Способ определения уровня биосовместимости штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ определения уровня биосовместимости штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий. Способ включает раздельное выращивание штаммов на жидкой среде и соинкубирование их супернатантов в отдельности с взвесью клеток тест-штамма Bifidobacterium lognum МС-42. Отмытые клетки тест-штамма культивируют в питательном бульоне, отделяют супернатант, в котором затем культивируют соинкубированный ранее штамм, предварительно выращенный на плотной питательной среде, определяют его ростовые свойства, антилизоцимную активность, биопленкообразование. Рассчитывают уровень биосовместимости штаммов – В, (%) по формуле:

, где РСо и РСk - ростовые свойства штаммов в опыте и контроле, ед. ОП₄₅₀; БПОо и БПОk – биопленкообразование, ед. ОП₆₃₀; АЛАо и АЛАk - антилизоцимная активность, мкг/мл*ОП₄₅₀. При значении В, равном либо более 50%, биосовместимость штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий считают высокой. Способ позволяет определить уровень биосовместимости штаммов в консорциуме бактерий пробиотического действия. 4 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и медицине и может использоваться в научно-исследовательских и производственных бактериологических лабораториях с целью получения консорциума бифидобактерий и/или лактобактерий с высокой биосовместимостью для производства лечебно-профилактических средств пробиотической направленности, биологически активных добавок и бактерийных препаратов.

В связи с неблагоприятными экологическими условиями, стрессами, антибактериальной, лучевой и химиотерапией, дисбиозами, возникающими вследствие перенесенных заболеваний, увеличивается количество людей страдающих нарушениями нормальной микрофлоры организма. Для лечения и профилактики этих нарушений все большее внимание уделяется как препаратам, обладающим пробиотическим действием, так и пищевым продуктам, содержащим представителей нормальной микрофлоры кишечника - бифидобактерий и лактобактерий.

Проблема коррекции дисбиозов толстого кишечника человека можно рассматривать как общемедицинскую, поскольку нарушения микробиоценоза существенно в патогенезе большого количества заболеваний различной этиологии, в том числе и патологии висцеральных органов [Бухарин, О.В. Микросимбиоценоз / О.В. Бухарин, Н.Б. Перунова - Екатеринбург: УрО РАН, 2014. - 260 с.].

В настоящее время в мире продолжается поиск консорциумов пробиотических микроорганизмов с высоким лечебно-профилактическим эффектом. Большинство пробиотических препаратов создается на основе бифидобактерий и лактобактерий, являющихся наиболее значимыми представителями микросимбиоценоза человека и выполняющими многофункциональную роль в поддержании гомеостаза хозяина [Шендеров Б.А. Пробиотики, пребиотики и синбиотики. Общие и избранные разделы проблемы / Б.А. Шендеров // Пищевые ингредиенты. Сырье и добавки. - 2005. - №2. - С. 23-26; Бухарин, О.В. Бифидофлора при ассоциативном симбиозе человека / О.В. Бухарин, Н.Б. Перунова, Е.В. Иванова. - Екатеринбург: УрО РАН, 2014. С. 127-139].

Важной причиной не всегда убедительной клинической эффективности применяемых пробиотиков является то, что нередко при создании консорциума микроорганизмов пробиотического действия подбираются виды бактерий без учета их биосовместимости, что приводит к подавлению жизнеспособности микроорганизмов и утрате практически значимых свойств.

Известно наличие межвидового антагонизма у лактобактерий, реализуемого за счет продукции биологически активных соединений (молочная кислота, лактоцины, перекись водорода и т.д.) [Глушанова Н.А. Биосовместимость пробиотических и резидентных лактобацилл / Н.А. Глушанова, А.И. Блинов // Тезисы VII Славяно-Балтийского научного форума «Санкт-Петербург - Гастро-2005» // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. - 2005. - №1. - С. 31].

В результате пробиотические бифидобактерии и лактобактерий могут вступать в конкурентные взаимоотношения как между собой в консорциуме, так и с нормофлорой толстого кишечника человека, и лишь транзиторно сохраняется в организме, не всегда оказывая клиническое действие.

Получение консорциума штаммов с высокой биосовместимостью имеет преимущества в обеспечении эффективной и быстрой коррекции микроэкологических нарушений с выраженным лечебно-профилактическим действием.

Известен способ индивидуального подбора пробиотических препаратов, содержащих лактобактерий и/или бифидобактерии для элиминации условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника, заключающийся в выявлении адгезивной активности пробиотических препаратов, содержащих лактобактерий и/или бифидобактерии, к буккальному эпителию пациента, определении биосовместимости исследуемых пробиотических препаратов с индигенными лакто- и бифидобактериями пациента [патент РФ 2428468, C12N 1/20, A61K 35/74, 2011].

В известном способе для определения биосовместимости пробиотических и индигенных лактобактерий и бифидобактерий используют капельную методику. Проводят наложение капель двух исследуемых штаммов с отступом в 1-2 мм друг от друга и оценку особенности их роста в месте контакта на питательном агаре. Культуры считают биосовместимыми в случае обнаружения роста двух исследуемых культур, сходного с ростом в контроле. При задержке или отсутствии роста одной из культур взаимоотношения между ними рассматриваются как антагонистические и культуры считаются не совместимыми.

Однако такой подход не позволяет определить уровень биосовместимости, так как метод является качественным.

Известен способ получения консорциума бифидобактерий для приготовления бактерийных препаратов и биологически активных добавок к пище, предназначенных для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта людей старше 14 лет, предусматривающий совместное культивирование в питательной среде входящих в него штаммов [патент РФ 2491332, C12N 1/20, A61K 35/74, А23С 9/12, A23L 1/29, 2013].

Данный способ основан на предварительном изучении и подборе для совместного культивирования штаммов по принципу биосовместимости и с учетом кинетики роста каждого из них. Алгоритмом к созданию консорциума бифидобактерий является совместное культивирование входящих в него штаммов с учетом длительности экспоненциальной фазы роста каждого из них, на основании чего определяется временная точка засева питательной среды при поэтапном внесении инокулятов монокультур. Для этого подбирают строго количественное соотношение посевного материал каждого из штаммов. По оптическому стандарту мутности устанавливают концентрацию колониеобразующих единиц (КОЕ/мл), соответствующую 1 млрд. клеток бифидобактерий.

Такой же подход использован при получении консорциумов бифидобактерий и лактобактерий, используемых для приготовления бактериальных препаратов, заквасок для кисломолочных продуктов, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок, предназначенных для коррекции микрофлоры людей в различные его возрастные периоды [патенты РФ 2180348, 2180915, 2180914, C12N 1/20, A61K 35/74, А23С 9/12, 2002].

Основным недостатком известных способов является то, что при создании консорциумов бифидобактерий и лактобактерий учитывается только их рост и резистентность к среде. Однако из-за широкого видового разнообразия пробиотических составляющих в консорциуме существует высокий риск конкурентных или нейтральных взаимоотношений пробиотических культур как в консорциуме, так и с микрофлорой человека [Глушанова Н.А. Исследование ауто-, изо- и гомоантагонизма пробиотических штаммов лактобацилл / Н.А. Глушанова, Н.Б. Вербицкая, Л.Н. Петров, А.И. Блинов, Б.А. Шендеров // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2005. - №6 (44). - С. 138-142; Дармов И.В. Выживаемость микроорганизмов пробиотиков в условиях in vitro, имитирующих условия пищеварения у человека / И.В. Дармов, И.Ю Чичерин., И.П. Погорельский, И.А. Лундовских // Экспериментальная гастроэнтерология. - 2011. - №3. - С. 6-11].

Технический результат, на достижение которого направлено патентуемое изобретение, заключается в разработке способа определения уровня биосовместимости штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий.

Для достижения указанного технического результата заявляемый способ определения уровня биосовместимости штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий, включает следующие этапы:

- выращивание каждого из исследуемых штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий в отдельности в жидкой питательной среде при 37°С в течение 48 часов в СО₂-инкубаторе;

- центрифугирование полученных бульонных культур при 3200 об/мин в течение 15 минут и отделение супернатантов от микробных клеток путем пропускания через мембранные фильтры;

- выращивание тест-штамма В. longum МС-42 на плотной питательной среде при 37°С в течение 48 часов в СО₂-инкубаторе и приготовление из выросшей культуры одномиллиардной взвеси (оптическая плотность 3 McF) на 0,9% растворе хлорида натрия;

- соинкубирование супернатантов исследуемых штаммов, каждого в отдельности, с одномиллиардной взвесью тест-штамма В. longum МС-42 в соотношении 1:2 в течение 1 часа в СО₂-инкубаторе;

- центрифугирование всех проб при 3200 об/мин в течение 15 минут, отмывание клеток тест-штамма В. longum МС-42 трижды 0,9% раствором хлорида натрия, ресуспендирование отмытых клеток В. longum МС-42 в питательный бульон и культивирование при 37°С в течение 48 часов в СО₂-инкубаторе, центрифугирование полученных проб и отделение супернатантов от микробных клеток пропусканием через мембранные фильтры;

- выращивание, каждого исследуемого штамма микроорганизмов в отдельности, на плотной питательной среде при 37°С в течение 48 часов в СО₂-инкубаторе и приготовление из каждой выросшей культуры одномиллиардной взвеси (оптическая плотность 3 McF) на 0,9% растворе хлорида натрия;

- приготовление опытных проб путем смешивания полученных взвесей исследуемых штаммов с супернатантами В. longum МС-42 и питательным бульоном в соотношении 1:1:8, причем проводят смешивание супернатанта В. longum МС-42 соответственно с взвесью того исследуемого штамма, с которым ранее он был соинкубирован;

- приготовление контроля из полученных взвесей исследуемых штаммов микроорганизмов с питательным бульоном в соотношении 1:9;

- культивирование опытных и контрольных проб при 37°С в течение 48 часов в СО₂-инкубаторе;

- определение значения показателя ростовых свойств, антилизоцимной активности и биопленкообразования исследуемых штаммов в опытных и контрольных пробах;

- расчет показателя уровня биосовместимости исследуемых штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий с тест-штаммом В. longum МС-42 по формуле:

где В - показатель уровня биосовместимости, %;

РСо - ростовые свойства штаммов в опыте, ед. ОП₄₅₀;

PCk - ростовые свойства штаммов в контроле, ед. ОП₄₅₀;

БПОо - биопленкообразование штаммов в опыте, ед. ОП₆₃₀;

БПОk - биопленкообразование штаммов в контроле, ед. ОП₆₃₀;

АЛАо - антилизоцимная активность штаммов в опыте, мкг/мл*OD;

АЛАk - антилизоцимная активность штаммов в контроле, мкг/мл*OD,

при этом при значении показателя уровня биосовместимости равном либо больше 50% биосовместимость штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий считают высокой.

Техническим результатом изобретения является тот факт, что заявляемый способ позволяет определить уровень биосовместимости штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий и использовать полученные данные при получении консорциумов бифидобактерий и/или лактобактерий пробиотического действия, используемых для получения заквасок, пробиотических препаратов, биологически активных добавок и продуктов питания.

При изучении регуляторных межмикробных взаимодействий в микросимбиоценозе авторами экспериментально установлена возможность определения «свой-чужой» по оппозитному (усиление/подавление) эффекту базовых физиологических характеристик (репродукция и адаптация) микроорганизмов в паре «доминант-ассоциант» [Бухарин, О.В. Микросимбиоценоз / О.В. Бухарин, Н.Б. Перунова - Екатеринбург: УрО РАН, 2014. С. 187-203]. Это позволило дифференцировать по наличию синергизма или антагонизма «свои» и «чужие» микросимбионты. Этот метод хорошо зарекомендовал себя для оценки чужеродности пробиотических культур Е. coli М-17 (с островом патогенности) и Е. coli ЛЭГМ-18 (без острова патогенности) [Бухарин О.В., Перунова Н.Б., Иванова Е.В., Андрющенко СВ. Межмикробное распознавание «свой-чужой» в паре «доминант-ассоциант» пробиотических штаммов Escherichia coli М-17 и Escherichia coli ЛЭГМ-18 // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2016. №3, С. 3-9]. Тестирование культуры Е. coli М-17 выявило угнетение изучаемых биологических признаков, что позволило отнести Е. coli М-17 к «чужим» видам, хотя она использовалась в коммерческом препарате «Колибактерин» (снят с производства) в прошлом. Тогда как Е. coli ЛЭГМ-18 (без этого фрагмента) подлежала оценке как «своя», поскольку резко усиливала свои биологические характеристики.

При разработке заявляемого изобретения мы опирались на ранее выявленный нами феномен микробного распознавания в паре «доминант-ассоциант», основанный на принципе индукции метаболитов в результате предварительного соинкубирования с супернатантом ассоциантов и формировании обратной связи в паре «доминант-ассоциант». При этом соинкубирование микробных культур с метаболитами проводили в несколько этапов, оценивая результат по изменению базовых параметров физиологических функций микросимбионтов [Бухарин, О.В. Микросимбиоценоз / О.В. Бухарин, Н.Б. Перунова - Екатеринбург: УрО РАН, 2014. С. 184-186].

В проведенных экспериментах в качестве исследуемых культур были использованы 12 штаммов бифидобактерий и лактобактерий. В том числе 6 производственных культур: Bifidobacterium bifidum 791 (ВНИИ Генетика Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика), номер депозита ЦМПМ №В-3300 и Государственная коллекция микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (ГКНМ ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского) №80), Lactobacillus plantarum 8Р-А3 (Государственная коллекция патогенных микроорганизмов (ГКПМ), Россия, №900811), Lactobacillus fermentum 90Т-С4 (ГКПМ, Россия, №900812), Lactobacillus acidophilus К3Ш24 (№42 в ГКНМ ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского или №В-3190 в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика), Lactobacillus acidophilus 100аш (ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика, ВКПМ № В-3190), Lactobacillus acidophilus NK1 (ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика, ВКПМ № В-8957 (В центральной лаборатории ВНИМИ №22/10)) и 6 клинических штаммов, изолированных при изучении микроэкологического состояния толстого кишечника человека: В. bifidum 218, В. longum 315, В. pseudocatenulatum 138, L. acidophilus 15, L. plantarum 34, В. adolescentis 189.

Микроорганизмы данных видов были нами использованы в работе, поскольку являются одними из наиболее значимых представителей микрофлоры организма человека, выполняя многофункциональную роль в поддержании гомеостаза организма и часто входят в состав лечебно-профилактических препаратов (про- и синбиотиков).

Для определения биосовместимости был использован тест-штамм Bifidobacterium longum МС-42 (ранее идентифицированный в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика, номер депозита ЦМПМ №В-1987 и ГКНМ ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского №210 в качестве Bifidobacterium adolescentis МС-42; в настоящее время по данным полногеномного секвенирования идентифицирован как Bifidobacterium longum МС-42 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/biosample/4263942).

Использование в качестве тест-штамма В. longum МС-42 обусловлено тем, что данный вид бифидобактерий характерен для детей и взрослых и выделяется у 40-60% детей первого года жизни и 70-75% детей старшего возраста и взрослых [Бухарин, О.В. Бифидофлора при ассоциативном симбиозе человека / О.В. Бухарин, Н.Б. Перунова, Е.В. Иванова. - Екатеринбург: УрО РАН, 2014. С. 42-49]. Кроме того, известна возможность использования В. longum МС-42 в микробном распознавании чужеродности клинических штаммов микроорганизмов в микросимбиоценозе кишечника человека [Бухарин, О.В. Микросимбиоценоз / О.В. Бухарин, Н.Б. Перунова - Екатеринбург: УрО РАН, 2014. С. 194-203].

Авторами были проведены следующие эксперименты.

Исследуемые культуры бифидобактерий и лактобактерий выращивали в жидкой питательной среде, а тест-штамм В. longum МС-42 - на плотной питательной среде при 37°С в течение 48 часов в CO₂-инкубаторе (BINDER, Германия).

Затем из бульонных культур бифидобактерий и лактобактерий получали супернатанты, отделяя надосадок от бактериальных клеток центрифугированием при 3200 об/мин в течение 15 минут и фильтрацией внеклеточной жидкости через мембраны «Millipore» с диаметром пор 0,2 мкм.

Параллельно из выросшей культуры тест-штамма В. longum МС-42 готовили одномиллиардную взвесь по стандарту мутности (1×10⁹ КОЕ/мл, 3 McF).

Далее соинкубировали супернатанты исследуемых бифидобактерий и лактобактерий, каждого в отдельности, с взвесью тест-штамма В. longum МС-42 (1×10⁹ КОЕ/мл, 3 McF) в соотношении 1:2 в течение 1 часа в СО₂-инкубаторе (BINDER, Германия).

Затем центрифугировали все пробы при 3200 об/мин в течение 15 минут, отмывали клетки тест-штамма В. longum МС-42 трижды 0,9% раствором хлорида натрия, ресуспендировали отмытые клетки В. longum МС-42 в питательный бульон и культивировали при 37°С в течение 48 часов в СО₂-инкубаторе, центрифугировали полученные пробы и отделяли супернатанты от микробных клеток пропусканием через мембранные фильтры;

Определение влияния каждого супернатанта тест-штамма В. longum МС-42 на антилизоцимную активность, ростовые свойства и биопленкообразование исследуемых культур бифидобактерий и лактобактерий проводили путем добавления его в соотношении 1:9 в питательный бульон с взвесью бифидобактерий и лактобактерий (3 McF), с которой проводилось предварительное соинкубирование. В качестве контроля на каждом этапе исследований вместо супернатанта В. longum МС-42 использовали эквивалентное количество питательного бульона.

Для определения антилизоцимной активности (АЛА) бактерий использовали известный способ определения антилизоцимной активности микроорганизмов [патент РФ 2126051, C12Q 1/02, 1999].

Согласно известному способу для определения АЛА в качестве тест-культуры использовали суточную агаровую культуру Micrococcus lysodeikticus (штамм №2665 ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Культуру растворяли в физиологическом растворе, доводили оптическую плотность (ОП) тест-штамма до 0,300 (0,28-0,32). На 1/15М фосфатном буфере (рН=6,2) готовили раствор лизоцима с концентрацией 20 мкг/мл. Для изучения влияния супернатанта В. longum МС-42 на АЛА бифидобактерий и лактобактерий, в одномоментно вносилось по 2800 мкл питательного бульона, 100 мкл суспензии суточной агаровой культуры бифидобактерий и лактобактерий в концентрации 0,5×10⁶ КОЕ/мл и 100 мкл супернатанта В. longum МС-42 (опыт) или 100 мкл питательного бульона (контроль). Все пробы инкубировались 48 часов статически при 37°С в CO₂-инкубаторе (BINDER, Германия). Контрольные и опытные пробы бифидобактерий и лактобактерий отделяли от микробных клеток центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 минут и получали супернатант. Супернатант бифидобактерий и лактобактерий объемом 0,9 мл смешивали с 0,1 мл приготовленного раствора лизоцима и инкубировали 60-120 мин при 37°С. Затем смесь супернатанта с лизоцимом помещали в полистеролловый планшет и вносили суспензию микрококка. Замер оптической плотности проводили через 30 с и 150 с после внесения в лунки микрококка.

Антилизоцимную активность исследуемой культуры рассчитывали по формуле:

где

А - антилизоцимная активность в микрограммах инактивированного лизоцима/мл супернатанта * ед. оптической плотности бульонной культуры, мкг/мл*OD;

V1 - объем (0,1 мл) раствора лизоцима исходной концентрации (20 мкг/мл);

V2 - объем (0,9 мл) супернатанта бульонной культуры исследуемого штамма;

С - исходная концентрация лизоцима (20 мкг/мл);

Y - оптическая плотность бульонной культуры исследуемого штамма, ед. оптической плотности;

ΔD₀ - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в опыте между 30 и 150 секунд [D₀(30") - D₀(150")];

ΔDk - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в контроле между 30 и 150 секунд [D_к(30") - D_к(150")].

Антилизоцимную активность опытных и контрольных проб выражали в мкг/мл*OD.

Для изучения ростовых свойств (PC) исследуемых штаммов бифидобактерий и лактобактерий выполнялось измерение оптической плотности биомассы культуры. Для этого применялись 96-луночные стерильные плоскодонные планшеты, в лунки которых одномоментно вносилось по 100 мкл питательного бульона, 135 мкл суспензии суточной агаровой культуры бифидобактерий и лактобактерий в концентрации 0,5×10⁶ КОЕ/мл и 15 мкл супернатанта В. longum МС-42 (опыт) и 15 мкл питательного бульона (контроль). Все пробы инкубировались 48 часов статически при 37°С в СО₂-инкубаторе (BINDER, Германия). Для учета репродуктивных свойств бифидобактерий и лактобактерий проводили замер на спектрофотометре (BioTek, США) при длине волны 450 нм. Репродуктивные свойства опытных и контрольных проб выражали в условных единицах оптической плотности.

Проводили изучение биопленкообразования (БПО) исследуемых штаммов бифидобактерий и лактобактерий фотометрическим методом по интенсивности поглощения красителя (кристалл-виолета) микробной биопленкой, адгезированной к поверхности лунки полистиролового планшета [ G.A., Kolter R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol Microbiol 1998, 30, P. 295-304; G.A., Pratt L.A., Watnick P.I., Newman D.K., Weaver V.В., Kolter R. Genetic approaches to the study of biofilms. Methods Enzymol 1999, 310, P. 91-109]. В лунки 96-луночных стерильных плоскодонных планшетов одномоментно вносилось по 100 мкл питательного бульона, 135 мкл суспензии суточной агаровой культуры бифидобактерий и лактобактерий в концентрации 0,5×10⁶ КОЕ/мл и 15 мкл супернатанта В. longum МС-42 (опыт) или 15 мкл питательного бульона (контроль). Все пробы инкубировались 48 часов при 37°С в СО₂-инкубаторе (BINDER, Германия). Для учета биопленкообразования после удаления планктонных (свободноплавающих) клеток микроорганизмов трехкратной промывкой лунок дистиллированной водой (200 мкл) и подсушивания планшетов на воздухе (30 мин), осуществлялось окрашивание сформированных биопленок внесением в лунки 1% раствора кристалл-виолета (45 мин при комнатной температуре). Отмывание свободного красителя выполняли трехкратной обработкой лунок дистиллированной водой, а экстракцию фиксированного в биопленках красителя проводили добавлением к пробам 200 мкл 96% этанола. Интенсивность окрашивания последнего, соответствующая значению показателя биопленкообразования бифидобактерий и лактобактерий, определяли на спектрофотометре (BioTek, США) при длине волны 630 нм. Показатель биопленкообразования опытных и контрольных проб выражали в условных единицах оптической плотности (ОП₆₃₀).

Полученные значения АЛА, БПО и PC бифидобактерий и лактобактерий использовали для расчета показателя уровня биосовместимости бифидобактерий и лактобактерий с тест-штаммом В. longum МС-42 по формуле:

где В - показатель уровня биосовместимости, %;

РСо - ростовые свойства штаммов в опыте, ед. ОП₄₅₀;

PCk - ростовые свойства штаммов в контроле, ед. ОП₄₅₀;

БПОо - биопленкообразование штаммов в опыте, ед. ОП₆₃₀;

БПОk - биопленкообразование штаммов в контроле, ед. ОП₆₃₀;

АЛАо - антилизоцимная активность штаммов в опыте, мкг/мл*OD;

АЛАk - антилизоцимная активность штаммов в контроле, мкг/мл*OD

Авторами было проведено 72 теста в дублировании, в ходе которых были определены значения показателя уровня биосовместимости культур бифидобактерий и лактобактерий с тест-штаммом В. longum МС-42. Суммированные результаты на основании 3 кратного повторения опытов приведены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, у разных исследуемых культур бифидобактерий и лактобактерий уровень биосовместимости с тест-штаммом В. longum МС-42 определялся как с положительным, так и с отрицательным значением.

Наличие положительного значения показатели уровня биосовместимости свидетельствовало о наличии синергидных взаимодействий между штаммами (синергизм) и их биосовместимости (БС). Синергидные взаимодействия были установлены у В. longum МС-42 с производственными штаммами - В. bifidum №791, L. fermentum 90Т-С4, L. acidophilus NK1, L. acidophilus 100 аш и клиническими культурами - В. bifidum 218, В. longum 315, В. adolescentis 189. Данные ассоциации были определены как биосовместимые.

Тогда как, отрицательные значения показателя уровня биосовместимости свидетельствовали о подавляющем влиянии метаболитов тест-штамма В. longum МС-42 на АЛА, PC и БПО культур бифидобактерий и лактобактерий, что означало антагонистические взаимодействия (антагонизм) между микроорганизмами и не позволяло рассматривать данные ассоциации как биосовместимые. Такие ассоциации были установлены у штамма В. longum МС-42 с культурами L. plantarum 8Р-А3 и L. acidophilus К3Ш24, L. plantarum 34.

Индифферентное влияние, характеризующееся отсутствием достоверного (р≤0,05) как ингибирующего, так и стимулирующего влияния метаболитов тест-штамма на изучаемые параметры культур бифидобактерий и лактобактерий, свидетельствовало о нейтральных взаимодействиях между культурами и не позволяло рассматривать данные ассоциации как биосовместимые. Наличие отрицательных или положительных значений показателя уровня биосовместимости в данных парах не учитывались. Такие ассоциации были установлены у штамма В. longum МС-42 с культурами В. pseudocatenulatum 138, В. adolescentis 189 и L. acidophilus 15 и считались бионесовместимыми (БНС).

Далее для определения биосовместимости исследуемых штаммов бифидобактерий и лактобактерий с тест-штаммом В. longum МС-42 проводили совместное с ним культивирование в питательном бульоне:

- В. longum МС-42 и В. bifidum №791;

- В. longum МС-42 и В. bifidum 218;

- В. longum МС-42 и L. fermentum 90Т-С4;

- В. longum МС-42 и В. longum 315;

- В. longum МС-42 и L.acidophilus NK 1;

- В. longum МС-42 и L.acidophilus 100 аш.

Далее заявляемым способом определяли показатель уровня биосовместимости исследуемых штаммов бифидобактерий и лактобактерий с тест-штаммом В. longum МС-42.

Затем определяли количество колониеобразующих единиц (КОЕ/мл) пробиотических и клинических штаммов (специфической активности штаммов).

Результаты исследований представлены в таблице 2.

В соответствии с требованиями ФСП [Отраслевой стандарт ОСТ 91500.05.001-00 "Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения", 2001, 38 с.] в 1 дозе пробиотического препарата должно содержаться производственных штаммов не менее 10⁹ КОЕ/мл, значение уровня высокой биосовместимости с тест-штаммом В. longum МС-42 было определено как равное либо больше 50%.

Как видно из таблиц 2, штаммы В. bifidum №791, В. bifidum 218 и L. fermentum 90Т-С4, имеющие специфическую активность 10×10⁹ КОЕ/мл и выше, характеризовались высоким значением показателя уровня биосовместимости с тест-штаммом В. longum МС-42 равном либо больше 50% (от 50 до 76%), тогда как КОЕ/мл исследуемых штаммов, имевшим показатель уровня биосовместимости менее 50%, был ниже 10×10⁹ КОЕ/мл и составлял у В. longum 315 - 8,76×10⁸ КОЕ/мл, у L. acidophilus NK 1 - 9,68×10⁷ КОЕ/мл и у L.acidophilus 100 аш - 4,52×10⁶ КОЕ/мл.

Таким образом, проведенные авторами исследования показали, что, развиваясь в ассоциации, в составе микробных консорциумов исследуемые штаммы бифидобактерий и лактобактерий в зависимости от показателя уровня их биосовместимости достигают различного уровня накопления биомассы, т.е. различной численности микробов при совместном культивировании.

На следующем этапе экспериментов авторами было установлено, что микроорганизмы, имеющие значение показателя уровня биосовместимости с тест-штаммом В. longum МС-42 равном либо больше 50%, между собой также имели высокий уровень биосовместимости (табл. 3) и не проявляли антагонистической активности по отношению друг к другу, сохраняя высокую численность (КОЕ/мл) микроорганизмов при совместном культивировании (табл. 4).

Как видно из таблицы 3, у разных исследуемых культур бифидобактерий и лактобактерий уровень биосовместимости по отношению друг к другу определялся с положительным значением, что свидетельствовало о наличии синергидных взаимодействий между штаммами (синергизм) и их биосовместимости. Значения уровня биосовместимости культур друг к другу составляли от 51 до 61%, что характеризовало высокий уровень биосовместимости микробных культур.

Как видно из таблиц 4 штаммы В. bifidum №791 и L. fermentum 90Т-С4, ранее имеющие высокий показатель уровня биосовместимости с тест-штаммом В. longum МС-42 (табл. 1), при совместном культивировании также достигали высокой численности 9,2×10¹⁰ КОЕ/мл и 9,1×10¹⁰ КОЕ/мл, что и отмечалось в микробном консорциуме из трех штаммов (В. bifidum №791, В. bifidum 218 и L. fermentum 90Т-С4), специфическая активность составляла 10×10⁹ КОЕ/мл.

Таким образом, заявляемый способ позволяет определить уровень биосовместимости штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий и использовать полученные данные при получении консорциумов бифидобактерий и/или лактобактерий пробиотического действия, используемых для получения заквасок, пробиотических препаратов, биологически активных добавок и продуктов питания.

Способ осуществляется следующим образом.

1. Выращивают каждый из исследуемых штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий в отдельности в жидкой питательной среде при 37°С в течение 48 часов в СО₂-инкубаторе.

2. Бульонные культуры исследуемых штаммов микроорганизмов центрифугируют (3200 об/мин в течение 15 минут), супернатанты отделяют от микробных клеток, пропускают через мембранные фильтры («Millipore», диаметр пор 0,2 мкм).

3. Параллельно выращивают тест-штамм В. longum МС-42 на плотной питательной среде при 37°С в течение 48 часов в CO₂-инкубаторе и из выросшей культуры готовят одномиллиардную взвесь (оптическая плотность 3 McF) на 0,9% растворе хлорида натрия.

4. Соинкубируют супернатанты исследуемых бифидобактерий и/или лактобактерий, каждого в отдельности, с одномиллиардной взвесью тест-штамма В. longum МС-42 (1×10⁹ КОЕ/мл, 3 McF) в соотношении 1:2 в течение 1 часа в СО₂-инкубаторе (BINDER, Германия).

5. После инкубации все пробы центрифугируют, надосадочную жидкость сливают, клетки тест-штамма В. longum МС-42 трижды отмывают 0,9% раствором хлорида натрия, ресуспендируют в 1,0 мл питательного Schaedler-бульона (BBL, США) и культивируют при 37°С в течение 48 часов в СО₂-инкубаторе, после культивирования пробы центрифугируют при 3200 об/мин в течение 15 минут и отделяют супернатанты от микробных клеток пропусканием через мембранные фильтры («Millipore», диаметр пор 0,2 мкм).

6. Параллельно исследуемые штаммы микроорганизмов (каждый исследуемый штамм микроорганизмов в отдельности) выращивают на плотной питательной среде при 37°С в течение 48 часов в СО₂-инкубаторе и из каждой выросшей культуры готовят одномиллиардную взвесь (оптическая плотность 3 McF) на 0,9% растворе хлорида натрия.

7. Полученные взвеси исследуемых штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий смешивают с супернатантами В. longum МС-42 и питательным бульоном в соотношении 1:1:8. Причем, супернатант В. longum МС-42 смешивают с взвесью того исследуемого штамма бифидо- и/ лактобактерий с которым ранее был соинкубирован тест-штамм В. longum МС-42 в соответствии с пунктом 4.

8. Готовят контроль. Полученные взвеси исследуемых штаммов микроорганизмов смешивают с питательным бульоном в соотношении 1:9.

9. Опытные и контрольные пробы культивируют при 37°С в течение 48 часов в СО₂-инкубаторе.

10. Определяют значения показателя ростовых свойств, антилизоцимной активности и биопленкообразования исследуемых штаммов микроорганизмов опытных и контрольных пробах.

Для изучения ростовых свойств (PC) исследуемых бифидобактерий и лактобактерий выполняют измерение оптической плотности биомассы культуры. Для этого применяют 96-луночные стерильные плоскодонные планшеты, в лунки которых одномоментно вносят по 100 мкл питательного бульона, 135 мкл суспензии суточной агаровой культуры бифидобактерий и лактобактерий в концентрации 0,5×10⁶ КОЕ/мл и 15 мкл супернатанта В. longum МС-42 (опыт) или 15 мкл питательного бульона (контроль). Все пробы инкубируют 48 часов статически при 37°С в СО₂-инкубаторе (BINDER, Германия). Для учета репродуктивных свойств бифидо- и лактобактерий проводят замер на спектрофотометре (BioTek, США) при длине волны 450 нм. Репродуктивные свойства опытных и контрольных проб выражают в условных единицах оптической плотности.

Для определения антилизоцимной активности (АЛА) используют известный способ определения антилизоцимной активности микроорганизмов [патент РФ 2126051, C12Q 1/02, 1999].

Согласно известному способу для определения АЛА в качестве тест-культуры используют суточную агаровую культуру Micrococcus lysodeikticus (штамм №2665 ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Культуру растворяют в физиологическом растворе, доводят оптическую плотность (ОП) тест-штамма до 0,300 (0,28-0,32). На 1/15М фосфатном буфере (рН=6,2) готовят раствор лизоцима с концентрацией 20 мкг/мл. В одномоментно вносят по 2800 мкл питательного бульона, 100 мкл суспензии суточной агаровой культуры бифидобактерий и лактобактерий в концентрации 0,5×10⁶ КОЕ/мл и 100 мкл супернатанта В. longum МС-42 (опыт) или 100 мкл питательного бульона (контроль). Все пробы инкубируют 48 часов статически при 37°С в СО₂-инкубаторе (BINDER, Германия). Контрольные и опытные пробы отделяют от микробных клеток центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 минут и получают супернатант. Супернатант бифидобактерий и лактобактерий объемом 0,9 мл смешивают с 0,1 мл приготовленного раствора лизоцима и инкубируют 60-120 мин при 37°С.

Затем смесь супернатанта с лизоцимом помещали в полистероловый планшет и вносили суспензию микрококка. Замер оптической плотности проводили через 30 с и 150 с после внесения в лунки микрококка.

Антилизоцимную активность исследуемой культуры рассчитывают по формуле:

где

A - антилизоцимная активность в микрограммах инактивированного лизоцима/мл супернатанта * ед. оптической плотности бульонной культуры, мкг/мл*OD;

V1 - объем (0,1 мл) раствора лизоцима исходной концентрации (20 мкг/мл);

V2 - объем (0,9 мл) супернатанта бульонной культуры исследуемого штамма;

С - исходная концентрация лизоцима (20 мкг/мл).

Y - оптическая плотность бульонной культуры исследуемого штамма, ед. оптической плотности;

ΔD₀ - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в опыте между 30 и 150 секунд [D₀(30") - D₀(150")];

ΔD_k - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в контроле между 30 и 150 секунд [D_к(30") - D_к(150")].

Определение биопленкообразования проводят с использованием фотометрического метода по интенсивности поглощения красителя (кристалл-виолета) микробной биопленкой, адгезированной к поверхности лунки полистиролового планшета [ G.A., Kolter R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol Microbiol 1998, 30, P. 295-304; G.A., Pratt L.A., Watnick P.I., Newman D.K., Weaver V.В., Kolter R. Genetic approaches to the study of biofilms. Methods Enzymol 1999, 310, P. 91-109]. В лунки 96-луночных стерильных плоскодонных планшетов одномоментно вносилось по 100 мкл питательного бульона, 135 мкл суспензии суточной агаровой культуры бифидобактерий и лактобактерий в концентрации 0,5×10⁶ КОЕ/мл и 15 мкл супернатанта В. longum МС-42 (опыт) или 15 мкл питательного бульона (контроль). Все пробы инкубировались 48 часов при 37°С в CO₂-инкубаторе (BINDER, Германия). Для учета биопленкообразования после удаления планктонных (свободноплавающих) клеток микроорганизмов трехкратной промывкой лунок дистиллированной водой (200 мкл) и подсушивания планшетов на воздухе (30 мин), осуществлялось окрашивание сформированных биопленок внесением в лунки 1% раствора кристалл-виолета (45 мин при комнатной температуре). Отмывание свободного красителя выполняли трехкратной обработкой лунок дистиллированной водой, а экстракцию фиксированного в биопленках красителя проводили добавлением к пробам 200 мкл 96% этанола. Интенсивность окрашивания» последнего, соответствующая значению показателя биопленкообразования бифидобактерий и лактобактерий, определяли на спектрофотометре (BioTek, США) при длине волны 630 нм. Показатель биопленкообразования опытных и контрольных проб выражали в условных единицах оптической плотности (ОП₆₃₀).

12. Рассчитывают показатель уровня биосовместимости исследуемых штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий с тест-штаммом В. longum МС-42:

где В - показатель уровня биосовместимости, %;

РСо - ростовые свойства штаммов в опыте, ед. ОП₄₅₀;

PCk - ростовые свойства штаммов в контроле, ед. ОП₄₅₀;

БПОо - биопленкообразование штаммов в опыте, ед. ОП₆₃₀;

БПОk - биопленкообразование штаммов в контроле, ед. ОП₆₃₀;

АЛАо - антилизоцимная активность штаммов в опыте, мкг/мл*OD;

АЛАk - антилизоцимная активность штаммов в контроле, мкг/мл*OD,

при этом при значении уровня биосовместимости равном либо больше 50% биосовместимость штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий считают высокой.

Примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1.

Определяли уровень биосовместимости штамма В. bifidum 791 (ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика, номер депозита ЦМПМ №В-3300 и ГКНМ ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского №80) по отношению к тест-штамму В. longum МС-42 (ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика, номер депозита ЦМПМ №В-1987 и ГКНМ ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского №210).

Исследуемый штамм В. bifidum 791 выращивали в жидком питательной среде при 37°С в течение 48 часов в CO₂-инкубаторе (BINDER, Германия).

Из бульонной культуры штамма В. bifidum 791 получали супернатант, отделяя надосадок от бактериальных клеток центрифугированием при 3200 об/мин в 15 минут и фильтрацией внеклеточной жидкости через мембраны «Millipore» с диаметром пор 0,2 мкм.

Параллельно выращивали тест-штамм В. longum МС-42 на плотной питательной среде при 37°С в течение 48 часов в СО₂-инкубаторе (BINDER, Германия) и из выросшей культуры готовили одномиллиардную взвесь по стандарту мутности 3 McF (1×10⁹ КОЕ/мл) на 0,9% растворе хлорида натрия.

Супернатант штамма В. bifidum 791 соинкубировали с взвесью тест-штамма В. longum МС-42 (1×10⁹ КОЕ/мл, 3 McF) в соотношении 1:2 в течение 1 часа в CO₂-инкубаторе (BINDER, Германия).

Затем центрифугировали при 3200 об/мин в течение 15 минут, отмывали клетки тест-штамма В. longum МС-42 трижды 0,9% раствором хлорида натрия, ресуспендировали отмытые клетки В. longum МС-42 в питательном бульоне и культивировали при 37°С в течение 48 часов в CO₂-инкубаторе, опять центрифугировали и отделяли супернатант от микробных клеток пропусканием через мембранные фильтры.

Параллельно выращивали исследуемый штамм В. bifidum 791 на плотной питательной среде при 37°С в течение 48 часов в СО₂-инкубаторе и готовили из выросшей культуры одномиллиардную взвесь (1×10⁹ КОЕ/мл, 3 McF) на 0,9% растворе хлорида натрия.

Готовили опытную пробу путем смешивания полученной взвеси исследуемого штамма В. bifidum 791 с супернатантом тест-штама В. longum МС-42 и питательным бульоном в соотношении 1:1:8.

Параллельно готовили контроль из одномиллиардной взвеси исследуемого штамма В. bifidum 791 с питательным бульоном в соотношении 1:9.

Опытную и контрольную пробу культивировали при 37°С в течение 48 часов в СО₂-инкубаторе.

Определяли значения показателя ростовых свойств штамма В. bifidum 791 в опытной и контрольной пробе.

Ростовые свойства штамма В. bifidum 791 оценивали по оптической плотности бульонной культуры штамма В. bifidum 791 в 96-луночных стерильных плоскодонных планшетах и выражали в условных единицах оптической плотности, замер проводили на спектрофотометре (BioTek, США) при длине волны 450 нм.

Значения показателя ростовых свойств штамма В. bifidum 791 составили в контроле 0,6 ед. ОП₄₅₀, в опыте - 0,8 ед. ОП₄₅₀.

Определяли значение показателя антилизоцимной активности штамма В. bifidum 791 в опытной и контрольной пробах.

Для определения антилизоцимной активности (АЛА) использовали известный способ определения антилизоцимной активности микроорганизмов [патент РФ 2126051, C12Q 1/02, 1999].

Рассчитывали антилизоцимную активность исследуемой культуры в опыте и контроле по формуле:

где

А - антилизоцимная активность в микрограммах инактивированного лизоцима/мл супернатанта * ед. оптической плотности бульонной культуры, мкг/мл*OD;

V1 - объем раствора лизоцима исходной концентрации;

V2 - супернатанта бульонной культуры исследуемого штамма;

С - исходная концентрация лизоцима;

Y - оптическая плотность бульонной культуры исследуемого штамма, ед. оптической плотности;

ΔD₀ - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в опыте между 30 и 150 секунд;

ΔD_k - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в контроле между 30 и 150 секунд;

Антилизоцимную активность опытных и контрольных проб выражают в мкг/мл*OD.

Рассчитывали антилизоцимную активность исследуемой культуры в контроле.

А - 0,71 мкг/мл*OD;

V1 - 0,1 мл;

V2 - 0,9 мл;

С - 20 мкг/мл;

Y - 0,41;

ΔD₀ - 0,312;

ΔDk - 0,360.

Рассчитывали антилизоцимную активность исследуемой культуры в опыте.

А - 1,8 мкг/мл*OD;

V1 - 0,1 мл;

V2 - 0,9 мл,;

С - 20 мкг/мл;

Y - 0,41;

ΔD₀ - 0,245;

ΔDk - 0,365;

Значения показателя антилизоцимной активности штамма В. bifidum 791, составили в контроле 0,71 мкг/мл*OD, в опыте - 1,8 мкг/мл*OD.

Определяли значения показателя биопленкообразования штамма В. bifidum 791 в опытной и контрольной пробах.

Определение биопленкообразования штамма В. bifidum 791 проводили с использованием фотометрического метода [ G.A., Kolter R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol Microbiol 1998, 30, P. 295-304; G.A., Pratt L.A., Watnick P.I., Newman D.K., Weaver V.В., Kolter R. Genetic approaches to the study of biofilms. Methods Enzymol 1999, 310, P. 91-109]. Оптическую плотность определяли на спектрофотометре (BioTek, США) при длине волны 630 нм и выражали в условных единицах оптической плотности.

Значения показателя биопленкообразования штамма В. bifidum 791, составили в контроле 0,6 ед. ОП₆₃₀, в опыте - 0,85 ед. ОП₆₃₀.

Полученные значения показателей ростовых свойств, биопленкообразования и антилизоцимной активности использовали для расчета показателя уровня биосовместимости исследуемого штамма В. bifidum 791 с тест-штаммом В. longum МС-42 по формуле:

где В - показатель уровня биосовместимости, %;

РСо - 0,8 ед. ОП450, ростовые свойства штамма в опыте, ед. ОП₄₅₀;

PCk - 0,6 ед. ОП450, ростовые свойства штамма в контроле, ед. ОП₄₅₀;

БПОо - 0,85 ед.ОП630, биопленкообразование штамма в опыте, ед. ОП₆₃₀;

БПОk - 0, 6 ед.ОП630, биопленкообразование штамма в контроле, ед. ОП₆₃₀;

АЛАо - 1,8 мкг/мл*OD, антилизоцимная активность штамма в опыте, мкг/мл*OD;

АЛАk - 0, 71 мкг/мл*OD, антилизоцимная активность штамма в контроле, мкг/мл*OD

Значение показателя уровня биосовместимости культуры В. bifidum №791 с тест-штаммом В. longum МС-42 равно 76% и согласно заявляемому способу означает высокую биосовместимость штаммов бифидобактерий В. bifidum №791 и В. longum МС-42, что позволяет использовать данные штаммы для получения консорциума штаммов бифидобактерий с высоким уровнем биосовместимости с целью создания пробиотического продукта или препарата.

Для подтверждения высокой биосовместимости исследуемых штаммов бифидобактерий было проведено совместное культивирование штаммов В. bifidum №791 и В. longum МС-42 в питательном бульоне с последующим определением численности выросших микроорганизмов - колониеобразующих единиц на миллилитр (КОЕ/мл). Установлено, что численность В. bifidum №791 составляла 14,1×10¹¹ КОЕ/мл и В. longum МС-42 15,2×10¹¹ КОЕ/мл., т.е. исследуемые штаммы не проявляли антагонистической активности по отношению друг к другу, сохраняя высокую численность (КОЕ/мл) микроорганизмов при совместном культивировании.

Пример 2.

Определяли уровень биосовместимости лактобактерий L. fermentum 90Т-С4 (ГКПМ, №900812) и бифидобактерий В. bifidum 791 (ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика, номер депозита ЦМПМ №В-3300 и ГКНМ ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского №80) согласно заявленному способу аналогично примеру 1.

Были получены следующие количественные значения:

- показатели ростовых свойств штамма L. fermentum 90Т-С4 составили в контроле 0,7 ед. ОП₄₅₀, в опыте - 1,2 ед. ОП₄₅₀; показатели биопленкообразования штамма L. fermentum 90Т-С4 составили в контроле 0,54 ед. ОП₆₃₀, в опыте - 0,92 ед. ОП₆₃₀; показатели антилизоцимной активности L. fermentum 90Т-С4 составили в контроле 0,9 мкг/мл*OD, в опыте - 1,1 мкг/мл*OD.

- показатели ростовых свойств штамма В. bifidum 791 составили в контроле 0,6 ед. ОП₄₅₀, в опыте - 0,8 ед. ОП₄₅₀; показатели биопленкообразования штамма В. bifidum 791, составили в контроле 0,6 ед. ОП₆₃₀, в опыте -0,85 ед. ОП₆₃₀; показатели антилизоцимной активности штамма В. bifidum 791 составили в контроле 0,71 мкг/мл*OD, в опыте - 1,8 мкг/мл*OD.

Полученные значения показателей ростовых свойств, биопленкообразования и антилизоцимной активности использовали для расчета показателя уровня биосовместимости исследуемого штамма L. fermentum 90Т-С4 со штаммом В. longum МС-42 и исследуемого штамма В. bifidum 791 со штаммом В. longum МС-42 согласно заявляемому изобретению по формуле аналогично примеру 1.

Показатель уровня биосовместимости культуры L. fermentum 90Т-С4 с тест-штаммом В. longum МС-42 составил 54%, что свидетельствовало о наличии высокой биосовместимости штаммов лактобактерий L. fermentum 90Т-C4 и В. longum МС-42.

Показатель уровня биосовместимости культуры В. bifidum №791 с тест-штаммом В. longum МС-42 составил 76%, что свидетельствовало о наличии высокой биосовместимости штаммов бифидобактерий В. bifidum №791 и В. longum МС-42.

Для подтверждения высокой биосовместимости исследуемых штаммов L. fermentum 90Т-С4 и В. bifidum №791 между собой было проведено их совместное культивирование в питательном бульоне с последующим определением численности выросших микроорганизмов - колониеобразующих единиц на миллилитр (КОЕ/мл). Установлено, что численность В. bifidum №791 составляет 9,2×10¹⁰ КОЕ/мл и L. fermentum 90Т-С4 - 9,1×10¹⁰ КОЕ/мл., т.е. исследуемые штаммы не проявляли антагонистической активности по отношению друг к другу, сохраняя высокую численность (КОЕ/мл) микроорганизмов при совместном культивировании.

Пример 3.

Для создания консорциума лактобактерий Lactobacillus acidophilus 100аш (L. acidophilus 100 аш) (ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика, ВКПМ №В-3190) и Lactobacillus acidophilus NK1 (ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика, ВКПМ №В-8957 (В центральной лаборатории ВНИМИ №22/10)) определяли показатель уровня биосовместимости штаммов лактобактерий согласно заявленному способу. Определяли показатель уровня биосовместимости аналогично примеру 1.

Были получены следующие количественные значения:

- ростовые свойства штамма L. acidophilus 100аш составили в контроле 0,96 ед. ОП₄₅₀, в опыте - 1,1 ед. ОП₄₅₀; биопленкообразование L. acidophilus 100аш в контроле - 0,89 ед. ОП₆₃₀, в опыте - 1,2 ед. ОП₆₃₀; антилизоцимная активность L. acidophilus 100аш в контроле - 1,3 мкг/мл*OD, в опыте - 1,3 мкг/мл*OD.

- ростовые свойства штамма L. acidophilus NK1 составили в контроле 1,0 ед. ОП₄₅₀, в опыте - 1,3 ед. ОП₄₅₀; биопленкообразование L. acidophilus NK1 в контроле - 0,32 ед. ОП₆₃₀, в опыте - 0,46 ед. ОП₆₃₀; антилизоцимная активность L. acidophilus NK1 в контроле - 1,1 мкг/мл*OD, в опыте - 1,3 мкг/мл*OD.

Полученные значения показателей ростовых свойств, биопленкообразования и антилизоцимной активности использовали для расчета показателя уровня биосовместимости исследуемого штамма L. acidophilus 100аш со штаммом В. longum МС-42 и исследуемого штамма L. acidophilus NK1 со штаммом В. longum МС-42 согласно заявляемому изобретению по формуле аналогично примеру 1.

В результате показатель уровня биосовместимости культуры L. acidophilus 100аш с тест-штаммом В. longum МС-42 составлял 25%, что свидетельствовало об отсутствии высокой биосовместимости L. acidophilus 100аш и В. longum МС-42.

Показатель уровня биосовместимости культуры L. acidophilus NK1 с тест-штаммом В. longum МС-42 составил 33%, что свидетельствовало об отсутствии высокой биосовместимости штаммов лактобактерий L. acidophilus NK1 и В. longum МС-42.

Для подтверждения отсутствия высокой биосовместимости исследуемых штаммов L. acidophilus 100аш и L. acidophilus NK1 между собой было проведено их совместное культивирование в питательном бульоне с последующим определением численности выросших микроорганизмов - колониеобразующих единиц на миллилитр (КОЕ/мл). Установлено, что численность L. acidophilus 100аш составляет 3,3×10⁵ КОЕ/мл и L. acidophilus NK1 - 6,81×10⁶ КОЕ/мл, низкая численность микроорганизмов говорит о том, что исследуемые штаммы проявляли антагонистическую активность по отношению друг к другу при совместном культивировании.

Способ определения уровня биосовместимости штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий, включающий следующие этапы:

- выращивание каждого из исследуемых штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий в отдельности в жидкой питательной среде при 37°С в течение 48 ч в СО₂-инкубаторе;

- центрифугирование полученных бульонных культур при 3200 об/мин в течение 15 мин и отделение супернатантов от микробных клеток путем пропускания через мембранные фильтры;

- выращивание тест-штамма В. longum МС-42 на плотной питательной среде при 37°С в течение 48 ч в СO₂-инкубаторе и приготовление из выросшей культуры одномиллиардной взвеси с оптической плотностью 3 МсF на 0,9% растворе хлорида натрия;

- соинкубирование супернатантов исследуемых штаммов, каждого в отдельности, с одномиллиардной взвесью тест-штамма В. longum МС-42 в соотношении 1:2 в течение 1 ч в СO₂-инкубаторе;

- центрифугирование всех проб при 3200 об/мин в течение 15 мин, отмывание клеток тест-штамма В. longum МС-42 трижды 0,9% раствором хлорида натрия, ресуспендирование отмытых клеток В. longum МС-42 в питательном бульоне и культивирование при 37°С в течение 48 ч в СО₂-инкубаторе, центрифугирование полученных проб и отделение супернатантов от микробных клеток пропусканием через мембранные фильтры;

- выращивание каждого исследуемого штамма микроорганизмов в отдельности на плотной питательной среде при 37°С в течение 48 ч в СО₂-инкубаторе и приготовление из каждой выросшей культуры одномиллиардной взвеси с оптической плотностью 3 МсF на 0,9% растворе хлорида натрия;

- приготовление опытных проб путем смешивания полученных взвесей исследуемых штаммов с супернатантами В. longum МС-42 и питательным бульоном в соотношении 1:1:8, причем проводят смешивание супернатанта В. longum МС-42 соответственно с взвесью того исследуемого штамма, с которым ранее он был соинкубирован;

- приготовление контроля из полученных взвесей исследуемых штаммов микроорганизмов с питательным бульоном в соотношении 1:9;

- культивирование опытных и контрольных проб при 37°С в течение 48 ч в СО₂-инкубаторе;

- определение значения показателя ростовых свойств, антилизоцимной активности и биопленкообразования исследуемых штаммов в опытных и контрольных пробах;

- расчет показателя уровня биосовместимости исследуемых штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий с тест-штаммом В. longum МС-42 по формуле:

где В - показатель уровня биосовместимости, %;

РСо - ростовые свойства штаммов в опыте, ед. ОП₄₅₀;

РСk - ростовые свойства штаммов в контроле, ед. ОП₄₅₀;

БПОо - биопленкообразование штаммов в опыте, ед. ОП₆₃₀;

БПОk - биопленкообразование штаммов в контроле, ед. ОП₆₃₀;

АЛАо - антилизоцимная активность штаммов в опыте, мкг/мл*ОП₄₅₀;

АЛАk - антилизоцимная активность штаммов в контроле, мкг/мл*ОП₄₅₀,

при этом при значении показателя уровня биосовместимости, равном либо больше 50%, биосовместимость штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий считают высокой.