Лекарственное средство для лечения острого миелоидного лейкоза (омл)

Группа изобретений относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой способы лечения Острого Миелоидного Лейкоза (ОМЛ) у пациента старше 65 посредством лекарственного средства и само лекарственное средство, включающее суспензию эритроцитов с инкапсулированной в них аспарагиназой в качестве активного компонента, где одна доза суспензии включает от 50 до 500 МЕ инкапсулированной аспарагиназы на кг веса тела. В данных способах лечения ОМЛ одна или несколько доз суспензии вводятся пациенту в фазу индукции или в течение фазы лечения. Группа изобретений позволяет вводить эффективную дозу L-аспарагиназы пациентам старше 65 лет без токсичного воздействия, посредством инкапсулирования L-аспарагиназы в суспензию эритроцитов. 4 н. и 19 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 10 пр.

 

Настоящее изобретение относится к терапевтическому лечению Острого Миелоидного Лейкоза (ОМЛ). В частности, оно касается новой композиции для лечения этого вида рака и связанного с ним способа терапевтического лечения.

ОМЛ представляет собой гетерогенное клональное заболевание гематопоэтических клеток-предшественников и является самым распространенным злокачественным заболеванием миелоидного ряда у взрослых. Средний возраст обращения к врачу пациентов с ОМЛ составляет около 65 лет.

Последние 30 лет L-аспарагиназа играет ключевую роль в химиотерапии Острого Лимфобластного Лейкоза (ОЛЛ). В настоящее время L-аспарагиназа используется в течение фазы индукции при лечении Острого Лимфобластного Лейкоза у детей и взрослых (<55 лет).

Capizzi R.L. и White C. (The Yale Journal of Biology and Medicine 61 (1988) 11-22) сообщают о значительной эффективности L-аспарагиназы при ОМЛ у взрослых пациентов с трудно поддающимся лечению или впервые рецидивирующим ОМЛ. Пациенты получали высокие дозы цитарабина и 6000 МЕ/м² аспарагиназы.

Okada S. и соавторы (British Journal of Haematology 2003, 123, 802-809) исследовали потенциальную эффективность L-аспарагиназы in vitro при разных подтипах детского ОМЛ. В итоге, клетки типов М1, М4 и М5 ОМЛ были относительно чувствительны к L-аспарагиназе, причем клетки М1 были более чувствительны.

Rubnitz J.E. и соавторы (Blood 2009, 113, 21, 5083-5089) занимались лечением острого недифференцированного лейкоза у детей. Они обследовали тех пациентов, которым не удалось достичь полной ремиссии в результате терапии, направленной на лечение ОМЛ, и которых часто переводили на режим стимуляции преднизоном, винкристином и L-аспарагиназой. Авторы предположили, что лечение бифенотипического лейкоза нужно начинать с одного курса индуктивной терапии ОМЛ-типа с условием перехода на лимфоидный тип индуктивной терапии с глюкокортикоидами, винкристином и L-аспарагиназой, в случае, если реакция пациента незначительна.

Однако, если данная стандартная терапия для детей и взрослых включает введение L-аспарагиназы, фермент вводится позже, в течение фазы закрепления, главным образом, в течение третьей фазы закрепления при лечении. Наконец, в клинике L-аспарагиназа никогда не используется в фазе индукции для пациентов, которым недавно поставили диагноз (начальное лечение ОМЛ).

Кроме того, стандартная терапия для пожилых пациентов с ОМЛ имеет неблагоприятный исход. Известен единственный случай, когда 66-летнюю японку с ОМЛ стимулировали L-аспарагиназой, винкристином и преднизолоном и добивались полной ремиссии. Однако в большинстве случаев пожилые пациенты по состоянию здоровья непригодны к интенсивной химиотерапии, считается, что они не переносят интенсивную химиотерапию, и возможно только паллиативное лечение.

Аспарагиназа представляет собой фермент, продуцируемый бактериальными микроорганизмами (E. coli или Erwinia chrysanthemi), которые использовали в противолейкозной химиотерапии около тридцати лет. Этот фермент гидролизует и уменьшает депо аспарагина, аминокислоты, незаменимой в продукции белков, необходимых для жизни клетки. В отличие от нормальных клеток, злокачественные лимфобластные клетки, очевидно, не имеют возможности продуцировать аспарагин сами и зависимы от его внеклеточных запасов при синтезе своих белков. Лечение аспарагиназой лишает их необходимого элемента и, таким образом, ведет к их гибели. Данное антимитотическое средство является селективным по отношению к опухолевым клеткам.

Нежелательные эффекты, связанные с этим ферментом, хорошо известны, главным из них являются, конечно, аллергии с клиническими симптомами, диабеты и панкреатиты, психические нарушения и нарушения коагуляции. В частности, природная аспарагиназа индуцирует образование циркулирующих антител, вызывая возрастание клиренса аспарагиназы и аллергические реакции, иногда достаточно тяжелые. Более того, из-за короткого периода полураспада фермента (24 часа) необходимы повторные инъекции и госпитализация. Это ведет к появлению пегилированных форм, ПЕГ-аспарагиназе, которая была утверждена Комиссией по контролю за лекарствами и питательными веществами как лечение первой линии при остром лимфобластном лейкозе (ОЛЛ). В конечном счете, индукция антител наблюдалась при трех формах аспарагиназы (E. Coli, Erwinia и ПЕГ-аспарагиназы), хотя пегилированные формы, как оказалось, были менее иммуногенными. По причине преждевременного прерывания лечения из-за аллергических реакций, очень часто не достигается терапевтический результат от аспарагиназы, которая за определенный период истощает депо аспарагина в плазме.

Предметом исследований является инкапсуляция аспарагиназы в эритроцитах для улучшения ее терапевтического индекса. Исследование переносимости инкапсулированной в эритроциты аспарагиназы было предпринято Kravtzoff и соавторами (C. Eur J Clin Pharmacol, 1996; 51(3-4): 221-5). Тринадцати пациентам, страдающим неходжскинскими лимфомами, делали инъекции аспарагиназы, инкапсулированной в эритроциты (30-200 МЕ/кг). Исследование продемонстрировало отсутствие аллергической реакции по сравнению с прямой инъекцией аспарагиназы (27%). Кроме того, инъекции инкапсулированной в эритроциты аспарагиназы позволяют продлить время истощения аспарагина до 50 последующих дней.

С другой стороны, в различных исследованиях (WO-A-2006/016247; Millan C G et al., Journal of Controlled Release, 2004, 95(1):27-49; Kravtzoff R et al., Journal of Pharmacy and Pharmacology, 1990, 42(7):473-476) описывается инкапсуляция аспарагиназы в эритроцитах и улучшение фармакокинетических свойств инкапсулированного фермента в контексте применения при лимфоме и остром лимфобластном лейкозе.

В конечном счете, существует большая потребность в поиске альтернативы современному лечению острого миелоидного лейкоза, которая будет эффективна не только в отношении детей и взрослых, для которых возможно применение интенсивной химиотерапии, но также для пациентов, которые ее не переносят, особенно пожилых, для которых интенсивная химиотерапия невозможна в настоящее время.

Авторы настоящего изобретения выяснили, что эта цель может быть достигнута, и предложили альтернативу в виде использования инкапсулированной в эритроциты L-аспарагиназы. В частности, данная инкапсулированная форма удобна для применения, особенно нерастворимая, в форме суспензии. Она может быть использована на любой стадии лечения химиотерапией, в частности, включая фазу индукции у пациентов, которые проходят первое лечение ОМЛ, или пациентов, у которых ОМЛ диагностировали недавно. Авторы настоящего изобретения также выяснили, что данное лечение подходит для пациентов, не переносящих интенсивную химиотерапию, включая пациентов с недавно диагностированным ОМЛ, особенно пожилых пациентов. Пациенты, для которых раньше была невозможна интенсивная химиотерапия, сейчас не только могут проходить лечение с помощью эффективной химиотерапии, но также могут достигать улучшения своего состояния при введении высокоэффективной частицы, L-аспарагиназы, лечения которой раньше избегали в связи с высоким уровнем нежелательных эффектов. Имеющийся на рынке продукт GRASPA® является примером суспензии человеческих эритроцитов с инкапсулированной в них L-аспарагиназой, который может быть использован для осуществления настоящего изобретения.

Первым объектом настоящего изобретения является суспензия эритроцитов с инкапсулированной в них аспарагиназой в качестве лекарственного средства для лечения Острого Миелоидного Лейкоза (ОМЛ).

Вторым объектом настоящего изобретения является применение суспензии эритроцитов с инкапсулированной в них аспарагиназой для получения лекарственного средства для лечения Острого Миелоидного Лейкоза (ОМЛ).

Третьим объектом настоящего изобретения является способ лечения Острого Миелоидного Лейкоза (ОМЛ), включающий введение эффективного количества суспензии эритроцитов с инкапсулированной в них аспарагиназой.

Дополнительные признаки и различные варианты осуществления изобретения, которые будут теперь представлены, применимы к первому, второму и третьему объектам изобретения.

В одном из вариантов осуществления изобретения пациент является пожилым. Как правило, пожилыми являются люди старше 65 лет.

В другом варианте осуществления изобретения пациент является взрослым человеком (младше 65 лет), человеком среднего возраста (<55 лет) или ребенком.

В одном из вариантов осуществления изобретения любой пациент с ОМЛ проходит лечение при изоляции от пациентов с FAB М3 подтипом.

В одном из вариантов осуществления изобретения лечению подвергается пациент с FAB М1 подтипом. В одном из вариантов осуществления изобретения лечению подвергается пациент с FAB М4 подтипом. В одном из вариантов осуществления изобретения лечению подвергается пациент с FAB М5 подтипом. В одном из вариантов осуществления изобретения лечению подвергаются пациенты с FAB М1, М4 и М5 подтипами. В других вариантах осуществления изобретения лечению подвергаются пациенты с FAB М1 и М4, М1 и М5 или М4 и М5 подтипами.

В одном из варианте осуществления изобретения лечению подвергаются пациенты с ОМЛ-злокачественными клетками, экспрессирующими небольшое количество аспарагинсинтетазы (АСНС).

В одном из вариантов осуществления изобретения пациент не переносит интенсивную химиотерапию. Непереносимость интенсивной химиотерапии означает, что организм пациента не выдерживает или возможно не выдержит токсичности, связанной со стандартной процедурой химиотерапии. Такие пациенты встречаются в любой группе. Это наиболее распространено среди пожилых, особенно среди людей старше 65 лет.

Как правило, эритроциты представляют собой суспензию в фармацевтически приемлемом физиологическом растворе. Он может быть использован в качестве стандартной среды для эритроцитов, в частности, раствор NaCl (предпочтительно 0,9%) с возможным добавлением таких компонентов, как глюкоза, декстроза, аденин и/или маннитол. Может быть использована стандартная среда, которая представляет собой SAG-маннитол и AD-раствор, которые являются растворами на основе которых аденина, глюкозы, маннитола и хлорида натрия. Раствор также может содержать такое антиферментативное средство, как L-карнитин.

В одном из вариантов осуществления изобретения одна доза суспензии включает от 50 до 500 МЕ, предпочтительно от 50 до 200 МЕ, более предпочтительно от 80 до 170 МЕ инкапсулированной аспарагиназы на кг веса тела. Стандартной дозой является 100 МЕ и 150 МЕ аспарагиназы на кг веса тела. По определению, доза представляет собой количество аспарагиназы, введенной пациенту в заданное время.

Инкапсуляция означает, что фермент находится внутри эритроцитов. Возможно, однако, что некоторое незначительное количество аспарагиназы удерживается в стенке эритроцита.

Введение предпочтительно осуществлять путем внутривенной или внутриартериальной инъекции. В одном из подходящих вариантов осуществления изобретения введение осуществляют путем перфузии из мешка с кровью или тому подобное. Введение обычно осуществляют внутривенно в руку или посредством центрального катетера.

Как правило, перфузия или инфузия одной дозы может длиться от 15 до 45 минут.

В одном из вариантов осуществления изобретения дозы суспензии вводят одному и тому же пациенту с промежутком во времени между двумя введениями. Промежуток времени обычно больше или равен 14 дням. Также он может составлять от 14 до 45 дней. Максимальный промежуток времени, около 45 дней, особенно подходит пациентам, имеющим аплазию, развившуюся в результате предыдущего лечения введением доз или лекарственных средств. Врач может контролировать границы аплазии и ввести дозу аспарагиназы после компенсации аплазии.

В соответствии с изобретением, суспензия содержит некоторое количество эритроцитов и некоторое количество инкапсулированной аспарагиназы, которое является достаточным для доставки пациенту назначенной дозы. Как правило, суспензия по изобретению может содержать от 30 до 300 МЕ инкапсулированной аспарагиназы на мл, предпочтительно от 70 до 150 МЕ на мл.

Суспензия может быть готова к использованию и имеет гематокрит, подходящий для введения путем инъекции или перфузии без разбавления.

В одном из вариантов осуществления изобретения суспензия готова к использованию. В соответствии с изобретением, гематокрит суспензии, готовой к использованию, преимущественно находится в интервале от приблизительно 40 до приблизительно 70%, предпочтительно от приблизительно 45 до приблизительно 55% и более предпочтительно составляет приблизительно 50%.

В другом варианте осуществления изобретения суспензию необходимо разбавлять перед использованием, например, перед введением путем инъекции или перфузии. В одном из вариантов осуществления изобретения с разбавлением такой суспензии перед применением гематокрит перед разбавлением находится в интервале от 60 до 90%.

Суспензия предпочтительно упакована по объему от приблизительно 10 до приблизительно 250 мл. Упаковку производят предпочтительно в пакеты для крови такого типа, который подходит для переливания крови. Общее количество инкапсулированной аспарагиназы, соответствующее предписанию врача, предпочтительно содержится в одном пакете для крови и т.п. Также оно может содержаться в нескольких пакетах для крови и т.п.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения суспензию по изобретению используют для первого назначения нуждающемуся в этом пациенту. Пациент может быть единственным, кому недавно поставили диагноз ОМЛ или кто впервые лечится от ОМЛ. Пациент также может иметь рецидив заболевания в настоящий момент или перенести его в прошлом. Использование при первом назначении означает, что суспензию используют в начале лечения или при новом лечении в течение фазы индукции (первая фаза лечения, целью которой является инициация ремиссии). Настоящее изобретение позволяет при введении аспарагиназы на ранней стадии использовать аспарагиназу при интенсивной химиотерапии.

Таким образом, конкретными вариантами осуществления изобретения являются следующие:

- суспензия, согласно изобретению для применения в качестве лекарственного средства в течение фазы индукции при лечении ОМЛ;

- применение суспензии по изобретению для получения лекарственного средства, предназначенного для введения в течение фазы индукции при лечении ОМЛ;

- способ лечения ОМЛ, включающий введение суспензии согласно изобретению в течение фазы индукции при лечении ОМЛ.

Данный вариант осуществления изобретения можно применять по отношению к любому нуждающемуся в этом пациенту, в том числе, преимущественно к пациентам, не переносящим стандартное лечение.

При благоприятном для пациента ходе лечения можно говорить об инициации ремиссии, фаза индукции может следовать за несколькими фазами закрепления, обычно 2 или 3. Суспензию согласно изобретению можно использовать в любой момент в течение хода лечения, т.е. в любую или во всех фазах индукции и закрепления. В одном из вариантов осуществления изобретения суспензию используют во всех фазах.

В одном из вариантов осуществления изобретения суспензию используют в качестве лекарственного средства для лечения множественной терапией или комбинированной терапией пациентов с острым миелоидным лейкозом (ОМЛ). Это значит, что суспензию эритроцитов с инкапсулированной в них аспарагиназой применяют во время химиотерапевтического лечения, в котором используют одно или несколько химиотерапевтических средств.

Под другим химиотерапевтическим средством имеется в виду любое стандартное или новое химическое или биологическое средство для лечения ОМЛ. Некоторые примеры включают: цитарабин (например, Aracytine® или AraC), митоксантрон, амсакрин, этопозид, тиогуанин, преднизолон, винкристин, VP16, даунорубицин, азацитидин, децитабин.

В данном варианте осуществления изобретения другим химиотерапевтическим средством является цитарабин. Цитарабин можно использовать в режиме приема низких доз или в режиме приема высоких доз. При приеме низких доз, это касается режима приема низких доз, применяют стандартный ход лечения. Низкие дозы составляют обычно 10 или 20 мг/м², как правило, два раза в день. В отличие от этого, режим приема высоких доз составляет порядка 200 мг/м²/д (д=день) или более. Низкие дозы определяют в настоящем описании диапазоном от 1 до 100 мг/м²/д, в частности, от 5 до 50 мг/м²/д.

В одном из вариантов осуществления изобретения цитарабин вводят ежедневно, предпочтительно на протяжении 5-15 дней непрерывно, главным образом, в течение 8-12 дней, например, 10 дней.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ лечения острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) включает введение эффективного количества суспензии эритроцитов с инкапсулированной в них аспарагиназой и включает следующую схему фаз индукции:

1-й месяц

Цитарабин

- от 1 до 100 мг/м²/д, в частности, от 5 до 50 мг/м²/д, например, 20, 30 или 40 мг/м²/д,

- в течение 5-15 дней, главным образом, в течение 8-12 дней, например, 10 дней, предпочтительно с Д1 по Д10,

Суспензия эритроцитов с инкапсулированной в них аспарагиназой

- от 50 до 500 МЕ, предпочтительно от 50 до 200 МЕ, более предпочтительно от 80 до 170 МЕ инкапсулированной аспарагиназы на кг веса тела; стандартная доза составляет 100 МЕ и 150 МЕ

- Введение одной дозы после последнего введения цитарабина,

2-й месяц и до окончания фазы индукции, т.е. каждый месяц до 12-го месяца,

Цитарабин

- от 1 до 100 мг/м²/д, в частности, от 5 до 50 мг/м²/д, например, 20, 30 или 40 мг/м²/д,

- в течение 5-15 дней, главным образом, в течение 8-12 дней, например, 10 дней, предпочтительно с Д1 по Д10,

Суспензия эритроцитов с инкапсулированной в них аспарагиназой

- от 50 до 500 МЕ, предпочтительно от 50 до 200 МЕ, более предпочтительно от 80 до 170 МЕ инкапсулированной аспарагиназы на кг веса тела; стандартная доза составляет 100 МЕ и 150 МЕ

- Введение одной дозы в Д1, Д2 или Д3.

В одном из вариантов осуществления изобретения:

1-й период 28 дней

Цитарабин 40 мг/м², например, предлагается 20 мг/м² (два раза в день) с Д1 по Д10, ежедневно

Одна доза суспензии эритроцитов с инкапсулированной в них аспарагиназой 100 МЕ/кг в Д11

2-й период по 28 дней до 12-го месяца

Цитарабин 40 мг/м², например, предлагается 20 мг/м² с Д1 по Д10, ежедневно

Одна доза суспензии эритроцитов с инкапсулированной в них аспарагиназой 100 МЕ/кг в Д1.

В одном из вариантов осуществления изобретения митоксантрон действует совместно с суспензией и цитарабином в течение некоторых фаз, особенно в фазу индукции.

Регистрационный номер CAS для аспарагиназы: 9015-68-3. Ее общепринятым названием является аспарагиназа; другими общими названиями для нее являются: коласпаза, L-аспарагиназа и L-аспарагинаминогидролаза.

В настоящем изобретении термин «аспарагиназа» охватывает аспарагиназу любого происхождения, в частности, она может быть природного или рекомбинантного происхождения, и любое производное аспарагиназы, например, такое как ее ПЕГ-форма или фрагмент, сохраняющий активность L-аспарагиназы. Также он охватывает аспарагиназу независимо от ее бактериального происхождения. Таким образом, аспарагиназа может быть типа E. coli, в частности, E. coli HAP-A-1-3, типа Erwinia chrysanthemi или типа Wolinella succinogenes. Под «типом» понимается то, что он может быть получен из культуры одноименных бактерий или что он может быть рекомбинантным, другими словами, это форма аспарагиназы этих бактерий, полученная путем генной инженерии. В предпочтительном варианте осуществления это тип E. coli HAP-A-1-3.

Термин «аспарагиназа» также охватывает подобные аспарагиназе вещества, которыми в рамках настоящего изобретения являются бактериальные ферменты, обладающие L-аспарагинаминогидролазной активностью. В качестве примера можно привести Acinetobacter glutaminase asparaginase (AGA).

Предпочтительно эритроциты являются эритроцитами человеческого происхождения. В одном из вариантов осуществления изобретения используют эритроциты самого пациента.

Технологии, с помощью которых возможно инкапсулирование в эритроциты активных компонентов, известны и базируются на технологии лизис-запечатывание, которой в настоящем описании отдается предпочтение и которая описывается в патентах EP-A-101341 и EP-A-679101, на которые специалисты в данной области техники могут сослаться. Согласно данной технологии основное отделение диализной установки (например, диализный мешок или диализный картридж) непрерывно питается суспензией эритроцитов, тогда как вторичное отделение содержит водный раствор для лизирования эритроцитов, гипотонический по отношению к суспензии эритроцитов; затем, в установке запечатывания, запечатывание эритроцитов проводится в присутствии аспарагиназы под возрастающим осмотическим и/или онкотическим давлением, и затем собирается суспензия эритроцитов, содержащих аспарагиназу.

Среди вариантов, описанных к настоящему времени, предпочтительным является способ, описанный в WO-A-2006/016247, который делает возможным инкапсулирование аспарагиназы эффективным, воспроизводимым, надежным и стабильным методом. Этот способ включает следующие стадии:

1 - суспензия сгустка эритроцитов в изотоническом растворе с уровнем гематокрита, который выше или равен 65%, охлаждение в диапазоне между +1 и +8°C,

2 - измерение осмотической резистентности с использованием образца эритроцитов из вышеупомянутого сгустка частиц, возможно осуществление стадий 1 и 2 в любом порядке (включая параллельный),

3 - процедура лизиса и интернализации аспарагиназы внутри камеры, при температуре постоянно поддерживаемой в диапазоне от +1 до +8°C, включая переход суспензии эритроцитов на уровень гематокрита, который выше или равен 65%, и гипотонического лизирующего раствора, охлажденного в диализном картридже до температуры от +1 до +8°C, причем параметры лизиса подбираются на основе предшествующего измерения осмотической резистентности; и

4 - процедура запечатывания проводится в присутствии гипертонического раствора во второй камере, внутри которой температура составляет от +30 до +40°C.

Под «интернализацией» следует понимать проникновение аспарагиназы внутрь эритроцитов.

В частности, для диализа сгусток эритроцитов суспендируют в изотоническом растворе при высоком уровне гематокрита, который выше или равен 65%, предпочтительно выше или равен 70%, и данная суспензия охлаждается до температуры от +1 до +8°C, предпочтительно от +2 до +6°C, обычно около +4°C. Согласно данному методу, уровень гематокрита находится в диапазоне от 65 до 80%, предпочтительно от 70 до 80%.

Предпочтительно измерять осмотическую резистентность на эритроцитах только перед стадией лизиса, в присутствии или в отсутствие аспарагиназы в суспензии. Эритроциты или суспензию, содержащую их, хранят преимущественно при температуре, близкой или равной температуре, выбранной для лизиса. Согласно другой значимой характеристике изобретения, измерение осмотической резистентности проводят быстро, другими словами, процедуру лизирования проводят после взятия образца в короткие сроки. Предпочтительно, чтобы промежуток времени между взятием образца и началом лизиса составлял или был меньше 30 минут, лучше был меньше или равен 25 и даже 20 минутам.

Для более детального рассмотрения метода проведения процедуры лизис-запечатывание с измерением и поправкой на осмотическую резистентность, специалисты в данной области техники могут обратиться к WO-A-2006/016247.

Настоящее изобретение будет теперь описано более подробно с помощью способов реализации, принятых в качестве неограничивающих примеров.

На фигурах 1 и 2 представлены графики, иллюстрирующие способы определения времени полураспада аспарагиназы или инкапсулированной аспарагиназы.

Пример 1: Способ для инкапсулирования в мышиные эритроциты L-аспарагиназы

L-аспарагиназу (Kidrolase®, OPI-EUSA Limonest France) инкапсулируют в мышиные эритроциты (мыши OF1) методом гипотонического диализа в диализной сумке. Кровь предварительно центрифугируют для отделения плазмы, а затем 3 раза промывают 0,9% NaCl. Гематокрит доводят до 70% в присутствии аспарагиназы, перед началом диализа добавляют до конечной концентрации 400 МЕ/мл эритроцитов или красных кровяных клеток (RBC). Диализ длится 50 минут при 4°C за счет лизирующего буфера низкой осмолярности. Затем мышиные эритроциты запечатывают добавлением раствора с высокой осмолярностью и инкубируют 30 минут при 37°C. После двух промываний 0,9% NaCl и одного промывания Sag-маннитололом с добавлением бычьего сывороточного альбумина бычьей сыворотки BSA (6%) гематокрит эритроцитов доводят до 50%. Инкапсулированная в эритроциты L-аспарагиназа называется L-Aspa RBC. При инкапсуляции получают L-Aspa RBC в концентрации 40 МЕ аспарагиназы/мл RC при уровне гематокрита 50%.

В ходе процедуры инкапсуляции вся кровь, промытая RBC, RBC совместно с L-аспарагиназой (перед диализом) и RBC, нагруженными L-аспарагиназой (после диализа), тестируют на:

- гематокрит (Ht)

- средний объем осажденных частиц (ACV)

- среднюю концентрацию гемоглобина в эритроците (ACHC)

- общую концентрацию гемоглобина и

- количество клеток.

Аликвоты клеточных суспензий извлекают перед и после гипотонического диализа для измерения активности фермента L-аспарагиназы. Оценку L-аспарагиназы проводят согласно протоколу, опубликованному в: Orsonneau et al., Ann Biol Clin, 62:568-572.

Пример 2: Определение фармакокинетических и фармакодинамических параметров L-Aspa RBC у мышей

Мышиная L-Aspa RBC была введена OF1 мышам для определения времени полураспада L-Aspa RBC при циркуляции у мышей и демонстрации истощения депо L-аспарагина в плазме мышей. Каждой мыши была введена внутривенно разовая доза 200 МЕ/мл.

Время полураспада L-Aspa RBC составляет 12,39±0,74 дней (расчет основан на активности фермента). Если время полураспада L-Aspa RBC у мышей оценивали по методу клеточных меток (CFSE-L-Aspa RBC), то значение составляло 16,52±3,13 дней, и 15,83±3,31 дней для RBC, помеченных CFDA-SE (CFSE RBC).

Истощение депо плазменного L-аспарагина является полным (<2 мкМ), занимает 15 минут после введения L-Aspa RBC и сохраняется по меньшей мере 20 дней.

Таблица 1 Фармакокинетические данные, полученные для L-Aspa RBC и для мышиных RBC, помеченных CFDA-SE (CFSE RBC)
	RBC	L-аспарагиназа
	Выжившие в течение 24 часов (%)	Время полураспада (дни)	Выжившие в течение 24 часов (%)	Время полураспада (дни)
L-Aspa RBC	-	-	57,9±2,5	12,39±0,74
CFSE-L-Aspa RBC	80,7±0,7	16,52±3,13	76,7±1,4	12,20±1,38
CFSE RBC	92,7±2,6	15,83±3,31	-	-

Время полураспада рассчитывается следующим образом:

Точка пересечения, полученная из графика уравнения, делит его на две части. Затем соответствующее значение абсциссы рассчитывается путем опускания перпендикуляра на график.

В качестве примера приведен расчет, показанный на фигуре 1, где рассчитываемая точка пересечения равна 2,8461.

Половина точки пересечения: 1,42

Расчет соответствующего значения на абсциссе:

1,42=(-0,1145*X)+2,8

Х=(1,42-2,8)/-0,1145=-1,38/-0,1145=12 дней.

Более корректное время полураспада может быть рассчитано вторым способом, где значение на оси ординат - это величина логарифма, а величина на оси абсцисс является линейной величиной, как показано на фигуре 2.

Время полураспада рассчитывается следующим образом:

Ln(2)/коэффициент кривой на графике.

В примере на фигуре 2 (который является таким же примером, как пример фигуры 1) время полураспада:

Ln(2)/0,083=8,3 дней.

Таблица 2 Измерение остаточной активности L-аспарагиназы как функции от времени для L-Aspa RBC и свободной L-аспарагиназы
Время
	15 мин	24 ч	3 д	9 д	14 д	20 д
L-Aspa RBC	100	57,1	46,9	39,8	24,9	10,6	остаточная активность аспарагиназы (%)
свободная L-аспарагиназа	100	3,3	0	0	0	0

Кроме того, оценка циркулирующей в плазме L-аспарагиназы показывает, что спустя 24 часа после введения мышам L-Aspa RBC полученные величины находятся в пределе чувствительности анализа (между 1 и 3 МЕ/литр).

Пример 3: Инкапсулирование L-аспарагиназы в эритроциты человека

Способ, описанный в WO-A-2006/016247, используется для производства партии инкапсулированной в эритроциты L-аспарагиназы. В соответствии с указаниями в WO-A-2006/016247 принимается во внимание осмотическая резистентность и в соответствии с этим устанавливаются параметры лизиса (подбирается интенсивность подачи суспензии эритроцитов в диализном картридже). Далее способ осуществляется согласно рекомендации врача, который принимает во внимание вес пациента и необходимую для введения дозу L-аспарагиназы. Характеристики конечного продукта следующие:

- средний объем осажденных частиц (MCV): 70-95 фЛ

- средняя концентрация гемоглобина в эритроците (MCHC): 23-35 г/дл

- внеклеточный гемоглобин ≤0,2 г/дЛ суспензии

- осмотическая резистентность ≤6 г/л NaCl

- средняя концентрация L-аспарагиназы: 78-146 МЕ/мл

- внеклеточная L-аспарагиназа ≤2% от общей активности фермента.

Полученная таким образом суспензия эритроцитов называется GRASPA® и упоминается в литературе.

Сравнительный пример 4: стандартное химиотерапевтическое лечение ОМЛ у детей и взрослых моложе 60 лет:

Индукция:

Арацитин 200 мг/м²/д × 7 дней

Митоксантрон 12 мг/м²/д × 5 дней

Первое закрепление:

На 21 день или позже

Арацитин 3 г/м² × 2/д × 3 дня

Амсакрин 100 мг/м²/д × 3 дня

Второе закрепление:

Арацитин 200 мг/м²/д × 4 дня

VP16 100 мг/м²/д × 4 дня

Даунорубицин 40 мг/м²/д × 4 дня

Третье закрепление:

Арацитин 3 г/м² × 2/д в Д1, Д2, Д8, Д9

L-аспарагиназа (свободная форма) 6000 МЕ/м²/д в Д2, Д9

Сравнительный пример 5: стандартное химиотерапевтическое лечение ОМЛ у пациентов, не переносящих его:

Таких пациентов лечат арацитином и/или другими лекарственными средствами, применяют паллиативное лечение. L-аспарагиназа не используется для таких пациентов, поскольку такие пациенты не переносят фермент.

Пример 6: Лечение согласно изобретению любого пациента, включая пациентов, не переносящих стандартное лечение, включая пожилых; фаза индукции:

1-й период 28 дней

Цитарабин (Ara C) 20 мг/м² (два раза в день) ежедневно с Д1 по Д10

GRASPA® (эритроциты с инкапсулированной в них аспарагиназой, в суспензии) 100 МЕ/кг в Д11

2-й период по 28 дней до 12-го месяца

Цитарабин (Ara C) 20 мг/м² ежедневно с Д1 по Д10

GRASPA® 100 МЕ/кг в Д1

Пример 7: Лечение согласно изобретению пациентов, не переносящих стандартное лечение, включая пожилых:

Фаза индукции в примере 6 у пациентов с ремиссией следует через месяц лечения до полного выздоровления или до смерти, с помощью:

Цитарабина (Ara C) 20 мг/м² ежедневно с Д1 по Д10

GRASPA® 100 МЕ/кг в Д1

Пример 8: Лечение детей и взрослых согласно изобретению:

Фаза индукции в примере 6 следует за фазой закрепления, обычно за 2 или 3 фазами закрепления.

Предпочтительно использовать GRASPA® 100 МЕ/кг на любой или некоторых фазах закрепления, совместно с другими химиотерапевтическими средствами. В одном из вариантов изобретения GRASPA® 100 МЕ/кг используют на всех фазах закрепления.

Пример 9: Лечение детей и взрослых высокими дозами арацитина; фаза индукции:

1-й вариант изобретения:

Арацитин 200 мг/м²/д × 7 дней

Митоксантрон 12 мг/м²/д × 5 дней

Одна доза GRASPA® 100 МЕ/кг в Д1

2-й вариант изобретения:

Арацитин 200 мг/м²/д × 7 дней

Митоксантрон 12 мг/м²/д × 5 дней

Одна доза GRASPA® 100 МЕ/кг в Д1

Пример 10: Закрепление после фазы индукции согласно примеру 9:

Первое закрепление:

На 21 день или позже

Арацитин 3 г/м² × 2/д × 3 дня

Амсакрин 100 мг/м²/д × 3 дня

Одна доза GRASPA® 100 МЕ/кг

Второе закрепление:

Арацитин 200 мг/м²/д × 4 дня

VP16 100 мг/м²/д × 4 дня

Даунорубицин 40 мг/м²/д × 4 дня

Одна доза GRASPA® 100 МЕ/кг

Третье закрепление:

Арацитин 3 г/м² × 2/д в Д1, Д2, Д8, Д9

Одна доза GRASPA® 100 МЕ/кг.

1. Лекарственное средство для лечения Острого Миелоидного Лейкоза (ОМЛ) у пациента старше 65 лет, включающее суспензию эритроцитов с инкапсулированной в них аспарагиназой в качестве активного компонента, где одна доза суспензии включает от 50 до 500 МЕ инкапсулированной аспарагиназы на кг веса тела.

2. Лекарственное средство по п.1, где одна доза суспензии включает от 50 до 200 МЕ инкапсулированной аспарагиназы на кг веса тела.

3. Лекарственное средство по п.1, где одна доза суспензии включает от 80 до 170 МЕ инкапсулированной аспарагиназы на кг веса тела.

4. Способ лечения Острого Миелоидного Лейкоза (ОМЛ) у пациента старше 65 лет, включающий введение эффективного количества суспензии эритроцитов с инкапсулированной в них аспарагиназой, где одна доза суспензии включает от 50 до 500 МЕ инкапсулированной аспарагиназы на кг веса тела.

5. Способ лечения Острого Миелоидного Лейкоза (ОМЛ) у пациента старше 65 лет, включающий введение эффективного количества суспензии эритроцитов с инкапсулированной в них аспарагиназой, где одна или несколько доз суспензии вводятся пациенту в фазу индукции и где одна доза суспензии включает от 50 до 500 МЕ инкапсулированной аспарагиназы на кг веса тела.

6. Способ лечения Острого Миелоидного Лейкоза (ОМЛ) у пациента старше 65 лет, включающий введение эффективного количества суспензии эритроцитов с инкапсулированной в них аспарагиназой, где одна или несколько доз суспензии вводятся пациенту в течение фазы лечения и где одна доза суспензии включает от 50 до 500 МЕ инкапсулированной аспарагиназы на кг веса тела.

7. Способ по п.6, где одна доза суспензии включает от 50 до 200 МЕ инкапсулированной аспарагиназы на кг веса тела.

8. Способ по п.6, где одна доза суспензии включает от 80 до 170 МЕ инкапсулированной аспарагиназы на кг веса тела.

9. Способ по п.6, где одна доза суспензии включает 100 МЕ или 150 МЕ аспарагиназы на кг веса тела.

10. Способ по любому одному из пп.6-9, где одна или несколько доз суспензии вводятся пациенту в фазу индукции.

11. Способ по любому одному из пп.4-9, где две вводимые одному и тому же пациенту дозы вводятся с промежутком во времени, который больше или составляет 14 дней, как правило, от 14 до 45 дней.

12. Способ по п.11, где промежуток во времени составляет от 14 до 45 дней.

13. Способ по любому одному из пп.4-9, где применяется суспензия эритроцитов с инкапсулированной в них аспарагиназой в ходе химиотерапевтического лечения одного и того же пациента с применением одного или нескольких других химиотерапевтических средств.

14. Способ по п.13, где другим химиотерапевтическим средством является цитарабин, митоксантрон, амсакрин, этопозид, тиогуанин, преднизолон, винкристин, VP16, даунорубицин, азацитидин или децитабин.

15. Способ по п.13, где суспензия применяется с цитарабином.

16. Способ по п.13, где суспензия применяется с цитарабином в фазу индукции.

17. Способ по п.15 или 16, где цитарабин применяется в режиме низких доз 1-100 мг/м² поверхности тела/день.

18. Способ по п.15 или 16, где цитарабин применяется в режиме низких доз 5-50 мг/м² поверхности тела/день.

19. Способ по п.15 или 16, где цитарабин применяется в режиме низких доз 20 мг/м² поверхности тела/день.

20. Способ по п.15 или 16, где цитарабин применяется в режиме низких доз 40 мг/м² поверхности тела/день.

21. Способ по любому одному из пп.4-9, где суспензия эритроцитов с инкапсулированной в них аспарагиназой применяется в одной или нескольких фазах закрепления в лечении ОМЛ.

22. Способ по п.4, где одна доза суспензии включает от 50 до 200 МЕ инкапсулированной аспарагиназы на кг веса тела.

23. Способ по п.15, включающий следующую схему фаз:

1-й период 28 дней

цитарабин 40 мг/м² ежедневно с дня 1 по день 10,

суспензия эритроцитов с инкапсулированной в них аспарагиназой 100 МЕ/кг в день 11;

2-й период по 28 дней до 12-го месяца

цитарабин 40 мг/м² ежедневно с дня 1 по день 10,

суспензия эритроцитов с инкапсулированной в них аспарагиназой 100 МЕ/кг в день 1.