Способ выявления эффективного криопротектора по цитохимическому показателю содержания лейкоцитарной щелочной фосфатазы аутокрови

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для выявления эффективного криопротектора по цитохимическому показателю содержания лейкоцитарной щелочной фосфатазы (ЛЩФ) аутокрови. Для этого у больного до начала криогемотрансфузионной терапии эксфузируют порцию свежей аутокрови. Стабилизируют кровь раствором цитрата натрия. В контрольную пробу (КП) добавки криопротекторов не вносят. В опытные пробы (ОП) вносят по одной равной дозе тестируемых криопротекторов, перемешивают при плюс 37°С в течение 4 ч. Капли приготовленных ОП и КП наносят в объеме 4 мкл на предметные стекла и делают мазки. Готовят препараты для выявления ЛЩФ в с/я нейтрофилах по методике азосочетания Кеплоу. Проводят сравнительное исследование среднего цитохимического коэффициента (СЦК) ЛЩФ для с/я нейтрофилов в ОП и КП. Тестируемый криопротектор оценивают как эффективный для пациента при значениях СЦК ЛЩФ ОП, равных значениям СЦК ЛЩФ КП. Тестируемый криопротектор оценивают как неэффективный для пациента при значениях СЦК ЛЩФ ОП, отличных от СЦК ЛЩФ КП. Изобретение позволяет выявить in vitro оптимальный криопротектор на доклиническом этапе криогемотрансфузионной терапии и снизить риск посттрансфузионных осложнений у пациентов. 1 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно лабораторной диагностике, и может быть использовано для выявления эффективного криопротектора по цитохимическому показателю содержания лейкоцитарной щелочной фосфатазы (ЛЩФ*(* Лейкоцитарная щелочная фосфатаза - фермент, участвующий в транспорте фосфора через мембрану лейкоцитов и являющийся показателем фосфорно-кальциевого обмена. Уровень этого фермента в лейкоцитах служит доказательством патологического процесса в тканях организма при отсутствии симптомов или их смазанности.)) в аутокрови на доклиническом этапе трансфузионной терапии и предупреждения посттрансфузионных осложнений криопротекторного генеза. Для осуществления способа у пациента эксфузируют порцию свежей аутокрови, стабилизируют раствором цитрата натрия, делят на равные части, в контрольную пробу (КП) добавки криопротекторов не вносят, в опытные пробы (ОП) вносят по одной равной дозе тестируемых криопротекторов, перемешивают при плюс 37°C в течение 4 ч, капли приготовленных биологических жидкостей (ПБЖ) из ОП и КП наносят в объеме 4 мкл на предметные стекла, делают мазки, готовят препараты для выявления ЛЩФ в с/я нейтрофилах по методике азосочетания Кеплоу**(** Справочник по клиническим лабораторным методам исследования под ред. Е.А. Кост. Москва "Медицина" 1975 г.; справочник "Лабораторные методы исследования в клинике" под ред. проф. В.В. Меньшикова Москва "Медицина" 1987 г.), клетки микроскопируют в проходящем свете, проводят сравнительное исследование среднего цитохимического коэффициента (СЦК) ЩФ для с/я нейтрофилов в ОП и КП; тестируемый криопротектор оценивают как эффективный для конкретного пациента и пригодным к использованию (НКИ) с лечебной целью при значениях СЦК ЛЩФ ОП, равных значениям СЦК ЛЩФ КП; тестируемый криопротектор оценивают как неэффективный для конкретного пациента и непригодный к использованию (НКИ) с лечебной целью при значениях СЦК ЛЩФ ОП, отличных от таковых СЦК КП. Способ прост и доступен врачу по клинической лабораторной диагностике. Использование способа позволяет на доклиническом этапе трансфузионной терапии определить in vitro эффективность криопротектора и его пригодность в качестве добавки в рецепты криоконсервантов для живых клеток, исключающих посттрансфузионные осложнения криопротекторного генеза.

Уровень техники.

В современной клинической медицине посттрансфузионные реакции и осложнения рассматривают как один из универсальных механизмов патогенеза различных заболеваний, характеризующихся накоплением в тканях организма избытка токсических продуктов обмена веществ или клеточного реагирования, маркерами которых служат качественные и полуколичественные характеристики определенных цитохимических ферментативных реакций в лейкоцитах крови до и после смешивания с криопротекторами. Эти процессы могут развиваться сразу после внутривенных инъекций по типу яркой многосимптомной реакции, либо по типу скрытно и медленно развивающихся симптомов посттрансфузионных осложнений (Цитохимия замороженной клетки / Обозная Э.И., Пушкарь Н.С., Маркова О.П., Панков Е.Я. - Киев: Наук. Думка, 1981. - 176 с.). Поэтому возникает проблема раннего выявления признаков вредного влияния токсичных криопротекторов на организм и предупреждения посттрансфузионных осложнений протекторного генеза.

Известные методы биологического и биохимического исследования сыворотки крови (определение концентрации молекул средней массы, продуктов перекисного окисления липидов, билирубина и т.д.) имеют ряд недостатков:

- необходимость вводить криопротектор или гемоконсервант на его основе в периферическую вену больного, то есть производить инвазивную манипуляцию, которая может быть сопряжена с техническими трудностями, осложнениями технического характера или непереносимостью субъектом лекарственного препарата;

необходимость использования лабораторных животных и специальной биохимической лаборатории, оснащенной сложным оборудованием и реактивами, что делает анализы не всегда доступными и дорогими как для лечебно-профилактических учреждений, так и для пациентов.

Эти недостатки ограничивают количество и частоту необходимых исследований.

На основании предложенных в литературе лабораторных модификаций для оценки полноценности ядерных клеток крови на этапах низкотемпературного консервирования и прогнозирования предполагаемых результатов криогемотрансфузионной терапии широко используются технологии качественной и полуколичественной оценки цитохимических показателей активаторов жизненно важных клеточных ферментов в периферической крови пациентов.

Известен метод цитохимического обнаружения ЛЩФ для оценки нормальных и патологических процессов (Цитохимия костного мозга при криоконсервировании: Атлас / Обозная Э.И., Панков Е.Я.; Отв. Ред. А.М. Белоус; АН УССР. Ин-т пробл. Криобиологии и криомедицины. - Киев: Наук. Думка, 1989. - 256 с.).

За прототип предлагаемого изобретения выбран способ, позволяющий выявить содержание ЛЩФ в высушенных мазках донорской крови (Архагов Ю.Ф. Изменение морфологии и функционально-метаболической активности лейкоцитов в процессе хранения донорской крови и под влиянием различных лучей: Автореф. дис.… канд. мед. наук. М., 2003. - 155 с.). Основным недостатком способа-прототипа является отсутствие сравнительных исследований СЦК лейкоцитов на ЛЩФ в мазках проб венозной крови, смешанных с 15% раствором гексаметиленбистетраоксиэтилмочевины (15% ГМБТОЭМ), 3,3% раствором Глицерола (3,3% Гл), 10% раствором диметилсульфоксида (10% ДМСО), гемоконсервантом Тромбокриодмац (ТКД) или гемоконсервантом на основе 55% раствора диметилацетамида (ДМАЦ) с 5% раствором гидроксиэтилкрахмал (ГЭК) (55% ДМАЦ + 5% ГЭК), с таковыми значениями СЦК КП. Вместе с тем, определение эффективного криопротектора на этапе, предшествующем криогемотрансфузионной терапии, очень важен для больного, так как позволяет снизить риск посттрансфузионных осложнений криопротекторного генеза.

Целью изобретения является устранение отмеченного недостатка и создание такого способа, который бы позволял in vitro выявлять для конкретного больного эффективный криопротектор или гемоконсервант на его основе на этапе, предшествующем плановой трансфузии криоконсервированного компонента крови.

Раскрытие изобретения.

Техническим результатом изобретения является доступность, простота выявления эффективного криопротектора на доклиническом этапе криогемотрансфузионной терапии.

Технический результат в заявляемом способе выявления эффективного криопротектора по цитохимическим показателям содержания ЛЩФ аутокрови достигается тем, что, как и в способе-прототипе, анализ содержания ЛЩФ в с/я нейтрофилах осуществляют по методике азосочетания Кеплоу.

Новым в способе является то, что определение эффективного криопротектора проводят путем сравнительных исследований СЦК ОП на ЛЩФ для 15% ГМБТОЭМ, 3,3% Гл, 10% ДМСО, гемоконсерванта ТКД или комбинированного гемоконсервантом на основе 55% ДМАЦ и 5% ГЭК, со значениями СЦК КП. При этом: тестируемый криопротектор оценивают как эффективный для конкретного пациента и пригодным к использованию (ПКИ) с лечебной целью при значениях СЦК ЛЩФ ОП, равных значениям СЦК ЛЩФ КП; тестируемый криопротектор оценивают как неэффективный для конкретного пациента и непригодный к использованию (НКИ) с лечебной целью при значениях СЦК ЛЩФ ОП, отличных от таковых СЦК КП.

Необходимое оборудование:

1. Система счетверенных контейнеров с интегрированным лейкоцитарным фильтром для получения лейкофильтрованных компонентов крови Leukotrap WB с пробоотборником для лабораторных исследований,

2. Предметные стекла,

3. Пробирки для крови на 20 мл с винтовой герметичной пробкой.

4. Световой микроскоп с проходящим светом,

5. Набор тест-доз различных криопротекторов или гемоконсервантов на их основе, разрешенных к клиническому применению МЗ России,

6. Набор реагентов для цитохимического определения ЩФ в лейкоцитах. Заявляемый способ имеет основное преимущество в сравнении с прототипом -

определение эффективного криопротектора реализуют путем сравнительных исследований значений СЦК ЛЩФ ОП аутологичной крови, смешанных с тест-дозами 15% ГМБТОЭМ, 3,3% Гл, ТКД, 10% ДМСО или 55% ДМАЦ + 5% ГЭК, со значениями СЦК ЛЩФ КП.

Заявляемый способ осуществляют следующим образом. У обследуемого натощак, до начала внутривенных трансфузий криоконсервированных компонентов крови (криогемотрансфузионной терапии) готовят в пробирках «линейку» из тест-доз с 15% ГМБТОЭМ; 3,3% Глицерола, гемоконсервантом ТКД, 10% ДМСО или комбинированным гемоконсервантом на основе 55% ДМАЦ и 5% ГЭК по 1,5 мл в каждой; в пробоотборник эксфузируют 25 мл аутологичной венозной крови на стабилизирующем растворе цитрата натрия и фасуют с помощью дозаторной пипетки в 6 помеченных маркером пробирок по 4,0 мл в каждую; затем в пробирку №1 вносят 0,25 мл тест-дозы 15% ГМБТОЭМ, в пробирку №2 - 0,25 мл тест-дозы 3,3% Гл, в пробирку №3 - 0,25 мл тест-дозы ТКД, в пробирку №4 - 0,25 мл 10% ДМСО, в пробирку №5 - 0,25 мл гемоконсерванта на основе 55% ДМАЦ + 5% ГЭК, в пробирку №6 с КП аутокрови криопротектор не вносят; компоненты в пробирках №№1 - 6 герметизируют пробками, перемешивают на шейкере при температуре плюс 37°С в течение 4 ч; из каждой пробирки биопробы раскапывают с помощью дозаторной пипетки на чистые предметные стекла, готовят тонкие мазки, быстро высушивают, препарат на ЛЩФ готовят по методике азосочетания Кеплоу**(**Справочник по клиническим лабораторным методам исследования под ред. Е.А. Кост. Москва "Медицина" 1975 г.; справочник "Лабораторные методы исследования в клинике" под ред. проф. В.В. Меньшикова Москва "Медицина" 1987 г.). Для выявления ЛЩФ используют комплект реагентов заводского приготовления, с/я нейтрофилы микроскопируют в проходящем свете, проводят сравнительное исследование СЦК ЛЩФ, выявленных в сегментоядерных нейтрофилах ОП и КП. О пригодности тестируемых криопротекторов к использованию в планируемых криогемотрансфузиях судят по соответствию значений СЦК ОП к величине СЦК ЛЩФ КП; тестируемый криопротектор оценивают как эффективный для конкретного пациента и пригодным к использованию (ПКИ) с лечебной целью при значениях СЦК ЩФ ОП, равных значениям СЦК ЛЩФ КП; тестируемый криопротектор оценивают как неэффективный для конкретного пациента и НКИ с лечебной целью при значениях СЦК ЩФ ОП, отличных от значений СЦК ЛЩФ КП. Способ прост и доступен врачу по клинической лабораторной диагностике современного онкогематологического центра. Использование способа позволяет выявить in vitro эффективный криопротектор на доклиническом этапе криогемотрансфузионной терапии и исключить внутривенную инфузию непригодного для конкретного больного криопротектора.

Необходимое оборудование: предметные стекла, пробирки для крови на 5 и 20 мл с винтовой герметичной пробкой, световой микроскоп с проходящим светом, набор тест-доз различных криопротекторов или гемоконсервантов на их основе, разрешенных к клиническому применению МЗ России, набор реагентов для цитохимического определения ЩФ в лейкоцитах in vitro диагностики производства РФ.

В качестве иллюстрации работоспособности заявляемого способа выявления эффективного криопротектора по цитохимическому показателю содержания ЛЩФ в аутокрови приводим 3 примера (Табл. 1), которые подтверждают практическое применение данного способа.

Пример №1. Результаты исследования крови донора П-ва показывают, что из числа исследованных тест-доз криопротекторов оптимальным является комбинированный криопротектор на основе 55% ДМАЦ и 5% ГЭК (СЦК ОП с/я нейтрофилов составляет 1,28 против 1,28 в КП. Заключение: ПКИ является комбинированный криопротектор на основе 55% ДМАЦ и 5% ГЭК, а НКИ являются 3,3% Глицерол, 15% ГМБТОЭМ, ТКД или 10% ДМСО, которые несут риски посттрансфузионных осложнений.

Пример №2. Результаты исследования крови донора Н-н показывают, что из числа исследованных тест-доз криопротекторов оптимальным является комбинированный криопротектор, содержащий 55% ДМАЦ + 5% ГЭК у которого СЦК ОП с/я нейтрофилов составляет 1,26, в ОП - также 1,26. Заключение: ПКИ является криопротектор на основе 55% ДМАЦ + 5% ГЭК, а НКИ являются 15% ГМБТОЭМ, 3,3% Глицерол, ТКД и 10% ДМСО, которые несут риски посттрансфузионных осложнений.

Пример №3. Результаты исследования крови донора С-ва показывают, что из числа исследованных тест-доз криопротекторов оптимальным является комбинированный криопротектор на основе 55% ДМАЦ и 5% ГЭК (СЦК с/я нейтрофилов в ОП составляет 1,29 против 1,29 в КП). Заключение: ПКИ является криопротектор комбинированный криопротектор на основе 55% ДМАЦ и 5% ГЭК, а НКИ являются 15% ГМБТОЭМ, 3,3% Глицерол, ТКД, 10%) ДМСО, которые несут риски посттрансфузионных осложнений.

Представленные примеры иллюстрируют применимость предлагаемого способа выявления эффективного криопротектора по содержанию щелочной фосфатазы в лейкоцитах консервированной крови. Способ дешев и может быть внедрен в практику медицинских центров, использующих трансфузии криоконсервированных компонентов крови или костного мозга.

Таким образом, благодаря использованию более чувствительного способа выявления эффективного криопротектора по содержанию ЩФ в лейкоцитах консервированной крови удается снизить риски планируемой криогемотрансфузионной терапии криопротекторного генеза.

Предлагаемое изобретение отвечает критериям «новизна» и «изобретательский уровень», так как проведенные патентно-информационные исследования не выявили источников патентной и научно-технической литературы, которые бы порочили новизну предлагаемого способа, равно как и известных способов с существенными признаками предлагаемого технического решения. Техническим результатом использования является возможность проведения индивидуального скрининга криопротекторов на доклиническом этапе их применения.

Способ выявления эффективного криопротектора по цитохимическому показателю содержания лейкоцитарной щелочной фосфатазы (ЛЩФ) аутокрови, отличающийся тем, что у больного до начала криогемотрансфузионной терапии эксфузируют порцию свежей аутокрови, стабилизируют раствором цитрата натрия, делят на равные части, в контрольную пробу (КП) добавки криопротекторов не вносят, в опытные пробы (ОП) вносят по одной равной дозе тестируемых криопротекторов, перемешивают при плюс 37°С в течение 4 ч, капли приготовленных биологических жидкостей из ОП и КП наносят в объеме 4 мкл на предметные стекла, делают мазки, готовят препараты для выявления ЛЩФ в с/я нейтрофилах по методике азосочетания Кеплоу, клетки микроскопируют в проходящем свете, проводят сравнительное исследование среднего цитохимического коэффициента (СЦК) ЛЩФ для с/я нейтрофилов в ОП и КП; тестируемый криопротектор оценивают как эффективный для конкретного пациента и пригодный к использованию с лечебной целью при значениях СЦК ЛЩФ ОП, равных значениям СЦК ЛЩФ КП; тестируемый криопротектор оценивают как неэффективный для конкретного пациента и непригодный к использованию с лечебной целью при значениях СЦК ЛЩФ ОП, отличных от таковых СЦК КП.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, пульмонологии и аллергологии, и касается прогнозирования риска развития бронхиальной астмы у детей раннего возраста.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики инфекционного мононуклеоза у человека. Для этого определяют относительное содержание атипичных мононуклеаров в гематологических мазках.

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования вероятности развития аденомиоза у женщин с миомой матки.

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования вероятности развития пролиферирующей миомы матки. Проводят иммунологическое исследование.

Изобретение относится к медицине, в частности к способу прогнозирования риска развития гепаторенального синдрома у больных с портальной гипертензией цирротического генеза.

Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии, и может быть использовано для прогнозирования риска дизадаптации сердечной деятельности при эпилепсии у детей.

Изобретение относится к медицине и касается способа ингибирования нуклеарного фактора каппа В в культуре клеток, включающего добавление бактериального липополисахарида в концентрации 1 мкг/мл к свежевыделенным по стандартной методике на градиенте плотности фиколла мононуклеарным клеткам крови крыс Wistar, затем добавление к данной смеси 5-гидроксиникотината калия, растворенного в фосфатно-солевом буфере, в конечной концентрации 35 мкг/мл.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к животноводству. Для отбора проб волос кобыл для исследования на элементный состав проводят настриг требуемого образца волос длиной L, которую рассчитывают с учетом скорости их отрастания от корня по формуле: L=S×I, где L - дистальное расстояние, отмеряемое от корня волос (мм), S - скорость роста волос (мм/сут), I - изучаемый временной период (сут).

Изобретение относится к области экологии, в частности к оценке территории, загрязненной тяжелыми металлами (ТМ), и может найти применение при мониторинге окружающей среды.

Изобретение относится к медицине, педиатрии, инфекционным болезням. Способ диагностики острых кишечных инфекций бактериальной этиологии у детей младшего возраста включает проведение общего анализа периферической крови, определение значения индекса ядерной интоксикации лейкоцитов, расчет вероятности бактериальной этиологии ОКИ по формуле: , где Р - вероятность в % бактериальной этиологии ОКИ; е - основание натурального логарифма, равное 2,7, Х - значение ЯИИ конкретного больного, при значении Р более 50% делают вывод о бактериальной этиологии ОКИ, менее 50% - об отсутствии бактериальной этиологии ОКИ.

Изобретение относится к области медицины, а именно к судебной медицине, и может быть использовано для посмертного определения факта мгновенно наступившей смерти при проведении судебно-медицинской экспертизы. Для этого проводят исследование концентрации веществ низкой и средней молекулярной массы (ВНСММ) в сыворотке крови (Мк) и в моче (Мм) трупа с помощью спектрофотометрического метода на длинах волны от 238 до 298 нм с шагом 4 нм, определение их соотношения и при значении соотношения определяют факт мгновенного наступлении смерти без атонального периода, при значении соотношения определяют наступление смерти с наличием агонии. Изобретение обеспечивает возможность определения факта мгновенно наступившей смерти без атонального периода, позволяет проводить экспресс диагностику в кратчайшие сроки после судебно-медицинского исследования трупа. При этом не требуется изъятия частей органов для гистологического и гистохимического исследования. 4 ил., 4 табл.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для выявления эффективного криопротектора по цитохимическому показателю содержания лейкоцитарной щелочной фосфатазы аутокрови. Для этого у больного до начала криогемотрансфузионной терапии эксфузируют порцию свежей аутокрови. Стабилизируют кровь раствором цитрата натрия. В контрольную пробу добавки криопротекторов не вносят. В опытные пробы вносят по одной равной дозе тестируемых криопротекторов, перемешивают при плюс 37°С в течение 4 ч. Капли приготовленных ОП и КП наносят в объеме 4 мкл на предметные стекла и делают мазки. Готовят препараты для выявления ЛЩФ в ся нейтрофилах по методике азосочетания Кеплоу. Проводят сравнительное исследование среднего цитохимического коэффициента ЛЩФ для ся нейтрофилов в ОП и КП. Тестируемый криопротектор оценивают как эффективный для пациента при значениях СЦК ЛЩФ ОП, равных значениям СЦК ЛЩФ КП. Тестируемый криопротектор оценивают как неэффективный для пациента при значениях СЦК ЛЩФ ОП, отличных от СЦК ЛЩФ КП. Изобретение позволяет выявить in vitro оптимальный криопротектор на доклиническом этапе криогемотрансфузионной терапии и снизить риск посттрансфузионных осложнений у пациентов. 1 табл., 3 пр.

Наверх