Новое производное аналога инсулина

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к новому производному аналога инсулина, и может быть использовано в медицине. Изобретение позволяет получить производное инсулина с длительным фармакокинетическим профилем, что позволяет его использовать в лечении пациентов, страдающих от диабета, с применением более редких инъекций лекарственного препарата на основе такого производного. 9 н. и 1 з.п. ф-лы, 17 табл., 10 пр.

 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к новому производному аналога человеческого инсулина, полезного для лечения диабета.

Предпосылки создания изобретения

Инсулин представляет собой полипептидный гормон, секретируемый бета-клетками поджелудочной железы. Инсулин состоит из двух полипептидных цепей, обозначенных как цепи А и В, которые связаны между собой двумя дисульфидными мостиками между цепями. В человеческом, свином и бычьем инсулине цепи А и В содержат 21 и 30 аминокислотных остатков соответственно. Тем не менее, от вида к виду существуют вариации среди аминокислотных остатков, присутствующих в различных позициях в этих двух цепях. Широкое применение генной инженерии сделало возможным получение аналогов природных инсулинов путем замены, удаления и добавления одного или более аминокислотных остатков. Инсулин используется для лечения сахарного диабета и заболеваний, связанных с ним или являющихся его результатом.

В течение десятилетий были разработаны и поставлены на рынок препараты инсулина с разной продолжительностью действия, и общими примерами таких препаратов являются препараты инсулина длительного действия, препараты инсулина среднего действия и препараты инсулина быстрого действия. Многие пациенты принимают 2-4 инъекции в день каждую неделю, каждый месяц и каждый год, возможно, в течение многих десятилетий. До настоящего времени не было одобрено базальных продуктов инсулина для введения реже, чем ежедневная подкожная инъекция. Дискомфорт большого количества ежедневных инъекций может, например, быть уменьшен благодаря использованию производных инсулина, имеющих чрезвычайно большую продолжительность действия.

В различных патентных заявках, включая WO 2010/049488 и WO 2011/161125, упоминается возможность введения производных инсулина с большими интервалами. WO 2009/115469 относится к некоторым ацилированным, стабилизированным по отношению к протеазам инсулинам, где по меньшей мере одна гидрофобная аминокислота замещена гидрофильными аминокислотами.

Было бы очень желательно для пациентов, страдающих диабетом, чтобы были доступны базальные препараты инсулина для введения примерно один раз в неделю.

Задачи изобретения

Задачей настоящего изобретения является преодоление или частичное устранение по меньшей мере одного из недостатков предшествующего уровня техники или обеспечение полезной альтернативы.

Другой аспект настоящего изобретения касается предложения производных инсулина с длительными фармакокинетическими (далее ФК) профилями, например, такими, чтобы подкожное введение раз в неделю или реже было удовлетворительным лечением пациента с диабетом, нуждающегося в лечении базальным инсулином.

Другой аспект настоящего изобретения касается предложения производных инсулина с длительными ФК профилями, например более длительными, чем ФК профиль человеческого инсулина после подкожного введения. Для этой цели ФК профиль может быть определен, как описано в примерах 5 и 6 данной заявки.

Другой аспект настоящего изобретения касается предложения производных инсулина, имеющих высокую растворимость в водной среде, возможно содержащей цинк, например, растворимость которых выше, чем растворимость человеческого инсулина. Для этой цели растворимость может быть определена, как описано в примере 7 данной заявки.

Другой аспект настоящего изобретения касается предложения производных инсулина, которые растворимы в водной среде, содержащей цинк, например по меньшей мере 5 ионов цинка на гексамер инсулина при измерении после хранения по меньшей мере в течение 4 недель после приготовления при температуре 37°С или ниже. Для этой цели растворимость, например, можно определить, как описано в примере 7 данной заявки.

Другой аспект настоящего изобретения касается предложения производных инсулина, которые растворимы в водной среде, содержащей цинк, например, по меньшей мере, 5 ионов цинка на гексамер инсулина, при измерении в течение от 24 до 48 часов после приготовления. В связи с этим, растворимость может быть определена, как описано в примере 7 данной заявки.

Другой аспект настоящего изобретения касается предложения производных инсулина, имеющих хорошую стабильность по отношению к ферментам, например к протеолитическим ферментам, присутствующим в желудке человека, например, к пепсину, химотрипсину и карбоксипептидазе А. Для этой цели устойчивость к действию ферментов может быть определена, как описано в примере 1 из WO 2008/034881.

Другой аспект настоящего изобретения касается предложения производных инсулина, обладающих хорошей стабильностью, особенно химической и физической стабильностью при хранении, например при хранении при 5°С и при 30°С в течение, например, 2 лет и 2 недель, соответственно. Для этой цели химическая стабильность может быть определена, как описано в примерах 9 и 10 данной заявки, и физическая стабильность может быть определена, как описано в примерах 9 и 10 данной заявки.

Другой аспект настоящего изобретения касается предложения производных инсулина, которые эффективно могут быть введены перорально, например, один раз в день, пациентам с диабетом. Кроме того или в качестве альтернативы, настоящее изобретение касается предложения производных инсулина, которые обладают высокой биодоступностью при пероральном введении.

Другой аспект настоящего изобретения касается предложения производных инсулина, имеющих сниженные ежедневные флуктуации, например, различия между концентрациями в плазме (C_max и C_min) после введения, например, один раз в неделю подкожно.

Другой аспект настоящего изобретения касается предложения производных инсулина, имеющих пониженное влияние на изменение биологической доступности после перорального введения изо дня в день.

Другой аспект настоящего изобретения касается предложения производных инсулина, имеющих высокую активность, т.е. вызывающих большой отклик при низкой концентрации лекарственного средства (активность препарата выражена в единицах количества, необходимого для создания эффекта заданной интенсивности).

Другой аспект настоящего изобретения касается предложения производных инсулина, которые очень хорошо связываются с рецептором инсулина. В связи с этим афинность рецептора к инсулину может быть определена, как описано в примере 2 данной заявки.

Другой аспект настоящего изобретения касается предложения производных инсулина, имеющих низкую афинность к рецептору инсулина. В связи с этим афинность к рецептору инсулина может быть определена, как описано в примере 2 данной заявки.

Определения

Термин "диабет" или "сахарный диабет" включает в себя диабет 1 типа, диабет 2 типа, гестационный диабет (во время беременности) и другие состояния, которые вызывают гипергликемию. Этот термин используется для обозначения нарушения обмена веществ, в котором поджелудочная железа вырабатывает недостаточное количество инсулина или в котором клетки организма не могут надлежащим образом реагировать на инсулин, таким образом, не давая клеткам поглощать глюкозу. В результате, глюкоза накапливается в крови.

Сахарный диабет 1 типа, называемый также инсулинзависимым сахарным диабетом (ИЗСД) и юношеским диабетом, вызывается разрушением В-клеток, как правило, приводящим к абсолютной инсулиновой недостаточности. Диабет 2 типа, также известный как инсулиннезависимый сахарный диабет (ИНСД) и взрослый диабет, связан с преимущественной резистентностью к инсулину и, таким образом, с относительным дефицитом инсулина и/или с преимущественным секреторным дефектом инсулина с резистентностью к инсулину.

В данной заявке названия инсулинов даны в соответствии со следующими принципами: названия даны в виде мутаций и модификаций (ацилирования) по отношению к человеческому инсулину. Для названия ацильной части наименование дается в соответствии с номенклатурой IUPAC, а в других случаях - в соответствии с номенклатурой пептидов. Например, ацильную часть:

можно, например, назвать "эйкозандиоил-γGlu-OEG-OEG", "эйкозандиоил-γGlu-2xOEG" или "эйкозандиоил-gGlu-2xOEG", или "19-карбоксинонадеканоил-γGlu-OEG-OEG", где OEG - сокращение для аминокислоты NH₂(CH₂)₂O(СН₂)₂ОСН₂СО₂Н, [2-(2-аминоэтокси)этокси]уксусной кислоты, и γGlu (и gGlu) - сокращение для аминокислоты гамма-глутаминовой кислоты в L-конфигурации. Альтернативно, ацильную часть можно назвать согласно номенклатуре IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC). Согласно этой номенклатуре в изобретении указанной ацильной части присвоено следующее название: [2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]-этокси]ацетил].

Например, инсулин Примера 1 (имеющий приведенную ниже последовательность/структуру) имеет название "А14Е,В16Е,В25Н,B29K-(N^εЭйкозандиоил-gGlu-2xOEG),дезВ30 человеческий инсулин", где показано, что аминокислота в положении А14, Y в человеческом инсулине, заменена на Е, аминокислота в положении В16, Y в человеческом инсулине, заменена на Е, аминокислота в положении В25, F в человеческом инсулине, заменена на Н, аминокислота в положении В29, K в человеческом инсулине, изменена путем ацилирования на ε-атоме азота в остатке лизина В29, обозначенном N^ε, остатком эйкозандиоил-gGlu-2xOEG, и аминокислота в положении В30, Т в человеческом инсулине, удалена.

Звездочки в формуле ниже показывают, что этот остаток является другим (т.е. является мутантным) по сравнению с человеческим инсулином.

Альтернативно, инсулины по данному изобретению могут быть названы в соответствии с номенклатурой IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC). Согласно этой номенклатуре инсулину Примера 1 (т.е. соединению 1) присваивается следующее название: N{эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинона-деканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[GluA14,GluB16,HisB25],дез-ThrB30-инсулин (человеческий).

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к производному аналога инсулина, т.е. к А14Е,В16Е,В25Н,B29K(N(эпс)эйкозандиоил-gGlu-2xOEG),дезВ30 человеческому инсулину (соединению 1).

Подробное описание изобретения

Неожиданно было обнаружено, что А14Е,В16Е,В25Н,29K(N(эпс)эйкозандиоил-gGlu-2xOEG),дезB30 человеческий инсулин решает вышеуказанные задачи в достаточной степени. Например, лечение путем подкожного введения этого соединения 1 раз в неделю или реже будет удовлетворительным лечением пациента с диабетом, нуждающегося в лечении базальным инсулином. Кроме того, соединение 1 имеет высокую растворимость в водной среде, возможно содержащей цинк. В одном аспекте соединение 1 имеет растворимость, которая выше растворимости человеческого инсулина.

В одном из аспектов соединение 1 является растворимым в водной среде, содержащей цинк, такой как содержащей по меньшей мере 5 ионов цинка на гексамер инсулина, по меньшей мере 6 ионов цинка на гексамер инсулина, по меньшей мере 7 ионов цинка на гексамер инсулина, по меньшей мере 8 ионов цинка на гексамер инсулина или по меньшей мере 9 ионов цинка на гексамер инсулина, в котором растворимость измеряют после хранения в течение по меньшей мере 4 недель при 37°С или ниже после приготовления.

В одном аспекте настоящего изобретения соединение 1 является растворимым в водной среде, содержащей цинк, такой как по меньшей мере 5 ионов цинка на гексамер инсулина, по меньшей мере 6 ионов цинка на гексамер инсулина, по меньшей мере 7 ионов цинка на гексамер инсулина, по меньшей мере 8 цинка ионов на гексамер инсулина, по меньшей мере 9 ионов цинка на гексамер инсулина, по меньшей мере 10 ионов цинка на гексамер инсулина, по меньшей мере 11 ионов цинка на гексамер инсулина или по меньшей мере 12 ионов цинка на гексамер инсулина, в котором растворимость измеряют в течение от 24 до 48 часов после приготовления.

В одном из аспектов изобретения растворимость определяют, как описано в примере 7 данной заявки.

Фармацевтические композиции, содержащие соединение 1, могут быть получены способом, который известен сам по себе, то есть с использованием эксципиентов, обычно используемых в подобных композициях инсулина.

Инъекционные фармацевтические композиции, содержащие соединение 1, могут быть получены с использованием традиционных методик фармацевтической промышленности, которые предусматривают растворение и смешивание ингредиентов, подходящих для получения желаемого конечного продукта. Таким образом, в соответствии с одной методикой соединение 1 растворяют в количестве воды, которое несколько меньше, чем конечный объем фармацевтической композиции, предназначенной для получения. Изотонический агент, консервант и буфер добавляют по мере необходимости, а значение pH раствора доводят, при необходимости, с использованием кислоты, например соляной кислоты, или основания, например водного раствора гидроксида натрия, в случае необходимости. И, наконец, объем раствора доводят водой с получением желаемой концентрации ингредиентов.

Более конкретно, препарат инсулина данного изобретения, например раствор, может быть получен путем растворения соединения 1 в водной среде при слабо кислых условиях. Водную среду делают, например, изотонической путем добавления агента, регулирующего тоничность. Кроме того, водная среда может содержать, например, буферы, консерванты и ионы цинка. Значение pH раствора доводят в направлении нейтральности, не доводя слишком близко к изоэлектрической точке соединения данного изобретения, для того, чтобы избежать возможного осаждения. Значение pH конечного препарата инсулина зависит от концентрации ионов цинка, а также от концентрации соединения согласно настоящему изобретению. Препарат инсулина изготавливают стерильным, например, путем стерильной фильтрации.

Фармацевтическая композиция может содержать один или более эксципиентов.

Термин "эксципиент" в широком смысле относится к любому компоненту, кроме активного терапевтического ингредиента (ингредиентов). Эксципиент может быть инертным веществом, неактивным веществом и/или не терапевтически активным веществом.

Эксципиент может служить различным целям в зависимости от фармацевтической композиции, например, в качестве носителя, наполнителя, разбавителя, вспомогательного вещества для таблетки, и/или для улучшения введения и/или абсорбции активного вещества. Примеры эксципиентов включают, но не ограничены этим, разбавители, буферы, консерванты, агенты, регулирующие тоничность (также известные как агенты тоничности или изотонические агенты), хелатирующие агенты, поверхностно-активные вещества, ингибиторы протеазы, смачивающие агенты, эмульгаторы, антиоксиданты, объемообразующие агенты, ионы металлов, масляные носители, белки и/или цвиттерион, и стабилизаторы.

Фармацевтическая композиция фармацевтически активных ингредиентов с различными эксципиентами известна в данной области, см., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (например, издание 19 (1995) и любые более поздние издания).

Композиции инсулина вводят пациентам известным способом, например, в соответствии с общим знанием пациента в сочетании с общим знанием врача. Настоящее изобретение лучше всего использовать для удобства пациента. Таким образом, конкретные интервалы введения будут изучены для каждого пациента, где дозы вводят реже, чем ежедневно. Окончательный способ применения, таким образом, зависит как от возможностей продукта и от предрасположенности и предпочтений пациента. Это связано с тем, что эффект от любого продукта инсулина зависит от потребности в инсулине отдельного пациента и от чувствительности к фармакодинамическому действию указанного инсулина и, наконец, также от предпочтений пациента в данной ситуации. Эти условия могут меняться с течением времени, как с точки зрения более длительных периодов (лет), так и изо дня в день. Оптимальная доза для любого пациента будет зависеть от множества факторов, включая возраст, массу тела, физическую активность и диету пациента, от возможной комбинации с другими препаратами и от тяжести состояния, подлежащего лечению. Рекомендуется, чтобы схема приема лекарственного средства определялась для каждого конкретного пациента специалистами в данной области техники аналогичным образом, как и для известных инсулиновых композиций, тем не менее, принимая во внимание идеи настоящего изобретения, касающиеся интервалов дозировки.

Для удобства пациентов предполагается, что они предпочитают, чтобы временной интервал (промежуток времени) от введения соединения 1 до следующего введения соединения 1 имел ту же продолжительность или приблизительно ту же продолжительность, которая рассчитывается количеством дней. Можно даже ожидать, что пациенты предпочтут, чтобы введение соединения 1 происходило один раз в неделю, то есть в тот же день недели, например, каждое воскресенье. Это будет введение соединения 1 каждый 7 день и не чаще в среднем в расчете на период времени, составляющий 1 месяц, 6 месяцев или 1 год. Для некоторых пациентов может быть желательным введение соединения 1 каждый 6 день или приблизительно каждый 6 день и не чаще в среднем в расчете на период времени, составляющий 1 месяц, 6 месяцев или 1 год. Для других пациентов может быть желательным введение соединения 1 каждый 5 день или приблизительно каждый 5 день и не чаще в среднем в расчете на период времени, составляющий 1 месяц, 6 месяцев или 1 год. Для других пациентов может быть желательным введение соединения 1 каждый 4 день или приблизительно каждый 4 день и не чаще в среднем в расчете на период времени, составляющий 1 месяц, 6 месяцев или 1 год. Даже другие пациенты могут считать предпочтительным введение соединения 1 дважды в неделю, например, с интервалом приблизительно от 3 до 4 дней между каждым введением в среднем в расчете на период времени, составляющий 1 месяц, 6 месяцев или 1 год. Для некоторых пациентов может быть желательным введение соединения 1 каждый 3 день или приблизительно каждый 3 день и не чаще в среднем в расчете на период времени, составляющий 1 месяц, 6 месяцев или 1 год. Для некоторых пациентов может быть желательным введение соединения 1 каждый 2 день или приблизительно каждый 2 день и не чаще в среднем в расчете на период времени, составляющий 1 месяц, 6 месяцев или 1 год. Для некоторых пациентов может быть желательным введение соединения 1 каждый 8 день или приблизительно каждый 8 день и не чаще в среднем в расчете на период времени, составляющий 1 месяц, 6 месяцев или 1 год. Даже другие пациенты могут не вводить соединение 1 с временным интервалом точно такой же длительности (в днях), неделя за неделей, месяц за месяцем или год за годом. Некоторые пациенты могут вводить соединение 1 где-то в интервале времени от каждого 6 дня до каждого 8 дня в среднем в расчете на период времени, составляющий 1 месяц, 6 месяцев или 1 год и не чаще. Другие пациенты могут вводить соединение 1 где-то в интервале времени от каждого 5 дня до каждого 7 дня в среднем в расчете на период времени, составляющий 1 месяц, 6 месяцев или 1 год и не чаще. Даже другие пациенты могут вводить соединение 1 где-то в интервале времени от каждого 4 дня до каждого 8 дня в среднем в расчете на период времени, составляющий 1 месяц, 6 месяцев или 1 год и не чаще. Перечисленные интервалы времени следует понимать как средние временные интервалы в течение определенного периода времени, скажем, недель, месяцев или лет. Здесь предполагается, что термин "день" охватывает 24 часа (то есть день и ночь), и для облегчения, количество часов, которое не делится на 24, округляется до целого числа дней. Следовательно, например, 30 часов соответствует 1 дню и 40 часов соответствует 2 дням. Упомянутое выше введение является парентеральным.

Пациенты могут иметь ежедневную потребность в базальном инсулине более приблизительно 0,2 МЕ/кг массы тела в день и менее приблизительно 1 МЕ/кг массы тела в день и, кроме того, пациенты могут иметь общую ежедневную потребность в инсулине (то есть, базальный плюс прандиальный) более приблизительно 1 МЕ/кг массы тела в день. Тем не менее, эти диапазоны могут значительно отличаться от пациента к пациенту и для некоторых пациентов могут быть вне указанных здесь диапазонов.

Заболевания и состояния, которые являются главными целями данного изобретения, представляют собой сахарный диабет (1 или 2 типа) или другие состояния, характеризующиеся гипергликемией, а также метаболические заболевания и состояния в целом, где метаболические эффекты инсулина имеют клиническую значимость или представляют интерес, такие как преддиабет, нарушенная толерантность к глюкозе, метаболический синдром, ожирение, кахексия, потеря/гибель бета-клеток in vivo, чрезмерный аппетит и воспаление. Известно или предполагается, что все эти типы состояний получают пользу от стабильного метаболического состояния у субъекта, который имеет такое заболевание или состояние. Во всяком случае, любой терапевтический режим, в котором включено введение инсулина, может быть изменен путем реализации представленных здесь указаний, а это означает, что такие методы терапии будут включать в себя введение инсулинов пролонгированного профиля действия согласно представленным здесь указаниям.

Для осуществления этого изобретения соединение 1 можно вводить парентерально пациентам, нуждающимся в таком лечении. Парентеральное введение может быть осуществлено путем подкожной, внутримышечной или внутривенной инъекции с помощью шприца, возможно шприца-ручки. В качестве альтернативы, парентеральное введение может быть осуществлено с помощью инфузионного насоса. Другими вариантами введения являются: введение композиции инсулина перорально, интраназально или пульмонарно, предпочтительно в виде фармацевтических композиций, порошков или жидкостей, специально предназначенных для достижения поставленной цели.

Альтернативно, с целью осуществления этого изобретения соединение 1 можно вводить перорально пациентам, нуждающимся в таком лечении. Пероральное введение может быть осуществлено путем перорального введения твердых, полутвердых или жидких фармацевтических композиций.

Варианты осуществления способа согласно настоящему изобретению включают те, в которых введение соединения 1 дополняется более частым введением быстродействующего природного инсулина, аналога инсулина или производного инсулина и/или введением неинсулинового противодиабетического лекарственного средства. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение соединения 1 дополняют введением неинсулинового противодиабетического лекарственного средства, такого как метформин.

Предпочтительные признаки изобретения

Чтобы подвести итог и дополнить сказанное выше, признаки и положения настоящего изобретения заключаются в следующем:

1. А14Е,В16Е,В25Н,B29K(N(эпс)эйкозандиоил-gGlu-2xOEG),дезВ30 человеческий инсулин (Соединение 1).

2. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение 1.

3. Соединение 1 для применения в качестве лекарственного средства.

4. Соединение 1 для применения для получения фармацевтической композиции для лечения или профилактики диабета.

5. Соединение 1 для применения для получения фармацевтической композиции для лечения или профилактики диабета 1 типа и/или 2 типа.

6. Соединение 1 для применения при лечении диабета, где соединение вводят одному и тому же пациенту каждый 2 день или менее часто в среднем в течение периода времени, составляющего по меньшей мере 1 месяц, 6 месяцев или 1 год, причем это соединение не вводят более часто одному и тому же пациенту.

7. Соединение 1 для применения при лечении диабета, где соединение вводят одному и тому же пациенту каждый 3 день или менее часто в среднем в течение периода времени, составляющего по меньшей мере 1 месяц, 6 месяцев или 1 год, причем это соединение не вводят более часто одному и тому же пациенту.

8. Соединение 1 для применения при лечении диабета, где соединение вводят дважды в неделю или менее часто в среднем в течение периода времени, составляющего по меньшей мере 1 месяц, 6 месяцев или 1 год, причем это соединение не вводят более часто одному и тому же пациенту.

9. Соединение 1 для применения при лечении диабета, где соединение вводят одному и тому же пациенту каждый 4 день или менее часто в среднем в течение периода времени, составляющего по меньшей мере 1 месяц, 6 месяцев или 1 год, причем это соединение не вводят более часто одному и тому же пациенту

10. Соединение 1 для применения при лечении диабета, где соединение вводят одному и тому же пациенту каждый 5 день или менее часто в среднем в течение периода времени, составляющего по меньшей мере 1 месяц, 6 месяцев или 1 год, причем это соединение не вводят более часто одному и тому же пациенту.

11. Соединение 1 для применения при лечении диабета, где соединение вводят одному и тому же пациенту каждый 6 день или менее часто в среднем в течение периода времени, составляющего по меньшей мере 1 месяц, 6 месяцев или 1 год, причем это соединение не вводят более часто одному и тому же пациенту.

12. Соединение 1 для применения при лечении диабета, где соединение вводят одному и тому же пациенту один раз в неделю или менее часто в среднем в течение периода времени, составляющего по меньшей мере 1 месяц, 6 месяцев или 1 год, причем это соединение не вводят более часто одному и тому же пациенту.

13. Соединение 1 для применения при лечении диабета, где соединение вводят каждый 8 день или менее часто.

14. Соединение 1 для применения при лечении диабета, где соединение вводят каждый 9 день или менее часто.

15. Соединение 1 для применения при лечении диабета, где соединение вводят каждый 10 день или менее часто.

16. Соединение 1 для применения при лечении диабета, где соединение вводят каждый 11 день или менее часто.

17. Соединение 1 для применения при лечении диабета, где соединение вводят каждый 12 день или менее часто.

18. Соединение 1 для применения при лечении диабета, где соединение вводят каждый 14 день или менее часто.

19. Соединение 1 для применения при лечении диабета, где соединение вводят каждый 21 день или менее часто.

20. Соединение 1 согласно любому из пунктов с 6 по 19, где текущее или повторное лечение длится в течение более 1 месяца.

21. Соединение 1 согласно любому из пунктов с 6 по 19, где текущее или повторное лечение длится в течение более 2 месяцев.

22. Соединение 1 согласно любому из пунктов с 6 по 19, где текущее или повторное лечение длится в течение более 3 месяцев.

23. Соединение 1 согласно любому из пунктов с 6 по 19, где текущее или повторное лечение длится в течение более 1 года (одного года).

24. Соединение 1 согласно любому из пунктов с 2 по 23, где соединение вводят парентерально, предпочтительно подкожно, внутримышечно или внутривенно.

25. Соединение 1 согласно любому из пунктов с 2 по 23, где соединение вводят парентерально.

26. Способ лечения или профилактики диабета, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения 1.

27. Способ согласно пункту 26, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения 1 одному и тому же пациенту каждый 2 день или менее часто в среднем в течение периода времени, составляющего по меньшей мере 1 месяц, 6 месяцев или 1 год, причем это соединение не вводят более часто одному и тому же пациенту.

28. Способ согласно пункту 26, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения 1 одному и тому же пациенту каждый 3 день или менее часто в среднем в течение периода времени, составляющего по меньшей мере 1 месяц, 6 месяцев или 1 год, причем это соединение не вводят более часто одному и тому же пациенту.

29. Способ согласно пункту 26, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения 1 одному и тому же пациенту дважды в неделю или менее часто в среднем в течение периода времени, составляющего по меньшей мере 1 месяц, 6 месяцев или 1 год, причем это соединение не вводят более часто одному и тому же пациенту.

30. Способ согласно пункту 26, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения 1 одному и тому же пациенту каждый 4 день или менее часто в среднем в течение периода времени, составляющего по меньшей мере 1 месяц, 6 месяцев или 1 год, причем это соединение не вводят более часто одному и тому же пациенту.

31. Способ согласно пункту 26, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения 1 одному и тому же пациенту каждый 5 день или менее часто в среднем в течение периода времени, составляющего по меньшей мере 1 месяц, 6 месяцев или 1 год, причем это соединение не вводят более часто одному и тому же пациенту.

32. Способ согласно пункту 26, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения 1 одному и тому же пациенту каждый 6 день или менее часто в среднем в течение периода времени, составляющего по меньшей мере 1 месяц, 6 месяцев или 1 год, причем это соединение не вводят более часто одному и тому же пациенту.

33. Способ согласно пункту 26, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения 1 одному и тому же пациенту один раз в неделю или менее часто в среднем в течение периода времени, составляющего по меньшей мере 1 месяц, 6 месяцев или 1 год, причем это соединение не вводят более часто одному и тому же пациенту.

34. Способ согласно пункту 26, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения 1 одному и тому же пациенту каждый 8 день или менее часто.

35. Способ согласно пункту 26, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения 1 одному и тому же пациенту каждый 9 день или менее часто.

36. Способ согласно пункту 26, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения 1 одному и тому же пациенту каждый 10 день или менее часто.

37. Способ согласно пункту 26, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения 1 одному и тому же пациенту каждый 11 день или менее часто.

38. Способ согласно пункту 26, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения 1 одному и тому же пациенту каждый 12 день или менее часто.

39. Способ согласно пункту 26, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения 1 одному и тому же пациенту каждый 14 день или менее часто.

40. Способ согласно пункту 26, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения 1 одному и тому же пациенту каждый 21 день или менее часто.

41. Способ согласно пункту 26, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения 1 одному и тому же пациенту, где текущее или повторное лечение диабета соединением 1 длится в течение более 1 месяца.

42. Способ согласно пункту 26, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения 1 одному и тому же пациенту, где текущее или повторное лечение диабета соединением 1 длится в течение более 2 месяцев.

43. Способ согласно пункту 26, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения 1 одному и тому же пациенту, где текущее или повторное лечение диабета соединением 1 длится в течение более 3 месяцев.

44. Способ согласно пункту 26, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения 1 одному и тому же пациенту, где текущее или повторное лечение диабета соединением 1 длится в течение более 1 года (одного года).

45. Способ согласно пункту 26, включающий парентеральное, предпочтительно подкожное, внутримышечное или внутривенное, введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения 1 одному и тому же пациенту.

46. Способ согласно пункту 26, включающий пероральное введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения 1 одному и тому же пациенту.

47. Водный раствор, содержащий соединение 1.

48. Водный раствор, содержащий соединение 1 и по меньшей мере 5 ионов цинка на гексамер инсулина.

49. Водный раствор, содержащий соединение 1 и по меньшей мере 6 ионов цинка на гексамер инсулина.

50. Водный раствор, содержащий соединение 1 и по меньшей мере 7 ионов цинка на гексамер инсулина.

51. Водный раствор, содержащий соединение 1 и по меньшей мере 8 ионов цинка на гексамер инсулина.

52. Водный раствор, содержащий соединение 1 и по меньшей мере 9 ионов цинка на гексамер инсулина.

53. Водный раствор, содержащий соединение 1 и по меньшей мере 10 ионов цинка на гексамер инсулина.

54. Водный раствор, содержащий соединение 1 и по меньшей мере 11 ионов цинка на гексамер инсулина.

55. Водный раствор, содержащий соединение 1 и по меньшей мере 12 ионов цинка на гексамер инсулина.

56. Водный раствор согласно любому из пунктов с 47 по 55, где pH находится в диапазоне от 7 до 8.

57. Водный раствор согласно любому из пунктов с 47 по 55, где pH составляет приблизительно 7,4.

58. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение 1 и один или более эксципиентов.

59. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение 1 и один или более эксципиентов, выбранных из группы, состоящей из разбавителей, буферов, консервантов, агентов, регулирующих тоничность, хелатирующих агентов, поверхностно-активных веществ, ингибиторов протеазы, смачивающих агентов, эмульгаторов, антиоксидантов, объемообразующих агентов, ионов металлов, масляных носителей, белков и/или цвиттериона и стабилизаторов.

60. Фармацевтическая композиция согласно пункту 59, содержащая по меньшей мере 4,5 ионов цинка на гексамер инсулина.

61. Фармацевтическая композиция согласно пункту 59, содержащая по меньшей мере 5 ионов цинка на гексамер инсулина.

62. Фармацевтическая композиция согласно пункту 59, содержащая по меньшей мере 6 ионов цинка на гексамер инсулина.

63. Фармацевтическая композиция согласно пункту 59, содержащая по меньшей мере 7 ионов цинка на гексамер инсулина.

64. Фармацевтическая композиция согласно пункту 59, содержащая по меньшей мере 8 ионов цинка на гексамер инсулина.

65. Фармацевтическая композиция согласно пункту 59, содержащая по меньшей мере 9 ионов цинка на гексамер инсулина.

66. Фармацевтическая композиция согласно пункту 59, содержащая по меньшей мере 10 ионов цинка на гексамер инсулина.

67. Фармацевтическая композиция согласно пункту 59, содержащая по меньшей мере 11 ионов цинка на гексамер инсулина.

68. Фармацевтическая композиция согласно пункту 59, содержащая по меньшей мере 12 ионов цинка на гексамер инсулина.

69. Фармацевтическая композиция согласно любому из пунктов с 59 по 68, где pH находится в диапазоне от 7 до 8.

70. Фармацевтическая композиция согласно любому из пунктов с 59 по 68, где pH составляет приблизительно 7,4.

71. Фармацевтическая композиция согласно любому из пунктов с 59 по 68, которая находится в форме водного раствора.

72. Фармацевтическая композиция согласно любому из пунктов с 59 по 68, которая находится в форме таблетки.

73. Фармацевтическая композиция согласно любому из пунктов с 59 по 68, которая находится в форме твердого, полутвердого или жидкого препарата, содержащегося в капсуле, такой как мягкая или твердая капсула.

74. Любой новый продукт, устройство, способ или применение, характеризуемые признаком и/или пунктом формулы изобретения и/или комбинацией признаков и/или пунктов формулы изобретения, раскрытых в данном документе.

Любое сочетание двух или более вариантов осуществления, описанных в данном документе, находится в пределах объема настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано со ссылкой на следующие примеры, которые не предназначены для любого ограничения заявленного объема настоящего изобретения.

В настоящем документе используются следующие сокращения:

βAla - бета-аланил;	MeCN - ацетонитрил;
Aoc - 8-аминооктановая кислота;	OEG - [2-(2-
tBu - трет-бутил;	аминоэтокси)этокси]этилкарбонил;
DCM - дихлорметан;	Su - сукцинимидил-1-ил-2,5-
DIC - диизопропилкарбодиимид;	диоксопирролидин-1-ил;
DIPEA - DIEA - N,N-диизопропилэтиламин;	OSu - сукцинимидил-1-илокси-2,5-диоксо-пирролидин-1-илокси;
DMF - N,N-диметилформамид	RPC - обращенно-фазная
DMSO - диметилсульфоксид;	хроматография;
EtOAc - этилацетат;	RT - комнатная температура;
Fmoc - 9-флоренилметилокси-	TFA - трифторуксусная кислота;
карбонил;	THF - тетрагидрофуран;
γGlu (gGlu) - гамма-L-глутамил;	TNBS - 2,4,6-
DyGlu (DgGlu) - гамма-D-глутамил;	тринитробензолсульфоновая кислота;
HCl - соляная кислота;	TRIS - трис(гидроксиметил)-
НОАс - уксусная кислота;	аминометан; и
HOBt - 1-гидроксибензотриазол;	TSTU - O-(N-сукцинимидил)-1,1,3,3-
NMP - N-метилпирролидон;	тетраметилуроний тетрафторборат.

Следующие примеры и общие методики относятся к промежуточным соединениям, и конечным продуктам, определенным в настоящем описании и на схемах синтеза. Получение соединения по настоящему изобретению подробно описано с помощью следующих примеров, но описанные химические реакции раскрыты в смысле их общей применимости для получения соединения согласно настоящему изобретению. Иногда описанная реакция может быть не применима для каждого соединения, включенного в раскрытый объем настоящего изобретения. Соединения, для которых это имеет место, могут быть легко определены специалистами в данной области. В этих случаях реакции могут быть успешно выполнены с помощью обычных модификаций, известных специалистам в этой области техники, то есть путем соответствующей защиты мешающих групп, путем замены другими обычными реагентами или путем обычной модификации условий реакции. В качестве альтернативы, другие реакции, описанные здесь, или другие обычные реакции будут применимы для получения соответствующих соединений согласно изобретению. Во всех препаративных методах все исходные материалы известны или могут быть легко получены из известных исходных материалов. Все температуры приведены в градусах Цельсия и, если не указано иное, все части и проценты даны по массе при ссылке на выход, и все части даны по объему при ссылке на растворители и элюенты.

Конструирование векторов, экспрессия в дрожжах, обработка и очистка аналогов инсулина могут быть выполнены с использованием стандартных методик, легко определяемых специалистами в данной области техники. Один неограничивающий пример получения аналогов инсулина был описан ранее (Glendorf Т, Sørensen AR, Nishimura Е, Pettersson I, & Kjeldsen T: Importance of the Solvent-Exposed Residues of the Insulin В Chain α-Helix for Receptor Binding; Biochemistry 2008 47 4743-4751). Если коротко, то мутации вводят в векторы кодирования инсулина с использованием ПЦР с перекрывающимися праймерами. Аналоги инсулина экспрессируют в виде слитых белков, подобных проинсулину, с мини-С-пептидом Ala-Ala-Lys в штамме МТ663 Saccharomyces cerevisiae. Одноцепочечные предшественники ферментативно превращают в двухцепочечные аналоги дезВ30 с использованием эндопротеазы A. lyticus. Полное превращение в двухцепочечный дезВ30 аналог проверяют с помощью MALDI-TOF МС (времяпролетной масс-спектрометрии с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы), а его чистоту измеряют с помощью ОФ-ВЭЖХ (обращенно-фазной ВЭЖХ) при кислых и нейтральных значениях pH.

Соединение согласно изобретению можно очистить с использованием одного или нескольких из следующих способов, которые являются типичными в данной области техники. Эти способы, при необходимости, можно изменять в отношении градиентов, pH, солей, концентрации, потока, колонок и так далее. В зависимости от таких факторов, как профиль примесей, растворимости конкретного производного инсулина и т.п., эти изменения будут понятны и сделаны специалистом в данной области техники.

После кислотной ВЭЖХ или обессоливания соединения выделяют путем лиофилизации чистых фракций. После нейтральной ВЭЖХ или анионообменной хроматографии соединения обессоливают, осаждают при изоэлектрическом pH или очищают с помощью кислотной ВЭЖХ.

Типичные способы очистки

Система ВЭЖХ представляет собой систему Gilson, состоящую из следующих элементов: жидкостный инжектор модели 215, насос модели 322-Н2 и УФ-детектор модели 155. Детектирование, как правило, осуществляют при 210 нм и 280 нм. Система очистки жидкостной хроматографии быстрого разрешения (ЖХБР) Akta (Amersham Biosciences) состоит из следующих элементов: насос модели Р-900, УФ-детектор модели UV-900, детектор pH и проводимости модели pH/С-900, коллектор фракций модели Frac-950. Детектирование в УФ-области, как правило, осуществляют при длине волны 214 нм, 254 нм и 276 нм. ЖХБР-система Explorer Air (Amersham BioGE Health Caresciences) состоит из следующих элементов: насос модели Р-900, УФ-детектор модели UV-900, детектор pH и проводимости модели pH/С-900, коллектор фракций модели Frac-950. Детектирование в УФ-области, как правило, осуществляют при длине волны 214 нм, 254 нм и 276 нм.

Кислотная ВЭЖХ

Колонка: Phenomenex, Gemini, 5 мк, С18, 110 , 250×30 см

Поток: 20 мл/мин

Элюент: А: 0,1% TFA в воде,

В: 0,1%TFA в CH₃CN

Градиент: от 0 до 7,5 мин: 10% В

от 7,5 до 87,5 мин: от 10% В до 60% В

от 87,5 до 92,5 мин: 60% В

от 92,5 до 97,5 мин: от 60% В до 100% В

Нейтральная ВЭЖХ

Колонка: Phenomenex, Gemini, С18, 5 мкм 250×30,00 мм, 110

Поток: 20 мл/мин

Элюент: А: 20% CH₃CN в водном 10 мМ TRIS плюс 15 мМ (NH₄)SO₄ pH равно 7,3

В: 80% CH₃CN, 20% вода

Градиент: от 0 до 7,5 мин: 0% В

от 7,5 до 52,5 мин: от 0% В до 60% В

от 52,5 до 57,5 мин: 60% В

от 57,5 до 58 мин: от 60% В до 100% В

от 58 до 60 мин: 100% В

от 60 до 63 мин: 10% В

Анионообменная хроматография

Колонка: 150 мл (2,6×28 см) Poros 50HQ

Поток: 25 мл/мин

Элюент: А буфер: 15 мМ TRIS, 50 мМ ацетат аммония в 50% этаноле, pH 7,5 (1,6 мСм/см)

В буфер: 15 мМ TRIS, 500 мМ ацетат аммония в 50% этаноле, pH 7,5 (14 мСм/см)

Градиент: от 0 до 80% В за 20 CV (объемов колонки)

Твердофазный синтез

19-((S)-1-карбокси-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-диоксопирролидин-1-илоксикарбонил-метокси)этокси]этилкарбамоил}метокси)этокси]этилкарбамоил}пропилкарбамоил)-нонадекановая кислота;

(Альтернативное название: Эйкозандиоил-gGlu-OEG-OEG-OSu)

19-((S)-1-карбокси-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-диоксопирролидин-1-илоксикарбонил-метокси)этокси]этилкарбамоил}метокси)этокси]этилкарбамоил}пропилкарбамоил)-нонадекановую кислоту можно синтезировать на твердом носителе с использованием способов, хорошо известных специалистам в области твердофазного пептидного синтеза. Этот способ, например, включает в себя присоединение Fmoc-защищенной аминокислоты на полистирол-2-хлортритилхлоридную смолу. Это присоединение может, например, быть осуществлено с использованием свободной N-защищенной аминокислоты в присутствии третичного амина, такого как триэтиламин или N,N-диизопропилэтиламин (см ссылки ниже). С-конец этой аминокислоты (который присоединен к смоле) находится на конце синтетической последовательности, которая соединяется с родительскими инсулинами согласно изобретению. После присоединения Fmoc-аминокислоты к смоле удаляют защитную Fmoc-группу с использованием, например, вторичных аминов, таких как пиперидин или диэтиламин, а затем снова присоединяют другую (или такую же) Fmoc-защищенную аминокислоту и снимают защиту. Синтез последовательности завершают путем присоединения моно-трет-бутил-защищенной жирной (α, ω) двухосновной кислоты, а именно моно-трет-бутилового эфира эйкозандиовой кислоты. Отсоединение соединений от смолы осуществляют с использованием разбавленной кислоты, такой как 0,5-5% TFA/DCM (трифторуксусная кислота в дихлорметане), уксусная кислота (н-р, 10% в DCM или НОАс/трифторэтанол/DCM 1:1:8) или гексафторизопропанол в DCM (см., н-р, "Organic Synthesis on Solid Phase", F.Z. , Wiley-VCH, 2000. ISBN 3-527-29950-5; "Peptides: Chemistry and Biology", N. Sewald & H.-D. Jakubke, Wiley-VCH, 2002, ISBN 3-527-30405-3; и "The Combinatorial Cheemistry Catalog" 1999, Novabiochem AG; и приведенные здесь ссылки). Это гарантирует то, что защита с трет-бутилового эфира, присутствующего в соединении в качестве защитных групп карбоновой кислоты, не снимается. Наконец, С-концевую карбоксигруппу (освобожденную от смолы) активируют, например, в виде N-гидроксисукцинимидного эфира (OSu) и используют либо непосредственно, либо после очистки в качестве связывающего реагента, или после удаления защитной группы для присоединения к А14Е,В16Е,В25Н,дезВ30 человеческому инсулину.

Альтернативно, ацилирующий реагент 19-((S)-1-карбокси-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-диоксопирролидин-1-илоксикарбонилметокси)этокси]этилкарбамоил}метокси)этокси]-этилкарбамоил}пропилкарбамоил)нонадекановую кислоту можно получить с помощью синтеза в растворе:

Моно-трет-бутил-защищенную жирную двухосновную кислоту, моно-трет-бутиловый эфир эйкозандиовой кислоты, активируют, например, в виде OSu-эфира, как описано ниже, или в виде любого другого активированного сложного эфира, известного специалистам в этой области техники, такого как HOBt- или HOAt-эфир. Этот активный сложный эфир соединяют с α-трет-бутиловым эфиром глутаминовой кислоты в подходящем растворителе, таком как THF, DMF, NMP (или в смеси растворителей), в присутствии подходящего основания, такого как DIPEA или триэтиламин. Промежуточный продукт выделяют, например, с использованием способов экстракции или хроматографии. Полученный промежуточный продукт снова подвергают активации (как описано выше) и присоединению к OEG-OEG ([2-(2-{2-[2-(2-амино-этокси)-этокси]-ацетиламино}-этокси)-этокси]-уксусной кислоте), как описано выше, с последующей активацией TSTU с получением ацилирующего реагента 19-((S)-1-карбокси-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-диоксопирролидин-1-илоксикарбонилметокси)этокси]этил-карбамоил}метокси)этокси]этилкарбамоил}пропилкарбамоил)нонадекановой кислоты.

Ацилирующим реагентом, полученным с помощью описанных выше способов, может быть OSu-эфир со снятой трет-бутильной защитной группой после активации. Это может быть сделано путем обработки с помощью TFA OSu-активированного трет-бутил-защищенного ацилирующего реагента. После ацилирования А14Е,В16Е,В25Н,дезВ30 человеческого инсулина полученный незащищенный ацилированный А14Е,В16Е,В25Н,дезВ30 человеческий инсулин получают, например, как описано в примере 1.

Если реагентом, полученным любым из вышеуказанных способов, является не OSu-эфир со снятой трет-бутильной защитной группой после активации, ацилирование А14Е,В16Е,В25Н,дезВ30 человеческого инсулина приводит к получению соответствующего трет-бутил-защищенного ацилированного А14Е,В16Е,В25Н,дезВ30 человеческого инсулина. Чтобы получить незащищенный ацилированный А14Е,В16Е,В25Н,дезВ30 человеческий инсулин, с защищенного инсулина следует снять защиту. Это может быть сделано путем обработки TFA с получением незащищенного ацилированного А14Е,В16Е,В25Н,дезВ30 человеческого инсулина.

В качестве альтернативы, ацилирующий реагент может быть синтезирован в растворе с использованием бензильной защиты карбоксильных групп, как это показано ниже.

19-((S)-1-Карбокси-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-диоксо-пирролидин-1-илоксикарбонил-метокси)этокси]этилкарбамоил}метокси)этокси]этилкарбамоил}пропилкарбамоил)-нонадекановая кислота;

(Альтернативное название: Эйкозандиоил-gGlu-OEG-OEG-OSu)

Способ жидкостной хроматомасс-спектрометрии (ЖХМС)

Для определения массы образца после элюирования из системы ВЭЖХ Waters Alliance НТ использовали масс-спектрометр Waters Micromass ZQ.

Элюенты: А: 0,1% Трифторуксусная кислота в воде

В: 0,1% Трифторуксусная кислота в ацетонитриле

Колонка: Phenomenex, Jupiter С4 50×4,60 мм, id: 5 мкм

Градиент: от 10% до 90% В за 7,5 мин при 1,0 мл/мин

Колонка: Phenomenex, Jupiter 5 мкм С4 300 50×4,60 мм

LC method: 10-90% В 10 мин: А: 0,1% CH₃CN В: CH₃CN:

от 0 до 7,5 мин: от 10 до 90% В

от 7,5 до 8,5 мин: от 90 до 10% В

от 8,5 до 9,5 мин 10% В

Поток: 1 мл/мин

от 9,5 до 10,00 мин 10% В

Поток: 0,1 мл/мин

N-гидроксисукцинимидный эфир трет-бутилового эфира эйкозандиовой кислоты

Моно-трет-бутиловый эфир эйкозандиовой кислоты (5 г, 12,54 ммоль) и TSTU (4,53 г, 15,05 ммоль) смешивали в THF (50 мл), добавляли DIPEA (2,62 мл) и полученную мутную смесь перемешивали при RT в течение 2 ч, затем добавляли DMF (30 мл) с получением прозрачного раствора, который дополнительно перемешивали в течение ночи. Полученную смесь выпаривали почти досуха, осадок перемешивали с холодным ацетонитрилом, что приводило к осаждению осадка. Его фильтровали и сушили в вакууме в течение ночи с получением 6,01 г (97%) N-гидроксисукцинимидного эфира трет-бутилового эфира эйкозандиовой кислоты.

МС (с электрораспылением): m/z: 440 (М-56 (tBu)).

(S)-2-(19-трет-Бутоксикарбонилнонадеканоиламино)пентандиовой кислоты 1-трет-бутиловый эфир

2,5-Диоксо-пирролидин-1-иловый эфир трет-бутилового эфира эйкозандиовой кислоты (6,01 г, 12,124 ммоль) растворяли в THF (150 мл) и смешивали с суспензией H-Glu-OtBu (2,71 г, 13,33 ммоль) в смеси DMF/вода (1/1, 40 мл). В результате получали гелеобразный раствор, который нагревали до получения прозрачного раствора, который перемешивали при комнатной температуре в течение 3-х часов. Затем раствор упаривали, добавляли 100 мл воды и смесь нагревали до 60°С, в результате чего получали раствор, который кристаллизовался при охлаждении. Осадок перекристаллизовывали из ацетонитрила и кристаллы сушили в вакууме.

Выход 6,82 г (96%).

МС (с электрораспылением): m/z 584 (М+1).

5-(2,5-диоксопирролидин-1-иловый) эфир 1-трет-бутилового эфира (S)-2-(19-трет-бутоксикарбонилнонадеканоиламино)пентандиовой кислоты

(S)-2-(19-трет-Бутоксикарбонилнонадеканоиламино)пентандиовой кислоты 1-трет-бутиловый эфир (6,52 г, 11,17 ммоль) растворяли в THF (100 мл), добавляли DIPEA (2,14 мл), затем раствор TSTU (3,70 г, 12,29 ммоль) в ацетонитриле (25 мл). Смесь перемешивали в течение ночи при RT, затем выпаривали с получением коричневатого осадка, который перекристаллизовывали из ацетонитрила. После охлаждения в течение ночи при 5°С образовывался порошок. Его растворяли в THF и сушили с использованием MgSO₄, фильтровали и выпаривали досуха с получением 6,17 г (81%) указанного в заголовке соединения.

МС (с электрораспылением): m/z: 681 (М+1).

19-{(S)-1-трет-Бутоксикарбонил-3-[2-(2-({2-(2-карбоксиметоксиэтокси)этилкарбамоил]-метокси}этокси)этилкарбамоил]пропилкарбамоил}нонадекановой кислоты трет-бутиловый эфир:

(Альтернативное название: ^tBu-Эйкозандиоил-gGlu(O^tBu)-OEG-OEG-ОН)

К раствору 5-(2,5-диоксопирролидин-1-илового) эфира 1-трет-бутилового эфира 2-(19-трет-бутоксикарбонилнонадеканоиламино)-пентандиовой кислоты (2,50 г) и [2-(2-{2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]уксусной кислоты (альтернативное название: H-OEG-OEG-OH) (1,47 г) в этаноле (40 мл) добавляли DIPEA (1,26 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи и затем концентрировали в вакууме. К осадку добавляли водную 0,1Н HCl (150 мл) и этилацетат (200 мл). Слои разделяли, водный слой экстрагировали этилацетатом (100 мл). Объединенные органические слои промывали водой и солевым раствором, сушили (сульфат магния) и концентрировали в вакууме с получением масла, которое кристаллизовалось при стоянии.

Выход 96% (3,1 г). ЖХМС: Теоретическая масса: 874,2. Обнаружено: 874,49.

19-((S)-1-трет-Бутоксикарбонил-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-диоксо-пирролидин-1-илоксикарбонилметокси)этокси]этилкарбамоил}метокси)этокси]этилкарбамоил}-пропилкарбамоил)нонадекановой кислоты трет-бутиловый эфир;

(Альтернативное название: ^tBu-Эйкозандиоил-gGlu(O^tBu)-OEG-OEG-OSu)

К раствору 19-{(S)-1-трет-Бутоксикарбонил-3-[2-(2-{[2-(2-карбоксиметокси-этокси)этилкарбамоил]метокси}этокси)этилкарбамоил]пропилкарбамоил}-нонадекановой кислоты трет-бутилового эфира (3,1 г) в ацетонитриле (50 мл) добавляли TSTU (1,39 г) и DIPEA (0,91 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи и затем концентрировали в вакууме. К остатку добавляли водный раствор 0,1Н HCl (100 мл) и этилацетат (200 мл). Слои разделяли и водный слой экстрагировали этилацетатом (50 мл). Объединенные органические слои промывали водой и солевым раствором, сушили (сульфат магния) и концентрировали в вакууме с получением масла.

Выход 99% (3,4 г). ЖХМС: Теоретическая масса: 971,2 Обнаружено: 971,8.

19-((S)-1-Карбокси-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-диоксо-пирролидин-1-илоксикарбонилметокси)этокси]этилкарбамоил}метокси)этокси]этилкарбамоил}пропилкарбамоил)нонадекановая кислота;

(Альтернативное название: Эйкозандиоил-gGlu-OEG-OEG-OSu)

19-((S)-1-трет-Бутоксикарбонил-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-диоксо-пирролидин-1-илоксикарбонилметокси)-этокси]этилкарбамоил}метокси)этокси]этилкарбамоил}-пропилкарбамоил)нонадекановой кислоты трет-бутиловый эфир (3,4 г) перемешивали в TFA (75 мл) в течение 45 мин и затем концентрировали в вакууме. Остаток концентрировали с толуолом 3 раза с получением твердого вещества. Остаток кристаллизовали в 2-пропаноле и фильтровали с получением белого кристаллического соединения.

Выход 80% (2,4 г). ЖХМС: Теоретическая масса: 859,03 Обнаружено: 859,44.

Для ацилирования остатка лизина в положении В29 (в положении эпсилон) А14Е,В16Е,В25Н,дезВ30 человеческого инсулина предпочтительно проводили ацилирование при щелочном значении pH (н-р, при pH 10, 10,5 или 11). Это проиллюстрировано в примере 1 настоящего документа.

Пример 1

N(Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбокси-нонадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]-этокси]ацетил]-[GluA14,GluB16,HisB25],дез-ThrB30-инсулин (человеческий);

(Альтернативное название: F14E,В16Е,В25Н,B29K(N^εэйкозандиоил-gGlu-2xOEG), дезВ30 человеческий инсулин: Соединение 1)

А14Е,В16Е,В25Н,дезВ30 человеческий инсулин (3,0 г, 0,53 ммоль) растворяли в 150 мМ водного Na₂CO₃ (40 мл) и добавляли 5 мл THF. Значение pH доводили до 11,0 с помощью 1М водного NaOH. При интенсивном перемешивании растворяли 19-((S)-1-карбокси-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-диоксопирролидин-1-илоксикарбонилметокси)этокси]-этилкарбамоил}метокси)этокси]этилкарбамоил}пропилкарбамоил)нонадекановую кислоту (641 мг, 0,75 ммоль, полученную как описано выше) в смеси 1,5 мл THF и 1,5 мл DMF в течение 1 минуты. pH поддерживали на уровне 10,5-11 при добавлении 1Н водного раствора NaOH. Смесь перемешивали в течение одного часа.

Значение pH доводили до 7,5 с помощью 1М HCl и добавляли 50%-ный этанол до объема 500 мл. Значение pH доводили до 7,5. Измеряли электропроводность, которая составила 1,6 мСм/см.

Очистку проводили с помощью анионообменной хроматографии на установке Explorer:

Колонка: 150 мл (2,6×28 см) Poros 50HQ

А буфер: 15 мМ TRIS, 50 мМ ацетат аммония в 50% этаноле, pH 7,5 (1,6 мСм/см)

В буфер: 15 мМ TRIS, 500 мМ ацетат аммония в 50% этаноле, pH 7,5 (14 мСм/см)

Градиент: от 0 до 80% В за 20 CV

Поток: 25 мл/мин.

Раствор продукта, 700 мл, разбавляли 700 мл 50%-ного этанола и очищали еще раз:

Колонка: 150 мл (2,6×28 см) Poros 50HQ

А буфер: 15 мМ TRIS, 50 мМ ацетат аммония в 50% этаноле, pH 7,5 (1,6 мСм/см)

В буфер: 15 мМ TRIS, 500 мМ ацетат аммония в 50% этаноле, pH 7,5 (14 мСм/см)

Градиент: от 0 до 100% В за 12 CV

Поток: 25 мл/мин.

Раствор продукта, 300 мл, разбавляли 300 мл воды и обессоливали на колонке С18:

Колонка: 30×250 мм (Daiso_200_15 мкм_FEFgel304_ODDMS_30×250 мм), объем колонки равен 177 мл

А Буфер: 10% ацетонитрил в воде milli-Q плюс 0,1% TFA

В Буфер: 80% ацетонитрил в воде milli-Q плюс 0,1% TFA

Градиент: от 25 до 80%В за 20 мин.

Поток: 35 мл/мин.

Фракцию продукта лиофилизировали с получением соли трифторуксусной кислоты, которую растворяли в 50 мл воды плюс 10 мл ацетонитрила и доводили pH до 8,0 с помощью 0,5М водного NaOH, и лиофилизировали с получением 1,25 г (36%) указанного в заголовке инсулина.

ЖХМС (с электрораспылением): m/z равно 1593,1 (М+4)/4. Рассчитано: 1594,1.

Пример 2

Афинность к рецептору инсулина

Афинность ацилированных аналогов инсулина согласно данному изобретению к рецептору человеческого инсулина определяют с помощью SPA-анализа (сцинтилляционного анализа сближения) микропланшетного анализа захвата антитела. SPA PVT шарики, связывающие антитела, реактив против мышиных антител (Amersham Biosciences, № по кат. PRNQ0017) смешивают с 25 мл буфера для связывания (100 мМ HEPES, pH 7,8, 100 мМ хлорида натрия, 10 мМ MgSO4, 0,025% Tween-20). Смесь реагентов для одной планшеты Packard Optiplate (Packard No. 6005190) состоит из 2,4 мкл очищенного рекомбинантного рецептора человеческого инсулина (с или без экзона 11), разбавленного 1:5000, количества исходного раствора A14Tyr[¹²⁵I]-человеческого инсулина, соответствующего 5000 импульсов в минуту на 100 мкл смеси реагентов, 12 мкл 1:1000 раствора антител F12, 3 мл SPA-шариков и связывающего буфера до 12 мл. Затем в каждую лунку Packard Optiplate добавляют в общей сложности 100 мкл смеси реагентов и из соответствующих образцов готовят серии разведений производного инсулина в Optiplate. Затем образцы инкубируют в течение 16 часов при осторожном встряхивании. Затем фазы разделяют центрифугированием в течение 1 мин и осуществляют счет радиоактивности планшет в Topcounter. Данные по связыванию аппроксимируют с использованием алгоритма нелинейной регрессии в GraphPad Prism 2.01 (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния) и афинность выражают относительно афинности человеческого инсулина в процентах (%).

Соответствующий анализ также использовали с буфером для связывания, который также содержал 1,5% HSA (человеческого сывороточного альбумина) для имитации физиологических условий.

Пример 3

Гидрофобность производных инсулина согласно изобретению

Гидрофобность производного инсулина определяют посредством ВЭЖХ с обращенной фазой, проведенной при изократических условиях. Время элюции производного инсулина сравнивают со временем элюции человеческого инсулина (обозначенного здесь HI) или другого производного с известной гидрофобностью при тех же самых условиях. Гидрофобность, k'rel, рассчитывают как: k'rel_deriv=((t_deriv-t₀)/(t_ref-t₀))*k'rel_ref. При использовании HI в качестве стандарта: k'rel_ref=k'rel_HI=1. Исключенное время системы ВЭЖХ, t₀, определяют путем введения 5 мкл 0,1 мМ NaNO₃.

Условия разделения:

Колонка: Lichrosorb RP-C18, 5 мкм, 4×250 мм

Буфер А: 0,1 М фосфат натрия pH 7,3, 10 об. % CH₃CN

Буфер В: 50 об. % CH₃CN

Объем введения: 5 мкл

Время прогона: максимум 60 минут

После прогона начального градиента выбирают изократический уровень для прогона производного и стандарта (например, HI), и время элюции производного и стандарта при изократических условиях используют в приведенном выше уравнении для расчета k'rel_derive.

Пример 4

Расщепление производных инсулина с использованием ферментов полости двенадцатиперстной кишки

Расщепление производных инсулина с использованием ферментов полости двенадцатиперстной кишки (полученных фильтрацией содержимого двенадцатиперстной кишки) от крыс SPD. Анализ проводили с использованием робота в 96-луночной планшете (2 мл) с 16 лунками, доступными для производных инсулина и стандартов. Производные инсулина ~15 мкМ инкубировали с ферментами двенадцатиперстной кишки в 100 мМ HEPES, pH равно 7,4 при 37°С, образцы отбирали через 1, 15, 30, 60, 120 и 240 мин, и реакцию гасили добавлением TFA. Интактные аналоги инсулина в каждый момент времени определяли с помощью ОФ-ВЭЖХ. Полупериод расщепления определяли экспоненциальной аппроксимацией данных и нормировали к полупериоду, определенному для стандартных инсулинов, А14Е, В25Н, дезВ30 человеческого инсулина или человеческого инсулина в каждом анализе. Количество добавленных ферментов для расщепления было таким, что полупериод расщепления стандартного инсулина составлял от 60 мин до 180 мин. Результат приведен в виде полупериода расщепления для аналога инсулина в двенадцатиперстной кишке крысы, деленного на полупериод расщепления стандартного инсулина из того же самого эксперимента (относительный показатель расщепления).

Пример 5

Фармакокинетика (РК) у крыс при внутривенном введении

Крысам под наркозом внутривенно (в.в.) вводили аналоги инсулина в разных дозах и измеряли плазматические концентрации тестируемых соединений с использованием иммуноанализов или масс-спектрометрии в определенные интервалы времени в течение 4 часов или более после введения.

Затем рассчитывали фармакокинетические параметры с использованием WinNonLin Professional (Pharsight Inc., Маунтин-Вью, Калифорния, США).

Использовали неголодавших самцов крыс Wistar (Taconic), весящих приблизительно 200 граммов. Измеряли массу тела и затем анестезировали крыс смесью гипнорм/дормикум (каждое соединение разводили по отдельности 1:1 в стерильной воде и затем смешивали; готовили в день эксперимента). Анестезию инициировали 2 мл/кг смеси гипнорм/дормикум п.к. (подкожно) с последующими двумя поддерживающими дозами 1 мл/кг п.к. с интервалами по 30 минут и двумя поддерживающими дозами 1 мл/кг п.к. с интервалами по 45 минут. При необходимости, для того, чтобы поддерживать крыс под легкой анестезией на протяжении всего периода исследования, применяли дополнительную дозу(зы) от 1 до 2 мл/кг. Взвешивание и начальную анестезию проводили в помещении для содержания крыс для того, чтобы избежать стрессового воздействия на животных посредством перевода их из одного помещения в другое.

Пример 6

Фармакокинетичесие (РК) профили у собак при внутривенном введении

Целью данного протокола является получение фармакокинетических (РК) данных из зависимостей концентрации в плазме от времени различных аналогов инсулина после внутривенного введения собакам породы бигль, и расчет соответствующих фармакокинетических параметров для этих аналогов.

Животные имели свободный доступ к водопроводной питьевой воде. Животных взвешивали в каждый день дозирования. Каждое испытуемое вещество давали 3 животным. Принимали во внимание состояние отдельных животных в плане количества и масштабов процедур, которые будут проводиться на каждом животном. Полный профиль концентрации в плазме от времени получали для каждого животного. Во время забора крови собак помещали на стол, и техник-ветеринар, сидящий рядом, удерживал их неподвижно. К этой процедуре приучали в течение периода акклиматизации. Образцы крови по 0,5 мл собирали в пробирки с ЭДТА в соответствии со следующим режимом:

Предварительная доза (-10, 0) и 5, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 300, 480, 600, 720, 960, 1440, 1920, 2880, 4320, 5760, 7200, 8640, 10080 минут.

В течение периодов частого отбора проб образцы крови брали из катетеров Venflon в головной вене, которую оставляли открытой с физиологическим раствором и гепарином. Остальные образцы крови брали из яремной вены.

Образцы крови держали на льду в течение максимум 20 минут перед центрифугированием при 4°С в течение 4 минут при 1300×g.

Плазму немедленно переносили в две микропробирки с 80 мкл плазмы в каждой от каждого образца крови и помещали в соответствии со схемой штатива. Плазму хранили при -20°С до проведения анализа.

Профили концентрации в плазме относительно времени анализировали с помощью фармакокинетического анализа без компартментализации с использованием WinNonlin Professional 5.2 (Pharsight Inc., Маунтин-Вью, Калифорния, США).

Расчеты проводили с использованием индивидуальных значений концентрации в зависимости от времени от каждого животного.

Пример 7

Начальная растворимость соединения 1 и соединения сравнения А в присутствии цинка

Соединение 1 и соединение сравнения А (т.е. N{эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]-ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[GluA14,HisB16,HisB25],дез-ThrB30-инсулин (человеческий); Альтернативное название: А14Е,В16Н,В25Н,B29K(N^εэйкозандиоил-gGlu-2xOEG),дезВ30 человеческий инсулин, соответственно, растворяли в воде milli-Q при pH приблизительно 8. Добавляли фенол, крезол, ацетат цинка (Zn), хлорид натрия и глицерин в указанном порядке, в результате получали конечную фармацевтическую композицию, содержащую: от 4,2 до 5 мМ инсулина, 1,6% глицерина, 25 мМ фенола, 25 Мм крезола, pH 7,4 и концентрацию цинка и хлорида натрия, указанную в таблице ниже. Фармацевтические композиции хранили в течение 24 ч при 22°С и центрифугировали при 15000×g в течение 15 минут. 100 мкл супернатанта переносили во флаконы для ВЭЖХ и определяли концентрацию с использованием кислой гель-фильтрации, как описано в Eur. Pharm. NovoRapid. Количество растворимого инсулина определяли в процентах от начальной концентрации. Точность измерений составляла плюс/минус 2%.

Вывод

Соединение сравнения в композиции без NaCl является растворимым при условиях теста в присутствии до 12,5 молекул цинка на гексамер. Соединение сравнения А в композиции с 20 мМ NaCl является растворимым при условиях теста в присутствии до 10,5 молекул цинка на гексамер.

Соединение 1 является растворимым в композиции без NaCl при условиях теста до приблизительно 15,3 молекул цинка на гексамер инсулина. Кроме того, соединение 1 является растворимым в композиции с 20 мМ NaCl при условиях теста до приблизительно 14,5 молекул цинка на гексамер инсулина.

Пример 8

Начальная растворимость человеческого инсулина в присутствии цинка Человеческий инсулин растворяли в воде milli-Q при значении pH приблизительно 8. Фенол, крезол, ацетат цинка (Zn), хлорид натрия и глицерин добавляли в указанном порядке, в результате получали конечную композицию, содержащую: от 4,2 до 5 мМ инсулина, 1,6% глицерина, 25 мМ фенола, 25 мМ крезола, pH - 7,4, и с концентрацией цинка и хлорида натрия, как указано в таблице ниже. Композиции выдерживали 24 часа при температуре 22°С и затем центрифугировали при 15000×g в течение 15 мин. 100 мкл супернатанта переносили во флаконы для ВЭЖХ и определяли концентрацию с использованием кислой гель-фильтрации, как описано в Eur. Pharm. NovoRapid. Количество растворимого инсулина определяли в процентах от исходной концентрации.

Точность измерения составляла плюс/минус 2%.

Вывод

Человеческий инсулин является растворимым в композициях, содержащих до 6 Zn/гексамер инсулина, когда композиция содержит NaCl, и до 4 Zn/гексамер инсулина, когда композиция почти не содержит NaCl.

Пример 9

Химическая и физическая стабильность в зависимости от содержания цинка и хлорида натрия

Целью этого эксперимента являлось измерение химической и физической стабильности композиций в диапазоне цинк/гексамер, определенного экспериментами SEC (гель-проникающей хроматографии). Кроме того, целью этого эксперимента была проверка, влияет ли присутствие хлорида натрия на химическую и/или физическую стабильность.

Композиции

Композиции содержали: 3,6 мМ соединения 1,25 мМ фенола, 25 мМ крезола, pH 7,4; цинк и хлорид натрия, как указано ниже.

Композицию получали следующим образом:

Порошок соединения 1 растворяли в воде Milli-Q в исходном растворе в приблизительно двойном количестве в качестве конечной концентрации в композиции. Фенол, крезол, ацетат цинк, хлорид натрия и глицерин добавляли в указанном порядке. Полученный раствор имел pH приблизительно 7,8, pH доводили до 7,4 с помощью 0,2Н HCl, в результате получали конечное увеличение концентрации хлорида 1,45 мМ.

Композицию стерильно фильтровали и заполняли ей картриджи с пробками на 3 мл.

Физическую стабильность измеряли следующим образом:

Склонность к фибриллообразованию измеряли с помощью анализа с тиофлавином Т (ThT). Потенциальное осаждение, приводящее к образованию видимых частиц, измеряли как потенциальное увеличение мутности. Образование частиц с размерами менее 2 мкм измеряли с помощью динамического рассеяния света (DLS). Образование частиц с размерами более 2 мкм измеряли с помощью микропоточной визуализации (MFI).

Химическую стабильность измеряли в виде увеличения частиц с высокой молекулярной массой (HMWP) в процентах и уменьшения чистоты, как измерено с помощью обращено-фазной UPLC.

Склонность к Фибриллообразованию с помощью анализа с тиофлавином Т

Концентрацию соединения 1 определяли в соответствии со способом, описанным в WO 2013/153000.

Стабильность в покое соединения 1 проверяли методом DLS

Физическую стабильность соединения 1 в композициях с различными

концентрациями NaCl и ацетата цинка, выдержанных при 4°С, 37°С и 45°С, проверяли с помощью динамического рассеяния света (DLS).

Метод

Каждый образец измеряли трехкратно на ридере планшетов DynaPro при 25°С путем считывания 20 сигналов за 10 секунд; Данные представлены как среднее значение из трех измерений. Образцы не подвергали фильтрации, но вместо этого их центрифугировали при 15000×g в течение 20 мин, чтобы удалить только самые крупные флоккуляты и агрегаты, которые в противном случае блокируют измерения. Кроме того, для герметизации лунки DLS-планшета для микротитрования использовали парафиновое масло вместо более распространенной пластиковой пленки.

Средний размер олигомеров белка, определенный с помощью DLS, находится в диапазоне от 3,8 нм (для композиции с 5,8 Zn/гексамер инсулина, 20 мМ NaCl, при 37°С, через 2 недели) до 5,95 нм (для композиции с 10,5 Zn/гексамер инсулина, 75 мМ NaCl при 4°С, через 2 недели). Для образцов, хранившихся при 4°С, гидродинамический диаметр уменьшается в среднем на 1%, в то время как он увеличивался на 1 и 4% для образцов, хранившихся при 37 и 45°С соответственно. Кроме того, все записанные авто-корреляционные функции соответствовали одномодальным распределениям частиц, что указывает на довольно узкое распределение по размерам, где отсутствуют какие-либо крупные агрегаты.

Вывод

Хотя различные условия выдерживания композиций обусловили существенно отличающиеся средние размеры олигомеров, изменение с течением времени было чрезвычайно мало, если вообще имело место, и оказалось, что все композиции являются физически стабильными при температуре 4°С, 37°С, а также 45°С в течение 8-недельного периода испытания. В течение этого периода агрегаты не образовывались.

Измерение частиц с размерами более 2 мкм с помощью МП Композиции анализировали на предмет образования частиц до видимого микрометрового диапазона с помощью микропоточной визуализации (MFI™). Количество частиц, как правило, было низким, и большая доля частиц имела темный сферический внешний вид, ожидаемый для капель силиконового масла. Однако в композиции, содержащей 10,5 Zn/гексамер и 150 мМ или 75 мМ, появились крупные полупрозрачные хлопьевидные частицы после 2 недель инкубации при 45°С и после 8 недель при температуре 37°С, соответственно.

Вывод о физической стабильности

Физическую стабильность измеряли в виде лаг-периода в анализе ThT как зависимость повышения соотношения цинк/гексамер от повышения содержания цинка от 5,8 до 8,1 Zn/гексамер инсулина. Среднее изменение размера олигомеров, как измерено DLS, не выявило изменения размера олигомеров и образования агрегатов в любой из композиций. Измерение частиц с помощью MFI показало увеличение образования частиц в композициях, содержащих 10,5 Zn/гексамер и 75 мМ NaCl.

Таким образом, физическая стабильность была оптимальной в композициях, содержащих более 5,8 и менее 10,5 Zn/гексамер инсулина.

Химическая стабильность

Образование HMWP измеряли с помощью гель-фильтрационной колонки с элюентом, не содержащим уксусной кислоты, как описано в WO 2013/153000. HMWP для образцов, хранившихся при 4°С, вычитали из HMPW для образцов, хранившихся при 30°С или 37°С.

Вывод

В композициях, содержащих 5,8 Zn/гексамер инсулина, наблюдалось большее образование HMWP, чем в композициях, содержащих 8,1 Zn/гексамер инсулина или выше.

Потеря чистоты

Потерю чистоты измеряли относительно исходной. Из чистоты, измеренной с помощью обращенно-фазной хроматографии на образцах, хранившихся при 4°С, вычитали чистоту, измеренную для образцов, хранившихся при 30°С или 37°С. Использовали способ определения чистоты UPLC, слегка модифицированный по отношению к способу, описанному в публикации WO 2013/153000. В данном случае использовали Waters CSH, колонку С18, которая в данном случае улучшает разделение и количество допускаемых в колонку введений до ее замены.

Вывод

В композициях, содержащих 5,8 Zn/гексамер инсулина, наблюдалось самое высокое разрушение. В композициях, содержащих 8,1 Zn/гексамер инсулина или более, наблюдалось более низкое разрушение. Таким образом, химическая стабильность является оптимальной в композициях, содержащих 8,1 цинка/гексамер или более. Стабильность является более высокой в композициях, содержащих 75 мМ NaCl, чем в композициях, содержащих 20 мМ NaCl.

Пример 10

Целью этого эксперимента было изучение олигомеризации путем гель-проникающей хроматографии в зависимости от содержания NaCl в композиции, содержащей соединение сравнения А (т.е. N{эпсилон-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]-амино]этокси]этокси]ацетил]-[GluA14,HisB16,HisB25],дез-ThrB30-инсулин (человеческий); альтернативное название: А14Е,В16Н,В25Н,B29K(N^εэйкозандиоил-gGlu-2xOEG), дезВ30 человеческий инсулин; при концентрации 4,2 мМ инсулина и с фиксированным соотношением цинк/гексамер инсулина. Кроме того, целью этого эксперимента было измерение физической и химической стабильности.

Композиция

Соединение А растворяли в воде milli-Q при pH приблизительно 8. Фенол, крезол, ацетат цинка (Zn) и глицерин добавляли в указанном порядке с получением конечной композиции, содержащей: 4,5 Zn/гексамер инсулина, 25 мМ фенола, 25 мМ крезола, pH 7,4, концентрация инсулина составляла 4,2 мМ, концентрация хлорида натрия (NaCl), ацетата цинк и глицерина, как указано в таблице ниже.

Физическую стабильность оценивали путем измерения

1. Склонности к фибриллообразованию, измеренной с помощью анализа с тиофлавином Т. Склонность к фибриллообразованию измеряли с помощью анализа с тиофлавином Т (ThT) в виде лаг-периода до образования фибрилл. Анализ ThT проводили, как описано, на свежеприготовленных образцах; и

2. Радиусов олигомеров в нм и образования агрегатов менее 4 мкм путем динамического рассеяния света.

Химическую стабильность композиций определяли как повышение белка с высокой молекулярной массой (HMWP) в примесях, относящихся к инсулину, после хранения в течение четырех недель (4 нед.) при 37°С относительно количества HMWP после хранения при 4°С.

HMWP измеряли с помощью метода 2 определения HMWP, как описано в WO 2013/153000.

Образование примесей, относящихся к инсулину, таких как соединения деамидирования, измеряли с помощью обращенно-фазной хроматографии (UPLC).

Количество мономера измеряли с помощью нативной гель-фильтрации с использованием метода 2, как описано в WO 2013/153000 с элюентом без фенола.

Вывод

Количество мономера соединения А уменьшается в зависимости от концентрации хлорида натрия с большим эффектом добавления только до 50 мм NaCl. Химическое разрушение, измеренное как образование HMWP и примесей, является низким во всех композициях, не зависимо от содержания мономеров. Лаг-период ThT увеличивается с повышением содержания цинка и хлорида натрия.

Вывод

Гидродинамический радиус увеличивается с увеличением концентрации соли. Концентрация Zn оказывает незначительное влияние на размеры, за исключением 7 ионов Zn на гексамер инсулина. Не наблюдалось существенного влияния температуры инкубации на размер олигомеров и физическую стабильность.

1. Производное инсулина с длительным фармакокинетическим профилем, представляющее собой

А14Е, В16Е, В25Н, В29К (N(эпс)-эйкозандиоил-gGlu-2хОЕG),дезВ30 человеческий инсулин (Соединение 1),

где формула показывает, что аминокислота в положении А14, Y в человеческом инсулине, заменена на Е, аминокислота в положении В16, Y в человеческом инсулине, заменена на Е, аминокислота в положении В25, F в человеческом инсулине, заменена на Н, аминокислота в положении В29, К в человеческом инсулине, изменена путем ацилирования на эпсилон-атоме азота в остатке лизина В29 остатком эйкозандиоил-gGlu-2xOEG, и аминокислота в положении В30, Т в человеческом инсулине, удалена,

где OEG представляет собой сокращение для [2-(2-аминоэтокси)этокси]уксусной кислоты NH₂(CH₂)₂O(CH₂)₂OCH₂CO₂H,

и gGlu представляет собой сокращение для гамма-глутаминовой кислоты в L-конфигурации.

2. Применение соединения по п. 1 в качестве лекарственного средства, обладающего активностью инсулина.

3. Применение соединения по п. 1 в качестве лекарственного средства для лечения диабета.

4. Применение соединения по п. 1 для лечения диабета, где соединение вводят одному и тому же пациенту каждый 2 день или реже и в среднем в течение периода времени, составляющего 1 месяц, 6 месяцев или 1 год, причем указанное соединение не вводят чаще одному и тому же пациенту.

5. Применение соединения по п. 1 для лечения диабета, где соединение вводят два раза в неделю или реже и в среднем в течение периода времени, составляющего 1 месяц, 6 месяцев или 1 год, причем указанное соединение не вводят чаще одному и тому же пациенту.

6. Применение соединения по п. 1 для лечения диабета, где соединение вводят один раз в неделю или реже и в среднем в течение периода времени, составляющего 1 месяц, 6 месяцев или 1 год, причем указанное соединение не вводят чаще одному и тому же пациенту.

7. Водный раствор, содержащий соединение по п. 1, для лечения или профилактики диабета, где водный раствор имеет рН в диапазоне от 7 до 8 и дополнительно содержит изотонический агент, консервант, буфер и по меньшей мере 5 ионов цинка на гексамер инсулина.

8. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики диабета, содержащая соединение по п. 1 в эффективном количестве и один или более эксципиентов.

9. Фармацевтическая композиция по п. 8, содержащая по меньшей мере 4,5 ионов цинка на гексамер инсулина.

10. Способ лечения или профилактики диабета, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения по п. 1.