Антигенный полипептид для выявления в плазме крови иммунного маркера - аутоантитела к vegfr1 и его применение
Изобретение относится к биотехнологии. В настоящей заявке представлена композиция для выявления аутоантитела к VEGFR1, содержащая эффективное количество следующих трех антигенных полипептидов:
где соотношение отдельных антигенных полипептидов в композиции составляет 1:1:1. В настоящем изобретении также представлен способ выявления в плазме крови иммунного маркера - аутоантитела к VEGFR1 с помощью описанного в настоящей заявке антигенного полипептида VEGFR1 и тест-набор, содержащий антигенный полипептид VEGFR1. Изобретение расширяет арсенал средств выявления аутоантител к VEGFR1. 4 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к области иммунологии и относится к антигенному полипептиду VEGFR1. С использованием данного антигенного полипептида можно получить специфический реагент для выявления уровня антитела к VEGFR1 в плазме крови человека.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Исследования последних лет показали, что обнаружение и определение опухолеассоциированных антител в крови здоровых людей имеет важное значение для направленного лечения. Например, трастузумаб и бевацизумаб, которые широко используются в клинической практике в отношении таких мишеней, как рецептор 2 типа эпидермального фактора роста (HER2) и фактор A роста эндотелия сосудов (VEGF-A), стали важным средством для клинического лечения опухоли на поздних стадиях. Однако из-за слишком сильных побочных эффектов эти два моноклональных антитела могут использоваться только в качестве лекарственных средств третьей линии. Таким образом, в настоящее время задачей, требующей незамедлительного решения, является разработка новых средств со слабыми побочными эффектами для предупреждения метастазирования и рецидива опухоли после местного лечения. Однако в области иммунотерапии основное техническое препятствие решению этой задачи заключается в том, что нужно сначала найти инновационное практическое решение для создания целевой методики, а затем принципиально новое решение для иммунотерапии опухолей может быть разработано в дальнейшем.
VEGFR1 также называют рецептором 1 типа фактора роста эндотелия сосудов, и он считается одним из специфических белков, экспрессируемых раковыми клетками. В результате большого количества исследований было обнаружено, что VEGFR1 может экспрессироваться в большом количестве во многих солидных опухолях у человека, например, в случае рака печени, рака легкого, рак почки, рака кишечника, рака молочной железы и т.д. В связи с тем, что антигенный эпитоп полипептида VEGFR1 локализован главным образом на поверхности опухолевой клетки и может быть использован в качестве целевого участка для соответствующего антитела, уничтожающего опухолевые клетки, в области медицины является общепризнанным фактом, что соответствующее антитело к VEGFR1 в случае клинического применения с большой вероятностью станет принципиально новым средством для лечения рака, которое будет обеспечивать наиболее быстрый эффект и характеризоваться низким уровнем побочных эффектов. В настоящее время в области биотехнологии единственный способ выявления и скрининга соответствующего антитела к VEGFRl предусматривает использование рекомбинантного белка в качестве антигена, при этом он будет осуществляться с помощью векторной конструкции, трансфекции, экспрессии, скрининга, очистки и других сложных процессов. Однако в связи со сложной пространственной структурой белка и трудностью обнаружения линейного эпитопа антигена, специфичность антител, выявленных с помощью рекомбинантного белка, является низкой, и при этом значительная часть антител не может связаться с целевым участком антигена на поверхности мембраны опухолевых клеток, в результате могут использоваться только средства для качественного выявления, не соответствующие стандарту, и соответственно невозможно разработать применимые на практике средства для предупреждения и лечения опухолей. В то же время, из-за высокой чувствительности способа ELISA, к методике очистки белка предъявляются очень высокие требования в отношении стабильности, поэтому предназначенный для выявления рекомбинантный белок, удовлетворяющий таким требованиям, стоит дорого. В стране проживания авторов настоящего изобретения и за ее пределами до сих пор не существует эффективных средств для выявления и скрининга соответствующего антитела к VEGFR1.
С использованием линейного полипептида антигенного эпитопа VEGFR1, специально сконструированного согласно настоящему изобретению, можно эффективно решить вышеупомянутые технические задачи, получить реагент для выявления с чрезвычайно высокой специфичностью, определить показатель концентрации иммунного маркера - антитела к VEGFR1, в плазме крови здоровых доноров в соответствии с приведенным описанием методики и получить комплексное решение для выявления, идентификации, качественных и количественных применений в отношении антитела к VEGFR1 с высокой точностью, простотой использования и умеренной стоимостью. Таким образом, методика по настоящему изобретению может заложить практическую основу для разработки совершенно новой иммунотерапии опухолей с низким уровнем побочных эффектов, причем с использованием природных антител к VEGFR1 из организма здорового человека.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Объектом настоящего изобретения является обеспечение линейного антигенного полипептида для выявления аутоантитела к VEGFR1 и, таким образом, получение специфического реагента для выявления аутоантитела к VEGFR1 и разработка соответствующей предпочтительно осуществляемой на практике схемы выполнения способа. Согласно настоящему изобретению сконструированы всего три линейных антигенных полипептида VEGFR1, аминокислотные последовательности которых показаны в таблице 1.
Таблица 1. Последовательности антигенных полипептидов VEGFR1
| Сокращенное обозначение VEGFR1 | H-DEGVYHCKATNQKGSVESSAYLTVQGTSDKSNLE-OH |
| H-DLKLSCTVNKFLYRDVTWILLRTVNNRTMHYSI-OH | |
| H-ESGLSDVSRPSFCHSSCGHVSEGKRRFTYDHAEL-OH |
Общеизвестно, что связывание антигена с антителом фактически происходит только между антигенной детерминантой и антигенсвязывающим участком. В большей степени комплементарная пространственная структура и конфигурация антигена и антитела приводят к более стабильному связыванию антигена и антитела, более высокой специфичности и более высокой эффективности связывания. Поскольку целевое антитело и структура его связывающего участка являются необходимыми предварительными условиями, то состояние связывания и характеристики аффинности всего белкового антигена и антитела могут быть определены в соответствии с антигенной детерминантой.
Соответственно, исходя из биологических характеристик белка VEFGR1, иммуноинформатического прогноза и моделирования в отношении множественных эпитопов, а также анализа различных параметров, связанных с антигенностью, согласно настоящему изобретению сконструированы аминокислотные последовательности вышеупомянутых трех линейных полипептидных антигенов, которые полностью комплементарны целевому антителу в отношении пространственной структуры и конфигурации.
Многочисленные исследования подтверждают, что VEGFR1 представляет собой один опухолеассоциированный антиген и может экспрессироваться в различных солидных опухолях. Следовательно, антитело к VEGFR1 можно рассматривать как природное противоопухолевое антитело, и оно может играть роль иммунологического надзора в организме человека и предотвращать образование и прогрессирование опухолей. Методика по настоящему изобретению обеспечивает улучшение количественного выявления природного противоопухолевого антитела и обеспечивает важный инструмент для разработки новых продуктов для компании по производству биологических препаратов с использованием плазмы крови и разработки новых мер против опухолей для клинической медицины. Например, компания по производству биологических препаратов с использованием плазмы крови может использовать методику по настоящему изобретению для скрининга плазмы крови с целью получения гамма-глобулина, обогащенного антителом к VEGFR1, для предупреждения и лечения опухолей в клинических условиях. Кроме того, в клиниках пациентам с опухолью на ранней стадии после местного лечения (например, после операции или лучевой терапии) может быть непосредственно перелита плазма крови, обогащенная антителом к VEGFR1, подвергнутая скринингу с помощью методики по настоящему изобретению, с целью усиления у них функции иммунологического надзора и предупреждения рецидива и метастазирования опухоли. В этом заключается практическое значение методики по настоящему изобретению.
Как показано в таблице 1, три антигенных полипептида, используемых для выявления аутоантитела к VEFGR1 в плазме крови с помощью способа ELISA, обеспечивают в виде продуктов высокой чистоты с рекомендуемой чистотой не менее 95%. Технический результат, который может быть достигнут согласно настоящему изобретению, проиллюстрирован с помощью следующего технического контроля с использованием контрастной сэндвич-методики испытаний, которая является общепринятой в данной области техники.
В настоящей заявке обеспечивается способ выявления иммунного маркера, аутоантитела к VEFGR1, в плазме крови с использованием трех антигенных полипептидов, показанных в таблице 1, предусматривающий следующие стадии:
1. перед выполнением действия осуществляют растворение каждого из антигенных полипептидов в 5 мг/мл растворе для хранения с использованием 65-67% уксусной кислоты, а затем осуществляют смешивание равных объемов и помещают в холодильник при -20°С (погрешность менее 2°С) для хранения;
2. перед началом выполнения действия сначала осуществляют разбавление смешанного в равных объемах раствора трех антигенных полипептидов, показанных в таблице 1, с использованием покрывающего буфера до 10-50 мкг/мл, где покрывающий буфер представляет собой 0,1 М фосфатный буферный раствор, содержащий 0,15 М хлорида натрия и 10 мМ EDTA, и при этом значение рН составляет 7,2-7,4;
3. нанесение покрытия на 96-луночный планшет (Thermo Scientific, США), активированный малеимидом, инкубирование в течение ночи при 4°С и трехкратное промывание промывочным раствором, где промывочный раствор представляет собой 0,1 М фосфатный буферный раствор, содержащий 0,15 М хлорида натрия и 0,1% TWEEN-20, и при этом значение рН составляет 7,0-7,4; и
4. осуществление последовательного отбора образцов и анализа следующим образом:
а. обеспечение двух лунок с подлежащим тестированию образцом плазмы крови, при этом с обеспечением двух лунок отрицательного контроля (NC обозначает раствор отрицательного контроля, не содержащий антитело к VEFGR1 из плазмы крови, для получения, таким образом, значений показателя для трех антигенных полипептидов по настоящему изобретению, показанных в таблице 1, в среде для отрицательного контроля, не содержащей аутоантитело к VEFGR1, с целью подтвердить, что композиция по настоящему изобретению вряд ли обеспечит положительный результат в случае отсутствия аутоантител к VEFGR1) и двух лунок положительного контроля (PC обозначает раствор положительного контроля, содержащий стандарт антитела к VEFGR1, для получения, таким образом, значений показателя для трех антигенных полипептидов по настоящему изобретению, показанных в таблице 1, при уровне стандартного эталонного содержания антитела к VEFGR1 с целью подтвердить, что композиция по настоящему изобретению вероятно будет обеспечивать положительный результат в случае присутствия аутоантитела к VEFGR1, и далее он будет служить в качестве исходного уровня для сравнения со значениями показателя для подлежащего тестированию образца плазмы крови);
b. разбавление подлежащего тестированию образца плазмы крови в соответствии с соотношением 1:200 с помощью раствора для анализа, причем раствор для анализа является таким же, как в случае раствора антигенов для нанесения покрытия, причем он представляет собой 0,1 М фосфатный буферный раствор, содержащий 0,15 М хлорида натрия и 10 мМ EDTA, и при этом значение рН составляет 7,0-7,4, добавление в каждую лунку по 100 мкл, инкубирование при 25°С в течение 1-2 ч., а затем трехкратное промывание;
с. после разбавления меченого пероксидазой хрена антитела козы к IgG человека (для проверки того, является ли выявленное в плазме крови вещество специфическим антителом) с использованием раствора для анализа из стадии b (который представляет собой 0,1 М фосфатный буферный раствор, содержащий 0,15 М хлорида натрия и 10 мМ EDTA, и при этом значение рН составляет 7,0-7,4), причем антитело характеризуется рабочим диапазоном 1:10000-1:150000, добавление в каждую лунку по 100 мкл и инкубирование при 25°С в течение 1-2 ч.;
d. после трехкратного промывания с использованием вышеупомянутого промывочного раствора (который представляет собой 0,1 М фосфатный буферный раствор, содержащий 0,15 М хлорида натрия и 0,1% Tween-20, и при этом значение рН составляет 7,0-7,4) добавление в каждую лунку по 100 мкл смешанного раствора 3,3ʹ,5,5ʹ-тетраметилбензидина (ТМВ) и пероксидазы и выдерживание в темноте в течение 20-30 мин. при комнатной температуре; и
e. добавление в каждую лунку по 50 мкл 10% раствора серной кислоты (10% H2SO4) в качестве стоп-раствора, затем определение значения оптической плотности (OD) с помощью считывающего устройства для микропланшетов, где длина волны детектирования составляет 450 нм, и эталонная длина волны составляет 630 нм, завершение выявления в течение 10 мин. после добавления стоп-раствора и, соответственно, выполнение количественного анализа уровня аутоантитела к VEGFR1 в плазме крови индивидуума; и
5. выполнение анализа данных, полученных с помощью выявления в ходе рандомизированного отбора образцов и анализа для каждого индивидуума в группе, и определение относительного уровня аутоантитела к VEGFR1 в плазме крови с использованием показателя положительных образцов (PSR), где способ расчета PSR является следующим: PSR = [значение OD для VEGFR1 - значение OD для NC] / [значение OD для PC - значение OD для NC]; и построение графика с помощью способа с использованием нормального распределения (Q-Q).
Для практического применения три антигенных полипептида, перечисленные в таблице 1, могут быть получены с обеспечением простого и удобного в использовании тест-набора, который может быть вакуум-герметизированным и упакованным с использованием неметаллических материалов и может храниться не менее шести месяцев при температуре 4°C. Таким образом, настоящая заявка также предусматривает устройство для тестирования, содержащее три антигенных полипептида, перечисленные в таблице 1. Вкратце, после того как 96-луночный планшет, активированный малеимидом, покрытый смешанным раствором трех антигенных полипептидов, высушили в сушильной камере при 45°С, осуществляют вакуумную герметизацию и упаковывание планшета с использованием неметаллических упаковочных материалов, и при этом каждая комбинация реагентов представляет собой удобный тест-набор. Предполагается, что все три антигенных полипептида представляют собой продукты с чистотой не менее 95%.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На фиг. 1 представлен график квартильного распределения для концентрации антитела к VEGFR1 в плазме крови.
На этой фигуре по горизонтальной оси представлена концентрация антитела к VEGFR1 в плазме крови в виде значения PSR, по вертикальной оси представлен диапазон квартильного распределения концентрации антитела к VEGFR1 в плазме крови, и при этом значение PSR на горизонтальной оси, соответствующее точке 0, является медианным значением.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Отбор образцов осуществляют следующим образом: отбирают 121 образец плазмы крови от здоровых взрослых людей, включая образцы плазмы крови от 65 мужчин и 56 женщин. С помощью клинического физикального обследования было определено, что у всех доноров образцов крови отсутствовали опухоли любого типа. До использования все образцы плазмы крови хранят при -80°С, и при этом в результате проверки не был обнаружен образец плазмы крови, подвергавшийся повторному замораживанию и оттаиванию (не более 3 раз) в течение периода хранения, не превышающего двух лет.
2. Исследование образцов осуществляют следующим образом: образцы плазмы крови оттаивают при 4°С, и при этом в эксперименте используют три антигенных полипептида, перечисленные в таблице 1, которые синтезированы UK SEVERN BIOTECH Co., Ltd., причем чистота составляет 95%, и выполняют следующие специфические стадии:
(1) перед выполнением действия осуществляют растворение каждого из антигенных полипептидов в 5,7 мг/мл растворе для хранения с использованием 67% уксусной кислоты, а затем осуществляют смешивание равных объемов и помещают в холодильник при -20°С для хранения;
(2) перед началом выполнения действия сначала осуществляют разбавление смешанного раствора трех антигенных полипептидов с использованием покрывающего буфера до 28,5 мкг/мл, где покрывающий буфер представляет собой 0,1 М фосфатный буферный раствор, содержащий 0,15 М хлорида натрия и 10 мМ EDTA, и при этом измеренное значение рН составляет 7,2;
(3) нанесение покрытия на 96-луночный планшет (Thermo Scientific, США), активированный малеимидом, инкубирование в течение ночи при 4°С в течение 16,5 ч. и трехкратное промывание промывочным раствором, где промывочный раствор представляет собой 0,1 М фосфатный буферный раствор, содержащий 0,15 М хлорида натрия и 0,1% Tween-20, где измеренное значение рН составляет 7,3; и
(4) осуществление последовательного отбора образцов и анализа следующим образом:
а. обеспечение двух лунок с подлежащим тестированию образцом плазмы крови и дополнительно обеспечение двух лунок отрицательного контроля (NC обозначает раствор отрицательного контроля, не содержащий антитело к VEFGR1 из плазмы крови человека, предоставленный компанией Sigma-Aldrich) и двух лунок положительного контроля (PC обозначает раствор положительного контроля, содержащий стандарт антитела к VEFGR1 из плазмы крови человека, предоставленный компанией Sigma-Aldrich);
b. разбавление плазмы крови в соответствии с соотношением 1:200 с помощью раствора для анализа, причем раствор для анализа является таким же, как в случае раствора антигенов для нанесения покрытия, причем он представляет собой 0,1 М фосфатный буферный раствор, содержащий 0,15 М хлорида натрия и 10 мМ EDTA, где измеренное значение рН составляет 7,2, добавление в каждую лунку по 100 мкл и инкубирование при 25°C в течение 1,5 ч.;
с. после трехкратного промывания с использованием вышеупомянутого промывочного раствора (который представляет собой 0,1 М фосфатный буферный раствор, содержащий 0,15 М хлорида натрия и 0,1% Tween-20, и при этом измеренное значение рН составляет 7,2) разбавление меченого пероксидазой хрена антитела козы к IgG человека (предоставленного компанией Sigma-Aldrich) с использованием раствора для анализа, причем антитело характеризуется условием использования в соответствии с соотношением 1:285000, добавление в каждую лунку по 100 мкл и инкубирование при 25°С в течение 1,5 ч.;
d. после трехкратного промывания с использованием промывочного раствора (который представляет собой 0,1 М фосфатный буферный раствор, содержащий 0,15 М хлорида натрия и 0,1% Tween-20, где измеренное значение рН составляет 7,2) добавление в каждую лунку по 100 мкл смешанного раствора 3,3ʹ,5,5ʹ-тетраметилбензидина (TMB) и пероксидазы (предоставленного компанией Life Technologies) и выдерживание в темноте в течение 25 мин. при комнатной температуре; и
e. добавление в каждую лунку по 50 мкл 10% раствора серной кислоты (10% H2SO4) в качестве стоп-раствора, затем определение значения оптической плотности (OD) с помощью считывающего устройства для микропланшетов, где длина волны детектирования составляет 450 нм, и эталонная длины волны составляет 630 нм, и завершение выявления в течение 10 мин. после добавления стоп-раствора.
3. Анализ результатов: далее проводили сравнительный анализ распределения для аутоантитела к VEGFR1 у целевых индивидуумов с использованием экспериментальных результатов. При анализе данных, полученных посредством выявления, описанного выше, уровень аутоантитела к VEGFR1 в плазме крови определяли с использованием показателя положительных образцов (PSR), и при этом PSR рассчитывали по следующей формуле: PSR = [значение OD для VEGFR1 - значение OD для NC] / [значение OD для PC - значение OD для NC], и при этом он представлен на нижеследующей фигуре с помощью способа с использованием нормального распределения (Q-Q). На этой фигуре по горизонтальной оси представлено значение PSR, отражающее концентрацию антитела к VEGFR1 в плазме крови, по вертикальной оси представлен диапазон квартильного распределения концентрации антитела к VEGFR1 в плазме крови, и при этом значение PSR на горизонтальной оси, соответствующее точке 0, является медианным значением.
Как показано на фиг. 1, медианное значение PSR для концентрации антитела к VEGFR1 в плазме крови составляет 1,53, коэффициент асимметрии S составляет 1,65, а коэффициент эксцесса K составляет 4,63, которые характеризуются высоким уровнем статистической значимости (w=0,89, p<0,0001). На кривой нормального распределения максимальное значение точки поворота вправо является пороговым значением (граничное значение = 3,8), а именно, 8 образцов из общего количества 121 образец плазмы крови от здоровых взрослых людей характеризуются высоким содержанием аутоантитела к VEGFR1, и при этом в соответствии с данным вариантом осуществления число индивидуумов, характеризующихся значением, превышающим пороговое значение, составляет 6,6%. В соответствии с данным вариантом осуществления также можно отметить, что уровень антитела к VEGFR1 в случайно выбранных образцах плазмы крови от здоровых взрослых людей соответствует асимметричному распределению, где 8 образцов плазмы крови характеризуются высоким содержанием природного аутоантитела к VEGFR1 и представляют ценность для клинического применения.
В соответствии с данным вариантом осуществления с помощью теста на одновременный отрицательный контрастный эффект подтверждено, что согласно настоящему изобретению ложноположительные результаты отсутствуют, а на описанной выше фигуре по горизонтальной оси представлены рассчитанные значения PSR в образцах крови от индивидуумов при сравнении со стандартом антитела к VEFGR1 из плазмы крови человека в качестве положительного контроля, предоставленным компанией Sigma-Aldrich, которые обозначены в ходе создания описанной выше фигуры. Для облегчения восприятия в другом аспекте концентрация аутоантитела к VEGFR1 (значение PSR) может быть распределена на 4 диапазона, и при этом доля случаев, попадающих в каждый диапазон концентрации антитела в данном варианте осуществления, показана в нижеследующей таблице.
Прилагаемая таблица. Распределение для аутоантитела к VEGFR1 из 121 образца плазмы крови от здоровых взрослых людей
| Доля случаев (%) | Концентрация антитела (PSR) | |
| 34 | (28,1%) | 0,00-0,90 |
| 50 | (41,3%) | 0,91-2,30 |
| 29 | (24,0%) | 2,31-3,79 |
| 8 | (6,6%) | 3,80-8,60 |
Согласно вышеизложенному конкретному варианту осуществления для выявления антитела к VFPGR1 в плазме крови человека используется раствор отрицательного контроля и стандартный раствор положительного контроля, предоставленный международной компанией по производству биохимических реактивов Sigma-Aldrich, и при этом результаты сравнительного исследования с использованием сэндвич-методики подтверждают, что три линейных антигенных полипептида, сконструированные согласно настоящему изобретению, могут специфично связываться с аутоантителом к VEFGR1 в плазме крови, а именно, аминокислотные последовательности трех линейных полипептидных антигенов характеризуются эффективной комплементарностью с белковой последовательностью антитела к VEFGR1 в отношении пространственной структуры и конфигурации, что, таким образом, обеспечивает возможность количественного определения уровня аутоантитела к VEFGR1 в плазме крови у различных индивидуумов. В результате получено применимое на практике средство для выявления аутоантитела к VEFGR1 в плазме крови, и при этом способ синтеза для получения трех линейных полипептидных антигенов, сконструированных в соответствии с настоящим изобретением, является относительно простым и экономически целесообразным, что обеспечивает теоретическую и практическую основу для клинического применения и разработки, связанных с лечением опухолей с использованием плазмы крови с высоким содержанием природного аутоантитела к VEFGR1.
<110> ЦИНДАО ХАЙЛАНЬШЭНЬ БИОТЕКНОЛОДЖИ КО., ЛТД
<120> Антигенный полипептид для выявления в плазме крови иммунного маркера – аутоантитела к VEGFR1, и его применение
<130> Изобретение
<160> 3
<170> PatentIn версия 3.3
<210> 1
<211> 34
<212> БЕЛОК
<213> Последовательность 1
<400> 1
Asp Glu Gly Val Tyr His Cys Lys Ala Thr Asn Gln Lys Gly Ser Val
1 5 10 15
Glu Ser Ser Ala Tyr Leu Thr Val Gln Gly Thr Ser Asp Lys Ser Asn
20 25 30
Leu Glu
<210> 2
<211> 33
<212> БЕЛОК
<213> Последовательность 2
<400> 2
Asp Leu Lys Leu Ser Cys Thr Val Asn Lys Phe Leu Tyr Arg Asp Val
1 5 10 15
Thr Trp Ile Leu Leu Arg Thr Val Asn Asn Arg Thr Met His Tyr Ser
20 25 30
Ile
<210> 3
<211> 34
<212> БЕЛОК
<213> Последовательность 3
<400> 3
Glu Ser Gly Leu Ser Asp Val Ser Arg Pro Ser Phe Cys His Ser Ser
1 5 10 15
Cys Gly His Val Ser Glu Gly Lys Arg Arg Phe Thr Tyr Asp His Ala
20 25 30
Glu Leu
1. Композиция для выявления аутоантитела к VEGFR1, содержащая эффективное количество следующих трех антигенных полипептидов:
где соотношение отдельных антигенных полипептидов в композиции составляет 1:1:1.
2. Способ выявления аутоантитела к VEGFR1 у индивидуума, предусматривающий следующие стадии: смешивание равных количеств трех антигенных полипептидов согласно п. 1, затем нанесение покрытия на 96-луночный аналитический планшет, активированный малеимидом, инкубирование при температуре 4°С в течение ночи, промывание и осуществление последовательного отбора образцов и анализа.
3. Способ по п. 2, где последовательный отбор образцов и анализ предусматривает обеспечение двух лунок с подлежащим тестированию образцом плазмы крови, при этом с обеспечением двух лунок отрицательного контроля и двух лунок положительного контроля, разбавление плазмы крови буфером для анализа, разбавление меченного пероксидазой хрена антитела козы к IgG человека, промывание и добавление в каждую лунку по 100 мкл смешанного раствора 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМВ) и пероксидазы, выдерживание в темноте в течение 20-30 мин при комнатной температуре, добавление в каждую лунку по 50 мкл 10% раствора серной кислоты (10% H2SO4) в качестве стоп-раствора и затем определение значения оптической плотности (OD) с помощью считывающего устройства для микропланшетов, где длина волны детектирования составляет 450 нм и эталонная длина волны составляет 630 нм.
4. Применение композиции по п. 1 для выявления аутоантитела к VEGFR1.
5. Тест-набор для выявления аутоантитела к VEGFR1, полученный из композиции по п. 1, где три антигенных полипептида соответственно объединены в тест-набор для последующего использования после их отдельного вакуумного упаковывания с использованием неметаллических медицинских упаковочных материалов.
