Способ получения иммуноглобулина против лихорадки эбола из сыворотки крови лошадей, жидкого

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к разработке технологий производства защитных иммунобиологических препаратов, и касается получения иммуноглобулина Эбола из сыворотки крови лошадей, иммунизированных вирусом Эбола, методом спиртового осаждения по Кону. Сущность изобретения заключается в том, что способ получения гетерологичного иммуноглобулина против лихорадки Эбола включает дополнительные стадии очистки и концентрирования препарата с использованием методов ионообменной и гельфильтрационной хроматографии, иммуноглобулина против лихорадки Эбола, включающие ионообменную хроматографию на колонке BPG 140/500 GE Health care с QSepharose FF при температуре 20°С и скорости подачи образца 350 мл/мин с последующей градиентной элюцией фракции Ig G от 0 до 100% буферным раствором с рН 8,0, содержащим 0,02 моль/л трис (гидрокси-метил)аминометана и 1 моль/л NaCl при той же скорости в течение 80 минут; гель-фильтрационную хроматографию на колонке BPG 140/950 GE Health care с сорбентом 40 SEC, уравновешенной фосфатно-глициновым буферным раствором с рН 6,9, содержащим 0,02 М фосфата натрия с 2% глицина, при скорости потока 100 мл/мин в изократическом режиме элюирования при той же скорости; концентрирование и стерилизующую фильтрацию раствора иммуноглобулина на автоматической системе фильтрации и концентрирования в тангенциальном потоке «Владисарт» через кассеты с пределом эксклюзии 100 кДа при скорости потока 500 мл/мин, входном давлении не более 2 бар и выходном давлении не более 1 бар. Технический результат заключается в том, что разработанный способ обеспечивает получение иммуноглобулина против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей с более высоким содержанием мономерной фракции иммуноглобулина (не менее 95%) и меньшим количеством посторонних фракций димеров, полимеров и агрегатов (не более 5%), а также отсутствием остаточного этилового спирта, что снижает анафилактогенность иммуноглобулина и приводит качество препарата в соответствие с требованиями Европейской Фармакопеи к гетерологичным препаратам. 2 табл., 1 пр., 2 ил.

 

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к разработке технологий производства защитных иммунобиологических препаратов, в частности к разработке способа получения специфического средства экстренной профилактики лихорадки Эбола.

Смертельно опасный вирус Эбола - возбудитель одноименной особо опасной лихорадки военные специалисты рассматривают как один из наиболее вероятных биологических поражающих агентов - основы биологического оружия и террора [1-4].

В результате эпидемии лихорадки Эбола в 2014-2015 г.г., унесшей жизни более 11 тысяч человек, было инфицировано более 26 тысяч жителей планеты, а смертельно опасный вирус Эбола, ранее регистрировавшийся только в Африке, проник в Европу и Америку [5]. Эти события в очередной раз подтвердили актуальность разработки средств биологической защиты в отношении возбудителя лихорадки Эбола, в том числе медицинских средств защиты для экстренной профилактики и лечения этой особо опасной инфекции. Одним из путей решения проблемы является разработка и использование гетерологичного иммуноглобулина против лихорадки Эбола [6]. Впервые такой препарат был разработай в Научно-исследовательском институте микробиологии МО РФ [7], зарегистрирован в Государственном Реестре лекарственных средств и разрешен для медицинского применения и промышленного выпуска в РФ (регистрационное удостоверение №96/309/123/8) [8-11].

Иммуноглобулин показал высокую эффективность в экспериментах на животных, были подтверждены его протективные свойства при введении по эпидемическим показаниям людям в качестве средства экстренной профилактики. Однако опыт клинического применения препарата выявил развитие общих реакций у 21% и местных реакций - у 33% пациентов [12], поэтому рекомендации по его применению ограничивались ситуациями, в которых контакт с возбудителем мог быть приравнен к заражению [6, 13, 14]. В настоящее время иммуноглобулин Эбола не входит в список иммунобиологических препаратов, разрешенных для применения в медицинской практике на территории Российской Федерации.

Известен способ получения иммуноглобулина против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей жидкого (иммуноглобулина Эбола), включающий приготовление антигена из вирулентного штамма вируса Эбола, получение иммунной крови, получение иммунной сыворотки с использованием 30% раствора хлористого кальция, выделение и концентрирование иммуноглобулинов методом осаждения этиловым спиртом на холоду по Кону, стерилизующую фильтрацию, фасовку и упаковку [7, 11]. Данный способ является единственным аналогом (прототипом) предлагаемого изобретения.

Способ обеспечивает получение нетоксичного апирогенного стерильного средства экстренной профилактики лихорадки Эбола со специфической активностью, выражающейся титром вируснейтрализующих антител не ниже 1:4096, содержанием гамма-глобулиновой фракции не ниже 90%, содержанием примесей посторонних белков не более 10% и остаточным количеством этилового спирта не более 4%.

К недостаткам существующего способа следует отнести то, что в получаемом конечном продукте содержится большое количество посторонних белков сыворотки крови (до 10% альбуминов, α - и β- глобулинов) и остаточного количества (до 4%) этилового спирта, повышающих реактогенность препарата [9]. При анализе методом гельфильтрационной ВЭЖХ в препарате выявляют около 88% мономеров, 6% димеров, 3% полимеров и 3% агрегатов, что свидетельствует о низкой чистоте иммуноглобулиновой фракции. В результате препарат обладает анафилактогенностью, характеризующейся индексом анафилаксии по Вейглу 2,5±0,5.

Целью настоящего изобретения является разработка способа получения иммуноглобулина против лихорадки Эбола, обеспечивающего получение конечного продукта с более высокой степенью очистки, что позволит значительно снизить анафилактогенность препарата.

Технический результат предлагаемого изобретения, заключается в том, что разработанный способ обеспечивает получение иммуноглобулина против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей с более высоким содержанием мономерной фракции иммуноглобулина (не менее 95%) и меньшим количеством посторонних фракций димеров, полимеров и агрегатов (не более 5%), а также отсутствием остаточного этилового спирта, что снижает анафилактогенность иммуноглобулина и приводит качество препарата в соответствие с требованиями Европейской Фармакопеи к гетерологичным препаратам [16].

Указанный технический результат достигается за счет того, что предлагаемый способ содержит дополнительные стадии очистки и концентрирования иммуноглобулина против лихорадки Эбола, включающие ионообменную хроматографию на колонке BPG 140/500 GE Health care с QSe-pharose FF при температуре 20°С и скорости подачи образца 350 мл/мин с последующей градиентной элюцией фракции Ig G от 0 до 100% буферным раствором с рН 8,0, содержащим 0,02 моль/л трис (гидроксиметил)аминометана и 1 моль/л NaCl при той же скорости в течение 80 минут; гель-фильтрационную хроматографию на колонке BPG 140/950 GE Health care с сорбентом 40 SEC, уравновешенной фосфатно-глициновым буферным раствором с рН 6,9, содержащим 0,02 М фосфата натрия с 2% глицина, при скорости потока 100 мл/мин в изократическом режиме элюирования при той же скорости; концентрирование и стерилизующую фильтрацию раствора иммуноглобулина на автоматической системе фильтрации и концентрирования в тангенциальном потоке «Владисарт» через кассеты с пределом эксклюзии 100 кДа при скорости потока 500 мл/мин, входном давлении не более 2 бар и выходном давлении не более 1 бар.

Сущность изобретения заключается в том, что способ получения гетерологичного иммуноглобулина против лихорадки Эбола включает дополнительные стадии очистки и концентрирования препарата с использованием методов ионообменной и гельфильтрационной хроматографии, а также концентрирования раствора иммуноглобулина в тангенциальном потоке через кассеты с пределом эксклюзии 100 кДа. Стадия ионообменной хроматографии позволяет выделить фракции IgG на сорбенте Q Sepharose FF, удалить остатки альбумина, а также фракции эуглобулинов, в которых содержится минимальное количество специфических антител при достаточно большом (до 60 % по массе) содержании белка. На следующем этапе очистки с помощью гельфильтрационной хроматографии отделяют высокомолекулярные фракции димеров и полимеров и низкомолекулярные фрагментарные фракции, которые снижают качество иммуноглобулинов. При элюции иммуноглобулина на хроматографической колонке этиловый спирт уходит в составе раствора.

Новизна изобретения заключается в том, что из технологии получения гетерологичных иммуноглобулинов не известно использование дополнительных операций безаффинной очистки и концентрирования препарата методом ионообменной и гельфильтрационной хроматографии для получения иммуноглобулина против лихорадки Эбола.

Изобретательский уровень предложенного технического решения заключается в том, что из уровня техники явным образом не следует, что использование дополнительных стадий очистки и концентрирования в технологии получения иммуноглобулина против лихорадки Эбола с использованием методов ионообменной и гельфильтрационной хроматографии, а также концентрирования раствора иммуноглобулина в тангенциальном потоке через кассеты с пределом эксклюзии 100 кДа обеспечивает получение более безопасного препарата иммуноглобулина.

Промышленная применимость заключается в возможности использования для реализации заявленного способа получения специфического иммуноглобулина типового биотехнологического оборудования и доступных в микробиологической и фармацевтической промышленности РФ материалов.

Предложенное техническое решение может быть использовано для получения более качественного средства экстренной профилактики особо опасного инфекционного заболевания - лихорадки Эбола для нужд населения и воинских контингентов Российской Федерации.

Пример выполнения

По разработанной технологии приготовлены экспериментально-производственные серии иммуноглобулина лошадиного Эбола очищенного. Приготовление включало следующие стадии.

1. Приготовление антигена

Антиген для иммунизации животных-продуцентов готовили путем инфицирования обезьян вирулентным возбудителем лихорадки Эбола, штамм Заир. Печень погибших животных гомогенизировали, готовили 10 % вируссодержащую суспензию на фосфатно-солевом буфере и центрифугировали ее при 500-700 g в течение 10 минут.Биологическая активность антигена составляла не менее 3,0 lg БОЕ/мл.

Перед иммунизацией антиген контролировали на стерильность и специфическую активность. До момента прохождения контролей разлитый антиген помещали на хранение при температуре от минус 55 до минус 65°С

2. Иммунизация лошадей и получение иммунной сыворотки крови

Иммунизацию животных, получение иммунной крови, приготовление иммунной сыворотки крови и выделение иммуноглобулинов методом осаждения этиловым спиртом проводили согласно технологиям, отработанным для производства иммуноглобулина против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей жидкого, зарегистрированного в Реестре лекарственных средств России в 1996 году.

Иммунизацию лошадей вирулентным возбудителем лихорадки Эбола проводили после выдерживания их в карантине в течение 45 суток в условиях, предусмотренных для работы с возбудителями I группы патогенности. В целях безопасности (исключения возможности выноса вирулентного возбудителя) животных содержали в зонированных помещениях в течение 7 суток, а затем, после полной дезинфекции кожных покровов и помещения, выводили в «чистую» половину конюшни, где осуществляли все последующие операции по взятию крови.

Грундиммунизацию лошадей проводили путем однократной подкожной инъекции антигена в область шеи. Объем вводимого для грундиммунизации антигена составлял 20 мл. Продолжали иммунизацию не ранее чем через месяц циклами, состоящими из однократной инъекции антигена и последующих кровопусканий. Антиген вводили в область крупа в объеме от 80 до 100 мл внутримышечным способом. В процессе гипериммунизации у животных ежедневно измеряли температуру. При ее повышении выше нормы дальнейших манипуляций с животными не осуществляли до исчезновения данных симптомов.

На 8 сутки после последней иммунизации осуществляли пробное кровопускание для контроля специфической безопасности крови, которую подтверждали по отсутствию негативных колоний через 8-10 суток после внесения пробы цельной сыворотки, полученной путем отстаивания крови, на монослойную культуру GMK-AH-1 (Д), чувствительную к вирусу Эбола, и инкубирования ее при температуре 37°С. Основное кровопускание проводили только после получения результатов контроля на 14-35 сутки после последней иммунизации в несколько приемов. После отстаивания крови в течение 2-3 часов отсасывали плазму светло-желтого цвета.

Иммунную сыворотку получали путем дефибринирования плазмы крови 30% раствором хлористого кальция (1,8 мл раствора на 1 л плазмы) путем энергичного встряхивания в течение 15-30 минут. Дефибринированную плазму оставляли на срок от 18 до 24 часов при комнатной температуре. По истечении указанного срока фибриновые нити и комочки собирались в верхнем, а сыворотка - в нижнем слое жидкости; на дне бутыли оседало небольшое количество

эритроцитов. От 5 лошадей получали 6 партий сыворотки крови объемом около 10 л каждая.

Для фракционирования использовали стерильные свежие сыворотки. Выделение и концентрацию иммуноглобулинов проводили только по окончании контролей специфической активности крови после основного кровопускания.

3. Выделение иммуноглобулина G методом спиртового осаждения на холоду

Выделение и концентрирование иммуноглобулинов из сыворотки крови проводили методом спиртового осаждения при низких температурах по Кону [8]. Схема выделения иммуноглобулинов построена на последовательных изменениях следующих факторов: диэлектрической постоянной раствора, ионной силы, величины рН, концентрации этилового спирта, концентрации белка. Для выделения иммуноглобулинов использовали «Комбинированную установку для фракционирования белков сыворотки крови этанолом на холоду» производства 000 «АРТЛАЙФ ТЕХНО», п. Юрга Кемеровской обл. Собственно фракционирование белков проводили в реакторе с охлаждающим режимом от минус 5° до минус 70 С в асептических условиях путем трех основных и одного дополнительного последовательных осаждений этиловым спиртом.

В результате цикла осаждений получали около 190 г серовато-белого или белого студенистого осадка иммуноглобулинов, который помещали на хранение при температуре минус 20°С на срок не более 1 месяца.

Анализ серий иммуноглобулинов против лихорадки Эбола, полученных по Кону, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) показал, что содержание общего белка в них находится в диапазоне от 72 до 120 мг/мл, содержание иммуноглобулина G - 82-94%.

4. Очистка методом ионообменной хроматографии и гельфильтрации

Дополнительная очистка включала ряд операций, изложение которых представлено ниже.

Осадки иммуноглобулина после третьего осаждения и дополнительного извлечения иммуноглобулина, каждый в отдельности, растворяли в 0,02 моль/л буферном растворе трис(гидроксиметил)аминометан до конечной концентрации белка 0,9-1,1 мг/мл. Пробы каждого раствора объемом 20 мл отбирали для определения величины рН и фракционного состава методом гельфильтрационной ВЭЖХ. До завершения контроля растворы иммуноглобулина хранили при температуре от 2 до 8°С.

Ионообменную хроматографию раствора иммуноглобулина на колонке BPG 140/500, GE Health Care с сорбентом QSepharose FF проводили при температуре 20°С. Для этого 100 литров раствора белка с помощью насоса подачи образца со скоростью 350 мл/мин подавали на хроматографическую колонку. После нанесения раствора (285 минут) сорбент промывали 6 литрами 0,02 моль/л буферного раствора трис (гидроксиметил)аминометан со скоростью 385 мл/мин (15 минут). Иммуноглобулин элюировали с колонки буферным раствором, содержащим 0,02 моль/л трис(гидроксиметил)аминометан 1 моль/л NaCl, в условиях градиентной элюции от 0 до 100 %. Общий объем градиента составлял около 20 литров. Фракции собирали в бутыли объемом 1 литр. Фракции, содержащие не менее 92 % иммуноглобулина G, объединяли (3,6 литра) и передавали на стадию гельфильтрации.

Для удаления высокомолекулярных примесей полученные после ионообменной хроматографии растворы иммуноглобулинов очищали гельфильтрационной хроматографией. Полуфабрикат иммуноглобулина Эбола подавали на колонку BPG 140/950, GE Health Care с сорбентом 40 SEC, предварительно уравновешенную фосфатно-глициновым буферным раствором, со скоростью потока 100 мл/мин. После нанесения раствора фракции разделяли в изократическом режиме элюирования, подавая 12 литров фосфатно-глицинового буферного раствора при той же скорости потока. Сбор фракций по 400 мл начинали с началом выхода хроматографического пика и продолжали до схода пика. Фракции, содержащие мономер иммуноглобулина, объединяли (3,2 л) и доводили концентрацию белка до нужного значения. Данную операцию повторяли 6 раз ввиду ограничения гельфильтрационной колонки по объему наносимого образца (не более 5 % от объема колонки). Суммарный объем раствора после шести нанесений составил 19,2 л. Количество мономерного иммуноглобулина на стадии - 52,4 г

5. Концентрирование и стерилизующая фильтрация

Концентрирование и стерилизующую фильтрацию раствора иммуноглобулина проводили на автоматической системе фильтрации и концентрирования в тангенциальном потоке «Владисарт», снабженной перистальтическим насосом. Для концентрирования использовали тангенциальные кассеты с пределом эксклюзии 100 кДа, скорости потока 500 мл/мин, входном давлении не более 2 бар и выходном давлении не более 1 бар. Стерилизующую фильтрацию проводили через мембранные кассетные фильтры с размером пор 0,22 мкм.

Таким образом, объем конечного раствора иммуноглобулина после двух хроматографических стадий очистки и стерилизующей фильтрации - 480 мл. Концентрация белка в растворе - 90-110 мг/мл.

Результаты анализа ВЭЖХ иммуноглобулина, очищенного методом хроматографии (фиг. 1) и препарата - прототипа (фиг.2) демонстрируют, что по качественному составу оба продукта не отличаются друг от друга. Однако площади пиков белков - примесей в иммуноглобулине после стадии спиртового осаждения на холоду значительно больше, чем в хроматографически очищенном препарате, что свидетельствует об обоснованности включения в технологию производства иммуноглобулина дополнительной стадии очистки.

Разработанный образец иммуноглобулина против лихорадки Эбола представляет собой мономерную фракцию иммуноглобулина (не менее 95 %) с незначительным содержанием (не более 5 %) димеров, полимеров и агрегатов

После завершения этапов очистки 10 % раствор иммуноглобулина на фосфатно-глициновом буфере подвергали предварительной и стерилизующей фильтрации с помощью установки «Владисарт», состоящей из разборного фильтродержателя АСФ-009 в комплекте с мембранными кассетными фильтрами с размером пор 0,22 мкм и перистальтического насоса.

Стерильный препарат разливали в стеклянные флаконы по 6 мл.

В таблице 1 представлены характеристики полученных серий препарата.

Таблица 1 - Характеристика показателей качества трех серий иммуноглобулина Эбола из сыворотки крови лошадей, жидкого, приготовленного заявляемым методом

Наименование показателя, ед. измерения	Требования НТД	Значения показателей
02/2015	03/2015	04/2015
Объем серии в дозах	Не менее 100	138	120	170
Описание	Прозрачность или слегка опалесцирующая, бесцветная или светло-желтого цвета жидкость.	Прозрачная бесцветная жидкость	Прозрачная бесцветная жидкость	Прозрачная бесцветная жидкость
Подлинность	Должен содержать специфические антитела к вирусу Эбола	Содержит вируснейтрализующие антитела к вирусу Эбола	Содержит вируснейтрализующие антитела к вирусу Эбола	Содержит вируснейтрализующие антитела к вирусу Эбола
Прозрачность	Оптическая плотность при длине волны 540 нм не должна быть более 0,05	0,003	0,004	0,005
Цветность	Оптическая плотность препарата при длине волны 400 нм не должна быть более 0,15	0,01	0,02	0,03
pH	От 6,8 до 7,2	7,12	7,03	6,95
Извлекаемый объем	Не менее номинального	Соответствует	Соответствует	Соответствует
Белок	От 9 до 11 %	10,7	10,9	10,2
Молекулярные параметры	Содержание мономерной фракции иммуноглобулина - не менее 95 %; Содержание димеров, полимеров и агрегатов - не более 5 %	Мономерная иммуноглобулиновая фракция - 96,9 %; Димеры, полимеры и агрегаты 3,1 %	Мономерная иммуноглобулиновая фракция - 97,3 %; Димеры, полимеры и агрегаты 2,7 %	Мономерная иммуноглобулиновая фракция - 97,1 %; Димеры, полимеры и агрегаты - 2,9 %
Стерильность	Должен быть стерильным	Стерилен	Стерилен	Стерилен
Пирогенность	Должен быть апирогенным	Апирогенен	Апирогенен	Апирогенен
Аномальная токсичность	Должен быть нетоксичным	Нетоксичен	Нетоксичен	Нетоксичен
Специфическая активность	Титр вируснейтрализующих антител против вируса Эбола (штамм Заир) должен быть не ниже 1:4096	1:4096	1:8192	1:4096

Сравнительные характеристики препаратов иммуноглобулина против лихорадки Эбола, полученного предлагаемым способом по сравнению с прототипом представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Характеристики иммуноглобулина против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей, жидкого, полученного предлагаемым способом

Наименование характеристик их размерность	Численные значения показателей для…
прототипа	Препарата, полученного заявленным способом
Содержание мономеров, %	Не менее 88	Не менее 95
Содержание димеров, полимеров и агрегатов %	Не более 12	Не более 5
Содержание этилового спирта, %	Не более 4,0	отсутствует
Анафилактогенность, индекс анафилаксии	2,5±0,5	1,5±0,5

Выводы. Предлагаемый способ позволяет получить экспериментально-производственные серии нетоксичного апирогенного стерильного средства экстренной профилактики лихорадки Эбола, содержащего большее по сравнению с аналогом количество активной мономерной фракции Ig G, меньшее количество димеров, полимеров и агрегатов, не содержащего этиловый спирт. Препарат обладает защитной эффективностью и меньшей анафилактогенностью, что снижает риск развития анафилактических реакций при введении людям.

Библиографические данные

1 Неэндемические и экзотические вирусные инфекции: этиология, диагностика, индикация и профилактика / Под ред. С.В. Борисевича, Е.Н. Храмова, А.Л. Ковтуна. - М.: 2014.

2 Feldmann H., Jones S., Klenk H.D., Schnittler H.J. Ebola virus: From discovery to vaccine / H. Feldmann, S. Jones, H.D. Klenk, H.J. Schnittler // Nat. Rev. Immunol. 2003; 3: 677-685.

3 Baize S., Pannetier D., Oestereich L., Rieger T., Koivogui L. Emergence of Zaire Ebola Virus Disease in Guinea. Preliminary Report : New Engl. J. Med 2014; 1-8.

4 Johnson E., Jaax N., White J., Jarling P. Lethal experimental infections of rhesus monkeys by aerosolized Ebola virus. Int. J.Exp. Pathol. 1995; 76: 227-236.

5 Background document potential Ebola therapies and vaccines / WHO 3 September 2014.

6 Маркин В.А., Михайлов В.В., Краснянский В.П. и др. Разработка принципов экстренной профилактики и лечения лихорадки Эбола. Вопр. вирусол. 1997;1: 31-34.

7 Борисевич И.В., Краснянский В.П., Михайлов В.В. и др. Разработка и изучение свойств иммуноглобулина против лихорадки Эбола. Вопр. вирусол. 1995; 6: 270-273.

8 Государственный Реестр лекарственных средств. М.: Медицина, 1996.

9 Иммуноглобулин против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей, жидкий: ФСП 42-0102-0242-00, ФС 42-0030-00. Введ. 2000-07-26. М.: Департаментом Государственного контроля качества, эффективности, безопасности лекарственных средств и медицинской техники МЗ РФ, 2000.

10 Инструкция по применению иммуноглобулина против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей, жидкого. Введ. 2001-03-12. М.: Первым заместителем министра здравоохранения РФ - Главным государственным санитарным врачом РФ, 2001.

11 Пат. 2130318 Российская Федерация, МКИ С.1 Препарат, содержащий иммуноглобулин против лихорадки Эбола, из сыворотки крови лошадей, жидкий (иммуноглобулин Эбола) / В.В.Михайлов, И.В.Борисевич, Г.Д. Тиманькова, В.П. Краснянский, Н.В. Потрываева, Е.В. Лебединская, Н.К. Черникова; заявитель и патентообладатель Вирусологический центр НИИ микробиологии МО: заявка № 96113771, заявл. 05.07.1996; зарегистр. В Гос.реестре изобретений РФ 20.05.1999.

12 Хмелев А.Л., Борисевич С.В., Черникова Н.К. и др. Оценка безопасности профилактического использования иммуноглобулинов против вирусных геморрагических лихорадок из сывороток крови лошадей. Антибиотики и химиотерапия 2012; 6: 103-106.

13 Борисевич И.В., Маркин В.А., Фирсова И.В. и др. Эпидемиология, профилактика, клиника и лечение геморрагических лихорадок. Эпидемиология, профилактика, клиника и лечение геморрагических лихорадок. Вопр. вирусол. 2006; 5: 8-16.

14 Медуницын, Н.В. Вакцинология. М., 2010.

15 Cohn E.J., Strong L., Hugnes W.L. et al. Amer. Chem. Soc. 1946; 68: 3: 459-464.

16 Европейская Фармакопея 7.0. Том 1, 2010: 1273 с.

Способ получения иммуноглобулина против лихорадки Эбола, из сыворотки крови лошадей, жидкого, включающий приготовление антигена из вирулентного штамма вируса Эбола, иммунизацию им лошадей, получение иммунной сыворотки с использованием 30% раствора хлористого кальция, выделение и концентрирование иммуноглобулинов методом осаждения этиловым спиртом на холоду, стерилизующую фильтрацию, фасовку и упаковку, отличающийся тем, что дополнительно содержит стадии очистки и концентрирования иммуноглобулинов, включающие: ионообменную хроматографию на колонке BPG 140/500 GE Health care с QSepharose FF при температуре 20°С и скорости подачи образца 350 мл/мин с последующей градиентной элюцией фракции Ig G от 0 до 100% буферным раствором с рН 8,0, содержащим 0,02 моль/л трис (гидроксиметил)аминометана и 1 моль/л NaCl при той же скорости в течение 80 минут; гель-фильтрационную хроматографию на колонке BPG 140/950 GE Health care с сорбентом 40 SEC, уравновешенной фосфатно-глициновым буферным раствором с рН 6,9, содержащим 0,02 М фосфата натрия с 2% глицина, при скорости потока 100 мл/мин в изократическом режиме элюирования при той же скорости; концентрирование и стерилизующую фильтрацию раствора иммуноглобулина на автоматической системе фильтрации и концентрирования в тангенциальном потоке «Владисарт» через кассеты с пределом эксклюзии 100 кДа при скорости потока 500 мл/мин, входном давлении не более 2 бар и выходном давлении не более 1 бар.