени партнерами по связыванию.

36. Способ согласно варианту осуществления 34 или 35, где специфичный для мишени партнер по связыванию представляет собой антитело или фрагмент антитела.

37. Способ согласно варианту осуществления 34 или 35, где специфичный для мишени партнер по связыванию представляет собой природный или сконструированный лиганд, малую молекулу, аптамер, пептид или олигонуклеотид.

38. Способ согласно любому из вариантов осуществления 34-37, где меченые визуализирующие нуклеиновые кислоты мечены идентично.

39. Способ согласно любому из вариантов осуществления 34-37, где каждая из меченых визуализирующих нуклеиновых кислот содержит отличную от других метку.

40. Способ согласно любому из вариантов осуществления 34-39, где меченые визуализирующие нуклеиновые кислоты представляют собой флуоресцентно меченные визуализирующие нуклеиновые кислоты.

41. Способ согласно любому из вариантов осуществления 34-40, где одна или несколько мишеней представляют собой белки.

42. Способ согласно любому из пп. 34-41, где образец представляет собой клетку, клеточный лизат или тканевой лизат.

43. Способ согласно любому из вариантов осуществления 34-42, где образец визуализируют на стадии (5) с применением конфокальной или эпифлуоресцентной микроскопии.

44. Способ согласно любому из вариантов осуществления 34-43, где несвязанная нуклеиновая кислота для докинга является частично двухцепочечной.

45. Способ согласно любому из вариантов осуществления 34-43, где несвязанная визуализирующая нуклеиновая кислота является частично двухцепочечной.

46. Способ согласно любому из вариантов осуществления 34-45, где визуализирующая нуклеиновая кислота представляет собой молекулярный маяк или имеет вторичную структуру со шпильками.

47. Способ согласно любому из вариантов осуществления 34-45, где визуализирующая нуклеиновая кислота представляет собой молекулярный маяк или имеет вторичную структуру со шпильками, которая обладает свойством самогашения.

48. Способ согласно любому из вариантов осуществления 34-45, где визуализирующая нуклеиновая кислота представляет собой полудуплекс.

49. Способ согласно варианту осуществления 48, где полудуплекс обладает свойством самогашения.

50. Способ согласно любому из вариантов осуществления 34-49, где нуклеиновая кислота для докинга имеет вторичную структуру со шпильками.

51. Способ согласно любому из вариантов осуществления 34-50, где визуализирующая нуклеиновая кислота связана с несколькими испускающими сигнал компонентами посредством дендримерной структуры или полимерной структуры.

ЭКВИВАЛЕНТЫ

Хотя в данном документе было описано и проиллюстрировано несколько вариантов осуществления настоящего изобретения, средние специалисты в данной области легко представят себе другие разнообразные средства и/или структуры для выполнения функции и/или получения результатов и/или одного или нескольких преимуществ, описанных в данном документе, и каждый из таких вариантов и/или модификаций считается находящимся в пределах объема вариантов осуществления настоящего изобретения, описанных в данном документе. В более общем смысле, специалисты в данной области легко поймут, что все параметры, размеры, материалы и конфигурации, описанные в данном документе, подразумеваются как иллюстративные, и что фактические параметры, размеры, материалы и/или конфигурации, будут зависеть от конкретного пути применения или путей применения, для которых применяют идеи настоящего изобретения. Специалисты в данной области поймут или будут способны установить путем не более чем проведения стандартных экспериментов многие эквиваленты конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, описанных в данном документе. Таким образом, следует понимать, что вышеупомянутые варианты осуществления представлены только в качестве примера, и что в пределах объема прилагаемых пунктов формулы изобретения и их эквивалентов варианты осуществления настоящего изобретения можно осуществлять на практике иным образом, нежели конкретно описано и заявлено. Варианты осуществления настоящего изобретения согласно настоящему раскрытию направлены на каждые отдельные признак, систему, изделие, материал, набор и/или способ, описанные в данном документе. В дополнение, любая комбинация двух или более таких признаков, систем, изделий, материалов, наборов и/или способов, если такие признаки, системы, изделия, материалы, наборы и/или способы не являются взаимно несовместимыми, включена в объем настоящего изобретения согласно настоящему раскрытию.

Все определения, определяемые и используемые в данном документе, следует понимать как имеющие преимущественную силу над словарными определениями, определениями в документах, включенных посредством ссылки, и/или обычными значениями определяемых терминов.

Все литературные источники, патенты и заявки на патенты, раскрытые в данном документе, включены посредством ссылки по отношению к объекту, для которого цитируется каждый из этих документов, которая в некоторых случаях может включать документ полностью.

Формы единственного числа, используемые в данном документе в описании изобретения и формуле изобретения, если явно не указано противоположное, следует понимать как означающие ʺпо меньшей мере одинʺ.

Фразу ʺи/илиʺ, используемую в данном документе в описании изобретения и формуле изобретения, следует понимать как означающую ʺлюбой из двух или оба вместеʺ элемента, объединенных таким образом, т.е. элемента, которые в некоторых случаях присутствуют вместе, а в других случаях присутствуют по отдельности. Несколько элементов, перечисленных с использованием ʺи/илиʺ, следует толковать таким же образом, т.е. как ʺодин или несколькоʺ элементов, объединенных таким образом. Необязательно могут присутствовать другие элементы, отличные от элементов, конкретно определенных с помощью формулировки ʺи/илиʺ, независимо от того, связаны они или не связаны с этими конкретно определенными элементами. Таким образом, в качестве неограничивающего примера, ссылка на ʺA и/или Bʺ, используемая вместе с открытым выражением, таким как ʺсодержащийʺ, может относиться в одном варианте осуществления только к А (необязательно включая элементы, отличные от B); в другом варианте осуществления только к B (необязательно включая элементы, отличные от A); в еще одном варианте осуществления как к А, так и к B (необязательно включая другие элементы); и т.д.

Как используется в данном документе в описании изобретения и формуле изобретения, ʺилиʺ следует понимать как имеющее то же значение, что и у ʺи/илиʺ, как определено выше. Например, при разделении объектов в перечне ʺилиʺ или ʺи/илиʺ будет интерпретироваться как включающее, т.е. как включение по меньшей мере одного, но также с включением более чем одного из ряда или перечня элементов и необязательно дополнительных не включенных в перечень элементов. Только термины, явно указывающие на противоположное, такие как ʺтолько один изʺ или ʺровно один изʺ или, при использовании в формуле изобретения, ʺсостоящий изʺ, будут относиться к включению ровно одного элемента из ряда или перечня элементов. Как правило, термин ʺилиʺ, используемый в данном документе, будет только тогда интерпретироваться как обозначение исключающих альтернатив (то есть ʺодин или другой, но не обаʺ), когда ему предшествуют исключающие термины, такие как ʺлибоʺ, ʺодин изʺ, ʺтолько один изʺ или ʺровно один изʺ. ʺСостоящий по существу изʺ, используемый в формуле изобретения, будет иметь свое обычное значение, используемое в области патентного права.

Как используется в данном документе в описании изобретения и формуле изобретения, фразу ʺпо меньшей мере одинʺ в отношении перечня из одного или нескольких элементов следует понимать как означающую по меньшей мере один элемент, выбранный из любого одного или нескольких элементов в перечне элементов, но не обязательно включающую по меньшей мере один из всех без исключения элементов, конкретно перечисленных в перечне элементов, и не исключающую любых комбинаций элементов в перечне элементов. Это определение также допускает возможность того, что необязательно могут присутствовать элементы, отличные от элементов, конкретно определенных в перечне элементов, к которым относится фраза ʺпо меньшей мере одинʺ, независимо от того, связаны они или не связаны с этими конкретно определенными элементами. Таким образом, в качестве неограничивающего примера, ʺпо меньшей мере один из А и Bʺ (или, эквивалентно, ʺпо меньшей мере один из А или Bʺ или, эквивалентно, ʺпо меньшей мере один из А и/или Bʺ) может относиться в одном варианте осуществления по меньшей мере к одному, необязательно включая более чем один, A при отсутствии B (и необязательно включая элементы, отличные от B); в другом варианте осуществления по меньшей мере к одному, необязательно включая более чем один, B при отсутствии A (и необязательно включая элементы, отличающиеся от A); в еще одном варианте осуществления по меньшей мере к одному, необязательно включая более чем один, A, и по меньшей мере к одному, необязательно включая более чем один, B (и необязательно включая другие элементы); и т.д.

Также следует понимать, что, если явно не указано противоположное, в любых способах, заявленных в данном документе, которые включают более чем одну стадию или действие, порядок стадий или действий в способе необязательно ограничены порядком, в котором перечислены стадии или действия в способе.

В формуле изобретения, так же как и в вышеприведенном описании изобретения, все переходные фразы, такие как ʺсодержащийʺ, ʺвключающийʺ, ʺнесущийʺ, ʺимеющийʺ, ʺвключающий в себяʺ, ʺподразумевающийʺ, ʺвмещающийʺ, ʺобразованный изʺ и т.п. следует понимать как открытые, т.е. означающие включение без ограничения. Только переходные фразы ʺсостоящий изʺ и ʺсостоящий главным образом изʺ будут соответственно закрытыми или полузакрытыми переходными фразами, как изложено в United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures, Section 2111.03.

1. Способ тестирования образца на наличие одной или нескольких мишеней, включающий

(1) приведение образца в контакт с одним или несколькими специфичными для мишени партнерами по связыванию, где каждый специфичный для мишени партнер по связыванию соединен с докинг-цепью и где специфичные для мишени партнеры по связыванию с разной специфичностью соединены с разными докинг-цепями,

(2) необязательно удаление несвязанных специфичных для мишени партнеров по связыванию,

(3) приведение образца в контакт с мечеными визуализирующими цепями с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна докинг-цепям, с получением меченых визуализирующих цепей, стабильно связанных с докинг-цепями,

(4) необязательно удаление несвязанных меченых визуализирующих цепей,

(5) визуализацию образца с целью выявления расположения и количества меченых визуализирующих цепей, стабильно связанных с докинг-цепями,

(6) тушение сигнала от связанной меченой визуализирующей цепи или удаление связанных меченых визуализирующих цепей от докинг-цепей путем ферментативного расщепления, модификации или разрушения меченых визуализирующих цепей, и

(7) повторение стадий (3)-(6) каждый раз с меченой визуализирующей цепью с уникальной нуклеотидной последовательностью по отношению ко всем остальным меченым визуализирующим цепям.

2. Способ по п. 1, где на стадии (1) образец приводят в контакт с несколькими специфичными для мишени партнерами по связыванию.

3. Способ по п. 1, где специфичный для мишени партнер по связыванию представляет собой антитело или фрагмент антитела.

4. Способ по п. 1, где меченые визуализирующие цепи мечены идентично.

5. Способ по п. 1, где каждая из меченых визуализирующих цепей содержит отличную от других метку.

6. Способ по п. 1, где меченые визуализирующие цепи представляют собой флуоресцентно меченные визуализирующие цепи.

7. Способ по п. 1, где одна или несколько мишеней представляют собой белки.

8. Способ по п. 1, где образец представляет собой клетку, клеточный лизат или тканевой лизат.

9. Способ по п. 1, где образец визуализируют на стадии (5) с применением конфокальной или эпифлуоресцентной микроскопии.

10. Способ по п. 1, где тушение сигнала на стадии (6) предусматривает фотообесцвечивание.

11. Способ тестирования образца на наличие одной или нескольких мишеней, включающий

(1) приведение образца в контакт с одним или несколькими специфичными для мишени партнерами по связыванию, где каждый специфичный для мишени партнер по связыванию соединен с нуклеиновой кислотой для докинга и где специфичные для мишени партнеры по связыванию с разной специфичностью соединены с разными нуклеиновыми кислотами для докинга,

(2) необязательно удаление несвязанных специфичных для мишени партнеров по связыванию,

(3) приведение образца в контакт с мечеными визуализирующими нуклеиновыми кислотами с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна нуклеиновым кислотам для докинга, с получением меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, стабильно связанных с нуклеиновыми кислотами для докинга,

(4) необязательно удаление несвязанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот,

(5) визуализацию образца с целью выявления расположения и количества меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, стабильно связанных с нуклеиновыми кислотами для докинга,

(6) удаление связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот от нуклеиновых кислот для докинга путем изменения температуры и/или условий буфера и

(7) повторение стадий (3)-(6) каждый раз с меченой визуализирующей нуклеиновой кислотой с уникальной нуклеотидной последовательностью по отношению ко всем остальным меченым визуализирующим нуклеиновым кислотам.

12. Способ по п. 11, где на стадии (1) образец приводят в контакт с несколькими специфичными для мишени партнерами по связыванию.

13. Способ по п. 11, где специфичный для мишени партнер по связыванию представляет собой антитело или фрагмент антитела.

14. Способ по п. 11, где специфичный для мишени партнер по связыванию представляет собой природный или сконструированный лиганд, малую молекулу, аптамер, пептид или олигонуклеотид.

15. Способ по п. 11, где меченые визуализирующие нуклеиновые кислоты мечены идентично.

16. Способ по п. 11, где каждая из меченых визуализирующих нуклеиновых кислот содержит отличную от других метку.

17. Способ по п. 11, где меченые визуализирующие нуклеиновые кислоты представляют собой флуоресцентно меченные визуализирующие нуклеиновые кислоты.

18. Способ по п. 11, где одна или несколько мишеней представляют собой белки.

19. Способ по п. 11, где образец представляет собой клетку, клеточный лизат или тканевой лизат.

20. Способ по п. 11, где образец визуализируют на стадии (5) с применением конфокальной или эпифлуоресцентной микроскопии.

21. Способ по п. 11, где меченые визуализирующие нуклеиновые кислоты удаляют от нуклеиновых кислот для докинга путем снижения концентрации соли, добавления денатуранта или повышения температуры.

22. Способ по п. 21, где соль представляет собой соль Mg++.

23. Способ по п. 21, где денатурант представляет собой формамид, мочевину или DMSO.

24. Способ по п. 11, где меченые визуализирующие нуклеиновые кислоты не удаляют от нуклеиновых кислот для докинга путем замещения цепи в присутствии конкурирующей нуклеиновой кислоты.

25. Способ по п. 11, где несвязанная нуклеиновая кислота для докинга является частично двухцепочечной.

26. Способ по п. 11, где несвязанная визуализирующая нуклеиновая кислота является частично двухцепочечной.

27. Способ по п. 11, где визуализирующая нуклеиновая кислота представляет собой молекулярный маяк или имеет вторичную структуру со шпильками.

28. Способ по п. 11, где визуализирующая нуклеиновая кислота представляет собой молекулярный маяк или имеет вторичную структуру со шпильками, которая обладает свойством самогашения.

29. Способ по п. 11, где визуализирующая нуклеиновая кислота представляет собой полудуплекс.

30. Способ по п. 29, где полудуплекс обладает свойством самогашения.

31. Способ по п. 11, где нуклеиновая кислота для докинга имеет вторичную структуру со шпильками.

32. Способ по п. 11, где визуализирующая нуклеиновая кислота связана с несколькими испускающими сигнал компонентами посредством дендримерной структуры или полимерной структуры.

33. Способ тестирования образца на наличие одной или нескольких мишеней, включающий

(1) приведение образца в контакт с одним или несколькими специфичными для мишени партнерами по связыванию, где каждый специфичный для мишени партнер по связыванию соединен с нуклеиновой кислотой для докинга и где специфичные для мишени партнеры по связыванию с разной специфичностью соединены с разными нуклеиновыми кислотами для докинга,

(2) необязательно удаление несвязанных специфичных для мишени партнеров по связыванию,

(3) приведение образца в контакт с мечеными визуализирующими нуклеиновыми кислотами с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна нуклеиновым кислотам для докинга, с получением меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, стабильно связанных с нуклеиновыми кислотами для докинга,

(4) необязательно удаление несвязанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот,

(5) визуализацию образца с целью выявления расположения и количества меченых визуализирующих нуклеиновых кислот, стабильно связанных с нуклеиновыми кислотами для докинга,

(6) инактивацию связанных меченых визуализирующих нуклеиновых кислот путем удаления или модификации их испускающих сигнал компонентов без полного удаления визуализирующей нуклеиновой кислоты и

(7) повторение стадий (3)-(6) каждый раз с мечеными визуализирующими нуклеиновыми кислотами с уникальной нуклеотидной последовательностью по отношению ко всем остальным меченым визуализирующим нуклеиновым кислотам.

34. Способ по п. 33, где на стадии (1) образец приводят в контакт с несколькими специфичными для мишени партнерами по связыванию.

35. Способ по п. 33, где специфичный для мишени партнер по связыванию представляет собой антитело или фрагмент антитела.

36. Способ по п. 33, где специфичный для мишени партнер по связыванию представляет собой природный или сконструированный лиганд, малую молекулу, аптамер, пептид или олигонуклеотид.

37. Способ по п. 33, где меченые визуализирующие нуклеиновые кислоты мечены идентично.

38. Способ по п. 33, где каждая из меченых визуализирующих нуклеиновых кислот содержит отличную от других метку.

39. Способ по п. 33, где меченые визуализирующие нуклеиновые кислоты представляют собой флуоресцентно меченные визуализирующие нуклеиновые кислоты.

40. Способ по п. 33, где одна или несколько мишеней представляют собой белки.

41. Способ по п. 33, где образец представляет собой клетку, клеточный лизат или тканевой лизат.

42. Способ по п. 33, где образец визуализируют на стадии (5) с применением конфокальной или эпифлуоресцентной микроскопии.

43. Способ по п. 33, где несвязанная нуклеиновая кислота для докинга является частично двухцепочечной.

44. Способ по п. 33, где несвязанная визуализирующая нуклеиновая кислота является частично двухцепочечной.

45. Способ по п. 33, где визуализирующая нуклеиновая кислота представляет собой молекулярный маяк или имеет вторичную структуру со шпильками.

46. Способ по п. 33, где визуализирующая нуклеиновая кислота представляет собой молекулярный маяк или имеет вторичную структуру со шпильками, которая обладает свойством самогашения.

47. Способ по п. 33, где визуализирующая нуклеиновая кислота представляет собой полудуплекс.

48. Способ по п. 47, где полудуплекс обладает свойством самогашения.

49. Способ по п. 33, где нуклеиновая кислота для докинга имеет вторичную структуру со шпильками.

50. Способ по п. 33, где визуализирующая нуклеиновая кислота связана с несколькими испускающими сигнал компонентами посредством дендримерной структуры или полимерной структуры