Способ определения содержания продуктов протеолиза muc1 и диагностическая тест-система для его осуществления

Изобретение относится к медицине и касается способа выявления продуктов протеолиза MUC-1, имеющих С-концевой лизин в жидкости, при котором приводят в контакт исследуемую жидкость с тест-системой для выявления продуктов протеолиза MUC-1, имеющих С-концевой лизин, которая включает по крайней мере выбранную одну из: полноразмерная молекула плазминогена, ее фрагмент, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1-4, 6-20. Система содержит меченые моноклональные антитела к MUC-1 и твердый носитель с прикрепленными к нему одной из: полноразмерная молекула плазминогена, ее фрагмент, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1-4, 6-20, или прикрепленные к носителю моноклональные антитела к MUC-1 и меченные одной из: полноразмерная молекула плазминогена, ее фрагмент, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1-4, 6-20. При превышении порогового уровня оптической плотности, определенного у жидкости, не имеющей MUC-1 с С-концевым лизином, определяют в исследуемой жидкости повышенное содержание продуктов протеолиза MUC-1, имеющего С-концевой лизин. Изобретение обеспечивает выявление субъекта, имеющего повышенный уровень MUC-1 c C-концевым лизином, способным связываться с плазминогеном или его фрагментами. 4 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 5 пр.

 

Изобретение относится к области медицины и иммунологии и предназначено для иммунологической диагностики, включающей применение как нативной молекулы, так и пептидных последовательностей фрагментов плазминогена, которые могут быть использованы в качестве универсальной системы детекции продуктов протеолиза MUC1 с образованием на COOH-концах пептидной цепи лизина (C-концевой лизин), а также для проведения анализа с целью выявления у человека заболеваний, ассоциированных с повышенной концентрацией продуктов протеолиза MUC1 с лизином на COOH-конце пептидной цепи.

Терминология

Технические и научные термины, использованные в описании изобретения, имеют тот же смысл и значение, которые обычно применяются в соответствующих областях науки и техники.

Термин "антиген", используемый в изобретении, относится к молекуле MUC1 с лизином на COOH-конце пептидной цепи, способным связываться с антителами.

Термин "детектор" относится к пептидной последовательности, способной связываться с C-концевым лизином MUC1 образовавшимся после протеолиза.

Термин "крингл" относится к белковому домену, имеющему структуру, стабилизированную тремя дисульфидными связями.

Термин "домен" относится к участку белка, характеризующемуся определенными структурными или функциональными свойствами.

Термин "анализ" относится к методам выявления высокомолекулярных соединений и включает в себя стадии: (а) стадию контактирования антигена с биологическим образцом при условиях, подходящих для образования комплексов антиген-антитело; и (б) стадию детекции указанных комплексов.

Термин «маркер» относится к высокомолекулярным соединениям определенной структуры, выявление которых в образцах тканей человека ассоциировано с определенным спектром заболеваний.

Термин «эпитоп» в настоящем изобретении относится к участку белковой молекулы, который способен образовать связь с антителом.

Термин «лиганд» в настоящем изобретении относится к белковой молекуле, которая способна образовать нековалентную связь с C-концевым лизином MUC1.

Термин «субъект» в настоящем изобретении относится к человеку, от которого была получена сыворотка крови для проведения анализа.

Термин «диагностический тест» представляет собой определение диагностического показателя с помощью конкретного лабораторного метода, аналитические параметры которого остаются на постоянном уровне.

Уровень техники

Необходимость поиска новых маркеров для проведения диагностики заболеваний, ассоциированных с повышенным уровнем протеолитической активности в организме, в частности, при возникновении онкологических процессов на наиболее ранних сроках не вызывает сомнений. Известно, что развитие опухоли сопровождается высоким уровнем протеолиза (Al-Majid S., Waters Н. The biological mechanisms of cancer-related skeletal muscle wasting: the role of progressive resistance exercise // Biol. Res. Nurs. 2008. Vol. 10, №1. P. 7-20). Сегодня протеазы рассматривают, как один из факторов канцерогенеза (Bashir Т., Pagano М. Aberrant ubiquitin-mediated proteolysis of cell cycle regulatory proteins and oncogenesis // Adv. Cancer. Res. 2003. Vol. 88. P. 101-144;). В протекании процессов канцерогенеза установлено участие всех типов протеаз, под действием которых усиливается пролиферация, инвазия и метастазирование клеток опухоли (Чилингиров Р.Х. Влияние ингибиторов протеолиза на некоторые бактериальные возбудители и течение гнойно-воспалительного процесса // Пат. физиол. и эксперим. терапия. 1997. №3. С. 37-39; K. Proteinase-activated receptor 2 (PAR-2) in gastrointestinal and pancreatic pathophysiology, inflammation and neoplasia // Scand. J. Gastroenterol. 2008. Vol. 43, №8. P. 902-909), но наибольший вклад в этот процесс вносят сериновые протеазы (Zorio Е., J., F., L.A., R., A. Fibrinolysis: the key to new pathogenetic mechanisms // Curr. Med. Chem. 2008. Vol. 15, №9. P. 923-929). Мишенями сериновых протеаз в основном являются пептидные связи, образованные остатками положительно заряженных аминокислот, лизина и аргинина, а также эфиры и амиды этих аминокислот (Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов. Под ред. Курганова Б.И. Москва: «Мир», 1980. 432 с). В настоящее время опубликован ряд работ, показывающих, что продукты протеолитической активности могут служить универсальными маркерами, обнаружение которых у человека может быть ассоциировано с различными аутоиммунными и онкологическими процессами. Так, например, согласно работам Robert Jordan et al. (патент US 08501907), повышенное содержание продуктов протеолиза иммуноглобулинов может служить маркером наличия аутоиммунного или онкологического заболевания.

В работе Peter C. Harpel et al (The J. of biological chemistry Vol. 264, No. 1, Iseue of January 5, pp. 616-624, 1989), представлены данные о специфическом протеолизе иммуноглобулинов плазмином. При этом часть молекулы иммуноглобулина после расщепления специфически может взаимодействовать с молекулой плазминогена благодаря наличию С-концевого лизина. Плазмин обычно получается из плазминогена путем его активации стрептокиназой или урокиназой. Плазмин относится к эндопептидазам - сериновым протеазам трипсиноподобного действия. Известно, что плазмин обладает фибринолитической активностью посредством связывания с C-концевыми лизиновыми остатками фибрина и дальнейшим протеолизом нитей фибрина, предотвращая образование сгустка. Участие C-концевых лизинов бактериальных белков в связывании с плазминогеном было продемонстрировано в работе Marco Candela et al., (Binding of Human Plasminogen to Bifidobacterium, Journal of bacteriology, Aug. 2007, p. 5929-5936). В этой работе белки, которые связывались с плазминогеном, подвергались обработке карбоксипептидазой В, которая специфически отщепляет только C-концевые лизин и аргинин. После такой обработки, белки теряли способность связываться с плазминогеном, что указывает на исключительное участие C-концевых лизинов в связывании с плазминогеном и его крингловыми фрагментами. Система плазминоген/плазмин принимает активное участие не только в процессах фибринолиза, но и тесно связана с ангиогенезом и канцерогенезом. Функционально значима не только нативная молекула плазминогена (плазмина), но и целый спектр продуктов ее деградации. Ферментативно деградированные формы плазминогена по своему действию на низкомолекулярные субстраты могут превосходить цельную молекулу (Ю.Г. Клысь, Н.В. Зайцева, А.И. Кизим, С.В. Веревка, Протеолитические производные плазминогена при развитии злокачественных новообразований, Онкология, Т 12, №1, 2010). Описаны варианты существования кринглов плазминогена в плазме: K1-3; K2-3; K1-4; K1-4,85; K1-5 (Perri S, Martineau D, Francois M, et al. Plasminogen kringle 5 blocks tumor progression by antiangiogenic and proinflammatory pathways. Mol Cancer Ther 2007; 6: 441-449). Известно, что все кринглы, а также их комбинации, принимают активное участие в ангиогенезе и онкогенезе. Кроме того, они имеют лизин-связывающие сайты (за исключением 3-го крингла). Наиболее изучена функциональная активность первых четырех кринглов (К1-4). Последовательность из этих кринглов представляет ангиостатин (Francis J. Castellino, Victoria A. Ploplis, Structure and function of the plasminogen/plasmin system, Thromb Haemost 2005; 93: 647-54; C. Boccaccio and Paolo M. Comoglio Cancer Res 2005; 65(19): 8579-82; Rijken DC, Lijnen HR. New insights into the molecular mechanisms of the fibrinolytic system. J Thromb Haemost 2009; 7: 4-13). Активация сериновых протеаз, которые являются основными участниками процессов протеолиза в области опухоли, приводит к увеличению количества продуктов распада белков, имеющих как было описано выше, С-концевой лизин. Поскольку сама молекула плазминогена/плазмина, а также ее фрагменты имеют лизин-связывающие сайты, они могут связываться с продуктами деградации сериновых протеаз и служить детектором для исследования концентрации этих продуктов в циркуляции, что может отражать как начало самого процесса канцерогенеза, так и его активность. Такой детектор обладает универсальностью по сравнению с предлагаемыми способами детекции продуктов деградации, которые требуют для этого анализа моноклональных антител, получаемых на каждый продукт протеолиза. Определение уровня продуктов протеолиза в образцах плазмы человека и животных можно проводить с помощью иммуноанализа, например иммуноферментного анализа (ИФА) где в качестве детектора используется молекула плазминогена или ее фрагменты.

Муцин 1 (MUC1), высокомолекулярный мембранно-связанный гликопротеид, относят к опухоль-ассоциированным антигенам. Повышенная, по сравнению с нормальным эпителием, экспрессия MUC1 характерна для клеток большинства эпителиальных злокачественных новообразований человека. В частности, при раке молочной железы (РМЖ) и аденокарциноме легкого сверхэкспрессия MUC1 наблюдается более чем в 90% случаев. При РМЖ, раке легкого и ряде других злокачественных опухолей повышенный уровень онкомаркера СА15-3 (MUC1) в сыворотке крови коррелирует с прогрессированием заболевания, но не обладает достаточной специфичностью и чувствительностью для ранней диагностики рака или индивидуального прогноза у онкологических больных. Молекула MUC1 имеет в своем составе аминокислотную последовательность Lys1093-Phe1094 (Рис. 1), которая может расщепляться плазмином с образованием С-концевого лизина. Авторы предложили метод определения продукта протеолиза молекулы MUC1 с С-концевым лизином на основе использования моноклональных антител к этим продуктам и способности плазминогена и его производных связываться с С-концевым лизином пептидной цепи.

В настоящее время используется огромное количество всевозможных разновидностей и модификаций ИФА. Широкое распространение получили разные варианты твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).

Твердофазный ИФА был предложен в 1971 году. Основные принципы твердофазного ИФА, независимо от модификации, заключаются в следующем:

1. На 1 этапе реакции адсорбируют антигены или антитела на твердой фазе. При этом не связавшиеся с твердой фазой реагенты легко удаляются отмыванием.

2. В сенсибилизированных лунках инкубируют исследуемый образец и контроли сравнения. При этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные комплексы. Не связавшиеся компоненты удаляют отмыванием.

3. При добавлении конъюгата антитело-фермент(метка) или антиген-фермент(метка) он связывается с комплементарным участком антигена(антитела) на твердой фазе. Инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит к развитию цветной реакции или проявлению флюоресценции. Эту реакцию можно остановить на нужной стадии, выраженность окрашивания или флуоресценции можно оценить визуально или по оптической плотности.

Уровень содержания исследуемых антигенов определяют при помощи непрямого ИФА. В лунках панелей адсорбируют антитела против искомых белков (антигенов) и инкубируют с образцами сыворотки или другого биологического материала, полученного от больного (спинномозговая жидкость, слюна и др.). Специфические антигены, связавшиеся с антителами на твердой фазе, выявляют с помощью вторых антител к другому эпитопу антигена конъюгированных с ферментом или флуоресцентной меткой. Также может использоваться конюгат моноклональных антител ко вторым антителам. В зависимости от цели анализа используют разные антиглобулиновые реагенты, выявляющие антитела всех изотипов, либо специфичные к отдельным классам и подклассам иммуноглобулинов. Основное достоинство метода состоит в универсальности конъюгата. Реакция методически проста.

Основные этапы непрямого ИФА для определения наличия специфического антигена (или антитела) в исследуемом образце:

1. Антиген, лиганд (антитело) адсорбируют на твердой фазе, затем отмывают от не связавшихся компонентов.

2. Блокируют свободные места связывания. Отмывают.

3. В лунки вносят исследуемый материал, инкубируют и затем проводят процедуру отмывки. Параллельно ставят пробы с положительным и отрицательным контролями.

4. Добавляют вторые антитела с конюгатом (или антиглобулиновый конъюгат) в рабочем разведении, инкубируют, отмывают от не связавшихся компонентов.

5. Вносят субстрат, инкубируют. По достижении оптимального уровня окрашивания в лунках с положительным контролем реакцию останавливают, добавляя стоп-раствор.

6. Измеряют количество продукта реакции на ИФА-ридере.

При оптимальных условиях проведения анализа метод является высокоспецифичным и чувствительным. Он позволяет выявлять нанограммовые количества антигена (антител) в сыворотках (плазме) исследуемых больных.

Таким образом, нами был разработан метод и тест-система на его основе для детекции молекулы MUC1 с С-концевым лизином. В заявленном изобретении для проведения иммуноанализа в качестве антигенов и детекторов наряду с полноразмерным плазминогеном были использованы фрагменты плазминогена определенной структуры.

Раскрытие изобретения

Повышенный уровень концентрации MUC1 с С-концевым лизином, способного связываться с плазминогеном или его фрагментами, являются диагностическим признаком заболеваний, ассоциированных с повышенным уровнем концентрации MUC1 с С-концевым лизином.

Авторы изобретения предположили, что в области хронического воспаления, которое наблюдается при опухолевом процессе, происходит активация сериновых протеаз, что приводит к увеличению продуктов распада белков с С-концевым лизином. Эти продукты протеолиза выходят в кровь и их количество можно определить при помощи анализа крови. Эксперименты, проведенные авторами изобретения, показали, что продукты протеолиза с С-концевым лизином можно обнаружить с помощью плазминогена или его фрагментов.

Таким образом, повышение титра MUC1 с С-концевым лизином в сыворотке крови больных субъектов или плазме по сравнению со здоровыми является маркером заболеваний, ассоциированных с повышенным уровнем MUC1 с С-концевым лизином и измерение содержания уровня данного гликопротеида в сыворотке крови может использоваться в качестве диагностического признака развивающегося патологического процесса.

В настоящее время в опубликованных источниках отсутствуют какие-либо данные об использовании предложенного метода детекции концентрации MUC1 с С-концевым лизином.

Авторы изобретения раскрывают новый способ определения уровня MUC1 с С-концевым лизином в крови, представляющий собой диагностическую тест-систему для выявления субъекта с повышенным содержанием протеолитического фрагмента MUC1 с С-концевым лизином способным связываться с плазминогеном или его фрагментами, включающую твердый носитель, антиген или детектор представляющие собой полноразмерный плазминоген или его фрагмент, содержащий по меньшей мере один крингл и контрольную пробу К.

При этом фрагмент плазминогена в заявленной тест-системе выбран из списка представленном в таблице 1. При этом контрольной пробой К в заявленной тест-системе является проба, взятая у здорового субъекта.

При осуществлении способа определения уровня MUC1 с С-концевым лизином в крови с использованием заявленной тест-системы, фрагменты плазминогена выбраны из списка представленного в таблице 1. При этом выявление MUC1 с С-концевым лизином проводят при помощи иммунной реакции с последующей детекцией колориметрическим, флуоресцентным или кондуктометрическим методами.

При этом превышение значения уровня MUC1 с С-концевым лизином в исследуемой пробе по сравнению с контрольной пробой К более чем на 30% является показателем наличия у субъекта патологического процесса.

Патологическим процессом является рак легких или наличие метастазов в легких при раке простаты

Способ позволяет использовать заявленную диагностическую тест-систему для выявления субъекта, имеющего повышенный уровень MUC1 с С-концевым лизином способного связываться с плазминогеном или его фрагментами. Для того, чтобы диагностировать повышенный по сравнению с нормальным уровнем MUC1 с С-концевым лизином у исследуемого субъекта, проводят сравнение полученного для него уровня MUC1 с С-концевым лизином с уровнем, обнаруживаемом в контрольном образце, полученном от здорового субъекта (доноров).

Способ включает выявления продуктов протеолиза MUC-1, имеющих С-концевой лизин в жидкости, при котором приводят в контакт исследуемую жидкость с тест-системой для выявления продуктов протеолиза MUC-1 имеющих С-концевой лизин, которая включает по крайней мере выбранную одну из: полноразмерная молекула плазминогена, ее фрагмент, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1-4 6-20, система содержит твердый носитель с прикрепленными к нему одной из: полноразмерная молекула плазминогена, ее фрагмент имеющий последовательность SEQ ID NO: 1-4, 6-20 и меченные моноклональные антитела к MUC-1 или прикрепленные е носителю моноклональные антитела к MUC-1 и меченные одной из: полноразмерная молекула плазминогена, ее фрагмент, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1-4, 6-20, при превышении порогового уровня оптической плотности определенного у жидкости не имеющей MUC-1 с С-концевым лизином, определяют в исследуемой жидкости повышенное содержание продуктов протеолиза MUC-1 имеющего С-концевой лизин.

Лиганды и детекторы для проведения иммуноанализа

По своей химической природе плазминоген является гликопротеином, молекула которого содержит 791 аминокислотных остатков и 24 дисульфидных мостика. Белок состоит из одной полипептидной цепи, где N-концевой аминокислотой является глютамин, С - концевой аспарагин. В состав молекулы входит 2%-3% углеводов, локализованных в тяжелой цепи. Олигосахариды присоединяются к Асп288 и Тре345. При активации плазминогена, происходит расщепление пептидной связи Арг560-Вал561 и образуются две цепи, легкая и тяжелая, соединенные дисульфидными связями. В легкой цепи (Вал561-Асн790) находится активный протеазный центр, включающий аминокислотную последовательность: серии, гистидин, аспарагин. В тяжелой цепи плазминогена (Лиз78-Арг560) имеется 5 близких по аминокислотной последовательности петлеобразных участка - доменов или кринглов, которые представляют собой компактные структуры глобулярного типа с хорошо выраженным гидрофобным ядром. Подобные структуры принимают участие в осуществлении белковых взаимодействий в процессе свертывания крови. Кринглы тяжелой цепи обозначаются К1, К2, К3, К4, К5. В доменах К1-5 локализованы специфические участки, обладающие сильным сродством к лизину, ε-аминокапроновой кислоты, парааминобензойной кислоте и другим ω - карбоновым аминокислотам, обладающими антифибринолитическими свойствами. Лизинсвязывающие участки (ЛСУ) играют важную роль во взаимодействиях между плазмином (плазминогеном) и фибрином, а также плазмином и его ингибитором - (антиплазмин). Любой из фрагментов плазминогена, содержащий крингл, независимо от того, является ли он продуктом естественного расщепления в организме человека или получен в результате расщепления плазминогена in vitro (например, в результате ферментативного воздействия), может быть использован для выявления MUC1 с С-концевым лизином.

Для определения титра MUC1 с С-концевым лизином при различных заболеваниях, связанных с накоплением его в циркуляции, в качестве детектора, помимо фрагментов плазминогена, может использоваться также полноразмерная молекула плазминогена.

Полноразмерный плазминоген и различные продукты его расщепления: тяжелая цепь и любой из фрагментов, содержащий крингл, могут быть использованы в качестве лиганда иммобилизованного на твердой фазе для детекции MUC1 с С-концевым лизином в образцах плазмы и сыворотки крови человека.

Лиганды и детекторы являются или нативная молекула Glu-плазминогена или протеолитические производные нативного Glu-плазминогена, либо производные молекулы Glu-плазминогена полученные с помощью генно-инженерных методов, путем синтеза рекомбинантного пептида в эукариотических или бактериальных системах экспрессии. Рекомбинантные лиганды и детекторы соответствуют аминокислотной последовательности аналогичных участков Glu-плазминогена. В частности, лигандом и детектором для осуществления раскрытого в изобретении способа диагностики, кроме полноразмерного плазминогена, могут являться также фрагменты представленные в таблице 1.

Авторы изобретения впервые обнаружили и экспериментально подтвердили, что плазминоген или его фрагменты могут быть использованы в качестве лигандов и детекторов для определения титра MUC1 с С-концевым лизином при постановке иммуноферментной реакции, где исследуемым образцом является образец сываротки крови человека и результат данной реакции может быть использован в качестве значимого диагностического признака для выявления наличия патологического процесса у исследуемого субъекта.

Несмотря на то, что раскрытый в настоящем изобретении способ определения основан на использовании в качестве детектора строго определенных полипептидов, квалифицированному специалисту в данной области техники очевидно, что аналогичным образом могут быть использованы и другие белки и пептиды, имеющие в своем составе идентичные аминокислотные последовательности представленные в таблице 1.

Специалисту очевидно также, что в качестве антигенов и детекторов по настоящему изобретению могут быть использованы любые полипептиды, обладающие значительным уровнем гомологии (80% и выше) с заявленными полипептидами представленные в таблице 1, так как замена отдельных аминокислот, не изменяющая пространственной структуры крингла, не является препятствием для детекции MUC1 с С-концевым лизином.

В таблице 1 приведено описание различных полипептидов - производных плазминогена, формирующих кринглы, которые могут быть использованы для постановки иммуноферментной реакции с образцами сыворотки крови человека для выявления MUC1 с С-концевым лизином.

В таблице 2 приведены стадии заболевания, при которых тестировались образцы сыворотки.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Первичная структура плазминогена человека.

Черными стрелками показано место расщепления пептидных связей: (а) отщепление сигнального пептида - требуется для образования нативной формы Glu-плазминогена; (b) отщепление активационного пептида (Glu'-Lys⁷⁷) и превращение Glu-плазминогена в Lys⁷⁸-плазминоген или Glu-плазмина в Lys⁷⁸-плазмин; (с) расщепление пептидной связи Arg⁵⁶¹-Val⁵⁶² и превращение плазминогена в плазмин.

Белыми стрелками показаны границы интронов в нуклеотидной последовательности гена плазминогена человека. Треугольники обозначают места прикрепления N-связанных олигосахаридов в положении 289 и О-связанных гликанов в позиции 346. Каталитические триады His⁶⁰³, Asp⁶⁴⁶, и Ser⁷⁴¹, обозначены звездочкой (*). Дисульфидные связи обозначены сплошной линией.

Фиг 2. Аминокислотная последовательность молекулы MUC1.

alanine-ala-A; arginine-arg-R; asparagine-asn-N; aspartic acid-asp-D; cysteine-cys-C; glutamine-gln-Q; glutamic acid-glu-E; glycine-gly-G; histidine-his-H; isoleucine-ile-I; leucine-leu-L; lysine-lys-K; methionine-met-M; phenylalanine-phe-F; proline-pro-P; serine-ser-S; threonine-thr-T; tryptophan-trp-W; tyrosine-tyr-Y; valine-val-V.

Осуществление изобретения

Плазминоген и его фрагменты, раскрытые в настоящем изобретении (табл. 1), были получены либо генно-инженерным способом, либо очищены из плазмы крови и использованы в качестве антигенов и детекторов для создания наборов для иммунного анализа при определении титра MUC1 с С-концевым лизином в крови пациентов с различными патологиями в том числе онкологическими заболеваниями.

Выделение лигандов для проведения иммуноанализа

Получение Тяжелой цепи (Glu-H) Glu¹-Arg⁵⁶¹ и Легкой цепи (L) Val⁵⁶²-Asn⁷⁹¹ цепи плазминогена.

Принцип метода состоит в активации плазминогена в плазмин с последующим восстановлении S-S-связей между тяжелой и легкой цепями в условиях, исключающих автолиз, и выделении фрагментов аффинной хроматографией на Lys-Сефарозе 4В. Урокиназа разрывает активационную связь Arg₅₆₁-Val₅₆₂ в плазминогене. Образующийся плазмин разрывает связь 77-78 и отщепляется N-терминальный пептид (1-77). Меркаптоэтанол восстанавливает связи Cys₅₅₈-Cys₅₆₆ и Cys₅₄₈-Cys₆₆₆, соединяющие тяжелую и легкую цепи.

Первый этап: выделение достаточного количества Glu-Pg из плазмы крови. Glu-Плазминоген выделяли из замороженной донорской плазмы крови человека с помощью аффинной хроматографии на Lys-сефарозе 4В при 4°C и рН 8,0. Плазму крови размораживали в присутствии апротинина, центрифугировали 30 min при 4°C и разбавляли в 2 раза 0,02 М К-фосфатным буфером, рН 8,0, содержавшим 20 KIU/ml апротинин. Подготовленную плазму наносили на колонку с Lys-сефарозой 4В, уравновешенную 0,1 М К-фосфатным буфером, рН 8,0, содержавшим 20 KIU/ml апротинин. Колонку промывали от не связавшихся белков 0,3 М К-фосфатным буфером, рН 8,0, содержавшим 20 KIU/ml апротинин, в течение ночи под свободным протоком до А₂₈₀=0,05-0,01. Сорбированный Glu-Pg элюировали раствором 0,2 М 6-аминокапроновой кислоты 0,1 М К-фосфатном буфере, рН 8,0, содержавшем 20 KIU/ml апротинин. Фракции, содержавшие белок, объединяли и подвергали дополнительной очистке осаждением (NH₄)₂SO₄ (0,31 g/ml раствора белка). Осадок оставляли при 4°C на 18-24 часа, после чего отделяли центрифугированием и растворяли в 0,05 М Трис-HCl буфере, рН 8,0 до концентрации порядка 1,5-2,0 mg/ml. Очищенный Glu-Pg диализовали при 4°C против воды (рН 8,0) и лиофилизировали.

Второй этап: получение двухцепочечного плазмина путем активации одноцепочечного Glu-Pg урокиназой (фирмы "Wakamoto Pharmaceutical Co. Ltd." (Корея). К раствору Glu-Pg (5 mg/ml) в 0,05 М Трис-HCl буфере, рН 8,8, содержавшем 0,02 М L-лизин, 0,15 М NaCl, 20% глицерин и 6000 KIU/ml апротинина, добавляли урокиназу до конечной концентрации 600 IU/ml и инкубировали 4 часа при 37°C. Полноту превращения Glu-Pg в плазмин контролировали по росту до максимального значения скорости гидролиза специфического субстрата плазмина S-2251 (HD-Val-Leu-Lys p-nitroanilide, "Sigma", США) в пробах, отобранных из реакционной смеси.

Третий этап: восстановление S-S-связей между тяжелой и легкой цепями плазмина. К полученному раствору плазмина добавляли меркаптоэтанол до конечной концентрации 0,25 mM и инкубировали в токе азота в темноте в течение 20 мин. Образовавшиеся свободные SH-группы блокировали, инкубируя реакционную смесь со свежеприготовленным раствором йодоуксусной кислоты в 0,1 М Na-фосфатном буфере, рН 8,0 (конечная концентрация 0,315 М) и инкубировали 20 мин.

Четвертый этап: разделение тяжелой и легкой цепей плазмина хроматографией на колонке с Lys-Сефарозе 4В. Реакционную смесь разбавляли до концентрации 1 мг/мл 0,1 М Na-фосфатным буфером, рН 8,0, содержавшим 20 KIU/ml апротинин и наносили на колонку с Lys-Сефарозой 4В, уравновешенную тем же буфером. Хроматографию проводили при 25°C. Тяжелая цепь плазмина, содержащая кринглы 1-5 и 30 аминокислотных остатков соединительного пептида, сорбируется на аффинном носителе, а легкая цепь не сорбируется и элюируется уравновешивающим буфером Тяжелую цепь (M_r ~ 56-57 kDa) элюировали раствором 0,2 М раствором 6-аминокапроновой кислоты в 0,1 М Na-фосфатном буфере, рН 8,0. Объединенные фракции диализовали против воды (~ рН 8,0) и высушивали лиофильно. При необходимости препарат растворяли в 0,05М Трис-HCl буфере, pH7,4 и дополнительно очищали с помощью гель-фильтрации на колонке с Сефадексом G-75 (1,65×80 cm). Объединенные фракции белкового пика диализовали против воды рН 8,0 и лиофилизировали.

Чистоту и молекулярную массу препаратов оценивали методом электрофореза в 12% ПААГ в присутствии 0,1% SDS. Кроме того, отсутствие амидазной активности (по S-2251) до и после инкубации ее раствора со стрептокиназой свидетельствовало, что тяжелая цепь не содержит следовых концентраций мини-плазминогена, которые могли не обнаружиться при электрофорезе.

Получение Lys-плазминогена (Lys⁷⁸-Asn⁷⁹¹) и Тяжелой цепи (Lys-H Lys⁷⁸-Arg⁵⁶¹) проводили тем же самым методом, только без добавления ингибитора - апротинина.

Получение миниплазмина (Val⁴⁴²-Asn⁷⁹¹) Миниплазмин включает в себя К5 и легкую цепь плазмина. Его последовательность начинается от Val⁴⁴² и до Asn⁷⁹¹ включительно. Получается он при эластолизе Lys-плазминогена (Lys⁷⁸-Asn⁷⁹¹) дальнейшей доочисткой гель-фильтрацией на сефодексе G-75.

Получение крингла K1-4,5 (Lys⁷⁸-Arg⁵³⁰) проводили по методике, описанной в работе Cao R., Wu H.L., Veitonmaki N., Linden P., Farnedo J., Shi C.Y., and Cao Y. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 5728-5733, с некоторыми модификациями. Glu-плазминоген (10 мг/мл) активировали урокиназой (600 МЕ/мл) в 0,05 М фосфатном буфере рН 9,0, содержащем 0,02 М L-лизин и 0,1 М NaCL, при 37°C. Полноту превращения плазминогена в плазмин контролировали по увеличению амидазной активности раствора до максимального значения. К раствору плазмина добавляли равный объем 0.2 М глицеринового буфера, рН 12,0 и инкубировали в течение 18 ч при 25°C и конечном значении рН 10,5. Реакционную смесь разбавляли в 5 раз буфером, содержащим 0,1 М фосфатный буфер, рН 8,0 и 40 KIU/мл апротинина, и наносили на колонку с Lys-сефарозой 4 В, уравновешенную тем же буфером. После выхода микро-плазмина, сорбированный ангиостатин К1-4,5 элюировали с колонки 0,2 М раствором 6-аминокапроновой кислоты в 0,1 М фосфатный буфер, рН 8,0 и 40 KIU/мл апротинина, диализовали против воды и лиофилизировали. Чистоту препарата проверяли с помощью SDS-ПААГ-электрофореза в 12%-ном геле. Кроме того К 1-4,5 может быть естественным продуктом, включающим кринглы 1-4 плюс 85% К5, (Lys⁷⁸-Arg⁵³⁰). Плазмин превращается в К1-4,5 в две стадии. Сначала плазминоген переходит в плазмин, затем плазмин подвергается аутопротеолизу внутренней петли 5 крингла. Аутопротеолиз может быть вызван свободными сульфгидрильными донорами или щелочной средой. Кроме того такая деградация плазмина происходит при добавлении к субстрату концентрированной ростовой среды клеток НТ 1080, а также ряда других культивированных опухолевых клеток. В этот процесс вовлечена плазмин-редуктаза, которая содержится в ростовой среде опухолевых клеток (Paul Stathakis, Angelina J. Lay, Melinda Fitzgerald, Christian Schlieker, Lisa J. Matthias and Philip J. Hogg, Angiostatin Formation Involves Disulfide Bond Reduction and Proteolysis in Kringle 5 of Plasmin, J. Biol. Chem. Vol. 274, No. 13, Issue of March 26, pp. 8910-8916, 1999; Soff G. A. Angiostatin and angiostatin-related proteins, Cancer Metastasis Rev., 19: 97-107, 2000; Hao Wang, Ryan Schultz, Jerome Hong, Deborah L. Cundiff, Keyi Jiang, and Gerald A. Soff, Cell Surface-Dependent Generation of Angiostatin4.5, Cancer Res January 1, 2004 64; 162).

Получение кринглов K1-4(Tyr⁸⁰-Ala⁴⁴⁰) и K1-3(Tyr⁸⁰-Val³³⁸) К4-5(Val³⁵⁵-Phe⁵⁴⁶) проводили при помощи гидролиза Glu-плазминогена эластазой по методу, описанному в работах Cao Y., Ji R. W., Davidson D., Schaller J., Marti D., Sohndel S., McCanse S. G., M. S., Llinas M., and Folkman J. (1996) J. Biol. Chem., 271, 29461-29467. Glu-плазминоген инкубировали с эластазой при соотношении 50:1 (М/М) в буфере содержащем 0,05 М Трис-HCl, рН 8,5, 0,5 М NaCl и 200 KIU апротинина, в течение 5 часов при комнатной температуре. Реакцию эластолиза останавливали трехкратным добавлением PMFS для поддержания его концентрации 1 мМ в течение 40-50 мин. Затем проводили гель-фильтрацию смеси на колонке с сефадексом G-75 для отделения низко- и высокомолекулярных примесей. Белковые фракции второго пика содержащего К1-3, К1-4, К4-5 и Миниплазмин, наносили на аффинную колонку с Lys-сефарозой 4В, уравновешенную буфером с 0,05 М Трис-HCl, рН 8,5 и 0,15 М NaCl. После выхода миниплазмина, который не сорбируется на носителе, сорбированные фрагменты К1-3, К1-4 и К4-5 элюировали раствором 0,2 М 6-аминокапроновой кислоты в том же буфере, диализовали против буфера содержащего 0,02 М Трис-HCl, рН 8,0 и наносили на колонку с гепарин-агарозой, уравновешенной тем же буфером. После элюции не связавшегося с носителем фрагмента К1-4 и К4-5 уравновешивающим буфером, фрагмент К1-3 элюировали раствором 0,25 М KCl в том же буфере. Полученные фрагмент К1-3 диализовали против воды и лиофилизовали. К1-4 и К4-5 разделяли с помощью гель-фильтрации на колонке с Сефадексом G-75.

Получение кринглов K5(Ser⁴⁴⁹(Pro⁴⁵²)-Fhe⁵⁴⁶), K1-3(Tyr⁸⁰-Val³³⁸), К-4 (Val³³⁵-Ala⁴⁴⁰) согласно работе Cao, Y., Chen, A., An, S. S. A., Ji, R. W., Davidson, D., and Llinas, M. (1997) J. Biol. Chem. 272, 22924-22928). Использовался метод ограниченного эластолиза Lys-Плазминогена (Lys⁷⁸-Asn⁷⁹¹). После обработки эластазой смесь наносили на колонку Mono-S (Bio-Rad) уравновешенную буфером, содержащим 20 мМ NaOAc, рН 5.0. Связавшиеся фрагменты градиентно элюировали буфером, содержащем 20 мМ NaOAc, 1 М KCl, рН 5.0. Были использованы градиент 0-20%, 20-50%, 50-70%, и 70-100%. К-5 сходил при 50% градиенте. По этой же схеме, но в другом градиенте получили К-4 (Val³³⁵-Ala⁴⁴⁰⁾ крингл и крингл K1-3(Tyr⁸⁰-Val³⁵⁴).

Кринглы K1-4 (Lys⁷⁸-Pro⁴⁴⁶) и K1-4(Lys⁷⁸-Lys⁴⁶⁸) получались согласно методу Patterson, В. С. and Sang, Q. А. (1997) J. Biol. Chem. 272, 28823-28825 с использованием металлопротеиназ.

Крингл K1-4(Asn⁶⁰-Pro⁴⁴⁷) получен по методу Lijnen, Н. R., Ugwu, F., Bini, A., and Collen, D. (1998) Biochemistry 37, 4699-4702 с использованием металлопротеиназ.

Потенциальным источником для получения однородного образца антигена в препаративных количествах является женское молоко, в котором MUC1 содержится как в мембранах жировых глобул, так и в растворимой его фракции в виде секреторной формы.

MUC1 был выделен из сыворотки женского молока последовательной очисткой методами иммуноаффинной хроматографией на сефарозе 4В с иммобилизованными мышиными моноклональными антителами к MUC1 ("Диатех-М», Москва) и гель-фильтрацией на колонке с Сефакрил-200 («Сигма», США).

Изготовление диагностической тест-системы для определения титра MUC1 с С-концевым лизином с помощью иммуноферментного анализа.

Были изготовлены два типа диагностической системы-прямой и обратный.

При изготовлении прямой диагностической системы в качестве лигандов для посадки на твердую фазу использовались полноразмерный плазминоген или его фрагменты, содержащие хотя бы один крингл представленные в таблице 1. Их первичная аминокислотная последовательность приведена в перечне последовательностей.

Лиганд разводили в 0,1 М карбонатно-бикарбонатном буфере рН 9,6 в максимальной концентрации 5 мкг/мл для молекул с молекулярным весом более 25 кД и 10 мкг/мл для молекул с молекулярным весом менее 25 кД. Данные разведения лиганда использовались для определения всех видов иммуноглобулинов.

PBS (phosphate buffered saline, фосфатный солевой раствор):

0,14М NaCl; 0,003М KCl; 0,005М Na₂HPO₄; 0,002М KH₂PO₄

Приготовление 1 л 10x PBS:

80 г - NaCl 2 г - KCl 18 г - Na₂HPO₄ 2 г - KH₂PO₄

Субстратный буферный раствор (рН 4,3): 31 мМ лимонная кислота, 0,05 н. NaOH, 3 мМ H₂O₂

Раствор ТМБ: 5 мМ 3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 70% ДМСО

Субстрат-хромогенный раствор (готовится перед употреблением): смешать 4 части субстратного буферного раствора и одну часть раствора ТМБ.

При создании набора для иммуноферментного анализа проводили предварительную иммобилизацию лиганда. Для иммобилизации лиганда могут быть использованы различные виды носителей, например ацетатцеллюлоза, стеклянные бусы или другие частицы, способные сорбировать белки, иммунологические пластиковые стрипы или планшеты.

На иммунологический планшет (Costar) в каждую лунку вносили по 100 мкл раствора лиганда. Инкубация проводилась в течение 14-16 часов при 4°C во влажной камере. Содержимое лунок удаляли путем вытряхивания, затем планшет дважды промывали раствором, содержащим однократный PBS с 0,05% Tweeen-20, по 200 мкл/на лунку для удаления не связавшегося лиганда. В качестве блокирующего раствора использовали 1% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) в PBS, по 200 мкл/лунка с инкубацией в течение 1,5-2 часов при комнатной температуре. После окончания инкубации блокирующую жидкость удаляли, планшет сушили в течение ночи при комнатной температуре и затем использовали в дальнейшей работе.

Исследуемые и контрольные образцы плазмы крови разводили в 10 раз буфером для инкубации (1% раствор бычьего сывороточного альбумина в PBS), после этого вносили по 100 мкл в соответствующие лунки планшета и инкубировали 1 час при 37°C. После окончания инкубации содержимое лунок удаляли, планшет промывали 4 раза промывочным раствором (PBS с 0,05% Tween-20), каждый раз тщательно удаляя содержимое лунок. Рабочее разведение раствора коньюгата мышиных моноклональных антител к MUC1 с пероксидазой хрена («Диатех-М», Москва) в PBS с 0,5% БСА вносили в соответствующие лунки планшета по 100 мкл/лунка и снова инкубировали 1 час при 37°C. Не связавшиеся компоненты удаляли 4-х кратной промывкой планшета промывочным раствором. Затем во все используемые лунки вносили по 100 мкл субстрат-хромогенного раствора и инкубировали 15 минут при 37°C. Реакцию останавливали, внося во все используемые лунки по 100 мкл стоп-раствора (2М H₂SO₄). Фотометрию проводили на фотометре вертикального сканирования «УНИПЛАН» (фирма «ПИКОН», Россия) с длиной волны 450 нм.

При изготовлении обратной диагностической системы в качестве детектора для иммуноферментного определения титра MUC1 с С-концевым лизином использовались полноразмерный меченный плазминоген или его фрагменты, содержащие хотя бы один крингл перечислены в табл.1. Их первичная аминокислотная последовательность приведена в перечне последовательностей. При создании обратной диагностической системы проводили предварительную иммобилизацию моноклональных мышиных иммуноглобулинов к MUC1 («Диатех-М», Москва). Для иммобилизации моноклональных мышиных иммуноглобулинов могут быть использованы различные виды носителей, например нитроцеллюлоза, стеклянные бусы или другие частицы, способные сорбировать белки, иммунологические стрипы или планшеты. На иммунологический планшет (Costar) в каждую лунку вносили по 100 мкл раствора (5 мкг/мл) моноклональных мышиных иммуноглобулинов к MUC1. Инкубация проводилась в течение 14-16 часов при 4°C во влажной камере. Содержимое лунок удаляли путем вытряхивания, затем планшет дважды промывали раствором, содержащим однократный PBS с 0,05% Tweeen-20, по 200 мкл/на лунку для удаления не связавшегося антигена. В качестве блокирующего раствора использовали 1% раствор бычьего сывороточного альбумина в PBS, по 200 мкл/лунка с инкубацией в течение 1,5-2 часов при комнатной температуре. После окончания инкубации блокирующую жидкость удаляли, планшет сушили в течение ночи при комнатной температуре и затем использовали в дальнейшей работе. Полноразмерный плазминоген или его фрагменты, содержащие хотя бы один крингл подвергались процедуре биотинилирования 10 мг-биотинилирующего реактива, Biotinamidohexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester (Sigma B-2643), растворили в 0,5 мл диметилформамида. Плазминоген или его фрагмент растворяли в 0,1М фосфатном буфере рН 7,4 в концентрации 1 мг/мл. К 1 мл этого раствора добавили 5 мкл биотинилирующего реактива в диметилформамиде. Инкубировали 1 час при комнатной температуре на шейкере. Добавили раствор апротинина до конечной концентрации 20 МЕ/мл, перенесли раствор в диализный мешок (4000 Да) и оставили на ночь на диализ против 0,01 М фосфатного буфера с 20 МЕ/мл апротинина, при 4°C. Полученный раствор конъюгата с биотином разбавили в 2 раза глицерином и заморозили.

Получение MUC1 с С-концевым лизином достигалось при помощи протеолитической реакции нативного MUC1 с плазмином. Для это MUC1, выделенный из молока в объеме 1 мл и концентрации 100 мкг/мл в PBS был добавлен к 1 мл плазмина 100 мкг/мл в PBS. Смесь инкубировали 12 часов при 37°C. Реакцию остановили добавлением 200 ед. апротинина в 20 мкл. Полученный раствор заморозили на -20°C до дальнейшего использования. Плазмин был получен при активации Lys-Плазминогена (Seq.2) 100 мкг/мл с помощью урокиназы 100 ед.

Для доказательства участия С-концевых лизинов MUC1 в связывании с плазминогеном образцы сыворотки после 1/10 были инкубированы с карбоксипептидазой В («Sigma-Aldrich»). 90 мкл образца и 10 мкл карбоксипептидазы В в PBS. После 1 инкубации в течение 3 часов при 37°C с карбоксипептидазой В, ферментативная реакция была остановлена 1,10-Phenathroline («Sigma-Aldrich») и образцы использовались для ИФА.

Проведение иммуноферментного детектирования титра MUC1 с С-концевым лизином способных связываться с плазминогеном или его фрагментами

Образцы сыворотки крови больных забирали из локтевой вены с помощью вакутейнеров. Затем образцы центрифугировали со скоростью 3000 об/мин в течении 15 мин. Сыворотку разливали в пробирки по 100 мкл, замораживали и хранили при температуре -40°C.

Контрольную группу составляли образцы сыворотки, взятые от 5 здоровых доноров.. Каждый образец был отрицателен в тестах на гепатиты А, В, С, вирусы ВИЧ, а также туберкулез и сифилис.

Уровень титра MUC1 с С-концевым лизином в контрольных образцах измерялся при помощи прямого и обратного иммуноферментного набора, согласно описанной методике. Разведение контрольных образцов плазмы подбиралось таким образом, чтобы оптическая плотность была не более 0,3.

При проведении прямого иммуноферментного анализа опытным путем установлено конечное разведение для проб - 1/10, которое в дальнейшем использовалось для анализа всех проб. В качестве лиганда использовалась как целая молекула плазминогена, так и ее фрагменты. Для точности измерения, уровня MUC1 с С-концевым лизином каждая проба анализировалась в дубле. После измерения 5 контрольных проб, был вычислен средний уровень оптической плотности.

Исследуемые и контрольные образцы сыворотки крови разводили в 10 раз буфером для инкубации, после этого вносили по 100 мкл в соответствующие лунки планшета и инкубировали 1 час при 37°C. После окончания инкубации содержимое лунок удаляли, планшет промывали 4 раза промывочным раствором (PBS с 0,05% Tween-20), каждый раз тщательно удаляя содержимое лунок. Рабочее разведение раствора конъюгата мышиных моноклональных антител к MUC1 с пероксидазой хрена («Диатех-М», Москва) в PBS с 0,5% БСА вносили в соответствующие лунки планшета по 100 мкл/лунка и снова инкубировали 1 час при 37°C. Не связавшиеся компоненты удаляли 4-х кратной промывкой планшета промывочным раствором. Затем во все используемые лунки вносили по 100 мкл субстрат-хромогенного раствора и инкубировали 15 минут при 37°C. Реакцию останавливали внесением во все используемые лунки по 100 мкл стоп-раствора (2М H₂SO₄).

Фотометрию проводили на фотометре вертикального сканирования «УНИПЛАН» (фирма «ПИКОН», Россия) с длиной волны 450 нм.

При проведении обратного иммуноферментного анализа опытным путем установлено конечное разведение для проб - 1/10, которое в дальнейшем использовалось для анализа всех проб. В качестве детектора использовалась как целая биотинилированная молекула плазминогена так и ее биотинилированные фрагменты. Для точности измерения, уровня MUC1 с С-концевым лизином каждая проба анализировалась в дубле. После измерения 5 контрольных проб, был вычислен средний уровень оптической плотности.

Использовались планшеты с адсорбированными мышиными моноклональными антителами против MUC1 («Диатех-М», Россия).

Исследуемые и контрольные образцы плазмы крови разводили в 10 раз буфером, после этого вносили по 100 мкл в соответствующие лунки планшета и инкубировали 1 час при 37°C. После окончания инкубации содержимое лунок удаляли, планшет промывали 4 раза промывочным раствором (PBS с 0,05% Tween-20), каждый раз тщательно удаляя содержимое лунок. Рабочее разведение коньюгата плазминогена с биотином или его фрагментов с биотином в PBS с 0,5% БСА вносили в соответствующие лунки планшета по 100 мкл/лунка и снова инкубировали 1 час при 37°C. Не связавшиеся компоненты удаляли 4-х кратной промывкой планшета промывочным раствором. Затем во все используемые лунки вносили 100 мкл раствора коньюгата стрептавидин-пероксидаза и инкубировали 30 мин при 37°C. Не связавшиеся компоненты удаляли 4-х кратной промывкой планшета промывочным раствором. Затем во все используемые лунки вносили по 100 мкл субстрат-хромогенного раствора и инкубировали 15 минут при 37°C. Реакцию останавливали, внося во все используемые лунки по 100 мкл стоп-раствора (2М H₂SO₄).

Фотометрию проводили на фотометре вертикального сканирования «УНИПЛАН» (фирма «ПИКОН», Россия) с длиной волны 450 нм.

Прямой и обратный иммуноферментный тест контрольных проб проводился с каждым отдельно взятым антигеном и биотинилированным детектором. Для сравнительного исследования в качестве контрольного образца из контрольной группы были взяты 5 образцов с показателями оптической плотности, отличающихся не более 5% от среднего. Эти 5 проб были объединены в одну пулированную пробу - контрольную пробу (К), использованную в качестве эталона нормального уровня титра MUC1 с С-концевым лизином. Положительными считались пробы, с оптической плотностью, превышавшую более чем на 30% оптическую плотность контрольной пробы. Данное пороговое значение позволяет исключить получение ложноположительных результатов, т.е. ошибочно отнести человека к группе больных или подверженных риску заболевания.

При исследовании уровня титра MUC1 с С-концевым лизином были использованы образцы сыворотки крови больных с раком легких и воспалительными заболеваниями. Для данных больных в примерах показаны результаты применения различных антигенов и детекторов в тест-системах, направленных на выявление повышенного титра MUC1 с С-концевым лизином.

Для доказательства участия С-концевых лизинов MUC1 в связывании с плазминогеном образцы сыворотки были разведены в 10 раз и инкубированы с карбоксипептидазой В («Sigma-Aldrich»).. К 90 мкл пробы в разведении 1/10 добавили 10 мкл раствора карбоксипептидазы В (5 мг/мл) в 0,01М фосфатном буфере рН7,4. Инкубировали 3 часа при 37°C. Ферментативную реакцию останавливали добавлением 6 мкл раствора 1,10-фенантролина в метаноле (180 мг/мл). По 100 мкл образца использовали для тестирования в иммуноферментном тесте на выявление повышенного титра MUC1 с С-концевым лизином. Также исследовали образец полученного MUC1 с С-концевым лизином после протеолиза плазмином, при инкубации MUC1 и плазмина, как было описано. Сравнивались образцы MUC1 до и после инкубации с плазмином, а также после обработки карбоксипептидазой В, как было описано.

Примеры

Пример 1

В процессе проведения прямого и обратного иммуноферментного анализа образца полученного MUC1 с С-концевым лизином после протеолиза плазмином in vitro в сравнении с MUC1 без добавления плазмина была выявлена значительная разница полученной оптической плотности. Так образец MUC1 без добавления плазмина показывал оптическую плотность 0,2-0,3, в то время как образец MUC1 после инкубации с плазмином in vitro имел оптическую плотность 1,1-1.9, в зависимости от выбранного антигена или лиганда представленного в Таблице 1. Это объясняется накоплением производного MUC1 с С-концевым лизином после протеолиза. После обработки исследуемых проб MUC1 (с добавлением плазмина и без) карбоксипептидазой В, различия между пробами MUC1 с добавлением плазмина и без исчезали. Что свидетельствует об участии С-концевого лизина молекулы MUC1 после протеолиза плазмином в связывании с целой молекулой плазминогена, так и ее фрагментами (SEQ ID NO 1-4, SEQ ID NO 6-13 и SEQ ID NO 18 - SEQ ID NO 20) Таблица 1.

Пример 2. Выявление связывания MUC1 с С-концевым лизином прямым тестом при раке легких.

Диагнозы больных с раком легких были установлены на основании следующих показателей: клинического обследования с морфологическим подтверждением поставленного диагноза и на основании онкологических маркеров. Всего в эту группу входило 10 больных. (Таблица 2)

Иммуноферментный анализ (ИФА) образцов проб взятых у больных раком легких и контрольного образца проводился согласно описанной методике. Положительными считались пробы, имевшие оптическую плотность в ИФА, более чем на 30% превышающие оптическую плотность контрольной пробы.

Результаты:

При использовании в качестве антигена последовательности SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13 в ИФА, количество положительных проб у больных раком легких составляло 8 из 10.

При использовании в качестве антигена последовательности SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20 в ИФА, количество положительных проб у больных раком легких составляло 6 из 10 После обработки проб карбоксипептидазой В, различий между контрольными пробами и раковыми пробами не было.

Пример 3. Выявление связывания MUC1 с С-концевым лизином обратным тестом при раке легких.

Диагнозы больных с раком легких были установлены на основании следующих показателей: клинического обследования с морфологическим подтверждением поставленного диагноза и на основании онкологических маркеров. Всего в эту группу входило 10 больных. (Таблица 2)

Иммуноферментный анализ (ИФА) образцов проб взятых у больных раком легких и контрольного образца проводился согласно описанной методике. Положительными считались пробы, имевшие оптическую плотность в ИФА, более чем на 30% превышающие оптическую плотность контрольной пробы.

Результаты:

При использовании в качестве детектора биотинилированных последовательностей SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13 в ИФА, количество положительных проб у больных раком легких составляло 8 из 10, После обработки проб карбоксипептидазой В, различий между контрольными пробами и раковыми пробами не было.

При использовании в качестве в качестве детектора биотинилированных последовательностей SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20 в ИФА, количество положительных проб у больных раком легких составляло 6 из 10. После обработки проб карбоксипептидазой В, различий между контрольными пробами и раковыми пробами не было.

Пример 4. Выявление связывания MUC1 с С-концевым лизином обратным тестом при раке простаты с метастазами в легкие. (Таблица 2)

Диагнозы больных с раком простаты с метастазами в легкие были установлены на основании следующих показателей: клинического обследования с морфологическим подтверждением поставленного диагноза и на основании онкологических маркеров. Всего в эту группу входило 6 больных.

При использовании в качестве антигена последовательности SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13 в ИФА, количество положительных проб у больных раком простаты с метастазами в легкие составляло 5 из 6.

При использовании в качестве антигена последовательности SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20 в ИФА, количество положительных проб у больных раком простаты с метастазами в легкие составляло 3 из 6. После обработки проб карбоксипептидазой В, различий между контрольными пробами и раковыми пробами не было.

Пример 5. Выявление связывания MUC1 с С-концевым лизином обратным тестом при туберкулезе. (Таблица 2)

Диагноз у больных туберкулез был установлен на основании следующих показателей: клинического обследования с морфологическим подтверждением поставленного диагноза. Всего в эту группу входило 5 больных.

Иммуноферментный анализ (ИФА) образцов проб взятых у больных туберкулезом и контрольного образца проводился согласно описанной методике. Положительными считались пробы, имевшие оптическую плотность в ИФА, более чем на 30% превышающие оптическую плотность контрольной пробы.

При использовании в качестве антигена последовательности SEQ ID NO 1-4, SEQ ID NO 6-20 не было выявлено различий между больными туберкулезом и контрольными пробами.

Таблица 2: Стадии заболевания, при которых образцы сывротки исследовались на наличие MUC1 с С-концевым лизином Группа с раком легких

Группа с раком предстательной железы с метастазами в легких

Группа с туберкулезом

Перечень последовательностей

1. Способ выявления продуктов протеолиза MUC-1, имеющих С-концевой лизин в жидкости, при котором приводят в контакт исследуемую жидкость с тест-системой для выявления продуктов протеолиза MUC-1, имеющих С-концевой лизин, которая включает по крайней мере выбранную одну из: полноразмерная молекула плазминогена, ее фрагмент, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1-4, 6-20, система содержит твердый носитель с прикрепленными к нему одной из: полноразмерная молекула плазминогена, ее фрагмент, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1-4, 6-20, и меченые моноклональные антитела к MUC-1 или прикрепленные к носителю моноклональные антитела к MUC-1 и меченные одной из: полноразмерная молекула плазминогена, ее фрагмент, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1-4, 6-20, при превышении порогового уровня оптической плотности, определенного у жидкости, не имеющей MUC-1 с С-концевым лизином, определяют в исследуемой жидкости повышенное содержание продуктов протеолиза MUC-1, имеющего С-концевой лизин.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что жидкостью является сыворотка крови, взятой от субъекта, и что превышение в ней уровня продуктов протеолиза MUC-1, имеющих С-концевой лизин, над пороговым уровнем более чем на 30% является показателем наличия у субъекта патологического процесса.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что жидкостью является сыворотка крови, взятой от субъекта, и что превышение в ней уровня продуктов протеолиза MUC-1, имеющих С-концевой лизин, над пороговым уровнем более чем на 30% является показателем наличия у субъекта риска развития патологического процесса.

4. Способ по пп. 1-3, отличающийся тем, что выявление продуктов протеолиза MUC-1, имеющих С-концевой лизин, проводят при помощи иммуноферментной реакции.

5. Способ по пп. 2, 3, отличающийся тем, что патологическим процессом является рак легких или наличие метастазов в легких при раке простаты.