Лекарственное средство на основе бифункционального антитела для лечения мукополисахаридоза ii типа

Изобретение относится к области биохимии, в частности к бифункциональному антителу, соединенному с последовательностью фермента идуронат-2-сульфатазы посредством глицин-серинового мостика, обладающему высокой аффинностью к инсулиновому рецептору человека. Изобретение позволяет эффективно осуществлять лечение мукополисахаридоза II типа. 2 ил., 1 табл., 4 пр.

 

Изобретение относится к области создания лекарственных средств с ферментативной активностью, в частности - бифункциональное антитело, соединенное с последовательностью фермента идуронат-2-сульфатазы посредством глицин-серинового мостика и высокоаффинное к инсулиновому рецептору человека. Бифункциональное антитело проявляет полную ферментативную активность идуронат-2-сульфатазы благодаря высокой степени конвертации цистеина в формилглицин в активном ферментном центре, а также содержит высокое количество N-соединенных гликанов с маннозо-6-фосфатными остатками.

Это соединение предназначено для использования в качестве активного компонента при изготовлении лекарственных средств в ферментативной заместительной терапии орфанного заболевания - мукополисахаридоза II типа или синдрома Хантера.

Мукополисахаридозы (МПС) - группа, объединяющая девять (I-IX, с промежуточными формами - 14) метаболических заболеваний, обусловленных более чем 40 генетическими нарушениями, приводящими к отсутствию или функциональной недостаточности ряда лизосомальных ферментов, участвующих в гидролитическом расщеплении гликозаминогликанов (мукополисахаридов). Гликозаминогликаны - олигосахариды, принимающие участие в формировании костей, хрящей, связок, роговицы, кожи, соединительной ткани и синовиальной жидкости (Burrow and Leslie 2008, Muenzer 2011).

У пациентов, страдающих мукополисахаридозом, наблюдается недостаточность или отсутствие, как минимум, одного из 11 ферментов катаболизма гликозаминогликанов, что с течением времени приводит к постепенному накоплению этих углеводов в клетках, жидкостях организма и соединительной ткани. В результате, перманентное накопление мукополисахаридов приводит к повреждению клеток, дисфункциям тканей и органов, наиболее часто характеризующимся гипретензионно-гидроцефальным синдромом, гепатоспленомегалией, сердечно-сосудистой недостаточностью, костно-суставными осложнениями, функциональными расстройствами ЦНС вплоть до тяжелых когнитивных расстройств и деменций.

Мукополисахаридоз II типа (МПС-II, синдром Хантера), в отличие от всех остальных форм мукополисахаридозов, имеющих аутосомно-рецессивный тип наследования, представляет собой единственную форму мукополисахаридозов с Х-сцепленным рецессивным типом наследования. МПС II - гетерогенная по клиническим проявлениям, прогрессирующая патология лизосомального накопления, возникающая вследствие недостаточности фермента идуронат-2-сульфатазы (идурсульфазы). Данный фермент в норме участвует в деградации мукополисахаридов дерматан-сульфата и гепаран-сульфата за счет гидролитического отщепления О-связанной сульфатной группы. Соответственно, в случае МПС II основной патогенетический механизм связан с прогрессирующим накоплением дерматан- и гепаран-сульфатов в лизосомах.

Несмотря на гетерогенность в скорости прогрессии заболевания, начало проявления признаков и симптомов обычно происходит между 2.5 и 4.5 годами. Более раннее развитие симптомов, как правило, означает более тяжелое течение болезни. Наиболее частыми клиническими симптомами МПС-II являются задержка умственного развития, увеличенный язык, характерные патологии лицевого скелета, алопеция, аномалии развития зубов, рестриктивное заболевание легких, гепатоспленомегалия, патология клапанов сердца, костно-суставные патологии, тяжелая низкорослость. Также, часто наблюдаются прогрессирующие неврологические расстройства, сопровождающиеся гидроцефалией и повышенным внутричерепным давлением. Смертельный исход обычно наступает в течение второй-третьей декады жизни, чаще всего, по причине дыхательной и/или сердечной недостаточности. Важно подчеркнуть, что заболевание протекает с вовлечение в патологический процесс нервной системы, в том числе со снижением интеллекта.

На сегодняшний день имеется два принципиальных способа лечения МПС II в России - ферментативно-заместительная терапия и симптоматическая терапия (включает в себя применение гепатопротекторов, сердечно-сосудистых и противовоспалительных средств, витаминов и препаратов, улучшающих антиоксидантную защиту). Трансплантация гематопоэтических стволовых клеток для лечения МПС II, в отличии от мукополисахаридоза I типа, не эффективно.

Стандарт лечения мукополисахаридоза II типа, утвержденный Минздравом РФ (Федеральные клинические рекомендации по диагностике и лечению мукополисахаридоза типа II, 2013), предусматривает использование ферментативной заместительной терапией препаратом Элапраза (Шайер, США) представляющей собой рекомбинантный фермент -идурсульфазу. При проведении ферментативной заместительной терапии продолжительность жизни больных с синдромом Хантера увеличивается в несколько раз.

Элапраза (МНН: Идурсульфаза) - орфанный (в США и Европе) медицинский продукт, представляющий рекомбинантную идуронат-2-сульфатазу человека. Этот фермент отвечает за гидролиз С2-сульфатных эфирных связей остатков идуроновой кислоты, входящей в состав глюкозаминогликанов (мукополисахаридов) дерматан-сульфата и гепаран-сульфата (Burrow and Leslie 2008).

Рекомбинантный фермент продуцируется в линии клеток человека (HT-1080), что обеспечивает естественный паттерн гликозилирования зрелого фермента, в виде секретируемого в культуральную среду мономерного белка с приблизительной массой 76 кДа. Это 525-аминокислотный белок, который образуется из 550-аминокислотного предшественника путем отрезания 25-аминокислотного сигнального пептида.

Экспрессированная идурсульфаза проходит сложную схему очистки, состоящую из шести этапов хроматографии, двух этапов ультрафильтрации и этапа фильтрации от вирусных частиц.

Идурсульфаза содержит две дисульфидные связи и восемь N-связанных сайтов гликозилирования, занятых сложными высокоманнозными олигосахаридами. Присутствие в олигосахаридных цепях остатков маннозо-6-фосфатов (М6Р) позволяет рекомбинантному ферменту связываться с М6Р-рецепторами на поверхности целевых клеток, что приводит в интернализации белка в клетки, попадание внутрь лизосом и деградацию лизосомальных мукополисахаридов.

Билогическая активность идурсульфазы также в значительной степени зависит от посттрансляционной модификации консервативного остатка цистеина в положении 59, преобразуемого в формилглицин. Как и прочие сульфатазы, идурсульфаза содержит двухвалентные катионы (в данном случае, кальций), которые участвуют в обеспечении каталитической активности фермента.

Оригинальный препарат Элапраза разработан компанией Transkaryotic Therapies Inc. и производится Shire Human Genetic Therapies Inc.

Обычный режим введения Элапразы - 0.5 мг/кг веса тела, раз в неделю, путем внутривенной инфузии в течение 3 часов (время инфузии может быть постепенно сокращено до 1 часа).

Основной минус при использовании ферментативной заместительной терапии Элапразой, является тот факт, что фермент не способен проникать через гематоэнцефалический барьер и таким образом в дальнейшем не предотвращает нейродегенеративные последствия заболевания. В итоге, даже при использовании ФЗТ Элапразой пациенты в основном погибают в возрасте 20 лет от нейродегенеративных последствий (Burrow and Leslie 2008, Wraith et al. 2008).

Задача заявляемой группы изобретений:

- расширить арсенал лекарственных средств для лечения мукополисахаридоза II типа

Задача решена путем

- получением лекарственного средства на основе бифункционального антитела, соединенного с последовательностью фермента идуронат-2-сульфатазы посредством глицин-серинового мостика и высокоаффинного к инсулиновому рецептору человека. соответствующего последовательностям по SEQ ID NO 1 и SEQ ID NO 2.

- увеличенной энзиматической активностью лекарственного средства, которая обеспечивается высоким содержанием формилглицина в положении 517 SEQ ID NO 2 (более 80%) и высокой специфичностью, благодаря увеличенному содержанию гликанов с маннозо-6-фосфатными остатками

Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами:

Фиг.1. Сравнение специфической активности бифункционального антитела (ИДС-биМАТ) с препаратом Элапраза на синтетическом флуорогенном субстрате 4-метилумбеллиферил-α-L-идуронит-2-сульфат-Na2 (4-MU-αIdoA-2S)

Фиг.2. Сравнительное содержание маннозо-6-фосфата в бифункциональном антителе ИДС-биМАТ с препаратом Элапраза

Пример 1. Определение уровня ферментативной активности бифункционального антитела, соединенного с аминокислотной последовательностью идуронат-2-сульфатазы

Специфическую активность бифункционального антитела определяют флюориметрическим анализом используя 4-мутилумбеллиферил-L-идуронид-2-сульфат (4-MUS) (Moscerdam Substrates, Нидерланды) (Voznyi, Keulemans and van Diggelen 2001). В процессе проведения анализа субстрат гидролизуется идуронат-2 сульфотазой с получением 4-мутилумбеллиферил-L-идуронид (MUBI), которая гидролизуется идуронидазой (IDUA, Aldurazyme, Genzyme, США) до 4-метилумбеллиферила (4-MU), который детектируют флуориметрически, используя настройки флуориметра: возбуждение флуоресценции при длине волны 450 нм и детекции флуоресценции при длине волны 365 нм. Калибровочную кривую строят по стандартному раствору 4-MU (Sigma-Aldrich, США). В ходе анализа смесь сначала инкубируют при 37°C, значении водородного показателя pH=4.5 в течение 4 часов, затем добавляют IDUA в количестве 12 мкг и дополнительно инкубируют смесь при 37°C в течение 24 ч. Инкубацию останавливают добавлением 0,2 мл 0,5 M карбоната натрия pH=10,3. Полученные результаты ферментативной активности бифункционального антитела ИДС-биМАТ в сравнении с препаратом Элапраза проиллюстрированы на Фиг.1.

Пример 2. Определение содержания формилглицина

Для определения содержания формилглицина используют метод абсолютного количества (AQUA). Выбирают пептидную последовательность AQQAVCAPSRVSF, включающую Cys-84, из данных пептидных карт, полученных комбинацией различных условий гидролиза при проведении анализа масс-спектрометрии MALDI-MS/MS и жидкостной хроматографии с ионизацией электроспреем совместно с масс- спектрометрией (LC-ESI-MS/MS). Выбранный пептид метят тяжелым изотопом (С13/N15) по Ала-7 положению, так, что его масса увеличивается на 4 Да. Стандартные растворы Cys-AQUA и FGly-AQUA обрабатывают бицинхиноновой кислотой с использованием набора для определения концентрации (Thermo Scientific Waltham, MA). Пептиды цистеиновый (Cys-) и формилглициновый (FGly-) идентифицируют в каждом образце хроматографически LC-ESI-MS/MS с использованием соответствующих стандартов, затем определяют их относительное количество. Образцы, дегликозилируют обработкой пептид-N-гликозидазой F, дитиотрейтолом и алкилируют с йодацетамидом.

Каждый образец расщепляют химотрипсином в трех индивидуальных повторностях и анализируют хроматографически LC-ESI MS/MS для определения содержания обоих пептидов. Основные пики цистеинового и формилглицинового пептидов экстрагируют из хроматограмм с применением метода экстракционной ионной хроматографии. Относительное количество формилглицинового и цистеинового пептидов в положении 84 рассчитывают на основании площади пиков по данным экстракционной ионной хроматографии. Значения отношения площадей рассчитываются отдельно для каждого из трех повторов, на основании чего рассчитывают средние значения и стандартные отклонения, приведенные в таблице 1.

Таблица 1. Определение количества формилглицина в бифункциональном анителе и препарате Элапраза по площади основного пика..

Номер образца (повторности)	Площадь пика формилглицина, %
	Бифункциональное антитело ИДС-биМАТ	Элапраза
101115	201115	241115
1	90,2	92,2	89,9	67,5
2	89,5	90,3	91,2	64,3
3	89,3	90,9	91	72
Среднее	90,5±0,92	67,9±3,86

Пример 3. Определение уровня маннозо-6-фосфата в сравнении с препаратом Элапраза

Анализируемый образец бифункционального антитела или препарата Элапраза гидролизуют трифторуксусной кислотой в конечной концентрации 6,75 М при 100°С в течение 90 минут. После гидролиза образцы отмывают в вакуумной центрифуге, осадок ресуспендируют в воде и фильтруют с использованием стерилизующей фильтрации с диаметром пор фильтра 0,22 мкм. Разделение маннозо-6-фосфата проводят с использованием высокоэффективной анионообменной хроматографии импульсным амперометрическим детектированием на хроматографической системе (Dionex, Sunnyvale, CA) с применением колонки Dionex CarboPAC™PA-10 [4×250 mm] и предколонки Dionex AminoTrap [3×30 mm]. Элюцию маннозо-6-фосфата проводят градиентом от 17% до 70% буфера, содержащего 100 мм натрия гидроксида и 1 М натрия ацетата за 21 минуту при 25°С со скоростью потока 1 мл/мин. Калибровочную кривую и количественное определение сахаров проводят используя стандартный раствор маннозо-6-фосфата (Sigma, США) (Zhou et al. 2002). Молярное отношение маннозо-6-фосфата рассчитывают исходя из молекулярной массы гликозилированного белка и его концентрации. Данные по содержанию маннозо-6-фосфата в бифункциональном антителе ИДС-биМАТ и препарате Элапраза приведены на Фиг.2.

Пример 4. Связывание бифункционального антитела ИДС-биМАТ с α-субъединицей человеческого инсулинового рецептора (HIR-ECD), экспрессированного в CHO клетках в иммуноферментном анализе

Афинность бифункционального антитела ИДС-биМАТ к инсулиновому рецептору человека HIR определяют с использованием иммуноферментного анализа. Для экспрессии инсулинового рецептора используют клетки яичников китайского хомячка CHO, трансфецированные плазмидой HIR-ECD и далее выращивают их в бессывороточной среде. Белок HIR-ECD выделяют с использованием афинных колонок, как описано (Boado, Zhang and Pardridge 2007). Очищенный белок HIR-ECD наносят в лунки Nunc-Maxisorb 96-луночного планшета, проводят связывание вариабельного участка бифункционального антитела к HIR ECD. Детектирование проводят с использованием биотинилированных козьих античеловеческих IgG (H+L) вторичных антител, с добавлением авидина, и биотинилировали пероксидазой (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Концентрацию бифункционального антитела ИДС-биМАТ, при которой происходит 50% максимальное связывание, определяют с использованием нелинейного регрессионного анализа.

Таким образом, изобретение представляет собой бифункциональное антитело, вариабельная часть которого является аффинной к человеческому инсулиновому рецептору, а С-концевой участок тяжелых цепей антитела содержит аминокислотную последовательность полноразмерного фермента идуронат-2-сульфатазы, соединенного посредством глицин-серинового участка. Соединение проявляет высокую специфическую идуронат-2-сульфатазную активность и способность взаимодействовать с инсулиновым рецептором человека, что предполагает использование настоящего изобретения для ферментатативной заместительной терапии синдрома Хантера или мукополисахаридоха II типа

Список литературы:

Boado, R.J., Y. Zhang & W.M. Pardridge (2007) Humanization of anti-human insulin receptor antibody for drug targeting across the human blood-brain barrier. Biotechnol Bioeng, 96, 381-91.

Burrow, T.A. & N.D. Leslie (2008) Review of the use of idursulfase in the treatment of mucopolysaccharidosis II. Biologics: Targets & Therapy, 2, 311-320.

Muenzer, J. (2011) Overview of the mucopolysaccharidoses. Rheumatology, 50, v4-v12.

Voznyi, Y.V., J.L. Keulemans & O.P. van Diggelen (2001) A fluorimetric enzyme assay for the diagnosis of MPS II (Hunter disease). J Inherit Metab Dis, 24, 675-80.

Wraith, J.E., M. Scarpa, M. Beck, O.A. Bodamer, L.De Meirleir, N. Guffon, A. Meldgaard Lund, G. Malm, A.T. Van der Ploeg & J. Zeman (2008) Mucopolysaccharidosis type II (Hunter syndrome): a clinical review and recommendations for treatment in the era of enzyme replacement therapy. European Journal of Pediatrics, 167, 267-277.

Zhou, Q., J. Kyazike, T. Edmunds & E. Higgins (2002) Mannose 6-phosphate quantitation in glycoproteins using high-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection. Anal Biochem, 306, 163-70.

Бифункциональное антитело, соединенное с последовательностью фермента идуронат-2-сульфатазы посредством глицин-серинового мостика, обладающее высокой аффинностью к инсулиновому рецептору человека, при этом легкая цепь антитела представлена аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1, тяжелая цепь, соединенная с аминокислотной последовательностью идуронат-2-сульфатазы посредством глицин-серинового аминокислотного мостика, представлена аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2.