Композиция и способ для детектирования злокачественного неопластического заболевания

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к композиции для специфического связывания гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19, что может быть использовано в медицине. Композиция содержит по меньшей мере два целенаправленных средства, причем одно первое целенаправленное средство распознает пептид кератин 7 и/или его фрагмент(ы) и одно второе целенаправленное средство распознает пептид кератин 19 и/или его фрагмент(ы), где первое и второе целенаправленные средства способны связываться специфически и одновременно с гетеротипичным комплексом кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагментом(ами). Изобретение позволяет диагностировать и/или прогнозировать, предсказывать эффективность лечения, оценивать результаты лечения, оценивать рецидив злокачественного неопластического заболевания, такого как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода и рак яичников у субъекта. 4 н. и 39 з.п. ф-лы, 5 ил., 8 табл., 13 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области злокачественных неопластических заболеваний. В частности, оно относится к композиции и способу для улучшения детектирования злокачественного неопластического заболевания, а также их диагностическим и/или прогностическим применениям.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Существует огромная потребность в простых, точных и экономически эффективных способах, которые могут помочь диагностировать злокачественное заболевание, для помощи в принятии решений и ведении при лечении пациентов. Использование доступных в настоящее время опухолевых маркеров, за некоторыми исключениями, было сведено к мониторингу терапии из-за недостаточных чувствительности и специфичности. По существу все опухолевые маркеры недостаточно эффективны в качестве одиночных маркеров, и существует необходимость в дополнении традиционных маркеров новыми и более специфическими маркерами. В частности, недостаточная опухолевая специфичность, то есть повышенные значения маркеров при различных доброкачественных состояниях, таких как цирроз печени, почечная недостаточность и общее воспаление в различных тканях, является фундаментальной проблемой доступных в настоящее время опухолевых маркеров.

Кератины или их фрагменты, циркулирующие в сыворотке, которые высвобождаются из апоптических или некротических опухолевых и неопухолевых клеток, были использованы в качестве опухолевых маркеров для мониторинга развития заболевания при некоторых раках. Экспрессия многих кератинов специфическим для эпителиальных клеток образом и тот факт, что профили экспрессии кератинов остаются относительно стабильными во время неопластического превращения, объясняют, почему кератины являются широко используемыми опухолевыми маркерами.

Наиболее широко используемыми кератиновыми опухолевыми маркерами являются тканевой полипептидный антиген (ТПА; смесь кератина 8 (K8), кератина 18 (K18) и кератина 19 (K19)), тканевой полипептидный специфический антиген (ТПС; происходит от K18), цитокератиновый фрагмент 21-1 (CYFRA 21-1; происходит от K19). ТПА был использован в качестве потенциального сывороточного маркера для идентификации индивидуумов с различными связанными с эпителиальными клетками карциномами, включая затрагивающие молочную железу, ободочную и прямую кишку, легкое и мочевой пузырь. ТПС был использован клинически в лечении индивидуумов с раками молочной железы, яичников, предстательной железы, а CYFRA 21-1 в лечении индивидуумов с раками легкого. Основными потенциальными клиническими применениями ТПА, ТПС и CYFRA 21-1 являются мониторинг ответа на лечение и рецидивов опухолей и предоставление прогностической информации. Для рекомендации к рутинному использованию в качестве опухолевого маркера данные маркеры имеют ограниченную клиническую полезность из-за недостаточной органной специфичности и повышенного уровня в сыворотке при незлокачественных заболеваниях. Высокие уровни ТПС и ТПА обнаружены в контексте нескольких заболеваний печени и различных воспалительных заболеваниях. CYFRA 21-1 является наиболее специфическим из кератиновых маркеров и получил широкое признание. Тем не менее, высокие уровни CYFRA сопровождают интерстициальный легочный фиброз и почечную недостаточность. При кардиальной сердечной недостаточности уровни CYFRA также приводят к ложноположительным результатам.

Как упомянуто выше, используемые в настоящее время опухолевые маркеры приводят к проблемам с ложноположительными результатами, не только CYFRA 21-1, но также, если отметить некоторые, например, раковый эмбриональный антиген (CEA), раковый антиген 125 (CA125), раковый антиген 19-9 (CA 19-9), раковый антиген 15-3 (CA15-3), нейрон-специфическая эндолаза (NSE), плоскоклеточная карцинома (ПКК).

Существует, таким образом, острая необходимость найти лучшие диагностические и прогностические маркеры, средства и способы при диагностировании и прогнозировании злокачественных неопластических заболеваний простым и надежный образом, а также средства для осуществления точного и менее искаженного способа или анализа для детектирования злокачественных неопластических заболеваний. Соответственно, целью настоящего изобретения является предоставление средств и способов для осуществления точных и менее искаженных диагностических анализов простым и эффективным образом для рутинного тестирования при диагностировании или прогнозировании злокачественных неопластических заболеваний.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данная цель может быть достигнута посредством предоставления композиции, содержащей по меньшей мере два целенаправленных средства, причем по меньшей мере одно первое целенаправленное средство распознает пептид кератин 7 (K7) и/или его фрагмент(ы), и по меньшей мере одно второе целенаправленное средство распознает пептид кератин 19 (K19) и/или его фрагмент(ы). Упомянутые первое и второе целенаправленные средства способны связываться специфически и одновременно с гетеротипичным комплексом кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагментом(ами).

Первое и/или второе целенаправленные средства могут представлять собой молекулу любого типа, которая будет распознавать целевые пептиды или их фрагмент(ы) и связываться с ними. Первое целенаправленное средство распознает пептид кератин 7 и/или его фрагмент(ы). Кератин 7 (K7) представляет собой белок, который у людей кодируется геном KRT7. Кератин 7 представляет собой кератин типа II и специфически экспрессируется в простом эпителии, выстилающем полости внутренних органов, и в протоках желез и кровеносных сосудах. K7 представляет собой белок размером 51 кДа и имеет длину 469 аминокислот.

Второе целенаправленное средство распознает пептид кератин 19 и/или его фрагмент(ы). Кератин 19 (K19) представляет собой белок, который у людей кодируется геном KRT19. K19 представляет собой кератин типа I, в основном обнаруженный в перидерме, временном поверхностном слое, который охватывает развивающийся эпидермис. K19 представляет собой белок размером 44 кДа и имеет длину 400 аминокислот.

Первое и/или второе целенаправленные средства, преимущественно, выбирают из группы, состоящей из лигандов, ингибиторов, пептидомиметических соединений, пептидов, белков, антител, антигенсвязывающего фрагмента(ов) антител и/или их комбинаций. Оба из первого и второго целенаправленных средств способны связываться специфически и одновременно с гетеротипичным комплексом кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагментом(ами).

Как используется в настоящем документе, термин "гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19" предназначен для обозначения молекулярного соединения, получаемого из параллельного и совмещенного димера между полноразмерным кератином 7 и полноразмерным кератином 19, и его фрагментов. Термин дополнительно включает перекрывающиеся димеры между кератином 7 и кератином 19, которые образуют антипараллельные тетрамеры между кератином 7 и кератином 19, и их фрагменты. Он дополнительно включает олигомеры, протофиламенты и филаменты, собранные из данных тетрамеров, и любые их фрагменты.

В гетеротипичном комплексе кератина 7 с кератином 19 должно быть как минимум не менее 3, предпочтительно по меньшей мере 5, или по меньшей мере 10, или по меньшей мере 15, или по меньшей мере 20, или по меньшей мере 25, или по меньшей мере 30, но, более предпочтительно, более чем 40 аминокислот в неразрывной последовательности, происходящей от участка кератина 7 гетеротипичного комплекса, и должно быть как минимум не менее 3, предпочтительно по меньшей мере 5, или по меньшей мере 10, или по меньшей мере 15, или по меньшей мере 20, или по меньшей мере 25, или по меньшей мере 30, но, более предпочтительно, более чем 40 аминокислот в неразрывной последовательности, происходящей от участка кератина 19 гетеротипичного комплекса. Упомянутые аминокислоты должны быть уникальными для кератина 7 или кератина 19 соответственно.

Преимущественно, упомянутые как минимум не менее 3, предпочтительно по меньшей мере 5, или по меньшей мере 10, или по меньшей мере 15, или по меньшей мере 20, или по меньшей мере 25, или по меньшей мере 30, но, более предпочтительно, более чем 40 аминокислот в неразрывной последовательности взяты из аминокислотной последовательности 256-412 в кератине 7. Более предпочтительно, данная неразрывная последовательность взята из аминокислотной последовательности 300-380 в кератине 7. Преимущественно, упомянутые как минимум не менее 3, предпочтительно по меньшей мере 5, или по меньшей мере 10, или по меньшей мере 15, или по меньшей мере 20, или по меньшей мере 25, или по меньшей мере 30, но, более предпочтительно, более чем 40 аминокислот в неразрывной последовательности взяты из аминокислотной последовательности 244-400 в кератине 19. Более предпочтительно, данная неразрывная последовательность взята из аминокислотной последовательности 311-375 в кератине 19. Когда первое и второе целенаправленные средства связываются специфически и одновременно с упомянутым гетеротипичным комплексом кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагментом(ами), они оба связаны с гетеротипичным комплексом кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагментом(ами) и образуют триплекс, содержащий упомянутые первое и второе целенаправленные средства и гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмент(ы). Упомянутые первое и второе целенаправленные средства образуют упомянутый триплекс с гетеротипичным комплексом кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагментом(ами) в течение временного периода, который достаточно продолжителен для детектирования триплекса с помощью любых средств или способов, которые описаны в настоящем документе, или же с помощью средств или способов, известных специалисту в данной области техники.

В одном предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере одно из первого или второго целенаправленных средств представляет собой антитело, антигенсвязывающий фрагмент(ы) или вариант, слитую конструкцию, производное или их комбинацию. Преимущественно, как первое, так и второе целенаправленные средства представляют собой антитела, антигенсвязывающий фрагмент(ы) или варианты, слитые конструкции, производные или их комбинацию, которые распознают гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмент(ы) и связываются с ними и образуют триплекс антиген-антитело. Упомянутый триплекс антиген-антитело, таким образом, содержит гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмент(ы), с которыми связываются как первое, так и второе антитела, антигенсвязывающий фрагмент(ы) или варианты, слитые конструкции, производные или их комбинация. Первое антитело, антигенсвязывающий фрагмент(ы), вариант, слитая конструкция, производное или их комбинация связывается с участком пептида кератина 7 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов), и второе антитело, антигенсвязывающий фрагмент(ы) или вариант, слитая конструкция, производное или их комбинация связывается с участком пептида кератина 19 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов).

Когда первое и второе целенаправленные средства представляют собой антитела, антигенсвязывающий фрагмент(ы) или варианты, слитые конструкции, производные или их комбинацию, они преимущественно связываются с разными антигенными сайтами гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов). Как правило, первое антитело, антигенсвязывающий фрагмент(ы), вариант, слитая конструкция, производное или их комбинация распознает и связывается специфически с антигенным сайтом, расположенным на участке кератина 7 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов). Второе антитело, антигенсвязывающий фрагмент(ы), вариант, слитая конструкция, производное или их комбинация распознает и связывается специфически с антигенным сайтом, расположенным на участке кератина 19 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов).

Упомянутые первое и второе целенаправленные средства могут связываться и образовывать триплекс с гетеротипичным комплексом кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагментом(ами) в любом порядке. Это означает, что в одном варианте осуществления первое целенаправленное средство сначала связывается с участком кератина 7 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) и образует дуплекс. После этого второе целенаправленное средство связывается с участком кератина 19 упомянутого дуплекса и образует триплекс.

В другом варианте осуществления второе целенаправленное средство сначала связывается с участком кератина 19 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) и образует дуплекс. После этого первое целенаправленное средство связывается с участком кератина 7 упомянутого дуплекса с образованием триплекса. В другом варианте осуществления как первое, так и второе целенаправленные средства связываются с гетеротипичным комплексом кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагментом(ами) по существу в одно и то же время.

В одном предпочтительном варианте осуществления первое и/или второе целенаправленные средства представляют собой первичные антитела и/или его фрагмент(ы), а в другом предпочтительном варианте осуществления упомянутые первое и/или второе целенаправленные средства представляют собой моноклональные или рекомбинантные антитела и/или их фрагмент(ы).

Когда первое целенаправленное средство представляет собой антитело, его, преимущественно, выбирают из группы, состоящей из антител C-35, C-62, C-68, C18, C35, KS 7.18, LDS-68, LP1K и RCK105 или фрагмента(ы) антител, вариантов, слитых конструкций, производных или их комбинации, которые распознают пептид кератин 7 и/или его фрагмент(ы), и оно обладает способностью связываться специфически с гетеротипичным комплексом кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагментом(ами). Преимущественно, первое целенаправленное средство распознает последовательность из по меньшей мере 3, или по меньшей мере 5, или по меньшей мере 7, или 10 или более аминокислот, расположенных на участке кератина 7 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19, которые уникальны для белковой последовательности кератина 7. Преимущественно, упомянутое первое целенаправленное средство распознает последовательность, расположенную в пределах аминокислотной последовательности 256-412 в участке кератина 7 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19. Более предпочтительно, упомянутая последовательность взята из аминокислотной последовательности 300-380 в участке кератина 7.

Преимущественно, антитело, распознающее пептид кератин 7 или его фрагменты, представляет собой моноклональное антитело Ks 7.18, производимое клоном Ks 7.18, который доступен от Progen Biotechnik, GmBH, Германия. Моноклональное антитело KS 7.18 связывается специфически с аминокислотами 300-350 участка K7 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 или его фрагмента(ов).

В качестве альтернативы, антитело, распознающее пептид кератин 7 или его фрагменты, представляет собой моноклональное антитело RCK105, производимое клоном RCK105, который доступен от Acris Antibodies Gmbh.

Когда второе целенаправленное средство представляет собой антитело, его, преимущественно, выбирают из группы, состоящей из антител A53-B/A2.26, также называемое, Ks19.1, BM-19.21, CCD003, CCD004, CKS04, CKS06, CKS14, K19,2, KM 4.62, LP2K, SA 21 и SA45 или фрагмента(ов) антител, вариантов, слитых конструкций, производных или их комбинаций, которые распознают пептид кератин 19 и/или его фрагмент(ы), и оно обладает способностью связываться специфически с гетеротипичным комплексом кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагментом(ами).

Преимущественно, второе целенаправленное средство распознает последовательность из по меньшей мере 3, или по меньшей мере 5, или по меньшей мере 7, или 10 или более аминокислот, расположенных на участке кератина 19 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19, которые уникальны для белковой последовательности кератина 19. Преимущественно, упомянутая последовательность расположена в пределах аминокислотной последовательности 244-400 в кератине 19. Более предпочтительно, данная последовательность взята из аминокислотной последовательности 311-375 в кератине 19.

Преимущественно, антитело, распознающее пептид кератин 19 или его фрагмент(ы), представляет собой моноклональное антитело BM-19.21, производимое клоном BM-19.21, который доступен от Roche Diagnostics. BM 19.21 связывается специфически с аминокислотами 346-367 участка K19 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19.

В качестве альтернативы, антитело, распознающее пептид кератин 19 или его фрагмент(ы), представляет собой моноклональное антитело Ks 19.2, которое доступно от Progen Biotechnik, GmBH. Ks 19.2 связывается специфически с аминокислотами 352-368 участка K19 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19.

В качестве альтернативы, антитело, распознающее пептид кератин 19 или его фрагмент(ы), представляет собой моноклональное антитело Ks 19.1, производимое клоном Ks 19.1, также называемое A53-B/A2. Ks 19.1 связывается специфически с аминокислотами 311-335 участка K19 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19.

Преимущественно, первое целенаправленное средство представляет собой моноклональное антитело Ks 7.18, и второе целенаправленное средство представляет собой моноклональное антитело BM-19.21.

В качестве альтернативы, первое целенаправленное средство представляет собой моноклональное антитело Ks 7.18, и второе целенаправленное средство представляет собой моноклональное антитело Ks 19.2.

В качестве альтернативы, первое целенаправленное средство представляет собой моноклональное антитело RCK105, и второе целенаправленное средство представляет собой моноклональное антитело Ks 19.1.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к способу in vitro детектирования гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) в биологическом образце, причем упомянутый способ содержит этапы:

a) приведения упомянутого биологического образца в контакт с композицией, описанной в настоящем документе; или, в качестве альтернативы,

b) приведения упомянутого биологического образца в контакт с первым целенаправленным средством, распознающим пептид кератин 7 и/или его фрагмент(ы); и

c) приведения упомянутого биологического образца в контакт со вторым целенаправленным средством, распознающим пептид кератин 19 и/или его фрагмент(ы); и

d) детектирования упомянутого гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов); причем этапы b) и c) могут быть выполнены в любом порядке или одновременно.

В предпочтительном варианте осуществления способа композицию, раскрытую в настоящем документе, используют для приведения в контакт с биологическим образцом в подходящих условиях. Примеры подходящих условий, при которых приводят в контакт упомянутую композицию и биологический образец описаны в другом месте настоящего документа ниже. После этого гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмент(ы) детектируют с помощью любого подходящего способа, как также описано в настоящем документе.

В качестве альтернативы первое и второе целенаправленные средства предлагают по отдельности, а не в виде композиции. При этом биологический образец может быть приведен в контакт с упомянутыми первым и вторым целенаправленными средствами в любом порядке. Поэтому в одном варианте осуществления биологический образец вначале приводят в контакт с первым целенаправленным средством, которое связывается с участком кератина 7 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов), присутствующего в биологическом образце, и образуют дуплекс между первым целенаправленным средством и гетеротипичным комплексом. После этого упомянутый дуплекс между первым целенаправленным средством и гетеротипичным комплексом, образованным таким образом, приводят в контакт со вторым целенаправленным средством, которое связывается с участком кератина 19 упомянутого образованного дуплекса и тем самым образует триплекс, содержащий первое и второе целенаправленные средства, связанные с гетеротипичным комплексом.

В другом варианте осуществления биологический образец вначале приводят в контакт со вторым целенаправленным средством, которое вначале связывается с участком кератина 19 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) и образует дуплекс между вторым целенаправленным средством и гетеротипичным комплексом. После этого упомянутый дуплекс, содержащий второе целенаправленное средство и гетеротипичный комплекс, образованный таким образом, приводят в контакт с первым целенаправленным средством, которое связывается с участком кератина 7 упомянутого образованного дуплекса и тем самым образует триплекс, содержащий первое и второе целенаправленные средства и гетеротипичный комплекс.

В еще одном варианте осуществления как первое, так и второе целенаправленные средства связываются с гетеротипичным комплексом кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагментом(ами) по существу в одно и то же время.

После этого гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмент(ы) детектируют с помощью любого подходящего способа, как описано ниже.

Первое и второе целенаправленные средства, используемые в способе in vitro, преимущественно, таковы, как описано выше в настоящем документе.

Биологический образец может представлять собой любой образец, выбранный из группы, состоящей из образцов твердых тканей, такие как, например, образцы биопсий, тканевые культуры или клетки, полученные из них, и их потомство, клинические образцы, клетки в культуре, клеточные супернатанты, клеточные лизаты или физиологические жидкости. Гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмент(ы) может экспрессироваться или не экспрессироваться в биологическом образце.

Преимущественно, способ используют для образцов биологических жидкостей, таких как, например, сыворотка крови, плазма крови, лимфа, экссудаты, кал, желудочная кислота, желудочный сок, лимфа, слизь, перикардиальная жидкость, перитонеальная жидкость, плевральная жидкость, гной, слюна, мокрота, синовиальная жидкость, слезы, пот, вагинальный секрет, рвота и моча. В особенно предпочтительном варианте осуществления способ используют для образцов крови, плазмы крови и/или сыворотки крови.

В предпочтительном варианте осуществления способ содержит дополнительный этап сравнения экспрессии гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) в биологическом образце с положительным и/или отрицательным контролем, причем положительный контроль содержит гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмент(ы), и отрицательный контроль не содержит гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмент(ы).

В предпочтительном варианте осуществления упомянутый положительный контроль представляет собой биологический образец, полученный от субъекта, который страдает от злокачественного неопластического заболевания, и упомянутый отрицательный контроль представляет собой биологический образец, полученный от здоровых субъектов, которые не страдают от злокачественного заболевания.

В другом варианте осуществления способ может содержать этап оценки количества гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов). Оценка может быть осуществлена по детектированным комплексам целенаправленных средств в соответствии со стандартной системой оценки, известной в данной области техники или описанной в настоящем документе.

Преимущественно, способ выполняют на автоматическом устройстве считывания, или выполняют детектирование вручную.

Еще один аспект настоящего изобретения представляет собой способ in vitro для

i) диагностирования и/или прогнозирования злокачественного неопластического заболевания у субъекта, и/или

ii) предсказания эффективности лечения злокачественного неопластического заболевания у субъекта, и/или

iii) оценки результата лечения злокачественного неопластического заболевания у субъекта, и/или

iv) оценки рецидива злокачественного неопластического заболевания у субъекта,

причем субъект представляет собой млекопитающее со злокачественным неопластическим заболеванием или с подозрением на него.

Субъект представляет собой млекопитающее из группы, состоящей из людей, отличных от людей приматов, таких как шимпанзе и другие виды обезьян и мартышек, сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, овцы, свиньи, козы и лошади, домашних млекопитающих, таких как собаки и кошки, лабораторных животных, включая грызунов, таких как мыши, крысы и морские свинки. Преимущественно, субъект представляет собой млекопитающее, включая людей и отличных от людей млекопитающих. В наиболее предпочтительном варианте осуществления субъект представляет собой человека.

Злокачественное неопластическое заболевание может представлять собой одно из группы, состоящей из рака желчных протоков (внепеченочных), рака мочевого пузыря, рака молочной железы, карциномы неизвестной локализации (первичной), рака шейки матки, рака толстой кишки, рака эндометрия, рака пищевода, рака желчного пузыря, рака желудка (живота), рака головы и шеи, гепатоцеллюлярного рака (печени), гипофарингеального рака, рака почек, ларингеального рака, рака печени (первичного), рака легкого (немелкоклеточного), рака легкого (мелкоклеточного), мезотелиомы, немелкоклеточного рака легкого, рака яичников, эпителиального рака яичников (поверхностной эпителиально-стромальной опухоли), герминогенной опухоли яичников, опухоли яичников с низким потенциалом злокачественности, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, ректального рака, почечно-клеточной карциномы (рака почек), рака слюнных желез, мелкоклеточного рака легкого, рака тонкого кишечника, рака желудка, рака яичка, рака щитовидной железы, переходно-клеточного рака почечной лоханки и мочеточника или рака матки (эндометриального).

Преимущественно, злокачественное неопластическое заболевание выбирают из группы, состоящей из рака легкого, рака мочевого пузыря, рака пищевода, гепатоцеллюлярного рака, рака поджелудочной железы, рака желудка и рака яичников. Способ является особенно предпочтительным, когда злокачественное неопластическое заболевание выбирают из группы, состоящей из рака легкого, рака мочевого пузыря, рака пищевода и рака яичников.

При диагностировании и/или прогнозировании злокачественного неопластического заболевания у субъекта способ содержит этапы

a) получения биологического образца от заданного субъекта

b) приведения упомянутого биологического образца в контакт с композицией, описанной в настоящем документе; или, в качестве альтернативы,

c) приведения упомянутого биологического образца в контакт с первым целенаправленным средством, распознающим пептид цитокератин 7 и/или его фрагмент(ы); и

d) приведения упомянутого биологического образца в контакт со вторым целенаправленным средством, распознающим пептид цитокератин 19 и/или его фрагмент(ы); и

e) детектирования упомянутого гетеротипичного комплекса цитокератина 7 с цитокератином 19 и/или его фрагмента(ов);

причем этапы c) и d) могут быть выполнены в любом порядке или одновременно; и

f) сравнения детектированного количества гетеротипичного комплекса цитокератина 7 с цитокератином 19 и/или его фрагмента(ов) с положительным и/или отрицательным контролем, посредством которого осуществляют диагностирование и/или прогнозирование злокачественного неопластического заболевания у субъекта.

Необязательно, может быть осуществлена оценка детектированных комплексов антиген-антитело в соответствии со стандартной системой оценки, известной в данной области техники или описанной в настоящем документе.

Образец может представлять собой любой образец, который может содержать злокачественное неопластическое заболевание. Другими вариантами осуществления являются те, в которых положительный контроль содержит клетки от субъекта, который страдает от злокачественного неопластического заболевания. Другими вариантами осуществления являются те, в которых отрицательный контроль содержит клетки от здоровых субъектов, которые не страдают от злокачественного неопластического заболевания.

При предсказании результата лечения у субъекта, страдающего от злокачественного неопластического заболевания, способ содержит этапы

a) получения биологического образца от субъекта, страдающего от злокачественного неопластического заболевания

b) детектирования экспрессии гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 в упомянутом биологическом образце

c) сравнения экспрессии гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 с положительным и/или отрицательным контролем и посредством этого предсказания результата лечения злокачественного неопластического заболевания у упомянутого субъекта на основании детектированной экспрессии гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагментов.

При оценке эффективности лечения злокачественного неопластического заболевания у субъекта, который проходит лечение от злокачественного неопластического заболевания, способ содержит этапы

a) получения биологического образца от субъекта, который проходит лечение от злокачественного неопластического заболевания,

b) детектирования экспрессии гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 в упомянутом биологическом образце

c) повторения этапов a) и b) в одной или нескольких временных точках во время лечения упомянутого субъекта от злокачественного неопластического заболевания, причем изменение относительной экспрессии гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 с течением времени показывает эффективность лечения.

Таким образом, показателем эффективного лечения является относительное изменение уменьшения экспрессии гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 относительно предыдущего образца, проанализированного на этапах повторения способа.

Необязательно, может быть осуществлена оценка детектированного гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 в соответствии со стандартной системой оценки, известной в данной области техники или описанной в настоящем документе.

Образец может представлять собой любой образец, который может содержать злокачественное неопластическое заболевание, предпочтительно биологический образец от субъекта, имеющего злокачественное неопластическое заболевание, и данный субъект будет проходить лечение, находится в периоде между лечениями или в настоящее время проходит лечение.

При оценке рецидива злокачественного неопластического заболевания способ содержит этапы

a) получения биологического образца от субъекта, имеющего или имевшего ранее злокачественное неопластическое заболевание,

b) детектирования экспрессии гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 в упомянутом биологическом образце,

c) повторения этапов a) и b) в одной или нескольких временных точках после лечения упомянутого субъекта от злокачественного неопластического заболевания, причем изменение относительной экспрессии гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 с течением времени может указывать на рецидив злокачественного неопластического заболевания.

Таким образом, показателем рецидива является относительное изменение увеличения количеств гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19, которые идентифицируют злокачественное неопластическое заболевание, то есть увеличение с течением времени экспрессии белкового маркера гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 относительно предыдущего образца, проанализированного на этапах повторения способа.

В другом аспекте настоящее изобретение предлагает применение способа in vitro для

i) детектирования гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и или его фрагментом(ами), и/или

ii) детектирования злокачественного неопластического заболевания; и/или

iii) диагностирования или прогнозирования злокачественного неопластического заболевания у субъекта, и/или

iv) предсказания результата лечения злокачественного неопластического заболевания у субъекта, и/или

v) оценки эффективности лечения злокачественного неопластического заболевания у субъекта, и/или

vi) оценки рецидива злокачественного неопластического заболевания у субъекта.

В другом аспекте настоящее изобретение предлагает набор для

i) детектирования гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) в биологическом образце; и/или

ii) детектирования злокачественного неопластического заболевания у субъекта; и/или

iii) диагностирования или прогнозирования злокачественного неопластического заболевания у субъекта; и/или

iv) предсказания результата лечения злокачественного неопластического заболевания у субъекта; и/или

v) оценки эффективности лечения злокачественного неопластического заболевания у субъекта; и/или

vi) оценки рецидива злокачественного неопластического заболевания у субъекта;

причем данный набор содержит:

a) композицию, описанную в настоящем документе; или, в качестве альтернативы,

b) первый контейнер, содержащий первое целенаправленное средство, распознающее пептид кератин 7 и/или его фрагмент(ы); и

c) второй контейнер, содержащий второе целенаправленное средство, распознающее пептид кератин 19 и/или его фрагмент, и,

d) необязательно, инструкции по выполнению способа, описанного в настоящем документе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фигура 1 показывает структуру белка кератина и сборку филаментов.

Фигура 2 показывает типичную калибровочную кривую для анализа K7/19.

Фигура 3 показывает чувствительность при специфичности 95% для доброкачественных заболеваний, определенную с помощью способа настоящего изобретения.

Фигура 4 показывает ROC-кривую, сравнивающую различные опухолевые маркеры, CA125, HE4, K7/19 и CYFRA, при раке яичников.

Фигура 5 показывает ROC-кривую, сравнивающую комбинацию ИФА CA125 и ИФА HE4 с комбинацией ИФА CA125 и анализа K7/19.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Перед описанием настоящего изобретения следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными описанными вариантами осуществления, поскольку способы, устройства и композиции могут, конечно, варьироваться. Также следует понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, предназначена только для цели описания конкретных вариантов осуществления, и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который ограничен только прилагаемой формулой изобретения. Следует отметить, что, как используется в настоящем документе и в прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают множественное число, если из контекста явно не следует иное, и включают ссылку на эквивалентные этапы и способы, известные специалистам в данной области техники.

Ожидается, что термины, используемые в настоящем изобретении, в общем придерживаются стандартных определений, обычно принятых средними специалистами в области техники молекулярной биологии. Несколько исключений, которые перечислены ниже, были дополнительно определены в пределах объема настоящего изобретения.

"По меньшей мере один", как используется в настоящем документе, означает один или несколько, то есть 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и так далее.

"Детектирование", "детектировать", "детектируя", как используется в настоящем документе, включает качественное и/или количественное детектирование (измерение уровней) по отношению к контролю или нет, и дополнительно относится к идентификации наличия, отсутствия или количества заданного белка, в частности гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов).

"Диагностика", как используется в настоящем документе, охватывает идентификацию природы заболевания.

"Прогноз", как используется в настоящем документе, охватывает предсказание в отношении возможного результата заболевания, перспективы в отношении восстановления после заболевания на основании природы и симптомов заболевания.

"Истинно положительные" относится к субъектам, имеющим локализованное или метастазирующее злокачественное новообразование.

"Ложно отрицательные" относится к субъектам, имеющим или локализованное, или метастазирующее злокачественное новообразование и не классифицированным в качестве таковых с помощью диагностического анализа.

"Истинно отрицательные" относится к субъектам, которые не имеют локализованного или метастазирующего злокачественного новообразования, и которые классифицированы в качестве таковых с помощью диагностического анализа.

"Ложно положительные" относится к субъектам, которые не имеют локализованного или метастазирующего злокачественного новообразования, но классифицированы с помощью обычного диагностического анализа как имеющие локализованное или метастазирующее злокачественное новообразование.

В зависимости от контекста термин "ложно положительные" может также относиться к субъектам, которые не имеют злокачественного новообразования, но классифицированы с помощью диагностического анализа как имеющие злокачественное новообразование или незлокачественное заболевание.

"Чувствительность", как используется в настоящем документе в контексте его применения к диагностическим анализам, относится к доле всех субъектов с локализованным или метастазирующим злокачественным новообразованием, которые корректно идентифицированы как таковые (то есть количество истинно положительных, деленное на сумму количеств истинно положительных и ложно отрицательных).

"Специфичность" диагностического анализа, как используется в настоящем документе в контексте его применения к диагностическим анализам, относится к доле всех субъектов без локализованного или метастазирующего злокачественного новообразования, которые корректно идентифицированы как таковые (то есть количество истинно отрицательных, деленное на сумму количеств истинно отрицательных и ложно положительных).

Термины "новообразование" или "опухоль" могут быть использованы взаимозаменяемо и относятся к аномальной массе ткани, причем рост данной массы превосходит рост нормальной ткани и не скоординирован с ним. Новообразование или опухоль может быть определено как "доброкачественное" или "злокачественное" в зависимости от следующих характеристик: степени клеточной дифференцировки, включая морфологию и функциональность, скорости роста, локальной инвазии и метастазирования. "Доброкачественное" новообразование обычно хорошо дифференцировано, имеет характерно более медленный рост, чем злокачественное новообразование, и остается локализованным на участке происхождения. Кроме того, доброкачественное новообразование не обладает способностью к инфильтрации, инвазии или метастазированию в отдаленные участки.

"Злокачественное" новообразование обычно хуже дифференцировано (анаплазия), имеет характерно быстрый рост, сопровождающийся прогрессирующей инфильтрацией, инвазией и разрушением окружающей ткани. Кроме того, злокачественное новообразование обладает способностью к метастазированию в отдаленные участки. Термин "метастазирование" относится к распространению или миграции раковых клеток из первичной (исходной) опухоли в другой орган или ткань, и его, как правило, можно идентифицировать по наличию "вторичной опухоли" или "вторичной клеточной массы" с типом ткани первичной (исходной) опухоли, а не органа или ткани, в которых вторичная (метастатическая) опухоль расположена. Например, карцинома легкого, которая мигрировала в кость, называется метастазирующим раком легкого, и состоит из раковых клеток, происходящий от эпителиальных клеток легкого, растущих в костной ткани.

"Здоровый" относится к субъекту, обладающему хорошим здоровьем. Такой субъект демонстрирует отсутствие любого злокачественного или незлокачественного заболевания. В контексте данной заявки "здоровый индивидуум" является здоровым только в том, что у него отсутствует любое злокачественное или незлокачественное заболевание; "здоровый индивидуум" может иметь другие заболевания или состояния, которые обычно не считаются "здоровыми".

"Субъект", как используется в настоящем документе, включает людей, отличных от людей приматов, таких как шимпанзе и другие виды обезьян и мартышек, сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, овцы, свиньи, козы и лошади, домашних млекопитающих, таких как собаки и кошки, лабораторных животных, включая грызунов, таких как мыши, крысы и морские свинки, и тому подобных. Данный термин не обозначает конкретный возраст или пол. Таким образом, предполагается, что охвачены взрослые и новорожденные субъекты, а также плоды, будь то мужчины или женщины. В предпочтительных вариантах осуществления субъект представляет собой млекопитающее, включая людей и отличных от людей млекопитающих. В наиболее предпочтительном варианте осуществления субъект представляет собой человека.

"Моноклональное антитело" или "mAb", как используется в настоящем документе, относится к антителу одного аминокислотного состава, которое направлено против конкретного антигена, и которое производится одним клоном B-клеток или гибридомой.

"Поликлональное антитело", как используется в настоящем документе, относится к антителу, которое направлено против конкретного антигена, которое происходит от разных линий B-клеток.

"Fab", как используется в настоящем документе, относится к фрагменту антитела среди фрагментов, получаемых посредством обработки IgG протеазой папаином, имеющему молекулярный вес, составляющий приблизительно 50000 Да, и антигенсвязывающую активность, в котором приблизительно половина N-концевой части H-цепи и вся L-цепь связаны вместе посредством дисульфидной связи.

"F(ab')2", как используется в настоящем документе, относится к фрагменту антитела среди фрагментов, получаемых посредством обработки IgG протеазой пепсином, имеющему молекулярный вес, составляющий приблизительно 100000 Да, и антигенсвязывающую активность, которая слегка больше, чем у Fab, связанному посредством дисульфидной связи шарнирного участка.

"Fab¹", как используется в настоящем документе, относится к фрагменту антитела, имеющему молекулярный вес, составляющий приблизительно 50000 Да, и антигенсвязывающую активность, который получают посредством разрезания дисульфидной связи шарнирного участка в F(ab')2. Как используется в настоящем документе, одноцепочечный полипептид Fv ("scFv") представляет собой ковалентно связанный VH::VL гетеродимер, который обычно экспрессируется из слитого гена, включающего в себя кодирующие VH и VL гены, связанные посредством кодирующего пептид линкера. Человеческий фрагмент scFv настоящего изобретения включает в себя CDR, которые поддерживаются в подходящей конформации, предпочтительно посредством использования метода генной рекомбинации.

"Гибридома", как используется в настоящем документе, обозначает клетку, которую получают посредством подвергания B-клетки, полученной посредством иммунизации антигеном отличного от человека млекопитающего, клеточному слиянию с клеткой миеломы, происходящей от мыши или тому подобного, которая производит желаемое моноклональное антитело, имеющее антигенную специфичность.

Термины "полипептид", "белок" и "пептид" используются в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения аминокислотных цепей, в которых аминокислотные остатки связаны пептидными связями или модифицированными пептидными связями. Аминокислотные цепи могут иметь любую длину больше чем две аминокислоты. Если не указано иное, термины "полипептид", "белок" и "пептид" также охватывают их различные модифицированные формы. Такие модифицированные формы могут представлять собой природные модифицированные формы или химически модифицированные формы. Примеры модифицированных форм включают, но без ограничения, гликозилированные формы, фосфорилированные формы, миристоилированныйе формы, пальмитоилированные формы, рибозилированные формы, ацетилированные формы, убиквитинированные формы и так далее. Модификации также включают внутримолекулярное перекрестное сшивание и ковалентное прикрепление к различным молекулам, таким как липиды, флавин, биотин, полиэтиленгликоль или их производные и так далее. Кроме того, модификации могут также включать циклизацию, разветвление и перекрестное сшивание. Кроме того, аминокислоты, отличные от обычных двенадцати аминокислот, кодируемых генами, также могут быть включены в полипептид.

Как используется в настоящем документе, "биологический образец" охватывает множество типов образцов, полученных от любого субъекта, имеющего или не имеющего злокачественное новообразование. Типичным субъектом является человек; однако любое млекопитающее, которое имеет злокачественное новообразование, которое может развиться в рак, может служить источником биологического образца, подходящего для использования в раскрытом способе. Примеры биологических образцов, подходящих для использования в раскрытых способах, включают, но без ограничения, образцы твердых тканей, такие как, например, образцы биопсий, тканевые культуры или клетки, полученные из них, и их потомство, клинические образцы, клетки в культуре, клеточные супернатанты, клеточные лизаты, физиологические жидкости. Например, биологические образцы включают образцы, полученные из ткани или жидкостей, полученных от индивидуума с подозрением на злокачественное новообразование.

Примеры образцов биологических жидкостей включают, но без ограничения, сыворотку крови, плазму крови, лимфу, экссудаты, кал, желудочную кислоту, желудочный сок, лимфу, слизь, перикардиальную жидкость, перитонеальную жидкость, плевральную жидкость, гной, слюну, мокроту, синовиальную жидкость, слезы, пот, вагинальный секрет, рвоту и мочу.

Другими примерами являются биопсии и/или аспираты, полученные с помощью тонкой иглы. Образцы могут быть свежими или обработанными после получения (например, с целью архивирования). В некоторых примерах обработанные образцы могут быть зафиксированы (например, зафиксированы формалином) и/или залиты воском (например, парафином).

Фиксаторы для подготовленных клеточных и тканевых препаратов хорошо известны в данной области техники и включают, без ограничения, 95% спиртовой фиксатор Буэна; 95% спиртовой фиксатор; фиксатор B5, фиксатор Буэна, формалиновый фиксатор, фиксатор Карновского (глутаральдегид), фиксатор Хартмана, фиксатор Олланда, раствор Орта (дихроматный фиксатор) и фиксатор Ценкера (смотри, например, Carson, Histotechology: A Self-Instructional Text, Chicago: ASCP Press, 1997). В некоторых примерах образец (или его фракция) присутствует на твердой подложке.

Твердые подложки, подходящие для использования в раскрытом способе, должны только нести биологический образец и, необязательно, но преимущественно, позволять удобное детектирование представляющих интерес белков в образце. Примеры подложек включают предметные стекла микроскопа (например, стеклянные предметные стекла микроскопа или пластмассовые предметные стекла микроскопа), покровные стекла (например, стеклянные покровные стекла или пластмассовые покровные стекла), чашки для культивирования тканей, многолуночные планшеты, мембраны (например, из нитроцеллюлозы или поливинилиденфторида (PVDF)) или BIACORE®; чипы.

"Лечение", как используется в настоящем документе, определено как ведение пациента с помощью медицинских или хирургических средств. Лечение улучшает или ослабляет по меньшей мере один симптом медицинского состояния или заболевания и необходимо для обеспечения выздоровления. Термин "результат лечения" или "исход лечения", как используется в настоящем документе, означает физический эффект лечения, оказанный на пациента.

Термин "алгоритм", как используется в настоящем документе, относится к математической формуле, которая обеспечивает взаимосвязь между двумя или более величинами. Такая формула может быть линейной или нелинейной и может существовать в виде различных численных весовых коэффициентов в памяти компьютера.

"Рак легкого" относится к новообразованию, например злокачественному новообразованию, легкого у данного субъекта, причем данное новообразование имеет эпителиальное происхождение, то есть к карциноме легкого. Карциномы легкого классифицируют по размеру и внешнему виду злокачественных клеток, и термин "рак легкого" включает как немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ), так и мелкоклеточный рак легкого (МРЛ). Термин "рак легкого", когда он используется без оговорок, включает как локализованный, так и метастазирующий рак легкого. Термин "рак легкого" может быть квалифицирован с помощью терминов "локализованный" или "метастазирующий" для различения между различными типами опухоли, где "локализованный" относится к исходной материнской опухоли, а метастазирующий к опухолям, которые распространились от исходной материнской опухоли.

Для стадирования НМРЛ при исходной оценке можно использовать систему TNM (опухоль, узел, метастазы). С помощью дескрипторов TNM назначается группа, начиная со скрытого рака и через стадии 0, IA (один-A), IB, IIA, IIB, IIIA, IIIB и IV (четыре). Эта группа стадий помогает при выборе лечения и определении прогноза.

Мелкоклеточную карциному легкого традиционно классифицируют как "в ограниченной стадии" (заключена в пределах одной половины грудной клетки и в объеме одного поля переносимой радиотерапии) или "в экстенсивной стадии" (более распространенное заболевание). При этом классификация и группирование TNM подходят для использования при оценке прогноза.

Как для НМРЛ, так и для МРЛ двумя общими типами оценки стадирования являются клиническое стадирование и хирургическое стадирование. Клиническое стадирование выполняют до окончательной хирургии. Оно основано на результатах томографических исследований (таких как КТ-сканирования и ПЭТ-сканирования) и результатах биопсии. Хирургическое стадирование оценивают или во время или после операции, и оно основано на объединенных результатах хирургических и клинических данных, включая хирургический отбор проб из грудных лимфатических узлов.

"Рак яичников" относится к новообразованию, например злокачественному новообразованию, яичника у данного субъекта женского пола, причем данное новообразование имеет эпителиальное происхождение.

Термин "рак яичников", когда он используется без оговорок, включает как локализованный, так и метастазирующий рак яичников. Термин "рак яичников" может быть квалифицирован с помощью терминов "локализованный" или "метастазирующий" для различения между различными типами опухоли, где "локализованный" относится к исходной материнской опухоли, а метастазирующий к опухолям, которые распространились от исходной материнской опухоли.

Рак яичников может быть стадирован в соответствии с системой AJCC/TNM. Она описывает распространение первичной опухоли (T), отсутствие или наличие метастазов в ближайшие лимфатические узлы (N) и отсутствие или наличие отдаленных метастазов (M). Распространение первичной опухоли содержит три подкатегории T1, T2, T3. Это очень напоминает систему, которая фактически используется большинством гинекологических онкологов, называемую системой FIGO. Обе опираются на результаты хирургии для определения фактической стадии. В системе FIGO стадия опухоли классифицируется с I по IV в зависимости от того, как далеко распространилась опухоль. Стадия IV является худшей, что означает, что опухоль распространилась до своего оцениваемого предела. Стадии I-III содержат подкатегории A, B и C.

"Рак пищевода" относится к новообразованию, например злокачественному новообразованию, пищевода у данного субъекта, причем данное новообразование имеет эпителиальное происхождение, то есть к карциноме пищевода. Данные карциномы разделяются на два класса: или аденокарциномы, или плоскоклеточные карциномы.

Наиболее распространенной системой, используемой для стадирования рака пищевода, является система TNM Американского объединенного комитета по раку (AJCC). Система TNM основана на нескольких ключевых элементах информации: T относится к тому, насколько далеко первичная опухоль проросла в стенку пищевода и в близлежащие органы. N относится к распространению рака в близлежащие лимфатические узлы. M указывает на то, метастазирует ли (распространяется в отдаленные органы) рак. G описывает степень рака, которая основана на том, как образцы раковых клеток выглядят под микроскопом. Стадирование также учитывает тип клеток рака (плоскоклеточная карцинома или аденокарцинома). Для плоскоклеточных раков локализация опухоли также может быть фактором, влияющим на стадирование.

"Рак мочевого пузыря" относится к новообразованию, например злокачественному новообразованию, мочевого пузыря у данного субъекта, причем данное новообразование происходит из уротелия или переходного эпителия. Рак мочевого пузыря, таким образом, относится к переходно-клеточной (уротелиальной) карциноме, но он также относится к аденокарциноме мочевого пузыря.

Системой стадирования, наиболее часто используемой для рака мочевого пузыря, является система Американского объединенного комитета по раку (AJCC). Ее также называют системой TNM. Категория T, описывающая опухоль, содержит подкатегории: T0, Ta, Tis, T1, T2a, T2b, T3a, T3b, T4.

Методы иммуноанализа, такие как иммуногистохимия (ИГХ) и иммуноцитохимия (ИЦХ)

Как используется в настоящем документе, "иммуноанализ" представляет собой биохимический тест, который измеряет присутствие или концентрацию вещества в образцах, которые часто содержат сложную смесь веществ. Такие методы анализа основаны на уникальной способности антитела связываться с высокой специфичностью с одной молекулой или антигеном или с очень ограниченной группой молекул или антигенов. Иммуногистохимия (ИГХ) и иммуноцитохимия (ИЦХ) являются двумя примерами методов иммуноанализа, подходящих для использования для детектирования антигена гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) в раскрытых способах и применениях.

Иммуноцитохимия (ИЦХ) является распространенным лабораторным методом, который использует антитела, которые нацелены на конкретные пептидные или белковые антигены в клетке с помощью специфических эпитопов. Затем эти связанные антитела могут быть детектированы с помощью нескольких различных способов. ИЦХ позволяет исследователям оценивать, экспрессируют или нет клетки в конкретном образце рассматриваемый антиген. В случаях, когда обнаружен иммунопозитивный сигнал, ИЦХ также позволяет исследователям определять, какие из субклеточных компартментов экспресиируют данный антиген.

В иммуногистохимии (ИГХ) образцы представляют собой срезы биологической ткани, в которых каждая клетка окружена архитектурой ткани и другими клетками, обычно находящимися в интактной ткани. Иммуноцитохимия является методом, используемым для определения присутствия конкретного белка или антигена в клетках (культивированных клетках, клеточных суспензиях) с помощью специфического антитела, которое связывается с ним, тем самым делая возможным визуализацию и исследование под микроскопом. Она является ценным инструментом для определения клеточного содержимого из отдельных клеток. Образцы, которые могут быть проанализированы, включают мазки крови, аспираты, тампоны, культивируемые клетки и клеточные суспензии.

Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и сэндвич-ELISA являются методами иммуноанализа, которые преимущественно используют в способах, раскрытых в настоящем документе. В (прямом) ELISA неизвестное количество антигена прикрепляют к поверхности, и затем на поверхность наносят специфическое антитело, так что оно может связываться с антигеном. Это антитело связано с ферментом, и на последнем этапе добавляют вещество, которое фермент может превращать в какой-либо детектируемый сигнал, чаще всего в изменение цвета химического субстрата. В сэндвич-ELISA к поверхности прикрепляют захватывающее антитело, которое может связываться с антигеном. Другие этапы эквивалентны ELISA.

В иммуноферментном анализе (ИФА), который аналогичен сэндвич-ELISA, к поверхности прикрепляют стрептавидин, и затем захватывающее антитело биотинилируют, в других отношениях другие этапы выполняют эквивалентно ELISA. Иммуноанализ ИФА преимущественно используют в способах, раскрытых в настоящем документе.

Вестерн-блот (иногда называемый белковым иммуноблотом) является широко используемым аналитическим методом, используемым для детектирования специфических белков в данном образце гомогената или экстракта из ткани. Он использует гель-электрофорез для разделения нативных или денатурированных белкок по длине полипептида (денатурирующие условия) или по 3-D структуре белка (нативные/неденатурирующие условия). Затем белки переносят на мембрану (как правило, из нитроцеллюлозы или PVDF), где их исследуют (детектируют) с использованием антител, специфических к целевому белку.

Целенаправленные средства, такие как, например, антитела, антигенсвязывающие фрагменты или варианты, слитые конструкции или производные, специфические для кератина 7 и кератина 19 и/или их фрагментов, используют для детектирования экспрессии гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов). Целенаправленные средства настоящего изобретения, преимущественно, предоставляют в виде композиции, но их можно также предоставлять по отдельности, но последовательно друг за другом. Способ настоящего изобретения, таким образом, предлагает антитела, антигенсвязывающие фрагменты или варианты, слитые конструкции или производные, связывающиеся с гетеротипичным комплексом кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагментом(ами). Антитела можно детектировать, как описано далее в настоящем документе, посредством прямого мечения самих антител, например с помощью радиоактивных меток, флуоресцентных меток, гаптеновых меток, таких как биотин, или фермента, такого как пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза. В качестве альтернативы используют непрямое мечение, при котором немеченое первичное антитело используют в сочетании с меченым вторичным антителом, включающим, например, антисыворотку, поликлональную антисыворотку или моноклональное антитело, специфическое для первичного антитела. Протоколы ИГХ и ИЦХ хорошо известны в данной области техники и коммерчески доступны, смотри, например, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, NY 1988) и Current Protocols in Immunology, and Current Protocols in Molecular Biology, both John Wiley and Sons, Inc., N. Y.), включенные в настоящий документ посредством ссылки.

Как показано выше, настоящее изобретение предлагает средства и способы для улучшения чувствительности и специфичности диагностики и/или прогноза злокачественного неопластического заболевания, такого как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода и/или рак яичников. Более конкретно, настоящее изобретение предлагает композицию, которая дает лучшую чувствительность при детектировании злокачественного неопластического заболевания, таким образом чтобы улучшить детектирование белковых маркеров злокачественного неопластического заболевания в ELISA и ИФА, а также в ИГХ и ИЦХ, тем самым давая более последовательный и надежный результат при выполнении диагностики и/или прогноза у пациентов, имеющих злокачественное неопластическое заболевание, такое как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода и/или рак яичников.

Кроме того, способы в соответствии с настоящим изобретением будут улучшать идентификацию злокачественных неопластических заболеваний, таких как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода и/или рак яичников, по сравнению с доступными способами.

Целенаправленные средства, используемые в способах настоящего документа, таким образом, демонстрируют улучшенное детектирование различных злокачественных неопластических заболеваний по сравнению с другими известными способами, такими как, например, CYFRA 21-1 (смотри примеры, приведенные в настоящем документе).

Примеры 2-5 показывают, что злокачественное неопластическое заболевание, такое как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода и/или рак яичников, идентифицируют по экспрессии гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов).

Способ детектирует злокачественное неопластическое заболевание, такое как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода и/или рак яичников, с помощью антител, связывающихся специфически с гетеротипичным комплексом кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагментом(ами).

Белки

Способ настоящего изобретения охватывает применение по меньшей мере двух целенаправленных средств, таких как, например, два первичных антитела, антигенсвязывающие фрагменты, варианты, слитые конструкции, производные или их фрагменты. По меньшей мере одно первое первичное антитело связывается специфически с кератином 7 или его фрагментами, и по меньшей мере одно второе первичное антитело связывается специфически с кератином 19 или его фрагментами. Упомянутые как первое, так и второе первичные антитела способны связываться специфически и одновременно с гетеротипичным комплексом кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагментом(ами) и/или его фрагментами.

Кератин 7 (K7) (эталонная последовательность в NCBI: NP_005547.3, идентификатор гена в NCBI: 3855), также известный как цитокератин 7 (CK7) или сарколектин (SCL), представляет собой белок, который у людей кодируется геном KRT7. Кератин 7 представляет собой кератин типа II и, вместе с другими генами, кодирующими кератины типа II, кластеризован в районе хромосомы 12q12-q13. K7 представляет собой белок размером 51 кДа, который имеет длину 469 аминокислот и имеет общую структуру, которую можно видеть на фиг. 1. Альтернативный сплайсинг может приводить к нескольким транскрипционным вариантам. Он специфически экспрессируется в простом эпителии, выстилающем полости внутренних органов, и в протоках желез и кровеносных сосудах.

Кератин 19 (K19) (эталонная последовательность в NCBI: NP_002267.2, идентификатор гена в NCBI: 3880) также известен как цитокератин 19 (CK19) и представляет собой кератин типа I, в основном обнаруженный в перидерме, временном поверхностном слое, который охватывает развивающийся эпидермис. K19 представляет собой белок размером 44 кДа, который имеет длину 400 аминокислот и имеет общую структуру, которую можно видеть на фиг. 1. K19 у людей кодируется геном KRT19 и расположен в гене в районе хромосомы 17q12-q21.

Кератины in vivo собираются в виде гетерополимеров, то есть белки типа I и типа II образуют гетеродимеры, которые в свою очередь собираются с образованием тетрамеров. Два мономера образуют параллельный димер посредством закручивания своих α-спиральных стержней в суперспираль, ориентированную совмещенным образом и в том же направлении, и затем два димера соединяются бок о бок в шахматной антипараллельной ориентации с образованием двунаправленного тетрамера (смотри фиг. 1). Когда кератины K7 и K19 собираются в гетеродимеры и тетрамеры, образуются гетеротипичные комплексы кератина 7 с кератином 19.

Как используется в настоящем документе, термин "гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19" предназначен для охвата молекулярного соединения, получаемого из параллельного и совмещенного димера между полноразмерным кератином 7 и полноразмерным кератином 19, и его фрагментов. Он дополнительно включает перекрывающиеся димеры между кератином 7 и кератином 19 в антипараллельных тетрамерах между кератином 7 и кератином 19 и их фрагменты. Он дополнительно включает олигомеры, протофиламенты и филаменты, собранные из данных тетрамеров, и любые их фрагменты. Для общей структуры гетеротипичного комплекса кератинов смотри фиг. 1.

В гетеротипичном комплексе кератина 7 с кератином 19 присутствует, преимущественно, как минимум не менее 3, предпочтительно по меньшей мере 5, или по меньшей мере 10, или по меньшей мере 15, или по меньшей мере 20, или по меньшей мере 25, или по меньшей мере 30, но, более предпочтительно, более чем 40 аминокислот в неразрывной последовательности, происходящей от участка кератина 7 гетеротипичного комплекса, и должно быть как минимум не менее 3, предпочтительно по меньшей мере 5, или по меньшей мере 10, или по меньшей мере 15, или по меньшей мере 20, или по меньшей мере 25, или по меньшей мере 30, но, более предпочтительно, более чем 40 аминокислот в неразрывной последовательности, происходящей от участка кератина 19 гетеротипичного комплекса. Упомянутые аминокислоты должны быть уникальными для кератина 7 или кератина 19 соответственно.

Преимущественно, упомянутые как минимум не менее 3, предпочтительно по меньшей мере 5, или по меньшей мере 10, или по меньшей мере 15, или по меньшей мере 20, или по меньшей мере 25, или по меньшей мере 30, но, более предпочтительно, более чем 40 аминокислот в неразрывной последовательности взяты из аминокислотной последовательности 256-412 в белке кератина 7. Более предпочтительно, неразрывная последовательность взята из аминокислотной последовательности 300-380 в кератине 7.

Преимущественно, упомянутые как минимум не менее 3, предпочтительно по меньшей мере 5, или по меньшей мере 10, или по меньшей мере 15, или по меньшей мере 20, или по меньшей мере 25, или по меньшей мере 30, но, более предпочтительно, более чем 40 аминокислот в неразрывной последовательности взяты из аминокислотной последовательности 244-400 в белке кератина 19. Более предпочтительно, неразрывная последовательность взята из аминокислотной последовательности 311-375 в кератине 19.

Антитела

В одном аспекте настоящее изобретение предлагает способ, охватывающий применение по меньшей мере двух целенаправленных средств, таких как, например, два первичных антитела, антигенсвязывающих фрагмента или варианта, слитых конструкции или их производных, для детектирования присутствия гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) в биологическом образце, причем первое первичное антитело, антигенсвязывающий фрагмент или вариант, слитая конструкция или их производное связывается специфически с кератином 7 или его фрагментами гетеротипичного комплекса, и второе первичное антитело, антигенсвязывающий фрагмент или вариант, слитая конструкция или их производное связывается специфически с кератином 19 или его фрагментами гетеротипичного комплекса. Преимущественно, по меньшей мере два антитела, антигенсвязывающих фрагмента или варианта, слитых конструкции или их производных присутствуют вместе в коктейле антител, или в готовом к использованию пользователем формате, или в концентрированном растворе, который требует разбавления перед его применением, иногда называемым маточным раствором.

Таким образом, один аспект настоящего изобретения охватывает композицию, содержащую по меньшей мере одно первое первичное антитело, антигенсвязывающий фрагмент или вариант, слитую конструкцию или их производное, которые распознают пептид кератин 7 и/или его фрагмент(ы), и по меньшей мере одно второе первичное антитело, антигенсвязывающие фрагменты или варианты, слитые конструкции или их производное, которые распознают пептид кератин 19 и/или его фрагмент(ы), причем как первое, так и второе первичные антитела способны связываться специфически и одновременно с гетеротипичным комплексом кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагментом(ами).

Предполагается, что "связывающийся специфически с" или "реагирующий специфически с", как используется в настоящем документе, эквивалентно "способный селективно связываться" или "связывающийся специфически с". Как используется в настоящем документе, предполагается, что данные выражения означают антитело или антигенсвязывающий фрагмент или вариант, слитую конструкцию или их производное, включая любой связывающий участок, получаемый из антитела, которые способны связываться с антигеном молекулы, а также которые связываются по меньшей мере в 10 раз сильнее с данными белками, чем с другими белками, например по меньшей мере в 50 раз сильнее или по меньшей мере в 100 раз сильнее. Связывающий участок может быть способен связываться селективно с белком в физиологических условиях, например in vivo. Подходящие способы измерения относительной силы связывания включают методы иммуноанализа, например, когда связывающий участок представляет собой антитело. В качестве альтернативы, связывание может быть оценено с помощью конкурентных методов анализа или с помощью анализа Biacore(R) (Biacore International AB, Швеция).

Предполагается, что термин "связывающий специфически и одновременно с", как используется в настоящем документе, обозначает, что первое и второе целенаправленные средства связываются специфически и одновременно с гетеротипичным комплексом кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагментом(ами) и образуют триплекс, содержащий упомянутые первое и второе целенаправленные средства и гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмент(ы). Упомянутые первое и второе целенаправленные средства образуют упомянутый триплекс с гетеротипичным комплексом кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагментом(ами) в течение временного периода, который достаточно продолжителен для детектирования комплекса с помощью любых средств или способов, которые описаны в настоящем документе, или же с помощью средств или способов, известных специалисту в данной области техники.

В варианте осуществления одного аспекта, каждое из первого и второго антител или антигенсвязывающих фрагментов или вариантов, слитых конструкций или их производных связывается с отдельными антигенными сайтами гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов). Как правило, первое первичное антитело реагирует специфически с антигенным сайтом, присутствующим на участке K7 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов), и второе первичное антитело реагирует специфически с антигенным сайтом, присутствующим на участке K19 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов).

Поскольку два мономера кератин 7 и кератин 19 гетеротипичного комплекса между кератином 7 и кератином 19 выровнены параллельным и совмещенным образом по спиральным структурам, любые два антитела, связывающиеся с соответствующими положениями от спирали 1A до спирали 2B (смотри фиг. 1) на кератине 7 и кератине 19 соответственно, не будут связываться одновременно. Это означает, что если кератин 7 обернут вокруг кератина 19, соответствующие открытые положения не позволяют связываться одновременно двум антителам по стерическим причинам. Это также иллюстрируется тем, что, например, аминокислоты 271-291 на кератине 19 спариваются в суперспираль с аминокислотами 283-303 на кератине 7. Если антитело к кератину 7 связывается в пределах последовательности 283-303 на кератине 7, то антитело к кератину 19 не сможет в то же время связываться с аминокислотами 271-291 на кератине 19 в гетеротипичном комплексе из-за стерических препятствий.

В способах, представленных в настоящем документе, можно использовать ряд доступных антител, которые связываются специфически с кератином 7, таких как, например, C-35, C-62, C-68, C18, C35, KS 7.18, LDS-68, LP1K, RCK105. При этом одним антителом, которое преимущественно используют в способах, представленных в настоящем документе, является моноклональное антитело к кератину 7, производимое клоном Ks 7.18, который доступен от Progen Biotechnik, GmBH, Германия. Моноклональное антитело KS 7.18 связывается специфически с аминокислотами 300-350 участка K7 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов).

Примерами доступных антител, которые будут связываться специфически с кератином 19, являются A53-B/A2.26, также называемое Ks19.1, BM-19.21, CCD003, CCD004,CKS04, CKS06, SA 21, SA 45, Ks19.2, LP2K. При этом одним антителом, которое преимущественно используют в представленном способе, является моноклональное антитело Ks 19.2, которое доступно от Progen Biotechnik, GmBH, также известное как моноклональное антитело BM-19.21, производимое клоном BM-19.21, который доступен от Roche Diagnostics. BM-19.21 связывается специфически с аминокислотами 346-367 участка K19 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов). Несколько антител против кератина 19 описаны в документе Epitope Specificity of 30 Monoklonal Antibodies against Cytokeratin Antigens: The ISOBM TD-1 workshop, Tumor Biol 1998;19:132-152.

Преимущественно, каждое из первого и второго первичных антител или антигенсвязывающих фрагментов или вариантов, слитых конструкций или их производных предоставляют в композиции в виде коктейля антител, в водной форме или в форме высушенного замораживанием порошка. Для последнего необходим этап регидратации для приведения антител в пригодную для использования жидкую форму перед использованием.

В качестве альтернативы первое и второе первичные антитела предоставляют по отдельности, то есть одно первичное антитело предоставляют до другого при использовании в способах, представленных в настоящем документе. В одном варианте осуществления первое первичное антитело, распознающее пептид кератин 7 и/или его фрагмент(ы), предоставляют в образец, содержащий гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмент(ы). Первое первичное антитело будет связываться с антигенным сайтом, присутствующим на участке K7 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов), и образовывать комплекс антиген-K7-антитело. После этого второе первичное антитело, распознающее пептид кератин 19 и/или его фрагмент(ы), предоставляют в образец, содержащий гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19-K7-антитело. Упомянутое второе первичное антитело будет связываться с антигенным сайтом, присутствующим на участке K19 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и образовывать комплекс K19-антитело-антиген-K7-антитело.

В альтернативном варианте осуществления второе первичное антитело, распознающее пептид кератин 19 и/или его фрагмент(ы), предоставляют в образец, содержащий гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмент(ы). Второе первичное антитело будет связываться с антигенным сайтом, присутствующим на участке K19 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и образовывать комплекс антиген-K19-антитело. После этого первое первичное антитело, распознающее пептид кератин 7 и/или его фрагмент(ы), предоставляют в образец, содержащий гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19-K19-антитело. Упомянутое первое первичное антитело будет связываться с антигенным сайтом, присутствующим на участке K7 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19, и образовывать комплекс K7-антитело-антиген-K19-антитело.

Антитела могут представлять собой целые антитела или их фрагменты, например антигенсвязывающий фрагмент или вариант, слитую конструкцию или их производное, при условии, что они способны связываться с желаемым белком in vitro. Такая специфичность связывания может быть определена с помощью способов, хорошо известных в данной области техники, таких как, например, ELISA, ИФА, иммуногистохимия, иммунопреципитация, вестерн-блоты, хроматография и проточная цитометрия, с использованием трансфецированных клеток, экспрессирующих все субъединицы или их гетеродимер (смотри примеры).

Термин "антитело" включает по существу интактные молекулы антител любых видов, таких как грызуны, например мышь, крыса, морская свинка, или не грызуны, такие как кролик, коза, овца, собака, свинья, верблюд, дромадер, осел, лошадь или курица, а также химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела (где по меньшей мере одна аминокислота мутировала по сравнению с природными человеческими антителами), одноцепочечные антитела, биспецифические антитела, тяжелые цепи антител, легкие цепи антител, гомодимеры и гетеродимеры тяжелых и/или легких цепей антител и их антигенсвязывающие фрагменты и производные. Например, антитело может представлять собой моноклональное антитело.

Антигенная специфичность придается вариабельными доменами и не зависит от константных доменов, как известно из экспериментов с бактериальной экспрессией фрагментов антител, все из которых содержат один или несколько вариабельных доменов. Данные молекулы включают подобные Fab молекулы; молекулы Fv; молекулы одноцепочечных Fv (ScFv), где участвующие домены V H и V L связаны посредством гибкого олигопептида;) и однодоменные антитела (dAb), содержащие изолированные V-домены. Общий обзор методов, используемых при синтезе фрагментов антител, которые сохраняют свои специфические связывающие сайты, можно найти в документе Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299.

Таким образом, под "антигенсвязывающим фрагментом" понимается функциональный фрагмент антитела, который способен связываться с любым из белков K7 или K19 или их фрагментами и гетеротипичным комплексом кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагментом(ами). Примеры антигенсвязывающих фрагментов могут быть выбраны из группы, состоящей из фрагментов Fv (например, одноцепочечных Fv и дисульфидно связанных Fv), подобных Fab фрагментов (например, фрагментов Fab, фрагментов Fab' и фрагментов F(ab)2), отдельных цепей антител (например, тяжелых или легких цепей), отдельных вариабельных доменов (например, доменов VH и VL) и доменных антител (dAb, включая одиночный и двойной форматы; то есть dAb-линкер-dAb).

Таким образом, в одном варианте осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент или вариант, слитая конструкция или их производное, содержит или состоит из интактного антитела. В одном варианте осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело.

Например, антитело или антигенсвязывающий фрагмент или вариант, слитая конструкция или их производное могут состоять по существу из интактного антитела. Под "состоит по существу из" авторы понимают, что антитело или антигенсвязывающий фрагмент, вариант, слитая конструкция или их производное состоит из части интактного антитела, достаточной для сохранения специфичности связывания к любому из двух различных белков K7 и K19 или их фрагментов. В других вариантах осуществления два различных белка K7 и K19 имеют человеческое происхождение.

Термин "антитело" также включает все классы антител, включая IgG, IgA, IgM, IgD и IgE. В одном варианте осуществления при этом антитело представляет собой молекулу IgG, такую как молекула IgG1, lgG2, lgG3 или lgG4. В одном варианте осуществления антитело представляет собой молекулу IgG1. В другом варианте осуществления антитело представляет собой молекулу IgG1 с легкой цепью каппа.

В другом варианте осуществления антитело может представлять собой неприродное антитело. Конечно, когда антитело представляет собой природное антитело, его предоставляют в выделенной форме (то есть отдельно от того, где оно обнаруживается в природе).

В объем настоящего изобретения также включены модифицированные варианты антител и их антигенсвязывающих фрагментов, например модифицированные посредством ковалентного прикрепления полиэтиленгликоля или другого подходящего полимера, и их применения.

Способы генерации антител и фрагментов антител хорошо известны в данной области техники. Например, антитела можно генерировать посредством любого из нескольких способов, которые используют индуцирование производства молекул антител in vivo, скрининг библиотек иммуноглобулинов или создание молекул моноклональных антител клеточными линиями в культуре. Сюда включают, но без ограничения, гибридомную технологию, технологию гибридом из человеческих B-клеток и технологию гибридом, полученных с помощью вируса Эпштейна-Барр (EBV).

Например, генерация моноклональных или поликлональных антител к K7 или K19 может быть осуществлена посредством иммунизации, когда цельный белок или его подходящий фрагмент могут быть введены в отличное от человека млекопитающие (такое как мыши или кролики) с последующими бустерными инъекциями для получения выработки антител. Может быть выделена сыворотка, выделяемая из иммунизированных животных, ради поликлональных антител, содержащихся в ней, или можно использовать селезенки от иммунизированных животных для производства гибридом и моноклональных антител.

В одном примере моноклональное антитело к одному из белков может быть получено из мышиных гибридом в соответствии с классическим способом Kohler и Milstein (Nature, 256:495, 1975) или производными от него способами. Кратко говоря, мышь (такую как Balb/c) повторно заражают несколькими микрограммами выбранного белка, или его пептидного фрагмента, или его конъюгата с подходящим носителем в течение периода в несколько недель. Затем мышь умерщвляют, и выделяют антителообразующие клетки селезенки. Клетки селезенки сливают с помощью полиэтиленгликоля с мышиными миеломными клетками, и избыточные неслитые клетки разрушают посредством выращивания системы на селективных средах, содержащих аминоптерин (среды HAT). Успешно слитые клетки разбавляют, и аликвоты разбавления помещают в лунки планшета для микротитрования, где продолжается рост культуры. Антителообразующие клоны идентифицируют посредством детектирования антитела в жидкости супернатанта лунок с помощью процедур иммуноанализа, таких как ELISA, как первоначально описано Engvall (Enzymol., 70:419, 1980), и производных от него способов.

Могут быть выращены выбранные положительные клоны, и их продукт в виде моноклонального антитела собирают для использования.

Коммерческие источники антител включают DAKO A/S, Abeam, Lab Vision, BioCare Medical, Cell Marque Corp. Abnova, Acris, Progen, Santa cruz biotech и так далее.

Образующие поликлональные антитела животные идентифицируют посредством кровопускания иммунизированным животным и отбора подходящего животного с подходящим титром поликлональных антител.

В некоторых вариантах осуществления антитела очищают перед использованием. Очистку антител осуществляют с помощью методов, доступных в данной области техники и известных специалисту.

Генерация антител K7 и K19 описана в данной области техники и доступна из коммерческих источников, как описано в настоящем документе, или доступна с помощью методов, известных специалисту в данной области техники благодаря ссылкам, находящимся в настоящем документе и соответственно включенным в настоящий документ посредством ссылки.

Антитело или антигенсвязывающий фрагмент или их производное могут также быть получены с помощью рекомбинантных средств. Подходящие моноклональные антитела к выбранным антигенам и белкам могут быть получены посредством методов, известных специалисту. Фрагменты антител также могут быть получены с помощью способов, хорошо известных в данной области техники. Например, фрагменты антител могут быть получены посредством протеолитического гидролиза антитела или посредством экспрессии в E. coli или клетках млекопитающего (например, в культуре клеток яичника китайского хомячка или в других системах экспрессии белков) кодирующего ДНК фрагмента. В качестве альтернативы, фрагменты антител могут быть получены посредством расщепления с помощью пепсина или папаина цельных антител посредством обычных способов.

Таким образом, в одном варианте осуществления по меньшей мере одно из первичных антител, используемых в способах, представленных в настоящем документе, представляет собой моноклональное антитело. В другом варианте осуществления по меньшей мере одно из первичных антител, используемых в способах настоящего изобретения, представляет собой рекомбинантное антитело.

В качестве альтернативы, можно детектировать образование комплекса с помощью duolink (O-link bioscience). Обычная иммунофлюоресценция может показывать присутствие отдельных белков, но не образование гетеродимеров между различными белками. С помощью Duolink может быть возможным точно локализовать, где происходит гетеродимеризация, и количественно определить относительную степень взаимодействия. Таким образом, с помощью метода duolink может быть возможным локализовать и количественно охарактеризовать гетеротипичный комплекс между кератином 7 и кератином 19 посредством использования одного антитела, специфического для кератина 7, и одного антитела, специфического для кератина 19, причем оба антитела одновременно связываются с гетеротипичным комплексом между кератином 7 и кератином 19.

Антитела, или антигенсвязывающие фрагменты, или их производные, или композиция, содержащая упомянутые антитела или антигенсвязывающие фрагменты или их производные, описанные в настоящем документе, могут быт лиофилизированы для хранения и восстановления в подходящем носителе перед использованием. Можно использовать любой подходящий способ лиофилизации (например, сушку распылением, сушку осадка) и/или способы восстановления. Специалистам в данной области техники будет ясно, что лиофилизация и восстановление ведут к различной степени потери активности антител (например, в случае обычных иммуноглобулинов антитела IgM имеют тенденцию к большей потере активности, чем антитела IgG), и что используемые уровни может быть необходимо скорректировать с увеличением, для того чтобы это компенсировать. В одном варианте осуществления лиофилизированная (высушенная замораживанием) композиция теряет не более чем приблизительно 20%, или не более чем приблизительно 25%, или не более чем приблизительно 30%, или не более чем приблизительно 35%, или не более чем приблизительно 40%, или не более чем приблизительно 45%, или не более чем приблизительно 50% своей активности (перед лиофилизацией) при регидратации. Специалистам в данной области техники также будет ясно, что антитела и антигенсвязывающие фрагменты, варианты, слитые конструкции и их производные, описанные в настоящем документе, могут существовать в мономерной форме или в форме их гомо- или гетеромультимеров (например, димера, тримера, тетрамера, пентамера и так далее).

Кроме того, в настоящем документе предусмотрено, что первичные антитела или их фрагменты могут быть меченными прямым или непрямым образом с помощью детектируемого соединения. Под прямым мечением понимается, что детектируемое соединение прикреплено к антителу. Под непрямым мечением понимается, что детектируемое соединение прикреплено к линкеру, такому как, например, вторичное или третичное антитело. Детектируемое соединение может представлять собой любое соединение или маркер, известные специалистам в данной области техники или описанные в настоящем документе и в качестве такого соединения способные к генерации сигнала, который делает возможным прямое или непрямое количественное или относительное измерение молекулы, к которой оно прикреплено.

Широкое разнообразие детектируемых соединений, или меток, и методы конъюгирования известны и подробно описаны как в научной, так и в патентной литературе. Подходящие метки включают радионуклиды, ферменты, субстраты, кофакторы, ингибиторы, флуоресцентные средства, хемилюминесцентные средства, магнитные частицы и тому подобные, которые хорошо известны специалисту. Детектируемое соединение может представлять собой отдельный атом или молекулу, который или прямо, или косвенно участвует в производстве детектируемых веществ. Необязательно, детектируемое соединение выбирают из группы, состоящей из флуоресцентного соединения, связанного с ферментом соединения, биотинилированного соединения и радиоактивно меченого соединения, как описано далее в настоящем документе, например ниже. Под "меткой", "детектируемым соединением" понимается любая детектируемая метка, которая может быть прикреплена непосредственно (например, флуоресцентная молекула, интегрированная в полипептид) или опосредованно (например, посредством связывания с первичным антителом с помощью вторичного, третичного или более антитела с интегрированной флуоресцентной молекулой) к представляющей интерес молекуле. Таким образом, метка, маркер или детектируемое соединение предстаяют собой любую метку, которая может быть визуализирована, например, с помощью способов визуализации.

Под "детектируемым соединением" авторы дополнительно понимают, что соединение представляет собой такое, которое, когда расположено в целевом участке, после предоставления композиции настоящего изобретения в биологический образец, такой как образец ткани или образец биологической жидкости, может быть детектировано in vitro. Это предусматривает, что детектируемое соединение генерирует сигнал, и, кроме того, удобно и поэтому включено в следующих вариантах осуществления, если детектируемое соединение может быть детектировано, и относительное количество и/или местоположение участка (например, местоположение на образце ткани) могут быть определены. Детектируемые соединения хорошо известны в данной области техники.

Таким образом, антитела, или антигенсвязывающие фрагменты, или их производные, или композиция, содержащая такие антитела, или антигенсвязывающие фрагменты, или их производные, подходят для использования в способах, проиллюстрированных далее в настоящем документе с помощью способов и применений для детектирования гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов), диагностики или прогноза злокачественного неопластического заболевания, такого как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода и рак яичников, in vitro в биологических образцах. В других вариантах осуществления в настоящем документе проиллюстрированы используемые иммунохимические способы.

Подходящие детектируемые соединения хорошо известны в данной области техники, и прикрепление или связывание данных соединений с полипептидами и белками также хорошо известно в данной области техники. Другими примерами детектируемых соединений являются фермент; субстрат фермента; ингибитор фермента; кофермент; предшественник фермента; апофермент; флуоресцентное вещество; пигмент; хемилюминесцентное соединение; люминесцентное вещество; окрашивающее вещество; магнитное вещество; или металлические частицы, такие как коллоидное золото; радиоактивное вещество, такое как ¹²⁵I, ¹³¹I, ³²P, ³H, ³⁵S или ¹⁴C; фосфорилированное производное фенола, такое как нитрофенилфосфат, производное люциферина или производное диоксетана; или тому подобное. Фермент может представлять собой дегидрогеназу; оксидоредуктазу, такую как редуктаза или оксидаза; трансферазу, которая катализирует перенос функциональных групп, таких как амино-; карбоксильная, метильная, ацильная или фосфатная группа; гидролазу, которая может гидролизовать связь, такую как сложноэфирная, гликозидная, эфирная или пептидная связь; лиазу; изомеразу; или лигазу. Фермент может также быть конъюгирован с другим ферментом. Фермент может быть детектирован посредством ферментативной циклизации. Например, когда детектируемая метка представляет собой щелочную фосфатазу, измерение может быть осуществлено посредством наблюдения флуоресценции или люминесценции, генерируемой от подходящего субстрата, такого как производное умбеллиферона. Производное умбеллиферона может содержать 4-метилумбеллиферилфосфат. Флуоресцентная или хемилюминесцентная метка может представлять собой флуоресцеинизотиоцианат; производное родамина, такое как родамина B изотиоцианат или тетраметилродаминизотиоцианат; дансилхлорид (5-(диметиламино)-1-нафталинсульфонилхлорид); дансилфторид; флуорескамин (4- фенилспиро[фуран-2(3H),1'(3'H)-изобензофуран]-3,3'-дион); фикобилипротеин, такой как фикоцианин или фикоэритрин; акридиниевую соль; соединение люминола, такое как люмиферин, люцифераза или акворин; имидазолы; эфир щавелевой кислоты; хелатное соединение редкоземельных элементов, таких как европий (Eu), тербий (Tb) или самарий (Sm); или производное кумарина, такое как 7-амино-4-метилкумарин. Метка может также представлять собой гаптен, такой как адамантин, флуоресцеинизотиоцианат или карбазол. Гаптен может допускать образование агрегата при контакте с мультивалентным антителом или содержащим стрептавидин соединением. Другие примеры детектируемых соединений включают, но без ограничения, следующие: радиоизотопы (например, ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ¹²³I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ⁹⁰Y, ¹⁸⁸Re), радионуклиды (например, 11C, 18F, 64Cu), флуоресцентный метки (например, ФИТЦ, родамин, лантаноидные люминофоры, карбоцианин), ферментативные метки (например, пероксидазу хрена, [бета]-галактозидазу, люциферазу, щелочную фосфатазу), хемилюминесцентные, биотиниловые группы и заранее определенные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным связывающим объектом (например, парными последовательностями лейциновой застежки, сайтами связывания для вторичных антител, связывающими металлы доменами, эпитопными или белковыми метками, углеводами). В некоторых вариантах осуществления метки прикреплены посредством спейсерных ножек различной длины для уменьшения потенциальных стерических препятствий.

При непрямом мечении дополнительную молекулу или соединение приводят в контакт с комплексами антитело-антиген, то есть иммунными комплексами между первичным антителом и белком, с которым оно связывается, или генерируют в месте их нахождения. Например, детектируемое соединение, такое как фермент, может быть прикреплено или связано детектирующим антителом или детектирущей молекулой, как проиллюстрировано в настоящем документе. Генерирующая сигнал молекула может затем генерировать детектируемый сигнал в месте нахождения иммунного комплекса. Например, фермент, когда получает подходящий субстрат, может производить видимый или детектируемый продукт в месте нахождения иммунного комплекса.

В качестве другого примера непрямого мечения дополнительная молекула (которая может быть названа связывающим средством), которая может связываться или с представляющей интерес молекулой, или с представляющим интерес антителом (первичным антителом), такая как второе антитело к первичному антителу, может быть приведена в контакт с иммунным комплексом. Дополнительная молекула может содержать генерирующую сигнал молекулу или детектируемое соединение.

Дополнительная молекула может представлять собой антитело, которое поэтому может быть названо вторичным, третичным или более антителом. Связывание вторичного антитела с первичным антителом может формировать так называемый сэндвич с первым (или первичным) антителом и представляющей интерес молекулой. Иммунные комплексы могут быть приведены в контакт с меченым вторичным антителом в эффективных условиях и в течение периода времени, достаточного для того, чтобы позволить образоваться вторичному иммунному комплексу. Затем вторичные иммунные комплексы можно, как правило, промывать для удаления любых неспецифически связанных меченых вторичных антител, и затем остающаяся во вторичных иммунных комплексах метка может быть детектирована. Дополнительная молекула может также представлять собой или включать в себя одну из пары молекул или соединений, которые могут связываться друг с другом, таких как молекулы биотина/авидина, и тогда детектирующее антитело или детектирующая молекула должны включать другой член пары.

Другие примеры непрямого мечения включают детектирование комплексов первичное антитело-антиген (иммунных) с помощью двухстадийного подхода. Например, молекулу (которая может быть названа первым связывающим средством), такую как антитело, которое обладает аффинностью связывания к первичному иммунному комплексу между первичным антителом и антигеном можно использовать для образования вторичных комплексов. После промывания вторичный комплекс может быть приведен в контакт с другой дополнительной молекулой (которая может быть названа вторым связывающим средством), которая обладает аффинностью связывания к первому связывающему средству, снова в эффективных условиях и в течение периода времени, достаточного для того, чтобы позволить образоваться третичным комплексам. В данном примере второе связывающее средство может быть соединено с детектируемым соединением, что делает возможным детектирование третичных комплексов, образованных таким образом. Данная система может дополнительно содержать средства для обеспечения усиления сигнала.

Другими примерами первичных, вторичных или более связывающих средств со средствами для усиления сигнала являются конъюгированные антииммуноглобулины, такие как биотинилированные антитела (например, конъюгированные с авидином/стрептавидином), или стафилококковый белок A (связывается с IgG), белок G, декстран, аптамеры, белки, пептиды, малые органические молекулы, природные соединения (например, стероиды), непептидные полимеры или любые другие молекулы, которые специфически и эффективно связываются с другими молекулами, конъюгированными с детектируемым соединением или нет. В еще одном варианте осуществления вторичное, третичное или более связывающее средство представляет собой антитело, такое как антимышиный конъюгат, например свиное антимышиное антитело. Конъюгат может представлять собой конъюгат с декстраном, HRP, биотином, щелочной фосфатазой и так далее, как описано выше. В одном варианте осуществления детектируемое соединение представляет собой свиное антимышиное антитело, конъюгированное с декстраном и HRP.

В другом варианте осуществления вторичное, третичное или более связывающее средство представляет собой антитело, такое как антикроличий конъюгат, например козий антикроличий конъюгат. Конъюгат может представлять собой конъюгат с декстраном, HRP, биотином и так далее, как описано выше.

В одном варианте осуществления детектируемое соединение представляет собой козий антикроличий конъюгат с декстраном. В другом варианте осуществления вторичное, третичное или более связывающее средство представляет собой антитело, такое как антикозий конъюгат, такой как, например, кроличий антикозий конъюгат. Конъюгат может представлять собой конъюгат с декстраном, HRP, биотином и так далее, как описано выше.

В одном варианте осуществления детектируемое соединение представляет собой кроличьи антикозьи, конъюгированные с декстраном и щелочной фосфатазой, AP.

В еще одном варианте осуществления композиция, предлагаемая в настоящем документе, дополнительно содержит буфер. Примерами буферов являются трис-буферы, такие как трис-HCl, и ФСБ-буферы. Подходящие буферы доступны и известны в данной области техники.

Дополнительными добавками к буферам могут быть, например, Tween®20, БСА, азид натрия, глицерин и вода, и pH от приблизительно 5,5 до приблизительно 8,0, такой как приблизительно 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 или 8,0.

Композиция антител может в жидкой форме быть предоставлена в "готовой к использованию" форме или в концентрированной форме, которая может быть разбавлена перед использованием, например по меньшей мере 1×10, 1×20, 1×30, 1×40, 1×50, 1×60, 1×70, 1×80, 1×90, 1×100, 1×1000, 1×10000 и во всех диапазонах и значениях между ними, в любой подходящей буферной системе при использовании, такой как, например, буферные системы, предлагаемые в настоящем документе или нет, которые могут быть ясны специалисту в данной области техники.

В одном предпочтительном варианте осуществления первое первичное антитело моноклональное антитело Ks 7.18, распознающее пептид кератин 7 и/или его фрагмент(ы), конъюгировано с биотином, и второе первичное антитело BM 19.21, распознающее пептид кератин 19 и/или его фрагмент(ы), конъюгировано с пероксидазой (пероксидазой хрена (HRP)). Конъюгирование биотина или HRP известно специалисту в данной области техники.

Композицию в соответствии с настоящим изобретением можно также использовать отдельно или в комбинации с другими средствами для детектирования злокачественного новообразования, включая, но без ограничения, средства для детектирования и измерения других опухолевых маркеров, таких как: CA125, HE4, CA 19-9, CEA, CYFRA 21-1, ПКК, ProGRP, CA242, PSA, или диагностические средства, такие как ультразвук, КТ-сканирования, рентгенография грудной клетки, и/или маркеры ИГХ, такие как K5, K20, TTF-1, CDX2, MUC 2, p63, бета-катенин, p53, 34-бета-E12, ER, CD56, NCAM, K6, K7, K19.

Способы и применения композиции

Описанные в настоящем документе антитела, или антигенсвязывающие фрагменты, или их производные, или композиция, содержащая такие антитела, или антигенсвязывающие фрагменты, или их производные, могут быть использованы в различных иммунных способах, таких как иммуногистохимические (ИГХ) и иммунохимические способы. Общие протоколы для таких иммунных способов, в частности иммуногистохимических способов, известны в данной области техники. Кроме того, способы и применения настоящего изобретения могут быть объединены с другими диагностическими способами для улучшения результата дифференциальной диагностики.

Важность точного определения наличия или отсутствия злокачественных новообразований очевидна. Кроме того, влияние как на пациента, так и на систему здравоохранения также очевидно. Таким образом, некоторые варианты осуществления способов и применений предлагают детектирование гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) в заданном биологическом образце. Способы и применения содержат получение биологического образца от субъекта, приведение упомянутого образца в контакт с антителами, или антигенсвязывающими фрагментами, или их производными, или композицией, содержащей такие антитела, или антигенсвязывающие фрагменты, или их производные, раскрытые в настоящем документе, специфическими для двух белков K7 и K19, детектирование взаимодействия между упомянутыми антителами и гетеротипичным комплексом кератина 7 с кератином 19 или его фрагментом(ами), причем детектирование взаимодействия показывает присутствие или отсутствие гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов), что делает возможным, например, детектирование гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов), детектирование злокачественного неопластического заболевания в биологическом образце, диагностику, прогноз и так далее в соответствии с любым из способов, раскрытых в настоящем документе, результаты которого могут определить, здоров ли субъект или имеет злокачественное неопластическое заболевание.

Композицию и способы настоящего изобретения можно использовать, когда злокачественное неопластическое заболевание представляет собой рак желчных протоков (внепеченочный), рак мочевого пузыря, рак молочной железы, карциному неизвестной локализации (первичной), рак шейки матки, рак толстой кишки, рак эндометрия, рак пищевода, рак желчного пузыря, рак желудка (живота), рак головы и шеи, гепатоцеллюлярный рак (печени), гипофарингеальный рак, рак почек, ларингеальный рак, рак печени (первичный), рак легкого (немелкоклеточный), рак легкого (мелкоклеточный), мезотелиому, немелкоклеточный рак легкого, рак яичников, эпителиальный рак яичников (поверхностную эпителиально-стромальную опухоль), герминогенную опухоль яичников, опухоль яичников с низким потенциалом злокачественности, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, ректальный рак, почечно-клеточную карциному (рак почек), рак слюнных желез, мелкоклеточный рак легкого, рак тонкого кишечника, рак желудка, рак яичка, рак щитовидной железы, переходно-клеточный рак почечной лоханки и мочеточника или рак матки (эндометриальный).

Композиция и способы настоящего изобретения являются подходящими, когда злокачественное неопластическое заболевание представляет собой рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода, гепатоцеллюлярный рак, рак поджелудочной железы, рак желудка и рак яичников.

Композиция и способы настоящего изобретения являются особенно подходящими, когда злокачественное неопластическое заболевание представляет собой одно из рака легкого, рака мочевого пузыря, рака пищевода или рака яичников.

Доброкачественное заболевание имеет тенденцию к небольшому повышению значений опухолевых маркеров для данных индивидуумов по сравнению со здоровыми индивидуумами. Типичными доброкачественными заболеваниями, повышающими концентрацию маркеров, являются заболевания желчных путей, печени и почек. Из-за этих повышенных значений для большинства маркеров часто используют граничную зону или "серую зону", и эта серая зона также делает маркеры непригодными для диагностических целей. Значения опухолевых маркеров в граничной зоне очень неопределенные и не могут быть классифицированы как или опухоль, или доброкачественное заболевание. Субъекты, попадающие в пределы данной серой зоны, могут быть ложно приняты за имеющих или не имеющих рак. Субъекты, попадающие в пределы данной серой зоны, получат пользу от способов, предлагаемых в настоящем документе. В раскрытых способах и применениях гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмент(ы) может присутствовать с повышенными уровнями, с пониженными уровнями или вообще отсутствовать в образце, взятом от субъекта в определенном клиническом состоянии (например, здорового или имеющего злокачественное неопластическое заболевание, такое как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода или рак яичников).

Соответственно, различное присутствие гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов), обнаруженное в данном биологическом образце, предоставляет полезную информацию в отношении вероятности того, имеет ли подвергаемый тестированию субъект злокачественные неопластические заболевания, такие как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода и рак яичников, или является здоровым. Вероятность того, что подвергаемый тестированию субъект имеет злокачественные неопластические заболевания, такие как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода и рак яичников, или является здоровым, зависит от того, является ли количество гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) в тестовом образце, взятом от упомянутого субъекта, статистически значимым от количества гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) в биологическом образце, взятом от здоровых субъектов, или контрольного уровня, о котором известно, что он присутствует у здоровых субъектов.

Разницу в гетеротипичном комплексе кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагменте(ах), обнаруженную в данном биологическом образце, можно также использовать для определения того, реагирует ли субъект, о котором известно, что он имеет злокачественное неопластическое заболевание, такое как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода или рак яичников, на применяемое терапевтическое лечение. Количество гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов), детектированное в образце, взятом во время терапии, сравнивают с количеством гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов), детектированном в образце, взятом до получения лечения. Кроме того, количество гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов), детектированное в образце, взятом во время терапии, сравнивают с эталоном гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов), характерным для здорового субъекта. На основании сравнения можно определить, реагирует ли упомянутый субъект на терапевтическое лечение, и каков уровень этой реакции.

Кроме того, разницу в присутствии гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов), обнаруженную в заданном биологическом образце, можно также использовать для определения того, будет ли субъект, о котором известно, что он имеет злокачественное неопластическое заболевание, такое как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода или рак яичников, реагировать на заданное терапевтическое лечение. Количество гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов), детектированное в образце, взятом от субъекта, который диагностирован как имеющий злокачественное неопластическое заболевание, такое как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода или рак яичников, сравнивают с эталонными панелями гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов), взятыми от субъектов с аналогичными диагнозами, которые подвергались различным формам лечения. Эталонные панели гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов), созданные из образцов, взятых от субъектов, подвергнутых заданному лечению, причем лечение, приводящее к положительному результату, рассматривают как показатель того, что данное лечение оказывает положительный эффект на субъекта и поэтому считается успешным. Эталонные панели гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов), созданные из образцов, взятых от субъектов, подвергнутых заданному лечению, причем лечение, приводящее к нейтральному результату, рассматривают как показатель того, что данное лечение не оказывает терапевтического эффекта на субъекта и поэтому считается неуспешным. Эталонные панели гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов), созданные из образцов, взятых от субъектов, подвергнутых заданному лечению, причем лечение, приводящее к отрицательному результату, рассматривают как показатель того, что данное лечение не оказывает терапевтического эффекта на субъекта и считается неуспешным. На основании сравнения специалист в данной области техники сможет применять наилучший режим лечения для упомянутого субъекта. Кроме того, различное присутствие гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов), обнаруженное в данном биологическом образце, можно также использовать для определения стадии злокачественного неопластического заболевания, такого как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода или рак яичников у субъекта.

Количество гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19, детектированное в образце, взятом от субъекта, который диагностирован как имеющий злокачественное неопластическое заболевание, такое как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода или рак яичников, сравнивают с эталонной панелью биомаркеров, взятой от субъектов, о которых известно, что они имеют определенную стадию или степень злокачественного неопластического заболевания, такого как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода или рак яичников. На основании сравнение можно определить стадию или степень злокачественного неопластического заболевания, такого как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода или рак яичников, у упомянутого субъекта.

Гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмент(ы) могут присутствовать с повышенным уровнем, с пониженным уровнем, или вовсе отсутствовать в образце, взятом от субъекта в определенном клиническом состоянии (например, здорового или имеющего злокачественное неопластическое заболевание, такое как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода или рак яичников).

Соответственно, любое присутствие гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов), обнаруженное в данном биологическом образце, предоставляет полезную информацию в отношении вероятности того, имеет ли подвергаемый тестированию субъект злокачественное неопластическое заболевание, такое как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода или рак яичников, или является здоровым. Вероятность того, что подвергаемый тестированию субъект имеет злокачественное неопластическое заболевание, такое как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода или рак яичников, или является здоровым зависит от того, является ли количество гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) в тестовом образце, взятом от упомянутого субъекта, статистически значимым от количества гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) в биологическом образце, взятом от здоровых субъектов, или контрольного уровня, о котором известно, что он присутствует у здоровых субъектов.

Субъект, который, как считается, имеет злокачественное неопластическое заболевание, такое как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода или рак яичников, имеет морфологические, биохимические и функциональные изменения своей ткани, такие, что ткань может быть охарактеризована как злокачественное неопластическое заболевание, такое как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода или рак яичников. Стадия, до которой дошло развитие злокачественного неопластического заболевания, такого как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода или рак яичников, может быть определена с помощью известных способов, доступных в настоящее время и представленных в настоящем документе.

Анализ данных для анализа присутствия или отсутствия гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) может включать в себя этапы определения силы сигнала (например, интенсивности пиков) детектированного биомаркера и удаления "выбросов" (данных, отклоняющихся от заранее определенного статистического распределения). Примером является нормализация пиков, процесс, посредством которого рассчитывают интенсивность каждого пика относительно некоторого эталона. Например, эталон может представлять собой фоновый шум, генерируемый прибором и/или химическим веществом (например, поглощающей энергию молекулой), который устанавливают равным нулю на шкале. Затем силу сигнала, детектированную для каждого белка, можно отобразить в форме относительных интенсивностей в желаемом масштабе (например, 100). В варианте осуществления наблюдаемый сигнал для заданного пика может быть выражен в виде отношения интенсивности этого пика к сумме всего наблюдаемого сигнала как для пиков, так и для фонового шума в определенном диапазоне отношений массы к заряду. В варианте осуществления с образцом может быть введен стандарт, так что пик от стандарта можно использовать в качестве эталона для расчета относительных интенсивностей сигналов, наблюдаемых для детектированного гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов).

Получаемые данные могут быть преобразованы в различные форматы для отображения, обычно посредством использования компьютерных алгоритмов. При использовании любого из вышеуказанных форматов отображения можно легко определять по отображению сигнала, детектированы ли в образце гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмент(ы).

Типичный способ можно применять, например, для диагностики, прогнозирования, стадирования злокачественного неопластического заболевания, такого как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода или рак яичников, предсказания результата лечения, предсказания вероятности рецидива злокачественного неопластического заболевания, такого как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода или рак яичников, и так далее, как описано далее в настоящем документе.

Рецидив означает, что злокачественное неопластическое заболевание, такое как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода или рак яичников, возвращается после первоначального (или последующего) лечения(ий). К типичному первоначальному лечению относятся лучевая терапия, химиотерапия, антигормональное лечение и/или хирургия.

Некоторые способы, раскрытые в настоящем документе, подходят для применения для прогноза злокачественного неопластического заболевания, такого как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода или рак яичников. Прогноз представляет собой вероятный результат заболевания (как правило, независимый от лечения). Способы, раскрытые в настоящем документе, можно применять для прогнозирования, то есть предсказания вероятного результата заболеваний, таких как, например, рецидив в образце, полученном задолго до такого рецидива. Плохой (или худший) прогноз вероятен для субъекта с более агрессивным раком. В некоторых вариантах осуществления способа плохим прогнозом является выживаемость пациента менее чем 5 лет (как например выживаемость менее чем 1 год или выживаемость менее чем 2 года) после первоначальной диагностики неопластического заболевания. В некоторых вариантах осуществления способа хорошим прогнозом является выживаемость пациента более чем 2 года (как например выживаемость более чем 3 года, выживаемость более чем 5 лет или выживаемость более чем 7 лет) после первоначальной диагностики неопластического заболевания.

Другие варианты осуществления способа предсказывают результат лечения злокачественных неопластических заболеваний, таких как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода или рак яичников, у пациентов и подходят для применения для указания (например, выбора подходящих для использования) модальностей лечения для раковых пациентов. Как рассмотрено в другом месте в данном описании изобретения, экспрессия гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) предсказывает, что лечение (например, иммунотерапия, термотерапия, лазерная терапия, хирургия, лучевая терапия, химиотерапия), вероятно, будет неудачным (например, заболевание будет рецидивировать). Следовательно, гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмент(ы) может использоваться лицами, осуществляющими уход, для того, чтобы давать раковым пациентам рекомендации в отношении вероятно успешных методов лечения (например иммунотерапии, лазерной терапии, хирургии, термотерапии, лучевой терапии, химиотерапии). В контексте медицинской истории конкретного субъекта пациент и лицо, осуществляющее уход, могут принимать более обоснованные решения о том, лечить или нет (например, осуществлять хирургию) и/или обеспечивать или нет альтернативное лечение (такое как дистанционная лучевая терапия, брахитерапия, химиотерапия или динамическое наблюдение).

Настоящее изобретение, таким образом, относится к способам диагностики и прогнозирования злокачественного неопластического заболевания, такого как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода или рак яичников, посредством детектирования гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов), экспрессируемых в биологическом образце данного субъекта, причем присутствие или отсутствие гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) делает возможными диагностику или прогнозирование субъекта как здорового или имеющего злокачественное неопластическое заболевание, такое как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода или рак яичников. В одном варианте осуществления способы детектируют присутствие гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) в образце, причем данный маркер не экспрессируется в здоровых не имеющих заболевания индивидуумах. В близких вариантах осуществления способы настоящего изобретения детектируют повышенные уровни гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов), которые присутствуют с более высокими уровнями в образцах от индивидуумов, которые имеют злокачественное неопластическое заболевание, такое как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода или рак яичников, по сравнению с нормальными здоровыми индивидуумами.

Один аспект настоящего изобретения представляет собой способ in vitro детектирования гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) в биологическом образце, причем данный способ содержит этапы

a) приведения упомянутого биологического образца в контакт с композицией, содержащей по меньшей мере первое и второе целенаправленные средства или их фрагменты; или

b) приведения упомянутого биологического образца в контакт с первым целенаправленным средством, распознающим пептид кератин 7 и/или его фрагмент(ы); и

c) приведения упомянутого биологического образца в контакт со вторым целенаправленным средством, распознающим пептид кератин 19 и/или его фрагмент(ы); и

d) детектирования гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов), причем этапы b) и c) могут быть выполнены в любом порядке или одновременно.

Например, в одном варианте осуществления биологический образец приводят в контакт с композицией, содержащей по меньшей мере два целенаправленных средства, причем по меньшей мере одно первое целенаправленное средство распознает пептид кератин 7 и/или его фрагмент(ы), и по меньшей мере одно второе целенаправленное средство распознает пептид кератин 19 и/или его фрагмент(ы). Упомянутые первое и второе целенаправленные средства способны связываться специфически и одновременно с гетеротипичным комплексом кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагментом(ами). Специфическое и одновременное связывание упомянутых первого и второго целенаправленных средств с гетеротипичным комплексом кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагментом(ами) после этого детектируют посредством любых способов, хорошо известных специалистам в данной области техники, или, альтернативно, посредством предпочтительных способов, описанных в настоящем документе.

В альтернативном варианте осуществления биологический образец не приводят в контакт с первым и вторым первичными антителами как частями композиций, но первое и второе первичные антитела предоставляют по отдельности, то есть одно первичное антитело предоставляют до другого. Например, в одном варианте осуществления первое первичное антитело, распознающее пептид кератин 7 и/или его фрагмент(ы), приводят в контакт с биологическим образцом. Первое первичное антитело будет связываться с антигенным сайтом, присутствующим на участке K7 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 или его фрагмента(ов), присутствующих в упомянутом биологическом образце. Образуется комплекс между гетеротипичным комплексом кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагментом(ами) и антителом, распознающим пептид кератин 7 и/или его фрагмент(ы). После этого второе первичное антитело, распознающее пептид кератин 19 и/или его фрагмент(ы), предоставляют в биологический образец, содержащий гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмент(ы), связанные с первым первичным антителом, распознающим пептид кератин 7 и/или его фрагмент(ы). Упомянутое второе первичное антитело будет связываться с антигенным сайтом, присутствующим на участке K19 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) и образовывать комплекс K19-антитело-антиген-K7-антитело, то есть тройной комплекс, содержащий гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмент(ы) и два первичных антитела, распознающие пептиды кератин 7 и кератин 19 и/или их фрагмент(ы) соответственно.

В альтернативном варианте осуществления второе первичное антитело, распознающее пептид кератин 19 и/или его фрагмент(ы), предоставляют в биологический образец. Второе первичное антитело будет связываться с антигенным сайтом, присутствующим на участке K19 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) и образовывать комплекс антиген-K19-антитело. После этого первое первичное антитело, распознающее пептид кератин 7 и/или его фрагмент(ы), предоставляют в образец, содержащий гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмент(ы)-K19-антитело. Упомянутое первое первичное антитело будет связываться с антигенным сайтом, присутствующим на участке K7 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов), и образовывать комплекс K7-антитело-антиген-K19-антитело, то есть тройной комплекс, содержащий гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмент(ы) и два первичных антитела, распознающих пептиды кератин 7 и кератин 19 и/или их фрагменты соответственно.

На дополнительном этапе количество детектированных гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) можно сравнивать с положительным и/или отрицательным контролем, причем положительный контроль содержит гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмент(ы), и отрицательный контроль не содержит гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмент(ы). В другом варианте осуществления положительный контроль содержит ткань или физиологические жидкости, полученные от субъектов, у которых диагностировано злокачественное неопластическое заболевание, и отрицательный контроль представляет собой биологический образец, полученный от здоровых субъектов, которые не страдают от злокачественного заболевания.

Необязательно, может быть осуществлена оценка детектированных комплексов антиген-антитело в соответствии со стандартной системой оценки, известной в данной области техники или описанной в настоящем документе.

Образец может, конечно, представлять собой любой биологический образец, который, возможно, может содержать гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмент(ы). Примерами таких биологических образцов являются образцы тканей, образцы физиологических жидкостей или образцы клеток от людей, грызунов, таких как мыши, крысы, морские свинки, или от коз, овец, свиней, верблюдов, собак, кошек и даже кроликов или иные, как раскрыто в настоящем документе. В одном варианте осуществления образец взят от человека. В еще одном варианте осуществления образец представляет собой образец ткани или образец человеческой физиологической жидкости, такой как, например, сыворотка крови, плазма крови, лимфа, экссудаты, кал, желудочная кислота, желудочный сок, лимфа, слизь, перикардиальная жидкость, перитонеальная жидкость, плевральная жидкость, гной, слюна, мокрота, синовиальная жидкость, слезы, пот, вагинальный секрет, рвота и моча. Биологические образцы могут требовать подготовки для работы, и может быть осуществлена предварительная обработка образца в соответствии со способами, известными специалисту в данной области техники.

Способ in vitro детектирования гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) в биологическом образце, представленный в настоящем документе, можно, преимущественно, применять для

i) диагностирования и/или прогнозирования злокачественного неопластического заболевания у субъекта, или

ii) предсказания эффективности лечения злокачественного неопластического заболевания у субъекта, или

iii) оценки результата лечения злокачественного неопластического заболевания у субъекта, или

iv) оценки рецидива злокачественного неопластического заболевания у субъекта, причем субъект представляет собой млекопитающее со злокачественным неопластическим заболеванием или с подозрением на него.

Злокачественные неопластические заболевания могут представлять собой любое из рака желчных протоков (внепеченочных), рака мочевого пузыря, рака молочной железы, карциномы неизвестной локализации (первичной), рака шейки матки, рака толстой кишки, рака эндометрия, рака пищевода, рака желчного пузыря, рака желудка (живота), рака головы и шеи, гепатоцеллюлярного рака (печени), гипофарингеального рака, рака почек, ларингеального рака, рака печени (первичного), рака легкого (немелкоклеточного), рака легкого (мелкоклеточного), мезотелиомы, немелкоклеточного рака легкого, рака яичников, эпителиального рака яичников (поверхностной эпителиально-стромальной опухоли), герминогенной опухоли яичников, опухоли яичников с низким потенциалом злокачественности, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, ректального рака, почечно-клеточной карциномы (рака почек), рака слюнных желез, мелкоклеточного рака легкого, рака тонкого кишечника, рака желудка, рака яичка, рака щитовидной железы, переходно-клеточного рака почечной лоханки и мочеточника, рака матки (эндометриального).

При этом способы, раскрытые в настоящем документе, подходят для применения для

i) диагностирования и/или прогнозирования злокачественного неопластического заболевания у субъекта, или

ii) предсказания эффективности лечения злокачественного неопластического заболевания у субъекта, или

iii) оценки результата лечения злокачественного неопластического заболевания у субъекта, или

iv) оценки рецидива злокачественного неопластического заболевания у субъекта; когда субъект представляет собой млекопитающее, имеющее рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода, гепатоцеллюлярный рак, рак поджелудочной железы, рак желудка и рак яичников, или с подозрением на них. Способы, раскрытые в настоящем документе, особенно подходят для применения, когда субъект представляет собой млекопитающее, имеющее рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода и рак яичников, или с подозрением на них.

Например, один аспект настоящего изобретения представляет собой способ детектирования in vitro злокачественного неопластического заболевания в биологическом образце. Образец может представлять собой любой биологический образец, который может содержать злокачественное неопластическое заболевание, причем упомянутый способ содержит этапы

a) приведения упомянутого биологического образца в контакт с композицией, описанной в настоящем документе; или

b) приведения упомянутого биологического образца в контакт с первым целенаправленным средством, распознающим пептид цитокератин 7 и/или его фрагмент(ы); и

c) приведения упомянутого биологического образца в контакт со вторым целенаправленным средством, распознающим пептид цитокератин 19 и/или его фрагмент(ы); и

d) детектирования упомянутого гетеротипичного комплекса цитокератина 7 с цитокератином 19;

причем этапы b) и c) могут быть выполнены в любом порядке или одновременно.

Специфическое и одновременное связывание упомянутых первого и второго целенаправленных средств с гетеротипичным комплексом кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагментом(ами) можно детектировать посредством любых способов, хорошо известных специалистам в данной области техники, или, альтернативно, посредством предпочтительных способов, описанных в настоящем документе, посредством чего детектируют злокачественное неопластическое заболевание в биологическом образце.

На дополнительном этапе количество детектированных гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) можно сравнивать с положительным и/или отрицательным контролем, причем положительный контроль содержит клетки от субъекта, который страдает от злокачественного неопластического заболевания, и отрицательный контроль содержит клетки от здоровых субъектов, которые не страдают от злокачественного неопластического заболевания.

Необязательно, может быть осуществлена оценка детектированных комплексов антиген-антитело в соответствии со стандартной системой оценки, известной в данной области техники или описанной в настоящем документе.

Следующий аспект представляет собой способ in vitro диагностирования и/или прогнозирования злокачественного неопластического заболевания в биологическом образце, причем данный способ содержит этапы

a) приведения упомянутого биологического образца в контакт с композицией, определенной в настоящем документе; или

b) приведения упомянутого биологического образца в контакт с первым целенаправленным средством, распознающим пептид цитокератин 7 и/или его фрагмент(ы); и

c) приведения упомянутого биологического образца в контакт со вторым целенаправленным средством, распознающим пептид цитокератин 19 и/или его фрагмент(ы); и

d) детектирования гетеротипичного комплекса цитокератина 7 с цитокератином 19;

причем этапы b) и c) могут быть выполнены в любом порядке или одновременно; и

e) сравнения детектированного количества гетеротипичного комплекса цитокератина 7 с цитокератином 19 и/или его фрагмента(ов) с положительным и/или отрицательным контролем, посредством которого осуществляют диагностирование и/или прогнозирование злокачественного неопластического заболевания.

Необязательно, может быть осуществлена оценка детектированных комплексов антиген-антитело в соответствии со стандартной системой оценки, известной в данной области техники или описанной в настоящем документе.

Образец может представлять собой любой образец, который может содержать злокачественное неопластическое заболевание. Другими вариантами осуществления являются те, в которых положительный контроль содержит клетки от субъекта, который страдает от злокачественного неопластического заболевания. Другими вариантами осуществления являются те, в которых отрицательный контроль содержит клетки от здоровых субъектов, которые не страдают от злокачественного неопластического заболевания.

Таким образом, может иметь место способ диагностики или прогноза злокачественного неопластического заболевания посредством детектирования или не детектирования экспрессии гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) в биологическом образце данного субъекта, причем присутствие или отсутствие гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) обеспечивает диагностику или прогноз субъекта как здорового или имеющего злокачественное неопластическое заболевание. В одном варианте осуществления способы детектируют присутствие гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) в образце, причем маркер не экспрессируется в здоровых не имеющих заболевания индивидуумах. В близких вариантах осуществления способы настоящего изобретения детектируют повышенные уровни гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов), которые присутствуют с более высокими уровнями в образцах от индивидуумов, которые имеют злокачественное неопластическое заболевание, такое как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода, гепатоцеллюлярный рак, рак поджелудочной железы, рак желудка и рак яичников, по сравнению с нормальными здоровыми индивидуумами. Это дополнительно визуализировано в примерах, раскрытых в настоящем документе.

В одном варианте осуществления способ диагностики или прогноза злокачественного неопластического заболевания содержит: получение биологического образца от заданного субъекта, приведение упомянутого образца в контакт с композицией, раскрытой в настоящем документе, в условиях специфического связывания, предоставление антителам, связывающимся с пептидом кератином 7 и/или его фрагментом(ами) и пептидом кератином 19 и/или его фрагментом(ами), возможности связываться с гетеротипичным комплексом кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагментом(ами), детектирование антител с помощью способа детектирования, причем способ детектирования создает профиль экспрессии упомянутого гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) в образце, преобразование созданного профиля в машиночитаемую форму и сравнение профиля упомянутого образца с базой данных, содержащей профили сравнимых образцов, характерных для здоровых субъектов, субъектов, имеющих злокачественное неопластическое заболевание. Результат упомянутого сравнения обеспечивает определение того, является ли субъект, от которого был получен биологический образец, здоровым, или он имеет злокачественное неопластическое заболевание, на основании присутствия, отсутствия или относительного количества гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов).

В других вариантах осуществления детектирование гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) можно использовать в комбинации с другим диагностическим средством для диагностики субъекта как здорового или имеющего злокачественное неопластическое заболевание. Например, детектирование гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) можно использовать в комбинации с другими диагностическими средствами, специфическими для детектирования рака легкого, рака мочевого пузыря, рака пищевода и рака яичников, такими как, но без ограничения, оценка биопсии, рентгенография и симптомологическая оценка квалифицированным клиницистом.

Врачи обычно используют рентгенографию и компьютерную томографию грудной клетки для диагностики у пациентов рака легкого. Рак мочевого пузыря диагностируют с помощью цистоскопии, и связанные с мочой маркеры, такие как NMP 22, также могут помочь при диагностике. Рак пищевода обычно диагностируют посредством эзофагогастродуоденоскопии (EGD) или, возможно, глотания бария. Рак яичников диагностируют с помощью гинекологического осмотра, ультразвука и CA125. Диагностика должна быть подтверждена с помощью хирургии.

Если любой из тестов оказывается аномальным, доктора предписывают биопсию для подтверждения своих выводов. Биопсия ткани затем исследуется патологом. Может также использоваться дополнительное тестирование, такое как КТ-сканирование, или комбинированные КТ и ПЭТ-сканирования, или магнитно-резонанснаяя томография (МРТ) и другие способы, известные в клинической практике упомянутых раков.

Композиция настоящего изобретения, содержащая антитела, связывающиеся специфически с гетеротипичным комплексом кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагментом(ами), подходит для использования для детектирования сомнительных поражений, поскольку антитела, связывающиеся с гетеротипичным комплексом кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагментом(ами), будут детектировать только субъектов, имеющих злокачественное неопластическое заболевание, и будут давать отрицательную оценку в сомнительных случаях.

Количество гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) в образце может быть определено с помощью способов, хорошо известных в данной области техники. Подходящие способы для анализа уровней упомянутого белка (или антигена) в биологическом образце включают методы на основе антител. Например, белковая экспрессия упомянутых белков в ткани может быть исследована с помощью классических иммунохимических и/или иммуногистологических способов. В них специфическое распознавание обеспечивается первичным антителом (поликлональным или моноклональным) в композиции в соответствии с настоящим изобретением. Вторичная система детектирования может использовать флуоресцентно, ферментативно или иначе конъюгированные вторичные антитела, как рассмотрено в настоящем документе.

В одном варианте осуществления подлежащие тестированию биологические образцы идентифицируют как образцы, связанные со злокачественным неопластическим заболеванием, по повышенной или пониженной регуляции уровня гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) по сравнению с соответствующими нормальными здоровыми клетками. Под "повышенной регуляцией" авторы понимают, что гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмент(ы) возрастают по меньшей мере на 10% по сравнению с экспрессией данного белка в нормальных (здоровых) клетках. Аналогично, под "пониженной регуляцией" авторы понимают, что количество гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) понижено по меньшей мере на 10% по сравнению с экспрессией гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) в нормальных (здоровых) клетках. Например, уровень гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) может быть повышен по меньшей мере на 20%, 30%, 40%, 50% или даже 100% или более. Средства для измерения уровней антигенов в образцах включены в настоящий документ и также известны в данной области техники.

Детектирование соединения или антитела может быть достигнуто с помощью способов, хорошо известных в области техники клинической визуализации и диагностики, также описанных в настоящем документе и в данной области техники. Конкретный требуемый способ будет зависеть от типа детектируемой метки, прикрепленной к антителам композиции в соответствии с настоящим изобретением.

Следующим аспектом является способ in vitro предсказания результата лечения у субъекта для пациентов со злокачественным неопластическим заболеванием, причем данный способ содержит этапы

a) детектирования экспрессии гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) в биологическом образце, полученном от субъекта,

b) сравнения экспрессии гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) с положительным и/или отрицательным контролем, и посредством этого предсказания результата лечения злокачественного неопластического заболевания у упомянутого субъекта на основании детектированной экспрессии гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов).

Необязательно, может быть осуществлена оценка детектированного гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмент(ы) в соответствии со стандартной системой оценки, известной в данной области техники или описанной в настоящем документе.

Биологический образец может представлять собой любой образец, который может содержать злокачественное неопластическое заболевание, предпочтительно биологический образец от субъекта, имеющего злокачественное неопластическое заболевание.

Следующим аспектом является способ in vitro оценки эффективности лечения злокачественного неопластического заболевания, причем данный способ содержит этапы

a) предоставления биологического образца от субъекта, имеющего злокачественное неопластическое заболевание,

b) детектирования гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов)

c) повторения этапов a) и b) в одной или нескольких временных точках во время лечения упомянутого субъекта от злокачественного неопластического заболевания, причем изменение относительной экспрессии гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) с течением времени указывает на эффективное лечение.

Таким образом, показателем эффективного лечения является относительное изменение уменьшения экспрессии гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) относительно предыдущего по времени образца, проанализированного на этапах повторения способа.

Необязательно, может быть осуществлена оценка детектированных комплексов антиген-антитело в соответствии со стандартной системой оценки, известной в данной области техники или описанной в настоящем документе.

Образец может представлять собой любой образец, который может содержать злокачественное неопластическое заболевание, предпочтительно биологический образец от субъекта, имеющего злокачественное неопластическое заболевание, и данный субъект будет проходить лечение, находится в периоде между лечениями или в настоящее время проходит лечение.

Следующим аспектом является способ in vitro оценки рецидива злокачественного неопластического заболевания, причем данный способ содержит этапы a) предоставления биологического образца от субъекта, имеющего или имевшего ранее злокачественное неопластическое заболевание,

b) детектирования гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов),

c) повторения этапов a) и b) в одной или нескольких временных точках во время лечения упомянутого субъекта от злокачественного неопластического заболевания, причем изменение относительной экспрессии гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) с течением времени указывает на рецидив злокачественного неопластического заболевания.

Таким образом, показателем рецидива является относительное изменение увеличения количеств гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) которые идентифицируют злокачественное неопластическое заболевание, то есть увеличение с течением времени экспрессии гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) относительно предыдущего по времени образца, проанализированного на этапах повторения способа.

Способы, предлагаемые в настоящем документе, могут быть выполнены вручную, или, предпочтительно, на автоматическом устройстве считывания. Таким образом, в одном варианте осуществления способы выполняют вручную. В других вариантах осуществления способы выполняют на автоматическом устройстве считывания.

Применения композиции

Другие аспекты настоящего изобретения включают применения способов и композиции, предлагаемых в настоящем документе.

Следующим аспектом настоящего изобретения является применение способов, предлагаемых в настоящем документе, для детектирования гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов).

Следующим аспектом настоящего изобретения является применение способов, предлагаемых в настоящем документе, для детектирования злокачественного неопластического заболевания, такого как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода или рак яичников.

Следующим аспектом настоящего изобретения является применение способов для диагностики или прогнозирования злокачественного неопластического заболевания, такого как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода или рак яичников.

Следующим аспектом настоящего изобретения является применение способов для предсказания результата лечения злокачественного неопластического заболевания, такого как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода или рак яичников.

Следующим аспектом настоящего изобретения является применение способов для оценки эффективности лечения злокачественного неопластического заболевания, такого как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода или рак яичников.

Следующим аспектом настоящего изобретения является применение способов для оценки рецидива злокачественного неопластического заболевания, такого как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода или рак яичников.

Наборы

Настоящее изобретение предлагает также наборы для методов иммуноанализа, таких как иммуногистохимия. Таким образом, следующий аспект настоящего изобретения предлагает набор для методов иммуноанализа, содержащий

a) композицию настоящего изобретения, предложенную в настоящем документе; или

b) первый контейнер, содержащий первое целенаправленное средство, распознающее пептид кератин 7 и/или его фрагмент(ы), определенное в настоящем документе; и

c) второй контейнер, содержащий второе целенаправленное средство, распознающее пептид кератин 19 и/или его фрагмент, определенное в настоящем документе, и,

d) необязательно, инструкции по выполнению способов, определенных в настоящем документе.

Другие варианты осуществления включают реагенты для визуализации для возможности детектирования композиции, связывающейся специфически с гетеротипичным комплексом кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагментом(ами). Примеры реагентов для визуализации и детектирования известны в данной области техники.

В некоторых вариантах осуществления набора первичное антитело или антитела могут быть непосредственно помечены, как описано в настоящем документе.

Другие варианты осуществления набора включают в себя вторичное или более детектирование, такое как вторичные антитела (например, козьи антикроличьи антитела, кроличьи антимышиные антитела, антигаптеновые антитела) или отличные от антител гаптен-связывающие молекулы (например, авидин или стрептавидин), как описано в настоящем документе. В таких наборах вторичное или более средство детектирования может быть непосредственно помечено с помощью детектируемого соединения. В других примерах вторичное (или более) антитело или связывающее средство будет конъюгировано с гаптеном (таким как биотин, DNP и/или ФИТЦ), который можно детектировать посредством детектируемым образом меченой связывающей когнатный гаптен молекулы (например, стрептавидина (SA) с пероксидазой хрена, SA с щелочной фосфатазой). Некоторые варианты осуществления набора могут включать в себя колориметрические реагенты (например, DAB и/или AEC) в подходящих контейнерах для использования совместно с первичными или вторичными (или более высокого порядка) средствами детектирования (например, антителами или связывающими соединениями), которые помечены с помощью ферментов для проявления таких колориметрических реагентов.

В некоторых вариантах осуществления набор включает в себя образцы положительного или отрицательного контроля, такие как клеточная линия, ткань или физиологическая жидкость, о которых известно, что они экспрессируют или не экспрессируют гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмент(ы). Примеры контрольных образцов включают, но без ограничения, нормальные (например, нераковые) клетки или ткани, злокачественные неопластические образцы от субъекта, о котором известно, что он не имел или имел какой-либо рецидив злокачественного неопластического заболевания после лечения (например, по меньшей мере через 5 лет или по меньшей мере через 10 лет после лечения).

В некоторых вариантах осуществления набор включает в себя инструктирующие материалы, раскрывающие, например, средства применения композиции или дополнительных связывающих соединений или средств детектирования, например антитела, которое специфически связывается с гетеротипичным комплексом кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагментом(ами), или средства применения конкретного реагента. Инструктирующие материалы могут быть записаны, иметь электронную форму (например, компьютерной дискеты или компакт-диска) или могут быть визуальными (например, видеофайлами). Наборы могут также включать в себя дополнительные компоненты для облегчения конкретного применения, для которого разработан данный набор. Таким образом, например, набор может включать в себя буферы и другие реагенты, обычно используемые для осуществления на практике конкретного раскрытого способа. Такие наборы и соответствующее содержимое хорошо известны специалистам в данной области техники.

Набор может дополнительно содержать, в количестве, достаточном для по меньшей мере одного анализа, композицию в соответствии с настоящим изобретением в виде отдельно упакованного реагента.

Также, как правило, включены инструкции по применению упакованного реагента. Такие инструкции, как правило, включают в себя материальное выражение, описывающее концентрации реагентов и/или по меньшей мере один параметр способа анализа, такой как относительные количества подлежащих смешиванию реагента и образца, временные периоды поддержания для смесей реагент/образец, температура, буферные условия и тому подобное.

Следующий аспект настоящего изобретения предлагает набор для детектирования гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) в биологическом образце in vitro, причем данный набор содержит

a) композицию настоящего изобретения, предлагаемую в настоящем документе; или

b) первый контейнер, содержащий первое целенаправленное средство, распознающее пептид кератин 7 и/или его фрагмент(ы), определенное в настоящем документе; и

c) второй контейнер, содержащий второе целенаправленное средство, распознающее пептид кератин 7 и/или его фрагмент(ы), определенное в настоящем документе, и,

d) необязательно, инструкции по выполнению способов, определенных в настоящем документе.

Следующий аспект настоящего изобретения предлагает набор для детектирования злокачественного неопластического заболевания, такого как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода или рак яичников, в биологическом образце in vitro, причем данный набор содержит

a) композицию настоящего изобретения, предлагаемую в настоящем документе; или

b) первый контейнер, содержащий первое целенаправленное средство, распознающее пептид кератин 7 и/или его фрагмент(ы), определенное в настоящем документе; и

c) второй контейнер, содержащий второе целенаправленное средство, распознающее пептид кератин 7 и/или его фрагмент(ы), определенное в настоящем документе, и,

d) необязательно, инструкции по выполнению способов, определенных в настоящем документе.

Следующий аспект настоящего изобретения предлагает набор для диагностирования и/или прогнозирования злокачественного неопластического заболевания, такого как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода или рак яичников, в биологическом образце in vitro, причем данный набор содержит

a) композицию настоящего изобретения, предлагаемую в настоящем документе; или

b) первый контейнер, содержащий первое целенаправленное средство, распознающее пептид кератин 7 и/или его фрагмент(ы), определенное в настоящем документе; и

c) второй контейнер, содержащий второе целенаправленное средство, распознающее пептид кератин 7 и/или его фрагмент(ы), определенное в настоящем документе, и,

d) необязательно, инструкции по выполнению способов, определенных в настоящем документе.

Следующий аспект настоящего изобретения предлагает набор для предсказания результата лечения злокачественного неопластического заболевания у субъекта, такого как, например, пациенты с раком легкого, раком мочевого пузыря, раком пищевода или раком яичников, причем данный набор содержит

a) композицию настоящего изобретения, предлагаемую в настоящем документе; или

b) первый контейнер, содержащий первое целенаправленное средство, распознающее пептид кератин 7 и/или его фрагмент(ы), определенное в настоящем документе; и

c) второй контейнер, содержащий второе целенаправленное средство, распознающее пептид кератин 7 и/или его фрагмент(ы), определенное в настоящем документе, и,

d) необязательно, инструкции по выполнению способов, определенных в настоящем документе.

Следующий аспект настоящего изобретения предлагает набор для оценки эффективности лечения злокачественного неопластического заболевания, такого как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода или рак яичников, причем данный набор содержит

a) композицию настоящего изобретения, предлагаемую в настоящем документе; или

b) первый контейнер, содержащий первое целенаправленное средство, распознающее пептид кератин 7 и/или его фрагмент(ы), определенное в настоящем документе; и

c) второй контейнер, содержащий второе целенаправленное средство, распознающее пептид кератин 7 и/или его фрагмент(ы), определенное в настоящем документе, и,

d) необязательно, инструкции по выполнению способов, определенных в настоящем документе.

Следующий аспект настоящего изобретения предлагает набор для оценки рецидива злокачественного неопластического заболевания, такого как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода или рак яичников, причем данный набор содержит

a) композицию настоящего изобретения, предлагаемую в настоящем документе; или

b) первый контейнер, содержащий первое целенаправленное средство, распознающее пептид кератин 7 и/или его фрагмент(ы), определенное в настоящем документе; и

c) второй контейнер, содержащий второе целенаправленное средство, распознающее пептид кератин 7 и/или его фрагмент(ы), определенное в настоящем документе, и,

d) необязательно, инструкции по выполнению способов, определенных в настоящем документе.

Некоторое варианты осуществления набора могут включать в себя средство для переноски, как например коробку, пакет, сумку, пластмассовый ящик (такой как литая пластмассовая или другая прозрачная упаковка), обертку (такую как заклеенная или заклеивающаяся пластмассовая, бумажная или металлическая обертка) или другой контейнер.

В некоторых примерах компоненты набора заключены в одной упаковочной единице, такой как коробка или другой контейнер, причем эта упаковочная единица может иметь отсеки, в которые можно помещать один или несколько компонентов набора. В других примерах набор включает в себя один или несколько контейнеров, например флаконов, пробирок и тому подобных, которые могут содержать, например, один или несколько подлежащих тестированию биологических образцов.

Варианты осуществления набора включают в себя, например, шприцы, ватные тампоны или латексные перчатки, которые могут подходить для использования при манипулировании, сборе и/или обработке биологического образца. Наборы могут также, необязательно, содержать принадлежности, подходящие для использования при перемещении биологического образца из одного местоположения в другое, включая, например, капельницы, шприцы и тому подобное. Другие варианты осуществления набора могут включать в себя средства утилизации для утилизации использованных или больше не нужных элементов (таких как образцы от субъекта и так далее). Такие средства утилизации могут включать, без ограничения, контейнеры, которые пригодны для помещения утечки от утилизируемых материалов, такие как пластмассовые, металлические или другие непроницаемые пакеты, коробки или контейнеры.

Далее будут описаны неограничивающие примеры, которые воплощают некоторые аспекты настоящего изобретения.

ПРИМЕР 1

Способ анализа для определения гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 в физиологических жидкостях

Целью являлось создание способа анализа, подходящего для клинической оценки.

Моноклональное антитело Ks 7.18, специфическое к кератину 7, конъюгировали с биотином, и моноклональное антитело BM 19.21, специфическое к кератину 19 конъюгировали с пероксидазой в соответствии со способами, описанными в "Recent development in the periodate method of conjugating horseradish peroxidase (HRP) to antibodies" (M Barbara Wilson and Paul K. Nakane, Elsevier/North-Holland Biomedical Press, 1978).

Проводили сэндвич-иммуноферментный анализ для определения присутствия гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 или его фрагментов в физиологических жидкостях, полученных от пациентов, у которых было диагностировано злокачественное неопластическое заболевание, или полученных от пациентов, у которых было диагностировано незлокачественное заболевание, или от индивидуумов, считающихся здоровыми. В данной процедуре 100 мкл раствора антител в БСА-трис-буфере, pH 7,2, содержащего два моноклональных антитела, конъюгированное с биотином Ks 7.18 (1 мкг/мл) и конъюгированное с пероксидазой BM 19.21 (2 мкг/мл), инкубировали вместе с 50 мкл образца сыворотки или калибровочным стандартом, то есть образцами с известными концентрациями гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 или его фрагментов, в течение одного часа, встряхивая при комнатной температуре в покрытых стрептавидином лунках микропланшета. После инкубации лунки промывали шесть раз с помощью 0,05% Tween/ФСБ для удаления избытка антитела. Затем добавляли в лунки 100 мкл буферизованного ТМБ-субстрата (пероксид водорода и 3,3',5,5'-тетраметилбензидин) для проведения ферментативной реакции при комнатной температуре в течение 30 мин. Во время ферментативной реакции в лунке проявлялся синий цвет, если антиген, то есть гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19 или его фрагменты, присутствовал в образце сыворотки. Интенсивность цвета определяли в микропланшетном ридере на 620 нм. Калибровочные кривые строили для каждого анализа посредством откладывания величины поглощения в зависимости от концентрации для каждого калибровочного стандарта. Концентрации гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 или его фрагментов, присутствующих в образцах пациентов, определяли по калибровочной кривой. Способ анализа, описанный в данном примере, далее в данном документе называется "анализ K7/K19". Фигура 2 показывает типичную кривую калибровочного стандарта.

ПРИМЕР 2

Чувствительность анализа K7/K19 к различным формам рака

Всего 398 сывороток от пациентов, страдающих от различных форм рака, исследовали с помощью анализа K7/19, описанного в примере 1. Результаты приведены в таблице 1.

В результате, анализ K7/K19 продемонстрировал наивысшую клиническую чувствительность для рака мочевого пузыря, рака яичников, рака легкого и рака пищевода по сравнению с другими исследованными раками, и образцы от пациентов с раком легкого, раком мочевого пузыря и раком яичников имели особенно высокую концентрацию гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 (или его фрагмента(ов)). С другой стороны, анализ K7/K19 продемонстрировал значения чувствительности вплоть до 10% или менее для плоскоклеточной карциномы шейки матки и молочной железы, а также рака головы и шеи и раков желудочно-кишечного тракта. Значения концентрации гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 (или его фрагмента(ов)) для пациентов с этими последними раками лежали в том же диапазоне, что и в контрольных группах (здоровой и доброкачественной) в таблице 2. Таким образом, анализ K7/K19, как правило, не подходит для данных типов раков из-за низких значений чувствительности. Тем не менее, два пациента с раком молочной железы и один пациент с раком ЖК тракта имели более высокие значения, чем наивысшие значения от образцов в группе доброкачественного заболевания. Эти высокие значения могут указывать на агрессивный рак или плохой прогноз. Другими словами, хотя анализ обычно не подходит для некоторых раков, несколько случаев, когда анализ дает действительно высокие значения, могут иметь клиническое значение.

Таблица 1: Чувствительность при специфичности 96% для различных раков.

Группа раков	Кол-во образцов	Верхняя 95-я перцентиль (ед/мл)	Среднее (ед/мл)	Кол-во положительных при пороге 1,1 ед/мл	Положитель-ные тесты (%)
Легкого	119	381	80	43	361
Яичников	40	133	238	15	375
Пищевода (ПКК)	40	43	130	18	45
Мочевого пузыря	38	470	816	19	50
ЖК тракта	40	19	039	3	75
Шейки матки (ПКК)	40	18	035	4	10
Молочной железы	40	49	065	3	75
Головы, шеи	40	12	007	2	5

ПРИМЕР 3:

Установление референсного диапазона для здоровых индивидуумов.

Сто двенадцать (112) сывороток от по всей видимости здоровых индивидуумов исследовали в соответствии с анализом K7/K19, как описано в примере 1, для установления референсного диапазона для индивидуумов, не имеющих явных признаков злокачественного неопластического заболевания. 95% индивидуумов имели концентрацию гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 или его фрагмента(ов), которая составляла менее чем 1,01 ед/мл, или 95,5% имели значение, составляющее 1,09 ед/мл или менее. Пять (5) из 112 здоровых индивидуумов (то есть 4,5%) имели концентрацию выше 1,1 ед/мл. Средняя концентрация гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 или его фрагмента(ов) для исследованых индивидуумов составила 0,15 ед/мл (смотри таблицу 2).

ПРИМЕР 4:

Установление референсных диапазонов для индивидуумов с доброкачественным (нераковым) неопластическим заболеванием.

Всего 239 сывороток от пациентов, страдающих от заболеваний, о которых известно, что они обычно дают повышенные значения опухолевых маркеров, исследовали в анализе K7/19 в соответствии с примером 1. Результаты показаны в таблице 2 ниже.

В результате значение 95-й перцентили оказалось не больше для доброкачественных заболеваний, чем для здоровых доноров крови. Все группы давали 5% или менее положительных образцов при использовании порогового значения, составляющего 1,09 ед/мл, и 99% образцов из доброкачественной группы имели значения ниже 1,8 ед/мл (не показаны).

Таблица 2: Референстные значения и % положительных образцов для здоровых доноров крови и доброкачественных заболеваний соответственно

Группа раков	Кол-во образцов	Верхняя 95-я перцентиль (ед/мл)	Среднее (ед/мл)	Кол-во положительных при пороге 1,1 ед/мл	Положитель-ные тесты (%)
Здоровые доноры крови	112	1,01	0,15	5	4,5
Доброкачественное заболевание
Легкого	75	1,08	0,36	2	2,7
Гинекологическое	45	1,40	0,16	2	4,4
Печени	39	1,44	0,19	2	5,1
Почек	40	1,52	0,55	2	5
ХСН	40	0,85	0,25	1	2,5
Все доброкачественные	239	1,03	0,31	9	3,8

ПРИМЕР 5A:

Тест на возможную перекрестную реактивность с гетеротипичным комплексом кератина 8 с кератином 19 или кератином 19.

Калибровочный стандарт, содержащий гетеротипичный комплекс кератина 8 с кератином 19, то есть калибровочный стандарт набора CYFRA 21-1 (описан в: Lung cancer-associated keratin 19 fragments: development and biochemical characterisation of the new serum assay Enzymun-Test CYFRA 21-1. Bodenmüller H, Ofenloch-Hähnle B, Lane EB, Dessauer A, Böttger V, Donié F, Int J Biol Markers. 1994 Apr-Jun; 9(2):75-81), имеющий концентрацию кератина 19, составляющую 50 мкг/л, определенную с помощью набора CYFRA 21-1 для ИФА (Fujirebio Diagnostics Inc.) исследовали, как описано в примере 1, вместе с образцом донорской крови, калибровочным стандартом 0 в анализе K7/K19 (который состоит из калибровочной матрицы без кератина 7/19) и положительным контролем, состоящим из сыворотки от пациента с раком яичников.

Таблица 3: результаты для образцов в анализе K7/19

Образец	Поглощение на 620
Калибровочный стандарт 0	0,040
Калибровочный стандарт CYFRA 21-1, 50 мкг/л	0,048
Донор крови	0,060
Рак яичников	0,267

Вывод: Значимый сигнал не был детектирован в анализе, или детектированная концентрация была достаточно низкой для калибровочного стандарта CYFRA 21-1 50 мкг/л, чтобы какая-либо перекрестная реактивность к K19 или гетеротипичному комплексу кератина 8 с кератином 19 могла повлиять на клинические показатели. Это очевидно, поскольку наивысший калибровочный стандарт из набора CYFRA (50 мкг/л) оказался около предела детектирования для анализа K7/19 и в то же время также ниже, чем сыворотки от донора крови, и гораздо ниже, чем положительный контроль, состоящий из сыворотки при раке яичников.

ПРИМЕР 5B

Сравнение между клонами Ks 19.2 и BM 19.21

Анализ был разработан и проведен как в примере 1, но использовали клон Ks 19.2 моноклонального антитела к кератину 19 вместо клона BM 19.21. Данный анализ сравнивали с анализом с клоном BM 19.21 моноклонального антитела к кератину 19. Анализы были применены к таким же образцам. Пятнадцать (15) сывороток от индивидуумов, страдающих от рака (рака легкого, рака пищевода, рака мочевого пузыря или рака яичников) и 13 сывороток пациентов, страдающих от доброкачественного заболевания (печени, почек, легкого или ХСН) исследовали в соответствии с анализом K7/K19, как описано в примере 1.

Результаты:

Имела место высокая корреляция (r=0,97) между анализами, и число положительных образцов составило:

	Положительные, рак	Положительные, доброкачественные
Ks 7.18/BM 19.21	14/15	2/13
Ks 7.18/Ks 19.2	12/15	0/13

Вывод: Отсутствовала значимая разница между двумя анализами. Любое из "подобных BM 19.21" моноклональных антител можно использовать для демонстрации настоящего изобретения.

ПРИМЕР 6

Сравнение с известным маркером кератина 19 CYFRA 21-1

Такие же образцы, как и проанализированные в примерах 3 и 4, исследовали с помощью количественного иммуноферментного анализа (ИФА) CYFRA 21-1 в соответствии с прилагаемыми инструкциями по применению (Fujirebio Diagnostics Inc.). ИФА CYFRA 21-1 обеспечивает количественное определение растворимых фрагментов кератина 19 в человеческой сыворотке, и его часто используют в качестве вспомогательного средства при мониторинге развития заболевания во время курса заболевания и лечения у пациентов с раком легкого. Референсный предел верхней 95-й перцентили, равный 2,42 мкг/л, был рассчитан для ИФА CYFRA 21-1 на основании доброкачественных заболеваний, исключая заболевание почек (n=199). Результаты показаны графически на фигуре 3. Фигура 3 показывает чувствительность при специфичности 95% для доброкачественных заболеваний (за исключением заболевания почек). Пороговые значения составляли 2,42 мкг/л для ИФА CYFRA 21-1 и 1,1 ед/мл для анализа K7/19.

Вывод: Анализ K7/19 показывает превосходную специфичность по сравнению с ИФА CYFRA 21-1. Из фигуры 3 видно, что уровни опухолевого маркера CYFRA 12-1 (кератин 19) повышены у пациентов, страдающих от заболевания почек, а также у пациентов с кардиальной сердечной недостаточностью. Анализ K7/19 также более ограничен в отношении ткани, но имеет сравнимые значения чувствительности при раке яичников, раке пищевода (ПКК) и раке мочевого пузыря. Чувствительность при раке легкого, все гистотипы, ниже, чем в CYFRA 21-1.

ПРИМЕР 7

Оценка анализа K7/K19 для рака яичников и сравнение с известными маркерами.

Образцы сыворотки от женщин, посетивших больницу из-за аномального роста в нижней части живота или тазовой области (тазового образования) подвергали следующим способам анализа: ИФА CA 125, ИФА HE4, ИФА CYFRA 21-1 (все из которых коммерчески доступны от Fujirebio Diagnostics Inc.) и анализу K7/19 в соответствии с примером 1. ИФА CA 125 является специфическим для антигена CA125, а ИФА HE4 является специфическим для антигена HE4. Оба теста часто используют для мониторинга пациентов с гинекологическими злокачественными образованиями, такими как эпителиальный рак яичников. Хорошо охартеризованные образцы описаны в таблице 3 ниже. Оказалось, что в данном наборе образцов 21 пациент имел рак яичников и 60 пациентов имели доброкачественное заболевание. Построили рабочую характеристическую кривую (ROC), сравнивающую профили чувствительности в зависимости от специфичности для четырех методов анализа: ИФА CA 125, ИФА HE4, ИФА CYFRA 21-1 при раке яичников, как видно на фигуре 4.

ИФА CA125 и анализ K7/19 давали наивысшую чувствительность, 52%, при специфичности 95% и наибольшую площадь под кривой, тем самым демонстрируя более высокую способность к различению между раком яичников и доброкачественными тазовыми образованиями по сравнению с ИФА HE4 или ИФА CYFRA 21-1.

Таблица 4. Материал пациентов для исследования рака яичников

Диагноз	Патология	Кол-во образцов
Эпителиальный рак яичников	серозный	14
Эпителиальный рак яичников	эндометриоидный	2
Рак яичников неэпителиальный	гранулезная незрелая тератома	2
Эпителиальный рак яичников	муцинозный	3
		21
Доброкачественный	аденофиброма	2
Доброкачественный	простая киста	6
Доброкачественный	цистоаденома	7
Доброкачественный	дермоидный	3
Доброкачественный	эндометриоз	2
Доброкачественный	эндометриома	3
Доброкачественный	фиброма	2
Доброкачественный	гидросальпинкс	2
Доброкачественный	лейомиомы	1
Доброкачественный	зрелая кистозная тератома	2
Доброкачественный	муцинозная цистоаденома	3
Доброкачественный	миома	2
Доброкачественный	нормальный яичник с геморрагическим фолликулом	1
Доброкачественный	киста яичника	1
Доброкачественный	паратубарная киста	1
Доброкачественный	миома	2
Доброкачественный	серозная киста	4
Доброкачественный	серозная цистоаденофиброма	2
Доброкачественный	серозная цистоаденома	7
Доброкачественный	тератома	2
Доброкачественный	не определен	5
		60

ПРИМЕР 8

Комбинация биомаркеров из примера 7.

Фигура 5 показывает ROC-кривую, сравнивающую комбинацию ИФА CA125 и ИФА HE4 с комбинацией ИФА CA125 и анализа K7/19. Если ИФА CA125 сочетают с анализом K7/19, диагностическая чувствительность повышается по сравнению с тем, когда ИФА CA 125 или анализ K7/19 используют по отдельности.

Чувствительность для комбинации ИФА CA 125 и анализа K7/19 составляет 62% при специфичности 95%, и чувствительность, равная 100%, достигается при специфичности, равной 70%.

Вывод: примеры 7 и 8 демонстрируют, что анализ K7/19 может иметь клиническое применение при ведении пациентов с раком яичников. Благодаря относительно высокой специфичности к раку у анализа K7/19, применение гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 в качестве маркера злокачественного неопластического заболевания, такого как, например, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак пищевода и рак яичников, может увеличивать чувствительность без уменьшения специфичности.

ПРИМЕР 9

Рак легкого: дифференциальная диагностика между НМРЛ и МРЛ

Двадцать девять (29) сывороток от пациентов с мелкоклеточным раком легкого исследовали в соответствии с анализом K7/K19, как описано в примере 1. Двадцать восемь образцов имели концентрации гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 (или его фрагмента(ов)), которые были ниже 1,1 ед/мл. То есть только один из образцов был положительным при анализе K7/19. Образцы также ранее были проанализированы на ProGRP, и 17 из 29 образцов имели концентрации ProGRP выше 200 пг/мл, что демонстрирует, что образцы были взяты от индивидуумов с активным МРЛ.

Анализ K7/K19 способен к различению между немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ) и мелкоклеточным раком легкого (МРЛ). Это в комбинации с высокой специфичностью анализа K7/19 делает анализ K7/K19 пригодным в качестве средства для помощи при дифференциальной диагностике между мелкоклеточным и немелкоклеточным раком легкого. Анализ K7/K19 будет особенно полезным в комбинации с ProGRP, анализом с высокой чувствительностью и специфичностью к мелкоклеточному раку легкого (Tang Jian-hua, et. al. Meta analysis, Diagnostic value of tumours marker pro-gastrin-releasing peptide in patients with small cell lung cancer: a systematic review, Chinese Medical Journal 2011;124(10):1563-1568). CYFRA 21-1 также детектирует МРЛ и поэтому не подходит для использования в таком применении.

Кроме того, можно ожидать, что комбинированное измерение ProGRP и K7/19 может иметь значение при дифференциации между МРЛ и комбинированным МРЛ (к-МРЛ) и между крупноклеточной нейроэндокринной карциномой (КК-НЭО) и МРЛ.

ПРИМЕР 10

Диагностический потенциал анализа K7/K19 при раке легкого.

Данные из примера 3 (112 образцов от здоровых индивидуумов), примера 4 (239 образцов доброкачественных заболеваний) и примера 5 (398 образцов злокачественных неопластических заболеваний) использовали с пороговым значением в четыре раза больше порогового значения, использованного для доброкачественных заболеваний (заболевания почек были исключены в ИФА CYFRA 21-1, чтобы не дискредитировать данный анализ), что дает пороговые значения: 4,4 ед/мл для анализа K7/19 и 9,7 мкг/л для ИФА CYFRA 21-1. С данными пределами количества положительных образцов рака легкого, положительных образцов других раков (то есть не образцов рака легкого) и положительных образцов от пациентов, страдающих от доброкачественных заболеваний, приведены в таблице 5.

Таблица 5. положительные образцы в анализе K7/19 и ИФА CYFRA 21-1 при использовании диагностических пороговых значений

Анализ	Кол-во положительных образцов рака легкого от общего кол-ва 119	Кол-во положительных образцов других раков от общего кол-ва 280	Кол-во положительных с доброкачественными заболеваниями от общего кол-ва 240	ПЦПР рака легкого
K7/19	26 (22%)	22 (8%)	0	54%
CYFRA 21-1	23 (19%)	28 (10%)	1	45%

ПЦПР рака легкого=прогностическая ценность положительного результата для рака легкого (то есть положительные образцы рака легкого/все положительные образцы)

Вывод: Хотя процентная доля образцов, которые являются положительными, достаточно низка, положительные образцы с высокой вероятностью представляют собой рак. В случае анализа K7/K19 имеет место более чем 50% вероятность того, что образец, который имеет значение гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 (или его фрагмента(ов)), которое выше 4,4 ед/мл, представляет собой рак легкого. Для ИФА CYFRA 21-1 данная вероятность ниже, и, кроме того, не может быть исключена возможность почечной недостаточности (положительный доброкачественный образец). В этом предварительном наборе данных гистологические типы рака легкого не были известны.

ПРИМЕР 11

Потенциал анализа K7/K19 при раках желчных путей

Сыворотки от пациентов с распространенным подтвержденным эпителиальным раком в желчных путях или подтвержденным распространенным раком желудка подвергали анализу K7/19, как описано в примере 1.

Злокачественное заболевание	Количество проверенных сывороток	Положительные сыворотки в K7/K19
Карцинома поджелудочной железы	4	3
Рак желчного пузыря	2	2
Первичный печеночно-клеточный рак	1	1
Рак желудка	4	3

Вывод: Анализ K7/K19 может иметь клиническое значение также при ведении пациентов, страдающих от вышеупомянутых эпителиальных раков.

ПРИМЕР 12

Альтернативные способы анализа для определения гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 в сыворотке.

Целью являлось сравнение способов анализа, подходящих для клинической оценки, имеющих значительно отличающиеся местоположения эпитопов для антител по сравнению с анализом Ks7.18/BM 19.21, описанным в примере 1.

Антитело Ks.19.1, специфическое к кератину 19, связывается с аминокислотной последовательностью 311-335 на кератине 19 (Böttger et al. Eur. J. Biochem. 231, 475-485, 1995), а моноклональное антитело RCK 105 является специфическим для кератина 7 (Ramaekers et al. Exp Cell Res. 170(1):235-49, 1987).

Моноклональное антитело RCK105 конъюгировали с биотином, а моноклональное антитело BM Ks 19.1 конъюгировали с пероксидазой в соответствии со способами, описанными в "Recent development in the periodate method of conjugating horseradish peroxidase (HRP) to antibodies" (M Barbara Wilson and Paul K. Nakane, Elsevier/North-Holland Biomedical Press, 1978).

Проводили сэндвич-иммуноферментный анализ, как в примере 1, для определения присутствия гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 или его фрагментов в сыворотке, полученной от пациентов, у которых было диагностировано с злокачественное неопластическое заболевание. Два способа анализа сравнивали для одних и тех же 19 образцов рака.

Имела место высокая корреляция между способами анализа r=0,98, n=19 образцов, и оказалось невозможным продемонстрировать какое-либо значительное клиническое несоответствие, как видно в таблице ниже.

Результаты приведены в таблице ниже.

Комбинация Mab (K7/K19)	Злокачественное заболевание	Положительные/исследованные сыворотки
Ks 7.18/BM 19.21	Рак яичников	7/7
Ks 7.18/BM 19.21	Рак мочевого пузыря	6/6
Ks 7.18/BM 19.21	Рак легкого	6/6
RCK 105/Ks 19.1	Рак яичников	5/7
RCK 105/Ks 19.1	Рак мочевого пузыря	6/6
RCK 105/Ks 19.1	Рак легкого	5/6

Вывод: Альтернативный анализ для кератина 7/19 может быть создан посредством использования антитела к кератину 19, которое связывается с аминокислотами 311-331 на кератине 19, в паре с RCK 105, эпитоп которого расположен на другой части кератина 7, чем у антитела Ks 7.18.

ПРИМЕР 13

Местоположение эпитопа для антитела Ks 7.18 на кератине 7 может быть установлено посредством полного ингибирования антителом Ks 19.1 к кератину 19 в анализе на гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19.

Анализ был выполнен как в примере 1, но с mab Ks 19.1, конъюгированным с пероксидазой, вместо mab BM 19.21. Результаты для двух различных антител к кератину 19 в комбинации с антителом Ks 7.18 для определенных образцов показаны в таблице ниже.

Образец	Ks 7.18/Ks 19.1 (поглощение на 620 нм)	Ks 7.18/BM 19.21 (поглощение на 620 нм)
Калибровочный стандарт 0	0,04	0,04
Сыворотки донорской крови	0,04	0,04
Сыворотки рака 1	0,04	0,32
Сыворотки рака 2	0,04	0,27
Плевра 1 от рака легкого	0,06	3,57
Плевра 2 от рака легкого	0,07	3,47

Вывод:

Поскольку гетеротипичный комплекс между кератином 7 и кератином 19 выровнен параллельным и совмещенным образом по спиральным структурам, любые два антитела, связывающиеся с соответствующими открытыми положениями от спирали 1A до спирали 2B на кератине 7 и кератине 19 соответственно, не будут связываться одновременно, то есть, когда кератин 7 обернут вокруг кератина 19, соответствующие положения не позволяют связываться одновременно по стерическим причинам. Это также иллюстрируется тем, что, например, аминокислоты 271-291 на кератине 19 спариваются в суперспираль с аминокислотами 283-303 на кератине 7.

Эпитоп для BM 19.21 расположен на аминокислотной последовательности 352-368 на кератине 19. Эпитоп для антитела Ks 19.1 на кератине 19 расположен в аминокислотной последовательности 311-335. Соответствующей последовательностью на кератине 7 является 323-347.

Можно сделать вывод, что эпитоп для Ks 7.18 расположен на аминокислотной последовательности 300-350 на кератине 7.

1. Композиция для специфического связывания гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19, содержащая в эффективном количестве по меньшей мере два антитела, антигенсвязывающий фрагмент(ы) или их комбинации, причем по меньшей мере одно первое антитело, антигенсвязывающий фрагмент или их комбинация распознает последовательность, расположенную в пределах аминокислотной последовательности 256-412 или, более предпочтительно, в пределах аминокислотной последовательности 300-380 в участке кератина 7 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов), и по меньшей мере одно второе антитело, антигенсвязывающий фрагмент или их комбинация распознает последовательность, расположенную в пределах аминокислотной последовательности 244-400 или, более предпочтительно, в пределах аминокислотной последовательности 311-375 в участке кератина 19 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов), отличающаяся тем, что упомянутые первое и второе антитела, антигенсвязывающий фрагмент(ы) или их комбинация способны связываться специфически и одновременно с гетеротипичным комплексом кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагментом(ами).

2. Композиция по п. 1, в которой по меньшей мере одно из первого или второго антител представляет собой первичное антитело, антигенсвязывающий фрагмент(ы) или их комбинацию.

3. Композиция по п. 2, в которой первичное антитело представляет собой моноклональное или рекомбинантное антитело, антигенсвязывающий фрагмент(ы) или их комбинацию.

4. Композиция по п. 1, в которой первое антитело выбирают из группы, состоящей из антител C-35, C-62, C-68, C18, C35, KS 7.18, LDS-68, LP1K и RCK105 или антигенсвязывающего фрагмента(ов), вариантов, слитых конструкций, производных или их комбинации, и оно распознает последовательность из по меньшей мере 3, или по меньшей мере 5, или по меньшей мере 7, или 10 или более аминокислот, расположенных на участке кератина 7 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов).

5. Композиция по п. 4, в которой первое антитело представляет собой моноклональное антитело Ks 7.18, производимое клоном Ks 7.18, который доступен от Progen Biotechnik, GmBH, Германия.

6. Композиция по п. 4 в которой первое антитело представляет собой моноклональное антитело RCK105, производимое клоном RCK105, который доступен от Acris Antibodies Gmbh, Германия.

7. Композиция по п. 1, в которой второе антитело выбирают из группы, состоящей из антител A53-B/A2.26, также называемое Ks19.1, BM-19.21, CCD003, CCD004, CKS04, CKS06, Ks19.2, KM 4.62, LP2K, SA 21, SA 45, или антигенсвязывающего фрагмента(ов), вариантов, слитых конструкций, производных или их комбинации, и оно распознает последовательность из по меньшей мере 3, или по меньшей мере 5, или по меньшей мере 7, или 10 или более аминокислот, расположенных на участке кератина 19 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19.

8. Композиция по п. 7, в которой второе антитело представляет собой моноклональное антитело BM 19.21, производимое клоном BM-19.21, который доступен от Roche Diagnostics, и связывается специфически с аминокислотной последовательностью 346-367 кератина 19.

9. Композиция по п. 7, в которой второе антитело представляет собой моноклональное антитело Ks 19.2, производимое клоном Ks 19.2, который доступен от Progen Biotechnik, GmBH, Германия, и связывается специфически с аминокислотной последовательностью 352-368 кератина 19.

10. Композиция по п. 7, в которой второе антитело представляет собой моноклональное антитело Ks19.1, которое связывается с аминокислотной последовательностью 311-335 на кератине 19.

11. Композиция по любому из пп. 1-10, в которой первое антитело представляет собой моноклональное антитело Ks 7.18 и второе антитело представляет собой моноклональное антитело BM-19.21.

12. Композиция по любому из пп. 1-10, в которой первое антитело представляет собой моноклональное антитело Ks 7.18 и второе антитело представляет собой моноклональное антитело Ks 19.2.

13. Композиция по любому из пп. 1-10, в которой первое антитело представляет собой моноклональное антитело RCK105 и второе антитело представляет собой моноклональное антитело Ks 19.1.

14. Способ in vitro детектирования гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) в биологическом образце, причем упомянутый способ содержит этапы:

a) приведения упомянутого биологического образца в контакт с композицией, содержащей по меньшей мере два антитела, антигенсвязывающий фрагмент(ы) или их комбинации, причем по меньшей мере одно первое антитело, антигенсвязывающий фрагмент или их комбинация распознает последовательность, расположенную в пределах аминокислотной последовательности 256-412 или, более предпочтительно, в пределах аминокислотной последовательности 300-380 в участке кератина 7 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов), и по меньшей мере одно второе антитело, антигенсвязывающий фрагмент или их комбинация распознает последовательность, расположенную в пределах аминокислотной последовательности 244-400 или, более предпочтительно, в пределах аминокислотной последовательности 311-375 в участке кератина 19 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов), причем упомянутые первое и второе антитела, антигенсвязывающий фрагмент(ы) или их комбинация способны связываться специфически и одновременно с гетеротипичным комплексом кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагментом(ами); или, в качестве альтернативы,

b) приведения упомянутого биологического образца в контакт с первым антителом, антигенсвязывающим фрагментом или их комбинацией, которые распознают последовательность, расположенную в пределах аминокислотной последовательности 256-412 или, более предпочтительно, в пределах аминокислотной последовательности 300-380 в участке кератина 7 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов); и

c) приведения упомянутого биологического образца в контакт со вторым антителом, антигенсвязывающим фрагментом или их комбинацией, которые распознают последовательность, расположенную в пределах аминокислотной последовательности 244-400 или, более предпочтительно, в пределах аминокислотной последовательности 311-375 в участке кератина 19 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов): и

d) детектирования упомянутого гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) путем сравнения количества гетеротипичного комплекса цитокератина 7 с цитокератином 19 и/или его фрагмента(ов) с положительным и/или отрицательным контролем;

причем этапы b) и c) могут быть выполнены в любом порядке или одновременно.

15. Способ по п. 14, в котором биологический образец представляет собой образец биологической жидкости из группы, состоящей из сыворотки крови, плазмы крови, лимфы, экссудатов, кала, желудочной кислоты, желудочного сока, лимфы, слизи, перикардиальной жидкости, перитонеальной жидкости, плевральной жидкости, гноя, слюны, мокроты, синовиальной жидкости, слез, пота, вагинального секрета, рвоты и мочи.

16. Способ по п. 15, в котором образец биологической жидкости выбирают из группы, состоящей из крови, сыворотки и плазмы.

17. Способ по пп. 14-16, в котором по меньшей мере одно из первого или второго антител представляет собой первичное антитело, антигенсвязывающий фрагмент(ы) или их комбинацию.

18. Способ по п. 17, в котором первичное антитело представляет собой моноклональное или рекомбинантное антитело, антигенсвязывающий фрагмент(ы) или их комбинацию.

19. Способ по любому из пп. 14-16,18, в котором первое антитело выбирают из группы, состоящей из антител C-35, C-62, C-68, C18, C35, KS 7.18, LDS-68, LP1K и RCK105 или антигенсвязывающего фрагмента(ов), вариантов, слитых конструкций, производных или их комбинации, и оно распознает последовательность из по меньшей мере 3, или по меньшей мере 5, или по меньшей мере 7, или 10 или более аминокислот, расположенных на участке кератина 7 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19.

20. Способ по п. 19, в котором первое антитело представляет собой моноклональное антитело Ks 7.18, производимое клоном Ks 7.18, который доступен от Progen Biotechnik, GmBH, Германия.

21. Способ по п. 19, в котором первое антитело представляет собой моноклональное антитело RCK105, производимое клоном RCK105, который доступен от Acris Antibodies Gmbh, Германия.

22. Способ по любому из пп. 14-16,18, 20, 21 в котором второе антитело выбирают из группы, состоящей из антител A53-B/A2.26, также называемое Ks19.1, BM-19.21, CCD003, CCD004, CKS04, CKS06, Ks19.2, KM 4.62, LP2K, SA 21, SA 45, или фрагмента(ов) антител, вариантов, слитых конструкций, производных или их комбинации, и оно распознает последовательность из по меньшей мере 3, или по меньшей мере 5, или по меньшей мере 7, или 10 или более аминокислот, расположенных на участке кератина 19 гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19.

23. Способ по п. 22, в котором второе антитело представляет собой моноклональное антитело BM 19.21, производимое клоном BM-19.21, который доступен от Roche Diagnostics, и связывается специфически с аминокислотной последовательностью 346-367 на кератине 19.

24. Способ по п. 22, в котором второе антитело представляет собой моноклональное антитело Ks19.1, которое связывается с аминокислотной последовательностью 311-335 на кератине 19.

25. Способ по любому из пп. 14-16, 18, 20, 21, 23, 24, в котором первое антитело представляет собой моноклональное антитело Ks 7.18 и второе антитело представляет собой моноклональное антитело BM-19.21.

26. Способ по любому из пп. 14-16, 18, 20, 21, 23, 24, в котором первое антитело представляет собой моноклональное антитело Ks 7.18 и второе антитело представляет собой моноклональное антитело Ks 19.2.

27. Способ по любому из пп. 14-16, 18, 20, 21, 23, 24, в котором первое антитело представляет собой моноклональное антитело RCK105 и второе антитело представляет собой моноклональное антитело Ks 19.1.

28. Способ по любому из пп. 14-27, в котором положительный контроль содержит гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмент(ы).

29. Способ по любому из пп. 14-28, в котором положительный контроль представляет собой биологический образец, полученный от субъекта, который страдает от злокачественного неопластического заболевания.

30. Способ по любому из пп. 14-27, в котором отрицательный контроль не содержит гетеротипичный комплекс кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмент(ы).

31. Способ по любому из пп. 14-27 и 30, в котором отрицательный контроль представляет собой биологический образец, полученный от здоровых субъектов, которые не страдают от злокачественного заболевания.

32. Способ по п. 14-31, дополнительно содержащий этап оценки количества гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов).

33. Способ по любому из пп. 14-32, который выполняют на автоматическом устройстве считывания.

34. Способ по любому из пп. 14-32, в котором детектирование выполняют вручную.

35. Способ in vitro по любому из пп. 14-34 для

i) диагностирования и/или прогнозирования злокачественного неопластического заболевания у субъекта, и/или

ii) предсказания эффективности лечения злокачественного неопластического заболевания у субъекта, и/или

iii) оценки результата лечения злокачественного неопластического заболевания у субъекта, и/или

iv) оценки рецидива злокачественного неопластического заболевания у субъекта,

причем субъект представляет собой млекопитающее со злокачественным неопластическим заболеванием или с подозрением на него.

36. Способ по п. 35, в котором злокачественное неопластическое заболевание выбирают из группы, состоящей из рака желчных протоков (внепеченочных), рака мочевого пузыря, рака молочной железы, карциномы неизвестной локализации (первичной), рака шейки матки, рака толстой кишки, рака эндометрия, рака пищевода, рака желчного пузыря, рака желудка (живота), рака головы и шеи, гепатоцеллюлярного рака (печени), гипофарингеального рака, рака почек, ларингеального рака, рака печени (первичного), рака легкого (немелкоклеточного), рака легкого (мелкоклеточного), мезотелиомы, немелкоклеточного рака легкого, рака яичников, эпителиального рака яичников (поверхностной эпителиально-стромальной опухоли), герминогенной опухоли яичников, опухоли яичников с низким потенциалом злокачественности, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, ректального рака, почечно-клеточной карциномы (рака почек), рака слюнных желез, мелкоклеточного рака легкого, рака тонкого кишечника, рака желудка, рака яичка, рака щитовидной железы, переходно-клеточного рака почечной лоханки и мочеточника, рака матки (эндометриального).

37. Способ по п. 36, в котором злокачественное неопластическое заболевание выбирают из группы, состоящей из рака легкого, рака мочевого пузыря, рака пищевода, гепатоцеллюлярного рака, рака поджелудочной железы, рака яичка и рака яичников.

38. Способ по п. 37, в котором злокачественное неопластическое заболевание выбирают из группы, состоящей из рака легкого, рака мочевого пузыря, рака пищевода и рака яичников.

39. Применение способа in vitro по любому из пп. 14-38 для

i) детектирования гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагментом(ами), или

ii) детектирования злокачественного неопластического заболевания в биологическом образце; или

iii) диагностирования или прогнозирования злокачественного неопластического заболевания у субъекта, или

iv) предсказания результата лечения злокачественного неопластического заболевания у субъекта, или

v) оценки эффективности лечения злокачественного неопластического заболевания у субъекта, или

vi) оценки рецидива злокачественного неопластического заболевания у субъекта.

40. Применение по п. 39, причем злокачественное неопластическое заболевание выбирают из группы, состоящей из рака желчных протоков (внепеченочных), рака мочевого пузыря, рака молочной железы, карциномы неизвестной локализации (первичной), рака шейки матки, рака толстой кишки, рака эндометрия, рака пищевода, рака желчного пузыря, рака желудка (живота), рака головы и шеи, гепатоцеллюлярного рака (печени), гипофарингеального рака, рака почек, ларингеального рака, рака печени (первичного), рака легкого (немелкоклеточного), рака легкого (мелкоклеточного), мезотелиомы, немелкоклеточного рака легкого, рака яичников, эпителиального рака яичников (поверхностной эпителиально-стромальной опухоли), герминогенной опухоли яичников, опухоли яичников с низким потенциалом злокачественности, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, ректального рака, почечно-клеточной карциномы (рака почек), рака слюнных желез, мелкоклеточного рака легкого, рака тонкого кишечника, рака желудка, рака яичка, рака щитовидной железы, переходно-клеточного рака почечной лоханки и мочеточника, рака матки (эндометриального).

41. Применение по п. 40, причем злокачественное неопластическое заболевание выбирают из группы, состоящей из рака легкого, рака мочевого пузыря, рака пищевода, гепатоцеллюлярного рака, рака поджелудочной железы, рака яичка и рака яичников.

42. Применение по п. 41, причем злокачественное неопластическое заболевание выбирают из группы, состоящей из рака легкого, рака мочевого пузыря, рака пищевода и рака яичников.

43. Набор для

i) детектирования гетеротипичного комплекса кератина 7 с кератином 19 и/или его фрагмента(ов) в биологическом образце; или

ii) детектирования злокачественного неопластического заболевания у субъекта; или

iii) диагностирования или прогнозирования злокачественного неопластического заболевания у субъекта; или

iv) предсказания результата лечения злокачественного неопластического заболевания у субъекта; или

v) оценки эффективности лечения злокачественного неопластического заболевания у субъекта; или

vi) оценки рецидива злокачественного неопластического заболевания у субъекта;

причем данный набор содержит:

a) композицию, определенную в любом из пп. 1-13; или, в качестве альтернативы,

b) первый контейнер, содержащий первое целенаправленное средство, распознающее пептид кератин 7 и/или его фрагмент(ы); и

c) второй контейнер, содержащий второе целенаправленное средство, распознающее пептид кератин 19 и/или его фрагмент, и,

d) необязательно, инструкции по выполнению способа, определенного в любом из пп. 14-40.