Получение пегилированных фрагментов gd2-специфичных антител, индуцирующих прямую клеточную гибель gd2-позитивных опухолевых клеток, и их применение в терапии gd2-позитивных опухолей

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к созданию мультивалентной белковой конструкции нового формата на основе нескольких фрагментов антител, конъюгированных с молекулой полиэтиленгликоля, и имеющих сродство к ганглиозиду GD2, что может быть использовано в медицине. Указанную конструкцию используют в качестве активного действующего вещества в фармацевтических композициях, предназначенных для лечения многих видов онкологических заболеваний, характеризующихся экспрессией ганглиозида GD2 на поверхности опухолевых клеток, таких как нейробластома, мелкоклеточный рак легкого, саркома, глиома, ретинобластома, меланома и другие. Изобретение позволяет обеспечить больший уровень эффективности и безопасности при использовании в клинической практике за счет мультивалентности и отсутствия нежелательных эффекторных функций по сравнению с моноклональными антителами против ганглиозида GD2. 4 н. и 10 з.п. ф-лы, 8 ил., 2 табл.

 

Область техники

Данное изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности, к новым белковым конструкциям на основе фрагментов антител, специфически связывающих ганглиозид GD2, и применению этих конструкций для лечения онкологических заболеваний.

Уровень техники

В настоящее время во всем мире остро стоят задачи по разработке новых адресных, высокоэффективных и низкотоксичных методов терапии онкологических заболеваний. Одним из таких наиболее перспективных направлений является иммунотерапия с использованием препаратов на основе моноклональных антител, направленных на таргетные опухолевые молекулы. Мишенями для иммунотерапии рака могут служить не только белки, но и гликосфинголипиды, в частности ганглиозиды. Например, ганглиозид GD2 специфически представлен на поверхности клеток опухолей различного происхождения, включая нейробластомы, меланомы, глиомы, ретинобластомы, меланомы, мелкоклеточный рак легких, остеосаркомы, рабдомиосаркомы, саркомы Юинга. По некоторым данным, GD2-позитивные опухоли составляют около 10% от общего числа онкологических заболеваний, и для многих из них характерна крайне ограниченная эффективность классических методов терапии.

Применение антител к GD2 дало существенный эффект, выраженный в супрессии роста и гибели опухолевых клеток в экспериментах как in vitro, так и in vivo. Несколько препаратов GD2-специфичных моноклональных антител в настоящее время проходят клинические испытания, которые свидетельствуют в пользу перспективности иммунотерапии в лечении GD2-позитивных опухолей (Horta ZP, et al., Immunotherapy, September 2016, Vol. 8, No. 9, Pages 1097-1117). Один препарат, Unituxin (на основе антитела Dinutuximab), связывающий GD2, был одобрен для клинического применения в 2015 году (Ploessl С, et al., Ann Pharmacother, May 2016, 50: 416-422). Unituxin характеризуется значимой эффективностью действия и повышает на 20% 5-летнюю выживаемость пациентов с нейробластомой высокого риска в комбинированной терапии по сравнению с выживаемостью пациентов, получавших только химиотерапию. Однако Unituxin обладает рядом побочных эффектов. Основными из них являются: жар, боль, сыпь, лихорадка, анемия, в основном вызванные гиперактивацией иммунной системы и нейротоксичностью. Было показано, что выявленные побочные эффекты в основном обусловлены связыванием антител с нормальными неопухолевыми клетками, например, с периферическими нейронами, экспрессирующими на своей поверхности ганглиозид GD2. После связывания с клетками происходит взаимодействие Fc-региона полноразмерных антител с эффекторными клетками иммунной системы и белками системы комплемента, что приводит к повреждению периферических нейронов (Yuki N, et al. J Neurol Sci., 1997, 149(2): 127-130). Поэтому, одной из возможных стратегий для уменьшения побочных эффектов является изменение структуры или формата антител для снижения или полной отмены функциональных свойств Fc-региона. Было показано, что Fc-опосредованные цитотоксические функции антител не являются критически необходимыми для обеспечения противоопухолевого эффекта в случае GD2-позитивных опухолей. Например, внесение точечной мутации в GD2-специфичные антитела ch14.18 подавляло способность активировать комплемент-зависимый механизм клеточной гибели (CDC); такая мутация не приводила к снижению противоопухолевых эффектов антител, но при этом снижала побочные эффекты исходных GD2-специфичных ch14.18, проявляющиеся в аллодинии (LS Sorkin et al, Pain, 2010 Apr; 149(1): 135-142). В другой работе (Cochonneau D et al, Cancer Lett., 2013; 333(2): 194-204) с использованием OAc-GD2-специфичных антител 8B6 авторы показали, что однократно введенная внутривенно доза этих антител в NOD/SCID мышей статистически достоверно ингибировала рост опухоли. Поскольку в NOD/SCID мышах в силу отсутствия эффекторных клеток и циркулирующих белков системы комплемента проявление механизмов ADCC и CDC невозможно, то, по-видимому, проявление противоопухолевых эффектов вызывается другими механизмами, например, прямым цитотоксическим действием моноклональных антител. Сильное прямое цитотоксическое действие GD2-специфичных моноклональных антител, характерное для разных типов GD2-позитивных раков, показано в нескольких работах (Doronin I.I., et al., ВМС Cancer. 2014, Apr 28; 14:295; Horwacik I., et al. Apoptosis, 2015 May; 20(5):679-88.).

Классические молекулы антител обладают рядом преимуществ по сравнению с другими терапевтическими белками. Это в первую очередь высокая специфичность к мишени и стабильность в водном растворе, а также продолжительное время циркуляции в кровотоке, обусловленное связыванием с FcRn рецептором. Недостатком классических молекул антител можно считать их большой размер (150 кДа), который затрудняет их проникновение вглубь солидных опухолей. В общем случае Fc-регион антител опосредует цитотоксические свойства антител при связывании с лигандом на поверхности клеток за счет механизмов ADCC и CDC. Также разрабатываются препараты на основе фрагментов антител (Fab-фрагменты, scFv-фрагменты, BiTE и т.д.), которые обладают другими механизмами противоопухолевого действия и используются как в самостоятельном виде (биспецифические и мультивалентные фрагменты антител), так и в составе комплексных систем противоопухолевой терапии (таргетные наночастицы, CAR-T клетки, иммунотоксины и пр.).

Большинство GD2-позитивных новообразований представляют собой солидные опухоли, для которых характерна невысокая противоопухолевая эффективность моноклональных антител, обусловленная большими размерами этих молекул. Кроме того, нежелательные побочные эффекты терапии зачастую обусловлены наличием Fc-опосредованной цитотоксичности. Поэтому, в связи с общим ростом распространенности различных типов онкологических заболеваний в России и в мире, а также отсутствием эффективных и безопасных методов терапии GD2-позитивных опухолей имеется существенная потребность в создании лекарства нового формата на основе антител к GD2. Данное изобретение обладает рядом свойств, необходимых для решения поставленной задачи, и поэтому расширяет круг имеющихся кандидатов для лечения GD2-позитивных онкологических заболеваний.

Сущность изобретения

Задачей настоящего изобретения является создание терапевтического агента на основе антител к GD2 и разработка нового эффективного и безопасного способа лечения пациентов с онкологическими заболеваниями, характеризующимися присутствием ганглиозида GD2 на поверхности клеток опухоли. Также задачей настоящего изобретения является расширение арсенала средств для подавления пролиферации и индукции гибели GD2-позитивных опухолевых клеток.

Указанные задачи решаются путем создания нового терапевтического агента для лечения онкологических заболеваний, представляющего собой мультивалентную конструкцию, содержащую по меньшей мере два функциональных фрагмента антител, специфически связывающих ганглиозид GD2 и соединенных между собой при помощи ковалентной конъюгации с молекулой полиэтиленгликоля (ПЭГ). В предпочтительных вариантах изобретения каждый из этих функциональных фрагментов антител содержит по крайней мере (а) один вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий H-CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 1, H-CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 2, и Н-CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 3, и (б) один вариабельный домен легкой цепи, содержащий L-CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 4, L-CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 5, и L-CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 6. Таким образом, данная мультивалентная конструкция способна связывать две или более молекулы ганглиозида GD2. В некоторых вариантах изобретения конъюгация указанных функциональных фрагментов антител может происходить с помощью образования ковалентных связей между тиоловой группой неспаренного С-концевого цистеина фрагмента антитела и малеимидными группами молекулы ПЭГ.

В некоторых вариантах изобретения данная мультивалентная конструкция отличается тем, что содержит два, три или четыре функциональных фрагмента антител, каждый из которых содержит один фрагмент тяжелой цепи, содержащий последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 7, и один фрагмент легкой цепи, содержащий последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 8.

В других вариантах изобретения данная мультивалентная конструкция отличается тем, что содержит два, три или четыре функциональных фрагмента антител, каждый из которых содержит один фрагмент тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 9, и один фрагмент легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 10.

В некоторых вариантах изобретения данная мультивалентная. конструкция отличается тем, что содержит два, три или четыре функциональных фрагмента антител, каждый из которых содержит последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 11.

В некоторых вариантах изобретения данная мультивалентная конструкция отличается тем, что содержит два, три или четыре функциональных фрагмента антител, каждый из которых содержит последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 12.

В некоторых вариантах изобретения данная мультивалентная конструкция отличается тем, что содержит два, три или четыре функциональных фрагмента антител, каждый из которых содержит последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 13.

В некоторых вариантах изобретения данная мультивалентная конструкция отличается тем, что содержит два, три или четыре функциональных фрагмента антител, каждый из которых содержит последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 14.

В некоторых вариантах изобретения данная мультивалентная конструкция отличается тем, что используемая для конъюгации молекула полиэтиленгликоля имеет линейную структуру и молекулярную массу от 5 до 40 кДа. В других вариантах изобретения данная мультивалентная конструкция отличается тем, что используемая для конъюгации молекула полиэтиленгликоля имеет разветвленную структуру и молекулярную массу от 5 до 40 кДа.

Указанная задача также решается путем создания фармацевтической композиции для лечения онкологических заболеваний, содержащей вышеописанные варианты мультивалентных конструкций в терапевтически эффективном количестве, а также содержащей фармацевтически приемлемый носитель. В частном случае реализации изобретения описан способ лечения онкологического заболевания, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества вышеописанной фармацевтической композиции. Онкологическим заболеванием, для лечения которого применима данная фармацевтическая композиция, является нейробластома, ретинобластома, меланома, мелкоклеточный рак легких, остеосаркома, рабдомиосаркома, глиома, саркома Юинга или любая другая GD2-позитивная опухоль, а также любая опухоль, отдельные клеточные субпопуляции которой экспрессируют ганглиозид GD2. В частных случаях, клеточными субпопуляциями, которые экспрессируют ганглиозид GD2, могут являться раковые стволовые клетки, оставшиеся в организме после прохождения курса лечения GD2-негативной опухоли (например, курса химио- или радиотерапии). В некоторых вариантах изобретения описан способ уничтожения клетки в организме субъекта, на поверхности которой находится ганглиозид GD2, включающий введение этому субъекту терапевтически эффективного количества вышеописанной фармацевтической композиции.

При осуществлении изобретения достигаются следующие технические результаты: создан новый вариант терапевтического агента на основе фрагментов антител к GD2 для лечения онкологических заболеваний, характеризующихся присутствием ганглиозида GD2 на поверхности клеток опухоли; полученный терапевтический агент обладает рядом свойств, необходимых для его эффективного и безопасного использования: мультивалентность, относительно хорошая стабильность и увеличенное время нахождения в кровотоке, а также отсутствие нежелательных эффекторных функций, присущих полноразмерным антителам;

- разработана фармацевтическая композиция на основе мультивалентной конструкции, содержащей фрагменты антител к GD2;

- разработан новый способ лечения онкологических заболеваний;

- разработан новый эффективный способ уничтожения клетки в организме субъекта, на поверхности которой находится ганглиозид GD2.

Краткое описание рисунков

Рис. 1. Схема получения мультимерных фрагментов GD2-специфичных антител.

1А - получение димеров scFv-фрагментов с использованием ПЭГ-Малеимид2.

1Б - получение димеров Fab-фрагментов с использованием ПЭГ-Малеимид2.

1В - получение тетрамеров scFv-фрагментов с использованием ПЭГ-Малеимид4.

Рис. 2. Электрофорез образцов scFv-фрагментов GD2-специфичных антител после проведения реакции пегилирования с использованием ПЭГ-малеимид2 и ПЭГ-малеимид4. 1 - белковый состав после реакции конъюгирования scFv-фрагментов с ПЭГ-малеимид2; 2 - исходные scFv-фрагменты; 3 - белковый состав после реакции конъюгирования scFv-фрагментов с ПЭГ-малеимид4.

Рис. 3. А - хроматографическое разделение пегилированных scFv-фрагментов GD2-специфичных антител с использованием ПЭГ-малеимид2. Б - вестерн-блот анализ полученных фракций и исходного образца после реакции пегилирования. 1 - фракция димеров пегилированных scFv; 2 - фракция мономеров пегилированных scFv; 3 - фракция scFv; 4 - общая белковая смесь после реакции пегилирования.

Рис. 4. Оценка связывания с ганглиозидом GD2 исходных и модифицированных scFv-фрагментов GD2-специфичных антител, полученных с использованием ПЭГ-малеимид2. А - прямой иммуноферментный анализ, на подложке сорбирован ганглиозид GD2. Б - проточная цитофлуориметрия. Окрашивание GD2-позитивной клеточной линии EL-4. К_2Ат - контрольные клетки, окрашенные вторичными анти-видовыми антителами. MFI - средняя интенсивность флуоресценции.

Рис. 5. Оценка клеточной гибели под действием scFv-фрагментов GD2-специфичных антител, полученных с использованием ПЭГ-малеимид, ПЭГ-малеимид2 и ПЭГ-малеимид4. А - МТТ-тест, 72 ч инкубации, Б - PI-тест и 7AAD-тест, 24 ч. инкубации. К - интактные клетки.

Рис. 6. Оценка клеточной гибели под действием Fab-фрагментов GD2-специфичных антител, полученных с использованием ПЭГ-малеимид и ПЭГ-малеимид2. А - МТТ-тест, 72 ч инкубации, Б - PI-тест и 7AAD-тест, 24 ч. инкубации. К - интактные клетки.

Рис. 7. Динамика падения внутривенно введенных флуоресцентно-меченных фрагментов антител в крови мышей линии Balb/c. А - исходные и модифицированные scFv-фрагменты GD2-специфичных антител. Б - исходные и модифицированные Fab-фрагменты GD2-специфичных антител.

Рис. 8. Динамика падения внутривенно введенных флуоресцентно-меченных мономеров scFv-фрагментов антител, модифицированных молекулами ПЭГ различной молекулярной массы и формы в крови мышей линии Balb/c. Y - обозначает разветвленную структуру молекулы ПЭГ.

Определения и термины

Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены некоторые термины, использованные в настоящем описании изобретения.

В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

Под «субъектом» следует понимать человека или другое млекопитающее.

Ганглиозидом GD2 в настоящем описании называется дисиалоганглиозид, экспрессированный на поверхности опухолевых клеток нейроэктодермального происхождения со следующей IUPAC формулой: (2R,4R,5S,6S)-2-[3-[(2S,3S,4R,6S)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-5-[(2S,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-2-[(2R,3S,4R,5R,6R)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(E)-3-hydroxy-2-(octadecanoylamino)octadec-4-enoxy]oxan-3-yl]oxy-3-hydroxy-6-(hydroxyrnethyl)oxan-4-yl]oxy-3-amino-6-carboxy-4-hydroxyoxan-2-yl]-2,3-dihydroxypropoxy]-5-amino-4-hydroxy-6-(1,2,3-trihydroxypropyl)oxane-2-carboxylic acid.

Термин «антитело» эквивалентен термину «иммуноглобулин» и означает гликопротеин, состоящий из двух тяжелых (Н) цепей и двух легких (L) цепи, соединенных дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов - СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена CL. VH и VL-области могут быть далее подразделены на гипервариабельные участки, именуемые областями, определяющими комплементарность (H-CDR и L-CDR), разделенные более консервативными областями, именуемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL область состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца до карбокси-конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат домен связывания, который взаимодействует с антигеном (то есть, антигенсвязывающую часть антитела). Fc-регион молекулы иммуноглобулина состоит из димера, образованного СН2 и СН3 доменами двух тяжелых цепей; Fc-регион опосредует эффекторные функции антитела, то есть взаимодействие молекулы иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включающими различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента.

Термин «функциональный фрагмент антитела» в использованном здесь значении означает один или несколько фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, ганглиозидом GD2). Примеры функциональных фрагментов включают (i) Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из VL, VH, CL и СН1 доменов; (ii) F(ab')2-фрагмент, двухвалентный фрагмент, включающий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fv-фрагмент, состоящий из VL и VH доменов одного плеча антитела; (iv) два домена Fv-фрагмента, VL и VH, объединенных при помощи синтетического линкера в одну белковую цепь, в которой VL и VH области спариваются с образованием одновалентной конструкции (известна как одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv); см., например, Bird et al., Science, 1988, 242:423-426). Указанные фрагменты антител получают обычными методами, известными специалистам в данной области. В предпочтительных вариантах настоящего изобретения функциональные фрагменты антител не обладают или обладают сниженными эффекторными функциями; в частности, функциональные фрагменты антител могут не содержать Fc-регион.

Мультивалентная конструкция по настоящему изобретению может содержать от двух до нескольких функциональных фрагментов антител, каждый из которых способен специфически связываться с ганглиозидом GD2; таким образом, она содержит два или несколько антиген-связывающих участков. Функциональные фрагменты антител в мультивалентной конструкции могут включать вариабельные области, а также, иногда, константные области, выделенные из последовательностей иммуноглобулинов, специфически связывающих GD2. Предпочтительно, но без обязательных ограничений, функциональные фрагменты в составе мультивалентной конструкции по настоящему изобретению не обладают или обладают сниженными эффекторными функциями. Мультивалентность, т.е. способность связывать сразу несколько молекул антигена, обеспечивает конструкции по настоящему изобретению высокую авидность (стабильность взаимодействия между конструкцией и клеткой, экспрессирующей антигены на поверхности), что в свою очередь обеспечивает улучшенные функциональные свойства конструкции.

Используемые функциональные фрагменты антител по настоящему изобретению могут представлять собой «химерные» или «гуманизированные» фрагменты антител. Химерные фрагменты означают фрагменты антител, которые включают последовательности вариабельной области тяжелой и/или легкой цепей из одного вида и последовательности константной области из другого вида. Гуманизированные фрагменты означают фрагменты антител, которые включают последовательности фрагментов человеческих антител, в которых некоторые остатки CDR и, возможно, некоторые остатки каркасной области (FR) заменены остатками аналогичных сайтов из антител грызунов.

В некоторых вариантах изобретения функциональные фрагменты антител согласно изобретению содержат области тяжелых и/или легких цепей, включающие в себя аминокислотные последовательности, гомологичные аминокислотным последовательностям, описанным в Таблице 1 предпочтительных фрагментов антител, где указанные функциональные фрагменты антител сохраняют нужные функциональные свойства согласно изобретению (связывание с ганглиозидом GD2 и индукция клеточной гибели). Гомологичные фрагменты антител могут быть получены путем мутагенеза (например, сайт-направленного или ПЦР-опосредуемого мутагенеза) соответствующих молекул нуклеиновых кислот с последующим тестированием кодируемого модифицированного фрагмента антител на сохранение его функций в соответствии с описанными здесь функциональными анализами.

Используемый здесь термин «процент гомологии двух последовательностей» эквивалентен термину «процент идентичности двух последовательностей». Процент идентичности двух последовательностей определяется числом положений идентичных аминокислот в этих двух последовательностях с учетом числа пробелов и длины каждого пробела, которые необходимо ввести для оптимального сопоставления двух последовательностей путем выравнивания. Процент идентичности равен числу идентичных аминокислот в данных положениях с учетом выравнивания последовательностей, разделенному на общее число положений и умноженному на 100. Процент идентичности двух аминокислотных последовательностей может быть определен с помощью бесплатной программы NCBI Protein BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).

Термин «фармацевтически приемлемый носитель, растворитель и/или наполнитель» относится к таким носителям, растворителям и/или наполнителям, которые, являясь неактивными ингредиентами, в рамках проведенного медицинского заключения, пригодны для использования в контакте с тканями человека и животных без излишней токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.д. и отвечают разумному соотношению пользы и риска. «Неактивные ингредиенты» входят в состав лекарственного средства или вакцинного препарата для улучшения его растворимости и/или стабильности, а также для улучшения фармакокинетики и более эффективной доставки к специфическим органам или тканям. Неактивные ингредиенты включают в себя множество веществ, известных специалистам в области фармацевтики, таких как вещества для контроля рН или осмотического давления, антибактериальные агенты, антиоксиданты, поверхностно активные вещества (например, полисорбат 20 или 80), криостабилизаторы, консерванты, растворители, загустители, наполнители, носители (микро- или нано-частицы) и другие вещества.

Термин «терапевтически эффективное количество» подразумевает такое количество фармацевтической композиции, которое при попадании в организм субъекта будет эффективно индуцировать элиминацию клеток опухоли, экспрессирующих ганглиозид GD2. При применении в комбинированной терапии термин «эффективное количество» относится к комбинации количеств активных ингредиентов, прием которых ведет к превентивному или терапевтическому эффекту при последовательном или одновременном приеме. Точное требуемое количество может меняться от субъекта к субъекту в зависимости от вида млекопитающего, возраста и общего состояния пациента, тяжести заболевания, методики введения препарата, комбинированного лечения с другими препаратами и т.п. Фармацевтическая композиция, описанная в настоящем изобретении, может быть введена в организм пациента в любом количестве и любым путем введения, эффективным для лечения и/или профилактики онкологических заболеваний.

Подробное раскрытие изобретения

Создание оптимального терапевтического агента на основе антител к GD2.

Ганглиозид GD2 характеризуется низким уровнем экспрессии на некоторых типах здоровых клеток организма (в основном, это периферические нейроны, нейроны ЦНС, меланоциты и МСК костного мозга), и практически отсутствует на других здоровых клетках организма. При опухолевой трансформации количество GD2 возрастает в десятки и более раз, составляя до 10% от всех липидов и до 90% от ганглиозидов плазматической мембраны. Стандартные методы терапии GD2-позитивных опухолей обладают сильными побочными эффектами и малоэффективны. Единственный доступный в клинике препарат для таргетной терапии, моноклональное антитело к GD2, также обладает невысокой эффективностью и ярко выраженными побочными эффектами, значительная часть которых обусловлена наличием у антитела Fc-фрагмента и ассоциированной с ним функции активации системы комплемента. Другим недостатком является относительно большой размер антитела (150 кДа), который затрудняет проникновение вглубь опухолей.

В качестве альтернативного подхода в настоящем изобретении предлагается использовать GD2-связывающие фрагменты антител без Fc-домена для элиминации GD2-позитивных опухолевых клеток. Ранее авторами было показано, что Fab-фрагменты GD-2-специфичных антител сохраняют способность индуцировать клеточную гибель в опухолевых клетках (Doronin II et al., Bull Exp Biol Med, 2013, Mar; 154(5):658-63), несмотря на отсутствие Fc-ассоциированных эффекторных функций. Этот эффект может быть обусловлен блокированием или изменением сигнальных путей, опосредованных ганглиозидом GD2 (Horwacik I., et al. Apoptosis, 2015 May; 20(5):679-88). Тем не менее, GD2-связывающие фрагменты антител без Fc- домена имели существенные недостатки: более короткое время жизни в кровотоке и, иногда, менее эффективная индукция клеточной гибели по сравнению с полноразмерными антителами. Для увеличения продолжительности нахождения фрагментов антител в кровотоке была применена процедура пегилирования - ковалентная конъюгация с молекулой полиэтиленгликоля (ПЭГ). Этот метод был неоднократно успешно использован для других белковых молекул. Эта процедура действительно увеличивала продолжительность нахождения GD2-связывающих фрагментов антител в кровотоке, но при этом эффективность индукции клеточной гибели опухолевых клеток не всегда была достаточной. Неожиданно было обнаружено, что присоединение двух или более GD2-связывающих фрагментов антител к одной молекуле ПЭГ повышает цитотоксические эффекты GD2-связывающих фрагментов антител к клеткам опухоли. Такая мультивалентная конструкция также обладает достаточно длинным временем жизни в кровотоке, и, потенциально, сниженными побочными эффектами на нервные окончания по сравнению со стандартными антителами. Дело в том, что такая конструкция не будет индуцировать комплемент-зависимую цитотоксичность из-за отсутствия Fc-региона; при этом Fc-независимая цитотоксичность сильно зависит от концентрации GD2 на поверхности клетки, поэтому цитотоксичное действие мультивалентной конструкции будет более специфичным по отношению к опухолевым клеткам, где экспрессия GD2 отличается в сотни раз по сравнению с нормальными клетками (Svennerholm L, et al. Biochim Biophys Acta, 1994, 1214:115-123). Наличие молекулы ПЭГ в составе мультивалентной конструкции улучшает фармакокинетические характеристики молекулы за счет снижения печеночного клиренса и уменьшения поглощения ретикулоэндотелиальной системой; кроме того, пегилирование значительно повышает EPR-эффект (enhanced permeation and retention effect) - свойство препарата преимущественно локализоваться в опухоли при внутривенном введении. Препарат, накопленный в результате пассивной адресной доставки в очаге опухолевого роста, будет активно и избирательно взаимодействовать только с опухолевыми клетками, гиперэкспрессирующими ганглиозид GD2. Таким образом, описанная мультимеризация с использованием молекулы ПЭГ повышает как фармакокинетические, так и фармакодинамические свойства фрагментов антител к GD2.

Нижеследующие примеры приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.

Способы получения фрагментов GD2-специфичных антител

Фрагменты GD2-специфичных антител могут быть произведены с использованием векторов для рекомбинантной экспрессии, известных специалистам. Выбор промоторов и других регуляторных элементов может варьироваться в зависимости от предпочтений специалиста или от выбранной для экспрессии клетки-хозяина. Далее для иллюстрации приведены возможные варианты воплощения изобретения.

Рекомбинантные фрагменты антител могут быть получены по меньшей мере в трех системах экспрессии - в клетках E.coli, Pichia Pastoris и СНО. На основании последовательностей вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей антитела 14G2a (Bolesta Е et al., Cancer Res., 2005, Apr 15; 65(8):3410-8) был проведен дизайн конструкций scFv- и Fab-фрагментов GD2-специфичных антител. кДНК scFv- и Fab-фрагментов, оптимизированные для максимальной экспрессии в соответствующей системе были синтезированы в компании Genscript. Аминокислотные последовательности фрагментов антител, используемые в предпочтительных вариантах изобретения, приведены в Таблице 1.

Для экспрессии в E.coli scFv- и Fab-фрагментов GD2-специфичных антител соответствующие кДНК были встроены в вектор pET22b+ по рестриктным сайтам Ndel и Xhol. Идентичность конструкций ожидаемым была подтверждена секвенированием. Для экспрессии конструкции pET22b+/scFv и pET22b+/Fab трансформировали в штаммы Е. coli Rosetta2(DE3)pLysS или HMS174(DE3)pLysS, и проводили индукцию экспрессии по стандартному протоколу, известному специалистам, в течение 4 ч при 25°С или 22 ч при 20°С. Количество, а также локализацию белка оценивали при помощи BugBuster Protein extraction reagent (Novagen, USA) в соответствии с инструкцией производителя. Для выделения тотальной фракции белка клетки Е. coli, осажденные из 0.5 л культуры, тщательно ресуспендировали в 5 мл холодного лизирующего буфера (50 мМ NaH₂PO₄, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазол, 0.5 мМ фенилметилсульфонил фторид (PMSF), рН 7.2) и дополнительно охлаждали в течение 15 мин на льду. Затем суспензию обрабатывали ультразвуком до полного разрушения клеток. Полученный лизат центрифугировали при 10000 g в течение 20 мин. при 4°С. Осадок, содержащий клеточный дебрис, удаляли. Перевод белка в конечный буфер (фосфатный буфер (PBS), дополненный 0.02% NaN₃) осуществляли центрифугированием на фильтрах Amicon Ultra-4 с диаметром пор 10 кДа.

Для экспрессии в Pichia pastoris scFv- и Fab-фрагментов GD2-специфичных антител соответствующие кДНК были встроены в вектор pPICZalphaB по сайтам рестрикции Xhol/Notl. При этом пропептид для секреции (альфа-фактор из Saccharomyces cerevisiae) находился в одной рамке считывания с фрагментами антител. Для отщепления альфа-фактора были предусмотрены сайты действия протеаз Кех2 (EKRE) и Ste13 (ЕА ЕА). Клонирование проводили в стандартном штамме Е. coli XL1-blue, селекцию осуществляли при посеве на низко-солевую среду LB с 25 мкг/мл зеоцина. Методом электропорации трансфицировали клетки Pichia pastoris штаммов GS115 и smd1168h согласно инструкции к EasySelect Pichia Expression Kit (Invitrogen). Трансформанты сеяли на среду YPDS-агар с разной концентрацией зеоцина (500-2000 мкг/мл), трансформанты вырастали на 4-5 сутки. Полученные колонии рассевали для получения отдельных клонов, которые высевали на среду BMGH в 24-луночные планшеты и инкубировали при 30°С и 200 об/мин трое суток. Затем клетки собирали центрифугированием при 1500×g и комнатной температуре, и высевали на среду ВММН в 24-луночные планшеты. После чего инкубировали при 30°С и 200 об/мин в течение 4 суток. Каждые сутки добавляли 0,5% метанола. После окончания инкубации клетки отделяли центрифугированием при 5000×g, супернатанты оставляли для анализа.

Для экспрессии в клетках линии СНО scFv- и Fab-фрагментов GD2-специфичных антител соответствующие кДНК были встроены в векторы для стабильной экспрессии в клетках СНО линии DXB-11, дефицитной по гену дигидрофолатредуктазы (DHFR). Для Fab-фрагмента получение кодирующей последовательности легкой цепи ДНК проводили методом ПЦР; далее использовали клонирование по сайтам Xbal и Notl в экспрессионный вектор pcDNA3.3 с измененным полилинкером (Thermo Fisher Scientific). Клонирование части тяжелой цепи осуществляли в вектор pOptiVec (Thermo Fisher Scientific) с использованием рестриктных сайтов Xbal и Nhel. Для гена scFv-фрагмента использовали клонирование по сайтам Xbal и Notl в экспрессионный вектор pcDNA3.3. Полученные конструкции проверяли секвенированием. Препараты ДНК очищали с помощью ионообменной хроматографии и использовали для трансфекции клеток DXB-11. Введение экспрессионных конструкций в клетки осуществляли с помощью электропорации на приборе Gene Pulser Xcell System (BioRad), с использованием смеси плазмид, несущих тяжелую и легкую цепи антитела. Спустя 48 часов после начала трансфекции проводили смену среды культивирования на бессывороточную среду, содержащую 200 мкг/мкл G418 и лишенную гипоксантина и тимидина. Культивирование продолжали 19 дней, в течение которых проводили регулярное измерение клеточной плотности и жизнеспособности. После достижения устойчивых показателей роста (жизнеспособность выше 95% и время удвоения - не более 30 часов) стабильный клеточный пул клонировали лимитирующими разведениями (1 клетка на лунку 96 луночного планшета). В среду для клонирования клеток добавляли низкие концентрации метотрексата (25нМ). Спустя еще 14 дней позитивные по росту клеток лунки анализировали с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) на предмет секреции фрагментов антител. Колонии с максимальными значения продукции масштабировали до 24 луночных планшетов и подвергали второму раунду амплификации с использованием 100 нМ метотрексата. Клоны с максимальными значениями продуктивности дополнительно амплифицировали при 250 и 500 нМ метотрексата, после чего повторно клонировали методом лимитирующих разведений, как описано выше.

Полученные финальные клоны с максимальными значениями продуктивности и хорошими показателями роста масштабировали и далее культивировали в суспензионной культуре для получения препаративных количеств фрагментов антител.

Выделение и очистка фрагментов антител на примере экспрессии в E.coli

Для очистки scFv-фрагментов к полученным лизатам добавляли 50% суспензии Ni-NTA-агарозы и инкубировали 1 ч при 4°С при легком перемешивании. Затем суспензию переносили в колонку и дважды промывали буфером, содержащим 50 мМ NaH₂PO₄, 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол (рН 7.2). Элюцию проводили буфером, содержащим 50 мМ NaH₂PO₄, 300 мМ NaCl, 250 мМ имидазол (рН 7.2).

Для выделения и очистки Fab-фрагментов из клеточных лизатов использовали колонку с Protein L агарозой из набора реактивов HiTrap Protein L (GE Healthcare, США). После промывки и активации колонки связывающим буфером на нее наносили лизат клеток E.coli. Колонку промывали от несвязавшихся белков, затем элюировали Fab-фрагменты, используя элюирующий буфер. Очищенные фрагменты собирали в 15 мл пробирку, содержащую 750 мкл нейтрализующего буфера. Нейтрализованный раствор Fab-фрагментов переводили в фосфатный буфер (PBS), содержащий азид натрия (0.02%), центрифугированием через фильтры Amicon Ultra (максимальная пропускающая способность 100 кДа) при 1000 g в течение 20 мин.

Чистота полученных Fab- и scFv-фрагментов по белковому электрофорезу составила >95%. Полученные препараты были переведены в PBS, рН 7,4, и затем стерилизованы фильтрацией через мембрану с размером пор 0,22 мкм. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм.

Мультимеризация scFv- и Fab-фрагментов GD2-специфичных антител через пегилирование

Мультимеризация является одной из стратегий улучшения фармакокинетических и фармакодинамических свойств фрагментов антител. Больший молекулярный размер мультимеров на основе фрагментов антител способствует увеличению периода полужизни в сыворотке, а также более быстрому поглощению опухолью за счет EPR-эффекта, что приводит к их лучшему накоплению в опухоли по сравнению с исходными IgG антителами или мономерами фрагментов. Кроме того, мультимеризация, как правило, способствует мультивалентности против антигена-мишени, которая приводит не только к более высокой аффинности благодаря эффекту авидности, но также может способствовать улучшению функциональных свойств и компенсировать отсутствие индукции вторичных иммунных функций ADCC и CDC. В случае моноклональных антител к ганглиозиду GD2 Fc-фрагмент полноразмерных антител во многом определяет побочные эффекты, и иммунные механизмы ADCC и CDC имеют ограниченный положительный терапевтический эффект. В связи с этим, создание мультимерных фрагментов GD2-специфичных антител для терапии онкологических заболеваний имеет значительный потенциал.

В то же время мультимеры фрагментов антител, полученные стандартными способами, такими как использование стерической агрегации, формирования цистеиновых мостиков или кроссшивающих реагентов, часто характеризуются крайне низкой стабильностью и проблемами с масштабированием, что ограничивает перспективы их использования.

Одной из стратегий увеличения времени полужизни терапевтических молекул в кровотоке является увеличение гидродинамического объема молекулы путем связывания с инертными полимерами, такими как полиэтиленгликоль или другими гидрофильными полимерами. Причем только полиэтиленгликоль (ПЭГ)-производные белков одобрены FDA и другими регуляторными ведомствами для использования в медицине. Действительно, слияние или конъюгация различных пептидных молекул с полимерами существенно повышает их время полужизни, что было подтверждено экспериментально и в клинической практике.

Для усиления терапевтического потенциала фрагментов GD2-специфичных антител и улучшения их фармакокинетических свойств авторами было использовано сайт-направленное пегилирование, целью которого было не только увеличение времени циркуляции фрагментов в крови, но и усиление цитотоксических свойств за счет получения стабильных мультимеров фрагментов GD2-специфичных антител. Для получения ди-, три- и тетрамеров фрагментов антител использовали стандартные реагенты ПЭГ-малеимид2 и ПЭГ-малеимид4 (JenKem Technology USA, https://www.jenkemusa.com). Использованные производные ПЭГ позволяют присоединять к одной молекуле ПЭГ несколько (от 1 до 4) молекул фрагментов. Схемы реакций пегилирования представлены на Рис. 1.

Для проведения реакции пегилирования scFv- и Fab-фрагментов моноклональных антител к раствору фрагментов (2.5 мг/мл) в буфере для пегилирования (20 mM фосфатный буфер, с добавлением 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, рН 7.5) добавляли стоковый раствор 15 mM ТСЕР до достижения конечной концентрации ТСЕР 0.1 mM. Инкубацию проводили при комнатной температуре в течение 90 мин при аккуратном перемешивании. От восстановителя избавлялись центрифугированием через фильтры Amicon Ultra-4 (максимальная пропускающая способность 10 кДа), либо используя колонки для высаливания Zeba Desalting Columns (TermoFisher, США). Затем к раствору фрагментов антител добавляли соответствующие растворы малеимид-ПЭГ, в различных соотношениях. Инкубация длилась 16-18 ч при комнатной температуре с аккуратным перемешиванием на шейкере. На Рис. 2 представлены примеры пегилирования фрагментов GD2-специфичных антител (в формате scFv) с использованием ПЭГ-малеимид2 и ПЭГ-малеимид4. Эффективность пегилирования оценивали с помощью ПААГ-электрофореза. После подбора оптимальных условий проведения пегилирования выход реакций составлял не менее 90% (Рис. 1).

Для разделения полученных пегилированных фрагментов и получения чистых фракций, содержащих индивидуальные моно- и мультимеры фрагментов антител, проводили хроматографическую очистку с использованием анионообменной хроматографии или гель-фильтрации.

В одном из вариантов, для разделения полученных продуктов реакций пегилирования фрагментов антител проводили катионообменную хроматографию на колонке TSK-GEL SP-5PW с использованием ВЭЖХ-системы Beckman System gold, подвижная фаза: элюирующий буфер (25 мМ СН₃СООН, рН 4.0), линейный градиент 0 mM - 250 mM NaCl (в течение 90 мин при комнатной температуре, скорость потока была выбрана 1 мл/мин).

Альтернативно, для разделения полученных продуктов реакций пегилирования использовали гель-фильтрацию (эксклюзионную хроматографию) - колонку Superdex 200 10/30 GL и элюент PBS, пропущенный через фильтр 0.22 мкм. Скорость потока была выбрана 0.6 мл/мин.

В качестве иллюстрации, на Рис. 3 представлены хроматограммы разделения scFv-фрагментов после проведения пегилирования с использованием ПЭГ-малеимид2 и разделения модифицированных фрагментов методом гель-фильтрации на колонке Superdex 200 10/30 GL.

Оценка антиген-связывающих свойств пегилированных фрагментов GD2-специфичных антител.

После хроматографической очистки полученные пегилированные моно- и мультимеры фрагментов антител сравнивали по эффективности связывания с ганглиозидом GD2 стандартными методами, которые известны специалистам, а именно, методами ИФА и проточной цитофлуориметрии.

Оценка связывания различных фрагментов GD2-специфичных антител показала, что пегилирование с сохранением мономерной формы фрагментов не приводит к уменьшению взаимодействия с ганглиозидом GD2 относительно непегилированных фрагментов, а пегилирование с образованием мультимерных фрагментов GD2-специфичных антител показывало значимое увеличение связывания с антигеном (почти в 2 раза по сравнению с scFv и моно-scFv-ПЭГ), что подтверждалось как методом ИФА, так и окрашиванием полученными фрагментами и вторичными FITC-меченными анти-FLAG-антителами GD2-позитивных опухолевых линий с последующей оценкой на проточном цитофлуориметре (Рис 4).

Оценка цитотоксических эффектов пегилированных фрагментов GD2-специфичных антител.

Мультимеризация фрагментов антител приводила к усилению антиген-связывающей способности фрагментов антител и, потенциально, к увеличению цитотоксических свойств молекул. В то же время важными параметрами для проявления противоопухолевых эффектов терапевтических молекул является их размер и масса. Например, молекулы с массой более 150 кДа имеют ограниченный потенциал в клинике в силу неспособности проходить через стенки сосудов. В связи с этим, мультимеры фрагментов антител с молекулярной массой более 150 кДа не использовались в дальнейшей работе. Под данное ограничение не попадали и были проанализированы в последующих цитотоксических тестах моно-, ди- и тетра-scFv-ПЭГ, а также моно- и ди-Fab-ПЭГ.

Сравнительная оценка цитотоксических эффектов, индуцируемых фрагментами GD2-специфичных антител и их пегилированными производными, проводилась с использованием нескольких классических методов, а именно при помощи МТТ-теста, PI-теста, а также при помощи ДНК-красителя 7-AAD. В качестве клеточной модели исследования была использована линия мышиной лимфомы EL-4, которая характеризуется гиперэкспрессией ганглиозида GD2.

МТТ тест проводили с использованием стандартной колориметрической процедуры. Клетки GD2-позитивных опухолевых линий инкубировали в 96-луночных планшетах с последовательными разведениями фрагментов GD2-специфичных антител в течение 72 ч, затем центрифугировали (8 мин, 300 g), осадок суспендировали и добавляли по 30 мкл/лунка раствора МТТ (5 мг/мл в PBS). После выпадения кристаллов формазана (2-4 ч) его растворяли добавлением 100 мкл DMSO. Оптическое поглощение измеряли на спектрофотометре для планшетов Multiscan FC (Thermo Scientific, США) при длине волны 540 нм.

Окрашивание пропидиум иодидом (PI) проводили по методике, известной специалистам. Вкратце, после окончания инкубации с фрагментами антител и их пегилированными производными (10 мкг/мл в течение 24 ч), клетки EL-4 осаждали, фиксировали ледяным 70% EtOH в течение 1 ч при 4°С, дважды отмывали в PBS (300 g, 10 мин, 4°С). Затем клетки ресуспендировали в растворе для окрашивания ДНК (PBS, содержащий 20 мкг/мл PI и 10 мкг/мл РНКазы). Измерения проводили на проточном цитофлуориметре EPICS ELITE (Coulter, США). В каждом образце регистрировали не менее 1×10⁴ клеток. На гистограммах клетки с фрагментированной ДНК, дифференцировали от нормальных клеток по более низкой интенсивности флуоресценции. Обработку результатов проводили с использованием программы WinMDI.

Оценку проницаемости плазматической мембраны клеток проводили с помощью флуоресцентного ДНК-красителя 7-AAD. Перед окрашиванием клетки однократно отмывали в PBS и к осадку добавляли 0.5 мл раствора 7-AAD (2 мкг/мл). Флуоресценцию клеток регистрировали цитофлуориметрически. В каждом образце регистрировали не менее 1×10⁴ клеток. Обработку результатов проводили с использованием программы WinMDI.

На Рис. 5 представлены данные цитотоксической активности scFv-фрагментов GD2-специфичных антител и их пегилированных производных (мономеров, димеров и тетрамеров).

В МТТ-тесте жизнеспособность клеток EL-4 под действием scFv-фрагментов, а также их мономерных пегилированных производных падала примерно до 75%, в то время как пегилированные димеры scFv-фрагментов снижали жизнеспособность опухолевых клеток примерно до 50%, а в случае тетрамеров scFv-фрагментов жизнеспособность клеток при максимальных концентрациях фрагментов снижалась ниже 40% (Рис. 5А). Методом проточной цитофлуориметрии в PI- и 7-AAD-тестах было также показано, что инкубация клеток с scFv-фрагментами и их пегилированными мономерами приводила к увеличению количества клеток с фрагментированной ДНК и клеток с нарушением целостности плазматической мембраны относительно интактных клеток уже через 24 часа (Рис. 5Б). Данная активность была сравнима для обоих типов белка, и количество мертвых клеток увеличивалось примерно в два раза относительно интактных клеток. В случае пегилированных димеров и тетрамеров scFv-фрагментов индукция клеточной гибели в PI- и 7AAD-тестах усиливалась значительно, и пул клеток с индуцированной клеточной гибелью увеличивался относительно контрольных клеток примерно в 4 и 7 раз, соответственно.

В случае Fab-фрагментов цитотоксическая активность немодифицированных белков была выше по сравнению с немодифицированными scFv-фрагментами. Мономеры Fab-фрагментов снижали жизнеспособность на максимальных выбранных концентрациях до 50% по сравнению с контрольными клетками, а димеризация Fab-фрагментов приводила к усилению цитотоксической активности, когда жизнеспособность падала до 30% (Рис. 6). В цитометрических тестах также было получено подтверждение того, что димеризация фрагментов приводит к увеличению функциональной активности белка. Так, исходные Fab-фрагменты и пегилированные мономеры усиливают клеточную гибель примерно в 5 раз, а димеры пегилированных Fab-фрагментов более чем в 10 раз (Рис. 6).

В целом, для scFv- и Fab-фрагментов GD2-специфичных антител было показано, что сайт-направленное пегилирование с сохранением мономерной формы белка не снижает цитотоксической активности фрагментов антител, в то время как пегилирование, приводящее к образованию мультимерных фрагментов антител, усиливает цитотоксические свойства модифицированных белков.

Анализ времени циркуляции модифицированных фрагментов антител в крови мышей линии Balb/c.

Одной из основных целей пегилирования полученных рекомбинантных фрагментов GD2-специфичных антител являлось увеличение времени циркуляции в крови, которое для немодифицированных фрагментов является коротким. Для подтверждения увеличения этого фармакокинетического параметра фрагментов антител за счет их модификации путем пегилирования было проведено сравнение времени нахождения флуоресцентномеченных модифицированных и исходных фрагментов антител в крови мышей линии Balb/c. Для этого была проведена пришивка флуоресцентного красителя Sulfo-Cyanine5 активированного эфира (Sulfo-Cy5) к исходным и пегилированным фрагментам антител. К раствору фрагментов антител добавляли краситель в молярном избытке 10:1. После проведения реакции очистку от несвязанного красителя проводили методом гель-фильтрации, соотношение молекул белка к красителю в конъюгате составило примерно 1:1. Выбор данного флуоресцентного красителя был обусловлен длинноволновым максимумом испускания (662 нм), который позволяет избежать вклада аутофлуоресценции сыворотки крови при оценке интенсивности флуоресценции фрагментов антител в циркулирующей крови. Флуоресцентно-меченные образцы фрагментов антител (100-150 мкл) вводились мышам внутривенно в количестве 150 мкг/мышь (7,5 мг/кг). Контрольным мышам вводился PBS. Через определенные временные интервалы из хвостовой вены мышей проводили отбор крови для последующего получения сыворотки и измерения флуоресценции конъюгата, которая позволяет определить количество фрагментов антител в плазме крови. Полученные сыворотки разводили в 10 раз PBS и проводили измерение интенсивности флуоресценции на планшетном флуориметре Glomax multi detection system (Promega, США) с возбуждением при 625 нм и испусканием при 660-720 нм. На Рис. 7 показаны результаты экспериментов на примере фрагментов антител, модифицированных молекулами ПЭГ с молекулярной массой 10000 Да.

Пегилирование приводит к значительному увеличению времени циркуляции фрагментов антител в крови мышей, как в случае мономеров, так и мультимеров фрагментов антител. Немодифицированные scFv- и Fab-фрагменты выводятся быстро, уже через 30 мин после введения в циркуляции остается менее 10% и 15% от введенного образца, соответственно, через 2,5 ч после введения - только 5 и 8%, соответственно. На этих же временных интервалах в случае пегилированных образцов количество циркулирующих фрагментов антител значительно выше. Так, через 0,5 и 2,5 часа после введения пегилированных мономеров scFv-фрагментов остается более 50% и 20%, а в случае пегилированных мономеров Fab-фрагментов в крови сохраняется 58% и 26% от введенного образца. Мультимеризация приводит к значительному увеличению времени циркуляции фрагментов антител в крови мышей, особенно четко эта закономерность прослеживается для пегилированных тетрамеров scFv-фрагментов и пегилированных димеров Fab-фрагментов. Для данных модифицированных фрагментов GD2-специфичных антител мультимеризация за счет пегилирования приводит к увеличению времени полувыведения фрагментов антител с нескольких минут до нескольких часов (Рис. 7). Так же было показано, что увеличение молекулярной массы ПЭГ и использование молекул ПЭГ разветвленной Y-образной формы (ПЭГ40 Y, https://www.jenkemusa.com/product/y-mal-40k) приводит к увеличению времени циркуляции фрагментов антител в крови (Рис. 8).

Из рисунка видно, что пегилирование линейными молекулами ПЭГ приводит к снижению выведения белка из циркуляции по сравнению с исходными фрагментами и находится в прямой зависимости от молекулярной массы использованных молекул ПЭГ. Пегилирование фрагментов антител молекулами ПЭГ с молекулярной массой 40 кДа и разветвленной Y-образной формой приводит к значительно увеличенному времени циркуляции модифицированных фрагментов антител в крови (Рис. 8). Даже через неделю после введения более 2% от введенного образца scFv-ПЭГ40 Y находится в циркуляции.

Оценка стабильности пегилированных фрагментов GD2-специфичных антител в сравнении с немодифицированными фрагментами.

По литературным данным пегилирование увеличивает стабильность рекомбинантных белков в растворе (Lawrence РВ, Price JL Curr Opin Chem Biol. 2016 34:88-94). Для подтверждения этих данных в контексте фрагментов GD2-специфичных антител мы провели температурный стресс-тест для исходных и модифицированных фрагментов GD2-специфичных антител. В данном тесте использовались 4 варианта пегилированных scFv-фрагментов антител, различающихся молекулярной массой молекул ПЭГ (2 кДа, 10 кДа, 20 кДа и 40 кДа), а также исходные немодифицированные scFV-фрагменты. Все фрагменты в PBS в концентрации 1 мг/мл инкубировались в течение месяца при 37°С. В определенные временные точки проводили центрифугирование образцов при 15 тыс. g в течение 20 мин с целью осаждения агрегировавшего белка. После центрифугирования определялась концентрация белков в надосадочной жидкости и с аликвотой образца проводился ИФА с целью сравнения антиген-связывающих свойств фрагментов до и после стресс-теста (Таблица 2).

Как видно из Таблицы 2, пегилирование более высокомолекулярными молекулами приводит как к образованию меньшего количества агрегатов в растворе, так и к практически полному сохранению антиген-связывающей способности фрагментов антител. В случае исходных фрагментов антител или пегилированных молекулой ПЭГ 2 кДа наблюдается падение стабильности и антиген-связывающих свойств белка уже через неделю после начала стресс-теста.

Несмотря на то что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

1. Мультивалентная конструкция, специфически связывающая ганглиозид GD2, содержащая два, три или четыре функциональных фрагмента антител, специфически связывающих ганглиозид GD2 и соединенных между собой при помощи ковалентной конъюгации с молекулой полиэтиленгликоля.

2. Мультивалентная конструкция по п. 1, характеризующаяся тем, что каждый из фрагментов антител в конструкции содержит по крайней мере

(i) один вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий H-CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 1, H-CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 2, и Н-CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 3, и

(ii) один вариабельный домен легкой цепи, содержащий L-CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 4, L-CDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 5, и L-CDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 6.

3. Мультивалентная конструкция по п. 1, характеризующаяся тем, что содержит два, три или четыре функциональных фрагмента антител, каждый из которых содержит один фрагмент тяжелой цепи, содержащий последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 7, и один фрагмент легкой цепи, содержащий последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 8.

4. Мультивалентная конструкция по п. 1, характеризующаяся тем, что содержит два, три или четыре функциональных фрагмента антител, каждый из которых содержит один фрагмент тяжелой цепи, содержащий последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 9, и один фрагмент легкой цепи, содержащий последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 10.

5. Мультивалентная конструкция по п. 1, характеризующаяся тем, что содержит два, три или четыре функциональных фрагмента антител, каждый из которых содержит последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 11.

6. Мультивалентная конструкция по п. 1, характеризующаяся тем, что содержит два, три или четыре функциональных фрагмента антител, каждый из которых содержит последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 12.

7. Мультивалентная конструкция по п. 1, характеризующаяся тем, что содержит два, три или четыре функциональных фрагмента антител, каждый из которых содержит последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 13.

8. Мультивалентная конструкция по п. 1, характеризующаяся тем, что содержит два, три или четыре функциональных фрагмента антител, каждый из которых содержит последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 14.

9. Мультивалентная конструкция по п. 1, характеризующаяся тем, что используемая для конъюгации молекула полиэтиленгликоля имеет линейную структуру и молекулярную массу от 5 до 40 кДа.

10. Мультивалентная конструкция по п. 1, характеризующаяся тем, что используемая для конъюгации молекула полиэтиленгликоля имеет разветвленную структуру и молекулярную массу от 5 до 40 кДа.

11. Фармацевтическая композиция для лечения онкологического заболевания, содержащая мультивалентную конструкцию по любому из пп. 1-10 в терапевтически эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель, при этом онкологическое заболевание представляет собой GD2-позитивную опухоль или опухоль, отдельные клеточные субпопуляции которой экспрессируют ганглиозид GD2.

12. Способ лечения онкологического заболевания, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п. 11, при этом онкологическое заболевание представляет собой GD2-позитивную опухоль или опухоль, отдельные клеточные субпопуляции которой экспрессируют ганглиозид GD2.

13. Способ лечения по п. 12, в котором GD2-позитивная опухоль представляет собой нейробластому, ретинобластому, меланому, мелкоклеточный рак легких, остеосаркому, рабдомиосаркому, глиому или саркому Юинга.

14. Способ уничтожения клетки в организме субъекта, на поверхности которой находится ганглиозид GD2, включающий введение этому субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п. 11.