Способ экспресс-оценки криоустойчивости спермы жеребцов
Владельцы патента RU 2675947:
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт коневодства" (RU)
Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к способу экспресс-оценки криоустойчивости спермы жеребцов. Способ включает подготовку дозы спермы к замораживанию - оттаиванию и оценку подвижности спермиев. Для оценки используют мини-дозу спермы - 0,5 мл, которую замораживают в жидком азоте в течение 5 минут. Использование изобретения позволит сократить время общего анализа и обработки результатов. 1 табл.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Изобретение относится к экспресс способам оценки устойчивости спермы жеребцов к замораживанию.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Известны способы оценки устойчивости спермы жеребцов к замораживанию, имеющие высокую корреляцию с ее оплодотворяющей способностью после замораживания-оттаивания и поэтому используемые для прогноза ее криоустойчивости. При этом оценивают подвижность и выживаемость спермиев, целостность мембран, акросом и ферментов после холодового удара, показатели стимуляции дыхания, время редукции метиленового синего или определяют коэффициент осмотической устойчивости (Курбатов, А.Д. Криоконсервация спермы сельскохозяйственных животных [Текст] / А.Д. Курбатов, Е.М. Платов, Н.Б. Корбан, Л.Г. Мороз, В.А. Наук - Л,: Агропромиздат, 1988. - 255 с.; Осташко, Ф.И. Глубокое замораживание и длительное хранение спермы производителей [Текст] / Ф.И. Осташко. - Киев: Урожай, 1978. - 255 с.; Милованов, В.К. Биология воспроизведения и искусственное осеменение животных [Текст] / В.К. Милованов. - М., 1962. - 695 с.)
Наиболее близким к изобретению является способ определения резистентности спермиев жеребцов к холодовому шоку, который позволяет провести относительно быстро оценку спермы перед криоконсервацией (Сперма жеребцов неразбавленная свежеполученная [Текст]: ГОСТ 23681-79. - Введ. 1980-07-01. - М.: Изд-во стандартов, 1979 - 6 с).
Сущность способа определения резистентности спермиев к холодовому шоку (далее - резистентность) заключается в определении их выживаемости после резкого охлаждения до нулевой температуры. Резистентность вычисляется по формуле:
, где
П1 - подвижность спермиев после холодового шока, т.е. после 20 минут выдержки пробы спермы при нулевой температуре;
П2 - подвижность спермиев после выдержки пробы спермы при температуре 37°С в течение 5 мин в термостате и 20 мин при комнатной температуре.
Сперма, предназначенная для замораживания, должна иметь резистентность к холодовому шоку не ниже 0,1.
Как видим прежде, чем определять резистентность, необходимо знать подвижность спермиев, которая выражается в баллах и вычисляется по формуле:
, где
n - общее число подсчитанных спермиев;
n1 - число подсчитанных спермиев с прямолинейным поступательным движением;
10 - постоянный коэффициент.
Минимальной подвижностью спермиев принято считать подвижность, равную 0,5 балла (Сперма быков неразбавленная [Текст]: ГОСТ 20909.4-75. - Введ. 1976-07-01. - М.: Изд-во стандартов, 1976 - 11 с.).
Главным недостатком этого способа является трудоемкость и поэтому его рекомендовано проводить при первой проверке семени на холодоустойчивость, а затем периодически - один раз в квартал.
Сперма жеребцов отличается тем, что в нее попадает большое количество секретов придаточных половых желез, и их выделение происходит неравномерно. Очень часто разные эякуляты от одного и того же жеребца отличаются по объему, концентрации, подвижности спермиев. Различия по биохимическим свойствам, неоднородность ферментного и микроэлементного состава плазмы влияют на устойчивость спермы к глубокому охлаждению. Поэтому прогноз криоустойчивости спермиев желательно проводить для каждого эякулята.
В производственных условиях очень часто не хватает оборудования и условий для применения данного способа, т.е. для практики до сих пор не разработан быстрый, простой и дешевый способ оценки криоустойчивости спермы.
Свежеполученная неразбавленная сперма жеребцов должна соответствовать известным требованиям и нормам (Рекомендации по взятию, разбавлению и замораживанию спермы жеребцов [Текст]. - Дивово, 2006. - 23 с.; Инструкция по искусственному осеменению и трансплантации эмбрионов лошадей [Текст]. - Дивово, 2012. - 72 с.). Но не всегда хорошее качество семени после получения является гарантией его хорошего состояния после замораживания и последующего оттаивания. Как правило, большой процент спермодоз приходится выбраковывать из-за низкой подвижности или плохой выживаемости спермиев после размораживания. Только около 50% замороженного материала остается для хранения и использования. Поэтому перед нами стояла задача найти простой и дешевый способ, позволяющий быстро оценить криоустойчивость спермиев каждого эякулята.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Предлагаемый способ позволяет быстро оценить устойчивость спермы жеребцов к замораживанию, влияние на нее глубокого охлаждения, избавить от необходимости последующей выбраковки замороженного семенного материала, повысить эффективность проводимых работ без дополнительных вложений и затрат на оборудование и материалы, без сложной подготовки и обучения персонала, сократить время общего анализа и обработки результатов до 15 минут.
Для решения этих задач был подобран оптимальный режим ускоренной подготовки разбавленной спермы к замораживанию с таким условием, чтобы подвижность спермиев после деконсервации совпадала или была близка к показателям после обычного замораживания. Были испытаны параметры, которые могли повлиять на подвижность спермиев после процедуры замораживания-оттаивания - это объем дозы, формы фасовки спермы, режим предварительного охлаждения и режим процедуры криоконсервации и оттаивания.
В результате испытания разных объемов дозы и формы фасовки выяснилось, что подвижность спермиев практически не зависит ни от объема дозы (1,5 мл - 0,5 мл), ни от формы фасовки (пробирки Эппендорфа, соломины или тубы). С целью экономии спермы, для дальнейших исследований, мы выбрали самый маленький объем, равный 0,5 мл в любой из имеющихся фасовочных форм (Изучить возможность быстрой оценки устойчивости спермы жеребцов к замораживанию [Текст]: отчет о НИР (промежуточный): 4-7 / ФГБНУ «ВНИИ коневодства»; рук. Лебедева Л.Ф.; исполн. Науменкова В.А. - Дивово, 2016. - 3 с. - №0640-2014-0007).
Нами были проведены опыты по сокращению времени предварительной выдержки спермы в холодильнике при рекомендуемой температуре 4°С - 5°С, а также при более низкой - 1°С - 0°С.
Данный опыт показал, что сокращение времени выдержки спермы в условиях холодильника при 4°С - 5°С до 1,5 часа не приводит к снижению подвижности спермиев. При уменьшении времени выдержки в холодильнике до 1 часа, наблюдается небольшое снижение подвижности (на 0,2 балла или 8,7%). Таким образом, чем меньше время выдержки перед замораживанием, тем большие расхождения с контрольным вариантом наблюдались и тем больший поправочный коэффициент нужно применять
Так же выяснилось, что снижение температуры предварительного охлаждения разбавленной спермы перед криоконсервацией до 0°С не привело к желаемому результату, увеличив разницу между вариантами. Подвижность спермиев в таких пробах достоверно отличалась от контрольного варианта с обычным режимом подготовки к замораживанию. Разница составила 0,4-0,5 балла (Р>0,95) (Изучить возможность быстрой оценки устойчивости спермы жеребцов к замораживанию [Текст]: отчет о НИР (промежуточный): 4-7 / ФГБНУ «ВНИИ коневодства»; рук. Лебедева Л.Ф.; исполн. Науменкова В.А. - Дивово, 2016. - 3 с. - №0640-2014-0007).
Изучив зависимость подвижности спермиев после оттаивания от времени нахождения дозы в парах азота в процессе замораживания, мы установили, что оптимальное время нахождения мини-дозы (0,5 мл) в парах азота оказалось равным 5 минутам (Изучить возможность быстрой оценки устойчивости спермы жеребцов к замораживанию [Текст]: отчет о НИР (промежуточный): 4-7 / ФГБНУ «ВНИИ коневодства»; рук. Лебедева Л.Ф.; исполн. Науменкова В.А. - Дивово, 2016. - 3 с. - №0640-2014-0007), т.е. таким же как для дозы объемом 5 мл. (Инструкция по искусственному осеменению и трансплантации эмбрионов лошадей [Текст]. - Дивово, 2012. - 72 с.).
При обычном способе замораживания-оттаивания после выдержки спермы в парах азота, дозы опускаются в жидкий азот и процесс замораживания продолжается непосредственно в нем не менее суток с целью стабилизации кристаллов льда. Только после этого проводится контрольное оттаивание.
Для ускорения оценки мы проводили оттаивание, выдерживая сперму в азоте в течение 5, 10, 15 минут. Опытным путем было доказано, что подвижность спермиев во всех этих случаях была одинаковой. Мы считаем возможным выдерживать сперму в азоте в течение 5 минут (Изучить возможность быстрой оценки устойчивости спермы жеребцов к замораживанию [Текст]: отчет о НИР (промежуточный): 4-7 / ФГБНУ «ВНИИ коневодства»; рук. Лебедева Л.Ф.; исполн. Науменкова В.А. - Дивово, 2016. - 3 с. - №0640-2014-0007).
По результатам испытаний подобран оптимальный режим быстрой подготовки спермы к замораживанию в мини-объеме для проведения экспресс-оценки криоустойчивости спермы жеребцов с результативностью, получаемой при обычном способе замораживания-оттаивания. Совпадение оценки подвижности спермиев контрольных и опытных образцов отмечено в 99% случаев.
Применение данного способа экспресс-оценки дает возможность заранее спрогнозировать и определить результативность применения глубокого охлаждения семени без последующей выбраковки замороженного семенного материала. Способ отличается простотой и быстротой исполнения в ходе проведения плановых работ по криоконсервации, без сложных манипуляций, без дополнительных затрат на дорогостоящие реактивы и оборудование и на специальную подготовку работников.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Таким образом, чтобы оценить криоустойчивость спермы жеребца, осуществляют следующие действия:
1 сперму после получения и разбавления ЛХЦЖ-средой ставят для предварительного охлаждения и эквилибрации в холодильник, согласно «Рекомендациям по взятию, разбавлению и замораживанию спермы жеребцов» (Рекомендации по взятию, разбавлению и замораживанию спермы жеребцов [Текст]. - Дивово, 2006. - 23 с.). От общего объема разбавленной спермы отливают 0,5 мл и помещают в соломину для ее фасовки или в пробирку Эппендорфа;
2 выдерживают соломину или пробирку в холодильнике при температуре 4°С - 5°С в течение 1 или 1,5 часа.
3 переносят дозу для замораживания в охладитель с жидким азотом на поплавок. Выдерживают в парах жидкого азота в течение 5 минут и опускают непосредственно в азот на 5 минут;
4 сперму извлекают из жидкого азота с помощью пинцета и сразу переносят в водяную баню с температурой 38°С на 30 секунд, если это соломина, и на 60 секунд, если это пробирка Эппендорфа, вынимают из воды, обсушивают и раскупоривают;
5 после оттаивания, определяют подвижность спермиев известным способом, выражая ее в баллах.
Способ экспресс-оценки криоустойчивости спермы жеребцов, включающий подготовку дозы спермы к замораживанию - оттаиванию и оценку подвижности спермиев, отличающийся тем, что для оценки используют мини-дозу спермы - 0,5 мл, которую замораживают в жидком азоте в течение 5 минут.
