Способ определения влияния препаратов на взаимодействие комплемента с комплексом антиген-антитело

Изобретение относится к медицине, а именно к биологической химии, и может быть использовано для определения влияния препаратов на классический путь активации комплемента путем изучения гемолитической активности комплемента. Для этого предварительно к 50 мкл раститрованной от до 1/128 сыворотки крови добавляют по 50 мкл исследуемые препараты, разведенные в физрастворе до концентрации 10^-2 М, проводят предварительную инкубацию при температуре 4-6°С в течение 30 минут, после этого добавляют по 50 мкл сенсибилизированные эритроциты барана и вероналовый буфер. Затем повторно инкубируют, отбирают надосадочную жидкость и определяют ее оптическую плотность при длине волны 450 нм, а фиксацию комплемента (С%) сенсибилизированными эритроцитами в присутствии исследуемых препаратов рассчитывают по формуле: С%=(Е_о-Е_к)/Е_о-100, где: Е_о - оптическая плотность в присутствии препарата, Е_к - оптическая плотность контроля, в качестве которого используют вероналовый буфер. По величине С судят о влиянии препарата на C1q - субкомпонент первого компонента классического пути комплемента по степени гемолиза сенсибилизированных эритроцитов барана. Использование данного способа позволяет проводить сравнительную количественную оценку степени влияния тестируемых препаратов на классический путь активации комплемента. 2 ил., 2 пр.

 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к биологической химии, и может быть использовано для изучения влияния различных препаратов на способность связывания комплемента с антителом в комплексе с антигеном.

Система комплемента, являющаяся важнейшим регулятором адаптивного иммунитета, играет существенную роль в патогенезе многих заболеваний, а также механизмах иммунологической толерантности. Характеризуется тремя основными эффектами: фиксацией на мембране мембраноатакующего комплекса, ведущего к образованию в ней каналов и приводящего к гибели клеток (цитотоксический эффект); опсонизацией или фиксацией на чужеродных биологических поверхностях, повышающей фагоцитируемость макрофагами; генерацией медиаторов острой фазы воспаления. Ключевой реакцией классического пути активации комплемента является присоединение к комплексу антиген-антитело субкомпонента первого фактора комплемента - Clq.

Для изучения механизма активации комплемента по классическому пути часто используются эритроциты барана (Е), которые являются удобной моделью, т.к. после обработки антителами они становятся высокочувствительными к литическому действию комплемента. На поверхности Е находится липополисахаридный антиген Форссмана, к которому можно получить антитела с высоким титром. Обычно используют тест-систему, в которой Е обрабатывают кроличьими антителами и исследуют их лизис после инкубации с сывороткой крови.

Известна тест-система, называемая реакцией связывания комплемента (РСК), которая проводится для диагностики различных инфекций. По этому методу сначала в сыворотке крови пациента с помощью стандартных сывороток выявляется наличие антигенов или антител. Затем добавляются комплемент и сенсибилизированные эритроциты барана. При наличии в крови пациента антител к искомому патогену образуется иммунный комплекс, фиксирующий комплемент, в результате чего эритроциты не лизируются (положительная реакция). При отсутствии антител происходит их гемолиз (отрицательная реакция).

Впервые РСК была предложена немецким иммунологом Августом Вассерманом, который использовал ее для диагностики сифилиса [Wassermann A Hemolysine, Cytotoxine und Precipitine, Lpz., 1902].

Известен способ иммунокоррегирующей терапии доклинических и клинически выраженных форм иммунологической недостаточности и экспресс отбора средств для иммунокоррекции по Гевондян, характеризующийся тем, что иммунокоррекция звеньев иммунной системы достигается за счет повышения в крови и/или лимфе, и/или секретах содержания высокоавидных нормальных и/или специфических к антигену антител G класса путем селективного воздействия на процесс созревания антител в плазматических клетках и/или на структуру низкоавидных антител и трансформации их в высокоавидные. Об эффективности иммунокоррегирующей терапии и/или средства для иммунокоррекции судят на основании изменения в крови, и/или лимфе, и/или секретах содержания высокоавидных и/или низкоавидных антител и/или изменения структурных, и/или функциональных, и/или протективных свойств антител, и/или доступных SH-групп в IgG и индекса модулирующего воздействия, который определяют на основании соотношения результатов, полученных до и после иммунокоррегирующего воздействия для каждого показателя, соответственно. Выбор средства и способа воздействия ведется с учетом степени выраженности иммунологической недостаточности и/или формы иммунологической недостаточности (ЛИН-1, ЛИН-2, ИН-1, ИН-2) и/или клинических проявлений иммунопатологических синдромов (инфекционный, аллергический, аутоаллергический, лимфопролиферативный) и/или природы этиотропного агента [патент RU 2191385, 2002 г.].

Известен способ определения стимулирующего действия препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на защитную активность фагоцитов, заключающийся в том, что к образцам биологических жидкостей, содержащих фагоцитирующие клетки, добавляют препараты иммуноглобулинов для внутривенного введения и после предварительной инкубации дополнительно инкубируют образцы с объектом защитного действия, после чего определяют интенсивность хемилюминесценции образцов [патент RU 2318202, 2008 г.].

Наиболее близким аналогом изобретения является метод изучения функциональной активности комплемента по определению его гемолитической активности, который широко применяется в России и за рубежом [Штельцнер А. Реакция связывания комплемента // Иммунологические методы. Под ред. Г. Фримеля. - М.: Медицина, 1987. - С. 73-88; Мейл Д. Иммунология. Пер. с англ. Под. ред. А. Ройта, Дж. Бростоффа, Д. Мейла. М.: Мир. 2000. С. 527-546]. Данный метод включает в себя определение концентрации сыворотки крови, вызывающей 50% гемолиз клеток в стандартном препарате сенсибилизированных гемолизином бараньих эритроцитов (СН50). Процесс гемолиза описывается уравнением ln(y/1-y) [Mayer М.М. Complement and complement-fixation in experimental immunochemistry - Springfield: Thomas, 1961. - P. 589-591], где y - регистрируемая оптическая плотность раствора гемоглобина. Строя график зависимости ln(y/1-y) от lnNHS (где NHS объем сыворотки в мкл), в точке пересечения с осью абсцисс находят величину, соответствующую СН50. Недостатками данного способа являются трудоемкость и продолжительность исследования. Кроме того, результат исследования не так нагляден, поскольку требует построения графика.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка достоверного, технически простого в выполнении способа оценки влияния какого-либо препарата на Clq - субкомпонент первого компонента классического пути комплемента по степени гемолиза сенсибилизированных эритроцитов барана.

Технический результат при использовании изобретения - одновременная сравнительная количественная оценка степени влияния тестируемых препаратов на классический путь активации комплемента, сокращение продолжительности и повышение наглядности исследования.

Предлагаемый способ определения влияния препаратов на взаимодействие комплемента с комплексом антиген-антитело выполняется следующим образом:

1. Проводят сенсибилизацию эритроцитов барана.

2. В каждую лунку первого ряда 96-ти луночного планшета вносят донорскую сыворотку в количестве 50 мкл как источник комплемента и титруют от до 1/128.

3. Вносят исследуемые препараты, разведенные в физрастворе до концентрации 10^-2 М, в количестве 50 мкл и инкубируют в течение 30 минут при 4°С. В качестве препарата сравнения используют глюконат кальция, в контрольные лунки вместо препарата вносят вероналовый буфер.

4. После завершения инкубации в каждую лунку добавляют по 50 мкл ЕА и вероналовый буфер и планшет ставят в термостат на 1 час при 37°С.

5. После инкубации надосадочную жидкость переносят в новый планшет в той же последовательности и измеряют ее оптическую плотность при длине волны 450 нм на иммуноферментном анализаторе «Stat Fax-2100», производства США.

6. Фиксацию комплемента (С %) сенсибилизированными эритроцитами в присутствии исследуемых препаратов рассчитывают по следующей формуле:

С%=(Е_о-Е_к)/Е_о⋅100%,

где Е_о- оптическая плотность в присутствии препарата,

Е_к - оптическая плотность контрольной пробы.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет одновременно и довольно быстро оценить иммуностимулирующее действие по механизму активации классического пути комплемента большого количества различных веществ, а также сравнить их между собой. Например, если гемолиз ЕА не отличается от контроля, значит, данный препарат влияния на Clq не оказывает, отсутствие гемолиза, наоборот, указывает на его блокировку Clq. Разная степень задержки гемолиза - о различной степени влияния препарата на Clq.

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами: на фиг. 1 -фотография, на которой представлен результат влияния глюконатов и сульфатов 3d-металлов на взаимодействие комплемента здорового донора с комплексом антиген-антитело на рецепторах бараньих эритроцитов, где в лунки рядов A-G вносят: 1 - препарат сравнения CaGl, 2-MnGl, 3-FeGl, 4-CuGl, 5-ZnGl, 6-CoGl, 7-контроль (буфер), 8-MnSO₄, 9-FeSO₄, 10-CuSO₄, 11-ZnSO₄, 12-CoSO₄; на фиг. 2 - результат влияния глюконатов и сульфатов 3d-металлов на взаимодействие комплемента онкобольного с комплексом антиген-антитело на рецепторах бараньих эритроцитов (препараты вносят в той же последовательности).

Сущность изобретения поясняется следующими примерами.

Пример 1. Задача данного исследования - оценить влияние глюконатов и сульфатов 3d-металлов (Mn, Fe, Со, Cu, Zn) на классический путь активации комплемента здорового донора. Для выполнения этой задачи используется следующий порядок работы:

1. 0,7 мл эритроцитов (Е) отмывается и разводится физраствором 1:14. К отмытой взвеси Е добавляется вероналовый буфер, содержащий С^а2+и Mg²⁺(VBS⁺⁺) в соотношении 1:1 [Тэтин С.Ю., Ефетов К.А., Троицкий Г.В. и др. Комплементфиксирующая активность иммуноглобулина G в растворах этиленгликоля // Биоорган, химия. - 1985. - Т. 11, №8. - С. 1068-1073]. Затем в полученную взвесь добавляется 1/400 часть гемолитической сыворотки (8,4 мл+21 мкл). Смесь инкубируется при 37°С в течение 40 минут. После этого сенсибилизированные эритроциты (ЕА) отмываются четыре раза физ. раствором и один раз VBS⁺⁺.

2. Донорская сыворотка - источник Clq-субкомпонента комплемента, титруется с 1 по 12 столбец рядов A-G 96-ти луночного планшета от до 1/128 по 50 мкл, ряд Н (8-12 ряд) заполняется VBS⁺⁺ в таком же объеме.

3. Глюконаты (MeGl) и сульфаты (MeSO₄) 3d-металлов, разведенные в физрастворе до концентрации 10^-2 М, вносятся по 50 мкл: со 2 по 6 и с 8 по 12 ряды соответственно. 1 ряд - глюконат кальция (препарат сравнения); 7 ряд - контроль, в лунки этого ряда вносится по 50 мкл VBS⁺⁺. Содержимое всех лунок перемешивается и оставляется на 30 минут при 4°С.

4. Через 30 минут в каждую из лунок добавляется по 50 мкл ЕА, содержимое осторожно и тщательно перемешивается и инкубируется в течение часа при 37°С.

5. Через час надосадочная жидкость из каждой лунки по 50 мкл с помощью многоканальной пипетки переносится на другой планшет в той же последовательности и измеряется ее оптическая плотность при длине волны 450 нм на иммуноферментном анализаторе «Stat Fax-2100», производства США, результаты представлены на фиг. 1.

6. Фиксация комплемента (С %) сенсибилизированными эритроцитами в присутствии исследуемых препаратов рассчитывается по формуле:

С%=(Е_о-Е_к)/Е_о⋅100%

Рассчитаем С % для глюконата и сульфата кобальта

Величины их экстинкций таковы: E_CoGl=2,23 (В6); E_CoSO4=2,06 (В12); Е_к=1,07 (В7). По данной формуле С%_CoGl=52% и С%_CoSO4=48%.

Из полученных результатов следует, что в присутствии глюконата кобальта гемолиз эритроцитов возрастает на 52%, а в присутствии его соединения с серной кислотой - на 48%.

Пример 2. Задача данного исследования - оценить влияние глюконатов и сульфатов 3d-металлов на активацию комплемента в сыворотке крови онкологического больного. Для ее решения используется такая же схема опыта как в примере 1, лишь на 2 этапе вносится сыворотка онкобольного. Результаты представлены на фиг. 2.

Рассчитаем также С % для глюконата и сульфата кобальта.

Величины их экстинкций таковы: E_CoGl=2,2; E_CoSO4=1,84; Е_к=0,54. По формуле С%_CoGl=75,4% и С%_CoSO4=70,6%.

Из полученных результатов следует, что гемолиз эритроцитов под действием комплемента сыворотки крови онкологического больного возрастает на 75,4% в присутствии глюконата кобальта и сульфата - на 70,6%.

Таким образом, можно сделать вывод об иммуностимулирующем действии кобальта по механизму активации классического пути комплемента более значительном в сыворотке крови онкобольного.

Способ определения влияния препаратов на классический путь активации комплемента путем изучения гемолитической активности комплемента, включающий добавление сыворотки крови человека к сенсибилизированным эритроцитам барана, инкубацию при температуре 37°С в течение 60 минут, определение оптической плотности и расчет фиксации комплемента сенсибилизированными эритроцитами, отличающийся тем, что для проведения реакции используют 96-ти луночный планшет, предварительно к 50 мкл раститрованной от до 1/128 сыворотки крови добавляют по 50 мкл исследуемые препараты, разведенные в физрастворе до концентрации 10^-2 М, проводят предварительную инкубацию при температуре 4-6°С в течение 30 минут, после этого добавляют по 50 мкл сенсибилизированные эритроциты барана и вероналовый буфер, затем повторно инкубируют, отбирают надосадочную жидкость и определяют ее оптическую плотность при длине волны 450 нм, а фиксацию комплемента (С%) сенсибилизированными эритроцитами в присутствии исследуемых препаратов рассчитывают по формуле:

С%=(Е_о-Е_к)/Е_о-100,

где: Е_о - оптическая плотность в присутствии препарата,

Е_к - оптическая плотность контроля, в качестве которого используют вероналовый буфер,

и по величине С судят о влиянии препарата на C1q - субкомпонент первого компонента классического пути комплемента по степени гемолиза сенсибилизированных эритроцитов барана.