Способ получения регенерантов риса в культуре пыльников in vitro

Авторы патента:

A01H4/00 - Разведение растений из тканевых культур

Владельцы патента RU 2681339:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение " Федеральный научный центр агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки" (ФГБНУ "ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки") (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения регенерантов риса в культуре пыльников in vitro, включающий выращивание растений-доноров, стерилизацию метелок, посадку пыльников на питательную среду, получение каллуса, перенос его на регенерационную питательную среду, получение регенерантов и их укоренение на питательной среде. Отличительной особенностью способа является то, что семена растений-доноров высевают в климакамере в марте с получением пыльников в мае, которые без стерилизации переносят на среду для индукции каллуса и субкультивируют его на питательной среде с дальнейшим получением зеленых растений-регенерантов. Изобретение позволяет повысить выход регенерантов риса в культуре пыльников in vitro. 2 табл.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к селекции растений и сельскохозяйственной биотехнологии и может быть использовано для ускорения селекционного процесса риса.

Известен способ получения регенерантов риса, в котором растения-доноры выращивают в тепличных условиях, включающий стерилизацию метелок, посадку пыльников на среду N₆, трансплантацию каллусов на среду MS, укоренение регенерантов на безгормональной среде MS и высадкой в теплицу (см., например, Gueye, Т. Ndir, K.N. In vitro production of double haploid plants from two rice species (Oryza sativa L. and Oryza glaberrima Steudt.) for the rapid development of new breeding material. Scientific Research and Essaya. 2010. Vol. 5 (7). P. 709-713).

Недостатком данного способа получения регенератное риса является:

- не определен период выращивания растений-доноров в течение года и интенсивность освещения на всех этапах;

- большие материальные затраты на реактивы для стерилизации метелок риса;

- низкая интенсивность каллусообразования.

Известен также способ получения регенерантов риса, включающий выращивание растений-доноров в идеальных полевых условиях, стерилизацию метелок, инокуляция пыльников на среду N₆, посадка каллуса на среду MS, укоренение на питательной среде MS с последующей высадкой в теплицу (см., например, Mishra, R., Rao, G.J.N., Rao, R.N. [et al.]. Development and characterization of elite doubled haploid lines from two Indica rice hybrids. Rice Science. 2015. Vol. 22, №6. P. 290-299).

Недостатком данного способа считаем:

- использован только один период выращивания растений-доноров в течение года, а именно летний полевой сезон;

- большие затрат на стерилизацию метелок, использование хлорсодержащего вещества, вредящего здоровью исследователей.

Известен способ получения регенерантов риса в культуре пыльников in vitro (прототип), включающий выращивание растений-доноров, стерилизацию метелок, посадку пыльников на питательную среду, получение каллуса, перенос его на регенерационную питательную среду, получение регенерантов и их укоренение на питательной среде с последующей высадкой растений в открытый грунт или в теплицы (см., например, Гончарова, Ю.К. Использование метода культуры пыльников в селекции риса. Краснодар: ВНИИ риса, 2012. 91 с.).

Недостатки способа получения регенерантов риса в культуре пыльников в прототипе:

- не определена продолжительность выращивания растений доноров, предполагается, что в летний полевой сезон;

- высокие материальные затраты на приобретение препаратов для стерилизации;

- большая трудоемкость стерилизации метелок риса.

Цель изобретения - повысить выход регенерантов риса в культуре пыльников in vitro за счет подбора результативных периодов выращивания растений-доноров в искусственных условиях, исключения процедуры стерилизации метелок и увеличения выхода пробирочных растений.

Указанная цель достигается тем, что способ получения регенерантов риса в культуре пыльников in vitro, включающий выращивание растений-доноров, стерилизацию метелок, посадку пыльников на питательную среду, получение каллуса, перенос его на регенерационную питательную среду, получение регенерантов и их укоренение на питательной среде, отличающийся тем, что семена растений-доноров высевают в климакамере в марте с получением пыльников в мае, которые без стерилизации переносят на среду для индукции каллуса и субкультивируют его на питательной среде с дальнейшим получением зеленых растений-регенерантов.

По сравнению с прототипом признаками изобретательского уровня предлагаемого способа получения регенерантов риса в культуре пыльников является следующее:

1. «… семена растений-доноров высевают в климакамере в марте с получением пыльников в мае …», это позволяет:

- сократить время и затраты на получение максимального количества каллуса и увеличить объем инокулируемого материала;

- увеличить интенсивность каллусообразования с весенних растений-доноров из климакамеры по сравнению с летними растениями в открытом грунте в 2,4 раза;

2. «… без стерилизации переносят на среду для индукции каллуса и субкультивируют его на питательной среде с дальнейшим получением зеленых растений-регенервнтов.», что позволяет:

- экономить время, так как на обработку стерилизующими агентами и промывку автоклавированной дистиллированной водой затрачивается ежедневно час рабочего времени и перенаправить его на инокуляцию пыльников;

- избежать воздействия на цветки риса стерилизующих агентов, которые являются дополнительными стрессорами для пыльников;

- сократить трудозатраты и снизить воздействие вредных веществ на исследователя (гипохлорид натрия - летучее хлорсодержащее вещество).

Признаки, указанные в отличительной части описания достижения цели доказывают, что заявляемый способ получения регенерантов риса в культуре пыльников in vitro обладает новизной. Совокупность признаков, приведенных в сравнении свойств заявляемого и известного решения, дает основание сделать вывод, что заявляемый способ имеет изобретательский уровень.

Предлагаемый способ получения регенерантов риса в культуре пыльников in vitro осуществляется следующим образом. Семена растений-доноров высевают 15 марта в сосуды с почвой и выращивают в климатической камере при температуре 24°С, влажности 60%, освещенности 15000 люкс, режиме дня 14 часов. Сбор метелок с растений-доноров осуществляют в мае в утренние часы, когда расстояние между флаговым и предпоследним листами составляет 5-10 см, метелка находится внутри флагового листа. Раскрытия влагалища флагового листа не допускается. Низкотемпературную обработку свежесрезанных метелок внутри растений-доноров проводят путем помещения стеблей с метелкой и листьями в цилиндр с водой при 5°С в течение семи дней. Извлечение метелки из влагалища флагового листа осуществляют в асептических условиях стерильным пинцетом в чашку Петри. Пыльники выделяют стерильным инструментом на предметных стеклах, выдержанных в сухожаровом шкафу при температуре 250°С в течение 2 часов в чашках Петри. Пыльники инокулируют по 2 шт. в пробирку диаметром 14 мм, содержащую питательную среду N₆, застывшую под углом 45°.

Проведенные в течение года ежемесячные эксперименты подтвердили результативность закладки опыта в марте (табл. 1). В качестве контроля служили растения-доноры, выращенные в сосудах в открытом грунте с конца мая до начала августа в естественных условиях открытого грунта.

Каллусогенез проходит в темноте при температуре 25-27°С до высыхания среды (два месяца). В отдельные месяцы каллусообразование отсутствует (февраль-апрель, октябрь-ноябрь), что свидетельствует о сезонной зависимости каллусообразования при равных условиях выращивания растений-доноров в климатической камере. Результаты свидетельствуют о существенном повышении интенсивности каллусообразования в мае - 120 шт. (43,48%), достоверное превышение над контролем составило 26,46% (табл. 1). Таким образом, установлено, что наиболее интенсивное каллусообразование отмечено в мае, при выращивании в контролируемых условиях.

В таблице 2 представлены результаты инокуляции пыльников на питательную среду без стерилизации.

Результаты свидетельствуют о большей асептической чистоте пыльников, полученных с растений-доноров в климатической камере (0,2%) по сравнению с пыльниками, выделенными из растений, выращенных в поле (7,2%). Это объясняется закрытостью метелки во влагалище листа риса, где сохраняется асептическая чистота в цветках риса, что позволяет исключить этап стерилизации метелок риса перед введением пыльников в культуру in vitro.

Регенерацию растений из каллуса проводят в пробирках диаметром 18 мм с ватно-марлевыми пробками на среде N₆ в контролируемых условиях культуральной комнаты (температура 25°С, фотопериод 16/8 часов, интенсивности освещения 4000 люкс). Укоренение регенерантов осуществляют в пробирках диаметром 21 мм на питательной среде MS с половинным минеральным составом в аналогичных контролируемых условиях. Для дальнейшего получения семян регенеранты пересаживают в пластиковые стаканы с автоклавированным грунтом при 1 атм в течение часа.

Применение предлагаемого изобретения позволит эффективно вводить пыльники риса в культуру in vitro два раза в год, экономить время, реактивы и трудозатраты за счет отсутствия этапа стерилизации пыльников и существенно увеличить выход пробирочных растений-регенерантов риса в культуре пыльников.

Способ получения регенерантов риса в культуре пыльников in vitro, включающий выращивание растений-доноров, стерилизацию метелок, посадку пыльников на питательную среду, получение каллуса, перенос его на регенерационную питательную среду, получение регенерантов и их укоренение на питательной среде, отличающийся тем, что семена растений-доноров высевают в климакамере в марте с получением пыльников в мае, которые без стерилизации переносят на среду для индукции каллуса и субкультивируют его на питательной среде с дальнейшим получением зеленых растений-регенерантов.

Изобретения относятся к области биотехнологии. Изобретение представляет собой питательную среду, содержащую макро- и микросоли, готовящуюся по прописи WPM, но с дополнительным введением глицина и агар-агара, а также отличным содержанием микро- и макрокомпонентов, N6-(2-изопентил)аденина и индолилуксусной кислоты.

Способ повышения эффективности ризогенеза растений in vitro с помощью кофеина // 2679077

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ повышения эффективности ризогенеза растений in vitro, заключающийся в том, что экспланты базальной частью высаживают на питательную среду укоренения по прописи Мурасиге-Скуга, содержащую 1 мг/л β-индолилмасляной кислоты, с добавлением 1-50 мг/л кофеина.

Питательный раствор для выращивания микроклубней картофеля в аэропонике // 2678177

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой питательный раствор для выращивания картофеля в аэропонике, содержащий в 1 л воды: кальциевая селитра (нитрат кальция) - 1 г, фосфат калия однозамещенный - 0,25 г, сульфат магния - 0,25 г, хлорид калия (калийная соль) KCl - 0,125 г , хлорид железа - 0,0125 г, борная кислота - 19,63 г, марганец сернокислый - 14,00 г, цинк сернокислый - 1,41 г, медь сернокислая - 1,41 г, микробиологический препарат - 5 мл, обладающий широким спектром воздействия на фитопатогенные микроорганизмы.

Способ получения растительного сырья ириса сибирского (iris sibirica l.) методами биотехнологии // 2677921

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения растительного сырья ириса сибирского (Iris sibirica L.) клональным микроразмножением и выращиванием в условиях гидропоники, включающий введение эксплантов в культуру in vitro, культивирование на питательной среде MS для получения регенерантов, их размножение и укоренение, где на этапе собственно микроразмножения чередуют питательные среды через один пассаж, содержащие MS + (2,5-10,0) мкМ БАП + 1,0 мкМ НУК + 0,1 мкМ ИМК и MS + 1 мкМ БАП + 100 мг/л L-глютамин + 100 г/л аденин сульфат, полученный посадочный материал выращивают в гидропонной установке промышленного образца на питательной среде MS, содержащей половинный набор макросолей и микросолей, полный набор витаминов, хелата железа и кальция хлористого.

Питательная среда для укоренения побегов винограда в культуре in vitro // 2676127

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой питательную среду для укоренения побегов винограда in vitro, содержащую аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый, железо сернокислое, этилендиаминотетраацетат натрия, борную кислоту, марганец сернокислый, цинк сернокислый, калий йодистый, натрий молибденовокислый, медь сернокислую, кобальт хлористый, миоинозит, тиамин, пиридоксин, ИУК или ИМК, сахарозу, агар, воду, где оптимизированы соотношения макроэлементов и дополнительно содержатся натрий фосфорнокислый и кальций азотнокислый.

Способ поверхностной стерилизации эксплантов осины in vitro // 2675510

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ стерилизации эксплантов осины in vitro, включающий заготовку одревесневших побегов взрослых деревьев в марте-апреле, выгонку молодых растущих побегов, их поэтапную экспозицию в хлорсодержащих агентах, таких как 2% раствор «Domestos» в течение 8 минут и 10% раствор «Аламинол» в течение 10 минут.

Способ получения микроклубней картофеля in vitro // 2671102

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения микроклубней картофеля in vitro, включающий черенкование пробирочных растений и высадку одноузловых черенков на агаризованную питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы и витамины на основе прописи питательной среды Мурасиге и Скуга, Fe-хелат, агар-агар, сахарозу.

Способ размножения иммунноустойчивых образцов картофеля in vitro на аэрогидропонике // 2670485

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ размножения иммунноустойчивых образцов картофеля in vitro на аэрогидропонике, включающий орошение оснований черенков регенерантов, где в качестве питательного раствора вводят водный препарат Флорон в концентрации 0,5% с добавлением пектина в концентрации 0,3-0,4% водного раствора Флорона, причем, пектин готовят из кортофельных очисток оздоровленных клубней того же сорта или гибрида размножаемых регенерантов.

Способ получения безвирусного посадочного материала картофеля ценных сортов // 2668153

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения безвирусного посадочного материала картофеля ценных сортов, заключающийся в том, что проводят прививку поделенных на части микро- и мини-клубней картофеля ценного сорта после предварительного обеззараживания, подсушивания и удаления с клубня-няньки картофеля обычного сорта всех глазков, проводят прививку на клубень-няньку путем прижатия фрагментов микро- и мини-клубней к местам удаленных глазков с последующим подсушиванием, обеззараживанием среза вокруг прививки и дальнейшим культивированием в условиях in vivo.

Способ получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского (phlojodicarpus sibiricus (steph.) к.-pol.) в условиях in vitro // 2666920

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) в условиях in vitro, включающий стерилизацию семян вздутоплодника перекисью водорода в течение 5 мин, ополаскивание, трехкратное отмывание в течение 5 мин в дистиллированной воде, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов, следующего состава: NH4NO3 1650,000±2,0000 мг, KNO3 1900,000±2,0000 мг, MgSO4×7H2O 370,000±1,0000 мг, KH2PO4 170,000±0,1000 мг, CaCl2×2H2O 440,000±0,5000 мг, Н3ВО3 6,200±0,0100 мг, MnSO4×4H2O 22,300±0,0200 мг, ZnSO4×7H2O 8,600±0,0100 мг, KI 0,830±0,0010 мг, Na2MoO4×2H2O 0,250±0,0010 мг, CuSO4×5H2O 0,025±0,0001 мг, CoCl2×6H2O 0,025±0,0001 мг, FeSO4×7H2O 2,785±0,001 мг, Na-ЭДТА 3,725±0,001 мг, тиамин 0,100±0,0010 мг, пиридоксин 0,100±0,0010 мг, сахароза 30000,000±100,0000 мг, вода 1000 мл, агар 5000 мг, дальнейшее помещение растений, полученных in vitro, в аналогичную питательную среду с добавлением ауксина, при этом культивирование растений проводят в темноте, при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 4 недели, при пересеве используют 1/3 адвентивных корней, полученные адвентивные корни выращивают в течение более тридцати циклов.