Варианты химозина с улучшенными молокосвертывающими свойствами

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен выделенный вариант полипептида химозина, включающий изменение в положении 117 относительно последовательности бычьего химозина, где указанный вариант имеет активность химозина, а исходный полипептид по меньшей мере на 90% идентичен зрелому полипептиду верблюжьего химозина. Предложен способ получения указанного варианта полипептида химозина путем осуществления изменений в указанных положениях исходного полипептида. Предложены способ приготовления пищевого продукта и способ приготовления кормового продукта с использованием указанного варианта полипептида химозина. Группа изобретений позволяет получить вариант верблюжьего химозина с улучшенными молокосвертывающими свойствами (с более высоким соотношением C/P) по сравнению с верблюжьим химозином. 4 н. и 7 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл., 8 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к вариантам химозина с улучшенными молокосвертывающими свойствами.

Уровень техники

Ферментативная коагуляция молока под действием молокосвертывающих ферментов, таких как химозин и пепсин, представляет собой один из наиболее важных процессов при приготовлении сыров. Ферментативная коагуляция молока представляет собой двухфазный процесс: первую фазу, где протеолитический фермент, химозин или пепсин, атакует κ-казеин, что дает в результате метастабильное состояние структуры казеиновых мицелл, и вторую фазу, где молоко впоследствии коагулирует и образует коагулум.

Химозин (EC 3.4.23.4) и пепсин (EC 3.4.23.1), молокосвертывающие ферменты желудка млекопитающих, представляют собой аспарагинпротеазы, принадлежащие к широкому классу пептидаз.

Когда они продуцируются в клетках слизистой желудка, химозин и пепсин существуют как ферментативно неактивные пре-прохимозин и пре-пепсиноген соответственно. Когда химозин экскретируется, N-конечный пептидный фрагмент, пре-фрагмент (сигнальный пептид) отщепляется с получением прохимозина, содержащего про-фрагмент. Прохимозин находится по существу в неактивной форме фермента, который, однако, становится активным при кислотных условиях, превращаясь в активный химозин посредством аутокаталитического удаления про-фрагмента. Эта активация осуществляется in vivo в полости желудка при соответствующих условиях pH или in vitro при кислотных условиях.

Структурные и функциональные характеристики бычьего, то есть Bos taurus, пре-прохимозина, прохимозина и химозина широко исследуются. Пре-часть молекулы бычьего пре-прохимозина содержит остатков 16 aa и про-часть соответствующего прохимозина имеет длину остатка 42 aa (аминокислоты). Активный бычий химозин содержит 323 aa и представляет собой смесь двух форм, A и B, обе она являются активными.

Химозин продуцируется в природе у некоторых видов млекопитающих, таких как жвачные животные, верблюдовые, козы, буйволы, овцы, свиньи, люди, обезьяны и крысы.

Бычий химозин является коммерчески доступным для молочной промышленности в течение ряда лет.

WO 02/36752A2 (Chr. Hansen) описывает рекомбинантное продуцирование верблюжьего химозина.

Ссылки, перечисленные здесь ниже, могут в настоящем контексте рассматриваться как ссылки, описывающие мутанты химозина:

- Suzuki et al: Site directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218, Lys220 and Asp304 in chymosin, Protein Engineering, vol. 4, January 1990, pages 69-71;

- Suzuki et al: Alteration of catalytic properties of chymosin by site-directed mutagenesis, Protein Engineering, vol. 2, May 1989, pages 563-569;

- van den Brink et al: Increased production of chymosin by glycosylation, Journal of biotechnology, vol. 125, September 2006, pages 304-310;

- Pitts et al: Expression and characterization of chymosin pH optima mutants produced in Tricoderma reesei, Journal of biotechnology, vol. 28, March 1993, pages 69-83;

- M. G. Williams et al: Mutagenesis, biochemical characterization and X-ray structural analysis of point mutants of bovine chymosin, Protein engineering design and selection, vol. 10, September 1997, pages 991-997;

- Strop et al: Engineering enzyme subsite specificity: preparation, kinetic characterization, and x-ray analysis at 2.0 ANG resolution of Vallllphe site mutated calf chymosin, Biochemistry, vol. 29, October 1990, pages 9863-9871;

- Supannee et al: Site-specific mutations of calf chymosin B which influence milk-clotting activity, Food Chemistry, vol. 62, June 1998, pages 133-139;

- Zhang et al: Functional implications of disulfide bond, Cys45-Cys50, in recombinant prochymosin, Biochimica et biophysica acta, vol. 1343, December 1997, pages 278-286.

Ни одна из литературных ссылок, рассмотренных выше, не описывает прямо и однозначно ни одного из мутантов/вариантов химозина, как описано/заявляется ниже в настоящем документе.

Сущность изобретения

Проблема, которая должна решаться с помощью настоящего изобретения, заключается в получении вариантов химозина с улучшенными молокосвертывающими свойствами.

Как обсуждается в рабочих примерах в настоящем документе, авторы настоящего изобретения идентифицировали ряд улучшенных вариантов верблюжьего (см. пример 6 в настоящем документе) и бычьего (см. пример 7 в настоящем документе) химозина.

На основе сравнительного анализа верблюжьего и бычьего вариантов авторы настоящего изобретения идентифицировали ряд дополнительных положений аминокислот, которые являются важными в настоящем документе в том смысле, что посредством получения варианта в одном или нескольких из этих положений можно получить улучшенный вариант химозина (см. пример 8 в настоящем документе).

Как известно из литературы, различные последовательности природного полипептида химозина дикого типа, полученного от различных видов млекопитающих (таких, например, как жвачные животные, верблюдовые, овцы, свиньи или крысы), имеют относительно высокое сходство/идентичность последовательностей. На фигуре 1 в настоящем документе это иллюстрируется посредством выравнивания последовательностей релевантных для настоящего документа различных последовательностей химозина.

С учетом этого относительно близкого соотношения последовательностей предполагается, что 3D структуры различных природных химозинов дикого типа также являются относительно похожими друг на друга.

В настоящем контексте полученный природный химозин дикого типа (такой как бычий химозин или верблюжий химозин) в настоящем документе может представлять собой пример исходного полипептида, то есть исходного полипептида, в который вносят изменения для получения варианта полипептида химозина по настоящему изобретению.

Не ограничиваясь теорией, предполагается, что обсуждаемые в настоящем документе родственные положения аминокислот химозина имеют общее значение для любого релевантного для настоящего документа фермента химозина, представляющего интерес (например, для химозинов, например, жвачных животных, верблюдовых, овец, свиней, крыс и тому подобное), в том смысле, что при получении варианта в одном или нескольких из этих положений можно получить улучшенный в целом вариант химозина (например, улучшенный вариант химозина жвачных животных, верблюдовых, овец, свиней или крыс).

Как обсуждается в настоящем документе, в качестве эталонной последовательности для определения положения аминокислоты исходного полипептида химозина, представляющего интерес (например, верблюдовых, овец, жвачных животных и тому подобное), в настоящем документе используют общеизвестную последовательность препрохимозина бычьего химозина B (Genbank accession number P00794; описано в настоящем документе как SEQ ID NO: 1).

Препрохимозин бычьего химозина B SEQ ID NO: 1 может альтернативно называться в настоящем документе бычий (Bos bovis) химозин B или просто бычий химозин. Последовательность показана также на фигуре 1 в настоящем документе.

Другая релевантная для настоящего документа последовательность химозина представляет собой общеизвестную последовательность химозина Camelius dromedarius, в настоящем документе SEQ ID NO: 2. Она может альтернативно называться в настоящем документе верблюжьим химозином. Эта последовательность показана также на фигуре 1 в настоящем документе.

В настоящем контексте считается, что исходный полипептид химозина (например, от овец или крыс), который имеет, по меньшей мере, 65% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), может рассматриваться в настоящем документе как достаточно родственный структурно, например, бычьему или верблюжьему химозину, для улучшения посредством получения варианта любых из положений аминокислот, как описано в настоящем документе.

Соответственно, первый аспект настоящего изобретения относится к способу получения варианта выделенного полипептида химозина, включающему стадии:

(a): осуществление изменений в одном или нескольких положениях исходного полипептида, имеющего активность химозина, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 и 353; и

(b): продуцирования и выделения измененного полипептида со стадии (a) с получением при этом выделенного варианта полипептида химозина, где вариант имеет активность химозина;

и где

(i): положение аминокислоты исходного полипептида определяют посредством выравнивания последовательностей исходного полипептида с полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), то есть полипептид SEQ ID NO: 1 используют для определения соответствующей последовательности аминокислот в исходном полипептиде; и

(ii): исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 65% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), который содержит аминокислоты от положения аминокислоты 59 до положения аминокислоты 381 SEQ ID NO: 1.

Как известно из литературы, специалист в данной области может, основываясь на своих обычных общих знаниях, рутинным образом получать и очищать химозин и варианты химозина.

Говоря другими словами, когда специалист в данной области обладает релевантным для настоящего документа исходным полипептидом, имеющим активность химозина, представляющего интерес (например, от жвачных животных, верблюдовых, овец, свиней или крыс), рутинной работой для специалиста в данной области является получение варианта такого исходного химозина, представляющего интерес.

Второй аспект настоящего изобретения относится к выделенному варианту полипептида химозина, полученного с помощью способа по первому аспекту, или к любым релевантным для настоящего документа его вариантам осуществления.

Термин "полученный" по отношению ко второму аспекту выше должен пониматься таким образом, что выделенный вариант полипептида химозина получают с помощью способа первого аспекта или любых его релевантных для настоящего документа вариантов осуществления.

Соответственно, термин "полученный" по отношению ко второму аспекту не может пониматься как тот, который может, в принципе, быть получен.

Как обсуждается в настоящем документе в рабочих примерах в настоящем документе, получают варианты с использованием полипептида SEQ ID NO: 1 (бычий) в качестве исходного полипептида; такой вариант может называться в настоящем документе вариантами бычьего химозина.

Соответственно, третий аспект настоящего изобретения относится к выделенному варианту полипептида химозина, содержащему:

(a): изменение в одном или нескольких положениях исходного полипептида, имеющего активность химозина, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 и 353; и

(b): где вариант имеет активность химозина;

и где

(i): положение аминокислоты исходного полипептида определяют посредством выравнивания последовательностей исходного полипептида с полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), то есть полипептид SEQ ID NO: 1 используют для определения соответствующей последовательности аминокислот в исходном полипептиде; и

(ii): исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), который содержит аминокислоты от положения аминокислоты 59 до положения аминокислоты 381 SEQ ID NO: 1; и

(iii): выделенный вариант полипептида имеет менее чем 100% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином).

Как обсуждается в настоящем документе в рабочих примерах в настоящем документе, получают варианты с использованием полипептида SEQ ID NO: 2 (верблюжьего химозина) в качестве исходного полипептида; такой вариант может в настоящем документе называться вариантом верблюжьего химозина.

Соответственно, четвертый аспект настоящего изобретения относится к выделенному варианту полипептида химозина, содержащему:

(a): изменение в одном или нескольких положениях исходного полипептида, имеющего активность химозина, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 и 353; и

(b): где вариант имеет активность химозина;

и где

(i): положение аминокислоты исходного полипептида определяют посредством выравнивания последовательностей исходного полипептида с полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), то есть полипептид SEQ ID NO: 1 используют для определения соответствующей последовательности аминокислот в исходном полипептиде; и

(ii): исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином), который содержит аминокислоты от положения аминокислоты 59 до положения аминокислоты 381 SEQ ID NO: 2; и

(iii): выделенный вариант полипептида имеет менее чем 100% идентичность последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином).

Выделенный вариант полипептида химозина, как описано в настоящем документе, может использоваться в соответствии с литературными данными, например, для приготовления пищевого или кормового продукта, представляющего интерес (такого, например, как продукт на основе молока, представляющий интерес, который, например, может представлять собой сырный продукт).

Соответственно, пятый аспект настоящего изобретения относится к способу приготовления пищевого или кормового продукта, включающему добавление эффективного количества выделенного варианта полипептида химозина, как описано в настоящем документе, в пищевой или кормовой ингредиент (ингредиенты) и осуществление дополнительных стадий приготовления с получением пищевого или кормового продукта.

Вариант осуществления настоящего изобретения описан ниже в качестве только лишь примеров.

Определения

Все определения терминов, релевантных для настоящего документа, находятся в соответствии с тем, что понималось бы специалистом в данной области по отношению к релевантному для настоящего документа техническому контексту.

Термин "химозин" относится к ферменту класса EC 3.4.23.4. Химозин имеет высокую специфичность, и он сворачивает молоко посредством расщепления одинарной связи 105-Ser-Phe-|-Met-Ala-108 в каппа-цепи казеина. Альтернативное наименование, используемое в данной области, представляет собой «реннин».

Термин "активность химозина" относится к активности химозина для фермента химозина, как понимается специалистом в настоящем контексте.

Специалист в данной области знает, как определить релевантную для настоящего документа активность химозина. В рабочем примере 4 в настоящем документе предлагается пример стандартного способа определения удельной активности химозина, альтернативно называемой активностью свертывания или молокосвертывающей активностью.

В рабочем примере 5 в настоящем документе предлагается пример стандартного способа определения протеолитической активности.

Как известно из литературы, релевантное для настоящего документа так называемое отношение C/P определяется посредством деления удельной активности свертывания (C) на протеолитическую активность (P).

Как известно из литературы, более высокое отношение C/P означает, как правило, что потери белка во время, например, приготовления сыра из-за неспецифичной деградации белка уменьшается, то есть выход сыра улучшается, и что развитие горького вкуса у сыра во время его созревания уменьшается.

Термин "выделенный вариант" означает вариант, который модифицируется руками человека. В одном из аспектов вариант является чистым, по меньшей мере, на 1%, например, чистым, по меньшей мере, на 5%, чистым, по меньшей мере, на 10%, чистым, по меньшей мере, на 20%, чистым, по меньшей мере, на 40%, чистым, по меньшей мере, на 60%, чистым, по меньшей мере, на 80% и чистым, по меньшей мере, на 90%, как определено с помощью SDS PAGE.

Термин "зрелый полипептид" означает пептид в его конечной форме после трансляции и любых посттрансляционных модификаций, таких как N-конечный процессинг, C-конечный процессинг, гликозилирование, фосфорилирование и тому подобное. В настоящем контексте релевантный для настоящего документа зрелый полипептид химозина можно рассматривать как активную последовательность полипептида химозина, то есть без последовательностей пре-части и/или про-части. Релевантные для настоящего документа примеры зрелого полипептида представляют собой, например, зрелый полипептид SEQ ID NO: 1 (бычий химозин), который содержит аминокислоты от положения аминокислоты 59 до положения аминокислоты 381 SEQ ID NO: 1, или зрелый полипептид SEQ ID NO: 2 (верблюжий химозин), который содержит аминокислоты от положения аминокислоты 59 до положения аминокислоты 381 SEQ ID NO: 2.

Термин "исходный" или "исходный полипептид, имеющий активность химозина" означает полипептид, в котором осуществляют изменения для получения вариантов ферментов по настоящему изобретению. «Исходный» может представлять собой встречающийся в природе полипептид (дикого типа) или его вариант.

Термин "идентичность последовательности" относится к соотносимости между двумя последовательностями аминокислот или между двумя последовательностями нуклеотидов.

Для целей настоящего изобретения уровень идентичности последовательностей между двумя последовательностями аминокислот определяют с использованием алгоритма Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453), как осуществляется в программе Needle пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16:276-277), предпочтительно версии 3.0.0 или более поздней. Используемые необязательные параметры представляют собой штраф за внесение делеции в выравнивание 10, штраф за продолжение делеции 0,5 и подстановочную матрицу EBLOSUM62 (EMBOSS version of BLOSUM62). Результат Needle, отмечаемый как "самая обширная идентичность" (полученная с использованием опции -nobrief) используют как процент идентичности и вычисляют следующим образом:

(Идентичные остатки × 100)/(длина выравнивания последовательностей - общее количество разрывов при выравнивании последовательностей).

Для целей настоящего изобретения уровень идентичности последовательности между двумя последовательностями деоксирибонуклеотидов определяют с использованием алгоритма Needleman-Wunsch (Needleman и Wunsch, 1970, выше), как осуществляется для программы Needle из пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, выше), предпочтительно версии 3.0.0 или более поздней. Необязательные используемые параметры представляют собой штраф за внесение делеции в выравнивание 10, штраф за продолжение делеции 0,5 и подстановочную матрицу EDNAFULL (EMBOSS version of NCBI NUC4.4). Выходные данные Needle, отмечаемые как "самая обширная идентичность" (полученная с использованием опции - nobrief), используют как процент идентичности и вычисляют следующим образом:

(Идентичные деоксирибонуклеотиды × 100)/(длина выравнивания последовательностей - общее количество разрывов при выравнивании последовательностей).

Термин "вариант" означает пептид, имеющий активность химозина, содержащий изменение, например, замещение, инсерцию, и/или делецию, в одном или нескольких положениях. «Замещение» означает замену аминокислоты, занимающей некоторое положение, другой аминокислотой; «делеция» означает удаление аминокислоты, занимающей некоторое положение; и «инсерция» означает добавление 1-3 аминокислот рядом с аминокислотой, занимающей некоторое положение.

Аминокислота может представлять собой природные или искусственные аминокислоты, например, замещение, например, в частности, D-изомерами (или D-формами), например, D-аланина могло бы быть возможным теоретически.

Термин «пептид химозина дикого типа» означает химозин, экспрессируемый встречающимся в природе организмом, например, млекопитающим (например, верблюдицей или коровой), встречающимся в природе.

Чертежи

Фигура 1: выравнивание релевантных для настоящего документа различных последовательностей химозина. Показанный "Bos_bovis_chymosin_B" в настоящем документе представляет собой бычий химозин SEQ ID NO: 1, и показанный "Camelus_dromedarius" в настоящем документе представляет собой верблюжий химозин SEQ ID NO: 2. Используя бычий химозин SEQ ID NO: 1 в качестве эталонной последовательности, как описано в настоящем документе, можно, например, увидеть, что бычий химозин имеет "V" в положении 10, а верблюжий химозин имеет "A" в этом же положении 10. Можно, например, также увидеть, что жвачные животные/крысы имеют "Q" в положении 352, а верблюд/C._bactrianus имеет "E" в том же положении 352.

Относительно последовательностей химозина, показанных на фигуре 1, овца имеет 94,5% идентичность последовательностей с бычьей последовательностью SEQ ID NO: 1; C._bactrianus имеет 83,2% идентичность последовательностей с бычьей последовательностью SEQ ID NO: 1; Camelus_dromedarius (верблюжий химозин SEQ ID NO: 2) имеет 84% идентичность последовательностей с бычьей последовательностью SEQ ID NO: 1; свинья имеет 80,3% идентичность последовательностей с бычьей последовательностью SEQ ID NO: 1, и крыса имеет 71,9% идентичность последовательностей с бычьей последовательностью SEQ ID NO: 1.

Как понятно специалисту в данной области в настоящем контексте, релевантные для настоящего документа проценты идентичности последовательностей для последовательностей зрелых полипептидов, например для химозина овцы, C._bactrianus, верблюда, свиньи или крысы со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином то есть положения аминокислот от 59 до 381 SEQ ID NO: 1), являются относительно сходными с рассмотренными выше процентами идентичности последовательностей.

Фигура 2: 3D структура бычьего химозина. 3D структура является общедоступной. В качестве примера показано, где именно в бычьем химозине присутствуют положения аминокислот 296 и 294.

Подробное описание изобретения

Определение положения аминокислот химозина, представляющего интерес

Как обсуждается выше в качестве эталонной последовательности для определения положения аминокислоты релевантного для настоящего документа полипептида химозина, представляющего интерес (например, верблюда, овцы, жвачных животных и тому подобного), в настоящем документе используют общеизвестную последовательность бычьего химозина, описанную в настоящем документе как SEQ ID NO: 1.

Для целей настоящего изобретения полипептид, описанный как SEQ ID NO: 1 (бычий химозин), используют для определения соответствующего остатка аминокислоты в другом полипептиде химозина. Последовательность аминокислот другого полипептида химозина выравнивается с полипептидом, описанным как SEQ ID NO: 1, и на основании выравнивания последовательностей определяют количество положений аминокислот, соответствующих любому остатку аминокислоты в полипептиде, описанном как SEQ ID NO: 1, с использованием алгоритма ClustalW, как описано в рабочем примере 1 в настоящем документе.

Идентификация соответствующего остатка аминокислоты в другом полипептиде химозина может быть подтверждена с использованием алгоритма Needleman-Wunsch (Needleman и Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453), как осуществляется в программе Needle из пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16:276-277), предпочтительно версии 3.0.0 или более поздней.

Основываясь на приведенных выше хорошо известных компьютерных программах, для специалиста в данной области является рутинной работой определение положения аминокислоты релевантного для настоящего документа полипептида химозина, представляющего интерес (например, верблюда, овцы, жвачных животных и тому подобного).

На фигуре 1 в настоящем документе показан пример выравнивания последовательностей.

Только в качестве примера на фигуре 1 можно, например, увидеть, что используемая в настоящем документе эталонная бычья последовательность SEQ ID NO: 1 имеет "G" в положении 50, и последовательность "Camelus_dromedarius" (SEQ ID NO: 2 в настоящем документе) имеет "A" в этом же положении 50.

Номенклатура вариантов

При описании вариантов настоящего изобретения номенклатура, описанная ниже, адаптируется для простоты упоминания. Используют принятые IUPAC однобуквенные или трехбуквенные сокращенные наименования аминокислот.

Конкретные варианты, обсуждаемые в настоящем разделе "номенклатура" ниже, могут не представлять собой релевантные для настоящего документа варианты настоящего изобретения, то есть раздел "номенклатура" предназначен просто для описания релевантной для настоящего документа используемой номенклатуры как таковой.

Замещения. Для замещения аминокислот используют следующую номенклатуру: исходная аминокислота, положение, замещенная аминокислота. Соответственно, теоретическое замещение треонина аланином в положении 226 обозначается как "Thr226Ala" или "T226A". Множество мутаций разделяются знаками плюс ("+"), например, "Gly205Arg + Ser411Phe" или "G205R + S411F", что представляет собой замещения в положениях 205 и 411 глицина (G) аргинином (R) и серином (S) с фенилаланином (F) соответственно. Замещение, обозначенное, например, "226A", относится к замещению исходной аминокислоты (например, T, Q, S или другой исходной аминокислоты) аланином в положении 226.

Делеции. Для делеций аминокислоты используют следующую номенклатуру: исходная аминокислота, положение, *. Соответственно, делеция глицина в положении 195 обозначается как "Glyl95*" или "G195*". Множество делеций разделяются с помощью знаков плюс ("+"), например, "Glyl95* + Ser411*" или "G195* + S411*".

Инсерции. Для инсерции аминокислоты используют следующую номенклатуру: исходная аминокислота, положение, исходная аминокислота, вставленная аминокислота. Соответственно, инсерция лизина после глицина в положении 195 обозначается как "Glyl95Glylys" или "G195GK". Инсерция множества аминокислот обозначается (исходная аминокислота, положение, исходная аминокислота, вставленная аминокислота № 1, вставленная аминокислота № 2; и тому подобное). Например, инсерция лизина и аланина после глицина в положении 195 обозначается "Glyl95GlylysAla" или "G195GKA".

В таких случаях вставленные остатки аминокислоты нумеруются посредством добавления строчных букв в номер положения остатка аминокислоты перед вставленным остатком (остатками) аминокислоты. В указанном выше примере, таким образом, последовательность должна представлять собой:

Сходный	Вариант
195	195 195a 195b
G	G-K-A

Множественные изменения. Варианты, содержащие множественные изменения, разделяются с помощью знаков плюс ("+"): например, "Argl70Tyr+Glyl95Glu" или "R170Y+G195E" представляет собой замещение тирозина и глутаминовой кислоты вместо аргинина и глицина в положениях 170 и 195 соответственно.

Различные замещения. Когда в некоторые положения могут вводиться различные замещения, эти различные замещения разделяются запятой: например, "Arg170Tyr,Glu" или "R170Y,E" представляет замещение аргинина тирозином или глутаминовой кислотой в положении 170. Таким образом, "Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala" или "Y167G,A+R170G,A" обозначает следующие варианты:

"Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Gly" и "Tyr167Ala+Arg170Ala".

Способ получения выделенного варианта полипептида химозина

Как обсуждается выше, как известно в данной области, специалист на основе своих обычных общих знаний может рутинно получить и очистить химозин и варианты химозина.

Говоря другими словами, после того как специалист в данной области будет обладать релевантным для настоящего документа исходным полипептидом, имеющим активность химозина, представляющего интерес (например, жвачных животных, верблюдовых, овец, свиней или крыс), для специалиста в данной области является рутинной работой получение варианта такого исходного химозина, представляющего интерес.

Пример способа, пригодного для использования при получении и выделении химозина (варианта или исходного), может представлять собой хорошо известную технологию, например, технологию на основе грибкового рекомбинантного экспрессирования/продуцирования, как описано, например, в WO 02/36752A2 (Chr. Hansen).

Для специалиста в данной области также является рутинной работой осуществление изменений в одном или нескольких положениях в исходном полипептиде, имеющем активность химозина, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты.

Как известно специалисту в данной области, это может сделать, например, с помощью так называемого сайт-направленного мутагенеза и технологии на основе рекомбинантного экспрессирования/продуцирования.

Также рутинной работой для специалиста в данной области является определение того, имеет ли релевантный для настоящего документа исходный полипептид (например, верблюжий или бычий химозин дикого типа) и/или релевантный для настоящего документа вариант активность химозина или нет.

Как известно из литературы, активность химозина может быть определена с помощью так называемого отношения C/P, которое определяется посредством деления удельной активности свертывания (C) на протеолитическую активность (P).

Как известно из литературы, более высокое отношение C/P означает, как правило, что потери белка в течение, например, приготовления сыра из-за неспецифичной деградации белка уменьшаются, то есть выход сыра улучается, и что развитие горького вкуса в сыре во время созревания уменьшается.

В рабочем примере 4 в настоящем документе описывается соответствующий способ для определения удельной активности свертывания (C), а в рабочем примере 5 в настоящем документе описывается соответствующий способ определения протеолитической активности (P).

Предпочтительно выделенный вариант полипептида химозина, как описано в настоящем документе, представляет собой вариант, где вариант имеет активность химозина, дающую более высокое отношение C/P, по сравнению с отношением C/P бычьего химозина, содержащего зрелый полипептид с последовательностью SEQ ID NO: 1, в настоящем документе.

Предпочтительно выделенный вариант полипептида химозина, как описано в настоящем документе, представляет собой вариант, где вариант имеет активность химозина, дающую более высокое отношение C/P по сравнению с отношением C/P верблюжьего химозина, содержащего зрелый полипептид с последовательностью SEQ ID NO: 2, в настоящем документе.

Более предпочтительно выделенный вариант полипептида химозина, как описано в настоящем документе, представляет собой вариант, где вариант имеет

- активность химозина, дающую более высокое отношение C/P по сравнению с отношением C/P бычьего химозина, содержащего зрелый полипептид с последовательностью SEQ ID NO: 1, в настоящем документе; и

- активность химозина, дающую более высокое отношение C/P по сравнению с отношением C/P верблюжьего химозина, содержащего зрелый полипептид с последовательностью SEQ ID NO: 2, в настоящем документе.

Как обсуждается выше, в качестве эталонной последовательности для определения положения аминокислоты релевантного для настоящего документа полипептида химозина, представляющего интерес (например, верблюдовых, овец, жвачных животных и тому подобного), в настоящем документе используют общеизвестную последовательность бычьего химозина, описанную в настоящем документе как SEQ ID NO: 1.

Как обсуждается выше, основываясь, например, на компьютерных программах выравнивания последовательностей для последовательностей, обсуждаемых в настоящем документе, для специалиста в данной области является рутинной работой определение положения аминокислоты, релевантной для настоящего документа полипептида химозина, релевантного для настоящего документа, представляющего интерес (например, верблюдовых, овец, жвачных животных и тому подобного).

Термин "исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 65% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычий химозин)", например, способа первого аспекта, в настоящем документе может рассматриваться как относящийся к ограничению на основе последовательности исходного полипептида химозина, используемого для получения его варианта, релевантного для настоящего документа.

Говоря другими словами, зрелый исходный полипептид химозина (например, овцы или свиньи), который имеет, по меньшей мере, 65% идентичность последовательностей со зрелым бычьим химозином, как считается, является достаточно структурно идентичным, например, бычьему или верблюжьему химозину, чтобы быть релевантным для настоящего документа, то есть в настоящем контексте считается, что зрелый исходный полипептид химозина (например, от овцы или крысы), который имеет, по меньшей мере, 65% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), может рассматриваться в настоящем документе как достаточно структурно родственный, например, бычьему или верблюжьему химозину, чтобы его можно было улучшать посредством получения варианта в любом положении аминокислот, как описано в настоящем документе.

Полипептид верблюжьего химозина SEQ ID NO: 2 имеет 84% идентичность последовательностей с бычьим полипептидом SEQ ID NO: 1 (то есть с полной последовательностью SEQ ID NO: 1 от положения 1 до 381, которая включает пре и про последовательность).

Как понятно специалисту в данной области, в настоящем контексте релевантный для настоящего документа исходный полипептид, имеющий активность химозина, может уже представлять собой, например, вариант, например, соответствующего химозина дикого типа.

Например, вариант верблюжьего химозина, например, с 5-10 изменениями (например, замещениями), по сравнению с полипептидом верблюжьего химозина дикого типа SEQ ID NO: 2 по-прежнему будет исходным полипептидом, который имеет, по меньшей мере, 65% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим), как требуется, например, в первом аспекте в настоящем документе.

Говоря другими словами, релевантный для настоящего документа выделенный вариант полипептида химозина может содержать изменения (например, замещения) в положении ином, чем положение, например, первого аспекта в настоящем документе.

По отношению к последовательностям химозина, показанным на фигуре 1 в настоящем документе, овца имеет 94,5% идентичность последовательностей с бычьей последовательностью SEQ ID NO: 1; C._bactrianus имеет 83,2% идентичность последовательностей с бычьей последовательностью SEQ ID NO: 1; свинья имеет 80,3% идентичность последовательностей с бычьей последовательностью SEQ ID NO: 1, и крыса имеет 71,9% идентичность последовательности с бычьей последовательностью SEQ ID NO: 1.

Как понятно специалисту в данной области в настоящем контексте, релевантные для настоящего документа проценты идентичности последовательностей, например, зрелого химозина овцы, C._bactrianus, верблюда, свиньи или крысы со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином; то есть положения 59-381 аминокислот SEQ ID NO: 1) являются относительно подобными рассмотренным выше процентам идентичности последовательностей.

Предпочтительные варианты

Как обсуждается выше, например, первый аспект относится к выделенному варианту полипептида химозина, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 и 353.

Предпочтительный вариант осуществления относится к выделенному варианту полипептида химозина, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 и 353.

Может быть предпочтительным, чтобы, по меньшей мере, одно изменение представляло собой замещение, то есть релевантный для настоящего документа предпочтительный вариант осуществления относится к выделенному варианту полипептида химозина, где изменение включает замещение в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 и 353.

Предпочтительно выделенный вариант полипептида химозина представляет собой вариант, где изменение включает замещение в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 и 353.

Предпочтительно замещение представляет собой такое замещение, где замещение представляет собой 117N, 134Q, 141E, 143F, 156V, 2411, 279M, 2801, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 3111, 325M, 350N, 352L, 352Q, 353L или 353Q.

Как понятно специалисту в данной области в настоящем контексте, если исходный полипептид химозина уже имеет, например, "V" в положении 156, тогда нет смысла говорить об осуществлении замещения 156V для этого конкретного исходного полипептида химозина. Как можно увидеть на фигуре 1 в настоящем документе, химозин крысы дикого типа имеет "V" в положении 156; замещение 156V может рассматриваться в настоящем документе как иррелевантное для конкретной последовательности полипептида химозина крыса на фигуре 1.

Предпочтительно замещение представляет собой такое замещение, где замещение представляет собой 134Q, 141E, 143F, 2801, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 3111, 352L, 352Q, 353L или 353Q.

Предпочтительно замещение представляет собой такое замещение, где замещение представляет собой D117N, H134Q, Q141E, I143F, D156V, V241I, V279M, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, D325M, H350N, Q352L, E352L, E352Q, K353L или K353Q.

Как понятно специалисту в данной области в настоящем контексте, если исходный полипептид химозина не имеет, например, "D" в положении 156, тогда нет смысла говорить об осуществлении замещения D156V для этого конкретного исходного полипептида химозина. Как можно увидеть на фигуре 1 в настоящем документе, химозин крысы дикого типа имеет "V" в положении 156; замещение D156V может, следовательно, рассматриваться в настоящем документе как иррелевантное для конкретной последовательности полипептида химозина крысы на фигуре 1.

В предпочтительном варианте осуществления замещение представляет собой такое замещение, где замещение представляет собой H134Q, Q141E, I143F, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, Q352L, E352L, E352Q, K353L или K353Q.

В предпочтительном варианте осуществления замещение представляет собой такое замещение, где замещение представляет собой:

F281V + V306I + I321L;

H134Q + I154L + D216S;

V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;

D156V + G309D + M314L + V317I;

H134Q + L280I + G309W;

R119Q + D156V + V375L;

Y79S + R119S + H204R;

Y79S + H 134Q + Y365F + V375L;

Y194I + R213Q + G309D;

Y79S + D117N + I321L;

Y185F + D325M + E352Q;

Y79S + L224V + L311I;

S132F + H134Q + M200I + M215L + G221E;

F281V + G309W + S331Y + D337E;

D156V + G309D + M314L + V317I;

G128D + L188I + Y326F;

R119S + V241I + L280I + L311I +D325M;

R119Q + S284T + T297S + V306I + G309W

K279V + V281F;

Q298E + Q300R;

H350N + Q352E + K353L;

D307N + D309G или

Q141 E + I143F.

Предпочтительный исходный полипептид, имеющий активность химозина

Предпочтительно исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 70% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), более предпочтительно исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 75% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином).

Просто в качестве примера соответствующий, релевантный для настоящего документа исходный полипептид может представлять собой, например, бычий химозин A, как известно в данной области, бычий химозин A может иметь только единственное отличие в аминокислотах по сравнению с бычьим химозином B SEQ ID NO: 1 в настоящем документе.

Как обсуждается выше в рабочих примерах в настоящем документе, получают варианты с использованием полипептида SEQ ID NO: 1 (бычьего) в качестве исходного полипептида; такой вариант может называться в настоящем документе «вариантами бычьего химозина».

Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), более предпочтительно исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 95% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), и еще более предпочтительно исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 97% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином). Может быть предпочтительным, чтобы исходный полипептид представлял собой зрелый полипептид SEQ ID NO: 1 (бычий химозин).

Как понятно специалисту в данной области в настоящем контексте, релевантный для настоящего документа исходный полипептид, имеющий активность химозина, может уже представлять собой, например, вариант, например, соответствующего химозина дикого типа.

Например, вариант бычьего химозина, например, с 5-10 изменениями (например, замещениями) по сравнению со зрелым полипептидом бычьего химозина дикого типа SEQ ID NO: 1 по-прежнему будет представлять собой исходный полипептид, который имеет, по меньшей мере, 95% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином).

Зрелый полипептид SEQ ID NO: 1 (бычий) имеет 323 аминокислоты в длину соответственно, вариант бычьего химозина, например, с 25 замещениями аминокислот по сравнению со зрелым полипептидом бычьего химозина дикого типа SEQ ID NO: 1 не будет представлять собой исходный полипептид, который имеет, по меньшей мере, 95% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином).

Говоря другими словами, и в целом релевантный для настоящего документа выделенный вариант полипептида химозина может содержать изменения (например, замещения) в положениях иных, чем положения, например, первого аспекта в настоящем документе.

Как обсуждается выше в рабочих примерах в настоящем документе, получают варианты с использованием полипептида SEQ ID NO: 2 (верблюжьего) в качестве исходного полипептида; такой вариант может называться в настоящем документе вариантом верблюжьего химозина.

Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином), более предпочтительно исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 95% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином), и еще более предпочтительно исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 97% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином). Может быть предпочтительным, чтобы исходный полипептид представлял собой зрелый полипептид SEQ ID NO: 2 (верблюжий химозин).

Как понятно специалисту в данной области в настоящем контексте, исходный полипептид, который имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим), по-прежнему находится в пределах требований идентичности последовательностей по отношению к SEQ ID NO: 1 (бычьему) пункта (ii) первого аспекта в настоящем документе; то есть он будет представлять собой исходный полипептид, который имеет, по меньшей мере, 65% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином).

Выделенный вариант бычьего химозина

Как обсуждается выше в рабочих примерах в настоящем документе, получают варианты с использованием полипептида SEQ ID NO: 1 (бычьего) в качестве исходного полипептида; такой вариант может называться в настоящем документе «вариантом бычьего химозина».

Как обсуждается выше, третий аспект, соответственно, относится к выделенному варианту полипептида химозина, содержащему:

(a): изменение в одном или нескольких положениях исходного полипептида, имеющего активность химозина, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 и 353; и

(b): где вариант имеет активность химозина;

и где

(i): положение аминокислоты исходного полипептида определяют посредством выравнивания последовательностей исходного полипептида с полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), то есть полипептид SEQ ID NO: 1 используют для определения соответствующей последовательности аминокислот в исходном полипептиде; и

(ii): исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), который содержит аминокислоты от положения аминокислоты 59 до положения аминокислоты 381 SEQ ID NO: 1; и

(iii): выделенный вариант полипептида имеет менее чем 100% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином).

Описанные выше определения и предпочтительные варианты осуществления являются также релевантными для этого аспекта.

Предпочтительно выделенный вариант полипептида бычьего химозина, как описано в настоящем документе, представляет собой вариант, где вариант имеет активность химозина, дающую более высокое отношение C/P по сравнению с отношением C/P бычьего химозина, содержащего зрелый полипептид SEQ ID NO: 1.

В предпочтительном варианте осуществления исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 92% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), более предпочтительно исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 95% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), и еще более предпочтительно исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 97% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином).

Как понятно специалисту в данной области в настоящем контексте, выделенный вариант химозина может содержать изменения (например, замещения) в положениях аминокислот иных, чем приведено выше.

Например, вариант бычьего химозина, например, с 5-10 изменениями (например, замещениями) по сравнению с полипептидом бычьего химозина дикого типа SEQ ID NO: 1 будет по-прежнему представлять собой исходный полипептид, который имеет, по меньшей мере, 95% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином).

Может быть предпочтительным, чтобы выделенный вариант бычьего химозина содержал менее 30 изменений аминокислот (например, замещений) по сравнению со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), или может быть предпочтительным, чтобы выделенный вариант бычьего химозина содержал менее 20 изменений аминокислот (например, замещений) по сравнению со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), или может быть предпочтительным, чтобы выделенный вариант бычьего химозина содержал менее 10 изменений аминокислот (например, замещений) по сравнению со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), или может быть предпочтительным, чтобы выделенный вариант бычьего химозина содержал менее 5 изменений аминокислот (например, замещений) по сравнению со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином).

Как понятно специалисту в данной области в настоящем контексте, термин "выделенный вариант полипептида имеет менее чем 100% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином)" пункта (iii) выше относится к тому, что описанный в настоящем документе выделенный вариант бычьего химозина, разумеется, не должен содержать последовательность полипептидов, которая является на 100% идентичной общеизвестной последовательности бычьего химозина дикого типа SEQ ID NO: 1.

Предпочтительный вариант осуществления относится к выделенному варианту полипептида бычьего химозина, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 и 353.

Может быть предпочтительным, чтобы, по меньшей мере, одно изменение представляло собой замещение, то есть релевантный для настоящего документа предпочтительный вариант осуществления относится к выделенному варианту полипептида химозина, где изменение включает замещение в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 и 353.

Предпочтительно выделенный вариант полипептида химозина представляет собой вариант, где изменение включает замещение в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 и 353.

Предпочтительно замещение представляет собой такое замещение, где замещение представляет собой 117N, 134Q, 141E, 143F, 156V, 2411, 279M, 2801, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 3111, 325M, 350N, 352L, 352Q, 353L или 353Q.

Предпочтительно замещение представляет собой такое замещение, где замещение представляет собой 134Q, 141E, 143F, 2801, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 3111, 352L, 352Q, 353L или 353Q.

Предпочтительно замещение представляет собой такое замещение, где замещение представляет собой D117N, H134Q, Q141E, I143F, D156V, V241I, V279M, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, D325M, H350N, Q352L, E352L, E352Q, K353L или K353Q.

В предпочтительном варианте осуществления замещение представляет собой такое замещение, где замещение представляет собой:

F281V + V306I + I321L;

H134Q + I154L + D216S;

V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;

D156V + G309D + M314L + V317I;

H134Q + L280I + G309W;

R119Q + D156V + V375L;

Y79S + R119S + H204R;

Y79S + H134Q + Y365F + V375L;

Y194I + R213Q + G309D;

Y79S + D117N + I321L;

Y185F + D325M + E352Q;

Y79S + L224V + L311I;

S132F + H134Q + M200I + M215L + G221E;

F281V + G309W + S331Y + D337E;

D156V + G309D + M314L + V317I;

G128D + L188I + Y326F;

R119S + V241I + L280I + L311I + D325M;

R119Q + S284T + T297S + V306I + G309W

K279V + V281F;

Q298E + Q300R;

H350N + Q352E + K353L;

D307N + D309G; или

Q141E + I143F.

Выделенный вариант верблюжьего химозина

Как обсуждается выше в рабочих примерах в настоящем документе, получают варианты с использованием полипептида SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином) в качестве исходного полипептида; такой вариант может называться в настоящем документе «вариантом верблюжьего химозина».

Как обсуждается выше, четвертый аспект, соответственно, относится к выделенному варианту полипептида химозина, содержащему:

(a): изменение в одном или нескольких положениях исходного полипептида, имеющего активность химозина, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 и 353; и

(b): где вариант имеет активность химозина;

и где

(i): положение аминокислоты исходного полипептида определяют посредством выравнивания последовательностей исходного полипептида с полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), то есть полипептид SEQ ID NO: 1 используют для определения соответствующей последовательности аминокислот в исходном полипептиде; и

(ii): исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином); и

(iii): выделенный вариант полипептида имеет менее чем 100% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином).

Описанные выше определения и предпочтительные варианты осуществления являются также релевантными для этого аспекта.

Предпочтительно выделенный вариант полипептида верблюжьего химозина, как описано в настоящем документе, представляет собой вариант, где вариант имеет активность химозина, дающую более высокое отношение C/P по сравнению с отношением C/P верблюжьего химозина, содержащего зрелый полипептид SEQ ID NO: 2.

В предпочтительном варианте осуществления исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 92% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином), более предпочтительно исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 95% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином), и еще более предпочтительно исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 97% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином).

Как понятно специалисту в данной области в настоящем контексте, выделенный вариант «химозин» может содержать изменения (например, замещения) в положениях аминокислот иных, чем приведено выше.

Например, вариант верблюжьего химозина, например, с 5-10 изменениями (например, замещениями) по сравнению с полипептидом верблюжьего химозина дикого типа SEQ ID NO: 2 будет по-прежнему представлять собой исходный полипептид, который имеет, по меньшей мере, 95% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином).

Может быть предпочтительным, чтобы выделенный вариант верблюжьего химозина содержал менее 30 изменений аминокислот (например, замещений) по сравнению со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином), или может быть предпочтительным, чтобы выделенный вариант верблюжьего химозина содержал менее 20 изменений аминокислот (например, замещений) по сравнению со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином), или может быть предпочтительным, чтобы выделенный верблюжий вариант химозина содержал менее 10 изменений аминокислот (например, замещений) по сравнению со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином), или может быть предпочтительным, чтобы выделенный вариант верблюжьего химозина содержал менее 5 изменений аминокислот (например, замещений) по сравнению со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином).

Как понятно специалисту в данной области в настоящем контексте, термин "выделенный вариант полипептида имеет менее чем 100% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином)" пункта (iii) выше относится к тому, что описанный в настоящем документе выделенный вариант верблюжьего химозина, разумеется, не должен содержать последовательность полипептидов, которая является на 100% идентичной общеизвестной последовательности верблюжьего химозина дикого типа SEQ ID NO: 2.

Предпочтительный вариант осуществления относится к выделенному варианту полипептида верблюжьего химозина, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 и 353.

Может быть предпочтительным, чтобы, по меньшей мере, одно изменение представляло собой замещение, то есть релевантный для настоящего документа предпочтительный вариант осуществления относится к выделенному варианту полипептида химозина, где изменение включает замещение в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 и 353.

Предпочтительно выделенный вариант полипептида химозина, где изменение включает замещение в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 и 353.

Предпочтительно замещение представляет собой такое замещение, где замещение представляет собой 117N, 134Q, 141E, 143F, 156V, 2411, 279M, 2801, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 3111, 325M, 350N, 352L, 352Q, 353L или 353Q.

Предпочтительно замещение представляет собой такое замещение, где замещение представляет собой 134Q, 141E, 143F, 2801, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 3111, 352L, 352Q, 353L или 353Q.

Предпочтительно замещение представляет собой такое замещение, где замещение представляет собой D117N, H134Q, Q141E, I143F, D156V, V241I, V279M, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, D325M, H350N, Q352L, E352L, E352Q, K353L или K353Q.

В предпочтительном варианте осуществления замещение представляет собой такое замещение, где замещение представляет собой:

F281V + V306I + I321L;

H134Q + I154L + D216S;

V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;

D156V + G309D + M314L + V317I;

H134Q + L280I + G309W;

R119Q + D156V + V375L;

Y79S + R119S + H204R;

Y79S + H134Q + Y365F + V375L;

Y194I + R213Q + G309D;

Y79S + D117N + I321L;

Y185F + D325M + E352Q;

Y79S + L224V + L311I;

S 132F + H134Q + M200I + M215L + G221E;

F281V + G309W + S331Y + D337E;

D156V + G309D + M314L + V317I;

G128D + L188I + Y326F;

R119S + V241I + L280I + L311I +D325M;

R119Q + S284T + T297S + V306I + G309W

K279V + V281F;

Q298E + Q300R;

H350N + Q352E + K353L;

D307N + D309G; или

Q141E + I143F.

Способ приготовления продукта на основе молока

Как обсуждается выше, выделенный вариант полипептида химозина, как описано в настоящем документе, может использоваться в соответствии с литературой, например, для приготовления продукта на основе молока, представляющего интерес (такого, например, как сырный продукт).

Как обсуждается выше, один из аспектов настоящего изобретения относится к способу получения пищевого или кормового продукта, включающему добавление эффективного количества выделенного варианта полипептида химозина, как описано в настоящем документе, в пищевые или кормовые ингредиенты) и осуществление дополнительных стадий приготовления с получением пищевого или кормового продукта.

Предпочтительно пищевой или кормовой продукт представляет собой продукт на основе молока, и способ включает добавление эффективного количества выделенного варианта полипептида химозина, как описано в настоящем документе, в молоко и осуществление дополнительных стадий приготовления с получением продукта на основе молока.

Молоко может, например, представлять собой соевое молоко, овечье молоко, козье молоко, буйволиное молоко, молоко яка, молоко ламы, верблюжье молоко или коровье молоко.

Продукт на основе молока может представлять собой, например, ферментированный молочный продукт, столовый творог или сыр.

Аспекты/варианты осуществления в настоящем документе представлены в формате формулы изобретения

Описанные в настоящем документе аспекты и предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения могут быть представлены/описаны в так называемом формате формулы изобретения; это продемонстрировано ниже.

1. Способ получения варианта выделенного полипептида химозина, включающий стадии:

(a): осуществления изменения в одном или нескольких положениях исходного полипептида, имеющего активность химозина, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 и 353; и

(b): продуцирования и выделения измененного полипептида со стадии (a) и с получением при этом выделенного варианта полипептида химозина, где вариант имеет активность химозина;

и где

(i): положение аминокислоты исходного полипептида определяют посредством выравнивания последовательностей исходного полипептида с полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), то есть полипептид SEQ ID NO: 1 используют для определения соответствующей последовательности аминокислот в исходном полипептиде; и

(ii): исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 65% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), который содержит аминокислоты от положения аминокислоты 59 до положения аминокислоты 381 SEQ ID NO: 1.

2. Способ получения варианта выделенного полипептида химозина по п. 1, где выделенный вариант полипептида химозина имеет:

- активность химозина, дающую более высокое отношение C/P по сравнению с отношением C/P бычьего химозина, содержащего зрелый полипептид SEQ ID NO: 1; и

- активность химозина, дающую более высокое отношение C/P по сравнению с отношением C/P верблюжьего химозина, содержащего зрелый полипептид SEQ ID NO: 2.

3. Способ получения варианта выделенного полипептида химозина по любому из предыдущих пунктов, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 и 353.

4. Способ получения варианта выделенного полипептида химозина по любому из предыдущих пунктов, где изменение включает замещение в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 и 353.

5. Способ получения варианта выделенного полипептида химозина по любому из предыдущих пунктов, где изменение включает замещение в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 и 353.

6. Способ получения варианта выделенного полипептида химозина по п. 4, где замещение представляет собой 117N, 134Q, 141E, 143F, 156V, 2411, 279M, 2801, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 3111, 325M, 350N, 352L, 352Q, 353L или 353Q.

7. Способ получения варианта выделенного полипептида химозина по п. 6, где замещение представляет собой 134Q, 141E, 143F, 2801, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 3111, 352L, 352Q, 353L или 353Q.

8. Способ получения варианта выделенного полипептида химозина по п. 4, где замещение представляет собой D117N, H134Q, Q141E, I143F, D156V, V241I, V279M, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, D325M, H350N, Q352L, E352L, E352Q, K353L или K353Q.

9. Способ получения варианта выделенного полипептида химозина по п. 8, где замещение представляет собой H134Q, Q141E, I143F, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, Q352L, E352L, E352Q, K353L или K353Q.

10. Способ получения варианта выделенного полипептида химозина по п. 4, где замещение представляет собой:

F281V + V306I + I321L;

H134Q + I154L + D216S;

V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;

D156V + G309D + M314L + V317I;

H134Q + L280I + G309W;

R119Q + D156V + V375L;

Y79S + R119S + H204R;

Y79S + H134Q + Y365F + V375L;

Y194I + R213Q + G309D;

Y79S + D117N + I321L;

Y185F + D325M + E352Q;

Y79S + L224V + L311I;

S132F + H134Q + M200I + M215L + G221E;

F281V + G309W + S331Y + D337E;

D156V + G309D + M314L + V317I;

G128D + L188I + Y326F;

R119S + V241I + L280I + L311I +D325M;

R119Q + S284T + T297S + V306I + G309W

K279V + V281F;

Q298E + Q300R;

H350N + Q352E + K353L;

D307N + D309G; или

Q141E + I143F.

11. Способ получения варианта выделенного полипептида химозина по любому из предыдущих пунктов, где исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 75% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином).

12. Способ получения варианта выделенного полипептида химозина по п. 11, где исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 95% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином).

13. Способ получения варианта выделенного полипептида химозина по любому из пп. 1-10, где исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 95% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином), который содержит аминокислоты от положения аминокислоты 59 до положения аминокислоты 381 SEQ ID NO: 2.

14. Выделенный вариант полипептида химозина, полученный способом по любому из пп. 1-13.

15. Выделенный вариант полипептида химозина, содержащий:

(a): изменение в одном или нескольких положениях исходного полипептида, имеющего активность химозина, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 и 353; и

(b): где вариант имеет активность химозина;

и где

(i): положение аминокислоты исходного полипептида определяют посредством выравнивания последовательностей исходного полипептида с полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), то есть полипептид SEQ ID NO: 1 используют для определения соответствующей последовательности аминокислот в исходном полипептиде; и

(ii): исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), который содержит аминокислоты от положения аминокислоты 59 до положения аминокислоты 381 SEQ ID NO: 1; и

(iii): выделенный вариант полипептида имеет менее чем 100% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином).

16. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 15, где выделенный вариант имеет активность химозина, дающую более высокое отношение C/P по сравнению с отношением C/P бычьего химозина, содержащего зрелый полипептид SEQ ID NO: 1.

17. Выделенный вариант полипептида химозина по любому из пп. 15-16, где исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 97% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином).

18. Выделенный вариант полипептида химозина по любому из пп. 15-17, где выделенный вариант бычьего химозина содержит менее 10 изменений аминокислот (например, замещения) по сравнению со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином).

19. Выделенный вариант полипептида химозина по любому из пп. 15-18, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 и 353.

20. Выделенный вариант полипептида химозина по любому из пп. 15-19, где изменение включает замещение в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 и 353.

21. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 20, где изменение включает замещение в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 и 353.

22. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 20, где замещение представляет собой 117N, 134Q, 141 E, 143F, 156V, 2411, 279M, 2801, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 3111, 325M, 350N, 352L, 352Q, 353L или 353Q.

23. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 22, где замещение представляет собой 134Q, 141 E, 143F, 2801, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 3111, 352L, 352Q, 353L или 353Q.

24. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 22, где замещение представляет собой D117N, H134Q, Q141E, I143F, D156V, V241I, V279M, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, D325M, H350N, Q352L, E352L, E352Q, K353L или K353Q.

25. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 20, где замещение представляет собой:

F281V + V306I + I321L;

H134Q + I154L + D216S;

V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;

D156V + G309D + M314L + V317I;

H134Q + L280I + G309W;

R119Q + D156V + V375L;

Y79S + R119S + H204R;

Y79S + H134Q + Y365F + V375L;

Y194I + R213Q + G309D;

Y79S + D117N + I321L;

Y185F + D325M + E352Q;

Y79S + L224V + L311I;

S132F + H134Q + M200I + M215L + G221E;

F281V + G309W + S331Y + D337E;

D156V + G309D + M314L + V317I;

G128D + L188I + Y326F;

R119S + V241I + L280I + L311I + D325M;

R119Q + S284T + T297S + V306I + G309W

K279V + V281F;

Q298E + Q300R;

H350N + Q352E + K353L;

D307N + D309G; или

Q141E + I143F.

26. Выделенный вариант полипептида химозина, содержащий:

(a): изменение в одном или нескольких положениях исходного полипептида, имеющего активность химозина, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 и 353; и

(b): где вариант имеет активность химозина;

и где

(i): положение аминокислоты исходного полипептида определяют посредством выравнивания последовательностей исходного полипептида с полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), то есть полипептид SEQ ID NO: 1 используют для определения соответствующей последовательности аминокислот в исходном полипептиде; и

(ii): исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином), который содержит аминокислоты от положения аминокислоты 59 до положения аминокислоты 381 SEQ ID NO: 2; и

(iii): выделенный вариант полипептида имеет менее чем 100% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином).

27. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 26, где выделенный вариант имеет активность химозина, дающую более высокое отношение C/P по сравнению с отношением C/P верблюжьего химозина, содержащего зрелый полипептид SEQ ID NO: 2.

28. Выделенный вариант полипептида химозина по любому из пп. 26-27, где исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 97% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином).

29. Выделенный вариант полипептида химозина по любому из пп. 26-28, где выделенный вариант верблюжьего химозина содержит менее 10 изменений аминокислот (например, замещения) по сравнению со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином).

30. Выделенный вариант полипептида химозина по любому из пп. 26-29, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 и 353.

31. Выделенный вариант полипептида химозина по любому из пп. 26-30, где изменение включает замещение в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 и 353.

32. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 31, где изменение содержит замещение в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 и 353.

33. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 31, где замещение представляет собой 117N, 134Q, 141E, 143F, 156V, 2411, 279M, 2801, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 3111, 325M, 350N, 352L, 352Q, 353L или 353Q.

34. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 33, где замещение представляет собой 134Q, 141E, 143F, 2801, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 3111, 352L, 352Q, 353L или 353Q.

35. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 33, где замещение представляет собой D117N, H134Q, Q141E, I143F, D156V, V241I, V279M, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, D325M, H350N, Q352L, E352L, E352Q, K353L или K353Q.

36. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 31, где замещение представляет собой:

F281V + V306I + I321L;

H134Q + I154L + D216S;

V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;

D156V + G309D + M314L + V317I;

H134Q + L280I + G309W;

R119Q + D156V + V375L;

Y79S + R119S + H204R;

Y79S + H134Q + Y365F + V375L;

Y194I + R213Q + G309D;

Y79S + D117N + I321L;

Y185F + D325M + E352Q;

Y79S + L224V + L311I;

S132F + H134Q + M200I + M215L + G221E;

F281V + G309W + S331Y + D337E;

D156V + G309D + M314L + V317I;

G128D + L188I + Y326F;

R119S + V241I + L280I + L311I + D325M;

R119Q + S284T + T297S + V306I + G309W

K279V + V281F;

Q298E + Q300R;

H350N + Q352E + K353L;

D307N + D309G или

Q141E + I143F.

37. Способ приготовления пищевого или кормового продукта, включающий добавление эффективного количества выделенного варианта полипептида химозина по любому из пп. 14-36 в пищевой или кормовой ингредиент (ингредиенты) и осуществление дополнительных стадий приготовления с получением пищевого или кормового продукта.

38. Способ приготовления пищевого или кормового продукта по п. 37, где продукт представляет собой продукт на основе молока и где способ включает добавление эффективного количества выделенного варианта полипептида химозина по любому из пп. 14-36 в молоко и осуществление дополнительных стадий приготовления с получением продукта на основе молока.

39. Способ приготовления продукта на основе молока по п. 38, где молоко представляет собой соевое молоко, овечье молоко, козье молоко, буйволиное молоко, молоко яка, молоко ламы, верблюжье молоко или коровье молоко.

40. Способ приготовления продукта на основе молока по любому из пп. 38-39, где продукт на основе молока представляет собой ферментированный молочный продукт, столовый творог или сыр.

Примеры

Пример 1

Выравнивание и нумерация последовательностей белков химозина и последовательностей вариантов

Последовательности белков химозина совмещаются с использованием алгоритма ClustalW, как предусматривается EBI (EBI, инструменты, множественное выравнивание последовательностей, CLUSTALW", http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) и как описано в Larkin M.A, Blackshields G, Brown N.P, Chenna R, McGettigan P.A, McWilliam H, Valentin F, Wallace I.M, Wilm A, Lopez R, Thompson J.D, Gibson T.J, Higgins D.G (2007). Bio-informatics 23(21), 2947-2948.

Настройки ClustalW2 для множественного выравнивания последовательностей, для последовательностей, представляют собой Protein weight Matrix = BLOSUM, GAP open = 10, GAP EXTENSION = 0,05, GAP DISTANCES = 8, No End Gaps, ITERATION = none, NUMITER = 1, CLUSTERING = NJ

В качестве эталонной последовательности для бычьего химозина B используют препрохимозин (Gen-bank accession number P00794 описывается в настоящем документе как SEQ ID NO: 1), где N-конечный метионин имеет номер 1 (MRCL…) и где C-конечный изолейцин (в последовательности белка …LAKAI) имеет номер 381. Варианты совмещаются по сравнению с бычьим препрохимозином B, и остатки нумеруются в соответствии с соответствующим остатком бычьего химозина.

Пример 2

Конструирование вариантов химозина

Варианты химозина конструируют с использованием различных стратегий.

Когда здесь упоминается верблюжий химозин, здесь упоминается верблюжий химозин, содержащий полипептиды SEQ ID NO: 2 в настоящем документе.

Верблюжий химозин SEQ ID NO: 2 можно рассматривать как релевантный для настоящего документа исходный полипептид, имеющий активность химозина, используемый для получения его вариантов верблюжьего химозина.

Когда здесь упоминается бычий химозин, здесь упоминается бычий химозин, содержащий полипептид SEQ ID NO: 1 в настоящем документе.

Бычий химозин SEQ ID NO: 1 можно рассматривать как релевантный для настоящего документа исходный полипептид, имеющий активность химозина, используемый для получения его вариантов бычьего химозина в настоящем документе.

Варианты верблюжьего химозина конструируют на основе выравнивания последовательностей большого множества общеизвестных последовательностей аспарагинпротеазы, имеющих идентичность 25% или больше, по сравнению с бычьим химозином B.

Изменения, как правило, вводятся в гипервариабельных областях, в то время как консервативные области не изменяются. Множество изменений вводят в каждый конструкт варианта, обеспечивая то, что каждая отдельная мутация присутствует во множестве конструктов вариантов (относительно обсуждения результатов - см. пример 6 ниже).

Варианты бычьего химозина конструируют на основе сравнения бычьего и верблюжьего химозина. Бычьи остатки, например, изменяют на соответствующие им верблюжьи остатки (относительно обсуждения результатов - см. пример 7 ниже).

Пример 3

Приготовление ферментативного материала для вариантов химозина

Все варианты химозина синтезируют как синтетические гены и клонируют в грибковый вектор экспрессии, соответствующий в основном pGAM pR-C (описан в WO 02/36752 A2).

Векторы трансформируют в E. Coli, и плазмиду ДНК очищают с использованием стандартных протоколов молекулярной биологии, известных специалистам в данной области.

Плазмиды вариантов индивидуально трансформируют в штамм Aspergillus niger, и белок продуцируют в основном, как описано в WO 02/36752A2, и очищают с использованием стандартных хроматографических методик.

Как известно из литературы, специалист в данной области может основываться на этих общедоступных общих знаниях; продуцируют и очищают химозин и варианты химозина, такие как описанные в настоящем документе варианты бычьего и верблюжьего химозина.

Пример 4

Определение удельной активности химозина

4.1 Определение активности свертывания

Молокосвертывающую активность определяют с использованием метода REMCAT, который представляет собой стандартный метод, разработанный International Dairy Federation (метод IDF). Молокосвертывающую активность определяют по времени, необходимому для видимой флоккуляции стандартного субстрата молока, полученного из порошка обезжиренного молока низкотемпературной сушки с помощью раствора хлорида кальция, 0,5 г на литр (pH≈6,5). Время свертывания для образца сычужного фермента сравнивают со временем для эталонного стандарта, имеющего известную молокосвертывающую активность и имеющего такую же композицию ферментов согласно IDF Standard 110B, в качестве образца. Образцы и эталонные стандарты измеряют при идентичных химических и физических условиях. Образцы вариантов доводят приблизительно до 3 IMCU/мл с использованием 84 мМ буфера на основе уксусной кислоты, pH 5,5. Затем 200 мкл фермента добавляют к 10 мл предварительно нагретого молока (32°C) в стеклянной пробирке, помещенной на водяную баню, способную поддерживать постоянную температуру 32°C±1°C, при постоянном перемешивании.

Общую молокосвертывающую активность (крепость) сычужного фермента вычисляют в International Milk-Clotting Units (IMCU) на мл по отношению к стандарту, имеющему такую же композицию ферментов, как образец, в соответствии с формулой:

Крепость в IMCU/мл = Sstandard × Tstandard × Dsample

Dstandard × Tsample

Sstandard:	Молокосвертывающая активность международного эталонного стандарта для сычужного фермента
Tstandard:	Время свертывания в секундах, полученное для стандартного разбавления
Dsample:	Коэффициент разбавления для образца
Dstandard:	Коэффициент разбавления для стандарта
Tsample:	Время свертывания в секундах, полученное для разбавленного образца сычужного фермента от добавления фермента до времени флоккуляции

4.2 Определение общего содержания белка

Общее содержание белка определяют с использованием Pierce BCA Protein Assay Kit от Thermo Scientific, следуя инструкциям производителя.

4.3 Вычисление удельной активности свертывания

Удельную активность свертывания (IMCU/мг белка в целом) определяют посредством деления активности свертывания (IMCU/мл) на общее содержание белка (мг белка в целом на мл).

Пример 5

Определение протеолитической активности

Общую протеолитическую активность измеряют с использованием флуоресцентно меченого казеина Bodipy-FL в качестве субстрата (EnzChek; Molecular Bioprobes, E6638). Производные казеина, сильно меченые pH-нечувствительным зеленым-флуоресцентным Bodipy-FL, дают в результате почти полное гашение флуоресценции конъюгата. Гидролиз, катализируемый протеазой, высвобождает флуоресцентный Bodipy-FL. Этот способ является очень чувствительным, что является главным для этого эксперимента, поскольку CHYMAX M имеет самую низкую общую протеолитическую активность из всех коагулянтов, известных к настоящему времени.

Анализ осуществляют в 0,2 M фосфатном буфере, доведенном до желаемого значения pH, при конечной концентрации субстрата 0,04 мг/мл. Перед смешиванием 1 части субстрата с 1 частью фермента обе приготавливают в фосфатном буфере, все варианты ферментов нормируют на 50 IMCU/мл (в соответствии с примером 4). Субстрат и фермент смешивают в 96-луночных планшетах для микротитрования Nunc Fluoro, герметизируют и инкубируют при 32°C в течение 60 мин. После инкубирования герметизацию снимают и флуоресценцию регистрируют на флуориметре.

Пример 6

Оценка вариантов верблюжьего химозина

Для всех вариантов удельную активность свертывания (IMCU/мг белка в целом) определяют при pH 6,5 в соответствии с примером 4. Варианты ранкируют с использованием следующей стратегии. Вариант с самой низкой удельной активностью дает один пункт, второй снизу дает два пункта, и так далее.

Такую же стратегию ранкирования осуществляют для отношения C/P. Отношение C/P определяют для всех вариантов при pH 6,5 посредством деления удельной активности свертывания (IMCU/мг) на протеолитическую активность.

Определяют общее количество пунктов для каждого варианта с использованием обеих стратегий ранкирования, и конечное ранкирование осуществляют на основе суммы пунктов.

В качестве эталона включены верблюжий ген дикого типа и бычий ген дикого типа.

Термин "X" обозначает отсутствие изменений, то есть отсутствие мутации.

Поскольку все варианты включают множество мутаций, данные по ранкированным вариантам исследуют более подробно с использованием статистических методов и 3D структурного анализа для определения индивидуальных изменений аминокислот, которые имеют положительное или отрицательное воздействие. В этом исследовании также оцениваются/включаются бычьи варианты, обсуждаемые в примере 7, ниже.

Идентифицируются следующие мутации:

D117N	++ Основной сегмент
H134Q	++ Открытый сегмент
L280I	++ В углублении
D156V	+ Основной
V241I	+ Основной
D325M	+ Основной
R374L	-- Основной
K289N	-- Загнутый край с другой стороны
V279K	-- В углублении
G302D	-- Загнутый край
L353K	- Bход в углубление

L311I	++ Нижняя часть углубления
G309W	+ Наружный малый сегмент
G309D	+
V279M	+

Термин "+" относится к положительному изменению аминокислоты, то есть "++" является более положительным, чем "+".

Термин "-" относится к отрицательному изменению аминокислоты, то есть "--" является более отрицательным, чем "-".

Описания в правом столбце таблицы относятся к тому, где именно находятся индивидуальные мутации в 3D структуре бычьего химозина. 3D структура бычьего химозина является общедоступной. В качестве примера на фигуре 2 показано, где именно положения 296 и 294 аминокислот присутствуют в бычьем химозине.

Выводы

Приведенные выше результаты демонстрируют, что следующие мутации в верблюжьем химозине являются положительными (то есть улучшают отношение C/P по сравнению с верблюжьим химозином дикого типа):

D117N

H134Q

L280I

D156V

V241I

D325M

L311I

G309W

G309D

V279M

Пример 7

Оценка вариантов бычьего химозина

Варианты бычьего химозина оценивают на основе их отношения C/P только при pH 6,5.

	Мутации, бычий → верблюжий	Протеолитическая активность	Aктивность свертывания/мг	С/P
3	K279V, V281F	127,237	37	0,3
4	Q298E, Q300R	59,942	241	4,0
6	H350N, Q352E, K353L	106,417	191	1,8
7	D307N, D309G	56,349	47	0,8
8	Q141E, I143F	91,011	176	1,9
Бычий (3327)	Нет	124,237	157	1,3
Верблюжий (А01)	Нет	53,354	197	3,7

Поскольку все варианты включают множество мутаций, то и данные ранкированных вариантов исследуют более подробно с использованием статистических методов и 3D структурного анализа, для определения индивидуальных изменений аминокислот, которые имеют положительное или отрицательное воздействие. В этом исследовании также оцениваются/включаются верблюжьи варианты, обсуждаемые в примере 6.

Идентифицируют следующие положительные мутации бычьего химозина:

Q298E	++
Q300R	++
H350N	+
K353L	+
Q141E	+
I143F	+

Термин "+" относится к положительному изменению аминокислоты, то есть "++" является более положительным, чем "+".

Термин "-" относится к отрицательному изменению аминокислоты, то есть "--"является более отрицательным, чем "-".

Выводы

Приведенные выше результаты демонстрируют, что следующие мутации в бычьем химозине являются положительными (то есть улучшают отношение C/P по сравнению с бычьим химозином дикого типа):

Q300R

H350N

K353L

Q141E

I143F

Пример 8

Положения для получения положительной мутации в химозине

Сравнительная оценка результатов, описанных в примерах 6 и 7, дает в результате следующие данные.

Область каталитического углубления 279-281

Как показано в примере 7, двойная мутация K279V и V281F в бычьем химозине дает в результате отрицательное воздействие на отношение C/P. В верблюжьем химозине мутация V279K также дает в результате отрицательный результат (пример 6). Следовательно, можно сделать вывод, что оптимальная аминокислота в положении 281 представляет собой V. Наблюдается также, что мутация L280I у верблюда имеет положительное воздействие.

Область малого сегмента 298-300

Как показано в примере 7, двойная мутация Q298E и Q300R в бычьем химозине имеет положительное воздействие на отношение C/P.

Область каталитического углубления 350-353

Как показано в примере 7, тройная мутация H350N, Q352E и K353L в бычьем химозине имеет положительное воздействие на отношение C/P.

В верблюжьем химозине наблюдают (пример 6), что L353Q имеет положительное воздействие, в то время как L353K имеет отрицательное воздействие.

Область малого сегмента 307-311

Как показано в примере 7, двойная мутация D307N и D309G в бычьем химозине имеет отрицательное воздействие на отношение C/P.

В верблюжьем химозине G309D и G309W имеют положительное воздействие. Это означает, что мутация D307N в бычьем химозине является ответственной за отрицательное воздействие. В верблюжьем химозине мутация L311I, как показано, имеет положительные воздействия.

Область основного сегмента 134-143

Как показано в примере 7, двойная мутация Q141E и I143F в бычьем химозине имеет положительное воздействие на отношение C/P.

Изменение H134 в Q в верблюжьем химозине, как показано, имеет полезное воздействие

Положение	Предпочтительные аминокислоты
280	I
281	V
298	E
300	R
352	Q (менее предпочтительная L)
309	D или W
307	D
141	E
143	F
353	Q
352	Q
311	I
134	Q

Ссылки

1: WО 02/36752 A2 (Chr. Hansen)

2: Suzuki et al: Site directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218, Lys220 and Asp304 in chymosin, Protein Engineering, vol. 4, January 1990, pages 69-71.

3: Suzuki et al: Alteration of catalytic properties of chymosin by site-directed mutagenesis, Protein Engineering, vol. 2, May 1989, pages 563-569.

4: van den Brink et al: Increased production of chymosin by glycosylation, Jour nal of biotechnology, vol. 125, September 2006, pages 304-310.

5: Pitts et al: Expression and characterization of chymosin pH optima mutants produced in Tricoderma reesei, Journal of biotechnology, vol. 28, March 1993, pages 69-83.

6: M. G. Williams et al: Mutagenesis, biochemical characterization and X-ray structural analysis of point mutants of bovine chymosin, Protein engineering de sign and selection, vol. 10, September 1997, pages 991-997.

7: Strop et al: Engineering enzyme subsite specificity: preparation, kinetic char acterization, and x-ray analysis at 2.0 ANG resolution of Vallllphe site mutated calf chymosin, Biochemistry, vol. 29, October 1990, pages 9863-9871.

8: Supannee et al: Site-specific mutations of calf chymosin B which influence milk-clotting activity, Food Chemistry, vol. 62, June 1998, pages 133-139.

9: Zhang et al: Functional implications of disulfide bond, Cys45-Cys50, in recombinant prochymosin, Biochimica et biophysica acta, vol. 1343, December 1997, pages 278-286.

1. Способ получения выделенного варианта полипептида химозина, включающий стадии:

(a): осуществления изменений в одном или нескольких положениях исходного полипептида, имеющего активность химозина, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении по меньшей мере одной аминокислоты, соответствующем положению 117; и

(b): продуцирования и выделения измененного полипептида со стадии (a) с получением при этом выделенного варианта полипептида химозина, где вариант имеет активность химозина;

и где

(i): положение аминокислоты исходного полипептида определяют посредством выравнивания последовательностей исходного полипептида с полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), то есть полипептид SEQ ID NO: 1 используют для определения соответствующей последовательности аминокислот в исходном полипептиде, и

(ii): исходный полипептид имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином), который содержит аминокислоты от положения аминокислоты 59 до положения аминокислоты 381 SEQ ID NO: 2; и

где выделенный вариант полипептида химозина имеет:

активность химозина, дающую более высокое отношение C/P по сравнению с отношением C/P верблюжьего химозина, содержащего зрелый полипептид SEQ ID NO: 2.

2. Способ получения выделенного варианта полипептида химозина по любому из предыдущих пунктов, где изменением является замещение в положении по меньшей мере одной аминокислоты, соответствующем положению 117.

3. Способ получения выделенного варианта полипептида химозина по п. 2, где замещение представляет 117N.

4. Способ получения выделенного варианта полипептида химозина по п. 2, где замещение представляет собой D117N.

5. Выделенный вариант полипептида химозина, включающий:

(a): изменение в одном или нескольких положениях исходного полипептида, имеющего активность химозина, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении по меньшей мере одной аминокислоты, соответствующем положению 117; и

(b): где вариант имеет активность химозина;

и где

(i): положение аминокислоты исходного полипептида определяют посредством выравнивания последовательностей исходного полипептида с полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), то есть полипептид SEQ ID NO: 1 используют для определения соответствующей последовательности аминокислот в исходном полипептиде; и

(ii): исходный полипептид имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином), который содержит аминокислоты от положения аминокислоты 59 до положения аминокислоты 381 SEQ ID NO: 2; и

(iii): выделенный вариант полипептида имеет менее чем 100% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином); и

где выделенный вариант имеет активность химозина, дающую более высокое отношение C/P по сравнению с отношением C/P верблюжьего химозина, содержащего зрелый полипептид SEQ ID NO: 2.

6. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 5, где выделенный вариант верблюжьего химозина содержит менее 10 аминокислотных изменений (например, замещений) по сравнению со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином).

7. Выделенный вариант полипептида химозина по любому из пп. 5, 6, где изменением является замещение в положении по меньшей мере одной аминокислоты, соответствующем положению 117.

8. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 7, в котором замещением является 117N.

9. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 8, в котором замещением является D117N.

10. Способ приготовления пищевого продукта, включающий добавление эффективного количества выделенного варианта полипептида химозина по любому из пп. 5-9 в пищевой ингредиент (ингредиенты) и осуществление дополнительных стадий приготовления с получением пищевого продукта.

11. Способ приготовления кормового продукта, включающий добавление эффективного количества выделенного варианта полипептида химозина по любому из пп. 5-9 в кормовой ингредиент (ингредиенты) и осуществление дополнительных стадий приготовления с получением кормового продукта.