Способ получения эритроцитов, нагруженных одним или несколькими веществами, представляющими фармацевтический интерес, и полученные таким образом эритроциты
Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, в частности к способу получения эритроцитов, эритроцитам и фармацевтической композиции. Способ включает набухание эритроцитов с использованием первого гипотонического раствора, который приводит эритроциты к осмоляльности 250-200 мОсм/кг. Далее осуществляют дополнительное набухание эритроцитов, не достигая лизиса, с использованием второго гипотонического раствора, который более гипотоничен, чем первый гипотонический раствор, и который приводит эритроциты к осмоляльности 200-170 мОсм/кг. Далее осуществляют концентрирование эритроцитов и приведение концентрированных эритроцитов в контакт с лизирующим раствором, содержащим одно или несколько веществ, представляющих фармацевтический интерес, который приводит эритроциты к осмоляльности 150-110 мОсм/кг. Далее добавляют раствор для закупоривания с целью получения популяции эритроцитов, которые отличаются тем, что процентная доля фосфатидилсерина, образуемого эритроцитами, которую измеряют в анализе на аннексин V, составляет меньше 10%, а количество лактата, образуемого на каждые 106 эритроцитов, составляет 0,100 нмоль/ч. Полученные эритроциты могут использоваться в составе фармацевтической композиции для применения в терапевтическом лечении. Изобретение позволяет получать эритроциты, нагруженные одним или несколькими веществами, представляющими фармацевтический интерес, избегая механического напряжения и упрощая стадию закупоривания. 3 н. и 15 з.п. ф-лы,4 ил., 8 табл., 9 пр.
Изобретение относится к способу получения эритроцитов, нагруженных одним или несколькими активными ингредиентами, нагруженным эритроцитам, полученным таким образом, и фармацевтическим композициям, которые содержат указанные нагруженные эритроциты.
Настоящее изобретение также направлено на фармацевтические композиции, которые содержат указанные эритроциты, и их терапевтическое применение, в частности при лечении телеангиоэктатической атаксии.
ИЗВЕСТНЫЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Красные клетки крови, также известные как эритроциты, включены в известный уровень техники в числе носителей лекарственных средств, которые способны переносить и высвобождать в кровоток и/или эффективно направлять активные ингредиенты в целевые места. Преимущество использования эритроцитов в качестве носителей лекарственных средств основано в основном на том факте, что активный ингредиент можно удерживать в кровотоке в течение нескольких дней или недель и в любом случае в течение периода времени, значительно превышающего обычную ситуацию использования оральных или внутривенных составов или систем с замедленным высвобождением, которое опосредовано липосомами или другими носителями лекарственных средств. Кроме того, как только носители выполнили свою задачу переноса активного ингредиента, их удаляют из кровотока физиологическим путем для выведения нативных эритроцитов в печени и селезенке.
Предложено множество способов для инкапсуляции активных ингредиентов или контрастных веществ в красные клетки крови человека или млекопитающего для биомедицинских и клинических целей.
В частности, в патенте EP0882448 впервые описан способ инкапсуляции лекарственных средств в эритроцитах в концентрациях, достаточных для того, чтобы достигать желаемого фармакологического эффекта. Способ, описанный в предшествующем патенте, указанном выше, включает последовательность технологических стадий, которые можно вкратце описать следующим образом:
первая стадия, на которой эритроциты набухают,
вторая стадия, на которой происходит лизис набухших эритроцитов для того, чтобы обеспечить такое раскрытие пор в мембране указанных эритроцитов, чтобы оно было достаточным для проникновения активных ингредиентов, представляющих интерес, внутрь внутриклеточного пространства,
стадия концентрации лизированных эритроцитов
стадия инкапсуляции, на которой эритроциты приводят в контакт с активными ингредиентами, после чего следует закрывание/повторное закупоривание эритроцитов с целью захвата активных ингредиентов в красных клетках крови.
Описанный сейчас способ делает возможным получение эритроцитов, нагруженных активными ингредиентами и подходящих для применения в качестве носителей лекарственных средств. В настоящее время наиболее эффективным эталонным способом для инкапсуляции лекарственных средств в красных клетках крови для экспертов в этой области является тот, который описан выше.
Однако при использовании этого способа, согласно наблюдениям, на стадии концентрации лизированных эритроцитов при условиях работы, которые определены в патенте, который указан выше (EP0882448), на эти лизированные эритроциты действует механическое напряжение, которое может сделать последующую стадию восстановления нагруженных эритроцитов довольно сложной.
Среди различных известных способов инкапсуляции активных ингредиентов в эритроцитах, один, описанный в патенте EP1773452-B1, предусматривает коррекцию параметров способа, такую как изменение скорости потока лизирующего раствора и корректировку его осмоляльности для того, чтобы добиваться воспроизводимости инкапсуляции активного ингредиента, поскольку варьирует осмотическая хрупкость (или глобулярная осмотическая резистентность) пациента.
Объем настоящего изобретения состоит в том, чтобы дополнительно усовершенствовать уже удовлетворительные результаты, которых достигают при использовании способа, описанного в EP 0882448, чтобы получить усовершенствованный способ инкапсуляции веществ, представляющих фармацевтический интерес, в эритроцитах.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящая заявка относится к способу получения эритроцитов, нагруженных одним или несколькими веществами, представляющими фармацевтический интерес, который, по сравнению с аналогичным способом, описанным в известном существующем уровне техники, как оказалось усовершенствован в нескольких аспектах.
В частности, этот способ включает ряд технологических стадий, которые отличаются тем фактом, что стадию концентрации эритроцитов осуществляют перед стадией лизиса клеток, последняя необходима для того, чтобы сделать возможным инкапсуляцию фармацевтически активных молекул в красных клетках крови. Более конкретно, эту стадию лизиса осуществляют во время стадии контакта с раствором, который содержит вещество, подлежащее инкапсуляции.
Способ по изобретению предусматривает, что начальные эритроциты проходят две последующие стадии набухания клеток, без лизиса, с использованием подходящих гипотонических растворов; в действительности, эти стадии заменяют стадию набухания и стадию лизиса согласно аналогичному способу известного уровня техники.
Следовательно, объект настоящего изобретения представляет собой способ получения эритроцитов, нагруженных одним или несколькими веществами, представляющими фармацевтический интерес, такими как активные ингредиенты, который включает стадии, на которых:
a) эритроциты набухают в первом гипотоническом растворе,
b) эритроциты, полученные на стадии a), дополнительно набухают, не достигая лизиса, при использовании второго гипотонического раствора, который является более гипотоническим, чем указанный первый раствор,
c) эритроциты, полученные на стадии b), концентрируют,
d) эритроциты, концентрированные таким образом, приводят в контакт с лизирующим раствором, который содержит одно или несколько веществ, представляющих фармацевтический интерес, и затем
e) раствор для закупоривания добавляют для получения популяции красных клеток крови, нагруженных указанными веществами, представляющими фармацевтический интерес.
Предпочтительно способ может включать промежуточную стадию (a2) между стадиями (a) и (b), где первый гипотонический раствор удаляют по меньшей мере частично перед добавлением второго гипотонического раствора.
Дополнительные объекты изобретения представляют собой популяцию эритроцитов, нагруженных одним или несколькими активными ингредиентами, которую можно получать посредством вышеуказанного способа, и фармацевтические композиции, которые содержат популяцию эритроцитов, которые нагружены, как определено выше.
Дополнительные объекты изобретения представляют собой фармацевтические композиции, которые содержат эритроциты, которые нагружены одним или несколькими активными ингредиентами, полученные посредством вышеуказанного способа, и указанные эритроциты и композиции для применения в лечении заболеваний, например, телеангиоэктатической атаксии.
Изобретение основано на неожиданном открытии того, что возможно инкапсулировать активные ингредиенты в эритроцитах, которые только прошли стадии набухания и концентрации, без предшествующей индукции гемолиза. В действительности, раскрытия пор (гемолиза) можно эффективно добиваться, после концентрации, с использованием того же раствора, содержащего вещества, представляющие интерес. Новый способ значительно более эффективен, чем предыдущие, и он дает конечный продукт (эритроциты, содержащие по меньшей мере одно фармацевтически активное вещество), очень схожий с нативными эритроцитами (не проходившими этот способ).
Преимущества, обеспечиваемые изобретением
Технологические изменения, введенные в новый способ, позволяют лучше сохранять плазматическую мембрану красных клеток крови и достигать более высокой концентрации, тем самым обеспечивая значительно более высокую эффективность инкапсуляции.
В способе по данному изобретению инкапсуляция веществ, представляющих интерес, происходит с улучшенным выходом по сравнению со способом, описанном в известном существующем уровне техники, что делает возможной инкапсуляцию большего количества терапевтически активных веществ. В частности, изобретатели этого способа продемонстрировали, что для того, чтобы достигать тех же уровней инкапсулированного активного ингредиента, возможно использовать, в способе по изобретению, количество начального активного ингредиента значительно меньшее, чем то, которое в настоящее время используют в стандартном способе, описанном в EP0882448. В частности, что также описано в экспериментальном разделе, чтобы инкапсулировать приблизительно 11 мг, например, фосфата дексаметазона натрия, при использовании того же количества красных клеток крови, подвергаемых обработке, приблизительно 500 мг исходного лекарственного средства необходимо при использовании способа известного уровня техники и только 62,5 мг при использовании способа, описанного в настоящем документе.
Кроме того, доказано, что этот способ воспроизводим и надежен в отношении инкапсулирования количеств вещества, представляющего интерес, в красных клетках крови пропорционально начальному количеству указанного вещества: эти характеристики делают возможным клиническое применение различных доз, что делает возможным введение доз, соответствующих различным клиническим потребностям, которые варьируют только в количестве активного ингредиента, добавляемого во время способа.
Показано, что увеличенная эффективность инкапсуляции имеет место не только для активных молекул, имеющих низкие молекулярные массы (например, фосфат дексаметазона натрия, как показано в примере 1), но также для молекул, которые имеют высокие молекулярные массы. В примере 5 показана эффективная инкапсуляция белков, имеющих молекулярные массы порядка 110 кДа (димеры гексокиназы дрожжей - Hk - 55 кДа) или порядка 60 кДа (тимидинфосфорилаза).
Благодаря модифицированной последовательности технологических стадий, также добивались значительный усовершенствований в физиологических параметрах, связанных с популяцией нагруженных эритроцитов, полученных с помощью способа по изобретению. В частности, как показано в примерах, эритроциты, которые нагружены с использованием способа, описанного в настоящем документе, имеют параметры, такие как средний объем клетки и жизнеспособность клетки (метаболизм), полностью сравнимые с таковыми у необработанных эритроцитов. В целом, экспериментальные данные показывают, что новый способ способен лучше сохранять размер клетки и содержимое клетки начальных эритроцитов по сравнению с известным уровнем техники, что позволяет, таким образом, получать популяцию нагруженных эритроцитов, значительно более схожую, с физиологической точки зрения, с популяцией необработанных эритроцитов.
Сравнительные эксперименты, которые проводили на популяции эритроцитов, которые нагружены в соответствии с изобретением или с использованием аналогичного способа известного уровня техники (EP0882448), показали, например, что средний объем клетки (MCV) красных клеток крови составляет приблизительно 86 фемтолитров (настоящее изобретение) и приблизительно 71 фемтолитр (известный уровень техники), соответственно, где значение MCV для необработанных эритроцитов составляет между 80 и 97 фемтолитрами. Кроме того, обнаружено, что среднее количество эритроцитарного гемоглобина (MCH), измеряемого в красных клетках крови, которые подвергали способу в настоящем документе и тому, который описан в известном уровне техники, составляет приблизительно 21,2 пикограмм (значительно ближе к нормальному) и приблизительно 14 пикограммов (известный уровень техники), соответственно, при этом значение для необработанных эритроцитов обычно варьирует между 27,6 и 33,3.
Более хорошее совпадение между эритроцитами, которые нагружены с использованием этого способа, и необработанными эритроцитами также подтверждает увеличенная наблюдаемая жизнеспособность клетки (метаболизм). В частности, как описано более подробно далее, жизнеспособность эритроцитов, обработанных в соответствии с настоящим изобретением, значительно лучше в отношении и увеличенных метаболических способностей и уменьшенного присутствия маркеров старения. Как рассмотрено более подробно далее, данные, связанные с более высокой жизнеспособностью клетки (более высокий метаболизм и меньше маркеров старения), позволят авторам изобретения утверждать, что способ, описанный в настоящем документе, фактически позволяет получать популяцию нагруженных эритроцитов, которые имеют большее время полужизни по сравнению с эритроцитами, полученными с использованием способа известного уровня техники. Из этого следует, что популяция эритроцитов в соответствии с изобретением делает возможными транспортировку инкапсулированных веществ и/или их высвобождение в течение периода времени, более длительного, чем то, которое допускают эритроциты, которые нагружены согласно способу, описанному в известном уровне техники.
Благодаря описанным техническим решениям настоящее изобретение также позволяет преодолеть ограничения способа, описанного в EP1773452-B1, и добиваться воспроизводимой инкапсуляции активного вещества без коррекции параметров способа для каждого отдельного пациента, поскольку способ не зависит ни от осмотической хрупкости красных клеток крови различных пациентов (как продемонстрировано в примере 7), ни от начального гематокрита (как продемонстрировано в примере 8).
Благоприятные свойства, описанные выше для эритроцитов по изобретению, в частности, наибольшее количество лекарственного средства, инкапсулированного внутри эритроцитов, и их большее время полужизни, делают указанные эритроциты эффективными при лечении различных заболеваний, например, телеангиоэктатической атаксии.
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг. 1 приведено схематическое представление способа, описанного в настоящем документе, в сравнении с способом известного уровня техники (EP 0882448).
На фиг. 2 представлен график, относящийся к глобулярной осмотической резистентности (RGO) для двух индивидуумов, которых оценивали посредством измерения общего свободного гемоглобина на основании осмоляльности. RGO также выражают в виде осмоляльности, при которой наблюдают 50% гемолиз, т.е. 50% свободного гемоглобина.
На фиг. 3 представлен набор подходящего для выполнения способа по изобретению, когда его используют в сочетании с медицинским устройством, как описано в BO 2010A000255.
На фиг. 4 показаны результаты исследования незарегистрированного препарата у 4 пациентов, пораженных телеангиоэктатической атаксией (02-01, 02-02, 02-05, 02-08), которых лечили эритроцитами, полученными с помощью как процедуры, представленной в известном уровне техники (EP 0882448) (старая процедура), так и процедуры в соответствии с настоящим изобретением (новая процедура).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
СЛОВАРЬ
Некоторые технические термины, типичные для этой области техники, объяснены далее.
Для целей настоящего изобретения выражение «набухание эритроцитов» обозначает увеличение объема и сферическую форму эритроцитов из-за увеличенного внутреннего давления, обусловленного вхождением преимущественно воды, при этом без каких-либо феноменов анормального раскрытия пор в клеточной мембране или необратимого ее разрушения. Обычно набухание, как понимают в данной заявке, не подразумевает вытекание клеточного материала.
В целях настоящего изобретения и в конкретной области техники термины «лизис» или «гемолиз» или «частичный лизис» обозначают обратимое раскрытие пор на клеточной мембране с последующим свободным прохождением в обоих направлениях внутри- и внеклеточных материалов. Следовательно, лизис представляет собой феномен временной и обратимой пермеабилизации и не включает полного и необратимого разрушения клеточной мембраны.
Из этого следует, что термин «лизированный эритроцит» относится к эритроциту, плазматическая мембрана которого отличается порами, которые могут быть повторно закрыты таким образом, что восстанавливают целостность клеточной мембраны.
В целях настоящего описания, выражение «раствор для (повторного) закупоривания» обозначает используемый раствор, который способен закрывать поры в плазматической мембране эритроцитов преимущественно через отток воды. Этот раствор позволяет инкапсулировать вещество(а), представляющее фармацевтический интерес, внутри эритроцитов благодаря раскрытию указанных пор.
В этом описании выражение «нагруженные эритроциты» обозначает эритроциты (также обозначаемые как красные клетки крови), в которых инкапсулированы различные количества одного или нескольких веществ, представляющих интерес.
В целях настоящего изобретения выражение «закупоренные эритроциты» относится к красным клеткам крови, которые, в отличие от лизированных эритроцитов, отличаются проницаемостью плазматической мембраны, сравнимой (перекрывающейся) с таковой у необработанных красных клеток крови.
Для того чтобы выполнять способ по изобретению, начальные эритроциты можно получать посредством сбора и выделения красных клеток крови из образца крови индивидуума. Исходный образец предпочтительно обрабатывают антикоагулянтом, таким как гепарин, чтобы предотвращать его коагуляцию.
Необязательно эритроциты, прежде чем их подвергают обработке в соответствии с изобретением, можно выделять и подвергать одной или нескольким промывкам в физиологическом растворе для того, чтобы получать популяцию начальных эритроцитов, в которых загрязнители, такие как плазма, тромбоциты, лимфоциты и т.д., находятся в нулевых или только несущественных концентрациях.
Стадия (a):
Как указано выше, способ включает стадию a), на которой популяция эритроцитов сначала набухает через использование первого гипотонического раствора.
В одном из вариантов осуществления изобретения первый гипотонический раствор имеет осмоляльность между 230 и 150 мОсм/кг и, например, предпочтительную осмоляльность 180 мОсм/кг. В любом случае, осмоляльность и объем первого раствора таковы, что контакт с этим первым раствором заставляет красные клетки крови достигать осмоляльности в диапазоне от 250 до 200 мОсм/кг. В частности, первый гипотонический раствор можно получать, например, посредством смешивания 5 объемов физиологического раствора и 3 объемов стерильной дистиллированной воды. В качестве неограничивающего примера, стадию (a) можно осуществлять, оставляя эритроциты приблизительно в 300 мл первого раствора при концентрации (гематокрите) приблизительно от 3 до 7%, в течение времени приблизительно 5 минут при комнатной температуре.
За стадией a) необязательно может следовать стадия удаления, по меньшей мере частично, первого гипотонического раствора из набухших эритроцитов. Такое удаление можно осуществлять, например, посредством мягкого центрифугирования обработанных эритроцитов и отделения супернатанта.
Стадия (b):
Набухшие эритроциты, полученные как описано выше, затем подвергают дополнительному набуханию через использование второго гипотонического раствора (стадия b). Второй раствор отличается за счет того факта, что он более гипотонический, чем первый раствор. Тоничность второго раствора выбирают таким образом, чтобы вызывать дополнительное набухание эритроцитов, однако, не вызывая их лизиса, который будет вызывать последующее вытекание внутриклеточного материала. Условиями гипотоничности управляют таким образом, чтобы избегать индукции чрезмерной ломкости клеток ввиду следующей стадии концентрации эритроцитов. Значения осмоляльности второго гипотонического раствора определяют экспериментально в лаборатории и они являются постоянными в способе. Осмоляльность второго раствора является такой, чтобы индуцировать состояние набухания в красных клетках крови, но не приводя к раскрытию пор на их поверхности, тем самым вызывая начальный отток клеточного содержимого и чрезмерную ломкость эритроцитов.
Второй гипотонический раствор имеет осмоляльность в диапазоне от 80 до 170 мОсм/кг. В предпочтительном варианте осуществления осмоляльность второго раствора составляет приблизительно 120 мОсм/кг. В любом случае, осмоляльность и объем второго раствора таковы, что контакт с этим вторым раствором заставляет красные клетки крови достигать осмоляльности в диапазоне от 200 до 170 мОсм/кг.
В частности, второй гипотонический раствор можно получать, например, посредством смешивания 5 объемов физиологического раствора и 7 объемов стерильной дистиллированной воды.
В качестве примера, стадию (b) можно осуществлять, оставляя эритроциты приблизительно в 64 мл второго раствора при концентрации (гематокрите) приблизительно от 8 до 15%, в течение времени приблизительно 5 минут при комнатной температуре.
Стадия (c):
Набухшие эритроциты, получаемые выше на стадиях a) и b), после этого подвергают стадии концентрации c). Любую известную технологию, подходящую для концентрации образца эритроцитов, такую как, пример, гемофильтрация, центрифугирование или диализ, можно использовать для того, чтобы концентрировать набухшие эритроциты. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, концентрацию осуществляют посредством гемофильтрации.
В частности, при гемофильтрации любой гемоконцентрационный фильтр (или даже диализный фильтр), известный экспертам в данной области, можно использовать для отделения клеточной части от жидкости, в которой ее суспендируют, для того, чтобы снижать объем суспензии и, таким образом, концентрировать набухшие эритроциты. В целом, чем меньше объем гемоконцентрационного фильтра (например, размеры для неонатального или педиатрического применения), тем выше уровень гемоконцентрации, которого можно достигать.
Гемоконцентрацию предпочтительно осуществляют при комнатной температуре в течении времени от 15 до 35 минут. В целом, концентрация эритроцитов (гематокрит), получаемых в конце стадии c), составляет выше 30%, например, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%. На этой стадии концентрации осмоляльность суспензии эритроцитов является почти постоянной, меняясь только на несколько единиц мОсм/кг по сравнению с осмоляльностью, получаемой после контакта со вторым гипотоническом раствором, используемым на предыдущей стадии b).
Поскольку стадию концентрации осуществляют на красных клетках крови, которые набухают, но по существу интактны по своей структуре, т.е., не лизированы, способ, описанный в настоящем документе, значительно снижает риск получения эритроцитов, необратимо поврежденных до состояния, в котором их нельзя более эффективно использовать в качестве носителя лекарственного средства. Фактически оптимальная цель способа состоит в получении популяции нагруженных и «восстановленных» эритроцитов с характеристиками, которые как можно более близки к физиологическим характеристикам исходной популяции, и все еще способны осуществлять функцию носителя эффективным образом и в течение длительных периодов времени.
Стадия (d):
Эритроциты, концентрированные таким образом, после этого приводят в контакт с гипотоническим раствором для лизиса, который содержит одно или несколько веществ, представляющих фармацевтический интерес (стадия d). Этот раствор отличается тем, что он снижает осмоляльность красных клеток крови до точки, в которой возникает их временный лизис, то есть обратимое раскрытие пор в клеточной мембране. Раствор, содержащий активные ингредиенты, может представлять собой, например, водный раствор с низкой осмоляльностью.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения лизирующий раствор имеет осмоляльность в диапазоне от 10 до 100 мОсм/кг. В любом случае осмоляльность и объем лизирующего раствора таковы, что контакт с лизирующим раствором заставляет красные клетки крови достигать осмоляльности в диапазоне от 150 до 110 мОсм/кг.
Этот раствор, помимо того, что он является гипотоническим, содержит вещество(а), представляющее интерес, которое подлежит инкапсуляции. Пермеабилизация плазматической мембраны эритроцитов, таким образом, будет содействовать их диффузии внутрь клеток.
В качестве примера, стадию (d) можно осуществлять, удерживая эритроциты, с концентрацией (гематокритом) 30-65%, в контакте с лизирующим раствором, содержащим активные вещества, в течение времени приблизительно 10 минут при комнатной температуре.
Стадия (e):
Для того чтобы инкапсулировать молекулу(ы), представляющую интерес, внутри эритроцитов, раствор для закупоривания используют для восстановления параметров обработанных эритроцитов как можно ближе к физиологическим условиям. Раствор для закупоривания представляет собой гипертонический раствор с осмоляльностью в диапазоне от 300 до 5000 мОсм/кг.
В конкретном варианте осуществления изобретения используемый раствор для закупоривания представляет собой раствор фосфата-инозина-глюкозы-пирувата-аденина (PIGPA). Следовательно, возможно добиваться схожего эффекта закрывания с использованием какого-либо гипертонического раствора, состоящего, например, из дистиллированной воды и минералов или других питательных веществ, используемых красными клетками крови. Однако гипертонический раствор PIGPA является предпочтительным, поскольку он содержит питательные вещества, которые помогают клетке восстанавливать часть утраченного содержимого, а также метаболические функции клетки. В связи с этим, содействуют повторному закупориванию пор и восстанавливают нормальную структуру мембраны (повторная ренатурация).
В качестве примера, раствор для закупоривания предпочтительно имеет следующую композицию: 33 мМ NaH2PO4, 1,606 M KCl, 0,194 M NaCl, 0,1 M инозина, 5 мМ аденина, 20 мМ АТФ, 0,1 M глюкозы, 0,1 M пирувата и 4 мМ MgCl2. В качестве примера, приблизительно 3 мл раствора для закупоривания можно использовать для объема приблизительно от 35 до 55 мл лизированных эритроцитов при концентрации (гематокрите) приблизительно 15-40%. В частности, контакт раствора для закупоривания с эритроцитами можно осуществлять, например, в течение приблизительно 30 минут, предпочтительно при температуре 37°C. На этом этапе суспензию красных клеток крови доводят до осмоляльности, по меньшей мере равной физиологическим уровням или превышающей их. Несмотря на то, что температура 37°C не является необходимой, она содействует быстрому и оптимальному восстановлению метаболических способов внутри клетки.
Вещества, представляющие фармацевтический интерес, которые подлежат инкапсуляции, или отдельно или в комбинации, в красных клетках крови, можно выбирать из тех, которые известны в связи с конкретными необходимыми терапевтическими потребностями.
В одном из вариантов осуществления изобретения соединения, представляющие фармацевтический интерес, выбирают из следующих групп: активные ингредиенты, выбранные из пептидов, олигопептидов, полипептидов, белков; активные ингредиенты, выбранные из олигонуклеотидов, аналогов нуклеотидов, нуклеозидов, аналогов нуклеозидов; активные ингредиенты, выбранные из гормонов, иммуносупрессантов, ингибиторов роста злокачественных клеток, кортикостероиды, глюкокортикоиды, антиретровирусные и нестероидные противовоспалительные средства, цитокины, токсины, вещества с вакцинирующим действием; контрастное вещество для диагностики; частицы или наночастицы, выбранные из наночастиц, содержащих металлические, магнитные наночастицы, суперпарамагнитные наночастицы (SPIO) и комплексы наночастиц и активных молекул.
Например, вещества можно выбирать из 6-меркаптопурина, флударабинфосфата, фосфорилированного азидотимидина, дидеоксицитозина, дидеоксиинозина, глутатиона, бисфосфонатов, преднизолона, фосфата преднизолона натрия, дексаметазона, фосфата дексаметазона натрия, бетаметазона, фосфата бетаметазона натрия, тимидинфосфорилазы, фенилаланин аммиак-лиазы, индоцианина зеленого и суперпарамагнитных частиц. Предпочтительные активные вещества представляют собой дексаметазон и бета-дексаметазон, также в форме фосфата, и дефлазакорт, тогда как наиболее предпочтительным активным веществом является фосфат дексаметазона натрия. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения активные ингредиенты также могут включать пролекарственные средства, а именно предшественники биологически активных ингредиентов. В качестве неограничивающего примера, это пролекарственное средство может представлять собой фосфат дексаметазона натрия (или дексаметазон 21-фосфат), который после инкапсулирования в красных клетках крови и введения пациенту подвергается превращению, через механизм эндогенной активации (дефосфорилирование), в активное противовоспалительное лекарственное средство, называемое дексаметазоном. Альтернативно, превращения пролекарственного средства в лекарственное средство можно добиваться посредством совместного введения соответствующего активатора в том же эритроците, в том случае, если механизм эндогенной активации отсутствует.
Дополнительная цель настоящего изобретения представляет собой популяцию эритроцитов, которые нагружены одним или несколькими веществами, представляющими фармацевтический интерес, которую получают с помощью способа, описанного выше.
Как уже указано, популяция эритроцитов, полученная с использованием способа по настоящему изобретению, демонстрирует более высокую жизнеспособность клеток (метаболизм и выживаемость) по сравнению с такой же популяцией, полученной с использованием способа, описанного в литературе. В частности, эритроциты, обработанные в соответствии с настоящим изобретением, имеют время полужизни клетки, оцениваемое в единицах процентной доли фосфатидилсерина, измеряемого с помощью анализа на аннексин V, очень схожее с таковым у нативных эритроцитов. Анализ на аннексин V осуществляет в лабораторной практике техник-лаборант, и он уже описан в литературе (Canonico B. et al. 2010). Следовательно, здесь дополнительные подробности не приведены. В указанном анализе измеряют процентную долю эритроцитов, которые экспрессируют фосфатидилсерин на внешней поверхности плазматической мембраны, присутствие которого указывает на повреждение и ускоренное старение клеток через естественный механизм элиминации. В целом, красные клетки крови с экспонированным фосфатидилсерином подвергаются фагоцитозу и элиминации из кровотока быстрее, чем эритроциты, которые не имеют этого белка на внешней мембране. Из этого следует, что чем ниже процентная доля эритроцитов с экспонированным фосфатидилсерином, тем выше прогнозируемое время полужизни эритроцитов, помещенных в кровоток в организме человека. Увеличенное время полужизни отражается в более длительном времени высвобождения лекарственного средства или более длительном времени транспортировки в кровотоке. В популяции эритроцитов, которые нагружены с использованием способа по изобретению, наблюдают среднюю процентную долю экспонированного фосфатидилсерина ниже 10%, например, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, тогда как соответствующее значение экспонированного фосфатидилсерина на эритроцитах, обработанных с использованием других способов, может превышать 20-40%. Эти результаты демонстрируют, что способ по изобретению позволяет получать эритроциты-носители, которые, имея почти природное прогнозируемое время полужизни, несут в кровотоке и/или высвобождают инкапсулированные вещества в течение периода времени, достаточно длительного для того, чтобы отвечать наиболее распространенным фармакологическим потребностям.
Превосходную жизнеспособность популяции эритроцитов, описанной в настоящем документе, также подтверждают посредством оценки метаболических способностей получаемых эритроцитов. Оценка метаболических способностей, как известно экспертам в данной области, отражает способность клетки сохранять биохимические функции, необходимые для ее выживаемости. Красные клетки крови представляют собой клетки, производство энергии в которых по существу основано на биохимическом пути гликолиза, в котором лактат представляет собой конечный продукт. Для популяции эритроцитов, составляющей цель этой заявки, продемонстрировано, что среднее количество лактата, образуемого на каждые 106 эритроцитов, составляет больше 0,100 нмоль/ч, т.е., очень схожее с таковым у нативных эритроцитов.
Биохимические/молекулярные характеристики, описанные выше в отношении популяции эритроцитов, образующей цель настоящей заявки, указывают, что эту популяцию можно использовать более эффективно в качестве носителя для активных ингредиентов, чем популяцию эритроцитов, описанную в известном уровне техники, поскольку она отличается более высокой жизнеспособностью и прогнозируемым более длительным временем полужизни.
Дополнительная цель настоящего изобретения состоит в фармацевтической композиции, которая содержит нагруженные эритроциты, полученные в соответствии с изобретением, и фармакологически приемлемый эксципиент.
Композиции, описанные в настоящем документе, представляют собой композиции, подходящие для введения эритроцитов и подходящие для достижения целевого места, представляющего фармакологический интерес. Следовательно, они представляют собой композиции для парентерального введения предпочтительно в физиологическом растворе, а также, например, водные суспензии (включая глюкозу) или те, которые формулируют, как описано в известном уровне техники. В качестве неограничивающего примера, воду или буферы, объединенные с консервантами, стабилизаторами, сахаром и минералами и т.д., можно использовать в качестве фармакологически приемлемых эксципиентов. Такие композиции также могут находиться в лиофилизированной форме для хранения, и их можно восстанавливать в подходящем носителе перед использованием.
Способ по настоящей заявке можно осуществлять с использованием любого аппарата, подходящего для гемофильтрации, оперирующего различными растворами и управляющего потоками, осмоляльностью и объемами. Предпочтительно, аппарат и способ работают автоматически на основании подходящей программы, например, с использованием медицинского электрического аппарата, называемого Red Cell Loader.
Пример набора для того, чтобы осуществлять способ в соответствии с определенным пунктом формулы изобретения, подлежащий использованию в сочетании с оборудованием, описанном в предшествующей итальянской патентной заявке BO2010A000255, показан на фиг. 3. Набор содержит следующие нумерованные структурные элементы:
(1) Шиповой соединитель для гипотонического раствора 1
(2) Шиповой соединитель для гипотонического раствора 2
(3) Шиповой соединитель для 2 л мешка инъецируемого физиологического раствора (промывка)
(4) Соединитель для мешка для отходов
(5) Люэровский соединитель для введения 50 мл крови пациента (50 мл шприц)
(6) Конечный собирающий мешок
(7) Мешок для отходов
(8) Мешок для переноса
(9) Соединитель для насоса к Red Cell Loader (правая сторона аппарата, со стороны стойки)
(10) Резервуары (для ультрафильтрата)
(11) Гемоконцентрационный фильтр
(12) Камера (камера Latham для разделения и промывания крови)
(13) Прокалываемое место (для ввода лекарственного средства и раствора для закупоривания PIGPA).
Заболевание любого типа, которое требует лечения с помощью подходящего инкапсулируемого лекарственного средства активного ингредиента, можно предпочтительно лечить с использованием эритроцитов по изобретению. Примером указанных заболеваний является телеангиоэктатическая атаксия (AT), которую лечат дексаметазоном, предпочтительно фосфатом дексаметазона натрия.
L’AT представляет собой редкую генетическую, аутосомную рецессивную патологию, обусловленную мутацией в гене ATM, с заболеваемостью 1:40000/1:300000. AT вызывает прогрессирующую нейродегенерацию мозжечка, которая вызывает прогрессирующую атаксию (двигательную дезорганизацию). Ее можно определять приблизительно в возрасте 2 лет, и при ней дегенерация протекает достаточно быстро, обычно приводя в инвалидное кресло приблизительно во втором десятилетии жизни. Основные неврологические симптомы представляют собой мозжечковую дизартрию, дисметрию и отсутствие координации движений глаз, к которым могут добавлять экстрапирамидальные симптомы, такие как хорея или брадикинезия. Пациенты очень восприимчивы к инфекциям и обычно умирают после 20 лет из-за тяжелых легочных осложнений или начала лейкоза.
ПРИМЕРЫ
Изобретение описано далее со всеми экспериментальными подробностями в следующих примерах, которые являются исключительно описательными и не ограничивают настоящее изобретение.
Пример 1: Способ нагрузки эритроцитов
Способ нагрузки эритроцитов осуществляли с использованием аппарата, описанного в патентной заявке (IT) BO2010A 000255 и U.S. 61/373,018, как детально описано далее.
Эритроциты, выделенные из 50 мл цельной крови посредством центрифужной системы типа «камеры Latham», вращающейся 5600 об/мин, промывают в 750 мл физиологического раствора на скорости промывания 225 мл/мин и переносят в мешок для переноса.
Количество 300 мл первого гипотонического раствора, имеющего осмоляльность 200 мОсм/кг, добавляют в мешок для переноса, который затем инкубируют плите смесителя при комнатной температуре в течение 5 минут. После этого первый гипотонический раствор удаляют посредством центрифугирования (камера) до тех пор, пока не достигают объема приблизительно 80 мл.
Эритроциты, концентрированные таким образом, переносят обратно в мешок для переноса, в который затем добавляют 64 мл второго гипотонического раствора с осмоляльностью 180 мОсм/кг.
Затем мешок инкубируют при комнатной температуре на плите при перемешивании в течение 5 минут. После инкубации эритроциты концентрируют с использованием гемоконцентрационного фильтра и приблизительно 80 мл ультрафильтрата собирают в резервуаре, в который с помощью вакуумного насоса подают небольшое отрицательное давление. Эритроциты, концентрированные таким образом, после этого извлекают и переносят в мешок для переноса. Лекарственное средство, представляющее интерес, в этом примере фосфат дексаметазона натрия (25 мг/мл), предварительно смешивали с приблизительно 11 мл воды для инъецируемых растворов (препарат имеет осмоляльность приблизительно 20 мОсм/кг) и добавляли в концентрированные эритроциты посредством инъекции в мешок для переноса. Эту операцию следует осуществлять за 5 минут. После этого содержимое мешка для переноса инкубируют при комнатной температуре на плите при перемешивании в течение 10 минут. Затем добавляют раствор для закупоривания (с осмоляльностью 3800 мОсм/кг) в количестве 3 мл. Это добавление следует выполнять за 5 минут. Мешок для переноса инкубируют в течение 30 минут при 37°C±2 на плите смесителя. Затем эритроциты переносят в камеру и тщательно промывают в 1100 мл физиологического раствора при скорости потока 225 мл/мин. Наконец, таким образом полученные нагруженные эритроциты переносят в конечный собирающий мешок. Общее время способа составляет приблизительно 1 ч и 30 мин.
Пример 2: Эффективность инкапсуляции
Способ, описанный в настоящем изобретении, обеспечивает эффективность инкапсуляции (введения) активного ингредиента (в этом примере, фосфата дексаметазона натрия) почти в 10 раз больше, чем известный способ (способ 1), как показано в таблице 1.
В частности, 50 мл цельной крови использовали в качестве исходного материала. Во время фазы нагрузки активным ингредиентом (стадия d) описанного выше способа, 20 мл DSP (фосфат дексаметазона натрия) 25 мг/мл добавляют для известного способа (т.е. согласно EP0882448) и только 2,5 мл того же раствора DSP добавляют с 11 мл воды для инъекций в способе по настоящему изобретению (способ 2).
Анализ содержания DSP в эритроцитах, которые нагружены согласно способу 1 или 2, осуществляли с использованием ВЭЖХ оборудования после экстрагирования активного ингредиента из красных клеток крови посредством кипячения и разведения в воде и метаноле. Результаты приведены в таблице 1.
| Таблица 1 | |||
| Известный способ Начальная доза 500 мг DSP |
Целевой способ по данному описанию Начальная доза 62,5 мг DSP | ||
| Инкапсулированный DSP в конце способа (среднее) | мг/мешок | 8,9 | 11,2 |
Пример 3: Образование лактата в эритроцитах
Использовали мешок цельной крови от здорового донора. Начальную порцию красных клеток крови донора использовали в качестве необработанного образца. Цельную кровь в количестве 50 мл обрабатывали с использованием способа по настоящему изобретению. В конце способа 30 мл обработанных эритроцитов собирали и доводили до 40% гематокрит посредством центрифугирования. Затем глюкозу добавляют в каждый образец и их инкубируют при 37°C в течение 3 часов, анализируя накопление лактата в супернатанте (превращение глюкозы в лактат по гликолитическому пути) каждые 30 минуты. Анализ осуществляли с использованием анализатора газов крови.
Образование лактата в необработанных RBC (красные клетки крови) сравнимо с образованием лактата в RBC, полученного при использовании способа, описанного в настоящем документе. Эти результаты показывают, что красные клетки крови, полученные с помощью способа, составляющего цель настоящего изобретения, способны поддерживать свою основную метаболическую функцию (гликолиз), превращая глюкозу в лактат с эффективностью, схожей с таковой у необработанных красных клеток крови (контроль), как показано в таблице 2.
| Таблица 2 | |||
| Способ, описанный в настоящем документе | |||
| 250 мг DSP | |||
| Необработанные RBC | Начальное количество | ||
| Образование лактата | нмоль 106RBC/h | 0,138 | 130 |
Пример 4: Время полужизни нагруженных эритроцитов
Оценочное время полужизни эритроцитов, которые нагружены согласно способу, описанному в настоящем документе, оценивали посредством измерения аннексина V на клеточной поверхности, который известен в качестве маркера гибели клеток (старения), как подробно описано далее.
В частности, использовали мешок цельной крови от здорового донора. Начальную порцию красных клеток крови донора использовали в качестве необработанного образца. Цельную кровь в количестве 50 мл обрабатывали с использованием способа по настоящему изобретению. эритроциты в количестве 106 брали из конечного продукта способа и из необработанного образца; их разводили в реакционном буфере для аннексина V, добавляли 3 мкл аннексина V, конъюгированного с флуорохромом FITC, и осуществляли анализ посредством проточной цитометрии.
Как показано ниже в таблице 3, увеличение аннексина V с 0,75% в необработанном контроле до 6,26% красных клеток крови, полученных при использовании способа, описанного в настоящем документе, указывает на тот факт, что последние имеют значительную способность оставаться в кровотоке в течение длительного времени. Для продуктов на основании красных клеток крови для трансфузионных целей в литературе приведены значения аннексина V, схожие с теми, которые получены для нагруженных красных клеток крови, полученных при использовании способа, описанного в настоящем документе (Relevy H. et al., 2008).
| Таблица 3 | ||
| Необработанные RBC | Способ, описанный в настоящем документе Начальное количество 250 мг DSP | |
| Аннексин V % | 0,75 | 6,26 |
Пример 5: Вариации инкапсулированной дозы
Способ по настоящему изобретению делает возможной инкапсуляцию доз активного ингредиента, такого как DSP (фосфат дексаметазона натрия), в очень широком терапевтическом диапазоне посредством простого варьирования начальной дозы используемого лекарственного средства, как показано далее в таблице 4. В частности, 50 мл цельной крови использовали для каждого эксперимента и для каждого начального количества DSP. DSP 25 мг/мл в количестве 20 мл добавляли для нагружения фосфатом дексаметазона натрия в соответствии с известным способом (EP0882448).
В случае способа, описанного в настоящем документе, 10 мл, 5 мл, 2,5 мл и 2 мл DPS 25 мг/мл, каждый предварительно смешан с 11 мл воды для инъекций, добавляли для доз 250, 125, 62,5 и 50, соответственно. Для анализа DSP, инкапсулированного в красных клетках крови, необходимо сначала разведение 1:10 в дистиллированной воде, стадия кипячения образца для денатурации белков, после чего следует центрифугирование и экстрагирование в воде и метаноле. Анализ инкапсулированного DSP осуществляли посредством ВЭЖХ. Результаты приведены в таблице 4.
| Таблица 4 | ||||||
| Известный способ | Способ, описанный в настоящем документе | |||||
| Начальное количество DSP | мг | 500 | 250 | 125 | 62,5 | 50 |
| Инкапсулированная доза DSP | мг | 8,9 | 29,4 | 18,3 | 11,2 | 9,9 |
Пример 6: Инкапсуляция активных ингредиентов с высокой молекулярной массой
Способ по настоящему описанию также делает возможной инкапсуляцию белков с высокой молекулярной массой, таких как гексокиназа (HK), с эффективностью инкапсуляции начального продукта больше 15%, как показано далее в таблице 5.
В частности, использовали 50 мл цельной крови от здоровых доноров, которую подвергали способу инкапсуляции, описанному в настоящем документе. Инкапсулированный активный ингредиент представлял собой белок гексокиназу. На стадии добавления активного ингредиента добавляли 200 мг HK, растворенной в 14 мл воды для инъекций.
| Таблица 5 | ||
| Способ, описанный в настоящем документе | ||
| Начальное количество белка HK | МЕ/всего | 10000 |
| Гексокиназа (HK), инкапсулированная в конце способа | МЕ/всего | 1600 |
Пример 7: Влияние глобулярной осмотической резистентности на нагружение эритроцитов
Каждый индивидуум обладает своей собственной глобулярной осмотической резистентностью (RGO), которая может влиять на результат способа нагружения. Данные, представленные далее, указывают, что доноры с различной осмотической силой сохраняют очень схожие нагрузки лекарственными средствами. Следовательно, доказано, что начальная RGO пациента не оказывает значительного влияния на способ по настоящему изобретению, как проиллюстрировано данными в таблице 6, в отличие от того, что показано для схожих известных способов.
Для того чтобы определять вариабельность нагрузки продуктом внутри красных клеток крови на основании RGO различных индивидуумов, способ, описанный в настоящем изобретении, использовали с начальной дозой DSP (фосфат дексаметазона натрия), равной 50 мг. Осуществляли всего 5 тестов, начав с 50 мл цельной крови от 5 различных индивидуумов с различными RGO.
Осмотическое глобулярное сопротивление каждого индивидуума измеряли посредством разведения части их цельной крови в растворах со снижающейся концентрацией NaCl (8 различных значений осмоляльности), посредством измерения свободного гемоглобина в каждом из растворов и построения графика общего свободного гемоглобина в качестве функции осмоляльности (см. фиг. 1). Затем получали значение RGO (соответствующее осмоляльности при 50% гемолиза или 50% свободного гемоглобина) посредством интерполяции указанных полученных кривых. Высвобожденный гемоглобин количественно определяли с помощью реактива Драбкина и показаний спектрофотометра (Drabkin DL. Med Sci 1949). Анализ DSP (фосфат дексаметазона натрия), нагруженного в конечные эритроциты, осуществляли после их лизиса посредством кипячения, экстрагирования в воде-метаноле и ВЭЖХ. Результаты приведены в таблице 6.
| Таблица 6 | |||
| RGO (Гемолиз 50%) | RGO (Гемолиз 50%) | Нагрузка DSP | |
| Образец | мОсм/кг | Концентрация NaCl в г/дл |
мг/мешок |
| 1 | 153 | 0,47 | 9,6 |
| 2 | 143 | 0,44 | 10,5 |
| 3 | 151 | 0,47 | 9,8 |
| 4 | 141 | 0,43 | 10,2 |
| 5 | 143 | 0,44 | 9,9 |
| Среднее | 146±5 | 0,45±0,02 | 10,0±0,4 |
Как показано выше в таблице 6, в способе, описанном в настоящем документе, нагружение фосфатом дексаметазона натрия (DSP) красных клеток крови индивидуумов с различными начальными RGO (от 141 до 153 мОсм/кг) не показывает изменений, которые можно рассматривать в качестве фармакологически отличного эффекта (средняя нагрузка 10,0±0,4 мг/мешок). Вариация инкапсулированного DSP по сравнению с вариацией RGO индивидуумов, как описано в этих примерах, незначительна с фармакологической точки зрения.
Пример 8: Влияние вариации начального гематокрита на нагружение эритроцитов
Для того чтобы определять вариабельность нагружения красных клеток крови на основании гематокрита начальной крови, способ, описанный в настоящем изобретении, использовали с начальной дозой DSP (фосфат дексаметазона натрия), равной 62,5 мг.
Осуществляли всего 10 тестов с 5 различными индивидуумами (1 гематокрит тест с приблизительно 40% гематокритом и 1 тест с приблизительно 50% гематокритом для каждого донора). Стандартизацию гематокрита для каждого донора осуществляли посредством центрифугирования или разведения начальной крови. Анализ нагружения DSP в конечных эритроцитах осуществляли после их лизиса посредством кипячения, экстрагирования в воде-метаноле и ВЭЖХ. Результаты приведены в таблице 7.
| Таблица 7 | ||||
| Образец | HCT начальной крови, скорректированный до 40% | HCT начальной крови, скорректированный до 50% | ||
| HCT (%) | Нагруженный DSP (мг/конечный мешок) | HCT (%) | Нагруженный DSP (мг/конечный мешок) | |
| 1 | 39,9 | 11,48 | 49,9 | 13,04 |
| 2 | 40,0 | 11,72 | 50,1 | 10,76 |
| 3 | 39,3 | 10,94 | 50,0 | 10,52 |
| 4 | 40,8 | 11,75 | 50,0 | 11,70 |
| 5 | 40,0 | 11,16 | 50,1 | 9,92 |
| Среднее | 40,0±0,5 | 11,41±0,65 | 50,0±0,1 | 11,19±1,22 |
Как показывают данные, приведенные в таблице 7, нагружение красных клеток крови фосфатом дексаметазона натрия у индивидуумов с различными начальными значениями гематокрита (гематокрит от 40 до 50%) является чрезвычайно постоянным (от 11,41 до 11,19 мг/конечный мешок) и не демонстрирует статистически значимых вариаций (p>0,05 в парном критерии Стьюдента) без необходимости менять параметры способа, описанные в настоящем документе. Вариация инкапсулированного DSP по сравнению с 10% вариацией начального гематокрита, который, напротив, имеет очень существенные вариации (p<0,001 в парном критерии Стьюдента) индивидуумов, описанных в этих примерах, незначительна с фармакологической точки зрения.
Пример 9: Лечение AT с использованием эритроцитов известного уровня техники и по изобретению
Клиническое исследование IEDAT-01
Осуществляли клиническое исследование, называемое IEDAT-01 (или IEDAT) в двух итальянских университетских центрах Brescia-Rome-Civil Hospital и La Sapienza University. Пациентов с телеангиоэктатической атаксией, включенных в исследование, лечили фосфатом дексаметазона натрия, инкапсулированным в эритроциты, полученные в соответствии с предыдущей технологией согласно EP0882448 (старая процедура). Это было проспективное открытое исследование в течение 6 месяцев. Пациенты получали терапию EryDex, фосфатом дексаметазона натрия, инкапсулированным в эритроциты от самих пациентов, с месячными интервалами.
Были включены всего 22 пациента в возрасте от 4 до 19 лет, 18 из которых регулярно проходили лечение, предоставляемое в течение 6 месяцев. Основной показатель эффективности исследования измеряли с помощью оценочной шкалы ICARS («International Cooperative Ataxia Rating Scale»), по которой оценивают изменения в неврологических симптомах, сравнивая значения, полученные в конце 6 месячного периода лечения, со значениями, полученными по ICARS, перед началом лечения (базовый уровень). Результаты для основной конечной точки (p = 0,02) и для вторичных конечных точек исследования были статистически значимыми. Это как в анализе популяции, подлежащей лечению (ITT), которая включает всех 22 пациентов, которые вошли в исследование, даже если они его не закончили, так и в анализе в соответствии с протоколом (PP), в котором вместо этого учитывают только пациентов, которые закончили 6-месячное лечение.
С точки зрения безопасности, лечение находят хорошо переносимым пациентами, включенными в исследование.
ICARS
Шкала ICARS («International Ataxia Rating Scale»), разработанная посредством Trouillas в 1997 году, является наиболее частым инструментом, используемым неврологами для того, чтобы оценивать и стандартизировать наиболее распространенные неврологические манифестации синдромов, связанных с нарушением мозжечковых функций (мозжечок), таких как атаксия. ICARS использовали в качестве меры исхода в различных интервенционных клинических исследованиях, в частности, при атаксии Фридрейха. Она представляет собой полуколичественную шкалу, разделенную на 4 подшкалы, связанные со следующими доменами: анормальная поза и анормальная походка; кинетические функции; глазодвигательные нарушения и речевые нарушения. Максимальная общая оценка составляет 100 очков (0 соответствует здоровым субъектам, 100 соответствует самой тяжелой степени состояния пациента).
IEDAT, ИССЛЕДОВАНИЕ НЕЗАРЕГИСТРИРОВАННОГО ПРЕПАРАТА ПРИ ТЯЖЕЛОЙ ПАТОЛОГИИ И НЕВРОЛОГИЧЕСКИЕ УЛУЧШЕНИЯ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ СТАРОЙ И НОВОЙ ПРОЦЕДУРЫ
Исследование IEDAT осуществляли для 22 пациентов AT, и его цель состояла в том, чтобы измерять эффект лечения EryDex (фосфат дексаметазона натрия, инкапсулированный в аутологические красные клетки крови согласно известной процедуре), оказываемый на неврологическое состояние пациентов, по шкале ICARS.
Четыре пациента, которые участвовали в исследовании IEDAT, продолжали лечение EryDex после окончания исследования по клиническому протоколу, называемому «Использование незарегистрированного препарата при тяжелой патологии».
Во время исследования IEDAT использовали эритроциты, которые нагружены с использованием процедуры с дексаметазоном фосфата посредством (старые процедуры EryDex, как описано в патенте EP0882448). 4 пациента, которые приступили к использованию незарегистрированного препарата, продолжали лечение EryDex с использованием старых процедур, затем перешли (после в среднем 5 лечений) к лечению EryDex, полученного посредством описанной процедуры в соответствии с этой заявкой (новые процедуры EryDex). Эта процедура ведет к значительному усовершенствованию по сравнению с предыдущей процедурой.
Далее в таблице 8 показано, что лечение 4 пациентов AT с использованием старых процедур вело к улучшению на 3,25 очка по шкале ICARS после 5 месяцев непрерывного лечения при использовании незарегистрированного препарата по сравнению с базовым уровнем исследования ICARS. Это значение, соответствующее процентное доле улучшения 5,9%, следует считать скромным с клинической точки зрения. В целом неврологи рассматривают улучшение по шкале ICARS меньше 10% как незначительное.
Эффекты, наблюдаемые у 4 пациентов после переключения на лечение EryDex, которых достигали с использованием новой процедуры, хорошо видны. Среднее улучшение фактически составляло 6,75 очка ICARS (13,1%) по сравнению со значением ICARS, наблюдаемым после лечение с использованием старых процедур. Новые процедуры, благодаря улучшениям определенных характеристик красных клеток крови (наиболее схожих с красными клетками крови пациента) и более высокой воспроизводимости инкапсуляции лекарственного средства, позволяли достигать высокого неврологического усовершенствования, релевантного с клинической точки зрения. Всего 4 пациента, которых лечили с использованием EryDex, от начала исследования IEDAT до конца исследования незарегистрированного препарата, имели среднее улучшении значений ICARS 10 очков или 18,3% (последняя колонка в нижеследующей таблице). Эти данные имеют даже большее значение по сравнению с тем, что наблюдали у пациентов AT, которые во время периода исследования не получали лечение EryDex и которые в среднем имели ухудшение в 7 очков по шкале ICARS.
| Таблица 8 | ||||||||
| Старая процедура | Новая процедура | |||||||
| Значения ICARS - исследования IEDAT | Значения ICARS - использование незарегистрированного препарата | |||||||
| ПАЦИЕНТ | Базовый уровень | Последний визит | Разница между базовым уровнем и последним визитом | Конец лечения по старой процедуре | Разница между базовым уровнем и старой процедурой | Конец лечения по новой процедуре | Разница между концом старой процедуры и концом новой процедурой | Разница между базовым уровнем и концом новой процедуры |
| 02-01 | 57 | 53 | -4 | 47 | -10 | 45 | -2 | -12 |
| 02-02 | 55 | 58 | 3 | 58 | 3 | 53 | -5 | -2 |
| 02-05 | 58 | 56 | -2 | 54 | -4 | 41 | -13 | -17 |
| 02-08 | 49 | 42 | -7 | 47 | -2 | 40 | -7 | -9 |
| Среднее | 54,75 | 52,25 | -2,5 | 51,5 | -3,25 | 44,75 | -6,75 | -10 |
| % улучше-ния ICARS | 4,6 | 5,9 | 13,1 | 18,3 |
График на фиг. 4 показывает значения ICARS для 4 пациентов в крайних значениях периода лечения с использованием старых и новых процедур (вслед друг за другом). Наклоны прямых линий интерполяции в отношении 3 из 4 пациентов (пациенты 02-02, 02-05, 02-08) очевидно больше во время периода лечения с использованием новых процедур. Больший наклон явно указывает на то, что в период использования новых процедур неврологическое состояние пациента улучшается быстрее, чем в период лечения с использованием старых процедур (хотя в случае одного пациента 02-02 имеет место даже ухудшение). Только у одного пациента (02-01) улучшение имеет более низкую скорость при использовании новых процедур; однако этот пациент уже достиг очень значительного улучшения при использовании предыдущего лечения и все же имеет дальнейшее улучшение его неврологического состояния при использовании новых процедур.
Прогрессирующее улучшение неврологического состояния, даже у пациентов, которые незначительно или вовсе не отвечали на лечение EryDex, получаемое с использованием старых OLD процедур, что связано с высоким уровнем переносимости лечения, демонстрирует, что терапия EryDex, получаемая в соответствии с новой процедурой и в соответствии с настоящим изобретением, приносит значительную клиническую пользу пациентам, страдающим телеангиоэктатической атаксией.
1. Способ получения эритроцитов, которые нагружены одним или несколькими веществами, представляющими фармацевтический интерес, который включает следующие стадии:
a) набухание эритроцитов с использованием первого гипотонического раствора, где указанный первый раствор приводит эритроциты к осмоляльности 250-200 мОсм/кг;
b) дополнительное набухание эритроцитов, полученных на стадии a), не достигая лизиса, с использованием второго гипотонического раствора, который более гипотоничен, чем первый гипотонический раствор, где указанный второй гипотонический раствор приводит эритроциты к осмоляльности 200-170 мОсм/кг;
c) концентрирование эритроцитов, полученных на стадии b);
d) приведение концентрированных эритроцитов в контакт с лизирующим раствором, содержащим одно или несколько веществ, представляющих фармацевтический интерес, где лизирующий раствор приводит эритроциты к осмоляльности в диапазоне от 150 до 110 мОсм/кг, и затем
e) добавление раствора для закупоривания с целью получения популяции эритроцитов, которые нагружены указанным одним или несколькими веществами, представляющими фармацевтический интерес.
2. Способ по п. 1, который между стадиями (a) и (b) включает дополнительную стадию, где по меньшей мере часть первого гипотонического раствора удаляют перед добавлением второго гипотонического раствора.
3. Способ по любому из пп. 1 или 2, где указанную стадию концентрации (c) осуществляют посредством гемофильтрации, гемодиализа или центрифугирования.
4. Способ по п. 1, где раствор для закупоривания на стадии (e) представляет собой гипертонический раствор от 300 до 5000 мОсм/кг.
5. Способ по п. 1, где вещества, представляющие фармацевтический интерес, выбирают из следующих активных действующих веществ: пептиды, олигопептиды, полипептиды, белки, активные ингредиенты, выбранные из: олигонуклеотидов, аналогов нуклеотидов, нуклеозидов, аналогов нуклеозидов; активные действующие вещества, выбранные из: гормонов, иммуносупрессантов, противоопухолевых средств, кортикостероидов, глюкокортикоидов, антиретровирусных противовоспалительных лекарственных средств, цитокинов, токсинов, веществ с иммунизирующими активностями; контрастные вещества для диагностики; частицы и наночастицы, выбранные из: металлосодержащих наночастиц, магнитных наночастиц, суперпарамагнитных частиц (SPIO), комплексов наночастиц и активных молекул.
6. Способ по п. 4, где вещества, представляющие фармацевтический интерес, выбирают из следующих активных действующих веществ: пептиды, олигопептиды, полипептиды, белки, активные ингредиенты, выбранные из: олигонуклеотидов, аналогов нуклеотидов, нуклеозидов, аналогов нуклеозидов; активные действующие вещества, выбранные из: гормонов, иммуносупрессантов, противоопухолевых средств, кортикостероидов, глюкокортикоидов, антиретровирусных противовоспалительных лекарственных средств, цитокинов, токсинов, веществ с иммунизирующими активностями; контрастные вещества для диагностики; частицы и наночастицы, выбранные из: металлосодержащих наночастиц, магнитных наночастиц, суперпарамагнитных частиц (SPIO), комплексов наночастиц и активных молекул.
7. Способ по п. 5, где указанный активный ингредиент представляет собой 6-меркаптопурин, флударабинфосфат, азидотимидинфосфат, дидеоксицитидин, деоксиаденозин, глутатион, бисфосфонаты, преднизолон, фосфат преднизолона, дексаметазон, фосфат дексаметазона, бетаметазон, фосфат бетаметазона, дефлазакорт, тимидинфосфорилазу, фенилаланин аммиак-лиазу, индоцианин зеленый, суперпарамагнитные частицы.
8. Способ по п. 6, где указанный активный ингредиент представляет собой 6-меркаптопурин, флударабинфосфат, азидотимидинфосфат, дидеоксицитидин, деоксиаденозин, глутатион, бисфосфонаты, преднизолон, фосфат преднизолона, дексаметазон, фосфат дексаметазона, бетаметазон, фосфат бетаметазона, дефлазакорт, тимидинфосфорилазу, фенилаланин аммиак-лиазу, индоцианин зеленый, суперпарамагнитные частицы.
9. Эритроциты для применения в терапевтическом лечении, которые нагружены одним или несколькими веществами, представляющими фармацевтический интерес, которые получены с помощью способа по п. 1, которые отличаются тем, что процентная доля фосфатидилсерина, образуемого эритроцитами, которую измеряют в анализе на аннексин V, составляет меньше 10%, а количество лактата, образуемого на каждые 106 эритроцитов, составляет больше 0,100 нмоль/ч.
10. Эритроциты по п. 9, где указанные одно или несколько веществ, представляющих фармацевтический интерес, выбирают из следующих активных действующих веществ: пептиды, олигопептиды, полипептиды, белки, активные ингредиенты, выбранные из: олигонуклеотидов, аналогов нуклеотидов, нуклеозидов, аналогов нуклеозидов; активные действующие вещества, выбранные из: гормонов, иммуносупрессантов, противоопухолевых средств, кортикостероидов, глюкокортикоидов, антиретровирусных противовоспалительных лекарственных средств, цитокинов, токсинов, веществ с иммунизирующими активностями; контрастные вещества для диагностики; частицы и наночастицы, выбранные из: металлосодержащих наночастиц, магнитных наночастиц, суперпарамагнитных частиц (SPIO), комплексов наночастиц и активных молекул.
11. Эритроциты по п. 10, где указанные активные ингредиенты выбирают из:
6-меркаптопурин, флударабинфосфат, азидотимидинфосфат, дидеоксицитидин, деоксиаденозин, глутатион, бисфосфонаты, преднизолон, фосфат преднизолона, дексаметазон, фосфат дексаметазона, бетаметазон, фосфат бетаметазона, дефлазакорт, тимидинфосфорилаза, фенилаланин аммиак-лиаза, индоцианин зеленый, суперпарамагнитные частицы.
12. Эритроциты по п. 9, где указанные активные ингредиенты выбирают из преднизолона, фосфата преднизолона, дексаметазона, фосфата дексаметазона, бетаметазона, фосфата бетаметазона, дефлазакорта.
13. Эритроциты по п. 12, в которых указанные активные ингредиенты выбирают из фосфата дексаметазона натрия и фосфата бетаметазона натрия.
14. Эритроциты по п. 9 для применения в лечении телеангиоэктатической атаксии.
15. Фармацевтическая композиция для применения в терапевтическом лечении, содержащая эритроциты по п. 9 и один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов.
16. Фармацевтическая композиция по п. 15, где указанные активные ингредиенты выбирают из преднизолона, фосфата преднизолона, дексаметазона, фосфата дексаметазона, бетаметазона, фосфата бетаметазона, дефлазакорта.
17. Фармацевтическая композиция по п. 16, в которых указанные активные ингредиенты выбирают из фосфата дексаметазона натрия и фосфата бетаметазона натрия.
18. Фармацевтическая композиция по п. 15 для применения в лечении телеангиоэктатической атаксии.
