Способ получения растительного сырья ириса сибирского (iris sibirica l.) методами биотехнологии

Авторы патента:

Ильичева Татьяна Ивановна (RU)

Базарнова Наталья Григорьевна (RU)

Тихомирова Людмила Ивановна (RU)

A01H4/00 - Разведение растений из тканевых культур

Владельцы патента RU 2677921:

федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Алтайский государственный университет" (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения растительного сырья ириса сибирского (Iris sibirica L.) клональным микроразмножением и выращиванием в условиях гидропоники, включающий введение эксплантов в культуру in vitro, культивирование на питательной среде MS для получения регенерантов, их размножение и укоренение, где на этапе собственно микроразмножения чередуют питательные среды через один пассаж, содержащие MS + (2,5-10,0) мкМ БАП + 1,0 мкМ НУК + 0,1 мкМ ИМК и MS + 1 мкМ БАП + 100 мг/л L-глютамин + 100 г/л аденин сульфат, полученный посадочный материал выращивают в гидропонной установке промышленного образца на питательной среде MS, содержащей половинный набор макросолей и микросолей, полный набор витаминов, хелата железа и кальция хлористого. Данный способ позволяет с 1 м² площади гидропонной установки за 3 месяца получить 1 кг сырой массы сырья или 3 кг в год сухой массы. 2 ил., 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, фармакологии, физиологии растений и может быть использовано для индустриального производства высокоценного сырья с целью получения лекарств, биологически активных добавок, функциональных пищевых продуктов, лечебно-профилактической косметики и индивидуальных биологически активных веществ.

Iris sibirica L. (ирис сибирский) - многолетнее корневищное растение, достигающее высоты 70-110 см. Листья линейные, зеленые, не жесткие, до 50-80 см длиной и 4 см шириной. Данный вид включен в региональные Красные книги в Алтайском и Ставропольском краях, Омской, Тверской, Тюменской областях как редкий, встречающийся в немногих местах. Две популяции находятся под защитой Висимского и Полистовского заповедников. Подземная часть содержит углеводы (сахароза - до 2,3%, фруктаны - до 2,7%, крахмал - до 2,5%). В листьях найдены фенолкарбоновые кислоты (кофейная, синаповая, n-кумаровая, феруловая); флавоноиды (кверцетин, мирицетин); антоцианы (дельфинидин, цианидин). Семена содержат глюкоманнаны - до 18%. Отвар используют при болезнях сердца, а также как ранозаживляющее средство. Подземная часть, цветки, семена применяют в тибетской медицине при пневмониях, бронхитах, гепатитах, хронических гастритах, гинекологических заболеваниях (Тихомирова Л.И., Базарнова Н.Г., Микушина И.В., Долганова З.В. Фармаколого-биохимическое обоснование практического использования некоторых представителей рода Iris L. (обзор) // Химия растительного сырья. 2015. №3. С. 25-34).

Известен способ получения культуры ткани (каллуса) I. sibirica L. с целью производства эфирного масла из данного вида растительного сырья (А.с. СССР №1064921. МПК: А01Н 3/02. Способ получения культуры ткани ириса / Асланянц Л.К., Маршавина З.В. Опубликовано: 07.01.1984) Данный способ предполагает получение каллусной ткани I. sibirica. В сравнении с традиционным сырьем (растений выращенных в почвенных условиях), использование каллусной массы по предлагаемому способу обеспечивает повышение качества эфирного масла, снижение себестоимости получаемого продукта, возможность непрерывного выращивания культур тканей независимо от природных условий, расширение сырьевой базы (Асланянц JI.K., Маршавина З.В. Об эфирном масле, синтезируемом культурой ткани ириса Iris sibirica // Прикладная биохимия и микробиология. 1979. Т. 15. С. 769-774; Асланянц Л.К., Маршавина З.В., Казарян А.Г. Продуктивность культуры клеток Iris sibirica L., выращенных на упрощенной питательной среде // Раст. ресурсы. 1988. Т. 24. С.107-110; Багдасарова З.М., Асланянц Л.К., Узунян Л.В. Биоконверсия терпеноидов культурой клеток ириса (Iris sibirica) // Прикладная биохимия и микробиология. 1988. Т. 24. С.774-778).

Недостатками данного способа (аналога) является использование каллусной культуры и малых объемов получения сырья в лабораторных условиях.

Наиболее близким (прототипом) является способ микроклонального размножения ириса сибирского (Патент РФ №2479992, МПК А01Н 4/00 Способ микроклонального размножения ириса сибирского (I. sibirica L), / Тихомирова Л.И., Смирнов С.В., Куцев М.Г. Заявитель и патентообладатель: ФГБОУ ВПО «Алтайский государственный университет». Заявка №2011143089 от 25.10.2011, патент опубликован 27.04.2013). Данный способ предполагает размножение культуре ткани I. sibirica за счет получения регенерантов прямым методом, минуя каллусную культуру, и повышение выхода саженцев за счет увеличения коэффициента размножения.

Недостатком данного способа (прототипа) является отсутствие этапа адаптации и выращивания I. sibirica, с целью получения растительной биомассы.

Задачей заявляемого изобретения является создание промышленно применимого способа получения растительного сырья ириса сибирского (Iris sibirica L.) методами биотехнологии: микроклональным размножением и выращиванием в условиях гидропоники.

Способ реализуется в два этапа.

1 этап (получение растений-регенерантов). Цветки I. sibirica берут в фазе бутонизации, когда они плотно закрыты листочками обертки и в условиях ламинарбокса проводят стерилизацию. Части трубки околоцветника и цветоножки делят на фрагменты размером не более 3×3 мм и помещают на питательные среды.

Питательные среды готовят по прописи MS (Мурасиге и Скуга), содержащие 30 г/л сахарозы. В них вводят фитогормоны в концентрациях 3мкМ НУК (α-нафтилуксусной кислоты) в сочетании с 8 мкМ БАП (бензиламинопурин). рН среды доводят до 5,8-5,9 и добавляют 0,6% агара. Среды разливают в пластиковые контейнеры (по 30 мл в каждый) или в культуральные флаконы (по 10 мл в каждый). Автоклавируют приготовленные питательные среды в течение 20 мин. при 1200°С. Экспланты культивируют в условиях фотопериода 16/8 часов свет/темнота при 24-260°С. Через 30 суток в ткани эксплантов развиваются вегетативные побеги, достаточной величины для пересадки на среды размножения.

На этапе собственно микроразмножения питательные среды готовят на основе MS+(2,5-10,0)мкМ БАП+1,0мкМ НУК+0,1мкМ ИМК (индолилмасляная кислота). Одной из основных проблем при микроклональном размножении является поддержание длительно пассируемой культуры. Для культуры ириса на этапе собственно микроразмножения необходимо чередовать среды с высоким содержанием БАП и низким MS+1мкМ БАП. При этом в питательные среды с низким содержанием фитогормона следует добавить L-глютамин и аденин сульфат в количестве 100 мг/л (MS+1мкМ БАП+100 мг/л L-глютамин+100 мг/л аденин сульфат). Такая схема культивирования позволяет регенерантам закладывать адвентивные и пазушные почки при высоких концентрациях, а в следующем пассаже при снижении гормональной нагрузки почки имеют возможность развиваться в побеги. Содержание негормональных стимуляторов роста L-глютамина и аденин сульфата в питательной среде оказывает положительное влияние на качество развивающихся побегов и способности их к укоренению. Необходимо четко соблюдать чередование сред, в противном случае происходит накапливание избыточного количества БАП в тканях регенерантов, что приводит к снижению коэффициента размножения, остановке роста побегов и в конечном итоге гибели растения (таблица 1, фиг. 1). На среды укоренения следует высаживать побеги только после пассирования на средах с низким содержанием БАП, дополненных негормональными стимуляторами роста, а часть побегов необходимо переносить на среды с высоким содержанием БАП для дальнейшего размножения. Укоренение проводят на питательной среде MS, дополненной 3мкМ НУК. Способность к укоренению на данной среде составляет 100%.

2 этап (получение гидропонного сырья). Растения-регенеранты вынимают из культуральных сосудов, отмывают корни в дистиллированной воде от агара, затем растения помещают в гидропонную установку промышленного образца типа «CuttingBoard 27» (производства французской GHE) на 90 суток для адаптации и выращивания растительного лекарственного сырья. Выращивание растительного лекарственного сырья ириса сибирского осуществляют на модифицированной питательной среде MS, содержащей половинный набор макросолей и микросолей, полный набор витаминов, хелата железа и кальция хлористого, при температуре 24-26°С, режим освещения: 16 часов день, 8 часов ночь.

Данный способ позволяет с 1 м² площади гидропонной установки за 3 месяца получить 1 кг сырой массы сырья или 3 кг в год сухой массы. (Фиг. 2).

Биологическую активность полученного биотехнологического сырья I. sibirica (растений-регенерантов и гидропонного сырья) в отношении простого герпеса человека изучали в сравнении с активностью традиционного сырья (интактных растений). Токсичность экстрактов I. sibirica и их противовирусную активность в отношении вируса простого герпеса исследовали в перевиваемой клеточной культуре почки зеленой мартышки VERO. За пятидесятипроцентную токсичную дозу, CD50, принимали разведение экстракта, при котором погибает 50% клеток. Пятидесятипроцентная эффективная доза, ED50, - разведение экстракта, которое защищает 50% клеток от цитопатического действия вируса. Индекс селективности, IS, или терапевтический индекс, - отношение токсичной дозы к эффективной (Finter N. В. Dye uptake methods for assessing viral cytopathogenicity and their application to interferon assays // J. Gen. Virol. 1969. №5. P. 419-427).

Как видно из табл. 2, все исследованные экстракты I. sibirica проявили противовирусную активность в отношении вируса простого герпеса. При невысокой токсичности и традиционное сырье, и биотехнологическое имеет относительно высокий индекс селективности. Особо следует отметить, что данные, полученные для традиционного сырья и биотехнологического сырья сопоставимы: все показатели отличаются не более чем в 2 раза, что не превышает ошибку метода. Наиболее сильное ингибирующее действие оказывает водный экстракт растений-регенерантов.

Примечание. Питательная среда №78-MS+1 мкМ БАП+L-глютамин+аденин сульфат 100 мг/л. * - различия с контролем достоверны при Р≤0,05

Способ получения растительного сырья ириса сибирского (Iris sibirica L.) клональным микроразмножением и выращиванием в условиях гидропоники, включающий введение эксплантов в культуру in vitro, культивирование на питательной среде MS для получения регенерантов, их размножение и укоренение, отличающийся тем, что на этапе собственно микроразмножения чередуют питательные среды через один пассаж, содержащие MS + (2,5-10,0) мкМ БАП + 1,0 мкМ НУК + 0,1 мкМ ИМК и MS + 1 мкМ БАП + 100 мг/л L-глютамин + 100 г/л аденин сульфат, полученный посадочный материал выращивают в гидропонной установке промышленного образца на питательной среде MS, содержащей половинный набор макросолей и микросолей, полный набор витаминов, хелата железа и кальция хлористого.

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой питательную среду для укоренения побегов винограда in vitro, содержащую аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый, железо сернокислое, этилендиаминотетраацетат натрия, борную кислоту, марганец сернокислый, цинк сернокислый, калий йодистый, натрий молибденовокислый, медь сернокислую, кобальт хлористый, миоинозит, тиамин, пиридоксин, ИУК или ИМК, сахарозу, агар, воду, где оптимизированы соотношения макроэлементов и дополнительно содержатся натрий фосфорнокислый и кальций азотнокислый.

Способ поверхностной стерилизации эксплантов осины in vitro // 2675510

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ стерилизации эксплантов осины in vitro, включающий заготовку одревесневших побегов взрослых деревьев в марте-апреле, выгонку молодых растущих побегов, их поэтапную экспозицию в хлорсодержащих агентах, таких как 2% раствор «Domestos» в течение 8 минут и 10% раствор «Аламинол» в течение 10 минут.

Способ получения микроклубней картофеля in vitro // 2671102

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения микроклубней картофеля in vitro, включающий черенкование пробирочных растений и высадку одноузловых черенков на агаризованную питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы и витамины на основе прописи питательной среды Мурасиге и Скуга, Fe-хелат, агар-агар, сахарозу.

Способ размножения иммунноустойчивых образцов картофеля in vitro на аэрогидропонике // 2670485

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ размножения иммунноустойчивых образцов картофеля in vitro на аэрогидропонике, включающий орошение оснований черенков регенерантов, где в качестве питательного раствора вводят водный препарат Флорон в концентрации 0,5% с добавлением пектина в концентрации 0,3-0,4% водного раствора Флорона, причем, пектин готовят из кортофельных очисток оздоровленных клубней того же сорта или гибрида размножаемых регенерантов.

Способ получения безвирусного посадочного материала картофеля ценных сортов // 2668153

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения безвирусного посадочного материала картофеля ценных сортов, заключающийся в том, что проводят прививку поделенных на части микро- и мини-клубней картофеля ценного сорта после предварительного обеззараживания, подсушивания и удаления с клубня-няньки картофеля обычного сорта всех глазков, проводят прививку на клубень-няньку путем прижатия фрагментов микро- и мини-клубней к местам удаленных глазков с последующим подсушиванием, обеззараживанием среза вокруг прививки и дальнейшим культивированием в условиях in vivo.

Способ получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского (phlojodicarpus sibiricus (steph.) к.-pol.) в условиях in vitro // 2666920

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) в условиях in vitro, включающий стерилизацию семян вздутоплодника перекисью водорода в течение 5 мин, ополаскивание, трехкратное отмывание в течение 5 мин в дистиллированной воде, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов, следующего состава: NH4NO3 1650,000±2,0000 мг, KNO3 1900,000±2,0000 мг, MgSO4×7H2O 370,000±1,0000 мг, KH2PO4 170,000±0,1000 мг, CaCl2×2H2O 440,000±0,5000 мг, Н3ВО3 6,200±0,0100 мг, MnSO4×4H2O 22,300±0,0200 мг, ZnSO4×7H2O 8,600±0,0100 мг, KI 0,830±0,0010 мг, Na2MoO4×2H2O 0,250±0,0010 мг, CuSO4×5H2O 0,025±0,0001 мг, CoCl2×6H2O 0,025±0,0001 мг, FeSO4×7H2O 2,785±0,001 мг, Na-ЭДТА 3,725±0,001 мг, тиамин 0,100±0,0010 мг, пиридоксин 0,100±0,0010 мг, сахароза 30000,000±100,0000 мг, вода 1000 мл, агар 5000 мг, дальнейшее помещение растений, полученных in vitro, в аналогичную питательную среду с добавлением ауксина, при этом культивирование растений проводят в темноте, при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 4 недели, при пересеве используют 1/3 адвентивных корней, полученные адвентивные корни выращивают в течение более тридцати циклов.

Способ клонального микроразмножения кирказона маньчжурского (aristolochia manshuriensis kom.) // 2662682

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения эндемика Маньчжурского флористического района Aristolochia manshuriensis Kom., включающий вычленение апикальных и латеральных почек, стерилизацию гипохлоритом натрия (экспозиция 7-10 мин), высаживание на питательные среды MS с добавлением 0,8 мг/л 6-ВАР и 0,05 мг/л ИУК, размножение микропобегов, их последующее укоренение на среде MS, содержащей 20 мг/л сахарозы и ИМК в концентрации 3-5 мг/л, адаптацию растений-регенерантов к условиям ex vitro посредством высаживания на смесь песка, торфа и дерновой листовой земли в соотношении 1:1:1, предварительно простерилизованной при 85-90°С в течение 1-2 ч.

Способ клонального микроразмножения иван-чая узколистного (chamaenerion angustifolium (l.) holub) // 2662677

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения иван-чая узколистного Chamaenerion angustifolium L.Holub, включающий вычленение пазушных меристем, стерилизацию эксплантов 7%-ным гипохлоритом кальция в течение 7 минут, высаживание на питательные среды MS с добавлением 6-ВАР в количестве 0,5 мг/л и MS с добавлением FeSO4⋅7H2O в количестве 30 мл/л, 6-ВАР в количестве 0,5 мг/л, IAA в количестве 0,01 мг/л, размножение микропобегов, их последующее укоренение на среде MS, дополненной 1 мг/л IBA, адаптацию растений-регенерантов к условиям ex vitro.

Способ сохранения ювенильного статуса культуры in vitro малины (rubus idaeus) // 2662670

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ сохранения ювенильного статуса культуры in vitro малины (Rubus idaeus), включающий перенос микрорастений малины на стадиях мультипликации или укоренения на питательные среды в условиях с пониженным уровнем освещенности и пониженной температурой, где смена освещенности и температуры происходит через 5 дней на стадии мультипликации и через 14 дней на стадии укоренения после начала очередного пассажа культивирования, при этом в качестве питательной среды на стадии мультипликации используют питательную среду MS с добавлением сахарозы 30 г/л, инозитола 100 мг/л, пиридоксина 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л, никотиновой кислоты 0,5 мг/л, 6-БАП 0,8 мг/л и зеатина 0,1 мг/л, а на стадии укоренения в качестве питательной среды используют питательную среду 1/2 QL с добавлением сахарозы 20 г/л, инозитола 100 мг/л, пиридоксина 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л, никотиновой кислоты 0,5 мг/л, индолилмасляной кислоты (ИМК) 0,1 мг/л, ИУК 0,1 мг/л, при этом уровень интенсивности освещенности снижается до 1000±200 люкс, а температура - до 4-8°С.

Способ укоренения и адаптации растений, полученных в культуре in vitro с использованием мха сфагнума // 2659237

Изобретение относится к области биотехнологии растений и может быть использовано в питомниководстве для производства посадочного материала с помощью технологии клонального микроразмножения.

Питательный раствор для выращивания микроклубней картофеля в аэропонике // 2678177

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой питательный раствор для выращивания картофеля в аэропонике, содержащий в 1 л воды: кальциевая селитра (нитрат кальция) - 1 г, фосфат калия однозамещенный - 0,25 г, сульфат магния - 0,25 г, хлорид калия (калийная соль) KCl - 0,125 г , хлорид железа - 0,0125 г, борная кислота - 19,63 г, марганец сернокислый - 14,00 г, цинк сернокислый - 1,41 г, медь сернокислая - 1,41 г, микробиологический препарат - 5 мл, обладающий широким спектром воздействия на фитопатогенные микроорганизмы. Изобретение позволяет повысить продуктивность микроклубней картофеля в аэропонной установке. 2 табл.