Способ пролонгирования высвобождения биологически активных веществ из теней эритроцитов

Авторы патента:

Рубцова Юлия Павловна (RU)

Егорихина Марфа Николаевна (RU)

Чарыкова Ирина Николаевна (RU)

Соснина Лариса Николаевна (RU)

Левин Григорий Яковлевич (RU)

G01N33/48 - биологических материалов, например крови, мочи (G01N 33/02-G01N 33/14,G01N 33/26,G01N 33/44,G01N 33/46 имеют преимущество; определение всхожести семян A01C 1/02); приборы для подсчета и измерения клеток крови (гемоцитометры) (подсчет клеток крови, распределенных по поверхности, путем сканирования этой поверхности G06M 11/02)

A61K9/52 - длительного действия или отличающиеся типом освобождения

A61K35/18 - эритроциты

Владельцы патента RU 2683322:

федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Приволжский исследовательский медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу пролонгирования высвобождения альбумина из теней эритроцитов. Способ пролонгирования высвобождения альбумина из теней эритроцитов, включающий использование в качестве контейнеров теней эритроцитов, получаемых путем гипоосмотического шока нативных эритроцитов и инкубации их в растворе биологически активных веществ с последующим «замыканием» теней эритроцитов в изотонической среде, при этом «замыкание» теней эритроцитов осуществляют путем добавления к ним раствора глутарового альдегида с последующим отмыванием теней от находящегося вне теней глутарового альдегида. Вышеописанный способ позволяет осуществлять пролонгированное высвобождение альбумина из теней эритроцитов. 2 пр.

Предлагаемое изобретение относится к медицине, биотехнологии, регенеративной медицине и может быть использовано в цитологии, гистологии, трансплантологии, биомедицинских исследованиях, клеточной биотехнологии и биоинженерии.

Важнейшей задачей тканевой инженерии является включение биоактивных веществ в структуру скаффолда для их постепенного высвобождения в процессе биорезорбции материала.

Существует вариант в инкапсуляции биологически активных веществ в системы лекарственной доставки, одной из которых являются тени эритроцитов. Как и сами скаффолды, системы доставки должны иметь регулируемую скорость биодеградации, отсутствие токсичности и отрицательного влияния на структуру клеток.

В качестве прототипа выбран способ, включающий использование в качестве контейнеров теней эритроцитов, получаемых путем гипоосмотического шока нативных эритроцитов и инкубации их в растворе биологически активных веществ с последующим «замыканием» теней эритроцитов в изотонической среде (SU 1718955 А1 Способ включения водорастворимого препарата в тени эритроцитов, Ж.Ш. Жумадилов, Т.П. Генинг, 15.03.92 Бюл. №10).

Однако заполненные тени эритроцитов вводятся внутривенно, поэтому не может происходить направленного действия препаратов на клетки, культивируемые в скаффолде. Системное введение факторов роста обычно является малоэффективным, а иногда и опасным вследствие их короткого времени жизни, особенно в физиологических средах, неизбирательного биораспределения, потенциальной токсичности и риска канцерогенной активности. Включение биоактивных веществ в тени эритроцитов и размещение их в скаффолде дает возможность локализованно доставлять оптимальную концентрацию биологически активных веществ внутрь имплантата.

Задача предполагаемого изобретения - усовершенствование способа.

Технический результат - создание условий для постепенного и контролируемого высвобождения биологически активных веществ из теней эритроцитов.

Технический результат достигается за счет того, что в способе, включающем использование в качестве контейнеров теней эритроцитов, получаемых путем гипоосмотического шока нативных эритроцитов и инкубации их в растворе биологически активных веществ с последующим «замыканием» теней эритроцитов в изотонической среде, с целью замедления процесса высвобождения биологически активных веществ «замыкание» теней эритроцитов осуществляют путем добавления к ним раствора глутарового альдегида, от изменения концентрации которого зависит длительность высвобождения биологически активных веществ, с последующим отмыванием теней от находящегося вне теней глутарового альдегида.

Способ пролонгирования высвобождения биологически активных веществ из теней эритроцитов осуществляют следующим образом. Для приготовления теней эритроцитов используют 1.5 мл донорских эритроцитов. Отмывают их физиологическим раствором 2 раза путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 мин. Затем, добавляя в отмытые эритроциты по 10 мл ледяной дистиллированной воды осуществляют гипоосмотический шок, центрифугируют 25 минут при 8000 об/мин, надосадочную жидкость сливают. Осадок суспензируют с 10 мл гипертонического раствора хлорида натрия (4%) для дальнейшего удаления, оставшегося в тенях эритроцитов гемоглобина, центрифугируют 10 минут при 8000об/мин, надосадочную жидкость удаляют. Полученные тени эритроцитов инкубируют с 4 мл смеси биологически активных веществ и разбавленной ледяной дистиллированной водой 1:1 в течение 20 минут при 4°С. Для «замыкания» мембраны эритроцитов восстанавливают изотоничность среды, добавляя раствор глютаральдегида в физиологическом растворе, и инкубируют в течение 30 мин при 37 С. После этого центрифугируют 10 минут при 4000об/мин., надосадочную жидкость удаляют. Оставшиеся, заполненные биологически активными веществами, тени эритроцитов отмывают от находящегося вне теней глутарового альдегида физиологическим раствором. Надосадочную жидкость после центрифугирования в течение 10 минут при 4000об/мин удалялиют. Для дальнейших исследований и оценки эффективности предложенного способа используют полученные тени эритроцитов с инкапсулированными биологически активными факторами, и замкнутыми с помощью глутарового альдегида.

Пример №1

Важнейшей задачей, решаемой с помощью предполагаемого способа, является постепенное высвобождение биологически активных веществ из контейнеров носителей (теней эритроцитов). В способе прототипа показано, что высвобождение антибиотиков из теней эритроцитов происходит постепенно при их внутривенном введении. Для проверки скорости высвобождения инкапсулированных факторов из теней эритроцитов в условиях in vitro проведены следующие исследования. Тени эритроцитов, полученные описанным ранее способом, инкубируют с раствором 10% альбумина, разведенного 1:1 дистиллированной водой. Заполненные альбумином тени эритроцитов, после их «замыкания» путем создания изотоничности среды в контроле - физиологическим раствором, а в опыте - глутаровым альдегидом, отмывают от находящейся вне теней альбумина и глютаральдегида, путем добавления физиологического раствора и центрифугирования 10 минут при 4000об/мин, надосадочную жидкость удаляют. Добавляют 1 мл физиологического раствора, перемешивают и центрифугируют 10 минут при 4000об/мин. Затем измеряют оптическую плотность супернатанта против физиологического раствора при длине волны 280 нм на спектрофотометре Spekol UV VIS (Zeiss, Германия). Установлено, что через сутки из теней эритроцитов в контроле («замкнутых» физиологическим раствором) высвобождается 54,5% инкапсулированного альбумина, а через двое суток- 78%, через трое суток-98%. Из теней эритроцитов, «замкнутых» 0,06% раствором глутарового альдегида, через сутки высвобождалось 30% инкапсулированного альбумина, через 2 суток- 51%, через трое суток-68%, через 4 суток- 75%, через 5 суток- 82%, через 6 суток- 92%.

При использовании 0,125% раствора глутарового альдегида для «замыкания» теней эритроцитов 93% высвобождение альбумина происходило лишь на 8 сутки.

Таким образом, данные исследования указывают на то, что из теней эритроцитов, приготовленных предположенным способом, инкапсулированный белок - альбумин, высвобождается значительно медленнее, чем в опытах, в которых «замыкание теней эритроцитов осуществляется известным способом, выбранном в качестве прототипа. Кроме того, установлено, что с помощью изменения концентрации глутарового альдегида, контролируется скорость высвобождения инкапсулированных веществ.

Для проверки эффективности способа пролонгирования высвобождения биологически активных веществ из теней эритроцитов, помещенных непосредственно в скаффолд, проведены следующие исследования.

Пример №2

Описанным выше способом получают тени эритроцитов с инкапсуляцией в них биологически активных веществ - смеси сыворотки крови и лизата тромбоцитов с добавлением фактора роста фибробластов и «замыкают» тени с использованием глутарового альдегида - опыт 1. Во втором опыте используют тени эритроцитов, в которых инкапсулируют те же биологически активные вещества, но «зымыкают» их с помощью физиологического раствора. В трех пробирках размещают дермальные фибробласты человека в физиологическом растворе с концентрацией клеток 280 клеток/мм³ и тщательно перемешивают их с тенями эритроцитов из опыта 1 и опыта 2. В третью пробирку, вместо теней эритроцитов помещают смесь фибробластов с физиологическим раствором (контроль). Во все три пробирки добавляют по 1,25 мл раствора фибриногена (25 мг/мл), тщательно перемешивают и добавляют раствор тромбина. Немедленно заливают эти смеси в силиконизированные чашки Петри. После полимеризации фибриногена полученные скаффолды извлекают из силиконизированных чашек Петри, перемещают в пластиковые чашки Петри большего диаметра и заливают 5 мл среды (DMEM без телячьей сыворотки). Контрольный скаффолд (без теней эритроцитов) заливают культуральной средой DMEM обогащенной 10% эмбриональной телячьей сыворотки, являющейся источником биологически активных веществ и факторов роста. Помещают чашки Петри со скаффолдами в СO₂ инкубатор с 5% содержанием СО₂ и температурой 37°С.

Количество клеток определяют через сутки с момента формирования скаффолда. Для этого от скаффолдов при помощи шаблона отделяют фрагменты площадью 0,64 см². В полученном фрагменте проводят анализ клеточной составляющей. Для визуализации ядер клеток в структуре скаффолда используют метод флуоресцентной микроскопии, реализуемый на многофункциональном фотометре-имиджере Cytation 5 (BioTek, США). Проводят прижизненное окрашивание ядер клеток в скаффолде с применением флуорохрома Hoechst 3334 (США) обладающим высокой специфичностью к двухцепочечной молекуле ДНК (длина волны возбуждения 377 нм и длина волны эмиссии 447 нм). Окрашивание проводят в соответствии с протоколом производителя. Количество ядер клеток подсчитывают в 10 полях зрения.

Как показали проведенные исследования, количество клеток (фибробластов) в скаффолде в контроле (без теней эритроцитов, но в присутствии в среде телячьей сыворотки), составляет 503 клетки/мм³, а в опыте, в котором тени эритроцитов («замкнутые» с помощью физиологического раствора, без использования глутарового альдегида) содержат биологически активные вещества - 600 клеток /мм³. При этом телячья сыворотка в питательную среду не добавляется. В опыте, в котором тени эритроцитов не содержат биологически активные вещества и в ростовой среде нет телячьей сыворотки, число клеток составляет лишь 322 клетки мм³. Это свидетельствует о том, что тени, «замкнутые» без участия глутарового альдегида, уже через сутки с момента формирования скаффолда, высвобождают биологически активные вещества, что вызывает повышение пролиферативной активности клеток культивируемых в скаффолде. В то же время тени эритроцитов «замкнутые» с участием глутарового альдегида, эти вещества еще не высвобождают, и пролиферативная активность клеток крайне низкая, о чем свидетельствует их количество.

Через неделю после формирования скаффолда количество фибробластов в опыте, где тени эритроцитов создаются с участием глутарового альдегида, значительно возросло и приблизилось к контролю. Количество фибробластов в опыте, в котором используют тени эритроцитов «замкнутые» без глутарового альдегида - ниже значений контроля. Это свидетельствует о том, что созданы условия для постепенного и контролируемого высвобождения биологически активных веществ из теней эритроцитов, что имеет важное значение в тканевой инженерии. Таким образом, проведенные исследования показали высокую эффективность предположенного способа.

Способ пролонгирования высвобождения альбумина из теней эритроцитов, включающий использование в качестве контейнеров теней эритроцитов, получаемых путем гипоосмотического шока нативных эритроцитов и инкубации их в растворе биологически активных веществ с последующим «замыканием» теней эритроцитов в изотонической среде, отличающийся тем, что «замыкание» теней эритроцитов осуществляют путем добавления к ним раствора глутарового альдегида с последующим отмыванием теней от находящегося вне теней глутарового альдегида.

Изобретение относится к области медицины, а именно к инфекционным болезням, терапии, медицинской генетике, и может быть использовано для прогнозирования риска развития рожи.

Способ прогнозирования течения репаративного процесса лапаротомной раны при остром перитоните // 2683312

Изобретение относится к области медицины, а именно к хирургии, и предназначено для прогнозирования течения репаративного процесса лапаротомной раны при остром перитоните.

Способ использования хондральных клеток для скринирования веществ, обладающих противовоспалительной активностью // 2683277

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Раскрыт способ скрининга веществ, обладающих противовоспалительной активностью, включающий смешивание исследуемого вещества с фиксированным количеством человеческого ФНО-альфа и добавление этой смеси к культуре клеток хондрального ряда с последующим измерением экспрессии биологического маркера.

Способ морфологической диагностики степени тяжести преэклампсии // 2682251

Изобретение относится к медицине, а именно к патоморфологии, и может быть использовано для морфологической диагностики степени тяжести преэклампсии. Изобретение представляет собой способ морфологической диагностики степени тяжести преэклампсии путем иммуногистохимического исследования базальной децидуальной оболочки плаценты, отличающийся тем, что в цитотрофобласте определяют индекс экспрессии маркера транскрипции (TFAM) митохондриальной ДНК и при значении индекса экспрессии TFAM от 0,32 до 0,4 у.е.

Способ дифференциальной диагностики посттравматической и идиопатической эпилепсии // 2682175

Изобретение относится к способу дифференциальной диагностики посттравматической и идиопатической эпилепсии, заключающемуся в том, что в сыворотке крови определяют концентрацию нейрегулина-1 и при его значении от 0 до 0,035 нг/мл диагностируют идиопатическую эпилепсию, а при значении показателя выше 0,035 нг/мл - посттравматическую эпилепсию.

Способ лечения хронического эрозивного гастрита, ассоциированного с helicobacter pylori и вирусом эпштейн-барр // 2681919

Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии, и может быть использовано для лечения хронического эрозивного гастрита, ассоциированного с Helicobacter pylori (HP) и вирусом Эпшейн-Барр (ВЭБ).

Способ определения риска прогрессирования кариеса и гингивита у детей и подростков // 2681894

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и может быть использовано для определения степени риска прогрессирования кариеса и гингивита у детей и подростков.

Детекция целевой последовательности путем нанопорового сенсорного обнаружения синтетических зондов // 2681822

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ детекции полинуклеотида или полинуклеотидной последовательности в образце.

Способ прогнозирования перехода средне-тяжёлого течения нумулярной микробной экземы в тяжёлое течение // 2681656

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии и клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для прогнозирования перехода средне-тяжелого течения в тяжелое течение у больных с нумулярной микробной экземой.

Определение пола, жизнеспособности и/или стадий развития птичьих эмбрионов в яйце // 2681536

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно способу контроля инкубации птичьего эмбриона в яйце для получения выборки яиц путем определения пола, стадии развития и/или жизнеспособности птичьего эмбриона.

Частицы фенилэфрина с покрытием и их применение в фармацевтических составах // 2681312

Настоящее изобретение относится к частице с продленным высвобождением, содержащей крахмал, фенилэфрин и сополимер этилакрилата и метилметакрилата, где указанные крахмал, фенилэфрин и сополимер этилакрилата и метилметакрилата покрыты по меньшей мере двумя слоями покрытия, где первый слой покрытия содержит этилцеллюлозу, ацетилтрибутилцитрат и стеарат магния и где второй слой покрытия содержит сополимер этилакрилата и метилметакрилата и водную дисперсию этилцеллюлозы.

Составы лоразепама с замедленным высвобождением // 2678324

Изобретение относится к медицине, в частности к фармацевтической композиции, которая содержит гранулы лоразепама с замедленным высвобождением и с отсроченным замедленным высвобождением.

Лекарственная пленка пролонгированного действия и способ её получения // 2678200

Группа изобретений относится к медицине. Описана лекарственная пленка пролонгированного действия, которая содержит основной компонент в виде 30%-ного водного раствора желатина, вспомогательный и лекарственный компоненты.

Способ доставки биологически активных веществ в скаффолд // 2665155

Изобретение относится к медицине, в частности к способу доставки биологически активных веществ в скаффолд. В качестве контейнеров используют тени эритроцитов, получаемых путем гипоосмотического шока нативных эритроцитов и инкубации их в растворе биологически активных веществ с последующим «замыканием» теней эритроцитов в изотонической среде.

Противопаразитарная композиция для защиты сельскохозяйственных животных // 2659174

Изобретение относится к области ветеринарии и представляет собой противопаразитарную композицию для защиты сельскохозяйственных животных, содержащую соединения из группы авермектинов, полимер и растворитель, отличающуюся тем, что дополнительно содержит ортосиликат полиола, выбранный из ортосиликата ксилита, или ортосиликата глицерина, или ортосиликата меглюмина, при этом композиция содержит соединения из группы авермектинов в инкапсулированном в полимерные микросферы виде и/или в свободном виде, причем компоненты в композиции находятся в определенном соотношении, масс.%.

Способ получения нанокапсул спирулины в каррагинане // 2650966

Изобретение относится в области нанотехнологии и пищевой промышленности. Способ получения нанокапсул спирулины в каррагинане характеризуется тем, что в качестве оболочки нанокапсул используют каррагинан, а в качестве ядра - спирулину, при этом порошок спирулины медленно добавляют в суспензию каррагинана в бензоле в присутствии 0,01 г Е472с в качестве поверхностно-активного вещества, затем перемешивают при 1000 об/мин, после приливают хлороформ, после чего полученную суспензию отфильтровывают и сушат при комнатной температуре, при этом массовое соотношение ядро:оболочка составляет 1:1, или 1:3, или 1:5.

Пролекарства на основе гидрогеля // 2647729

Изобретение относится к способу получения гидрогеля, включающему стадии: (а) обеспечения смеси, содержащей (a-i) реагент основной цепи, где реагент основной цепи имеет молекулярную массу в интервале от 1 до 100 кДа и представляет собой соединение такое, как определено в формуле изобретения, (a-ii) сшивающий реагент, где сшивающий реагент имеет молекулярную массу в интервале от 6 до 40 кДа и представляет собой соединение такое, как определено в формуле изобретения, и (a-iii) первый растворитель и по меньшей мере второй растворитель, где второй растворитель является несмешиваемым с первым растворителем, в массовом соотношении указанного по меньшей мере одного реагента основной цепи и указанного по меньшей мере одного сшивающего реагента в интервале от 1:99 до 99:1; и (b) полимеризации смеси со стадии (а) путем суспензионной полимеризации в гидрогель, причем полимеризацию на стадии (b) инициируют путем добавления основания.

Композиция, состоящая из множества частиц, покрытых кишечнорастворимой оболочкой и имеющих белковую внутреннюю оболочку // 2647462

Изобретение относится к медицине, в частности к композиции, состоящей из множества частиц, способу изготовления композиции и способу лечения желудочно-кишечного расстройства.

Способ получения нанокапсул лекарственных растений, обладающих иммуностимулирующим действием в пектине // 2647437

Изобретение относится в области нанотехнологии, медицины и пищевой промышленности. Способ получения нанокапсул лекарственных растений, обладающих иммуностимулирующим действием, где в качестве оболочки используют высоко- или низкоэтерифицированный яблочный или цитрусовый пектин, а в качестве ядра - настойку эхинацеи, характеризуется тем, что 5 мл настойки эхинацеи добавляют в суспензию высоко- или низкоэтерифицированного яблочного или цитрусового пектина в бензоле в присутствии 0,01 г препарата Е472с в качестве поверхностно-активного вещества при перемешивании 1300 об/мин, полученную суспензию отфильтровывают и сушат при комнатной температуре, при этом соотношение ядро : оболочка составляет 1:1 или 1:3.

Ферментированный молочный продукт, содержащий микрокапсулы, и способ его приготовления // 2644331

Группа изобретений относится к молочной промышленности. Ферментированный молочный продукт содержит ферментированную молочную композицию и микрокапсулы окисляемого активного вещества, оболочка которых состоит из капсулирующей композиции, содержащей альгинат и аскорбил пальмитат.

Способ стабилизации суспензий эритроцитов с инкапсулированным активным ингредиентом и их получение // 2668688

Изобретение относится к способу стабилизации суспензий эритроцитов, заключающих в себе активный ингредиент. Способ для получения стабилизированной суспензии эритроцитов, несущих инкапсулированный активный ингредиент, из содержащих активный ингредиент эритроцитов с восстановленным закрытым состоянием мембранных пор включает инкубацию эритроцитов с восстановленным закрытым состоянием мембранных пор в растворе для инкубации с осмоляльностью не менее 280 мосмоль/кг в течение 30 мин или дольше, причем раствор для инкубации не содержит агентов, вызывающих денатурацию клеточной мембраны эритроцитов, а жидкую среду затем удаляют из инкубированной суспензии и полученные эритроциты суспендируют в растворе, подходящем для введения этой суспензии пациенту путем инъекции, и причем указанный раствор для инкубации не содержит агентов, образующих мостики или поперечные сшивки.