Средство, сохраняющее популяцию гамк-ергических нейронов после острой перинатальной гипоксии
Владельцы патента RU 2672884:
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский государственный педагогический университет им. А.И. Герцена" (РГПУ им. А.И. Герцена) (RU)
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии им. И.П. Павлова Российской академии наук (RU)
Изобретение относится к медицине, в частности к средству, сохраняющему популяцию ГАМК-ергических нейронов после острой перинатальной гипоксии. Заявленное средство содержит 4-амино-3-фенилбутановую кислоту с салициловой кислотой в мольном соотношении (1-3):1. Осуществление изобретения позволяет получить малотоксичное средство, способное сохранять популяцию ГАМК-ергических нейронов после острой перинатальной гипоксии. 4 табл.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине и касается производных гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), сохраняющих популяцию ГАМК-ергических нейронов после острой перинатальной гипоксии.
Гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) является важнейшим тормозным нейромедиатором в головном мозге млекопитающих. Она синтезируется в нервных клетках путем декарбоксилирования главного возбуждающего медиатора глутамата под действием фермента глутамат-декарбоксилазы (GAD) [Roberts Е., Frankel S. Gamma-aminobutyric acid in brain: its formation from glutamic acid // J. Biol. Chem. 1950. Vol. 187. №1. P. 55-63]. ГАМК улучшает кровообращение и обменные процессы в головном мозге. Стимулируя выработку соматотропного гормона, ГАМК регулирует рост и развитие ребенка [Fine R., Zhang J., Stevens H.E. Prenatal stress and inhibitory neuron systems: implications for neuropsychiatric disorders // Molecular Psychiatry. 2014 Jun. Vol. 19. №6. P. 641-651; Kahle K.T. The GABA excitatory/inhibitory shift in brain maturation and neurological disorders // Neuroscientist. 2012. Oct. Vol. 18. №5. P. 467-486].
ГАМК является действующим веществом лекарственного средства аминалон. Он применяется для лечения некоторых заболеваний головного мозга и относится к ноотропным средствам [Машковский М.Д. Лекарственные средства. М. «Новая волна». 2012. С. 17; Ковалев Г.В. Ноотропные средства. Волгоград. Нижне-Волжское книжное издательство. 1990. 368 с]. ГАМК не используется для лечения патологических состояний и нервно-психических заболеваний обусловленных перинатальной патологией. Ее свойства сохранять популяцию ГАМК-ергических нейронов после острой перинатальной гипоксии также неизвестны.
Известно средство, обладающее антиишемической, гипотензивной, противоаритмической и ноотропной активностью, включающее производное ГАМК 4-амино-3-фенилбутановую кислоту и глутаминовую или никотиновую кислоты. Полученные средства имеют меньшую токсичность, чем исходные вещества, оказывают более выраженное антиангинальное и противоаритмическое действие, снижают артериальное давление [RU №2216322]. Свойство указанных в патенте композиций, сохранять популяцию ГАМК-ергических нейронов после острой перинатальной гипоксии не описано. Кроме этого, свойства 4-амино-3-фенилбутановой кислоты сохранять популяцию ГАМК-ергических нейронов после острой перинатальной гипоксии в литературных источниках не описаны. 4-Амино-3-фенилбутановая кислота в медицине вообще не используется.
Известно, что салициловая кислота обладает слабыми антисептическими, раздражающими и кератолитическими (в больших концентрациях) свойствами. Она применяется в медицине наружно [Машковский М.Д. Лекарственные средства. М. «Новая волна». 2012. С. 940]. Свойства салициловой кислоты защищать популяцию ГАМК-ергических нейронов после острой перинатальной гипоксии не описаны.
Гипоксия - одна из основных причин возникновения патологии головного мозга у новорожденных, что часто приводит к младенческой смертности и инвалидности. Неонатальная гипоксия является одним из наиболее мощных и наиболее частых факторов возникновения патологии головного мозга у новорожденных, отрицательно влияющих на последующее развитие ребенка. [Моргун А.В., Кувачева Н.В., Таранушенко Т.Е., Хилажева Е.Д. и др. Современные представления о патогенезе перинатального ишемического повреждения клеток нейроваскулярной единицы головного мозга: молекулы-мишени для нейропротекции. Вестник РАМН. 2013. Т. 12. С. 26-35].
В последнее время в клинических и экспериментальных исследованиях значительное внимание уделяется изучению механизмов гипоксических поражений головного мозга новорожденных, а также механизмов формирования перинатальной патологии мозга, что позволяет разрабатывать эффективные способы предупреждения перинатальной патологии, проявляющейся в последующем онтогенезе [Fan X., Kavalaars F., Heijen C.J. et all. Fharmacological neuroprotection after perinatal hypoxic-ishemic brain injury. // Curr. Neuropharmacol. 2010. Vol. 8. №4. P. 324-334; Herrera-Marschitz M., Neira Pefia Т., Rojas-Mancilla E., Morales P. et all. Short- and long-term consequens of perinatal asphyxia: looking for neuroprotective strategies. // Adv. Neurobiol. 2015. №10. P. 169-198].
Перинатальная гипоксия, как правило, приводит к изменению цитоархитектоники неокортекса, задержке нейроногенеза, пролонгированной гибели части нейронов. В результате чего, численность популяций разных типов нейронов в различных областях коры головного мозга сокращается [Northigton F.J., Chavez-Valdez R., Martin L.J. Neuronal cell death in neonatal hypoxia - ischemia. // Ann. Neuroll. 2011. V. 69. №5. P. 743-758; Отеллин В.A., Хожай Л.И., Ватаева Л.А. Влияние гипоксии в раннем перинатальном онтогенезе на поведение и структурные характеристики головного мозга. // Журнал эволюционной биохимии и физиологии им. И.М. Сеченова. 2012. Т. 48. №5. С. 467-473]. Известно, что гипоксия в раннем перинатальном онтогенезе приводит к основным неврологическим нарушениям деятельности центральной нервной системы (ЦНС) и занимает первое место в ряду всех заболеваний нервной системы в детском возрасте [Рогаткин С.О. Актуальные проблемы перинатальной неврологии на современном этапе. // Журн. неврол. психиатр. 2001. №7. С. 4-8; Моргун А.В., Кувачева Н.В., Таранушенко Т.Е., Хилажева Е.Д., Малиновская Н.А., Горина Я.В., Пожиленкова Е.А., Фролова О.В., Салмина А.Б. Современные представления о патогенезе перинатального ишемического повреждения клеток нейроваскулярной единицы головного мозга: молекулы-мишени для нейропротекции. // Вестник РАМН. 2013. №12. С. 26-35]. Перинатальные гипоксические поражения нервной системы почти у 40% детей приводят к инвалидности (детский церебральный паралич, симптоматическая эпилепсия, задержка умственного развития, нарушения в когнитивной и эмоциональной сферах) [Власюк В.В. Родовая травма и перинатальные нарушения мозгового кровообращения. СПб. Нестор-История. 2009. 252 с.]. Особенно остро неблагоприятное воздействие гипоксии-ишемии проявляется у недоношенных детей, органы и системы которых еще не сформированы для полноценного функционирования.
В настоящее время в реестре лекарственных препаратов отсутствуют средства для фармакологической коррекции структурных повреждений мозга, являющихся последствием воздействия гипоксии в ранний послеродовой период. Также неизвестны фармакологически активные вещества-субстанции, обладающие свойством сохранять популяцию ГАМК-ергических нейронов после острой перинатальной гипоксии.
Эта медицинская и социальная проблема определяет актуальность проведения экспериментальных исследований, направленных на поиск и разработку новых веществ-субстанций, обладающих свойством сохранять популяцию ГАМК-ергических нейронов после острой перинатальной гипоксии, применение которых базируется на данных исследований о механизмах и мишенях воздействия перинатальной гипоксии на мозг.
Задача изобретения - получить высокоэффективное и малотоксичное вещество-субстанцию производное ГАМК, сохраняющее популяцию ГАМК-ергических нейронов после острой перинатальной гипоксии. Применение средства будет основано на данных о механизмах и мишенях его действия.
Поставленная задача реализуется предлагаемым средством, включающим 4-амино-3-фенилбутановую кислоту и салициловую кислоту. Причем, соотношение 4-амино-3-фенилбутановая кислота : салициловая кислота как (1-3):1. При этом получают средство, сохраняющее популяцию ГАМК-ергических нейронов после острой перинатальной гипоксии.
Лекарственное средство содержит эффективную дозу композиции 4-амино-3-фенилбутановой кислоты с салициловой кислотой, фармакологически приемлемые носители и целевые добавки.
Технический результат изобретения заключается в том, что предлагаемое средство малотоксично и способно сохранять популяцию ГАМК-ергических нейронов после острой перинатальной гипоксии.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами: Получение композиции 4-амино-3-фенилбутановой кислоты с салициловой кислотой (КАФС).
В шаровую мельницу загружают соответствующие количества 4-амино-3-фенилбутановой и салициловой кислот. Количества компонентов приведены в таблице А. Смесь компонентов тщательно перемешивают в течение 0,5-1 часа, затем выгружают полученный продукт. Выход количественный.
Далее приводятся примеры, иллюстрирующие специфическую активность композиции 4-амино-3-фенилбутановой кислоты с салициловой кислотой (КАФС) в условиях острой перинатальной гипоксии.
Острая токсичность КАФС оценивалась по выживаемости белых мышей через 24 часа после парентерального (внутрибрюшинного) и энтерального (внутрижелудочного) введения вещества. Усредненные значения показателей ЛД50: при парентеральном введении - 1080 мг/кг, при энтеральном - более 1700 мг/кг. Вещество относится к малотоксичным, что позволяет классифицировать его как малоопасное.
Для изучения специфической активности КАФС защищать ГАМК-ергические нейроны в условиях острой перинатальной гипоксии были применены стандартные экспериментальные методы исследования, основанные на применении глутамат-декарбоксилазы (GAD-67) в качестве маркера ГАМК-ергических нейронов.
В работе были использованы новорожденные животные лабораторных крыс линии Wistar, содержавшиеся в условиях лабораторного вивария, в течение двух недель до начала эксперимента, на стандартном пищевом рационе, при свободном доступе к воде, при естественном световом режиме. Эксперименты проводились в одно и то же время суток. Приводимые в таблицах значения показателей представляют собой среднестатистическую оценку результатов измерения параметров с учетом принятых уровней достоверности (р<0.05).
Острая перинатальная гипоксия моделировалась на вторые постнатальные сутки в барокамере с проточной газовой смесью: кислород - 7.6-7.8%; углекислый газ - 0.15-0.21% и азот - 91.8% в течение одного часа, при температуре 21.3°С-23°С и нормальном общем давлении.
Для проведения эксперимента были сформированы следующие группы животных ювенильного (на 20 сутки жизни) и препубертатного (на 40 сутки жизни) возраста: контрольная группа 1 - новорожденные крысята (интактные животные), получавшие перорально физиологический раствор - позитивный контроль, (n=8-10); контрольная группа 2 - животные, подвергавшиеся воздействию гипоксии и получавшие физиологический раствор - негативный контроль, (n=8-10); опытная группа 3 - новорожденные крысята с гипоксией, получавшие КАФС, (n=8-10). Исследуемую композицию - КАФС в дозе 15 мг/кг вводили подкожно, один раз в день, ежедневно в течение 14 суток.
Для проведения гистологических исследований мозг крысят фиксировали в течение 24 часов в цинк-этанол-формальдегиде на фосфатно-солевом буфере (рН=7.4). Фиксированный материал обезвоживали и заливали в парафин по общепринятой гистологической методике.
Иммуноцитохимическую реакцию проводили на серийных фронтальных парафиновых срезах толщиной 4-5 мкм, окрашенных метиленовым синим (Sigma, США) в синтетической среде Permaunt (Termo, США) по методу Ниссля.
Для выявления ГАМК-ергических нейронов использовали кроличьи поликлональные антитела (Spring Bioscience, США); в качестве вторичных реагентов для GAD-67 использовали реактивы из набора EnVision + System-HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit (DakoCytomation, США). Для визуализации продукта иммуноцитохимической реакции применяли стандартную тест-систему в качестве хромогена использовали 3,3'-диаминобензидин (DAB+) (Dako, Дания). После проведения иммуноцитохимической реакции часть срезов докрашивали гематоксилином Джилла и заключали в синтетическую заливочную среду Permaunt (Termo, США). При проведении иммуноцитохимической реакции все процедуры были стандартизированы и осуществлялись одновременно для гистологических срезов, полученных от животных контрольных и опытной групп.
Количественный подсчет ГАМК-ергических нейронов проводили на цифровых изображениях серийных срезов, полученных при помощи светового микроскопа Leica DME (Leica, Германия) и цифровой камеры Leica ЕС3 (Leica, Германия). Подсчитывали число ГАМК-ергических нейронов в соматосенсорной области неокортекса на стандартной площади 1,06 мм2 при увеличении: окуляр × 10; объектив × 10 или 0,1 μkμ2 при увеличении: окуляр × 10; объектив × 40. Подсчитывали среднее число ГАМК-ергических нейронов на площади фрагментов неокортекса и стандартную ошибку среднего значения. Для подсчета использовали прикладные компьютерные программы Statistica 6.0, ImageScope Color и ORIGIN50. Приводимые в таблицах значения показателей представляют собой среднестатистическую оценку результатов измерения параметров с учетом принятых уровней достоверности (р<0.05).
Влияние КАФС на число ГАМК-ергических нейронов в соматосенсорной области неокортекса (ювенильный и препубертатный периоды развития животных) (табл. 1).
Результаты исследования показали, что у интактных животных ювенильного возраста (контрольная группа 1) ГАМК-ергические нейроны присутствуют во всех слоях неокортекса, они диффузно равномерно рассеяны по всему неокортексу (табл. 1). У животных контрольной группы 2 после острой перинатальной гипоксии наблюдалось существенное снижение (на 22%) общего числа ГАМК-ергических нейронов, в соматосенсорной области неокортекса, по сравнению с таковым у крыс контрольной группы 1 (табл. 1). Такой результат свидетельствует о значительной гибели ГАМК-ергических нейронов у животных, перенесших перинатальную гипоксию. Исследование влияния КАФС на количество ГАМК-ергических нейронов показало, что у крысят ювенильного возраста опытной группы 3 наблюдалось незначительное снижение общего числа ГАМК-ергических нейронов по сравнению с исходными показателями (контрольная группа 1) и было значительно выше (на 21,7%), чем у животных контрольной группы 2 (табл. 1).
Таким образом, предлагаемая композиция КАФС обладает выраженным свойством защищать ГАМК-ергические нейроны мозга крыс ювенильного возраста после острой перинатальной гипоксии, о чем свидетельствует практически равное количество ГАМК-ергических нейронов во всех слоях исследуемой области коры мозга у животных группы 3 с таковым у крысят контрольной группы 1. Существенно, что у животных негативного контроля, не получавших КАФС, в постнатальном периоде после гипоксии численность популяции ГАМК-ергических нейронов значительно снизилась (табл. 1).
Исследование влияния предлагаемого КАФС на животных, достигших препубертатного возраста, показало, что у крыс контрольной группы 1 также присутствует значительная численность популяции ГАМК-ергических нейронов во всех слоях коры (табл. 1). У крыс после острой перинатальной гипоксии (контрольная группа 2) наблюдается существенное снижение (на 39.5%) общего числа ГАМК-ергических нейронов, по сравнению с таковым у животных контрольной группы 1, что свидетельствует о прогрессирующем снижении числа ГАМК-ергических нейронов в слоях соматосенсорной области неокортекса после гипоксии (табл. 1). Результаты экспериментов показали, что у крыс препубертатного возраста опытной группы 3 общее число ГАМК-ергических нейронов во всех слоях неокортекса значительно больше (на 62.4%), чем у животных контрольной группы 2. Такой результат свидетельствует о выраженном свойстве КАФС предотвращать повреждение и гибель ГАМК-ергических нейронов (сохранять их популяцию), а также увеличивать их миграцию в неокортексе у крыс, перенесших на второй день жизни острую перинатальную гипоксию (табл. 1).
Влияние КАФС на число тормозных ГАМК-ергических нейронов в соматосенсорной области неокортекса (ювенильный и препубертатный периоды развития животных) (табл. 2, 3)
Изучение влияния КАФС на состояние ГАМК-ергической тормозной системы в разных слоях соматосенсорной области неокортекса животных ювенильного возраста (на 20 сутки жизни) показало, что у крысят контрольной группы 2 наблюдалось значительное снижение числа тормозных ГАМК-ергических нейронов во всех, но особенно в V и VI слоях неокортекса (табл. 2). В эксперименте на крысятах опытной группы 3, получавших КАФС в дозе 15 мг/кг установлено, что число ГАМК-ергических нейронов у этих животных превосходило в 1.3-1.7 раза таковое у крыс контрольной группы 2 (табл. 2).
Исследование неокортекса крыс препубертатного возраста (на 40 постнатальные сутки) показало, что у животных контрольной группы 2 после перинатальной гипоксии сохраняется тенденция к снижению численности тормозных нейронов в неокортексе (табл. 3). У животных опытной группы 3, получавших КАФС, число тормозных ГАМК-ергических нейронов в разных слоях неокортекса практически соответствует значениям интактных крыс (группа 1) и превосходит в 1.7-2.5 раза таковые у крыс негативного контроля (группа 2) (табл. 3).
Результаты проведенного эксперимента показали, что композиция КАФС в условиях острой перинатальной гипоксии обладает выраженным свойством сохранять популяцию ГАМК-ергических нейронов на 20-е и на 40-е сутки постнатального развития.
Лекарственное средство, содержащее в качестве действующего вещества, композицию 4-амино-3-фенилбутановой и салициловой кислот, в зависимости от выбранных носителей и целевых добавок, может быть изготовлено в любой твердой или жидкой лекарственной форме.
Таким образом, предлагаемое средство КАФС обладает выраженным свойством сохранять популяцию ГАМК-ергических нейронов после острой перинатальной гипоксии, имеет низкую токсичность, что предполагает возможность его длительного использования для фармакологической коррекции повреждений ЦНС у детей с перинатальной гипоксией.
Примечания * - в процентах по сравнению с контрольной группой 1; ** - в процентах по сравнению с контрольной группой 2
Примечания * - в процентах по сравнению с контрольной группой 1; ** - в процентах по сравнению с контрольной группой 2
Примечания * - в процентах по сравнению с контрольной группой 1; ** - в процентах по сравнению с контрольной группой 2
Средство, сохраняющее популяцию ГАМК-ергических нейронов после острой перинатальной гипоксии, характеризующееся тем, что оно включает 4-амино-3-фенилбутановую кислоту и салициловую кислоту, при этом мольное соотношение 4-амино-3-фенилбутановой кислоты и салициловой кислоты составляет (1-3): 1.
