Способ оценки агрегационной активности тромбоцитов

Изобретение относится к области медицины, а именно к области лабораторной диагностики, кардиологии, онкологии, терапии, и может быть использовано для оценки агрегационной активности тромбоцитов. Способ включает забор пробы крови, добавление индуктора агрегации к исследуемой пробе с последующим определением величины агрегации, тест проводят с цельной стабилизированной кровью с помощью низкочастотной пьезотромбоэластографии (НПТЭГ), для этого в кювету с пробой крови в объеме 0,38 мл добавляют 0,07 мл индуктора агрегации тромбоцитов АДФ, затем в течение 10 минут регистрируют кривую интенсивности агрегации тромбоцитов, причем запись проводят дважды: исходную до назначения препарата и контрольную после приема антиагрегантного препарата, далее определяют площадь сектора (S), ограниченного с одной стороны кривой, с другой - осью абсциссы. При превышении значения площади (S) относительно площади сектора (S₁), рассчитанной по референтным значениям контрольной группы условно здоровых лиц, равной 200-550 о.е., определяют повышение агрегационной активности тромбоцитов, а при снижении значения площади сектора (S) относительно площади сектора (S₁) определяют снижение агрегационной активности тромбоцитов. Изобретение обеспечивает сокращение времени подготовки образца крови для тестирования, повышение точности способа, возможность количественной оценки агрегационной активности тромбоцитов. 5 ил., 1 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к области лабораторной диагностики, кардиологии, онкологии, терапии, и может быть использовано для оценки агрегационной активности тромбоцитов.

Тромбоциты выполняют множество функций в поддержании гомеостаза организма, однако основной их функцией выступает участие в гемостазе, обусловленное ангиотрофической и адгезивно-агрегационной функциями [Балуда В.П. и др., 1980].

Под воздействием факторов, стимулирующих активацию тромбоцитов (тромбин, коллаген, АДФ, адреналин и т.д.), происходит их активация, функционально проявляющаяся изменением формы и экспонированием вторичных рецепторов, ключевыми из которых является GP IIb/IIIa. Помимо этого в процессе активации тромбоцита происходит экстернализация фосфатидилсерина с внутреннего слоя мембраны на наружный, результатом перемещения которого служит образование поверхности, на которой протекают гемокоагуляционные реакции [Кузник Б.И., 2010]. Являясь одним из основных составляющих тромбинового каскада, в условиях повышения агрегационной активности тромбоциты становятся первичным звеном, инициирующим фибриногенез. Это происходит за счет ряда причин, среди которых: изменение регионального кровотока, снижение тромборезистентности эндотелия (увеличение уровня эндотелина, тромбоксана А2 и т.д.) и др. [Бойцов С.А. 2004; Мазуров А.В., 2011].

В связи с вышеописанным, для предотвращения тромботических осложнений как при кардиологических заболеваниях, так и при других нозологиях, большое значение уделяется антиагрегантной терапии, составляющими которой являются ингибиторы ЦОГ-1 тромбоцитов, блокаторы P₂Y₁₂-рецепторов, антагонисты GPIIb/IIIa-рецепторов, ингибиторы фосфодиэстеразы и т.д., применяемые в виде монотерапии, а также в виде двойной антиагрегантной терапии. Множество из проводимых исследований выявляют не только резистентность к получаемой антиагрегантной терапии, но также и извращенный ответ, проявляющийся повышением функциональной активности форменных элементов крови после приема антиагреганта.

Вышеперечисленное диктует необходимость мониторинга эффективности применения антиагрегантов для профилактики развития тромботических осложнений на фоне длительной, а зачастую пожизненной терапии.

Известен способ определения агрегационной активности тромбоцитов методом низкочастотной контактной кондуктометрии. Суть метода заключается в измерении электропроводности цельной венозной нестабилизированной крови пропусканием через нее переменным током с частотой 200 Гц. Пробу крови помещают в термостатированную ячейку, погружают в нее пластинчатые электроды, соединенные с частотным генератором и блоком регистрации. За счет динамического изменения электрического сопротивления исследуемого образца крови, возникающего при коагуляции, происходит изменение проводимости, по которому оценивают наличие гипо- или гиперкоагуляционного состояния [Патент РФ №2282855, опубл. 27.08.2006]. Однако данный метод обладает рядом недостатков, среди которых: дороговизна измерительной ячейки, возникновение поляризационных явлений, приводящих к погрешности, и разрушение электродов за счет электролиза, возникающего за счет прямого контакта электродов с исследуемым образцом.

Наиболее близким к предлагаемому является способ оценки агрегации тромбоцитов турбидиметрическим методом (по Борну), на данный момент времени считающийся «золотым стандартом». Данный метод заключается в регистрации изменений светопропускания обогащенной тромбоцитами плазмы, произошедших в результате добавления индуктора агрегации тромбоцитов (АДФ, арахидоновая кислота и др.). При этом агрегация тромбоцитов отображается графически регистрируемым снижением оптической плотности и повышением светопропускания плазмой крови [Harrison Р. Platelet function analysis // Blood Reviews, 2005. Vol. 19. P. 111-123].

Основными недостатками данного метода являются: многоэтапный длительный преаналитический период пробоподготовки [Moffat K.A., Hayward С.Р., Raby A. Platelet Function Testing Performed by Light Transmittance Aggregometry // Hematology-coagulation. 2009. C. 1-8.], недостаточная точность измерений, обусловленная тем, что используют обогащенную тромбоцитами плазму, что исключает присутствие физиологического окружения тромбоцитов другими форменными элементами крови и т.д. в исследуемом образце, при этом не учитывается вклад, который вносит их взаимодействие с тромбоцитами. Также недостатком является невозможность осуществления количественной оценки агрегационной активности тромбоцитов.

Новым техническим результатом изобретения является сокращение времени подготовки образца крови для тестирования (отсутствие многоэтапного длительного преаналитического периода пробоподготовки), повышение точности способа за счет сохранения физиологического окружения тромбоцитов, возможность количественной оценки агрегационной активности тромбоцитов.

Для достижения нового технического результата в способе оценки агрегационной активности тромбоцитов, включающем забор пробы крови, добавление индуктора агрегации к исследуемой пробе с последующим определением величины агрегации, отличающемся тем, что тест проводят с цельной стабилизированной кровью с помощью низкочастотной пьезотромбоэластографии, для этого в кювету с пробой крови в объеме 0,38 мл добавляют 0,07 мл индуктора агрегации тромбоцитов, затем в течение 10 минут регистрируют кривую интенсивности агрегации тромбоцитов, далее определяют площадь сектора (S), ограниченного с одной стороны кривой, с другой - осью абсциссы, и при превышении значения площади (S) относительно площади сектора (S₁), рассчитанного по референтным значениям контрольной группы условно здоровых лиц, определяют повышение агрегационной активности тромбоцитов, а при снижении значения площади (S2) относительно площади сектора (S₁) определяют снижение агрегационной активности тромбоцитов.

Способ осуществляют следующим образом. У пациента из кубитальной вены, без наложения жгута, трехкомпонентным силиконированным шприцем, объемом 1 мл, производят забор цельной венозной крови. В течение 10 секунд от момента забора, кровь помещают в кювету, располагающуюся в термостате аппаратно-программного комплекса для клинико-диагностических исследований реологических свойств крови (АРП-01 М «Меднорд», Россия. Регистрационное свидетельство № ФСР 2010/09767 от 30 декабря 2010 года). В кювету помещают кровь в объеме 0,38 мл и добавляют 0,07 мл индуктора агрегации тромбоцитов. Интенсивность агрегации тромбоцитов регистрируют в виде кривой на экране персонального компьютера в течение 10 минут, под которой рассчитывают площадь (S). С помощью программы ИКС-ГЕМО 3-М и при превышении значения площади (S) относительно площади сектора (S₁), рассчитанной по референтным значениям контрольной группы условно здоровых лиц, определяют повышение агрегационной активности тромбоцитов, а при снижении значения площади (S₂) относительно площади сектора (S₁) определяют снижение агрегационной активности тромбоцитов.

Способ основан на результатах анализа данных клинических исследований, проведенных у двух групп. Первую группу составили пациенты, нуждающиеся в назначении антиагрегантной терапии (n=10), вторую группу составили условно здоровые добровольцы (n=10), чьи показатели площади (S₁) были определены как референтные значения агрегационной активности тромбоцитов, при наличии информированного согласия исследуемых обеих групп. У пациентов 1-ой группы была проведена сравнительная оценка динамики показателей «S» и «степень агрегации». Определение показателя «степень агрегации» производили методом исследования агрегации тромбоцитов по Борну на анализаторе агрегации «АЛАТ-2» БИОЛА (НПФ БИОЛА, Россия). Запись НПТЭГ проводилась дважды - исходная запись, до назначения препарата, и контрольная, после приема антиагрегантного препарата. Количественные данные представлены в виде Me [LQ; UQ], где Me - медиана, LQ - нижний квартиль, UQ - верхний квартиль, р - достигнутый уровень (Табл. 1 Приложения).

Референтные значения агрегационной активности тромбоцитов условно здоровых добровольцев, выражаемые показателем S₁, по результатам проведенных исследований составили: 324 о.е. [200; 550].

Пример №1

20.07.2016. Здоровый доброволец Д., 36 лет. После получения информированного согласия произведена оценка агрегационной активности тромбоцитов до и после приема клопидогрела (150 мг).

10:00. Проведено обследование: уровень систолического артериального давления - 120, диастолического - 85 мм рт.ст, частота сердечных сокращений 71/мин.

Из кубитальной вены правой руки, без наложения жгута, с использованием иглы от трехкомпонентного силиконированного шприца, производили забор венозной крови в две одноразовые стерильные вакуумные пробирки для взятия крови (BD Vacutainer®), объемом 4,5 мл каждая, содержащие буферный раствор цитрата натрия (соотношение кровь:цитрат 9:1). 0,38 мл крови, взятых из первой пробирки, помещали в стандартную кювету, объемом 0,45 мл, находящуюся в термостате АРП-01 М «Меднорд». После этого в кювету добавляли индуктор АДФ, объемом 0,07 мл в концентрации 2,5×10^-5 моль/л. На фиг. 1 представлена НПТЭГ, отображающая исходную агрегационную активность форменных элементов крови. Значение агрегационной активности тромбоцитов, определяемое методом НПТЭГ, находилось в пределах референтных значений (S=324 о.е.).

Параллельно с проводимым исследованием НПТЭГ проводили исследование агрегационной активности по методу Борна с использованием индуктора АДФ в концентрации 2,5×10^-5 моль/л на обогащенной тромбоцитами плазме. Для получения обогащенной тромбоцитами плазмы использовали центрифугу LABOFUGE 200 (Германия). Содержимое второй пробирки центрифугировали на 3500 оборотах в течение 6 минут. После этого производили запись агрегатограммы с использованием агрегометра Биола АЛАТ-2 (Россия). На фиг. 2 представлена исходная агрегатограмма. Агрегационная активность тромбоцитов находилась в пределах референтных значений (степень агрегации 25%)

10:30. Прием 150 мг клопидогрела.

13:00. По стандартной методике производили забор крови венозной крови в две одноразовые стерильные вакуумные пробирки для взятия крови (BD Vacutainer^®), объемом 4,5 мл каждая, содержащие буферный раствор цитрата натрия (соотношение кровь:цитрат 9:1). 0,38 мл крови, взятых из первой пробирки, помещали в стандартную кювету, объемом 0,45 мл, находящуюся в термостате АРП-01М «Меднорд». После этого в кювету добавляли индуктор АДФ, объемом 0,07 мл в концентрации 2,5×10^-5 моль/л. На фиг. 1 приведена НПТЭГ после проведения пробы. Агрегационная активность тромбоцитов (S) составила 56,7 о.е. Параллельно по вышеописанной методике проводили исследование агрегационной активности тромбоцитов с индуктором АДФ в концентрации 2,5×10^-5 моль/л на обогащенной тромбоцитами плазме (Биола АЛАТ-2, Россия). На фиг. 2 представлена агрегатограмма после приема 150 мг клопидогрела. Агрегационная активность тромбоцитов при проведении индуцированной агрегации по Борну составила 5%.

В ответ на фармакологическую нагрузку (Клопидогрел, 150 мг) регистрировали снижение агрегационной активности тромбоцитов (S) на 82,5%. Агрегационная активность тромбоцитов по данным агрегатометрии (по Борну) после приема 150 мг клопидогрела снизилась на 80%.

Вывод: оценка изменения агрегационной активности тромбоцитов, при сохранении их физиологического окружения, с помощью предлагаемого способа демонстрирует возможность его применения в клинической практике. При этом отпадает необходимость длительного этапа пробоподготовки с целью получения плазмы, насыщенной тромбоцитами, что существенно способствует оптимизации временного ресурса теста.

Пример №2

21.07.2016. Здоровый доброволец Л. 27 лет. После получения информированного согласия произведена оценка агрегационной активности тромбоцитов до и после приема клопидогрела (150 мг).

10:00. Проведено обследование: уровень систолического артериального давления - 118, диастолического - 75 мм рт.ст, частота сердечных сокращений 84/мин. Из кубитальной вены правой руки, без наложения жгута, с использованием иглы от трехкомпонентного силиконированного шприца, производили забор венозной крови в две одноразовые стерильные вакуумные пробирки для взятия крови (BD Vacutainer^®), объемом 4,5 мл каждая, содержащие буферный раствор цитрата натрия (соотношение кровь:цитрат 9:1). 0,38 мл крови, взятых из первой пробирки, помещали в кювету, объемом 0,45 мл, находящуюся в термостате АРП-01 М «Меднорд». После этого в кювету добавляли индуктор АДФ, объемом 0,07 мл в концентрации 2,5×10^-5 моль/л. На фиг. 3 представлена НПТЭГ, отображающая исходную агрегационную активность форменных элементов крови. Значение агрегационной активности тромбоцитов, определяемое методом НПТЭГ, находилось в пределах референтных значений условно здоровых лиц (S=200 о.е.). Параллельно, по вышеописанной методике проводили исследование агрегационной активности тромбоцитов с индуктором АДФ в концентрации 2,5×10^-5 моль/л на обогащенной тромбоцитами плазме (Биола АЛАТ-2, Россия). На фиг. 4 представлена исходная агрегатограмма. Агрегационная активность тромбоцитов достигла 60%.

10:30. Прием 150 мг клопидогрела.

13:00. По стандартной методике производили забор крови венозной крови в две одноразовые стерильные вакуумные пробирки для взятия крови (BD Vacutainer^®), объемом 4,5 мл каждая, содержащие буферный раствор цитрата натрия (соотношение кровь:цитрат 9:1). 0,38 мл крови, взятых из первой пробирки, помещали в стандартную кювету, объемом 0,45 мл, находящуюся в термостате АРП-01М «Меднорд». После этого в кювету добавляли индуктор АДФ, объемом 0,07 мл в концентрации 2,5×10^-5 моль/л. На фиг. 3 приведена НПТЭГ после проведения пробы. Агрегационная активность тромбоцитов (S) составила 35 о.е. Параллельно по вышеописанной методике проводили исследование агрегационной активности тромбоцитов с индуктором АДФ в концентрации 2,5×10^-5 моль/л на обогащенной тромбоцитами плазме (Биола АЛАТ-2, Россия). На фиг. 4 представлена агрегатограмма после приема 150 мг клопидогрела. Агрегационная активность тромбоцитов при проведении индуцированной агрегации по Борну составила 0%.

В ответ на фармакологическую нагрузку (Клопидогрел, 150 мг) регистрировали снижение агрегационной активности тромбоцитов (S) на 82,5%. Агрегационная активность тромбоцитов по данным агрегатометрии (по Борну) после приема 150 мг клопидогрела снизилась на 100%.

Вывод: оценка агрегационной активности тромбоцитов с помощью НПТЭГ с использованием пробы стабилизированной крови, в которой сохранено физиологическое окружение тромбоцитов, позволяет выполнить более объективную оценку их агрегационной активности, что открывает возможность применения предлагаемого способа в клинической практике. Также во время пробоподготовки для получения плазмы, обогащенной тромбоцитами по способу Борна, оказывается физическое воздействие на тромбоциты, что также снижает точность измерений и увеличивает его временной ресурс.

Приложение

Таблица 1. Показатель S₁ здоровых добровольцев, рассчитанный методом НПТЭГ, в о.е.

Фиг. 1. Измерение агрегационной активности тромбоцитов с помощью НПТЭГ (Пример 1):

А1 - кривая исходного уровня агрегационной активности тромбоцитов;

В1 - кривая уровня агрегационной активности тромбоцитов через 2,5 часа от момента приема 150 мг клопидогрела.

Фиг. 2. Измерение агрегационной активности тромбоцитов по методу Борна (Пример 1):

А2 - кривая исходного уровня агрегационной активности тромбоцитов;

В2 - кривая уровня агрегационной активности тромбоцитов через 2,5 часа от момента приема 150 мг клопидогрела.

Фиг. 3. Измерение агрегационной активности тромбоцитов с помощью НПТЭГ (Пример 2):

A3 - кривая уровня агрегационной активности тромбоцитов;

B3 - кривая уровня агрегационной активности тромбоцитов через 2,5 часа от момента приема 150 мг клопидогрела.

Фиг. 4. Измерение агрегации тромбоцитов по методу Борна (Пример 2):

A4 - кривая исходного уровня агрегационной активности тромбоцитов;

В4-кривая уровня агрегационной активности тромбоцитов через 2,5 часа от момента приема 150 мг клопидогрела.

Фиг. 5. Измерение активности агрегации по предлагаемому способу (общая схема): (S) площадь сектора ОАХ, ограниченного с одной стороны кривой А, рассчитанной по показателям, характеризующим повышенную активность агрегации тромбоцитов, а с другой - осью абсциссы ОХ;

(S₁) площадь сектора ОА₁₁Х, ограниченного с одной стороны кривой А₁₁, рассчитанной по референтным значениям контрольной группы условно здоровых лиц, а с другой - осью абсциссы ОХ;

(S₂) площадь сектора ОА₁₂Х, ограниченного с одной стороны кривой А₁₂, рассчитанной по показателям, характеризующим пониженную активность агрегации тромбоцитов, а с другой - осью абсциссы ОХ.

Способ оценки агрегационной активности тромбоцитов, включающий забор пробы крови, добавление индуктора агрегации к исследуемой пробе с последующим определением величины агрегации, отличающийся тем, что тест проводят с цельной стабилизированной кровью с помощью низкочастотной пьезотромбоэластографии (НПТЭГ), для этого в кювету с пробой крови в объеме 0,38 мл добавляют 0,07 мл индуктора агрегации тромбоцитов АДФ, затем в течение 10 минут регистрируют кривую интенсивности агрегации тромбоцитов, причем запись проводят дважды: исходную до назначения препарата и контрольную после приема антиагрегантного препарата, далее определяют площадь сектора (S), ограниченного с одной стороны кривой, с другой - осью абсциссы, и при превышении значения площади (S) относительно площади сектора (S₁), рассчитанной по референтным значениям контрольной группы условно здоровых лиц, равной 200-550 о.е., определяют повышение агрегационной активности тромбоцитов, а при снижении значения площади сектора (S) относительно площади сектора (S₁) определяют снижение агрегационной активности тромбоцитов.