Способ получения биобезопасной культуры мезенхимальных стволовых клеток из вартонова студня пуповины человека

Изобретение относится к медицине, а именно к биотехнологии, и может быть использовано для получения биобезопасной культуры мезенхимальных стволовых клеток из Вартонова студня пуповины человека. Способ включает выделение из ткани пуповины после операции «кесарево сечение» первичной культуры мезенхимальных стволовых клеток из Вартонова студня. Причем при выделении мезенхимальных стволовых клеток пуповину освобождают от остатков крови и промывают в растворе Версена с добавлением антибиотиков 100 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере, вены канюлируют с обеих сторон и промывают физиологическим раствором (0,9%). Дезагрегацию ткани проводят раствором, содержащим 0,1% коллагеназы 2 типа и 0,15% коллагеназы 4 типа, приготовленным на среде DMEM/F12 в соотношении 1:1, инкубируют при 37°С в течение 30 мин, собирают отделившиеся клетки. Далее центрифугируют при 800 об/мин в течение 15 мин, получая осадок клеток, который ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 100 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия. Ресуспендируют осадок клеток в ростовой среде DMEM/F12 в соотношении 1:1, переносят в культуральные флаконы и культивируют в атмосфере, содержащей 5% СO₂ до формирования 3/4 монослоя, меняя ростовую среду 3 раза в неделю. При достижении 3/4 монослоя клетки пересевают, получая культуру МСК, причем после 1 пассажа часть клеток используют для выявления наличия в культуре вирусов СПИД, гепатита В и С и микоплазмы методом ПЦР и в случае позитивного анализа на эти инфекции культура бракуется. Использование данного способа позволяет повысить выход и жизнеспособность мезенхимальных стволовых клеток, полученных из Вартонова студня пуповины человека. 1 табл.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и клеточной терапии и касается получения из Вартонова студня пуповины человека биобезопасной культуры мезенхимальных стволовых клеток однородной клеточной популяции. Изобретение может найти применение в медицине для лечения различных заболеваний.

В настоящее время клеточная терапия находит все более широкое применение в медицине. Путем трансплантации стволовых клеток успешно лечат различные заболевания, такие, как остеопороз (Патент РФ №2265442 от 10.12.2005), аллергические заболевания (Патент РФ №2250773 от 27.04.2005), паркинсонизм (Патент РФ №2259836 от 10.09.2005), травму головного мозга (Патент РФ №2216336 от 20.11.2003), онкологические заболевания (Патент РФ №2257219 от 27.07.2005), выращивают органы для трансплантации, изготавливают фармпрепараты из их дериватов.

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) нередко используют в роли трансплантата, т.к. они активизируют собственные резервы организма, способствуют образованию цитокинов и факторов роста.

Обычно МСК получают из костного мозга, (патент 2303632) хотя их можно выделять из фетальных органов гемопоэза, из скелетных мышц, из подкожной жировой ткани. Выделение и культивирование МСК относительно несложно, но существует проблема получения однородной клеточной популяции мезенхимальных стволовых клеток в достаточном количестве для трансплантации и консервации впрок. По известным методикам выращивания МСК из костного мозга обычно получают гетерогенные популяции клеток стромы с незначительным содержанием в них стволовых клеток. В работе с МСК используют традиционные методики работы с клетками (Культура животных клеток. Методы. Под ред. Р.Фрешни. М.: Мир. 1989 г. ), в каждом случае подбирая индивидуальную последовательность действий, условия выделения и наработки клеточной массы.

Однако одним из наиболее перспективных источников стволовых клеток является пуповина человека, (патент 2303632RU)

Известен способ лечения заболеваний роговицы у собак, заключающийся в ретробульбарном введении лекарственного вещества в непосредственной близости от патологического очага, отличающийся тем, что в качестве лекарственного средства используют мезенхимальные стволовые клетки пуповины или плаценты, взятые после нормальных родов, при этом осуществляют ретробульбарное введение клеток путем инъекции 1-2 мл физиологического раствора, содержащего 0,075-0,20×10 6 клеток/кг веса одномоментно 1-2 раза в год. Мезенхимальные стволовые клетки пуповины или плаценты были получены в соответствии со стандартной методикой следующим образом. Образцы пуповины или плаценты человека собирали после нормальных родов на 39-40 неделе гестации. Вены пуповины и плаценты канюлировали и промывали вначале раствором Хенкса, а затем 0,1% раствором коллагеназы I типа, приготовленным на среде DMEM без сыворотки, и инкубировали при 37°С 30 мин. Затем сосуды вновь промывали раствором Хенкса, ткань подвергали непродолжительному мягкому механическому воздействию, и собирали отделившиеся клетки. Полученные клетки осаждали центрифугированием. Осадок ресуспендировали в среде DMEM, содержащей 10% сыворотки, 100 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, 10 нг/мл базального фактора роста фибробластов (b-FGF), переносили в культуральные чашки и культивировали до формирования монослоя, меняя среду 2 раза в неделю. При достижении монослоя клетки пересевали в соотношении 1:3. (патент 2481112 RU)

Известен СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ПРОИСХОДЯЩИХ ИЗ ПУПОВИННОЙ КРОВИ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ZNF281 (патент 2511417 RU)

Недостатком способа является то, что в крови подавляющая часть стволовых клеток преиндуцирована в сторону клеток крови и не может быть использована для лечения заболеваний, не связанных с патологией крови.

Известен СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СОСУДИСТЫХ И ДЕМИЕЛИНИЗИРУЮЩИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ И КЛЕТОЧНАЯ КУЛЬТУРА, ПОЛУЧЕННАЯ ЭТИМ СПОСОБОМ (патент RU 2347579), включающий в себя выделение из пуповины новорожденного после нормальных родов культуры стволовых клеток, отличающийся тем, что осуществляют выделение культуры аллогенных мезенхимальных стволовых клеток для парентерального введения их пациенту с неврологической патологией, при выделении аллогенных мезенхимальных стволовых клеток пуповину освобождают от остатков крови и промывают в растворе Версена с добавлением антибиотиков 100 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,250/мл амфотерицина в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере, вены канюлируют с обеих сторон и промывают сначала раствором Хенкса, а затем 0,1%-ным раствором коллагеназы 1 типа, приготовленным на среде DMEM, и инкубируют при 37°С в течение 30 мин, затем осуществляют механическое воздействие на ткани пуповины, собирают отделившиеся клетки, промывая их раствором Хенкса, полученную после механического воздействия и промывания суспензию клеток центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, получая осадок клеток, который ресуспензируют в ростовой среде DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 100 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, ресуспендированный осадок клеток в ростовой среде DMEM переносят в культуральные чашки и культивируют до формирования монослоя, меняя ростовую среду DMEM 2 раза в неделю, и при достижении монослоя клетки пересевают в соотношении 1:3, а перед проведением клеточной терапии монослой переводят в суспензию путем обработки смесью раствора Версена и 0,25%-ного раствора трипсина в соотношении 1:1 в течение 20 мин при 37°С, которую затем трижды промывают физиологическим раствором с рН 7,2, затем суспензию осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 1000 об/мин, осадок клеток ресуспензируют в стерильном физиологическом растворе, получая аллогенные мезенхимальные стволовые клетки пуповины человека в количестве от 1-5 млн клеток в 5 мл физиологического раствора. Способ по п. 1, отличающийся тем, что выделение аллогенных мезенхимальных клеток производят из пуповины новорожденного после нормальных родов на 38-40 недели гестации. Клеточная культура для лечения заболеваний нервной системы, включающая полученную из пуповины новорожденного культуру стволовых клеток для парентерального введения их пациенту, отличающаяся тем, что она получена с возможностью выделения культуры аллогенных мезенхимальных стволовых клеток по п. 1, причем количество аллогенных мезенхимальных стволовых клеток в клеточной культуре - в диапазоне от 1 до 5 млн клеток в 5 мл физиологического раствора. Способ выбран нами в качестве прототипа. Недостатком прототипа является низкий выход МСК и низкая жизнеспособность клеток, вызванная применением в качестве дезагреганта смеси смесью раствора Версена и 0,25%-ного раствора трипсина в соотношении 1:1 в течение 20 мин при 37°С. Кроме того, такая культура может нести опасность для реципиента и медицинского персонала, проводящего манипуляции с такими препаратами из-за их возможной зараженности вирусами СПИДА, гепатитов В и С, микоплазмой.

Нами предложен способ получения биобезопасной культуры мезенхимальных стволовых клеток из Вартонова студня пуповины человека, включающий в себя выделение из пуповины новорожденного после операции «кесарево сечение» первичной культуры мезенхимальных стволовых клеток из Вартонова студня. При выделении мезенхимальных стволовых клеток пуповину освобождают от остатков крови и промывают в растворе Версена с добавлением антибиотиков 200 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере, вены канюлируют с обеих сторон и промывают физиологическим раствором (0,9%), затем осуществляют механическое и ферментативное воздействие на ткани пуповины, собирают отделившиеся клетки. Данный способ отличается тем, что дезагрегацию ткани проводят раствором, содержащим 0,1% коллагеназы 2 типа и 0,15% коллагеназы 4 типа, приготовленным на среде DMEM\F12 в соотношении 1:1, инкубируют при 37°С в течение 30 мин, собирают отделившиеся клетки, центрифугируют при 800 об/мин в течение 15 мин, получая осадок клеток, который ресуспендируют в ростовой среде DMEM\ F12, содержащей 10% фетальной сыворотки теленка, 100 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, ресуспендируют осадок клеток в ростовой среде DMEM\ F12 в соотношении 1:1 переносят в культуральные флаконы и культивируют в атмосфере, содержащей 5% CO2 до формирования 3\4 монослоя, меняя ростовую среду 3 раза в неделю, и при достижении 3\4 монослоя клетки пересевают в соотношении 1:2, причем после 1 пассажа часть клеток используют для выявления наличия в культуре вирусов СПИД, гепатита В и С и микоплазмы методом ПЦР и в случае позитивного анализа на эти инфекции культура бракуется.

Предложенный способ позволяет получать биобезопасную культуру, не зараженную опасными вирусами. Пересев клеток при достижении ими 3\4 монослоя позволяет поддерживать их в стадии логарифмического роста, что препятствует дифференцировке и повышает пролиферативный потенциал. Применение в качестве дезагрегирующего агента смеси содержащей 0,1% коллагеназы 2 типа и 0,15% коллагеназы 4 типа, приготовленной на среде DMEM\ F12 в соотношении 1:1 повышает выход и жизнеспособность клеток (табл. 1)

Способ получения биобезопасной культуры мезенхимальных стволовых клеток из Вартонова студня пуповины человека, включающий в себя выделение из ткани пуповины после операции «кесарево сечение» первичной культуры мезенхимальных стволовых клеток из Вартонова студня, причем при выделении мезенхимальных стволовых клеток пуповину освобождают от остатков крови и промывают в растворе Версена с добавлением антибиотиков 100 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере, вены канюлируют с обеих сторон и промывают физиологическим раствором (0,9%), затем осуществляют механическое и ферментативное воздействие на ткани пуповины и собирают отделившиеся клетки, отличающийся тем, что дезагрегацию ткани проводят раствором, содержащим 0,1% коллагеназы 2 типа и 0,15% коллагеназы 4 типа, приготовленным на среде DMEM/F12 в соотношении 1:1, инкубируют при 37°С в течение 30 мин, собирают отделившиеся клетки, центрифугируют при 800 об/мин в течение 15 мин, получая осадок клеток, который ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 100 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, ресуспендируют осадок клеток в ростовой среде DMEM/F12 в соотношении 1:1, переносят в культуральные флаконы и культивируют в атмосфере, содержащей 5% СO₂ до формирования 3/4 монослоя, меняя ростовую среду 3 раза в неделю, и при достижении 3/4 монослоя клетки пересевают, получая культуру МСК, причем после 1 пассажа часть клеток используют для выявления наличия в культуре вирусов СПИД, гепатита В и С и микоплазмы методом ПЦР и в случае позитивного анализа на эти инфекции культура бракуется.