Способ изготовления однокодовых и бескодовых тест-полосок

Группа изобретений относится к области диагностических тест-элементов. Диагностический тест-элемент для определения аналита, содержащегося в пробе крови, имеет тестовое поле, содержащее прозрачную пленку, нанесенный на прозрачную пленку по меньшей мере один детекторный слой и расположенный поверх детекторного слоя по меньшей мере один разделительный слой для отделения эритроцитов и кровяных пигментов от исследуемой пробы, причем по меньшей мере один разделительный слой содержит SiO₂ в количестве от 1,0 до 1,6 г/м² и твердые компоненты, включающие способствующий набуханию агент и по меньшей мере один рассеивающий свет пигмент, из насыщенной ими дисперсной системы, полученные диспергированием твердых компонентов в композиции покрытия, образующей разделительный слой. Также раскрывается композиция покрытия, способная образовывать разделительный слой на диагностическом тест-элементе, способ изготовления диагностического тест-элемента, а также применение диагностического тест-элемента для определения количества аналита в пробе субъекта. Группа изобретений обеспечивает минимизирование различий в кинетике диффузного отражения между отдельными партиями тест-элементов для осуществления более точного определения количества аналита. 4 н. и 10 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл., 3 пр.

 

Настоящее изобретение относится к области производства диагностических тест-элементов. В частности, изобретение относится к диагностическому тест-элементу для определения аналита, содержащегося в пробе физиологической жидкости, имеющему по меньшей мере одно тестовое поле с по меньшей мере одним детекторным слоем и по меньшей мере одним разделительным слоем, причем по меньшей мере один разделительный слой содержит дисперсный SiO₂ в количестве примерно от 1,0 до 1,6 г/м². Изобретение также относится к композиции покрытия, способной образовывать разделительный слой на вышеупомянутом предлагаемом диагностическом тест-элементе. Кроме того, предлагается способ изготовления диагностического тест-элемента, а также применение диагностического тест-элемента для определения количества аналита, предпочтительно глюкозы, в пробе субъекта.

Из уровня техники известно множество диагностических тест-элементов, которые могут использоваться для определения аналита (анализируемого вещества) в пробе физиологической жидкости. Указанным аналитом может быть, например, метаболит, такой как глюкоза. При этом можно проводить качественное и/или количественное определение аналита. Известными аналитами являются, например, глюкоза, в частности глюкоза крови, мочевая кислота, этанол и/или лактат. Вместо указанных выше аналитов или в дополнение к ним можно определять и другие типы аналитов. Физиологической жидкостью может быть, например, цельная кровь, плазма крови, интерстициальная жидкость, слюна, моча или другие виды физиологических жидкостей. Ниже осуществление изобретения в основном рассматривается на примерах определения глюкозы в цельной крови, что, разумеется, не ограничивает возможностей осуществления изобретения и не исключает других вариантов его применения.

Диагностические тест-элементы содержат, в принципе, по меньшей мере одно аналитический реагент для качественного и/или количественного определения аналита. Под аналитическим реагентом обычно понимается химическое вещество или смесь химических веществ, которое(-ая) в присутствии по меньшей мере одного аналита изменяет по меньшей мере одно поддающееся определению свойство, в частности свойство, определяемое физическими и/или химическими методами. Предпочтительно, чтобы такое изменение свойства происходило специфическим образом только в присутствии по меньшей мере одного определяемого аналита, но не в присутствии других веществ. Однако на практике может допускаться и неспецифическое изменение свойства в определенных пределах, обусловленное присутствием других химических веществ, присутствие которых в пробе физиологической жидкости обычно маловероятно и/или которые присутствуют лишь в очень низкой концентрации.

По меньшей мере одним изменением свойства может быть, например, изменение оптически обнаруживаемого свойства, в частности изменение цвета. Из уровня техники широко известны примеры диагностических тест-элементов с реагентами для выявления изменений оптических свойств. Например, в публикациях DE 19629656 A1, DE 19629657 A1, WO 2010/052306 или ЕР 0821234 В1 описаны диагностические тест-подложки для определения аналита в цельной крови посредством имеющейся в подложке реакционной системы, содержащей изменяющий цвет реагент. Такая диагностическая тест-подложка содержит тестовое поле, имеющее сторону нанесения пробы, на которую подается проба, и сторону детектирования, на которой вследствие реакции аналита с реакционной системой происходит оптически обнаруживаемое изменение. Тестовое поле выполнено так, чтобы содержащиеся в пробе эритроциты не попадали на сторону детектирования. Тестовое поле содержит, кроме того, прозрачную пластинку (слайд) и первый пленочный слой, а также второй пленочный слой, нанесенный на первый. При этом находящийся на прозрачной пластинке первый слой находится во влажном состоянии и поэтому рассеивает свет в существенно меньшей степени, чем находящийся на нем второй слой. Первый пленочный слой содержит наполнитель, показатель преломления которого близок к показателю преломления воды, тогда как второй слой содержит пигмент с показателем преломления, по меньшей мере равным 2,0 или даже большим, в частности составляющим по меньшей мере 2,2, в концентрации, составляющей по меньшей мере 25 мас. % или даже превышающей 25 мас. % в пересчете на сухой второй слой. Например, первый слой может содержать в качестве наполнителя алюмосиликат натрия.

Однако на практике известным из уровня техники тест-элементам, в частности тест-элементам, имеющим по меньшей мере одно тестовое поле, свойственны определенные недостатки и технические проблемы. Поскольку состав пленочных слоев может варьироваться от партии к партии, в процессе измерений также могут иметь место вариации, обусловленные, например, изменчивостью диффузного отражения. В настоящее время для обеспечения возможности точного измерения аналита применяются специфические для конкретных партий тест-элементов калибровочные характеристики, которые предоставляются в электронном формате в виде так называемых кодовых пластинок с постоянной памятью (ROM Keys). Однако ввод индивидуальной калибровочной характеристики для каждой отдельной партии является для специалиста-практика довольно обременительным мероприятием. Кроме того, существует риск использования неправильных калибровочных характеристик в случае смешения кодовых пластинок.

Одной возможностью, реализованной в настоящее время для исключения смешений и дополнительных операций по замене кодовой пластинки с калибровочной характеристикой, является сохранение калибровочной информации для диагностических тест-элементов на каждом элементе или на магазине, содержащем множество тест-элементов из одной партии. Однако это мероприятие является затратным и требует дополнительных технологических операций, поскольку необходимо снабжать кодом, например штриховым кодом, каждый тест-элемент или необходимо хранить тест-элементы одной партии в магазине, снабженном соответствующим штриховым кодом.

Тем не менее, существует потребность в менее сложных и дорогостоящих мероприятиях для обеспечения измерительных качеств диагностических тест-элементов, которые можно было бы реализовать без необходимости дополнительных технологических операций.

В качестве технической проблемы, положенной в основу настоящего изобретения, может рассматриваться необходимость разработки средств и методов для удовлетворения вышеупомянутых нужд. Решение указанной технической проблемы охарактеризовано в формуле изобретения и поясняется ниже.

Соответственно, настоящее изобретение относится к диагностическому тест-элементу для определения аналита, содержащегося в пробе физиологической жидкости, имеющему по меньшей мере одно тестовое поле с по меньшей мере одним детекторным слоем и по меньшей мере одним разделительным слоем, причем по меньшей мере один разделительный слой содержит твердые компоненты из насыщенной ими дисперсной системы и SiO₂ в количестве примерно от 1,0 до 1,6 г/м².

Термин "диагностический тест-элемент" в данном контексте относится к устройству, содержащему по меньшей мере одно тестовое поле для нанесения и анализа пробы. Соответственно, указанное тестовое поле содержит реагенты для анализа пробы на присутствие или отсутствие аналита. Как правило, такие реагенты включают в себя одно или несколько обнаруживающих веществ, которые распознают присутствие аналита в нанесенной пробе и которые приспособлены для того, чтобы в присутствии определяемого аналита претерпевать по меньшей мере одно обнаруживаемое изменение физического и/или химического свойства. Изменениями, проявляющимися в присутствии аналита, являются, как правило, оптические изменения, хотя могут рассматриваться и другие изменения, например химические или электрохимические.

Подробные сведения относительно принципов, лежащих в основе конструкции таких тест-элементов и технологий их производства, можно найти в публикациях DE 19629657 A1, DE 19629656 А1 или ЕР 0821234 В1, содержание которых включено в данное описание путем ссылки. Другими тест-элементами, которые могут использоваться при осуществлении настоящего изобретения, являются тест-элементы, раскрытые в публикациях ЕР 1035919 В1 или ЕР 1035920 В1, содержание которых также включено в данное описание путем ссылки. Слои предлагаемого в изобретении диагностического тест-элемента являются, в одном аспекте, пленочными слоями, получаемыми из суспензий или эмульсий полимерных пленкообразователей. Пленкообразователи в таких дисперсных системах содержат микроскопические полимерные частицы, нерастворимые в жидкости-носителе (обычно - в воде) и тонко рассеянные в этой жидкости-носителе. Когда в процессе образования пленки жидкость удаляется за счет испарения, эти частицы сближаются и плотно соприкасаются друг с другом. Значительные силы взаимодействия, возникающие в этом процессе, а также прирост поверхностной энергии, сопровождающий образование пленки, приводят к тому, что частицы превращаются в по существу сплошной, или непрерывный, пленочный слой. В качестве альтернативы также можно использовать эмульсию пленкообразователя, в которой он растворен в растворителе. Растворенный полимер эмульгирован в жидкости-носителе, несмешиваемой с растворителем. В качестве полимеров для таких пленкообразователей особенно подходят поливиниловые эфиры, поливинилацетаты, полиакрилаты, полиметакриловая кислота, поливиниламиды, полиамиды и полистирол. Наряду с гомополимерами также подходят смешанные полимеризаты, такие как смешанный полимеризат бутадиена, стирола или эфира малеиновой кислоты.

В одном варианте осуществления изобретения дисперсную и/или насыщенную дисперсную систему получают одним из методов, рассматриваемых в данном описании или известных специалисту, например, из статьи Poh1 и соавт. (2005) в журнале "Chemie Ingenieur Technik", том 77(3), стр. 258-262, и публикации EP 2360120 А1. Кроме того, в одном варианте осуществления изобретения степень дисперсности определяют одним из методов, рассматриваемых в данном описании или известных специалисту, например, из вышеупомянутой статьи Poh1 и соавт. и публикации EP 2360120 A1. В частном варианте осуществления изобретения насыщение дисперсной системы устанавливают путем определения распределения размеров рассеянных частиц, в частности путем измерения лазерной дифракции, или путем анализа дисперсности с помощью анализатора дисперсий, в частности анализатора LUMiSizer® (производства компании LUM GmbH, Берлин).

Из вышеизложенного следует, что предлагаемый в изобретении диагностический тест-элемент может использоваться для определения присутствия или отсутствия аналита либо его количества. Термин "количество" в данном контексте относится к абсолютному или относительному количеству аналита, присутствующего в пробе, нанесенной на диагностический тест-элемент. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительным относительным количеством является концентрация, т.е. количество, отнесенное к объему.

Термин "проба физиологической жидкости" в данном контексте охватывает, в принципе, все виды физиологических (биологических) жидкостей, такие как кровь и ее производные, моча, слюна, лимфа, водный раствор, слезы и т.д. Определяемый аналит заведомо или предположительно содержится в анализируемой пробе физиологической жидкости. Физиологическими жидкостями, в отношении которых известно, что они содержат диагностически релевантные аналиты, являются кровь, в том числе цельная кровь, плазма и сыворотка, а также моча, слюна, жир, синовиальная жидкость и пот. Но, как правило, в соответствии с настоящим изобретением в качестве физиологических жидкостей на предмет исследования их проб рассматриваются кровь и ее производные плазма и сыворотка.

В частности, аналитом, определяемым в соответствии с настоящим изобретением, является глюкоза. Соответственно, типичными обнаруживающими веществами для определения глюкозы как аналита, являются ферменты, такие глюкозодегидрогеназы. Как правило, использоваться должны глюкозодегидрогеназы или их мутанты, зависимые от флавинадениндинуклеотида (ФАД/FAD), никотинамидадениндинуклеотида в окисленной форме (НАД⁺/NAD⁺) или пирролохинолинхинона (ПХХ/PQQ), в том числе раскрытые в публикации WO 2011/020856. Кроме того, обнаруживающие вещества могут содержать ферменты, необходимые для переноса окислительно-восстановительных эквивалентов, полученных из глюкозодегидрогеназы, такие как диафоразы, в частности, липоамиддегидрогеназа или НАДФ-дегидрогеназа или ее ферментативно активный мутант. Кроме того, в качестве альтернативы или дополнения, аналитические реагенты могут содержать один или несколько медиаторов, т.е. веществ, способных переносить электрические заряды от одного вещества к другому. В частности, могут использоваться медиаторы, подходящие для переноса электронов. Таким веществом может быть, например, нитрозоанилин. Кроме того, аналитические реагенты, опять же в качестве альтернативы или дополнения, могут содержать по меньшей мере один индикатор. Под индикатором может пониматься вещество, которое само по себе может изменять по меньшей мере одно обнаруживаемое свойство в зависимости от того, в какой форме это вещество присутствует. Например, могут использоваться вещества, которые в окисленной и восстановленной форме могут иметь различные оптические свойства, например различные цвета. В качестве альтернативы или дополнения, индикатор может включать в себя вещество, которое имеет различные оптические свойства, например различные цветовые свойства, в различных зарядовых состояниях. В частности, индикатором, предполагаемым для осуществления настоящего изобретения, является 2,18-фосфорномолибденовая кислота, ниже также называемая фосфорномолибденовой кислотой. Таким образом, под одним или несколькими аналитическими реагентами вообще может пониматься одно вещество или смесь веществ, например, как пояснялось выше, смесь по меньшей мере одного фермента, по меньшей мере одного медиатора и по меньшей мере один индикатора. Такие аналитические реагенты в принципе известны из уровня техники, например, из указанных выше источников.

Термин "тестовое поле" в контексте настоящего изобретения относится к области диагностического тест-элемента, которая может использоваться для нанесения и/или анализа пробы. Тестовое поле может быть частью диагностического тест-элемента или может быть самим диагностическим элементом. В принципе, тестовое поле имеет сторону нанесения пробы, на которую наносится проба физиологической жидкости, и детекторную сторону, обеспечивающую возможность обнаружения изменения в оптическом и/или химическом свойстве при взаимодействии аналита с реагентом(-ами). Тестовое поле имеет по меньшей мере один детекторный слой, содержащий аналитический(-ие) реагент(-ы). Может использоваться система, имеющая один детекторный слой, или можно использовать несколько детекторных слоев, которые могут быть нанесены поверх друг друга - непосредственно друг на друга или с размещением между ними одного или нескольких других слоев. Особое же предпочтение отдается системе, имеющей только один детекторный слой. Вообще под слоем в контексте настоящего изобретения понимается элемент, посредством которого на подложку ровно нанесен материал слоя или выполненный в виде самостоятельной пленки. Слой может - но не обязательно должен - быть сплошным, но также может иметь, например, отверстия. Однако, как в частности поясняется ниже, особое предпочтение отдается по существу равномерному, предпочтительно пористому, но однородно нанесенному и однородно выполненному детекторному слою с равномерной толщиной. Толщина детекторного слоя, т.е. его средняя толщина, предпочтительно составляет от 3 до 60 мкм, в частности от 5 до 15 мкм, например 8 мкм.

В соответствии с изобретением тестовое поле содержит прозрачную пленку, на которую нанесены первый пленочный слой (т.е. детекторный слой) и второй пленочный слой (т.е. разделительный слой), которые расположены поверх друг друга в данном порядке, т.е. второй поверх первого. Важно, чтобы первый слой, расположенный на прозрачной пленке, рассеивал свет в существенно меньшей степени, чем перекрывающий его второй слой. Не имеющая покрытия сторона прозрачной пленки называется детекторной стороной, а сторона второго слоя, противоположная стороне, которой второй слой прилегает к первому, называется стороной нанесения пробы. В качестве прозрачных пленок подходят пластмассовые пленки, которые непроницаемы для жидкости. При этом особенно подходящей показала себя поликарбонатная пленка.

Термин "детекторный слой" (или "первый слой") в данном контексте относится к пленочному слою в тестовом поле, содержащему реагент(-ы), рассмотренный(-ые) выше. Кроме того, указанный слой также включает составы покрытия, содержащие полимерные пленкообразователи, способствующие набуханию агенты и слабо рассеивающие свет наполнители или не содержащие никаких наполнителей. В соответствии с настоящим изобретением слабо рассеивающими свет наполнителями являются те, у которых показатель преломления близок к показателю преломления воды. Особенно подходящими для этой цели показали себя диоксид кремния, силикаты и алюмосиликаты.

Термин "разделительный слой" (или "второй слой") в данном контексте относится к пленочному слою в тестовом поле, содержащему твердые компоненты из насыщенной ими дисперсной системы. Указанные твердые компоненты из насыщенной ими дисперсной системы в разделительном слое предлагаемого в изобретении диагностического тест-элемента обычно получены диспергированием твердых компонентов в композиции покрытия, образующей разделительный слой, до достижения их максимального содержания, после которого дальнейшего увеличения количества диспергированных твердых компонентов не наблюдается (стадия плато). Методы получения таких дисперсных композиций покрытия и слоев широко известны из уровня техники и подробнее описываются в данном описании.

Кроме того, разделительный слой содержит SiO₂ в количестве примерно от 1,0 до 1,6 г/м². Термин "примерно" в контексте настоящего изобретения предполагает возможность отклонения фактического значения от указанного в пределах ±15%, ±10%, ±5%, ±3%, ±2% или ±1%. В некоторых вариантах осуществления изобретения разделительный слой содержит SiO₂ в количестве примерно от 1,2 до 1,5 г/м². В некоторых вариантах осуществления изобретения разделительный слой содержит SiO₂ в количестве примерно от 1,3 до 1,4 г/м². В некоторых вариантах осуществления изобретения разделительный слой содержит SiO₂ в количестве примерно 1,4 г/м². В частности, разделительный слой может содержать SiO₂ в количестве примерно от 1,00 до 1,05 г/м², от 1,00 до 1,10 г/м², от 1,00 до 1,15 г/м², от 1,00 до 1,20 г/м², от 1,00 до 1,25 г/м², от 1,00 до 1,30 г/м², от 1,00 до 1,35 г/м², от 1,00 до 1,40 г/м², от 1,00 до 1,45 г/м², от 1,00 до 1,50 г/м² или от 1,00 до 1,55 г/м² или примерно от 1,05 до 1,60 г/м², от 1,10 до 1,60 г/м², от 1,15 до 1,60 г/м², от 1,20 до 1,60 г/м², от 1,25 до 1,60 г/м², от 1,30 до 1,60 г/м², от 1,35 до 1,60 г/м², от 1,40 до 1,60 г/м² или от 1,45 до 1,60 г/м². Далее, второй слой должен содержать способствующий набуханию агент и в любом случае по меньшей мере один пигмент, сильно рассеивающий свет. Кроме того, второй слой также может содержать как непористые, так и пористые наполнители. Добавка хорошо набухающего агента (т.е. вещества, увеличивающего свой объем при впитывании воды) позволяет получить слои, которые не только относительно быстро пропускают жидкость пробы, но и, несмотря на этот раскрывающий эффект способствующего набуханию агента, обладают хорошими свойствами в отношении отделения от исследуемой пробы, или задерживания, эритроцитов, а также кровяных пигментов. Свойства набухания должны быть настолько хорошими, чтобы для теста, при котором скорость цветообразования - как, например, в реакции определения глюкозы - зависит в основном от проникновения анализируемой жидкости через слой, оптически обнаруживаемую реакцию можно было измерить, самое большее, через минуту. Особенно подходящими способствующими набуханию агентами показали себя сополимер ангидрида малеиновой кислоты и метилвинилового эфира, ксантановая камедь и сополимер метилвинилового эфира и малеиновой кислоты. Следует иметь в виду, что в предлагаемом диагностическом тест-элементе может использоваться один или несколько детекторных слоев.

В соответствии с изобретением второй слой должен очень сильно рассеивать свет. В идеальном случае показатель преломления пигментов во втором пленочном слое должен составлять по меньшей мере 2,5. Поэтому в этот слой обычно добавляют TiO₂. Таким образом, в одном варианте выполнения предлагаемого диагностического тест-элемента по меньшей мере один разделительный слой также содержит TiO₂. В типичном случае TiO₂ присутствует в количестве примерно от 5,5 до 9,0 г/м². Как правило, разделительный слой может содержать TiO₂ в количестве примерно от 5,5 до 6,0 г/м², от 5,5 до 6,5 г/м², от 5,5 до 7,0 г/м², от 5,5 до 7,5 г/м², от 5,5 до 8,0 г/м² или от 5,5 до 8,5 г/м или примерно от 6,0 до 9,0 г/м², от 6,5 до 9,0 г/м², от 7,0 до 9,0 г/м², от 7,5 до 9,0 г/м², или от 8,0 до 9,0 г/м² или от 8,5 до 9,0 г/м² или примерно от 8,0 до 8,3 г/м², от 7,5 до 8,0 г/м², от 7,0 до 8,3 г/м², от 6,5 до 8,3 г/м², или от 6,0 до 8,3 г/м². В некоторых вариантах осуществления изобретения разделительный слой содержит TiO₂ в количестве примерно от 6,0 до 8,0 г/м². В некоторых вариантах осуществления изобретения разделительный слой содержит TiO₂ в количестве примерно от 7,0 до 8,0 г/м². В некоторых вариантах осуществления изобретения разделительный слой содержит TiO₂ в количестве примерно 7,5 г/м². Кроме того, предусматривается, что TiO₂ может присутствовать в количестве, при котором отношение SiO₂ к TiO₂ составляет примерно от 0,11 до 0,29, в частности примерно от 0,12 до 0,27, от 0,14 до 0,25 или от 0,16 до 0,20, и предпочтительно примерно составляет 0,17, 0,18 или 0,19.

Кроме того, в одном аспекте детекторный слой и разделительный слой по существу свободны от железосодержащих окислителей. Как правило, указанным железосодержащим окислителем является феррицианид калия (III).

В ходе исследований, результаты которых легли в основу настоящего изобретения, было установлено, что уровень дисперсности твердых компонентов в разделительном слое влияет на кинетику диффузного отражения диагностических тест-элементов. В отношении минимизации указанного влияния оказалось, что сильный уровень дисперсности, т.е. высокое содержание дисперсной фазы, достигающий стадии насыщения (стадия плато), т.е. максимального уровня, при котором дальнейшее увеличение дисперсности невозможно, позволяет минимизировать различия в кинетике диффузного отражения между отдельными партиями тест-элементов. Однако одно лишь увеличение дисперсности твердых компонентов имеет тот недостаток, что при определении низких уровней аналитов, например, уровней глюкозы в диапазоне от 0 до 10 мг/дл, можно получить степени диффузного отражения, превышающие 100%. Кроме того, для высоких уровней аналита в случае глюкозы кинетика замедлялась. Было установлено, что вышеупомянутые недостатки можно устранить, включив в состав разделительного слоя SiO₂ в количестве примерно от 1,0 до 1,6 г/м². Использование SiO₂ в вышеупомянутом количестве дает особенно выгодное диффузное отражение, составляющее от 90 до 98 Rem. % даже при низких концентрациях глюкозы, находящихся в районе 10 мг/дл. Большее количество SiO₂ приводит к уменьшению диффузного отражения, что, в свою очередь, сделает различия в диффузном отражении между высокими уровнями глюкозы, составляющими, например, 600 мг/дл, и низкими уровнями глюкозы, составляющими, например, 10 мг/дл, менее выраженными. Преимущество, связанное с вышеупомянутым выгодным диффузным отражением, обусловлено как включением SiO₂, так и высокой степенью дисперсности твердых компонентов, поскольку одно лишь использование SiO₂ опять же дает менее выгодное диффузное отражение. Дальнейших улучшений можно добиться за счет исключения феррицианида калия (III) как окислителя из состава детекторного слоя и разделительного слоя, а также за счет добавления в композицию покрытия, образующую детекторный слой и разделительный слой, слоя фосфорномолибденовой кислоты в качестве индикатора, что следует делать на весьма поздней стадии процесса, чтобы избежать гидролиза индикатора или его деградации. Кроме того, было установлено, что регулирование pH композиции покрытия следует проводить перед добавлением индикатора. При этом было установлено, что при использовании вышеупомянутых модификаций в детекторном слое и разделительном слое различные партии диагностических тест-элементов имеют сравнимые показатели диффузного отражения, т.е. находятся в пределах максимально допустимого отклонения ±5%. Таким образом, благодаря предлагаемому в изобретении диагностическому тест-элементу больше не требуется предоставлять индивидуальные калибровочные характеристики для отдельных партий диагностических тест-элементов, поскольку указанный тест-элемент позволяет использовать одну общую калибровочную характеристику для всех партий (однокодовые или бескодовые тест-полоски). Кроме того, изобретение позволяет отказаться от мероприятий, связанных с дополнительными расходами и затратами времени, таких как сохранение калибровочной информации на каждом диагностическом тест-элементе посредством штрихового кода или заключение тест-элементов, относящихся к одной партии, в снабженный соответствующим кодом магазин.

Приведенные выше определения и пояснения терминов относятся, с учетом необходимых изменений, к вариантам осуществления изобретения, рассматриваемым ниже.

Ниже описываются частные варианты выполнения предлагаемого в изобретении диагностического тест-элемента:

В одном варианте выполнения предлагаемого в изобретении диагностического тест-элемента указанный по меньшей мере один разделительный слой также содержит TiO₂.

В еще одном варианте выполнения предлагаемого в изобретении диагностического тест-элемента TiO₂ присутствует в количестве примерно от 5,5 до 9,0 г/м².

В еще одном варианте выполнения предлагаемого в изобретении диагностического тест-элемента TiO₂ присутствует в количестве, при котором отношение SiO₂ к TiO₂ составляет примерно от 0,11 до 0,29.

В еще одном варианте выполнения предлагаемого в изобретении диагностического тест-элемента детекторный слой и разделительный слой по существу свободны от железосодержащих окислителей.

При этом указанным железосодержащим окислителем может быть феррицианид калия (III).

В еще одном варианте выполнения предлагаемого в изобретении диагностического тест-элемента указанные твердые компоненты из насыщенной ими дисперсной системы получены диспергированием твердых компонентов в композиции покрытия, образующей разделительный слой, до достижения их максимального содержания, после которого дальнейшего увеличения количества диспергированных твердых компонентов не наблюдается (стадия плато).

Изобретение также относится к композиции покрытия, способной образовывать детекторный слой и разделительный слой на предлагаемом в изобретении диагностическом тест-элементе, описанном выше.

Термин "композиция покрытия" в данном контексте относится к композиции, обычно - водной композиции, которая способна образовывать разделительный слой, имеющийся в тестовом поле диагностического тест-элемента. Характерные компоненты указанного разделительного слоя содержатся и в композиции покрытия. Кроме того, указанная композиция содержит подходящие растворители указанных компонентов, хорошо известные специалисту, например, из публикаций DE 19629657 A1, DE 19629656 A1, EP 0821234 В1, EP 1035919 В1 или EP 1035920 B1, содержание которых включено в данное описание путем ссылки. Чтобы композиция покрытия могла образовывать разделительный слой предлагаемого в изобретении диагностического тест-элемента, в соответствии с изобретением предусматривается, что она содержит кремниевую кислоту в количестве примерно от 2,0 до 3,5 г на 100 г, в частности в количестве примерно от 2,1 до 3,2 г на 100 г композиции покрытия или в количестве примерно от 2,1 до 2,8 г на 100 г композиции покрытия и особенно в количестве примерно 2,45 г на 100 г композиции. В типичном случае указанная композиция также содержит TiO₂ в количестве примерно от 11,0 до 18,0 г на 100 г композиции покрытия, в частности в количестве примерно от 12,0 до 17,0 г на 100 г композиции покрытия или в количестве примерно от 13,0 до 15,0 г на 100 г композиции покрытия и особенно в количестве 13,6 г на 100 г композиции.

Так, в одном варианте осуществления изобретения композиция покрытия содержит кремниевую кислоту в количестве примерно от 2,0 до 3,5 г на 100 г композиции.

Кроме того, еще в одном варианте осуществления изобретения композиция покрытия также содержит TiO₂ в количестве примерно от 11,0 до 18,0 г на 100 г композиции.

Настоящее изобретение также относится к способу изготовления предлагаемого в изобретении диагностического тест-элемента, характеризующемуся тем, что твердые компоненты для разделительного слоя диспергируют в композиции покрытия (предпочтительно в композиции покрытия, пригодной для образования разделительного слоя, имеющегося в диагностическом тест-элементе) до достижения их максимального содержания, после которого дальнейшего увеличения количества диспергированных твердых компонентов не происходит (стадия плато), причем композиция покрытия содержит кремниевую кислоту в количестве примерно от 2,0 до 3,5 г на 100 г композиции.

Предлагаемый в изобретении способ в одном аспекте включает в себя приготовление композиции покрытия, способной образовывать разделительный слой, имеющийся в тестовом поле предлагаемого в изобретении диагностического тест-элемента. С этой целью предусматривается, в частности, что твердые компоненты будущего разделительного слоя диспергируют до достижения их максимального содержания, после которого дальнейшего увеличения количества диспергированных твердых компонентов не происходит (стадия плато). Дальнейшее увеличение числа диспергируемых твердых компонентов приведет к агрегации (укрупнению) и/или седиментации (выпадению в осадок) соответствующих частиц. Соответственно, специалист сможет легко определить максимальную степень дисперсности, т.е. насыщенное состояние дисперсной системы, например, путем проведения серии испытаний дисперсных систем, имеющих различную степень насыщения. Чтобы получить окончательное количество SiO₂ в разделительном слое, составляющее примерно от 1,0 до 1,6 г/м², в растворе, используемом для получения композиции покрытия, растворяют другие компоненты, такие как кремниевую кислоту, например, в количестве примерно от 2,0 до 3,5 г на 100 г композиции. Кроме того, в одном аспекте предлагаемого в изобретении способа в композиции можно растворять TiO₂, как правило, в количестве примерно от 11,0 до 18,0 г на 100 г композиции. В еще одном аспекте способа следует избегать наличия в составе композиции феррицианида калия как окислителя. Если в разделительном слое в качестве индикатора используется фосфорномолибденовая кислота, то во избежание ее гидролиза или деградации указанный компонент добавляют на довольно поздней стадии получения композиции покрытия, например не позже чем за один день до нанесения покрытия. В одном аспекте фосфорномолибденовую кислоту добавляют после того, как отрегулирован pH композиции покрытия.

Аналогичным образом, т.е. путем диспергирования и растворения необходимых компонентов, можно готовить композицию покрытия и для детекторного слоя. Компоненты раствора, используемого для получения покрытия, образующего детекторный слой - те же, что используются для формирования разделительного слоя, как это рассматривается в данном описании.

Изготовление диагностических тест-элементов, имеющих тестовые поля с многослойной структурой, в принципе хорошо известно специалисту и описано, например, в публикациях DE 19629657 A1, DE 19629656 A1 или EP 0821234 B1, содержание которых включено в данное описание путем ссылки. В одном аспекте сначала на тестовое поле, имеющееся на диагностическом элементе, наносят композицию покрытия для детекторного слоя. Затем из композиции покрытия удаляют растворитель, получая сухой первый, т.е. детекторный, слой. На следующем шаге на первый слой наносят композицию покрытия для разделительного слоя. Снова проводят удаление растворителя, получая второй, т.е. разделительный, слой. Удалять растворитель из композиции покрытия после ее нанесения на тестовое поле диагностического тест-элемента можно любыми известными методами, подходящими для удаления растворителей, в том числе термообработкой, выпариванием или сублимационной сушкой.

В одном варианте осуществления предлагаемого в изобретении способа в композицию покрытия добавляют в качестве индикатора фосфорномолибденовую кислоту.

В частном варианте осуществления предлагаемого в изобретении способа предусматривается, что фосфорномолибденовую кислоту добавляют менее чем за два дня, менее чем за один день, менее чем за шесть часов, менее чем за три часа, менее чем за два часа или менее чем за один час до нанесения композиции покрытия на тестовое поле диагностического тест-элемента.

Еще в одном варианте осуществления предлагаемого в изобретении способа фосфорномолибденовую кислоту добавляют после регулирования pH композиции покрытия.

Настоящее изобретение также относится к способу определения присутствия или количества аналита в пробе физиологической жидкости.

Такой способ может включать следующие шаги:

(а) предлагаемый в изобретении диагностический тест-элемент вводят в контакт с физиологической жидкостью, предположительно содержащей определяемый аналит, в условиях, обеспечивающих возможность определения аналита аналитическим(-и) реагентом(-ами), содержащимся(-мися) в детекторном слое;

(б) измеряют изменение по меньшей мере одного оптического свойства индикаторного реагента в смоченных жидкостью слоях на диагностическом тест-элементе, за счет чего определяют присутствие или количество аналита в пробе физиологической жидкости.

Введение в контакт (контактирование) в данном контексте означает, что пробу физиологической жидкости наносят на носитель таким образом, чтобы обеспечить возможность физического контакта содержащейся в носителе композиции, предусмотренной изобретением, с пробой физиологической жидкости. В частности, контактирование выполняют в течение такого времени и в таких условиях, которые достаточны для того, чтобы аналитический(-ие) реагент(-ы) активировался(-лись). Например, если определяемым аналитом является глюкоза, то глюкозодегидрогеназа должна восстановиться, т.е. смочиться и раствориться, и таким образом стать биологически активной. Подходящие для контактирования условия зависят от диагностического носителя (подложки) и известны из уровня техники. Проба физиологической жидкости, наносимая на тест-элемент, в одном аспекте может иметь объем менее 2 микролитров, в частности менее 1 микролитра.

При активации обнаруживающего вещества или веществ, например, восстановления биологически активной дегидрогеназы, это вещество связывается со своим субстратом, т.е. аналитом, содержащимся в пробе физиологической жидкости, вызывая обнаруживаемое изменение, такое как превращение субстрата в соответствующий продукт и окислительно-восстановительные эквиваленты. Окислительно-восстановительные эквиваленты, генерируемые, например, дегидрогеназой, позволяют определять активность дегидрогеназы, поскольку окислительно-восстановительные эквиваленты, генерируемые путем ферментативного превращения, катализируемого дегидрогеназой, переносятся агентом, способным выявлять изменение по меньшей мере одного оптического свойства индикатора в присутствии окислительно-восстановительных эквивалентов в композиции, содержащейся в индикаторном реагенте. Затем можно измерить изменение по меньшей мере одного оптического свойства индикатора. В зависимости конкретного диагностического тест-элемента, измерение изменения оптического свойства может проводиться различными методами, известными из уровня техники. Для обнаружения изменения оптического свойства, такого как цвет, может использоваться оптический датчик с пространственным разрешением. Под оптическим датчиком с пространственным разрешением понимается оптический датчик, имеющий множество оптических чувствительных элементов, способных снимать на детекторной стороне детекторного слоя области, не являющиеся полностью конгруэнтными. В частности, оптический датчик с пространственным разрешением может включать в себя по меньшей мере один датчик (приемник) изображения, т.е. массив оптических чувствительных элементов, который может быть одномерным или же двумерным. Таким образом, подобный оптический датчик может включать в себя, в частности, интегральную схему на приборах с зарядовой связью (ПЗС) и/или интегральную схему на комплементарных МОП-транзисторах. Кроме того, оптический датчик с пространственным разрешением может включать в себя по меньшей мере один оптический элемент для отображения детекторной стороны и/или детекторного слоя на рабочую (формирующую изображение) поверхность оптического датчика с пространственным разрешением.

Изменение по меньшей мере одного оптического свойства, измеряемое описанным выше способом, указывает на присутствие аналита. Специалисту должно быть понятно, что для определения количества аналита может требоваться сравнение степени изменения оптического свойства. С этой целью может потребоваться сравнение обнаруженного сигнала, сопровождающего оптическое изменение, с сигналами, сопровождающими оптические изменения, вызываемыми известными количествами аналитов, т.е. калибровочными сигналами. Методы такой калибровки хорошо известны специалисту.

В свете вышеизложенного, изобретение в целом предусматривает применение предлагаемого в изобретении диагностического тест-элемента для определения количества аналита, предпочтительно глюкозы, в пробе субъекта.

По результату определения количества аналита можно оценить, страдает ли субъект, например человек, определенным заболеванием или имеет предрасположенность к этому заболеванию. Таким образом, если определяемым аналитом является глюкоза, диагностический тест-элемент может использоваться для помощи в диагностике диабета или других заболеваний или расстройств с нарушением метаболизма глюкозы.

Все источники, цитируемые в данном описании, включены в него путем ссылки в отношении всего своего содержания и содержания, конкретно указанного в данном описании.

Чертежи

На фиг. 1 показана кинетика диффузного отражения при различных содержаниях глюкозы крови (0 мг/дл крови (A); 10 мг/дл крови (B); 60 мг/дл крови (C); 120 мг/дл крови (D); 300 мг/дл крови (E); 600 мг/дл крови (F)) для различных композиций покрытия, причем квадратики соответствуют композиции MIC, темные треугольники - бескодовой композиции (NoCode) без OAF и без K3, в дисперсном состоянии, светлые треугольники - бескодовой композиции с OAF и без K3, ромбики - бескодовой композиции без OAF и с K3, а крестики - системе MIC с OAF и с K3.

На фиг. 2 показано уменьшение впитывающей способности (А) и скорости впитывания (В) для бескодовой композиции покрытия без OAF и без K3 в дисперсном состоянии по сравнению с недисперсным.

На фиг. 3 показана линейная зависимость между концентрацией глюкозы и относительным диффузным отражением при низких концентрациях, причем прерывистая линия соответствует бескодовой композиции с OAF и с K3, а сплошная линия - бескодовой композиции с OAF и без K3.

На фиг. 4 показана кинетика диффузного отражения при различных содержаниях глюкозы крови (0 мг/дл крови (A); 10 мг/дл крови (B); 45 мг/дл крови (C); 120 мг/дл крови (D); 300 мг/дл крови (E); 600 мг/дл крови (F)) для различных композиций покрытия, причем светлые квадратики соответствуют бескодовой композиции с OAF плюс SiO₂, без K3, а темные квадратики - бескодовой композиции с OAF плюс SiO₂, с K3.

На фиг. 5 показана кинетика диффузного отражения при различных содержаниях глюкозы крови (0 мг/дл крови (A); 10 мг/дл крови (B); 60 мг/дл крови (C); 120 мг/дл крови (D); 300 мг/дл крови (E); 600 мг/дл крови (F)) для различных композиций покрытия, причем светлые квадратики соответствуют композиции MIC (без OAF и с K3), а крестики - бескодовой композиции с OAF плюс SiO₂, без K3.

На фиг. 6 показана однокодовая калибровочная кривая для бескодовой композиции с OAF плюс SiO₂, без K3 (график A). Точность измерения показана на графике B.

Примеры

Ниже приведены примеры, которые лишь иллюстрируют возможности осуществления изобретения или его аспекты. Эта примеры не должны интерпретироваться каким бы то ни было образом, ограничивающим объем охраны изобретения.

Пример 1: Изготовление диагностического тест-элемента

Компоненты, используемые для первого слоя, смешали в количествах, указанных в Таблице 1, отрегулировали pH на 6,75 и нанесли композицию в виде покрытия с удельным весом на единицу поверхности, составлявшим 75 г/м².

Компоненты, используемые для второго слоя, смешали в количествах, указанных в Таблице 2, отрегулировали pH на 6,75 и нанесли композицию в виде покрытия с удельным весом на единицу поверхности, составлявшим 50 г/м².

С использованием охарактеризованных выше композиций покрытий в качестве композиций для образования первого и второго слоев изготовление диагностических тест-элементов выполняли, в основном, как описано в публикациях DE 19629657 A1, DE 19629656 A1 или EP 0821234 B1.

Пример 2: Влияние степени дисперсности твердых компонентов и SiO₂ во втором слое на диффузное отражение

Глюкозу крови измеряли при различных концентрациях (т.е. 0, 10, 60, 120, 300 и 600 мг/дл крови) с использованием диагностических тест-элементов, имеющих различные покрытия, для определения влияния на несколько параметров в стандартной (MIC) и бескодовой системах покрытия в рамках анализа Accu-Chek-Active MIC. Измерения проводили в отношении следующих комбинаций:

- MIC с феррицианидом калия (K3);

- бескодовая композиция с K3;

- бескодовая композиция без K3;

- бескодовая композиция без K3, дисперсная.

Как видно из графиков, представленных на фиг. 1, различные степени дисперсности приводят к получению различных диффузных отражений. Поскольку дисперсность обычно колеблется от партии к партии, вышеупомянутое влияние степени дисперсности в тест-элементе диктует необходимость использования специфической для партии калибровки. Для минимизации влияния степени дисперсности на диффузное отражение использовался еще один слой с высоким содержанием диспергированных твердых компонентов (OAF), т.е. с дисперсной системой в состоянии насыщения.

- MIC с OAF и с K3

Однако при использовании этого слоя степени диффузного отражения при низких концентрациях глюкозы (например, 0-10 мг/дл глюкозы в крови) превышали 100%, что сделало процесс оценки с помощью калибровочной кривой (характеристика) уже невозможным. Кроме того, кинетика диффузного отражения оказалась сильно замедленной, см. фиг. 1.

Результатом использования высокой степени дисперсности в композиции покрытия также явилась уменьшенная пористость в сухом слое, вследствие чего увеличилась оптическая плотность. Как упоминалось выше, это приводит к увеличению диффузного отражения в пробах крови с низким или нулевым уровнем глюкозы. Кроме того, уменьшилась скорость проникновения глюкозы в слой. Эти эффекты были дополнительно подтверждены измерениями впитывающей способности измерения различных покрытий, т.е. бескодовой композиции без K3 и бескодовой композиции без K3 в дисперсном состоянии, см. фиг. 2.

Впитывающая способность уменьшилась примерно на 25%, а скорость проникновения - примерно на 50%, см. фиг. 2.

Во избежание нежелательного увеличения диффузного отражения при измерении низких уровней глюкозы крови и для улучшения кинетики количество SiO₂ во втором слое было увеличено примерно на 70% со значения примерно 0,7 г/м² до окончательного количества от 1,0 до 1,6 г/м². У тест-элементов с такими вторыми слоями удалось получить особенно выгодные диапазоны диффузного отражения от 90 до 98%. Кроме того, было установлено, что дальнейшее увеличение SiO₂ приводит к уменьшению диффузного отражения, вследствие чего различия в диффузном отражении между пробами с низкими концентрациями и пробами с высокими концентрациями менее выражены, что делает измерительную систему в целом менее точной.

Кроме того, было установлено, что использование повышенной концентрации SiO₂ во втором слое без увеличения степени дисперсности также приводит к уменьшению диффузного отражения и сильной зависимости от относительной влажности во время измерения. Соответственно, для усовершенствования тест-элемента в отношении независимой от партии калибровки увеличение степени дисперсности и увеличение содержания SiCh во втором слое следует использовать в сочетании друг с другом.

Пример 3: Влияние фосфорномолибденовой кислоты и феррицианида калия на диффузное отражение

Также было установлено, что фосфорномолибденовая кислота должна оставаться в составе композиции покрытия в течение как можно более короткого времени, чтобы избежать взаимного влияния с последующим измерением. Кроме того, было установлено, что NaOH, используемый для регулирования pH композиции покрытия, следует добавлять до добавления фосфорномолибденовой кислоты, во избежание ее гидролиза. В процесс приготовления композиции покрытия были внесены соответствующие изменения. Однако было установлено, что даже в этом случае калибровочные кодовые кривые были сигмоидальными, что затрудняет проведение различия между высокими и низкими концентрациями глюкозы в крови. Кроме того, было обнаружено увеличение длительности измерения.

Было установлено, что вышеупомянутые аспекты были обусловлены присутствием феррицианида калия (III) (K3) и что эти негативные эффекты можно преодолеть, исключив указанный K3 из обоих слоев тест-элемента, см. фиг. 3.

Еще один побочный результат исключения K3 заключался в том, что кинетика диффузных отражений, в частности при измерении концентраций глюкозы в крови в среднем диапазоне, например от 45 до 120 мг/дл, оказалась значительно более быстрой, см. фиг. 4.

На фиг. 5 усовершенствования, предпринятые в соответствии с настоящим изобретением, т.е. бескодовая композиция с OAF плюс SiO₂ и без K3, обобщаются и сопоставляются со стандартной MIC-системой без OAF с K3.

На фиг. 6(А) показана возможность получения линейной убывающей калибровочной кривой. Диффузное отражение при низкой концентрации глюкозы является достаточным, а различие между высокими и низкими концентрациями глюкозы - приемлемым, что обеспечивает хорошую точность и низкую изменчивость результатов.

На фиг. 6(В) показана точность усовершенствованного тест-элемента.

1. Диагностический тест-элемент для определения аналита, содержащегося в пробе крови, имеющий по меньшей мере одно тестовое поле, содержащее прозрачную пленку, нанесенный на прозрачную пленку по меньшей мере один детекторный слой и расположенный поверх детекторного слоя по меньшей мере один разделительный слой для отделения эритроцитов и кровяных пигментов от исследуемой пробы, причем по меньшей мере один разделительный слой содержит SiO₂ в количестве от 1,0 до 1,6 г/м² и твердые компоненты, включающие способствующий набуханию агент и по меньшей мере один рассеивающий свет пигмент, из насыщенной ими дисперсной системы, полученные диспергированием твердых компонентов в композиции покрытия, образующей разделительный слой, до достижения их максимального содержания, после которого дальнейшего увеличения количества диспергированных твердых компонентов не наблюдается (стадия плато).

2. Диагностический тест-элемент по п. 1, характеризующийся тем, что по меньшей мере один разделительный слой также содержит TiO₂.

3. Диагностический тест-элемент по п. 2, характеризующийся тем, что TiO₂ присутствует в количестве от 5,5 до 9,0 г/м².

4. Диагностический тест-элемент по п. 1 или 2, характеризующийся тем, что TiO₂ присутствует в количестве, при котором отношение SiO₂ к TiO₂ составляет от 0,11 до 0,29.

5. Диагностический тест-элемент по любому из пп. 1-4, характеризующийся тем, что детекторный слой и разделительный слой свободны от железосодержащих окислителей.

6. Диагностический тест-элемент по п. 5, характеризующийся тем, что железосодержащим окислителем является феррицианид калия (III).

7. Композиция покрытия, способная образовывать на диагностическом тест-элементе по любому из пп. 1-6 разделительный слой для отделения эритроцитов и кровяных пигментов от исследуемой пробы крови, включающая кремниевую кислоту в количестве от 2,0 до 3,5 г на 100 г композиции, а также способствующий набуханию агент и по меньшей мере один рассеивающий свет пигмент, диспергированные в композиции до достижения их максимального содержания, после которого дальнейшего увеличения количества диспергированных твердых компонентов не происходит (стадия плато).

8. Композиция покрытия по п. 7, характеризующаяся тем, что она содержит TiO₂ в количестве от 11,0 до 18,0 г на 100 г композиции.

9. Способ изготовления диагностического тест-элемента по любому из пп. 1-6, характеризующийся тем, что на прозрачную пленку наносят по меньшей мере один детекторный слой, а поверх него на тестовое поле наносят композицию покрытия, образующую разделительный слой, предназначенный для отделения эритроцитов и кровяных пигментов от исследуемой пробы крови, причем твердые компоненты, используемые для получения разделительного слоя и включающие способствующий набуханию агент и по меньшей мере один рассеивающий свет пигмент, диспергируют в композиции покрытия до достижения их максимального содержания, после которого дальнейшего увеличения количества диспергированных твердых компонентов не происходит (стадия плато), причем композиция покрытия содержит кремниевую кислоту в количестве от 2,0 до 3,5 г на 100 г композиции.

10. Способ по п.9, характеризующийся тем, что в композицию покрытия добавляют в качестве индикатора окислительно-восстановительного состояния фосфорно

молибденовую кислоту.

11. Способ по п.10, характеризующийся тем, что фосфорномолибденовую кислоту добавляют менее чем за два дня, менее чем за один день, менее чем за шесть часов, менее чем за три часа, менее чем за два часа или менее чем за один час до нанесения композиции покрытия на тестовое поле диагностического тест-элемента.

12. Способ по п. 10 или 11, характеризующийся тем, что рН композиции покрытия регулируют с использованием NaOH, причем фосфорномолибденовую кислоту добавляют после регулирования рН.

13. Применение диагностического тест-элемента по любому из пп. 1-6 для определения количества аналита в пробе крови субъекта.

14. Применение по п. 13, в котором аналитом является глюкоза.