Способ повышения эффективности ризогенеза растений in vitro с помощью кофеина

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ повышения эффективности ризогенеза растений in vitro, заключающийся в том, что экспланты базальной частью высаживают на питательную среду укоренения по прописи Мурасиге-Скуга, содержащую 1 мг/л β-индолилмасляной кислоты, с добавлением 1-50 мг/л кофеина. Изобретение позволяет повысить эффективность ризогенеза in vitro микрочеренков растений, культивируемых на питательных средах. 9 ил., 3 пр.

 

Использование: Биотехнология и сельское хозяйство

Сущность изобретения: стерильные микропобеги растений базальной частью помещают на питательную среду укоренения по прописи Мурасиге-Скуга [1], содержащую 1 мг/л β-индолилмасляной кислоты, с добавлением 1-50 мг/л кофеина. Заявляемое изобретение относится к области биотехнологии растений и может быть использовано для укоренения стерильных микрочеренков в культуре in vitro.

Получение корнесобственных плодовых и ягодных растений путем вегетативного размножения черенками является важным компонентом в интенсификации сельскохозяйственного производства. Для решения этой задачи эффективным подходом служит применение метода клонального микроразмножения, который позволяет получать большие объемы генетически однородного высококачественного посадочного материала в сжатые сроки.

Однако не все виды растений одинаково успешно размножаются и укореняются в условиях культуры in vitro. В зависимости от генотипа могут проявляться сложности на этапе размножения и укоренения растений на питательных средах. Это влечет за собой необходимость модификации отдельных элементов методики, а так же привлечения различных стимулирующих факторов для прохождения критических этапов культивирования.

В связи с этим, при культивировании растений in vitro используют различные факторы физической и химической природы, стимулирующие ризогенез. В качестве физических факторов применяют лазерное излучение [2], ультразвук [3], инкубацию в полной темноте в течение 5-6 суток [4].

Для активизации индукции корневых зачатков химическими способами, в основном, используют ауксины и фенольные соединения. Фенольные соединения в зависимости от химического строения, рН, концентрации и других факторов действуют как ингибиторы или как стимуляторы ризогенеза. Свои регуляторные функции эти соединения осуществляют через ферментную систему окисления ИУК [5]. К таким веществам относятся фенолкарбоновые кислоты. Для стимуляции морфогенетических процессов наиболее часто используют салициловую кислоту [6, 7, 8], галловую, сиреневую, n-кумаровую, феруловую, хлорогеновую кислоты [9, 10, 11].

Наиболее близким по своей сущности к заявленному изобретению является способ укоренения микрочеренков in vitro, с добавлением в питательную среду в качестве индуктора ризогенеза салициловой кислоты

Недостатком прототипа является то, что салициловая кислота используется в широком спектре концентраций 0,7-41,4 мг/л и требует тщательного их подбора для конкретного вида растения. В случае не удачного выбора концентрации или экспозиции воздействия салициловая кислота оказывает негативное влияние на микрочеренки [6]. Процесс образования корней значительно замедляется, в некоторых вариантах уменьшается число корней на укорененное растение и в ряде случаев их длина. Итоговая частота укоренения через 2 месяца культивирования практически одинакова во всех вариантах и незначительно превышает или находится в пределах контроля [6].

Целью изобретения является повышение эффективности ризогенеза генетически однородных микропобегов растений, полученных в культуре in vitro.

Цель достигается за счет того, что стерильные микропобеги высаживают на питательную среду укоренения на основе среды Мурасиге-Скуга [1], содержащую 1 мг/л β-индолилмасляной кислоты, с добавлением 1-50 мг/л кофеина.

Кофеин - соединение из группы метилксантинов. Это алкалоид, содержащийся в листьях чая (Thea sinensis), в семенах кофе (Coffea arabicd), в семенах какао (Theobroma cacao), в семенах кола (Cola acuminata) и в других растениях. Человеком используется как психостимулятор, поскольку сочетает психостимулирующие и аналептические свойства. Нет данных о применении данного соединения в качестве регулятора роста растений.

Пример 1.

Микропобеги ежевики сорта Логан Торнлесс длиной 1,5-2,5 см, полученные на питательной среде размножения из апикальных и латеральных почек материнского растения, помещали на среду укоренения по прописи Мурасиге-Скуга [1], с уменьшенным вдвое количеством макросолей и хелата железа, содержащую сахарозу - 20 г/л, пиридоксин HCl - 0,5 мг/л, никотиновую кислоту - 0,5 мг/л, тиамин HCl - 0,4, инозитол - 50 мг/л и 1 мг/л β-индолилмасляной кислоты (ИМК) с добавлением 1-5000 мг/л кофеина. рН питательной среды - 5,7-5,8. Среды стерилизовали автоклавированием (1 атм., 20 мин.). Витамины, индолилмасляную кислоту и кофеин стерилизовали фильтрованием и добавляли после автоклавирования ("Millipore" 0,22 μт, France).

Контролем служила среда без кофеина.

Субкультивирование побегов осуществляли в широкогорлых конических колбах емкостью 250 мл со 100 мл среды. Колбы закрывали тонкой алюминиевой фольгой и герметизировали липкой лентой.

Культивирование растений осуществляли в специально оборудованной культуральной комнате при 16-часовом световом дне с освещенностью 2400 люкс (люминесцентные лампы Osram L36W Cool Daylight), температуре воздуха 24±2°С и влажности воздуха 55-60%.

Эффективность обработки оценивали через месяц культивирования по числу укоренившихся микропобегов и количеству образовавшихся корней на одно укорененное микрорастение.

Применение кофеина на этапе ризогенеза позволило существенно повысить эффективность укоренения ежевики Логан Торнлесс (фиг. 1). Частота укоренения микрочеренков ежевики на среде, содержащей 1-50 мг/л кофеина, возросла от 46,7% при концентрации кофеина в питательной среде 1 мг/л до 82,6% при концентрации кофеина 10 мг/л по сравнению с 40,3% в контроле.

Среднее число корней на укорененный микрочеренок возросло от 4,2 шт. /побег при концентрации кофеина 1 мг/л до 6,2 шт. /побег при концентрации кофеина 10 мг/л по сравнению с 3,7 шт. в контроле (фиг. 2). Даже минимальная концентрация кофеина в питательной среде (1 мг/л) производила стимулирующий эффект, корни начинали образовываться быстрее, корневые зачатки закладывались дружно и одновременно (фиг. 3).

Наиболее эффективным определен диапазон концентраций кофеина от 5 до 50 мг/л. Дальнейшее повышение концентрации кофеина до 100 мг/л не способствовало повышению эффективности ризогенеза ежевики Логан Торнлесс, показатели упали до уровня контроля или несколько ниже (фиг. 1, 2, 3).

Концентрации кофеина в питательной среде свыше 100 мг/л оказывали негативное действие на растительные ткани, замедляя и останавливая процесс образования корней, останавливая рост побегов и вызывая пожелтения листьев.

Таким образом, при культивировании растительных тканей применение кофеина в концентрации выше 100 мг/л не рекомендуется

Пример 2.

Микропобеги ежемалинового гибрида Бойзенберри, достигшие на среде размножения длины 1,5-2,5 см, срезали и поместили на питательные среды и в те же условия, которые описаны в примере 1. Опытные среды содержали от 1 до 5000 мг/л кофеина и 1 мг/л ИМК. Контроль - среда MSУК с ИМК 1 мг/л без кофеина.

Эффективность обработки оценивали через месяц культивирования по числу укоренившихся микропобегов и количеству образовавшихся корней на одно укорененное микрорастение.

Как следует из полученных результатов, рабочими концентрациями кофеина для этой культуры были концентрации от 1 до 100 мг/л.

Применение кофеина на этапе ризогенеза позволило в 1,6-1,7 раза повысить эффективность укоренения ежемалинового гибрида Бойзенберри, частота укоренения возросла до 91,7% при концентрации кофеина 10 мг/л и до 93,7% при концентрации кофеина 50 мг/л по сравнению с 56,7% в контроле (фиг. 4).

Среднее число корней на укорененный микрочеренок возросло от 4,9 шт. в контроле до 7,2 и 7,8 шт. при концентрации кофеина 10 и 50 мг/л соответственно (фиг. 5).

На контрольной среде без кофеина лишь отдельные микрочеренки укоренились быстро и образовали значительное число корней на укорененное микрорастение, тогда как на средах с кофеином образование корней происходило одновременно в массовом порядке (фиг. 6). Это вело к сокращению продолжительности этапа ризогенеза и повышению экономической эффективности метода клонального микроразмножения.

Концентрации кофеина свыше 500 мг/л были губительны для растительных тканей, вызывая некрозы оснований побегов, погруженных в питательную среду и пожелтение листьев с последующим частичным некрозом тканей побегов.

Пример 3.

Микропобеги клонового подвоя яблони 54-545, достигшие на среде размножения длины 1,5-2,5 см, срезали и поместили на питательную среду укоренения, приготовленную по прописи Мурасиге-Скуга и в те же условия, которые описаны в примере 1. Опытные среды содержали от 1 до 5000 мг/л кофеина и 1 мг/л ИМК. Контроль - среда MSУК с ИМК 1 мг/л без кофеина.

Применение кофеина на этапе ризогенеза клонового подвоя яблони 54-118 производило положительный эффект. Частота укоренения микрочеренков возросла почти в 2 раза (фиг. 7), более чем в два раза увеличилось число корней на укорененный микрочеренок (фиг. 8).

Наиболее эффективны были концентрации кофеина 5 и 10 мг/л. Содержания кофеина в питательной среде от 1 до 10 мг/л было достаточно, чтобы у полученных микрорастений сформировалась хорошо развитая корневая система (фиг. 9). Развитая корневая система чрезвычайно важна для этапа адаптации, поскольку такие растения хорошо переносят высадку в грунт и хорошо развиваются в дальнейшем.

Литература

1. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - Vol. 5, №95. - P. 473-497.

2. Будаговский A.B. Теория и практика лазерной обработки растений монография / А.В. Будаговский. - Мичуринск, 2008. - 548 с.

3. Плаксина Т.В. Влияние ультразвукового облучения на корнеобразование у земляники и вишни / Т.В. Плаксина, О.В. Мочалова, А.Л. Верещагин, В.Н. Хмелев // Ползуновский вестник. - 2011. - №4-1. - С. 250-254.

4. Шорников Д.Г. Оптимизация условий культивирования in vitro ягодных и декоративных культур / Д.Г. Шорников, С.А. Брюхина, С.А. Муратова, М.Б. Янковская, Р.В. Папихин // Вестник Тамбовского государственного университета им. Г.Р. Державина. Серия: естественные и технические науки. - 2010. - Т. 15, Вып. 2. - С. 640-645.

5. Harborne J.B. Secondary plant products. - N.Y., 1980. - 363 p.

6. Шорников Д.Г. Действие салициловой кислоты на процессы размножения и укоренения растений in vitro / Д.Г. Шорников, М.Б. Янковская, С.А. Муратова // Биология будущего: традиции и инновации. Материалы Всероссийской конференции, посвященной 90-летию Уральского Государственного Университета им. A.M. Горького. Екатеринбург, 25-28 октября 2010 г. - Екатеринбург, 2010. - С. 82-83.

7. Поротикова О.В. Действие салициловой кислоты и ИМК на этапе укоренения ежевики Whitford Tornless in vitro / О.В. Поротикова, М.Б. Янковская, М.В. Романов // Вестник Мичуринского государственного аграрного университета. 2013. - №5. - С. 19-21.

8. Упадышев М.Т. Салициловая кислота как регулятор ризогенеза у плодовых и ягодных культур in vitro / М.Т. Упадышев, А.В. Гуськов // Сельскохозяйственная биология. - 1998. - №5. - С. 63-68.

9. Запрометов М.Н. Биохимия катехинов // Биосинтез, превращение и практическое использование. - М.: Наука, 1995. - 270 с.

10. Петрова А.Д. Хемотерапия и размножение садовых культур на питательных средах с фенокарбоновыми кислотами / А.Д. Петрова, М.Т. Упадышев // Плодоводство и ягодоводство России. - 2000. - Т. VII. -С. 67-72.

11. Упадышев М.Т. Ауксины и фенолкарбоновые кислоты как регуляторы ризогенеза растений рода Rubus in vitro / М.Т. Упадышев, А.В. Гуськов // Сельскохозяйственная биология. - 1996. - №1. - С. 92-98.

Способ укоренения микропобегов, включающий культивирование побегов in vitro, отличающийся тем, что побеги помещают базальной частью в питательную среду укоренения по прописи Мурасиге-Скуга, содержащую 1 мг/л β-индолилмасляной кислоты, с добавлением 1-50 мг/л кофеина.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой питательный раствор для выращивания картофеля в аэропонике, содержащий в 1 л воды: кальциевая селитра (нитрат кальция) - 1 г, фосфат калия однозамещенный - 0,25 г, сульфат магния - 0,25 г, хлорид калия (калийная соль) KCl - 0,125 г , хлорид железа - 0,0125 г, борная кислота - 19,63 г, марганец сернокислый - 14,00 г, цинк сернокислый - 1,41 г, медь сернокислая - 1,41 г, микробиологический препарат - 5 мл, обладающий широким спектром воздействия на фитопатогенные микроорганизмы.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения растительного сырья ириса сибирского (Iris sibirica L.) клональным микроразмножением и выращиванием в условиях гидропоники, включающий введение эксплантов в культуру in vitro, культивирование на питательной среде MS для получения регенерантов, их размножение и укоренение, где на этапе собственно микроразмножения чередуют питательные среды через один пассаж, содержащие MS + (2,5-10,0) мкМ БАП + 1,0 мкМ НУК + 0,1 мкМ ИМК и MS + 1 мкМ БАП + 100 мг/л L-глютамин + 100 г/л аденин сульфат, полученный посадочный материал выращивают в гидропонной установке промышленного образца на питательной среде MS, содержащей половинный набор макросолей и микросолей, полный набор витаминов, хелата железа и кальция хлористого.

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой питательную среду для укоренения побегов винограда in vitro, содержащую аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый, железо сернокислое, этилендиаминотетраацетат натрия, борную кислоту, марганец сернокислый, цинк сернокислый, калий йодистый, натрий молибденовокислый, медь сернокислую, кобальт хлористый, миоинозит, тиамин, пиридоксин, ИУК или ИМК, сахарозу, агар, воду, где оптимизированы соотношения макроэлементов и дополнительно содержатся натрий фосфорнокислый и кальций азотнокислый.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ стерилизации эксплантов осины in vitro, включающий заготовку одревесневших побегов взрослых деревьев в марте-апреле, выгонку молодых растущих побегов, их поэтапную экспозицию в хлорсодержащих агентах, таких как 2% раствор «Domestos» в течение 8 минут и 10% раствор «Аламинол» в течение 10 минут.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения микроклубней картофеля in vitro, включающий черенкование пробирочных растений и высадку одноузловых черенков на агаризованную питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы и витамины на основе прописи питательной среды Мурасиге и Скуга, Fe-хелат, агар-агар, сахарозу.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ размножения иммунноустойчивых образцов картофеля in vitro на аэрогидропонике, включающий орошение оснований черенков регенерантов, где в качестве питательного раствора вводят водный препарат Флорон в концентрации 0,5% с добавлением пектина в концентрации 0,3-0,4% водного раствора Флорона, причем, пектин готовят из кортофельных очисток оздоровленных клубней того же сорта или гибрида размножаемых регенерантов.

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения безвирусного посадочного материала картофеля ценных сортов, заключающийся в том, что проводят прививку поделенных на части микро- и мини-клубней картофеля ценного сорта после предварительного обеззараживания, подсушивания и удаления с клубня-няньки картофеля обычного сорта всех глазков, проводят прививку на клубень-няньку путем прижатия фрагментов микро- и мини-клубней к местам удаленных глазков с последующим подсушиванием, обеззараживанием среза вокруг прививки и дальнейшим культивированием в условиях in vivo.
Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) в условиях in vitro, включающий стерилизацию семян вздутоплодника перекисью водорода в течение 5 мин, ополаскивание, трехкратное отмывание в течение 5 мин в дистиллированной воде, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов, следующего состава: NH4NO3 1650,000±2,0000 мг, KNO3 1900,000±2,0000 мг, MgSO4×7H2O 370,000±1,0000 мг, KH2PO4 170,000±0,1000 мг, CaCl2×2H2O 440,000±0,5000 мг, Н3ВО3 6,200±0,0100 мг, MnSO4×4H2O 22,300±0,0200 мг, ZnSO4×7H2O 8,600±0,0100 мг, KI 0,830±0,0010 мг, Na2MoO4×2H2O 0,250±0,0010 мг, CuSO4×5H2O 0,025±0,0001 мг, CoCl2×6H2O 0,025±0,0001 мг, FeSO4×7H2O 2,785±0,001 мг, Na-ЭДТА 3,725±0,001 мг, тиамин 0,100±0,0010 мг, пиридоксин 0,100±0,0010 мг, сахароза 30000,000±100,0000 мг, вода 1000 мл, агар 5000 мг, дальнейшее помещение растений, полученных in vitro, в аналогичную питательную среду с добавлением ауксина, при этом культивирование растений проводят в темноте, при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 4 недели, при пересеве используют 1/3 адвентивных корней, полученные адвентивные корни выращивают в течение более тридцати циклов.

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения эндемика Маньчжурского флористического района Aristolochia manshuriensis Kom., включающий вычленение апикальных и латеральных почек, стерилизацию гипохлоритом натрия (экспозиция 7-10 мин), высаживание на питательные среды MS с добавлением 0,8 мг/л 6-ВАР и 0,05 мг/л ИУК, размножение микропобегов, их последующее укоренение на среде MS, содержащей 20 мг/л сахарозы и ИМК в концентрации 3-5 мг/л, адаптацию растений-регенерантов к условиям ex vitro посредством высаживания на смесь песка, торфа и дерновой листовой земли в соотношении 1:1:1, предварительно простерилизованной при 85-90°С в течение 1-2 ч.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения иван-чая узколистного Chamaenerion angustifolium L.Holub, включающий вычленение пазушных меристем, стерилизацию эксплантов 7%-ным гипохлоритом кальция в течение 7 минут, высаживание на питательные среды MS с добавлением 6-ВАР в количестве 0,5 мг/л и MS с добавлением FeSO4⋅7H2O в количестве 30 мл/л, 6-ВАР в количестве 0,5 мг/л, IAA в количестве 0,01 мг/л, размножение микропобегов, их последующее укоренение на среде MS, дополненной 1 мг/л IBA, адаптацию растений-регенерантов к условиям ex vitro.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ повышения эффективности ризогенеза растений in vitro, заключающийся в том, что экспланты базальной частью высаживают на питательную среду укоренения по прописи Мурасиге-Скуга, содержащую 1 мгл β-индолилмасляной кислоты, с добавлением 1-50 мгл кофеина. Изобретение позволяет повысить эффективность ризогенеза in vitro микрочеренков растений, культивируемых на питательных средах. 9 ил., 3 пр.

Наверх