Комбинированный пробиотический препарат на основе спорообразующих бактерий рода bacillus (варианты) для использования в животноводстве, способ его производства (варианты) и штамм bacillus subtilis (natto), используемый в качестве добавки к препарату

Предложена группа изобретений, относящаяся к биотехнологии и кормопроизводству в сельском хозяйстве. Предложены: комбинированный пробиотический препарат для использования в животноводстве (варианты), способ получения для каждого из вариантов препарата, штамм Bacillus subtilis (natto) ВКМ В-3057D, используемый в качестве добавки в составе одного из вариантов препарата. Предложенный пробиотический препарат (варианты) содержит смесь биомассы штаммов Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis в споровой форме, целевые добавки и наполнитель – сухую молочную сыворотку в определенных количествах, кроме того, содержит добавки. В одном варианте препарата содержатся клетки Bacillus subtilis (natto) ВКМ В-3057D и глюконат кальция в определенных соотношениях, в другом - ферментный препарат «Кемзайм Плюс» в определенном количестве. Способы получения вариантов препарата включают раздельное культивирование указанных штаммов, концентрирование культуральных жидкостей, сушку концентратов и введение вышеуказанных добавок в сухой концентрат до содержания в готовом препарате жизнеспособных бактерий не менее 5х10⁹. Группа изобретений обеспечивает получение препарата, который повышает эффективность профилактики и лечения животных, противомикробную защиту их организма при одновременном повышении конверсии корма. 5 н. и 2 з.п. ф–лы, 6 табл., 8 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к технологии получения комбинированных пробиотических препаратов для использования в составе комбикормов и премиксов в животноводстве.

Известно большое число пробиотических препаратов для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека и животных (ЕР 0097484, ЕР 0043962, US 4289888, RU 2528859, RU 2437563, RU 2493723). Такие препараты, обычно, содержат клетки бактерий, остатки культуральной жидкости (КЖ), жиры, белки, лактозу и различные добавки. Технология их получения включает в себя, как правило, подготовку раствора или взвеси биомассы микроорганизмов, введение в нее специальных добавок, сублимационное высушивание и получение готового продукта. Условия процесса и состав композиций определяются особенностями используемых микроорганизмов и характером поставленной задачи.

В настоящее время одним из перспективных направлений для обеспечения оздоровляющего воздействия пробиотиков на ЖКТ является применение препаратов, содержащих несколько штаммов микроорганизмов, обладающих синергетическим действием (RU 2506810, CN 20131206325, RU 2326692, RU 20040108554).

Обычно осуществляют раздельное глубинное культивирование штаммов с получением жидких культур. Затем проводят концентрирование жидких культур с последующим высушиванием полученной биомассы. Недостатком препаратов являются их недостаточная эффективность в отношении повышения резистентности организма к неблагоприятным условиям внешней среды, недостаточная термоустойчивость, относительно узкий спектр воздействия на организм. Наиболее близким по технической сущности к заявляемой группе изобретений является препарат для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний, содержащий клетки штаммов Bacillus subtilis ВКПМ В--2287 D и Bacillus licheniformis ВКПМ B-2414D в споровой форме с титром не менее 3×10⁹ спор/г, а также наполнитель (RU 2432393). Препарат характеризуется высокой антагонистической активностью, однако, в его состав входят живые микроорганизмы, чувствительные к антибиотикам, что приводит к сужению сферы его применения.

Задачей, стоявшей перед авторами, являлось создание нового комбинированного препарата с повышенной эффективностью на основе симбиотических культур, имеющего более выраженную гидрозил-гидролазную (целлюлолитическую) и антагонистическую активность в отношении болезнетворных микроорганизмов, способного храниться в широком диапазоне потребительских температур. Кроме этого, авторы ставили задачу по увеличению усвояемости животными кальция, необходимого при росте молодых животных и периоде лактации. Для решения поставленной задачи авторы использовали новые штаммы бактерий Bacillus subtilis ВКМ-B-2998D (полученный из штамма Bacillus subtilis ВКПМ В-314) и Bacillus licheniformis ВКМ-B-2999D (полученный из штамма Bacillus licheniformis ВКПМ В-8054).

1. Bacillus subtilis (сенная палочка) является антагонистом патогенных и условно- патогенных микроорганизмов, таких как сальмонелла, протей, стафилококки, стрептококки, дрожжевые грибки; продуцирует ферменты, удаляющие продукты гнилостного распада тканей, восстанавливает численность популяций лакто- и бифидобактерий, кишечной палочки и других микроорганизмов, составляющих нормофлору желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и обеспечивающих его нормальное функционирование; синтезирует аминокислоты, витамины и иммуноактивные вещества.

С помощью ненаправленного многоступенчатого УФ мутагенеза и селекции из штамма Bacillus subtilis ВКПМ В-314 был получен штамм Bacillus subtilis с индексом FL 31-14 (депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Скрябина РАН под номером ВКМ-B-2998D) обладающий высокой антагонистической и гликозил-гидролазной (целлюлолитической) активностью, который использовали при создании нового комплексного препарата.

2. Bacillus licheniformis продуцирует ряд белков, пептидов, ферментов и витаминов, способствует выработке организмом интерферона, которые уничтожают патогенные микробы и вирусы, приводя к нормализации микрофлоры кишечника, способствуют перевариванию пищи, снимают пищевые и химические отравления.

С помощью ненаправленного многоступенчатого УФ мутагенеза и селекции из штамма Bacillus licheniformis ВКПМВ-8054 был получен штамм Bacillus licheniformis с индексом FL 17-11 (депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Скрябина РАН под номером ВКМ-B-2999D), обладающий всеми перечисленными выше свойствами и отличающийся от исходного штамма устойчивостью к действию антибиотика вирджиниамицина, широко используемого в ветеринарии. Эти свойства позволили использовать его при создании нового комплексного препарата.

Добавки

1. Кальция глюконат - кристаллический порошок белого цвета хорошо растворим в воде.

Фармакологическое действие.

Восполняет дефицит кальция в организме - вещества, необходимого для формирования костной ткани, сокращения гладких, скелетных мышц, передачи нервных импульсов, деятельности миокарда, свертывания крови. Является источником органического кальция, который усваивается организмом лучше, чем кальций, входящий в состав неорганических солей.

2. Для улучшения усвояемости кальция и расширения спектра антагонистической активности целевого пробиотика авторами была использована культура Bacillus subtilis natto, которая синтезирует в процессе ферментации различные ферменты, витамины, аминокислоты и другие питательные вещества. Главным уникальным компонентом является поли (γ-глутаминовая кислота), которая обладает целым комплексом полезных свойств, а именно:

увеличивает растворимость кальция в толстом кишечнике, тем самым увеличивая

эффективность усвоения кальция;

снижает уровень холестерина в сыворотке крови;

действует как антиокислитель;

обладает фибринолитической активностью.

Штамм Bacillus subtilis (natto) также продуцирует суфрацин - вещество, действующее на Candida albicans.

С помощью ненаправленного многоступенчатого УФ мутагенеза и селекции из штамма Bacillus subtilis (natto) ВКПМ В-12079 был получен штамм Bacillus subtilis (natto) с индексом FL-7, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Скрябина РАН под номером BKM-B-3057D, обладающий всеми перечисленными выше свойствами и отличающийся от исходного штамма увеличенной антагонистической активностью в отношении Candida albicans, что позволило с успехом использовать его при создании нового комплексного препарата.

3. Ферментный препарат - Кемзайм Плюс представляет собой сыпучий порошок светло-серого цвета, не растворимый в воде. Кемзайм Плюс содержит комплекс ферментов (ксиланазу, β-глюканазу, целлюлазу, протеазу), а также вспомогательные вещества - известняк (73-83%), бентонит-монтмориллонит (3-7%), растительное масло (0,5-1,5%) Добавка не содержит генно-модифицированных продуктов и организмов.

Бактерии Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis не являются элементами нормофлоры в микробных сообществах человека и животных, но обладают свойствами, которые обеспечивают организму возможность поддерживать состояние микрофлоры на уровне экологически естественного. Они оптимизируют обмен веществ и улучшают снабжение организма биологически активными и строительными веществами, обеспечивают качественное переваривание пищи, оказывают антигистаминное и антитоксическое действие, существенно повышая неспецифическую резистентность организма.

Технический результат был достигнут созданием группы изобретений, включающей в себя:

1. Штаммы Bacillus subtilis ВКМ B-2998D) и Bacillus licheniformis ВКМ B-2999D) Bacillus subtilis (natto) ВКМ-B-3057D в споровой форме;

2. Препарат состава 1, включающий в себя смесь (1:1) штаммов Bacillus subtilis ВКМ-B-2998D и Bacillus licheniformis ВКМ-B-2999D в споровой форме, а также добавки: штамм Bacillus subtilis (natto) ВКМ B-3057D и глюконат кальция.

3. Препарат состава 2, включающий в себя смесь (1:1) штаммов Bacillus subtilis ВКМ-B-2998D и Bacillus licheniformis ВКМ-B-2999D в споровой форме, а также добавку ферментного препарата Кемзайм Плюс.

4. Способ получения препарата состава 1, включающий получение штаммов бактерий Bacillus subtilis ВКМ-B-2998D, Bacillus licheniformis ВКМ-B-2999D и штамма Bacillus subtilis (natto) ВКМ B-3057D, последующее раздельное культивирование этих штаммов на мелассно-кукурузной среде при рН 6,8-7,0, концентрирование культуральных жидкостей, сушку, смешивание полученной биомассы штаммов ВКМ-B-2998D и ВКМ-B-2999D в споровой форме между собой в соотношении 1:1 и затем с биомассой штамма Bacillus subtilis (natto) ВКМ В- 3057D в количестве 0.15% от массы препарата и глюконатом кальция в количестве 0,1 мас. % от массы препарата с последующей добавкой сухой молочной сыворотки до 100% массы препарата (приводящей к получению препарата с содержанием живых микроорганизмов не менее 5×10⁹ спор/г).

5. Способ получения препарата состава 2, включающий получение штаммов бактерий Bacillus subtilis ВКМ-B-2998D и Bacillus licheniformis ВКМ-B-2999D, последующее раздельное культивирование этих штаммов на мелассно-кукурузной среде при рН 6,8-7,0, концентрирование культуральных жидкостей, сушку, смешивание полученной биомассы штаммов ВКМ-B-2998D и ВКМ-B-2999D в споровой форме между собой в соотношении 1:1 и затем с ферментным препаратом Кемзайм Плюс в количестве 5% от массы препарата с последующей добавкой сухой молочной сыворотки до 100% массы препарата, приводящей к получению препарата с содержанием живых микроорганизмов не менее 5×10⁹ спор/г.

Важными свойствами нового комбинированного спорового пробиотика являются:

- широкий спектр действия по отношению к патогенным бактериям;

- повышенное содержание кальция;

- обеспечение условий для эффективного усвоения кальция;

- повышенная усвояемость клетчатки;

- термостабильность;

- высокое качество при хранении;

- экологическая безопасность;

- удобство в применении (как в составе комбикорма, так и при выпойке молоком, в составе заменителей).

Новый комбинированный препарат содержит штаммы (Bacillus subtilis ВКМ B-2998D и Bacillus licheniformis ВКМ-B-2999D), добавки -штамм Bacillus subtilis (natto) ВКМ B-3057D, кальция глюконат и вспомогательное вещество-наполнитель (сухую молочную сыворотку) (состав 1) или ферментный препарат Кемзайм Плюс (в качестве добавки) (состав 2) и отличается тем, что по составу №1 массовое соотношение (%) смеси штаммов Bacillus subtilis ВКМ B-2998D, Bacillus licheniformis ВКМ-B-2999D и культуры Bacillus subtilis (natto) ВКМ B-3057D, кальция глюконата и наполнителя составляет 0,35:0,15:0,1:99,4 с содержанием жизнеспособных спор не менее 5×10⁹ КОЕ/грамм (колониеобразующих единиц), а по составу 2 соотношение массы (%) смеси штаммов Bacillus subtilis ВКМ B-2998D и Bacillus licheniformis ВКМ-B-2999D, ферментного препарата - Кемзайм Плюс и наполнителя составляет 0,5:5,0:94,5 с содержанием жизнеспособных спор не менее 5×10⁹ КОЕ/грамм.

Практическое применение.

Новый препарат может использоваться как в сухой, так и в жидкой формах путем введения в корм или питье. Количество скармливаемых препаратов (по составу 1 и составу 2) было одинаковым и составляло 1 г/гол./сут. с молоком для телят до 1 мес. возраста + 0,5 кг/т комбикорма в составе комбикорма. В результате проведенных комплексных исследований было установлено, что использование препаратов при выпойке телят и в составе комбикормов-стартеров способствовало увеличению среднесуточных приростов живой массы на 5,9 и 8,5%, соответственно, повышению переваримости питательных веществ, снижению затрат кормов на единицу прироста.

Применение нового препарата для коров в период лактации в количестве 1,0 кг/т комбикорма (для состава 1 и состава 2) способствовало увеличению среднесуточных удоев 4%-ного молока на 11,1 и 6,8%, соответственно, повышению переваримости питательных веществ, снижению затрат кормов на единицу произведенной продукции.

Заключение по исследованию продуктивности поросят: результаты выращивания свиней с 1 до 105-дневного возраста показали эффективность использования исследуемых препаратов при выпойке поросят-подсосков (0-45 дней), а также возможность включения их в состав комбикормов для поросят в период доращивания (45-105 дней) в составе комбикорма-стартера.

Исследования крови поросят показало, что во всех опытных группах наблюдается статистически значимое увеличение количества эритроцитов по сравнению с контролем. Во всех группах эти показатели не выходили за рамки физиологической нормы. Тем не менее, достоверное увеличение количества эритроцитов говорит о потенциально высокой резистентности организмов животных опытных групп.

Заключение по исследованию кала: На основании результатов исследования, можно сделать вывод, что процесс пищеварения и усвояемости пищевых веществ в организме животных опытной группы, протекают более интенсивно, степень перевариваемости выше, что отразилось в итоге на приросте живой массы животных.

В результате проведенных исследований было показано, что препарат повышает эффективность профилактики и лечения животных, сочетает противомикробную защиту организма со стимулирующим воздействием на него, при одновременном увеличении конверсии корма с высоким содержанием клетчатки и кальция и расширяет ассортимент лечебно-профилактических препаратов природного происхождения.

Сущность заявляемой группы изобретений иллюстрируются, но не ограничивается следующими примерами.

Пример 1.

Получение штамма Bacillus subtilis ВКМ B-2998D.

С помощью ненаправленного многоступенчатого УФ мутагенеза и селекции из штамма Bacillus subtilis ВКПМ В-314 был получен новый штамм Bacillus subtilis ВКМ B-2998D, обладающий высокой антагонистической и гликозил-гидролазной (целлюлолитической) активностью, который использовали при создании нового комплексного препарата.

УФ мутагенез. Водную суспензию спор помещали на расстояние 40 см от УФ лампы (Mineralight, мощность 12,5 Вт с длиной волны 254 нм), при этом интенсивность излучения лампы составляла 0,25 мВт/см². Смыв с поверхности агаризованной среды фильтровали через стерильный ватный фильтр или через фильтровальную воронку Шотта (размер пор 100 мкм). В полученной суспензии при помощи камеры Горяева-Тома подсчитывали концентрацию спор. При необходимости суспензию разводили до концентрации (1,5-2)*10⁶ спор/см³. После подсчета и разведения суспензия подвергалась облучению в открытой чашке Петри. Посев производили на предварительно подготовленные чашки Петри с агаром, содержащим микрокристаллическую целлюлозу (МКЦ) или карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ) в составе, %: NaNO₃ - 0,2; K₂HPO₄ - 0,1; MgSO₄ - 0,05; KCl - 0,05; МКЦ (КМЦ) - 1,0; пептон - 0,02; агар - 2,0. Чашки инкубировали при температуре 37°C в течение суток.

Скрининг и отбор изолированных колоний. На первом этапе были построены кривые выживаемости колоний В. subtilis в зависимости от дозы облучения, а также определена зависимость частоты возникновения морфологических мутаций от дозы облучения. С учетом этих данных была определена оптимальная доза облучения, дающая максимальное число мутаций и в то же время обеспечивающая определенную степень выживаемости изолированных колоний. Степень выживаемости изолятов определяли по соотношению выросших колоний в необлученном контроле и после УФ-облучения. Колонии с измененной морфологией визуально отбирали и пересевали на свежую агаризованную среду. После инкубирования чашки Петри с выросшими изолированными культурами окрашивали водным раствором Люголя. Предварительно приготовленный раствор Люголя (KI - 2 гр, I - 1 гр, 300 мл дист. воды) в количестве 20-25 мл наливали в чашки Петри, оставляли на 3-5 минут, затем чашки осушали. Отбор полученных штаммов осуществляли по наличию и величине зон просветления на агаре. В результате был отобран штамм с индексом FL 31-14, дающий максимальную величину зоны просветления.

Идентификация полученного штамма FL 31-14. Для проведения полимеразной цепной реакции и дальнейшего секвенирования ПЦР-фрагментов гена 16SpPHK были использованы универсальные праймерные системы, позволяющие детектировать как эубактерии (11f-1492r), так и археи (8fa-A915R). Объем амплификационной смеси составлял 50 мкл и имел следующий состав: 1^х буфер ДНК полимеразы BioTaq (17 мМ (NH4)₂SO₄, 67 мMTris-HCl, рН 8.8, 2 мМMgCl₂); по 12.5 нмоль каждого из dNTP, 50 нг ДНК-матрицы; по 5 пмоль соответствующих праймеров и 3 ед. ДНК полимеразы BioTaq (Диалат ЛТД, Россия). Температурно-временной профиль ПЦР был следующим: первый цикл - 94°C × 9 мин, 55°C × 1 мин, 72° × 2 мин; последующие 30 циклов - 94°C × 1 мин, 55°C × 1 мин, 72°C × 2 мин; завершающий цикл - 72°C × 7 мин.

Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 2% геле агарозы при напряженности электрического поля 6 В/см.

Выделение и очистку продуктов ПЦР проводили из легкоплавкой агарозы с применением набора реактивов WizardPCRPreps (Promega, США), согласно рекомендациям производителя.

Секвенирование полученных ПЦР-фрагментов генов, кодирующих 16SpPHK, проводили по методу Сэнгера с соавт. с помощью набора реактивов BigDyeTerminatorv.3.1 (Applied Biosystems, Inc., USA) на генетическом анализаторе ABIPRIZM 3730 (Applied Biosystems, Inc., USA) согласно инструкциям производителя. При этом для секвенирования использовали праймеры и чтение проводили в двух направлениях.

По данным RDPClassifier, исследованный штамм с индексом FL-31-14 принадлежит к представителям рода Bacillus subtilis на уровне сходства нуклеотидных последовательностей генов 16SpPHK 95%

Первичный анализ сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изучаемого штамма проводили с помощью программного пакета BLAST. Согласно данным BLAST - анализа, ближайшими последовательностями генов 16SpPHK были последовательности, представленные в (см. Таблице 1)

Культурально-морфологические признаки. Полученный штамм Bacillus subtilis с индексом FL-31-14 имеет клетки-палочки с закругленными концами, расположенные одиночно, парами. Колонии белые, матовые, с неровным краем. Образуют анаэробно споры овальной формы, которые располагаются в клетки центрально. Окраска по Грамму - грамположительная. Штамм хорошо растет на мясо-пептонном агаре (МПА), БТН-агаре, а также на среде Гаузе №2, образуя матовые колонии кремоватого цвета с неровными краями.

Физиолого-биохимические признаки. Штамм Bacillus subtilis с индексом FL-31-14 ферментирует лактозу, глюкозу, арабинозу, ксилозу с образованием кислоты без газа. Редуцирует нитраты, обеспечивает метиленовую синь. Коагулазной, гиалуронидазной, лецитазной активностью не обладает. Обладает высокой гликозил-гидролазной (целлюлолитической) и антогонистической активностью. Культуру поддерживают на среде Гузе №2 следующего состава, %: триптон - 0,3; мясной пептон - 0,5; глюкоза - 1,0; натрий хлористый - 0,05; агар - 2,0, с пересевом не реже 1 раза в месяц, хранят на МПА и Гаузе №2. Оптимальная температура роста - 37°C, рН - 7,0.

Состав среды: LB-среда, %: триптон - 1; дрожжевой экстракт - 0,5; NaCl -1.

Отобранный в результате УФ мутагенеза и селекции штамм Bacillus subtilis с индексом FL-31-14 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Скрябина РАН под номером ВКМ-B-2998D.

Пример 2.

Получение штамма Bacillus licheniformis ВКМ B-2999D

С помощью ненаправленного многоступенчатого УФ мутагенеза и селекции из штамма Bacillus licheniformis ВКПМ В-8054 был получен новый штамм Bacillus licheniformis ВКМ B-2999D, устойчивый к действию антибиотика вирджиниамицина, (используемого в ветеринарии), который в дальнейшем использовали при получении нового комплексного препарата.

УФ мутагенез. Водную суспензию спор помещали на расстояние 40 см от УФ лампы (Mineralight, мощность 12,5 Вт с длиной волны 254 нм), при этом интенсивность излучения лампы составляла 0,25 мВт/см². Смыв с поверхности агаризованной среды фильтровали через стерильный ватный фильтр или через фильтровальную воронку Шотта (размер пор 100 мкм). В полученной суспензии при помощи камеры Горяева-Тома подсчитывали концентрацию спор. При необходимости суспензию разводили до концентрации (1,5-2)*10⁶ спор/см³. После подсчета и разведения суспензия подвергалась облучению в открытой чашке Петри. Посев производили на предварительно подготовленные чашки Петри со средой БТН, состава, %: мясной пептон - 2,0; дрожжевой экстр. - 0,3; NaCl - 0,5; агар - 2,0. Чашки инкубировали при температуре 37°С в течение суток. Скрининг и отбор изолированных колоний. На первом этапе были построены кривые выживаемости колоний В. licheniformis в зависимости от дозы облучения, а также определена зависимость частоты возникновения морфологических мутаций от дозы облучения. С учетом этих данных была определена оптимальная доза облучения, дающая максимальное число мутаций и в то же время обеспечивающая определенную степень выживаемости колоний. Степень выживаемости колоний определяли по соотношению выросших колоний в необлученном контроле и после УФ-облучения. Колонии с измененной морфологией визуально отбирали и пересевали на свежую агаризованную среду, содержащую сублетальную для исходного штамма дозу вирджиниамицина (1000 мкг/мл). Выросшие на такой среде наиболее крупные изолированные колонии отбирали для дальнейшего культивирования на среде, содержащей различные концентрации вирджиниамицина. В результате был отобран штамм с индексом FL-17-11, устойчивый к антибиотику вирджиниамицину в минимально ингибирующей концентрации >1000 мкг/мл.

Идентификация полученного штамма с индексом FL-17-11. Для проведения полимеразной цепной реакции и дальнейшего секвенирования ПЦР-фрагментов гена 16SpPHK были использованы универсальные праймерные системы, позволяющие детектировать как эубактерии (11f-1492r), так и археи (8fa-A915R). Объем амплификационной смеси составлял 50 мкл и имел следующий состав: 1^х буфер ДНК полимеразы BioTaq (17 мМ (NH₄)₂SO₄, 67 мМTris-HCl, рН 8.8, 2 мМMgCl₂); по 12.5 нмоль каждого из dNTP, 50 нг ДНК-матрицы; по 5 пмоль соответствующих праймеров и 3 ед. ДНК полимеразы BioTaq (Диалат ЛТД, Россия). Температурно-временной профиль ПНР был следующим: первый цикл - 94°С × 9 мин, 55°С × 1 мин, 72°С × 2 мин; последующие 30 циклов - 94°С × 1 мин, 55°С × 1 мин, 72°С × 2 мин; завершающий цикл - 72°С × 7 мин.

Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 2% геле агарозы при напряженности электрического поля 6 В/см.

Выделение и очистку продуктов ПЦР проводили из легкоплавкой агарозы с применением набора реактивов WizardPCRPreps (Promega, США), согласно рекомендациям производителя.

Секвенирование полученных ПЦР-фрагментов генов, кодирующих 16SpPHK, проводили по методу Сэнгера с соавт. с помощью набора реактивов BigDyeTerminatorv.3.1 (Applied Biosystems, Inc., US А) на генетическом анализаторе ABIPRIZM 3730 (Applied Biosystems, Inc., USA) согласно инструкциям производителя. При этом для секвенирования использовали праймеры и чтение проводили в двух направлениях.

Первичный анализ сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изучаемого штамма проводили с помощью программного пакета BLAST. Согласно данным BLAST - анализа, ближайшими последовательностями генов 16SpPHK были следующие последовательности, (см. Таблицу 2)

По данным RDPClassifier, исследованный штамм с индексом FL-17-11, полученный из штамма Bacillus licheniformis ВКПМ В-8054, принадлежит к представителям рода Bacillus licheniformis на уровне сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК95%.

Культурально-морфологические признаки. Штамм Bacillus licheniformis с индексом FL-17-11 имеет клетки прямые, палочковидные, длиной 2-3 мкм, подвижные. Образуют анаэробно споры овальной формы, которые располагаются в клетки центрально. Окраска по Грамму - грамположительная. Штамм хорошо растет на мясо-пептонном агаре (МПА), сусло-агаре, БТН-агаре и среде Гаузе №2 образуя матовые гладкие колонии белого цвета с неровными краями.

Физиолого-биохимические признаки. Ферментирует лактозу, глюкозу, арабинозу, ксилозу с образованием кислоты без газа. Редуцирует нитраты, обеспечивает метиленовую синь. Коагулазной, гиалуронидазной, лецитазной, целлюлолитической активностью не обладает, устойчив к действию антибиотика вирджиниамицина. Культуру поддерживают на БТН-агаре следующего состава %: пептон - 2,0; дрожжевой экстр. - 0,3; NaCl - 0,5; агар - 2,0; с пересевом не реже 1 раза в месяц, хранят на среде Гаузе №2 и БТН-агаре.

Оптимальная температура роста - 37°С, рН - 7,0. Состав среды: LB-среда, %: триптон - 1; дрожжевой экстракт - 0,5; NaCl -1.

Отобранный в результате УФ мутагенеза и селекции штамм Bacillus licheniformis с индексом 17-11 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Скрябина РАН под номером ВКМ-B-2999D.

Пример 3.

Получение штамма Bacillus subtilis (natto) BKM-B-3057D

С помощью ненаправленного многоступенчатого УФ мутагенеза и селекции из штамма Bacillus subtilis (natto) ВКПМ В-12079 был получен новый штамм Bacillus subtilis (natto) ВКМ -B-3057D, обладающий всеми свойствами характерными для исходного штамма и отличающийся от него увеличенной антагонистической активностью в отношении Candida albicans.

УФ мутагенез. Водную суспензию спор помещали на расстояние 40 см от УФ лампы (Mineralight, мощность 12,5 Вт с длиной волны 254 нм), при этом интенсивность излучения лампы составляла 0,25 мВт/см². Смыв с поверхности агаризованной среды фильтровали через стерильный ватный фильтр или через фильтровальную воронку Шотта (размер пор 100 мкм). В полученной суспензии при помощи камеры Горяева-Тома подсчитывали концентрацию спор. При необходимости суспензию разводили до концентрации (1,5-2)*10⁶ спор/см³. После подсчета и разведения суспензия подвергалась облучению в открытой чашке Петри. Посев производили на предварительно подготовленные чашки Петри с агаром, содержащим микрокристаллическую целлюлозу (МКЦ) или карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ) в составе, %: NaNO₃ - 0,2; K₂HPO₄ - 0,1; MgSO₄ - 0,05; KCl - 0,05; МКЦ (КМЦ) - 1,0; пептон - 0,02; агар - 2,0. Чашки инкубировали при температуре 37°С в течение суток.

Скрининг и отбор изолированных колоний. На первом этапе были построены кривые выживаемости колоний В. subtilis (natto) в зависимости от дозы облучения, а также определена зависимость частоты возникновения морфологических мутаций от дозы облучения. С учетом этих данных была определена оптимальная доза облучения, дающая максимальное число мутаций и в то же время обеспечивающая определенную степень выживаемости колоний. Степень выживаемости колоний определяли по соотношению выросших колоний в необлученном контроле и после УФ-облучения. Колонии с измененной морфологией визуально отбирали и пересевали на свежую агаризованную среду. После инкубирования чашки Петри с выросшими изолированными колониями использовали для выявления наибольшей антагонистической активности по отношению к тест-культуре Candida albicans АТСС10231 методом отсроченного антагонизма [ОФС.1.7.2.0009.15 Определение специфической активности пробиотиков, раздел 3 Фармакопея 13]. Отбор штаммов осуществляли по наличию максимальной зоны подавления роста тест-культуры Candida albicans АТСС10231. В результате был отобран штамм с индексом FL 7, дающий максимальную величину зоны подавления роста на уровне 25 мм.

Идентификация изолированного штамма с индексом FL 7 Для проведения полимеразной цепной реакции и дальнейшего секвенирования ПЦР-фрагментов гена 16SpPHK были использованы универсальные праймерные системы, позволяющие детектировать как эубактерии (11f-1492r), так и археи (8fa-A915R). Объем амплификационной смеси составлял 50 мкл и имел следующий состав: 1^х буфер ДНК полимеразы BioTaq (17 мМ (NH₄)₂SO₄, 67 мМTris-HCl, рН 8.8, 2 мМMgCl₂); по 12.5 нмоль каждого из dNTP, 50 нг ДНК-матрицы; по 5 пмоль соответствующих праймеров и 3 ед. ДНК полимеразы BioTaq (Диалат ЛТД, Россия).

Температурно-временной профиль ПНР был следующим: первый цикл - 94°С × 9 мин, 55°С × 1 мин, 72°С × 2 мин; последующие 30 циклов - 94°С × 1 мин, 55°С × 1 мин, 72°С × 2 мин; завершающий цикл - 72°С × 7 мин.

Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 2% геле агарозы при напряженности электрического поля 6 В/см.

Выделение и очистку продуктов ПЦР проводили из легкоплавкой агарозы с применением набора реактивов WizardPCRPreps (Promega, США), согласно рекомендациям производителя.

Секвенирование полученных ПЦР-фрагментов генов, кодирующих 16SpPHK, проводили по методу Сэнгера с соавт. с помощью набора реактивов BigDyeTerminatorv.3.1 (Applied Biosystems, Inc., USA) на генетическом анализаторе ABIPRIZM 3730 (Applied Biosystems, Inc.,USA) согласно инструкциям производителя. При этом для секвенирования использовали праймеры и чтение проводили в двух направлениях.

Первичный анализ сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изучаемых штаммов проводили с помощью программного пакета BLAST. Согласно данным BLAST - анализа, ближайшими последовательностями генов 16SpPHK были следующие последовательности (см. Таблицу 3)

По данным RDPClassifier, исследованный штамм с индексом FL-7, принадлежит к представителям рода Bacillus subtilis на уровне сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК 95%.

ХАРАКТЕРНЫЕ ПРИЗНАКИ:

I. Культурально-морфологические и микроскопические особенности штамма Bacillus subtilis (natto) с индексом FL-7.

Клетки культуры имеют вид палочек с закругленными концами, расположенные одиночно, парами. Споры овальные, не превышающие размер клетки, расположены центрально. Окраска по Грамму - грамположительная. На мясо-пептонном агаре (МПА), БТН-агаре, а также на среде Гаузе №2, образует матовые колонии кремоватого цвета с неровными краями.

II. Физиолого-биохимические свойства. Хорошо растет в интервале температур от 30 до 45°С. Минимальная температура 10°С, максимальная 50°С. Растет в интервале рН от 4,5 до 9,0, оптимально - при рН 7,5. При сбраживании сахаров газа не образует. Гидролизует крахмал. Реакция Фогес-Проскауэра (образование ацетилметилкарбинола) положительная. Индол не образует.Дезаминирование фенилаланина не происходит.Разлагает тирозин и использует цитрат. Проявляет гемолитическую активность - β гемолиз, Обладает значительной антагонистической активностью в отношении Candida albicans.

Условия хранения:

Культуру поддерживают пересевом не реже 1 раза в месяц, хранят на МПА и Гаузе №2. Культура хорошо хранится при замораживании (-70°С) в 40% глицерине, в лиофилизированном состоянии (защитная среда - обезжиренное молоко).

Отобранный штамм Bacillus subtilis (natto) с индексом FL-7 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Скрябина РАН под номером ВКМ-B-3057D.

Пример 4

Получение сухой биомассы штаммов В. subtilis ВКМ B-2998D и В. licheniformis BKMB-2999D.

Штаммы В. subtilis ВКМ B-2998D и В. licheniformis ВКМ B-2999D культивируются раздельно в ферментере с мелассно-кукурузной средой:

Среда для культивирования Bacillus subtilis ВКМ B-2998D в 1 дм³

Меласса - 25 г

Кукурузный экстракт -12,5 г

CaCl₂ - 1 г

MgSO₄ - 0,25 г

MnSO₄ - 0.03 г

CoCl₂ - 0.046 г

FeSO₄ - 0.001 г

CuSO₄ - 0.001 г

пеногаситель - 0,5 см³

вода водопроводная - до 1 дм³

Среда для культивирования Bacillus licheniformis ВКМ B-2999D в 1 дм³

Меласса - 33 г

Кукурузный экстракт -17,5 г

CaCl₂ - 1 г

MgSO₄ - 0,25 г

MnSO₄ - 0.03 г

CoCl₂ - 0.046 г

FeSO₄ - 0.001 г

CuSO₄ - 0.001 г

пеногаситель - 0,5 см³

вода водопроводная - до 1 дм³.

Ферментацию проводят при рН 6,8-6,9 и температуре 37°С, расходе воздуха (100- 150) дм³ в минуту, скорости перемешивания 50-200 об/мин; pO₂ - 30-50% в фазе интенсивного роста культуры. Продолжительность процесса ферментации 18-22 часа.

Процесс считается законченным, если концентрация клеток в споровой форме составляет 93-95%

По окончании инкубации штаммов В. subtilis ВКМ B-2998D и В. licheniformis ВКМ B-2999D культуральную жидкость концентрируют на высокоскоростной центрифуге с периодической выгрузкой концентрата. Центрифугирование культуральной жидкости проводят при скорости вращения ротора - 15000 об/мин. Скорость подачи культуральной жидкости 130-150 л³/ч. Содержание сухих веществ в полученном концентрате биомассы - 35-40%).

По окончании центрифугирования концентраты биомассы штаммов В. subtilis ВКМ B-2998D и В. licheniformis ВКМ B-2999D подвергают распылительной сушке.

Режимы сушки: Температура на входе в сушильную камеру - 130-135°С; Температура на выходе из сушильной камеры - 80-84°С.

Высушенная биомасса содержит не более 5% влаги, выход в расчете на культуральную жидкость 65-66,5%. Содержание жизнеспособных спор Bacillus subtilus ВКМ B-2998D и Bacillus licheniformis ВКМ B-2999D -не менее 1,0×10¹² КОЕ/г.

Пример 5

Получение целевого продукта состава 2

Для получения целевого продукта состава 2 с содержанием жизнеспособных спор штаммов Bacillus subtilus ВКМ B-2998D и Bacillus licheniformis ВКМ B-2999D 5×10⁹ КОЕ/г используют смеситель периодического действия.

В смеситель, вносят сухие концентраты биомассы штаммов Bacillus subtilus ВКМ B-2998D и Bacillus licheniformis ВКМ B-2999D в количестве 125 г каждой культуры и тщательно перемешивают в течение 10 мин., затем добавляют 2500,0 г комплексного ферментного препарата - Кемзайм Плюс и вновь перемешивают в течение 20 мин. После этого загружают 50 кг сухой молочной сыворотки, перемешивают еще 30 минут и получают целевой продукт.

Пример 6.

Получение сухой биомассы штамма Bacillus subtilis (natto) ВКМВ-3057D

Среда для культивирования Bacillus subtilus (natto) ВКМ B-3057D в 1 дм³

Меласса - 25 г

Кукурузный экстракт -12,5 г

Дрожжевой экстракт - 1 г

Триптон - 0,3 г

CaCl₂ - 1 г

MgSO₄ - 0,25 г

MnSO₄ - 0.03 г

CoCl₂ - 0.046 г

FeSO₄ - 0.001 г

CuSO₄ - 0.001 г

пеногаситель - 0,5 см³

вода водопроводная - до 1 дм³.

Ферментацию проводят при рН 6,8-6,9 и температуре 37°С, расходе воздуха 100-200 дм³ в минуту, скорости перемешивания 50-200 об/мин; pO₂ - 30-50% в фазе интенсивного роста культуры. Продолжительность процесса ферментации 20-24 часа.

Процесс считается законченным, если концентрация клеток в споровой форме составляет 93-95%.

По окончании инкубации штамма культуральную жидкость концентрируют на высокоскоростной центрифуге с периодической выгрузкой концентрата.

Центрифугирование культуральной жидкости проводят при скорости вращения ротора - 15000 об/мин. Скорость подачи культуральной жидкости 130-150 л/ч. Содержание сухих веществ в биомассе - 35-40%.

По окончании центрифугирования полученный концентрат биомассы штамма Bacillus subtilis natto ВКМ B-3057D подвергают распылительной сушке.

Режимы сушки: Температура на входе в сушильную камеру - 130-135°С; Температура на выходе из сушильной камеры - 80-84°С.

Высушенная биомасса содержит не более 5% влаги, выход в расчете на культуральную жидкость 60-65%. Содержание жизнеспособных спор в сухой биомассе Bacillus subtilus natto ВКМ B-3057D не менее 1,0×10¹² КОЕ/г.

Пример 7

Получение целевого продукта состава 1

Для получения целевого продукта состава 1 используют смеситель периодического действия.

В смеситель загружают сухие биомассы штаммов Bacillus subtilus ВКМ B-2998D, Bacillus licheniformis ВКМ B-2999D в количестве 87,5 г каждой культуры и перемешивают в течение 10 минут. Затем добавляют сухую биомассу штамма Bacillus subtilis natto ВКМ B-305D в количестве 75 граммов и 50 г глюконата кальция и вновь порошки тщательно перемешивают в течение 20 мин. После этого загружают 50 кг сухой молочной сыворотки, перемешивают еще 30 минут и получают целевой продукт с содержанием жизнеспособных спор на уровне 5×10⁹ КОЕ/г.

Пример 8.

Изучение стабильности нового комплексного пробиотика.

Была изучена стабильность препарата методом естественного хранения при температуре 22±2°С во влагонепроницаемом бумажном пакете с полимерным покрытием.

Полученные результаты приведены в таблице 4.

Как показывают полученные результаты, после хранения препарата при комнатной температуре на протяжении 24 мес. содержание живых микробных клеток остается на высоком уровне.

Результаты проведенных экспериментов показали высокую термостабильность нового препарата. Кратковременное повышение температуры не оказывает существенного влияния на качество препарата.

1. Комбинированный пробиотический препарат для использования в животноводстве, содержащий смесь биомассы штаммов бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis в споровой форме, целевые добавки и наполнитель - сухую молочную сыворотку, отличающийся тем, что он содержит смесь биомассы штаммов бактерий Bacillus subtilis ВКМ-B-2998D, Bacillus licheniformis ВКМ-B-2999D в соотношении 1:1, а в качестве добавок - биомассу штамма Bacillus subtilis (natto) ВКМ B-3057D и глюконат кальция в соотношении ингредиентов, % масс.:

- смесь (1:1) биомассы штаммов (В. subtilis, В. licheniformis) - 0.35,

- биомасса штамма В. subtilis (natto) ВКМ B-3057D - 0.15,

- глюконат кальция - 0.1,

- молочная сыворотка - до 100.

2. Пробиотический препарат по п. 1, отличающийся тем, что количество жизнеспособных бактерий в готовом препарате составляет не менее 5×10⁹ КОЕ/г.

3. Способ получения пробиотического препарата по п. 1, включающий получение штамма Bacillus subtilis (natto) ВКМ B-3057D, последующее раздельное культивирование штаммов Bacillus subtilis ВКМ-B-2998D, Bacillus licheniformis BKM-B-2999D, Bacillus subtilis (natto) ВКМ B-3057D на мелассно-кукурузной среде при рН 6,8-7,0, концентрирование культуральных жидкостей путем центрифугирования с последующей распылительной сушкой полученных концентратов, смешивание полученной сухой биомассы штаммов Bacillus subtilis ВКМ-B-2998D, Bacillus licheniformis ВКМ-B-2999D между собой в соотношении 1:1, а затем с биомассой штамма Bacillus subtilis (natto) ВКМ B-3057D в количестве 0.15% от массы препарата и глюконатом кальция в количестве 0,1 масс. % от массы препарата с последующей добавкой сухой молочной сыворотки до 100% массы препарата, приводящей к получению пробиотика с содержанием жизнеспособных бактерий не менее 5×10⁹ КОЕ/г.

4. Комбинированный пробиотический препарат для использования в животноводстве, содержащий смесь биомассы штаммов бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis в споровой форме, целевую добавку и наполнитель - сухую молочную сыворотку, отличающийся тем, что он содержит смесь биомассы штаммов бактерий Bacillus subtilis ВКМ-B-2998D, Bacillus licheniformis ВКМ-B-2999D в соотношении 1:1 и ферментный препарат «Кемзайм Плюс» в соотношении ингредиентов, % масс.:

- смесь (1:1) биомассы штаммов (В. subtilis, В. licheniformis) - 0,5,

- ферментный препарат «Кемзайм Плюс» - 5,

- молочная сыворотка - до 100.

5. Пробиотический препарат по п. 4, отличающийся тем, что количество жизнеспособных бактерий в готовом препарате составляет не менее 5×10⁹ КОЕ/г.

6. Способ получения пробиотического препарата по п. 4, включающий раздельное культивирование штаммов бактерий Bacillus subtilis ВКМ-В-2998D и Bacillus licheniformis ВКМ-B-2999D на мелассно-кукурузной среде при рН 6,8-7,0, концентрирование культуральных жидкостей путем центрифугирования с последующей распылительной сушкой полученных концентратов, смешивание полученной биомассы штаммов Bacillus subtilis ВКМ-B-2998D и Bacillus licheniformis ВКМ-B-2999D между собой в соотношении 1:1 и затем с ферментным препаратом «Кемзайм Плюс» в количестве 5% от массы препарата с последующей добавкой сухой молочной сыворотки до 100% массы препарата, приводящей к получению пробиотика с содержанием жизнеспособных бактерий не менее 5×10⁹ КОЕ/г.

7. Штамм Bacillus subtilis (natto) ВКМ B-3057D, используемый в качестве добавки к комбинированному пробиотическому препарату по п. 1.