Рекомбинантный штамм вируса гриппа a/pr8/hk-ns80e85a, экспрессирующий фрагменты антигенов esat-6 и ag85a m.tuberculosis, для получения векторной вакцины против туберкулеза

Представленное изобретение относится к области медицинской биотехнологии. Методом обратной генетики получен рекомбинантный штамм вируса гриппа A/PR8/HK-NS80E85A, который является аттенуированным, холодоадаптированным, температурочувствительным и экспрессирует фрагменты антигенов ESAT6 и Ag85A М.tuberculosis. Рекомбинантный штамм A/PR8/HK-NS80E85A генетически стабилен и обладает высокой репродуктивной активностью в системе развивающихся куриных эмбрионов, а также стимулирует специфический противотуберкулезный CD4+ Т-клеточный ответ Th1 типа с образованием полифункциональных антиген-специфических Т-клеток при интраназальном введении мышам. Данный рекомбинантный штамм A/PR8/HK-NS80E85A депонирован в Государственной коллекции вирусов Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения Российской Федерации под №2863. Изобретение может быть использовано для получения векторной вакцины против туберкулеза. 7 ил., 4 табл., 5 пр.

 

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и касается создания рекомбинантного штамма, предназначенного для получения векторной вакцины против туберкулеза.

Из уровня техники известен рекомбинантный штамм вируса гриппа, экспрессирующий микобактериальный протективный антиген ESAT-6, предназначенные для профилактики и лечения туберкулеза (патент РФ №2318872, C12N 7/01, опубл. 10.03.2008 г.)

К его недостаткам можно отнести клеточную систему культивирования, которая уступает по урожайности системе развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ), использующейся в настоящее время при производстве противогриппозных вакцин из живых холодоадаптированных вирусов гриппа. Кроме того, аттенуация (безопасность) штамма обеспечена единственным признаком - укорачиванием гена NS1, в отличие от полигенного признака аттенуации холодоадаптированных вирусов гриппа.

Также известен рекомбинантный штамм вируса гриппа ТВ-FLU ESAT6 2А AG85A, предназначенный для профилактики туберкулеза (Патент KZ А4 №28077, C12N 7/00, опубл. 15.01.2014 г.), который также обладает вышеперечисленными недостатками.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, являлось получение холодоадаптированного рекомбинантного вируса гриппа, экспрессирующего антигены ESAT-6 и Ag85A M.tuberculosis в составе укороченной рамки считывания NS1 и обладающего высокой репродуктивной активностью в системе РКЭ.

Новизной заявляемого рекомбинантного штамма является его холодоадаптированный фенотип, обеспечивающий дополнительную аттенуацию штамма, и способность штамма активно реплицироваться в системе РКЭ. Данные свойства рекомбинантного штамма были обеспечены за счет использования универсального донора внутренних генов А/Гонконг/1/68/162/35(H3N2) [Патент №2511431 от 25.07.2011], который ориентирован на получение штаммов, обладающих одновременно холодоадаптированным, температурочувствительным и высокорепродуктивным фенотипом.

Рекомбинантный штамм A/PR8/HK-NS80E85A относится к семейству Orthomyxoviridae, род Influenzavirus А, подтип H1N1. Штамм получен в апреле 2016 года методом обратной генетики, с помощью трансфекции клеток Vero набором из 8 плазмид на основе вектора pHW2000. Штамм прошел несколько пассажей в предельных разведениях в системе РКЭ, в результате которых был получен генетически стабильный вариант вируса.

Рекомбинантный штамм A/PR8/HK-NS80E85A является реассортантом с формулой генома 6:2. Состав генома: 2 гена (НА и NA) от вируса A/PR/8/34 (H1N1); 5 генов внутренних белков (РВ2, РВ1, PA, NP и М) от вируса А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2), 1 ген модифицированного неструктурного белка NS1 от вируса А/Гонконг/1/68/162/35(H3N2). Открытая рамка считывания NS1 укорочена до 80 аминокислот, после которых вставлена гетерологичная последовательность, кодирующая антиген ESAT6 (1-73) M.tuberculosis, отделенная глициновыми линкерами, после чего вставлен фрагмент антигена Ag85A (234-295) Рамка считывания NS1 терминирована кассетой из трех стоп-кодонов.

Рекомбинантный штамм A/PR8/HK-NS80E85A антигенно идентичен вирусу гриппа A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1). Рекомбинантный штамм A/PR8/HK-NS80E85A (H1N1) является холодоадаптированным, аттенуированным и экспрессирует фрагменты антигенов ESAT-6 и Ag85A M.tuberculosis.

Рекомбинантный штамм A/PR8/HK-NS80E85A генетически стабилен и обладает высокой репродуктивной активностью в системе развивающихся куриных эмбрионов

Рекомбинантный штамм A/PR8/HK-NS80E85A стимулирует специфический противотуберкулезный CD4+ Т-клеточный ответ Th1 типа с образованием полифункциональных антиген-специфических Т-клеток при интраназальном введении мышам.

Рекомбинантный штамм A/PR8/HK-NS80E85A применим для получения интраназальной векторной вакцины против туберкулеза.

Рекомбинантный штамм A/PR8/HK-NS80E85A депонирован в Государственной коллекции вирусов Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения Российской Федерации под №2863.

Сущность изобретения поясняется чертежами, где

на Фиг. 1 представлена карта плазмиды pHW-HK-NS80-E85A, кодирующей модифицированный ген NS вируса А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2), в который после 80 аминокислотного остатка рамки NS1 были вставлены туберкулезные антигены Ag85A и ESAT-6;

на Фиг. 2 показана генетическая стабильность штамма A/PR8/HK-NS80-E85A. (А) ПЦР фрагменты гетерологичной вставки в гене NS в плазмиде pHW-HK-NS80-E85A (дорожка 1) и в гене NS штамма PR8/HK-NS80-E85A (дорожка 2). (Б) ПЦР фрагменты гетерологичной вставки в гене NS пассажных вариантов Е1-Е4 штамма PR8/HK-NS80-Е85А (дорожки 1-4, соответственно). ММ - маркер молекулярного веса, п.о.;

на Фиг. 3 приведен результат молекулярно-генетического анализа гена NS рекомбинантного вируса гриппа A/PR8/HK-NS80E85A. (А) Положение делении на карте гена NS в плазмиде pHW-HK-NS80-E85A. (Б) Последовательность химерного белка, кодируемого рамкой NS1 A/PR8/HK-NS80E85A. Фрагмент белка NS1 (а.к. 1-80) выделен жирным шрифтом, фрагмент антигена ESAT-6 (а.к. 1-73) подчеркнут, фрагмент антигена Ag85A выделен курсивом, не выделенные а.к. образуют линкер;

на Фиг. 4 показана экспрессия химерных белков при заражении клеток рекомбинантным вирусом A/PR8/HK-NS80-E85. Окрашивание на NS1 (A), ESAT6 (Б) и Ag85A (В). Номера дорожек и вес белков приведены в таблице 3;

на Фиг. 5 показана экспрессия белка NS1(A) и антигена ESAT-6 (Б) при заражении клеток рекомбинантным вирусом A/PR8/HK-NS80-E85A;

на Фиг. 6 проиллюстрирована безопасность штамма A/PR8/HK-NS80-E85A для мышей (А) График динамики веса мышей после заражения соответствующими вирусами. Потерю веса для каждого животного в % относительно исходного (день 0) определяли индивидуально, затем считали среднее по группе; (Б) Вирусная нагрузка в респираторном тракте мышей после заражения соответствующими вирусами. Значение р дано по результатам многофакторного дисперсионного анализа с последующими попарными сравнениями по методу Тьюкки с поправкой на множественность сравнений;

на Фиг. 7 проиллюстрировна индукция Т-клеточного ответа при иммунизации мышей рекомбинантным вирусом A/PR8/HK-NS80-E85A. (А) Относительное содержание цитокин-продуцирующих CD4+-Т-лимфоцитов (%) в спленоцитах мышей после и/н иммунизации рекомбинантным вирусом A/PR8/HK-NS80-E85A и контрольным вирусом без вставки A/PR8/HK-NS80 (контроль). Значение р критерия дано по результатам t-теста Стьюдента (Б) Доля антиген-специфических CD4+ Т-лимфоцитов, продуцирующих IFNγ, IL-2 и TNFα в различных сочетаниях после и/н иммунизации рекомбинантным вирусом A/PR8/HK-NS80-E85A.

Способ получения рекомбинантного вируса гриппа A/PR8/HK-NS80E85A

Рекомбинантный вирус гриппа A/PR8/HK-NS80E85A был получен из 8 плазмид методом обратной генетики в культуре клеток Vero и стабилизирован методом клонирования в предельных разведениях в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). Использованные для трансфекции плазмиды кодировали гены НА и NA штамма A/PR/8/34 (H1N1), гены внутренних и неструктурных белков (РВ2, РВ1, PA, NP, М) вируса А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2), и модифицированный ген NS вируса А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2), в который после 80 аминокислотного остатка рамки NS1 были вставлены туберкулезные антигены Ag85A и ESAT-6 (Фиг. 1).

В результате серии последовательных пассажей в системе РКЭ материала трансфецированных клеток был получен вирус A/PR8/HK-NS80E85A, который характеризовался укороченной длиной гетерологичной вставки по сравнению со вставкой, закодированной в плазмиде pHW-HK-NS80-E85A, по результатам ОТ-ПЦР анализа. Для постановки ОТ-ПЦР анализа вирусную РНК выделяли с использованием набора RNEasy Mini Kit (Qiagen). Амплификацию фрагментов гена NS проводили методом ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с использованием специально подобранных праймеров HK-NS1-226F (5'-ggattctgaaggaagaatccg) и PR8-NS1-523R (5'-tgacatcctcagcagtatgtcc) (Syntol, Россия) и набора реагентов Ambion AgPath-ID One Step RT-PCR (Thermo). Длину ПЦР-фрагментов определяли методом электрофореза в 1% агарозном геле при окрашивании бромистым этидием, документирование проводили с помощью системы ChemiDoc (Bio Rad). Результаты анализа длины вставки в гене NS вируса A/PR8/HK-NS80E85A и в гене NS, закодированном в плазмиде pHW-HK-NS80-Е85А, представлены на Фиг. 2А.

При последующих пассажах вируса A/PR8/HK-NS80E85A в системе РКЭ длина вставки не изменялась (Фиг. 2Б).

Последовательность модифицированного гена NS полученного рекомбинантного вируса гриппа A/PR8/HK-NS80E85A была определена методом секвенирования по Сенджеру. Секвенирование ПЦР-продуктов, полученных методом ОТ-ПЦР, проводили с помощью набора реагентов BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) на капиллярном секвенаторе ABI GA3130 (Applied Biosystems). Полученные последовательности анализировали с использованием программы Vector NTI (Invitrogen).

По результатам анализа было определено местоположение делеции в гене NS (Фиг. 3А). Было показано, что делеция не приводит к сдвигу рамки считывания NS1, и что гетерологичная вставка содержит участок 1-73 антигена ESAT-6 и участок 234-295 антигена Ag85A (Фиг. 3Б).

Ниже приведены примеры, подтверждающие заявленные свойства штамма A/PR8/HK-NS80E85A.

Характеристика полученного штамма

Пример 1. Репродуктивные свойства штамма A/PR8/HK-NS80E85A в системе РКЭ

Штамм вируса гриппа A/PR8/HK-NS80E85A (H1N1) тестировали на инфекционную активность путем заражения РКЭ 10-дневного возраста. Готовили десятикратные падающие разведения вируссодержащей аллантоисной жидкости на фосфатно-солевом буфере с добавлением антибиотиков (100 ед/мл пенициллин, 100 мкг/мл стрептомицин, 5 мкг/мл амфотерицин В). Каждым разведением начиная с 10-8 до 10-2 заражали по 3 РКЭ вводя в аллантоисную полость 0,2 мл разведения. Эмбрионы инкубировали 48 часов при температуре 34°С. Наличие вируса в аллантоисной жидкости определяли в реакции гемагглютинации (РГА) с 0,5% суспензией куриных эритроцитов. Инфекционную активность вируса рассчитывали по методу Рида и Менча.

Репродуктивные свойства штамма представлены в таблице 1. Рекомбинантный вирус A/PR8/HK-NS80E85A показал высокую репродуктивную активность в РКЭ. Гемагглютинирующая активность рекомбинантного вируса A/PR8/HK-NS80E85A составляла от 1:16 до 1:64., инфекционная активность в РКЭ составила 6.94±0,32 lgЭИД50/0,2 мл.

Таблица 1 - Чувствительность к экспериментальной инфекции вируса гриппа A/PR8/HK-NS80E85A (H1N1)

Пример 2. Рекомбинантный вирус A/PR8/HK-NS80E85A является температурочувствительным и холодоадаптированным.

Температурочувствительный (ts-) и холодоадаптированный (са-)фенотипы являются маркерами аттенуации вирусов гриппа, используемых в качестве живых вакцин. Для определения фенотипа рекомбинантного вируса A/PR8/HK-NS80-E85A сравнивали показатели его инфекционной активности в РКЭ при различных температурах инкубации (табл. 2). Штамм A/PR8/HK-NS80-E85A обладает ts и са-фенотипом, так как разница в репродуктивной активности штамма при повышенной и оптимальной температурах (RCT39) составила более 5 lgЭИД50/мл, разница в репродукции при пониженной и оптимальной температурах RCT26 была менее 3 lgЭИД50/мл.

Таблица 2 - Инфекционная активность штамма PR8/HK-NS80-E85A при параллельном титровании в куриных эмбрионах при различных температурах

Пример 3. При заражении клеток MDCK рекомбинантным вирусом A/PR8/HK-NS80E85A происходит экспрессия туберкулезных антигенов ESAT-6 и Ag85A, сшитых с укороченным белком NS1

Экспрессия гетерологичных антигенов рекомбинантным векторным вакцинным штаммом обеспечивает презентацию антигенов иммунной системе и выработку иммунного ответа нужного типа. Экспрессию антигенов с модифицированной рамки считывания NS1 рекомбинантного вируса PR8/HK-NS80E85A оценивали в цитоплазме клеток MDCK через 6 часов после их заражения с помощью иммунофлуоресценции и Вестер-блот анализа.

Электрофорез и Вестерн-блот

Экспрессию модифицированного белка NS1 и антигенов ESAT-6 и Ag85A изучали через 6 часов после заражения клеток MDCK рекомбинантным штаммом A/PR8/HK-NS80-Е85А и контрольным вирусом A/PR8-NS124-ESAT6 (вирус со вставкой только антигена ESAT-6 из рабочей коллекции лаборатории векторных вакцин ФГБУ «НИИ гриппа»).

Культуру клеток MDCK (#FR-58, получены из коллекции IRR) растили в среде DMEM (Биолот) с 5% эмбриональной сывороткой Sus (Биолот) и 1% GlutaMAX (Gibco) при 37°С, 5% CO2. Суточный монослой клеток заражали вирусами в дозе 1-5 ТИД50/клетку и инкубировали при 34°С, 5% CO2 в течение 6 часов.

Для постановки Вестерн-блот клетки (≈1,2*106) снимали 0,25% трипсином-ЭДТА (Sigma) и ресуспендировали в 1X буфере Лэммли с β-меркаптоэтанолом (Bio-Rad). Затем проводили денатурирующий ЭФ образцов в 8-16% градиентном полиакриламидном геле, после чего белки переносили на нитроцеллулозную мембрану (Bio Rad). Мембрану блокировали 3% BSA (Amresco) в фосфатно-солевом буфере (PBS, Amresco), затем окрашивали антителами, разведенными в блокирующем буфере с добавлением 0,1% Tween-20 (Ferak Berlin). Использовали мышиные моноклональные антитела 1Н7 (ФГБУ «НИИ гриппа») против NS1 (1:5000), ab26246 (Abeam) против ESAT-6 (1:5000), и CSB-PA18279A0Rb (Cusabio) против Ag85A (1:500). В качестве вторичных антител были использованы меченые пероксидазой хрена Goat anti-mouse IgG(H+L) (G21040, Invitrogen) в разведении 1:2000 или Goat anti-rabbit IgG(H+L) (G21234, Invitrogen) в разведении 1:1000. Детекцию осуществляли с использованием Opti-4CN Substrate Kit (Bio Rad).

Результаты оценки экспрессии укороченного белка NS1 сшитого с участками антигенов ESAT-6 и Ag85A при заражении клеток MDCK вирусом A/PR8/HK-NS80-E85A иллюстрирует Фиг. 4. Результаты окрашивания окрашивания антителами против NS1 (А), ESAT-6 (Б) и Ag85 (В) лизатов клеток MDCK через 6 часов после заражения соответствующими вирусами. Дорожка 1 - клетки, зараженные вирусом A/PR8/HK-NS80-Е85А, дорожка 2 - клетки, зараженные вирусом A/PR8-NS124-ESAT6, дорожка 3 - незараженные клетки. ММ - маркер молекулярного веса, кДа. Стрелка отмечает лизат клеток, зараженных вирусом A/PR8/HK-NS80-E85A.

Приблизительная молекулярная масса антигенов NS1 и NS1 с гетерологичной вставкой по результатам теоретических расчетов с использованием сервера ExPASy ProtParam [51] приведена в таблице 3. По результатам Вестер-блот анализа видно, что собранный нами штамм экспрессирует туберкулезные антигены ESAT-6 и Ag85A, сшитые с гриппозным белком NS1. Молекулярный вес химерного белка схож с теоретически рассчитанным.

Таблица 3 - Приблизительная молекулярная масса химерных белков на основе NS1 и антигенов M.tuberculosis по результатам теоретических расчетов с использованием сервера ExPASy ProtParam

Иммунофлуоресценция

Экспрессию модифицированного белка NS1 и антигена ESAT-6 изучали через 6 часов после заражения клеток MDCK рекомбинантным штаммом A/PR8/HK-NS80-E85A и контрольными вирусами контрольными вирусами A/PR8/HK 6:2 RG (вирус без вставки) и A/PR8-NS124-ESAT6 (вирус со вставкой только антигена ESAT-6) из рабочей коллекции лаборатории векторных вакцин ФГБУ «НИИ гриппа»).

Для иммунофлуоресцентного окрашивания клетки фиксировали 4% параформальдегидом (Sigma) в PBS, пермеабилизировали 0,2% Triton Х-100 (Amresco) в PBS, блокировали 3% BSA в PBS. Антитела разводили в блокирующем буфере с добавлением 0,1% Tween-20. Окрашивание первичными антителами, проводили в течение ночи при +4°С, вторичными флуоресцентно-мечеными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре. Окрашивание с помощью DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, Serva) проводили, используя раствор 0,1 мкг/мл по 50 мкл на лунку. Использовали моноклональные мышиные антитела 1Н7 против NS1 (1:200) и поликлональные кроличьи антитела ab45073 (Abeam) против ESAT-6 (1:1000), в качестве вторичных антител использовали флуоресцентно меченые Goat Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488 (ab150077, Abeam, 1:1000) и Goat Anti-Mouse pAb to MsIgG Alexa Fluor® 488 (ab150113, Abeam, 1:1000). Клетки фотографировали с использованием Cytell Cell Imaging System (GE Healthcare), с применением цифрового увеличения и увеличения объектива 10Х.

Результаты иммунофлуоресцентного анализа приведены на Фиг. 5. Показано, что клетки, зараженные вирусами, в отличие от незараженньгх клеток, экспрессируют вирусный белок NS1. Также показана экспрессия белка ESAT-6 при заражении вирусами A/PR8-NS124-ESAT6 и A/PR8/HK-NS80-E85A, о чем можно судить по свечению клеток, окрашенных на ESAT-6.

Пример 4. Рекомбинантный вирус A/PR8/HK-NS80E85A (H1N1) аттенуирован для лабораторных мышей

Тестирование рекомбинантного вируса гриппа A/PR8/HK-NS80E85A (H1N1) на безвредность для лабораторных животных проводили на линейных белых мышах BALB/c, самках, массой 18-20 г. В исследованиях использовали здоровых животных, на которых ранее не проводили какие-либо испытания. Вирус вводили интраназально в объеме 30 мкл по 5.0 lgЭИД50/мышь. Для определения безопасности полученного штамма проводили мониторинг массы тела животных в течение 14 дней после заражения (5 шт/группу) и оценивали вирусную нагрузку в респираторном тракте мышей на 3 день после заражения (3 шт/группу). В качестве контрольных вирусов использовали патогенный для мышей штамм A/PR/8/1934 (H1N1) и частично аттенуированный для мышей штамм A/PR8-NS124-ESAT6 (вирусы из коллекции лаборатории векторных вакцин ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России).

В течение 14-дневного периода наблюдения после заражения все животные, зараженные вирусом A/PR8/HK-NS80E85A (H1N1) остались живы и ни у одного из них не были выявлены видимые признаки заболевания. Масса каждого животного в день окончания наблюдения не уменьшилась по сравнению с исходной. Таким образом, штамм A/PR8/HK-NS80-E85A был полностью аттенуирован, при этом мыши, зараженные патогенным штаммом A/PR/8/1934 (H1N1) в той же дозе, погибли к 8 суткам после заражения (Фиг. 6А).

Для определения вирусной нагрузки в респираторном тракте органы гомогенизировали в PBS с использованием Tissue Lyser (Qiagen, США). Вирусную нагрузку определяли по результатам титрования суспензии органов в культуре клеток MDCK в присутствии ТРСК-трипсина (2,5 мкг/мл) и амфотерицина В (2,5 мкг/мл). Зараженные клетки инкубировали при 34°С, 5% СО2 в течение 5 суток, результат оценивали в реакции гемагглютинации с 0,5% куриными эритроцитами, титр подсчитывали по методу Рида и Менча.

Титр неаттенуированного штамма A/PR/8/1934 (H1N1) в легких мышей составлял 5,42±0,38 lgТИД50/мл, что существенно превышало (р<0.001) вирусную нагрузку в легких мышей, зараженных частично аттенуированным вирусом A/PR8-NS124-ESAT6 (2,83±0,14 lgТИД50/мл) и полностью аттенуированным штаммом A/PR8/HK-NS80-E85A (1,67±0,29 lgТИД50/мл). При этом, штамм A/PR8/HK-NS80-E85A лучше размножался в носовых ходах мышей (2,58±0,14 lgТИД50/мл), чем в легких (р<0.05), что согласуется с его са-фенотипом (Фиг. 6Б).

Пример 5. Рекомбинантный вирус A/PR8/HK-NS80E85A стимулирует противотуберкулезный Т-клеточный ответ при иммунизации лабораторных мышей

Тестирование штамма вируса гриппа A/PR8/HK-NS80E85A (H1N1) на иммуногенность для лабораторных животных проводили на линейных черных мышах C57/black (5 мышей/группу). В исследованиях использовали здоровых животных, на которых ранее не проводили какие-либо испытания. Иммунизацию проводили интраназально по 5,0 lgЭИД50/мышь по 30 мкл/мышь вируса. Через 10 суток после иммунизации у мышей выделяли спленоциты. Гомогенизацию селезенки проводили при помощи пластиковых пестиков для ручной гомогенизации в микропробирках (Sarstedt, Германия). Гомогенаты органов фильтровали при помощи шприцевых фильтров 70 мкм в PBS с 2% FCS (Gibco, США). Отбирали 106 клеток в 100 мкл и стимулировали очищенным белком Ag85A (Novus Biologicals) в конечной концентрации 5 мкг/мл в присутствии костимулирующих антител к рецептору CD28 (Biolegend). После 12 часовой инкубации при 37°С, 5% CO2 в лунки добавляли брефельдин A (BD Biosciences). Для детекции живых клеток проводили окрашивание с помощью Zombie Red Fixable Viability kit (BioLegend). Для выделения популяции иммунных клеток использовали TruStain fcx CD 16/32 (BioLegend). Популяции лимфоцитов дифференцировали, используя антитела к поверхностным маркерам CD8-PE/Cy7, CD4-PerCp/Cy5.5 (BD Pharmingen), CD45-APC/Cy7 (BD Biosciences, США). Затем клетки фиксировали и пермеабелизировали с использованием набора реагентов Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permebilization kit with BD Goldgi Stop (BD Biosciences), после чего окрашивали на внутриклеточные цитокины с использованием антител IFNγ-FITS, TNFα-Brilliant Violet 421, IL2-PE (BD Pharmingen). Результаты окрашивания детектировали на проточном цитометре BD FACSCanto II (BD Biosciences) и анализировали в программе Kaluza Analysis 1.05а.

Для оценки способности гриппозного вектора A/PR8/HK-NS80-E85A индуцировать противотуберкулезный Т-клеточный иммунный ответ была определена внутриклеточная продукция цитокинов CD4+ Т-клетками иммунизированных мышей. В качестве контрольной группы использовали мышей, иммунизированных «пустым» вектором A/PR8/HK-NS80 (вирус из рабочей коллекции лаборатории векторных вакцин ФГБУ «НИИ гриппа»).

После однократной иммунизации рекомбинантным штаммом A/PR8/HK-NS80-Е85А доля цитокин-продуцирующих CD4+ Т-лимфоцитов в спленоцитах мышей при специфической стимуляции была достоверно выше, чем в контрольной группе животных (3.16±1.25 против 1.43±0.40; р=0.016, t-критерий Стьюдента, рис. 5А) (Фиг. 7А; табл. 4).

Далее была изучена функциональная активность CD4+ Т-клеток, способных под действием специфической стимуляции синтезировать IFN-γ, TNF-α и IL-2 или различные комбинации данных цитокинов. Среди популяции антиген-специфических CD4+ Т-клеток селезенки преобладали Т-клетки, секретирующие один цитокин (IFN-γ (36.85% от общего числа цитокин-продуцирующих CD4+-T-лимфоцитов), TNF-α (31.77%) или IL-2 (4.12%)). В то же время были обнаружены и полифункциональные антиген-специфические Т-клетки, продуцирующие два цитокина (IFN-γ и IL-2 (2.77%); IFN-γ и TNF-α (2.06%); TNF-α и IL-2 (16.32%)), а также минорная популяция тройных продуцентов, секретирующих IFN-γ, TNF-α и IL-2 (6.10%)) (Фиг. 7Б).

Таким образом, была продемонстрирована способность гриппозного вектора A/PR8/HK-NS80-E85A индуцировать специфический противотуберкулезный CD4+ Т-клеточный ответ у иммунизированных мышей линии C57/black при однократном интраназальном введении. Кроме того, обнаруженные полифункциональные Т-лимфоциты, благодаря более выраженной эффекторной функции по сравнению с Т-клетками, секретирующими только один цитокин, могут рассматриваться в качестве потенциального иммунологического маркера протективного иммунитета при туберкулезе.

Таблица 4 - Процентное содержание цитокин-продуцирующих CD4+-T-лимфоцитов

Рекомбинантный штамм вируса гриппа A/PR8/HK-NS80E85A, семейство Orthomyxoviridae, род Influenzavirus А, подтип H1N1, кодирующий фрагменты антигенов ESAT-6 (1-73) и Ag85A (234-295) M. tuberculosis в составе открытой рамки считывания укороченного белка NS1 (1-80), депонированный в Государственной коллекции вирусов под №2863, предназначенный для получения интраназальной векторной вакцины против туберкулеза.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии и касается рекомбинантного онколитического вируса осповакцины Л-ИВП_oncoM депонированного в государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и реккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером V-797.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается рекомбинантного онколитического вируса осповакцины Л-ИВП_oncoB депонированного в государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и реккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером V-796.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается рекомбинантного онколитического вируса осповакцины Л-ИВП_oncoQ, депонированного в государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и реккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером V-798.

Представленное изобретение относится к способу получения вируса герпеса, включающему культивирование клетки, инфицированной указанным вирусом герпеса, в культуре клеток, которая содержит ауринтрикарбоновую кислоту и эмбриональную телячью сыворотку.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно генной инженерии. Предложен штамм дрожжей Hansenula polymorpha - продуцент рекомбинантного белка L1 вируса папилломы человека (HPV) типа 11.

Настоящее изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Предложен штамм «ВН-3» вируса гепатита утят типа I рода Avihepatovirus семейства Picornaviridae, выделенный от клинически больных утят, адаптированный к утиным эмбрионам и культуре клеток и аттенуированный в отношении утят.

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой способ борьбы с личинками колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata), включающий использование инсектицидов на основе нуклеиновой кислоты, избирательно действующих на личинок насекомых определенного вида, где предварительно проводят листовую обработку картофеля препаратом-инсектицидом «АКТАРА» на основе действующего вещества тиаметоксама, после чего на третий день проводят контактную обработку пульверизатором личинок насекомого водным раствором короткого 17 нуклеотидов длиной антисмыслового фрагмента ДНК гена СР450 (цитохром Р450-зависимая монооксигеназа) колорадского жука с последовательностью 5'-TGAGAATACTAACGAGA-3' в концентрации 150 пмоль/мкл таким образом, чтобы на личинку I-II возраста попало не менее 1 мкл раствора.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и касается нового штамма вируса африканской чумы свиней African swine fever virus генотипа 2 серотипа VIII сем. Asfarviridae, рода Asfivirus, депонированного в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером штамм вируса африканской чумы свиней АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1 (Д).

Изобретение относится к области биотехнологии и производству противоящурных вакцин, а именно к способу определения титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для производства вакцины с применением метода ОТ-ПЦР-РВ и разработанной регрессионной моделью зависимости титра инфекционной активности вируса ящура от величины порогового цикла амплификации.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены способы доставки защитной изоформы ApoE и кодирующей ее нуклеиновой кислоты в центральную нервную систему млекопитающего.

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, и касается воздействия на микобактерии туберкулеза. Для этого в эксперименте in vitro используют полученную электрохимическим путем серебряную воду на негазированной минеральной воде «Красный ключ» с ионной концентрацией серебра 15%.

Изобретение относится к новым производным нитроимидазола формулы (I), а также к фармацевтической композиции на их основе и применению для изготовления лекарственного препарата для лечения заболеваний, вызываемых Mycobacterium tuberculosis.

Изобретение относится к соединениям, а именно к пираноиндолам общей формулы 1, где R1 означает Н, HO, CH3, C2H5, C3H7, AcO, Cl, CF3, CF3O, NO2, MeO; R2 означает Н, CH3, C2H5, C3H7, Ac, CH2Ph, CH2Ph-4-CN, CH2Ph-4-OMe; R3 означает Н, NHCH3, NHC3H5; R4 означает CN, CONH2, COOC2H5, NHCOPh, за исключением соединений 2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбонитрил, 2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-этоксикарбонил и 2-оксо-2,5-дигидропирано[3,2-b]индол-3-карбамид.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для получения лекарственного средства из растительного сырья, обладающего противотуберкулезным действием.

Настоящее изобретение относится к однослойной таблетке для применения при лечении туберкулеза. Таблетка содержит смесь гранул, содержащих изониазид, пиразинамид, этамбутол или их фармацевтически приемлемую соль и связующее средство для грануляции, рифампицина в порошкообразной форме, экстрагранулярных вспомогательных средств в количестве от 10 до 17 вес.%.

Изобретение относится к пригодным в медицине соединениям, имеющим структуру: .Предложены новые аналоги рифамицина, эффективные для лечения устойчивых к лекарствам бактерий, в особенности микобактерий, а также способ получения таких соединений, фармацевтическая композиция на их основе и способ лечения бактериальных инфекций с их использованием.

Изобретение относится к соединению формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, гдеR1 выбран из Н, F, Cl, Br, I, R101 и где R101 выбран из следующей группы, состоящей из фенила, пиридила, тиенила, фурила, тиазолила, изотиазолила, C1-6 алкила, N,N-ди(C1-6 алкил)амино-(СН2)0-3, С3-4 циклоалкила, где D101 выбран из СН2, О, S, NH и N(СН3); D102 представляет собой СН2 или одинарную связь; и T101 представляет собой СН или N; и R101 необязательно замещен 1, 2 или 3 F, Cl, Br, I, CN, СН3, CF3, СН3О или CF3O; m равно 0, 1 или 2; R2 выбран из Н, галогена или следующей группы, необязательно замещенной 1, 2 или 3 R01: C1-10 алкила и С1-10 алкокси; R3 выбран из следующей группы, необязательно замещенной 1, 2 или 3 R01: 6-12-членного арила, 6-12-членного арилалкилена и С3-6 циклоалкила; R4 представляет собой C1-8 алкил, необязательно замещенный 1 R01; R5 и R6 каждый независимо представляет собой Н или С1-8 алкил, где C1-8 алкил необязательно замещен 1 F, Cl, Br, I, CN, ОН или CF3; необязательно R5 и R6 вместе присоединены к одному атому с образованием 3-6-членного кольца, необязательно замещенного -ОН; T1 и Т2 каждый независимо выбран из СН и N; X выбран из СН, -С(С6-12 арил)-, -С(галоген)- и -С(С1-10 алкокси)-; Y выбран из СН; R01 выбран из F, Cl, Br, I, CN, ОН, CF3, CF3O, C1-8 алкокси и С1-8 алкила; «гетеро» представляет собой гетероатом или группу гетероатомов, выбранную из -NH-, -О-, -S- или N; где число гетероатомов или группы гетероатомов каждое независимо выбрано из 0, 1, 2 или 3, которые применяют при лечении заболеваний, вызванных микобактериями, такими как Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium avium и Mycobacterium marinum.

Изобретение относится к области органической химии, а именно 5-фтор-2-(4-этоксикарбонилпиперазин-1-ил)-1,3-бензотиазин-4-ону формулы (4), обладающему противотуберкулезной активностью, в том числе по отношению к штаммам микобактерий с множественной лекарственной устойчивостью.

Изобретение относится к производным Технический результат: получены новые соединения – производные фенотиазина, которые могут быть использованы для лечения микробных инфекций, таких как туберкулез.

Изобретение относится к производным этил 2-[{(пиперазин-1-ил)карбонил}амино]-5,6-дигидро-4Н-циклопента[b]тиофенил-3-карбоксилата общей формулы: где R1 - (2R)-3-этоксипропан-2-ол или этоксикарбонил или гидроксиэтил или (2S)-2-бутан-1-ол, R2 - Н или метил, которые селективно ингибируюют глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу микобактерий, при этом не оказывая влияния на активность гомологичных ферментов человека и животных, а также подавляют рост возбудителя туберкулеза Mycobacterium tuberculosis штамм H37Rv.

Представленное изобретение относится к способу получения аттенуированных штаммов вируса гриппа А-кандидатов в живые гриппозные вакцины. Способ заключается в том, что в консервативный участок СООН - домена РА-гена эпидемического вирулентного штамма A/WSN/33 вируса гриппа А включают аттенуирующую аминокислотную замену F658A одновременно с включением сайт-специфических мутаций в РВ1-ген и РВ2-ген, при этом в РВ1-ген штамма A/WSN/33 включают комплекс ts-мутаций из генома ХА штамма-донора аттенуации А/Энн Арбор/6/60 (H2N2) : K391Е, E581G, E457D или одну ts-мутацию I147Т из генома ХА штамма-донора аттенуации А/Краснодар/101/35/59 (H2N2), а в качестве сайт-специфических мутаций, включаемых в РВ2-ген штамма A/WSN/33, используют ts-мутацию V290L из генома ХА штамма-донора аттенуации А/Краснодар/101/35/59 (H2N2).

Представленное изобретение относится к области медицинской биотехнологии. Методом обратной генетики получен рекомбинантный штамм вируса гриппа APR8HK-NS80E85A, который является аттенуированным, холодоадаптированным, температурочувствительным и экспрессирует фрагменты антигенов ESAT6 и Ag85A М.tuberculosis. Рекомбинантный штамм APR8HK-NS80E85A генетически стабилен и обладает высокой репродуктивной активностью в системе развивающихся куриных эмбрионов, а также стимулирует специфический противотуберкулезный CD4+ Т-клеточный ответ Th1 типа с образованием полифункциональных антиген-специфических Т-клеток при интраназальном введении мышам. Данный рекомбинантный штамм APR8HK-NS80E85A депонирован в Государственной коллекции вирусов Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения Российской Федерации под №2863. Изобретение может быть использовано для получения векторной вакцины против туберкулеза. 7 ил., 4 табл., 5 пр.

Наверх