Способ борьбы с личинками колорадского жука (leptinotarsa decemlineata)
Владельцы патента RU 2675971:
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского" (RU)
Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой способ борьбы с личинками колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata), включающий использование инсектицидов на основе нуклеиновой кислоты, избирательно действующих на личинок насекомых определенного вида, где предварительно проводят листовую обработку картофеля препаратом-инсектицидом «АКТАРА» на основе действующего вещества тиаметоксама, после чего на третий день проводят контактную обработку пульверизатором личинок насекомого водным раствором короткого 17 нуклеотидов длиной антисмыслового фрагмента ДНК гена СР450 (цитохром Р450-зависимая монооксигеназа) колорадского жука с последовательностью 5'-TGAGAATACTAACGAGA-3' в концентрации 150 пмоль/мкл таким образом, чтобы на личинку I-II возраста попало не менее 1 мкл раствора. Изобретение позволяет снизить токсические нагрузки на окружающую среду и повысить эффективность воздействия на колорадского жука. 4 табл., 1 пр.
Изобретение относится к области борьбы с листогрызущими насекомыми на личиночной стадии развития.
Сегодня много исследований направленно на улучшение существующих биологических и химических препаратов. Так, существует сравнительно небольшой класс органических соединений-инсектицидов Неоникотииноиды. На российском рынке они представлены четырьмя действующими веществами: имидаклопридом (Конфидор, Танрек, Искра Золотая), тиаметоксамом (Актара), ацетамипридом (Моспилан, Гринда) и тиаклопридом (Калипсо, Биская). В случае с неоникотиноидами и другими химическими инсектицидами научные разработки по их улучшению направлены на снижение вреда для нецелевых организмов, а так же на замедление процесса приобретения генетической устойчивости к препарату со стороны насекомого-вредителя.
На сегодняшний день находятся на стадии разработки и пока самостоятельно не используются для контроля численности листогрызущих насекомых препараты на основе коротких антисмысловых ДНК-олигонуклеотидов. В то же время, обладая высокой избирательностью и отсутствием заметного негативного влияния на окружающую среду, они имеют большой потенциал стать основным средством увеличения эффективности химических инсектицидов, в частности неоникотиноидов, в борьбе с колорадским жуком и другими листогрызущими насекомыми.
Известен способ контроля численности листогрызущих насекомых при помощи механизма РНК-интерференции [Zhang, J., Khan, S.A., Heckel, D.G., Bock, R. (2015). Full crop protection from an insect pest by expression of long double-stranded RNAs in plastids. Science, February 2015 DOI: 10.1126/science. 1261680.], взятый нами в качестве прототипа, в котором используются формирующиеся в клетках двухцепочечные фрагменты РНК, что достигается путем генетической модификации растения.
Недостатками этого метода является то, что генетическая модификация (ГМ) растений и получение готового к культивации генно-модифицированного растения является дорогой технологией. Кроме этого, существует высокий риск возникновения генетической устойчивости к ГМ-растению со стороны насекомого.
Техническим результатом изобретения является снижение токсической нагрузки на окружающую среду и повышение эффективности воздействия на колорадского жука путем усиления действия химических инсектицидов.
Способ контроля численности личинок колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata) включает использование инсектицидов на основе нуклеиновой кислоты, избирательно действующих на личинок насекомых определенного вида, при этом предварительно проводят листовую обработку картофеля препаратом-инсектицидом «АКТАРА» на основе действующего вещества тиаметоксама, после чего на третий день проводят контактную обработку пульверизатором личинок насекомого водным раствором короткого 17 нуклеотидов длиной антисмыслового фрагмента ДНК гена CP450 (цитохром P450-зависимая монооксигеназа) колорадского жука с последовательностью 5'-TGAGAATACTAACGAGA-3' в концентрации 100 пмоль/мкл таким образом, чтобы на личинку I-II возраста попало не менее 1,5 мкл раствора.
В классической агротехнике при выращивании картофеля обработку в стандартной процедуре проводят 3 раза, и она не всегда эффективна т.к. у насекомого вырабатывается генетическая устойчивость к химическим инсектицидам. Потому мы предлагаем использовать наш препарат на основе коротких антисмысловых ДНК-олигонуклеотидов, который усиливает эффект действия препарата-инсектицида «АКТАРА». Он является менее затратным, экологически чистым, имеет целевой характер и к нему медленней вырабатывается генетическая устойчивость насекомого.
Авторами заявленного технического решения впервые выявлен тот факт, что обработка личинок колорадского жука антисмысловым фрагментом гена CP450 на фоне препарата «АКТАРА» достоверно увеличивает смертность личинок по сравнению с контролем. И поскольку влияние этого фрагмента на личинок колорадского жука выявлено впервые, это доказывает существенность отличий.
Причинно-следственная связь между отличительными признаками изобретения и достигаемым техническим результатом заключается в том, что антисмысловой фрагмент гена CP450 колорадского жука блокирует синтез белка CP450, отвечающий за нейтрализацию токсинов листа картофеля у жука в период кормления, тем самым вызывая отравление насекомого, что приводит к его дальнейшей гибели. Тонкие детали действия данного ДНК-олигонуклеотида на сегодняшний день неизвестны и изучаются. По-видимому, данный фрагмент ДНК работает по общему механизму действия антисмысловых олигонуклеотидов, снижая экспрессию гена целевого белка. Это вызывает интоксикацию организма и гибель насекомого.
Пример конкретного осуществления способа.
Для эксперимента были собраны личинки колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata) на третий день после обработки химическим инсектицидом «АКТАРА». В среднем, для каждого варианта эксперимента были использованы 20 личинок I-II личиночных возрастов. Все насекомые находились в пластиковых контейнерах объемом 100 мл, при среднесуточной температуре 20-25°C. В качестве питания использовали листья картофеля. Последовательность примененного антисмыслового фрагмента гена C450 была следующей: 5'-TGAGAATACTAACGAGA-3'. Личинки контрольной группы находящиеся в пластиковых контейнерах были обработаны водой. В качестве контрольного антисмыслового олигонуклеотида использовался ДНК-фрагмент NORM (случайный фрагмент) с последовательностью 5'-ACGTACGTACGTACGTA-3'. В ходе эксперимента на каждую личинку попало не менее 150 пмоль ДНК-олигонуклеотида. Фрагменты были синтезированы компанией Евроген (Россия). Был использован χ2-критерий Пирсона с поправкой Йетса для оценивания инсектицидного действия фрагментов ДНК. Эксперимент проводили в трехкратной повторности.
Антисмысловой фрагмент гена CP450 колорадского жука проявил достоверное инсектицидное действие на смертность личинок колорадского жука на фоне обработки препаратом «АКТАРА». Достоверные различия в смертности личинок были обнаружены между группами контроль и CP450 на третий (P<0,05) и четвертый (P<0,05) дни.
Результаты эксперимента представлены в таблицах 1, 2, 3 и 4. Полученные результаты показывают перспективность совместного применения антисмыслового фрагмента гена CP450 и препарата «АКТАРА» в практике сельского хозяйства с целью борьбы с колорадским жуком. По сравнению с прототипом заявленный способ является более доступным.
В таблице представлены средние значения и стандартные ошибки
средних значений
В таблице представлены средние значения и стандартные ошибки средних значений
Способ борьбы с личинками колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata), включающий использование инсектицидов на основе нуклеиновой кислоты, избирательно действующих на личинок насекомых определенного вида, отличающийся тем, что предварительно проводят листовую обработку картофеля препаратом-инсектицидом «АКТАРА» на основе действующего вещества тиаметоксама, после чего на третий день проводят контактную обработку пульверизатором личинок насекомого водным раствором короткого 17 нуклеотидов длиной антисмыслового фрагмента ДНК гена СР450 (цитохром Р450-зависимая монооксигеназа) колорадского жука с последовательностью 5'-TGAGAATACTAACGAGA-3' в концентрации 150 пмоль/мкл таким образом, чтобы на личинку I-II возраста попало не менее 1 мкл раствора.
