Препараты однодоменных антигенсвязывающих молекул

Данное изобретение относится к фармацевтике. Предложены способы получения стабильного фармацевтического препарата однодоменной антигенсвязывающей молекулы (SDAB), содержащего лиопротектор, гистидиновый буфер и SDAB, содержащую по меньшей мере две однодоменных молекулы, где одна однодоменная молекула связывается с человеческим сывороточным альбумином (HSA) и по меньшей мере одна другая однодоменная молекула связывается с другим антигеном-мишенью человека или его эпитопом. Получаемый препарат, в том числе восстановленный после лиофилизации, не склонен к агрегации, фрагментации, дезаминированию, окислению или изменению биологической активности в течение продолжительного периода времени. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 32 ил., 2 табл., 12 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

В данной заявке заявлен приоритет согласно U.S. серийный №61/109474, поданной 29 октября 2008 г., полное содержание которой включено в данную заявку посредством ссылки во всей ее полноте.

Перечень последовательностей

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был представлен через EFS-Web и таким образом включен в данную заявку посредством ссылки во всей своей полноте. Указанная копия ASCII, созданная 27 октября 2009 г., названа W22373WO.txt и имеет размер 8343 байта.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Достижения в биотехнологии сделали возможным получение целого ряда белков для фармацевтических применений с использованием методов рекомбинантных ДНК. Вследствие того, что белки обычно больше и сложнее, чем традиционные органические и неорганические лекарственные средства, изготовление лекарственных форм таких белков создает специальные проблемы. Для того чтобы белок оставался биологически активным, препарат должен сохранять конформационную целостность по меньшей мере коровой последовательности аминокислот белка, в то же время защищая многочисленные функциональные группы белка от деградации. Пути деградации белков могут включать химическую нестабильность (т.е. любой процесс, который включает модификацию белка путем образования или разрыва связей, что приводит к новой химической сущности) или физическую нестабильность (т.е. изменения в структуре белка более высокого порядка). Химическая нестабильность может быть следствием, например, дезаминирования, рацемизации, гидролиза, окисления, бета-элиминирования или дисульфидного обмена. Физическая нестабильность может быть следствием, например, денатурации, агрегации, осаждения или адсорбции. Тремя распространенными путями деградации белка являются агрегация белка, дезаминирование и окисление (Cleland et al. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10 (4): 307-377 (1993)).

Сушка при температуре ниже нуля градусов является обычно применяемой методикой сохранения белков, которая служит для удаления воды из интересующего белкового препарата. Сушка при температуре ниже нуля градусов, или лиофилизация, представляет собой процесс, в ходе которого вещество, предназначенное для сушки, сначала замораживают, а затем лед или замороженный растворитель удаляют посредством сублимации в вакуумной среде. Эксципиент может быть включен в предварительно лиофилизированные препараты для увеличения стабильности во время процесса лиофилизации и/или для увеличения стабильности лиофилизированного продукта при хранении (Pikal, M. Biopharm. 3 (9) 26-30 (1990) и Arakawa et al. Pharm. Res. 8 (3): 285-291 (1991)).

Таким образом, все еще существует потребность в создании белковых препаратов, в частности, для подкожного введения, которые стабильны при длительном хранении и доставке.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к препаратам однодоменных антигенсвязывающих молекул (также именуемых в данной заявке "SDAB молекулами" (от англ. single domain antigen binding molecules) (например, молекулы нанотел, в частности, препараты TNF-связывающих молекул нанотел). SDAB молекула может включать один или более единичных антигенсвязывающих доменов, которые взаимодействуют, например связываются, с одним или более белками-мишенями. Данные препараты являются полезными, например, в качестве фармацевтических препаратов для введения субъекту, например, человеку. Также раскрыты способ получения и применение препаратов, описанных в данной заявке, для лечения или предупреждения, например, TNF-ассоциированных расстройств.

[Примечание: Нанотело™ и Нанотела™ являются зарегистрированными товарными знаками Ablynx N.V.]

Соответственно, в одном аспекте в изобретении предложен препарат, который включает: (а) SDAB молекулу, например молекулу нанотела (например, TNF-связывающую молекулу нанотела); (б) лиопротектор; (в) (возможно) поверхностно-активное вещество; (г) (возможно) наполнитель; (д) (возможно) агент, регулирующий тоничность; (е) (возможно) стабилизатор; (ж) (возможно) консервант, и (з) такой буфер, чтобы рН препарата составлял примерно 5,0-7,5. В некоторых воплощениях препарат представляет собой жидкий препарат, лиофилизированный препарат, восстановленный лиофилизированный препарат, аэрозольный препарат или нефасованный препарат (например, замороженный нефасованный препарат). В некоторых воплощениях препарат вводят субъекту посредством инъекции (например, подкожной, внутрисосудистой, внутримышечной или интраперитонеальной) или посредством ингаляции.

В некоторых воплощениях SDAB молекула, например молекула нанотела (например молекула TNF-связывающего нанотела), в препарате находится в концентрации от примерно 0,5 мг/мл до примерно 350 мг/мл, от примерно 0,5 мг/мл до примерно 300 мг/мл, от примерно 0,5 мг/мл до примерно 250 мг/мл, от примерно 0,5 мг/мл до примерно 150 мг/мл, от примерно 1 мг/мл до примерно 130 мг/мл, от примерно 10 мг/мл до примерно 130 мг/мл, от примерно 50 мг/мл до примерно 120 мг/мл, от примерно 80 мг/мл до примерно 120 мг/мл, от примерно 88 мг/мл до примерно 100 мг/мл, или примерно 10 мг/мл, примерно 25 мг/мл, примерно 50 мг/мл, примерно 80 мг/мл, примерно 100 мг/мл, примерно 130 мг/мл, примерно 150 мг/мл, примерно 200 мг/мл, примерно 250 мг/мл или примерно 300 мг/мл.

В других воплощениях лиопротектор препарата представляет собой сахар, например сахарозу, сорбит или трегалозу. Например, лиопротектор может представлять собой сахарозу, сорбит или трегалозу в концентрации от примерно 2,5% до примерно 10%, от примерно 5% до примерно 10%, от примерно 5% до примерно 8%, или примерно 4%, примерно 4,5%, примерно 5%, примерно 5,5%, примерно 6%, примерно 6,5%, примерно 7%, примерно 7,5%, примерно 8%, примерно 8,5%, или примерно 9% (масса/объем).

В других воплощениях буфер в препарате представляет собой гистидиновый буфер в концентрации от примерно 5 мМ до примерно 50 мМ, от примерно 5 мМ до примерно 40 мМ, от примерно 5 мМ до примерно 30 мМ, от примерно 10 мМ до примерно 20 мМ, или примерно 10 мМ, примерно 20 мМ или примерно 30 мМ. В других воплощениях буфер в препарате представляет собой Трио-буфер, присутствующий в концентрации менее чем от примерно 5 мМ до примерно 50 мМ, от примерно 5 мМ до примерно 40 мМ, от примерно 5 мМ до примерно 30 мМ, от примерно 10 мМ до примерно 20 мМ, или примерно 10 мМ, примерно 20 мМ или примерно 30 мМ. рН буферов препарата обычно составляет от примерно 5 до 7. В некоторых конкретных воплощениях рН буфера препарата от примерно 5 до примерно 7,5, от примерно 5,5 до примерно 7,2. Например, рН буфера может составлять примерно 5, 5,5, 5,8-6,1, 6, 6,1, 6,5 или 7.

В некоторых воплощениях препарат (возможно) включает поверхностно-активное вещество в концентрации от примерно 0,001% до 0,6%, например, от примерно 0,01% до 0,6%, от примерно 0,1% до 0,6%, от примерно 0,1% до 0,5%, от примерно 0,1% до 0,4%, от примерно 0,1% до 0,3%, от примерно 0,1% до 0,2%, или от примерно 0,01% до 0,02%. В некоторых случаях препарат содержит более чем 0% и вплоть до примерно 0,6% (например, примерно от 0,1% до 0,2% полисорбата-20, полисорбата-40, полисорбата-60, полисорбата-65, полисорбата-80, полисорбата-85, полоксамера-188, сорбитанмонолаурата, сорбитанмонопальмитата, сорбитанмоностеарата, сорбитанмоноолеата, сорбитантрилаурата, сорбитантристеарата, сорбитантриолеата или их комбинации. В конкретных воплощениях препарат содержит примерно 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008%, 0,009%, от 0,01% до 0,02%, 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, от 0,1% до 0,2%, 0,11%, 0,12%, 0,13%, 0,14%, 0,15%, 0,16%, 0,17%, 0,18%, 0,19% или 0,2% полисорбата-80. Альтернативно, препарат может включать полоксамер-188 на уровне от примерно 0,01% до 0,6%, от примерно 0,1% до 0,6%, от примерно 0,1% до 0,5%, от примерно 0,1% до 0,4%, от примерно 0,1% до 0,3% или от примерно 0,1% до 0,2%.

В некоторых воплощениях препарат (возможно) включает наполнитель, например глицин, в концентрации от примерно 10 до примерно 200 мМ, от примерно 25 до примерно 175 мМ, от примерно 50 до примерно 150 мМ, от примерно 75 до примерно 125 мМ, или примерно 100 мМ.

В других воплощениях препарат (возможно) также включает агент, регулирующий тоничность, например молекулу, которая делает препарат по существу изотоничным или изоосмотичным человеческой крови. Примерные агенты, регулирующие тоничность, включают сахарозу, сорбит, глицин, метионин, маннит, декстрозу, инозит, хлорид натрия, аргинин и гидрохлорид аргинина.

В других воплощениях препарат (возможно) дополнительно включает стабилизатор, например молекулу, которая при объединении с интересующим белком (например SDAB молекулой) по существу предотвращает или уменьшает химическую и/или физическую нестабильность интересующего белка в лиофилизированной, жидкой или предназначенной для хранения форме. Примерные стабилизаторы включают сахарозу, сорбит, глицин, инозит, хлорид натрия, метионин, аргинин, и гидрохлорид аргинина. В некоторых воплощениях препарат включает стабилизатор в одном или более из следующих диапазонов: сахароза от примерно 1% до примерно 12% (например, примерно 5%, примерно 7,5%, примерно 8% или примерно 10%); сорбит от примерно 1% до примерно 7% (например, примерно 3%, примерно 4%, примерно 5%); инозит от примерно 1% до примерно 5%; глицин от примерно 10 мМ до примерно 125 мМ (например, от примерно 25 мМ до 100 мМ, примерно 80 мМ, примерно 90 мМ или примерно 100 мМ); хлорид натрия от примерно 10 мМ до 150 мМ (например, от примерно 25 мМ до 100 мМ, примерно 55 мМ); метионин от примерно 10 мМ до примерно 100 мМ (например, примерно 10 мМ, примерно 20 мМ, примерно 100 мМ); аргинин от примерно 10 мМ до примерно 125 мМ (например, от примерно 25 мМ до примерно 120 мМ, или примерно 100 мМ); гидрохлорид аргинина от примерно 10 мМ до примерно 70 мМ (например, от примерно 10 мМ до примерно 65 мМ, или примерно 55 мМ).

В других воплощениях препарат также может включать метионин в концентрации от примерно 10 до примерно 200 мМ, от примерно 25 до примерно 175 мМ, от примерно 50 до примерно 150 мМ, от примерно 75 до примерно 125 мМ, или примерно 100 мМ.

В одном из воплощений компонент препарата может функционировать в качестве одного или более чем одного лиопротектора, агента, регулирующего тоничность, и/или стабилизатора. Например, в зависимости от концентрации компонента, например, сахарозы, он может служить в качестве одного или более чем одного лиопротектора, агента, регулирующего тоничность, и/или стабилизатора. В других воплощениях, где в препарате необходимы несколько компонентов, используют различные компоненты. Например, когда в препарате требуется лиопротектор, агент, регулирующий тоничность, и стабилизатор, используют различные компоненты (например, сахароза, глицин и инозит могут быть использованы в комбинации, приводящей к комбинации лиопротектора, агента, регулирующего тоничность, и стабилизатора соответственно).

В одном из воплощений препарат включает: (a) SDAB молекулу, например молекулу нанотела (например, молекулу TNF-связывающего нанотела), в концентрации от примерно 0,5 до примерно 300 мг/мл, например, примерно 1 мг/мл, примерно 10 мг/мл, примерно 25 мг/мл, примерно 50 мг/мл, примерно 80 мг/мл, примерно 88 мг/мл, примерно 100 мг/мл, примерно 118 мг/мл, примерно 130 мг/мл, примерно 150 мг/мл или примерно 250 мг/мл; (б) сахарозу в концентрации от примерно 5% до примерно 10%, например, примерно 5%, примерно 6%, примерно 6,5%, примерно 7%, примерно 7,5%, примерно 8%, примерно 10%; (в) полисорбат-80 в концентрации от примерно 0 до примерно 0,6%, например, 0,01%, 0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5% или 0,6%; (г) (возможно) глицин в концентрации от примерно 0 до примерно 100 мМ, например, 100 мМ; (д) (возможно) метионин в концентрации от примерно 0 до примерно 100 мМ, например, 100 мМ; и (е) гистидиновый буфер (в концентрации от примерно 10 мМ до примерно 20 мМ) или Трио-буфер (в концентрации примерно 20 мМ), так что рН препарата составляет от примерно 5,0 до 7,5, например, 5, 5,5, 5,8-6,1, 6, 6,1, 6,5 или 7.

В одном из воплощений препарат представляет собой жидкий препарат. В одном из типичных воплощений жидкий препарат включает: а) SDAB молекулу, например молекулу нанотела {например, молекулу TNF-связывающего нанотела), в концентрации от примерно 10 до примерно 150 мг/мл, например, примерно 25 мг/мл, примерно 50 мг/мл, примерно 80 мг/мл, примерно 88 мг/мл, примерно 100 мг/мл, примерно 118 мг/мл, примерно 130 мг/мл; (б) сахарозу в концентрации от примерно 5% до примерно 10%, т.е. от примерно 7% до примерно 8%, например, 7,5%; или сорбит от примерно 1% до примерно 7% (например, примерно 3%, примерно 4%, примерно 5%) (в) полисорбат-80 в концентрации, например, от примерно 0,01% до 0,02% (например, 0,01%); (г) (возможно) глицин в концентрации от примерно 0 до примерно 100 мМ, например, 100 мМ; (д) (возможно) метионин в концентрации от примерно 0 до примерно 100 мМ, например, 100 мМ; и (е) гистидиновый буфер (в концентрации от примерно 10 мМ до примерно 20 мМ), или Трис-буфер (в концентрации примерно 20 мМ), так что рН препарата составляет от примерно 5 до 7,5, например, 5, 5,5, 5,8-6,1, 6, 6,1, 6,5 или 7. Жидкий препарат может присутствовать в изделии промышленного производства, таком как устройство, шприц или флакон с инструкциями по применению. В некоторых воплощениях шприц или флакон изготовлен из стекла, пластмассы или полимерного материала, такого как циклический олефиновый полимер или сополимер. В других воплощениях препарат может присутствовать в устройстве для инъекции (например, шприце для инъекции, например, предварительно заполненном шприце для инъекции). Шприц может быть адаптирован для индивидуального введения, например, в виде системы с одним флаконом, включающей автоинжектор (например, устройство шприц-ручку) и/или инструкции по применению. Препарат можно вводить субъекту, например пациенту, посредством инъекции, например периферического введения (например, подкожного, внутрисосудистого, внутримышечного или интраперитонеального введения).

В других воплощениях препарат представляет собой лиофилизированный препарат. В одном из типичных воплощений лиофилизированный препарат включает: a) SDAB молекулу, например молекулу нанотела (например, молекулу TNF-связывающего нанотела), в концентрации от примерно 10 до примерно 150 мг/мл, например, примерно 25 мг/мл, примерно 50 мг/мл, примерно 80 мг/мл, примерно 88 мг/мл, примерно 100 мг/мл, примерно 118 мг/мл, примерно 130 мг/мл; (б) сахарозу в концентрации от примерно 5% до примерно 10%, например, от примерно 4% до примерно 7%, например, 5%; (в) полисорбат-80 в концентрации, например, от примерно 0,01% до 0,02% (например, 0,01%); (г) (возможно) глицин в концентрации от примерно 0 до примерно 100 мМ, например, 100 мМ; (д) (возможно) метионин в концентрации от примерно 0 до примерно 100 мМ, например, 100 мМ; и (е) гистидиновый буфер (в концентрации от примерно 10 мМ до примерно 20 мМ, например, примерно 20 мМ), или Трис-буфер (в концентрации примерно 20 мМ), так что рН препарата составляет от примерно 5 до 7,5, например, 5, 5,5, 5,8-6,1, 6, 6,1, 6,5 или 7. Лиофилизированный препарат может быть восстановлен путем смешивания лиофилизата с подходящей водной композицией.

В других воплощениях препарат представляет собой нефасованный препарат. В одном из типичных воплощений нефасованный препарат включает: а) SDAB молекулу, например молекулу нанотела (например, молекулу TNF-связывающего нанотела), в концентрации от примерно 80 мг/мл до 300 мг/мл, например, примерно 150 мг/мл, примерно 175 мг/мл, примерно 200 мг/мл, примерно 250 мг/мл, примерно 275 мг/мл или примерно 300 мг/мл; (б) сахарозу в концентрации от примерно 5% до примерно 10%, например, от примерно 4% до примерно 8%, например, 5% или 7,5%; (в) полисорбат-80 в концентрации, например, от примерно 0,01% до 0,02%; (г) (возможно) глицин в концентрации от примерно 0 до примерно 100 мМ, например, 100 мМ; (д) (возможно) метионин в концентрации от примерно 0 до примерно 100 мМ, например, 100 мМ; и (е) гистидиновый буфер (в концентрации от примерно 10 мМ до примерно 20 мМ) или Трио-буфер (в концентрации примерно 20 мМ), так что рН препарата составляет от примерно 5 до 7,5, например, 5, 5,5, 5,8-6,1, 6, 6,1, 6,5 или 7. Нефасованный препарат может быть заморожен. В некоторых воплощениях нефасованный препарат может быть получен в большом масштабе, например, более чем 10 литров, 50 литров, 100, 150, 200 или более литров.

В некоторых воплощениях SDAB молекула, например молекула нанотела {например, молекула TNF-связывающего нанотела) препарата включает один или более единичных связывающих доменов {например, одно или более нанотел). Например, молекула нанотела может содержать полипептид, например, одноцепочечный полипептид, содержащий по меньшей мере один иммуноглобулиновый вариабельный домен (включающий одну, две или три определяющие комплементарность области (CDR)), или состоять из такого полипептида. Примеры SDAB молекул включают молекулы, естественно лишенные легких цепей {например, VHH, нанотела или антитела верблюдовых). Такие SDAB молекулы могут происходить или могут быть получены от животных семейства верблюдовых, таких как верблюд, лама, дромадер, альпака и гуанако. В других воплощениях SDAB молекула может включать однодоменные молекулы, включающие, но не ограничивающиеся этим, другие природные однодоменные молекулы, такие как однодоменные полипептиды акулы (IgNAR); и однодоменные каркасы {например, фибронектиновые каркасы). Однодоменные молекулы могут происходить из акулы.

В одном из воплощений SDAB молекула препарата представляет собой одноцепочечный полипептид, состоящий из одной или более однодоменных молекул. В воплощениях молекула нанотела является одновалентной или поливалентной {например, двухвалентной, трехвалентной или четырехвалентной). В других воплощениях молекула нанотела является моноспецифической или полиспецифической (например, биспецифической, триспецифической или тетраспецифической). SDAB молекула может содержать одну или более однодоменных молекул, которые являются рекомбинантными, CDR-привитыми, гуманизированными, верблюдизированными, деиммунизированными и/или полученными in vitro {например, выбранными посредством фагового дисплея). Например, SDAB молекула может представлять собой одноцепочечный слитый полипептид, содержащий одну или более однодоменных молекул, которые связываются с одним или более антигенами-мишенями. Типично, антиген-мишень представляет собой белок млекопитающего, например, человека. В некоторых воплощениях SDAB молекула связывается с сывороточным белком, например, с человеческими сывороточными белками, выбранными из одного или более чем одного сывороточного альбумина (человеческого сывороточного альбумина (HSA)), фибрина, фибриногена или трансферрина.

В одном типичном воплощении SDAB молекула препарата представляет собой трехвалентную, биспецифическую молекулу, состоящую из слияния одноцепочечных полипептидов двух однодоменных молекул (например, двух вариабельных областей верблюдовых), которые связываются с антигеном-мишенью, например, фактором некроза опухолей a (TNFα), и одной однодоменной молекулы (например, вариабельной области верблюдовых), которая связывается с сывороточным белком, например, HSA. Однодоменные молекулы SDAB молекулы могут быть расположены в следующем порядке от N- к С-концу: TNFα-связывающая однодоменная молекула - HSA-связывающая однодоменная молекула - TNFα-связывающая однодоменная молекула. Следует понимать, что любой порядок или комбинация однодоменных молекул против одной или более мишеней могут быть получены, как описано в данной заявке.

В одном из воплощений SDAB молекула препарата названа в данной заявке как "ATN-103," содержит аминокислотную последовательность, представленную на Фиг.30 (SEQ ID NO: 1), или аминокислотную последовательность, по существу идентичную ей (например, аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85%, 90%, 95% или более идентичную, или имеющую вплоть до 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 1 аминокислотных изменений (например, делеций, вставок или замен (например, консервативных замен) относительно аминокислотной последовательности, представленной на Фиг.30), или состоит из нее. Примеры дополнительных молекул трехвалентного, биспецифического нанотела, которые могут быть получены, как описано в данной заявке, включают TNF24, TNF25, TNF26, TNF27, TNF28, TNF60 и TNF62, раскрытые в Таблице 29 из WO 2006/122786.

В некоторых воплощениях по меньшей мере одна однодоменная молекула SDAB молекулы препарата, которая связывается с TNFα, включает одну, две или три CDR, имеющих аминокислотную последовательность: DYWMY (SEQ ID NO: 2) (CDR1), EINTNGLITKYPDSVKG (SEQ ID NO: 3) (CDR2) и/или SPSGFN (SEQ ID NO: 4) (CDR3), или имеющих CDR, которая отличается менее чем 3, 2 или 1 аминокислотными заменами (например, консервативными заменами) из одной из указанных CDR. В других воплощениях однодоменная молекула содержит вариабельную область, имеющую аминокислотную последовательность из аминокислот от примерно 1 до 115 на Фиг.30, или аминокислотную последовательность, по существу идентичную ей (например, аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85%, 90%, 95% или более идентичную ей, или имеющую вплоть до 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 1 аминокислотных изменений (например делеций, вставок или замен (например, консервативных замен) относительно аминокислотной последовательности, представленной на Фиг.30). В воплощениях TNFα-связывающая однодоменная молекула имеет одну или более биологических активностей молекулы TNFα-связывающего однодоменного антитела, показанной на Фиг.30. Например, TNFα-связывающая однодоменная молекула связывается с таким же или сходным эпитопом, что и эпитоп, распознаваемый TNFα-связывающей однодоменной молекулой, показанной на Фиг.30 (например, связывается с TNFα в его тримерной форме; связывается с сайтом TNFα, взаимодействующим с рецептором TNF; связывается с эпитопом в тримере TNFα, содержащем Gin в положении 88 и Lys в положении 90 на первом мономере TNF (мономер А), и Glu в положении 146 на втором мономере TNF (мономер В), или эпитопом, описанным в WO 06/122786). В другом воплощении TNFα-связывающая однодоменная молекула имеет активность (например, аффинность связывания, константу диссоциации, специфичность связывания, TNF-ингибиторную активность), сходную с любой из TNFα-связывающих однодоменных молекул, раскрытых в WO 06/122786.

В других воплощениях молекула TNFα-связывающего нанотела содержит одно или более нанотел, раскрытых в WO 2006/122786. Например, молекула TNFα-связывающего нанотела может представлять собой одновалентную, двухвалентную, трехвалентную молекулу TNFα-связывающего нанотела, раскрытую в WO 2006/122786. Примерные TNFα-связывающие нанотела включают, но не ограничиваются этим, TNF1, TNF2, TNF3, его гуманизированные формы (например, TNF29, TNF30, TNF31, TNF32, TNF33). Дополнительные примеры одновалентных TNFα-связывающих нанотел раскрыты в Таблице 8 из WO 2006/122786. Примерные двухвалентные молекулы TNFα-связывающего нанотела включают, но не ограничиваются этим, TNF55 и TNF56, которые содержат два нанотела TNF30, связанных через пептидный линкер с образованием единичного слитого полипептида (раскрытого в WO 2006/122786). Дополнительные примеры двухвалентных молекул TNFα-связывающего нанотела раскрыты в Таблице 19 из WO 2006/122786 как TNF4, TNF5, TNF6, TNF7, TNF8).

В других воплощениях по меньшей мере одна однодоменная молекула SDAB молекулы препарата, которая связывается с HSA, включает одну, две или три CDR, имеющих аминокислотную последовательность: SFGMS (SEQ ID NO: 5) (CDR1), SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 6) (CDR2) и/или GGSLSR (SEQ ID NO: 7) (CDR3), или имеющих CDR, которая отличается менее чем 3, 2 или 1 аминокислотными заменами (например, консервативными заменами) из одной из указанных CDR. В других воплощениях однодоменная молекула содержит вариабельную область, имеющую аминокислотную последовательность из аминокислот от примерно 125 до 239 на Фиг.30 (SEQ ID NO: 1), или аминокислотную последовательность, по существу идентичную ей (например, аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85%, 90%, 95% или более идентичную, или имеющую вплоть до 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 1 аминокислотных изменений (например делеций, вставок или замен (например, консервативных замен) относительно аминокислотной последовательности, представленной на Фиг.30 (SEQ ID NO: 1)). В воплощениях HSA-связывающая однодоменная молекула имеет одну или более биологических активностей HSA-связывающей однодоменной молекулы, показанной на Фиг.30 (SEQ ID NO: 1). Например, HSA-связывающая однодоменная молекула связывается с таким же или сходным эпитопом, что и эпитоп, распознаваемый HSA-связывающей однодоменной молекулой, показанной на Фиг.30 (SEQ ID NO: 1). В другом воплощении HSA-связывающая однодоменная молекула имеет активность (например, аффинность связывания, константу диссоциации, специфичность связывания), сходную с любой из HSA-связывающей однодоменной молекулы, раскрытой в WO 06/122786.

В других воплощениях HSA-связывающая SDAB молекула содержит одно или более нанотел, раскрытых в WO 2006/122786. Например, HSA-связывающая SDAB молекула может представлять собой одновалентную, двухвалентную, трехвалентную молекулу HSA-связывающего нанотела, раскрытую в WO 2006/122786. В других воплощениях HSA-связывающая SDAB молекула может представлять собой моноспецифическую или полиспецифическую молекулу, имеющую по меньшей мере одну из специфичностей связывания, которая связывается с HSA. Примерные TNFα-связывающие нанотела включают, но не ограничиваются этим, ALB1, его гуманизированные формы (например, ALB6, ALB7, ALB8, ALB9, ALB10), раскрытые в WO 06/122786.

В других воплощениях две или более однодоменных молекул SDAB молекулы являются слитыми, со связывающей группой или без нее, в виде генетического или полипептидного слияния. Связывающая группа может представлять собой любую связывающую группу, очевидную специалистам в данной области. Например, связывающая группа может представлять собой биосовместимый полимер длиной от 1 до 100 атомов. В одном из воплощений связывающая группа включает или состоит из остатков полиглициновых, полисериновых, полилизиновых, полиглутаматных, полиизолейциновых или полиаргининовых остатков или их комбинации. Например, полиглициновые или полисериновые линкеры могут включать по меньшей мере пять, семь, восемь, девять, десять, двенадцать, пятнадцать, двадцать, тридцать, тридцать пять и сорок остатков глицина и серина. Примерные линкеры, которые могут быть использованы, включают Gly-Ser повторы, например, (Gly)₄-Ser (SEQ ID NO: 8) повторы в одном, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи или более повторах. В воплощениях линкер имеет следующие последовательности: (Gly)₄-Ser-(Gly)₃-Ser (SEQ ID NO: 9) или ((Gly)₄-Ser)n (SEQ ID NO: 10), где n равно 4, 5 или 6.

Препараты по изобретению могут включать SDAB молекулу, которая модифицирована путем присоединения, например, ковалентного или нековалентного, второй группировки. Например, молекула нанотела может быть ковалентно присоединена к подходящему фармакологически приемлемому полимеру, такому как поли(этиленгликоль) (PEG) или его производное (такое как метоксиполи(этиленгликоль) или mPEG). Примеры пэгилированных молекул нанотел раскрыты как TNF55-PEG40, TNF55-PEG60, TNF56-PEG40 и TNF56-PEG60 в WO 06/122786.

В другом воплощении препараты по изобретению являются стабильными в течение по меньшей мере 3, 6, 9, 12 месяцев (например, по меньшей мере 24, 30, 36 месяцев), при температуре от примерно 2°C до примерно 25°C (например, примерно 4°C или 25°C). В некоторых воплощениях целостность SDAB молекулы поддерживается после хранения в препарате в течение по меньшей мере 3, 6, 9, 12 месяцев (например, по меньшей мере 24, 30, 36 месяцев) при температуре от примерно 2°C до примерно 25°C (например, примерно 4°C или 25°C). Например, SDAB молекула в препарате сохраняет по меньшей мере 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или вплоть до 100% биологической активности, например связывающей активности, SDAB молекулы после хранения при температуре от примерно 2°C до примерно 25°C (например, примерно 4°C или 25°C). В некоторых воплощениях препарат включает менее 10%, 9%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или меньше высокомолекулярных (HMW) компонентов после хранения в препарате в течение по меньшей мере 3, 6, 9, 12 месяцев (например, по меньшей мере 24, 30, 36 месяцев) при температуре от примерно 2°C до примерно 25°C (например, примерно 4°C или 25°C). В других воплощениях препарат включает менее 10%, 9%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или меньше низкомолекулярных (HMW) компонентов после хранения в препарате в течение по меньшей мере 3, 6, 9, 12 месяцев (например, по меньшей мере 24, 30, 36 месяцев) при температуре от примерно 2°C до примерно 25°C (например, примерно 4°C или 25°C). В других воплощениях препарат включает менее 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или меньше кислотных компонентов после хранения в препарате в течение по меньшей мере 3, 6, 9, 12 месяцев (например, по меньшей мере 24, 30, 36 месяцев) при температуре от примерно 2°C до примерно 25°C (например, примерно 4°C или 25°C). В других воплощениях препарат включает менее 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или меньше щелочных компонентов после хранения в препарате в течение по меньшей мере 3, 6, 9, 12 месяцев (например, по меньшей мере 24, 30, 36 месяцев) при температуре от примерно 2°C до примерно 25°C (например, примерно 4°C или 25°C). HMW, LMW, кислотные и щелочные компоненты могут быть определены в препаратах с использованием стандартных методик, таких как эксклюзионная-высокоэффективная жидкостная хроматография (BTOR-HPLC) и тому подобное, как описано в данной заявке.

В некоторых воплощениях после восстановления влагосодержания лиофилизированного SDAB препарата, данный препарат сохраняет по меньшей мере 80%, 90%, 95% или больше SDAB структуры, по сравнению с препаратом до лиофилизации. SDAB структуру определяют, например, с помощью анализ связывания, биоанализа, или соотношения HMW компонентов и LMW компонентов.

Препараты по изобретению также могут включать второй агент, например, второй терапевтически или фармакологически активный агент, который является полезным в лечении TNFα-ассоциированного расстройства, например, воспалительных или аутоиммунных расстройств, включая, но не ограничиваясь этим, ревматоидный артрит (RA) (например, ревматоидный артрит от умеренного до тяжелого), артритические состояния (например, псориатический артрит, ювенильный идиопатический полиартрит (JIA), анкилозирующий спондилоартрит (AS), псориаз, неспецифический язвенный колит, болезнь Крона, воспалительное заболевание кишечника и/или рассеянный склероз. Например, второй агент может представлять собой антитело против TNF или его TNF-связывающий фрагмент, где второе TNF антитело связывается с другим эпитопом, чем TNF-связывающая SDAB молекула препарата. Другие неограничивающие примеры агентов, которые могут быть приготовлены в виде препарата с TNF-связывающей SDAB молекулой, включают, но не ограничиваются этим, ингибитор цитокина, ингибитор фактора роста, иммунодепрессант, противовоспалительный агент, метаболический ингибитор, ферментный ингибитор, цитотоксический агент и цитостатический агент. В одном из воплощений дополнительный агент представляет собой стандартное лечение артрита, включая, но не ограничиваясь этим, нестероидные противовоспалительные средства (NSAIDs); кортикостероиды, включая преднизолон, преднизон, кортизон и триамцинолон; и противоревматические лекарственные средства, модифицирующие заболевание (DMARDs), такие как метотрексат, гидроксихлорохин (Plaquenil) и сульфасалазин, лефлуномид (Arava®), ингибиторы фактора некроза опухолей, включая этанерцепт (Enbrel®), инфликсимаб (Remicade®) (с метотрексатом или без него) и адалимумаб (Humira®), антитело против CD20 (например, Rituxan®), растворимый рецептор интерлейкина-1, такой как анакинра (Kineret®), золото, миноциклин (Minocin®), пеницилламин и цитотоксические агенты, включая азатиоприн, циклофосфамид и циклоспорин. В таких комбинированных терапиях можно преимущественно использовать более низкие дозировки вводимых терапевтических агентов, что позволит избежать возможных токсических эффектов или осложнений, ассоциированных с различными монотерапиями.

Альтернативную комбинацию эксципиентов и/или вторых терапевтических агентов можно идентифицировать и протестировать, следуя руководству, предложенному в данной заявке.

В еще одном воплощении препараты, описанные в данной заявке, являются подходящими для введения субъекту, например, субъекту-человеку (например, пациенту с TNFα-ассоциированным расстройством). Препарат может быть введен указанному субъекту посредством инъекции (например, подкожной, внутрисосудистой, внутримышечной или интраперитонеальной) или посредством ингаляции.

В другом аспекте в изобретении предложен способ или процесс получения препаратов, описанных в данной заявке. Способ или процесс включает: экспрессирование SDAB молекулы в клеточной культуре; очистку SDAB молекулы, например, путем пропускания SDAB молекулы через по меньшей мере одну стадию хроматографической очистки, стадии ультрафильтрации/диафильтрации; корректирование концентрации SDAB молекулы, например, до примерно 10 до 250 мг/мл в препарате, содержащем лиопротектор, поверхностно-активное вещество и буфер, как описано в данной заявке, например, сахарозу в концентрации от примерно 5% до примерно 10%, например, примерно 5%, примерно 10%; полисорбат-80 в концентрации от примерно 0 до примерно 0,02%, например, 0,01%, 0,02%; (возможно) глицин в концентрации от примерно 0 до примерно 100 мМ, например, 100 мМ; (возможно) метионин в концентрации от примерно 0 до примерно 100 мМ, например, 100 мМ; и (е) гистидин (в концентрации от примерно 10 до примерно 20 мМ) или Трис-буфер (в концентрации примерно 20 мМ), так что рН препарата составляет от примерно 5 до 7,5, например, 5, 5,5, 5,8-6,1, 6, 6,1, 6,5 или 7.

В другом аспекте в изобретении предложен способ или процесс получения восстановленного препарата, содержащего SDAB молекулу, например TNF-связывающую SDAB молекулу, как описано в данной заявке. Способ включает: лиофилизацию смеси SDAB молекулы, лиопротектора, поверхностно-активного вещества и буфера, посредством этого образование лиофилизированной смеси; и восстановление влагосодержания лиофилизированной смеси в разбавителе, посредством этого получение препарата, как описано в данной заявке. В одном из воплощений препарат включает: (а) SDAB молекулу, например молекулу TNF-связывающего нанотела, в концентрации от примерно 0,5 до примерно 200 мг/мл, например, примерно 1 мг/мл, примерно 50 мг/мл, примерно 80 мг/мл, примерно 88 мг/мл, примерно 100 мг/мл, примерно 118 мг/мл; (б) сахарозу в концентрации от примерно 5% до примерно 10%, например, примерно 5%, примерно 10%; (в) полисорбат-80 в концентрации от примерно 0 до примерно 0,02%, например, 0,01%, 0,02%; (г) (возможно) глицин в концентрации от примерно 0 до примерно 100 мМ, например, 100 мМ; (д) (возможно) метионин в концентрации от примерно 0 до примерно 100 мМ, например, 100 мМ; и (е) гистидин (в концентрации от примерно 10 до примерно 20 мМ) или Трис-буфер (в концентрации примерно 20 мМ), так что рН препарата составляет примерно 5 до 7,5, например, 5, 5,5, 5,8-6,1, 6, 6,1, 6,5 или 7.

В другом аспекте изобретение относится к способу лечения или предупреждения у субъекта (например, субъекта-человека) TNFα-ассоциированного расстройства, например, воспалительных или аутоиммунных расстройств, включая, но не ограничиваясь этим, ревматоидный артрит (RA) {например, ревматоидный артрит от умеренного до тяжелого), артритические состояния (например, псориатический артрит, ювенильный идиопатический полиартрит (JIA), анкилозирующий спондилоартрит (AS), псориаз, неспецифический язвенный колит, болезнь Крона, воспалительное заболевание кишечника и/или рассеянный склероз. Способ включает введение субъекту, например, пациенту-человеку, фармацевтической композиции, включающей TNF-связывающий SDAB препарат, как описано в данной заявке, например, препарат, содержащий TNF-связывающую SDAB молекулу, отдельно или в комбинации с любой из комбинированных терапий, описанных в данной заявке, в количестве, таком что один или более симптомов TNFα-ассоциированного расстройства уменьшаются.

В другом аспекте в изобретении предложен набор или изделие, которые включает устройство, шприц или флакон, содержащие препараты, описанные в данной заявке. Набор или изделие возможно может включать инструкции по применению. В некоторых воплощениях шприц или флакон изготовлен из стекла, пластмассы или полимерного вещества, такого как циклический олефиновый полимер или сополимер. В других воплощениях препарат может присутствовать в устройстве для инъекции (например, шприце для инъекции, например, предварительно заполненном шприце для инъекции). Шприц может быть адаптирован для индивидуального введения, например, в виде системы с одним флаконом, включающей автоинжектор (например, устройство шприц-ручку) и/или инструкции по применению. В одном из воплощений устройство для инъекции представляет собой предварительно заполненную ручку или другое подходящее устройство для автоинъекции, возможно с инструкцией по применению и введению.

В некоторых воплощениях набор или изделие (например, предварительно заполненные ручка или шприц с однократной или многократной дозой) предложены субъекту, например, пациенту или медицинскому работнику, предварительно упакованные с инструкциями по введению (например, самостоятельному введению) посредством инъекции (например, подкожной, внутрисосудистой, внутримышечной или интраперитонеальной).

В других воплощениях в изобретении предложено устройство для интраназального, трансдермального, внутривенного введения препаратов, описанных в данной заявке. Например, предложен трансдермальный пластырь для введения препаратов, описанных в данной заявке. В других случаях предложен пакет для внутривенного введения препаратов, описанных в данной заявке. В воплощениях пакет для внутривенного введения предложен с нормальным физиологическим раствором или 5%-ной декстрозой.

В другом аспекте в изобретении предложен способ инструктирования пациента (например пациента-человека), нуждающегося в SDAB молекуле, например молекуле TNFα нанотела, о том, как вводить препарат, описанный в данной заявке. Способ включает: (1) обеспечение пациента по меньшей мере однократной дозой препарата SDAB молекулы, описанной в данной заявке; и (2) инструктирование пациента относительно самостоятельного введения по меньшей мере однократной дозы, например, посредством инъекции (например, подкожной, внутрисосудистой, внутримышечной или интраперитонеальной). В одном из воплощений пациент имеет TNFα-ассоциированное расстройство, например, воспалительные или аутоиммунные расстройства, как описано в данной заявке.

В другом аспекте в изобретении предложен способ инструктирования реципиента относительно введения препарата молекулы TNFα нанотела, описанной в данной заявке. Способ включает инструктирование реципиента (например, конечного пользователя, пациента, врача, розничной или оптовой аптеки, дистрибьютора или аптечного отдела в больнице, частной лечебницы или НМО (организация по оказанию медицинских услуг)) о том, как следует вводить пациенту данный препарат.

В другом аспекте предложен способ распределения препарата SDAB молекулы, например молекулы TNFα нанотела, описанной в данной заявке. Способ включает обеспечение реципиента (например, конечного пользователя, пациента, врача, розничной или оптовой аптеки, дистрибьютора или аптечного отдела в больнице, частной лечебницы или НМО) упаковкой, содержащей достаточные стандарные дозировки SDAB молекулы, например молекулы TNFα нанотела, для лечения пациента в течение по меньшей мере 6, 12, 24 или 36 месяцев.

В другом аспекте в изобретении предложен способ или процесс оценки качества упаковки или множества упаковок (например, для того чтобы определить, не является ли она просроченной) препарата, описанного в данной заявке, содержащего SDAB молекулу, например молекулу TNFα нанотела. Способ включает оценку того, не является ли упаковка просроченной. Срок годности составляет по меньшей мере 6, 12, 24, 36 или 48 месяцев, например более 24 или 36 месяцев, от предварительно выбранного события, такого как изготовление, анализ или упаковка. В некоторых воплощениях решение или стадия взяты в результате анализа, например, SDAB молекулу в упаковке используют или бракуют, классифицируют, отбирают, отпускают или приостанавливают, транспортируют, доставляют в новое место, выпускают на рынок, в продажу или предлагают для продажи, изымают из оборота или больше не предлагают для продажи, в зависимости от того, не является ли продукт просроченным.

В другом аспекте в изобретении предложен способ хранения, распределения или использования препарата SDAB молекулы, например молекулы TNF нанотела, описанной в данной заявке. Способ включает:

хранение препарата в течение периода времени при заданной температуре, например менее 25°C, например, ниже точки замерзания или ниже 15°C, 10°C или 4°C. В воплощениях способ дополнительно включает обеспечение препарата для реципиента, например конечного пользователя, например, пациента или медицинского работника, для хранения в аналогичных или различных условиях (например, при более высокой температуре, чем первый период хранения). Препарат может представлять собой жидкий, лиофилизированный или восстановленный препарат.

В другом аспекте в изобретении предложен способ анализа продукта или процесса, например, процесса изготовления. Способ включает обеспечение препарата SDAB молекулы, например молекулы TNF нанотела, как описано в данной заявке, и оценивание параметра препарата, такого как цвет (например, от бесцветного до слегка желтого или от бесцветного до желтого), прозрачность (например, от прозрачного до слегка опалесцирующего или от прозрачного до опалесцирующего) или вязкость (например, от приблизительно 1 до 5 сП, когда измерено при температуре окружающей среды, такой как при 20°C-30°C, например, 25°C), количества одного или более из HMW, LMW, кислотных и/или щелочных компонентов, как описано в данной заявке. Анализ может включать оценку одного или более параметров. Возможно, определяют, удовлетворяет ли параметр предварительно выбранным критериям, например, определяют, присутствуют ли предварительно выбранные критерии, или присутствуют ли они в предварительно выбранном диапазоне, таким образом анализируя процесс.

В одном из воплощений анализ процесса включает измерение стабильности препарата SDAB молекулы. Стабильность препарата антител может быть измерена, например, по образованию агрегатов, которое анализируют, например, посредством эксклюзионной жидкостной хроматографии высокого давления (SE-HPLC), по цвету прозрачности или вязкости, как описано в данной заявке. Препарат может быть определен как являющийся стабильным и поэтому приемлемым для дальнейшей обработки или распределения, если изменение в анализируемом параметре составляет менее примерно 10%, 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,05% или 0,005% или меньше относительно заданного периода времени и возможно при заданной температуре.

В одном из воплощений способ дополнительно включает сравнение определенного значения с эталонным значением для анализа таким образом процесса изготовления.

В одном из воплощений способ дополнительно включает поддержание процесса изготовления, основанное, по меньшей мере частично, на анализе. В одном из воплощений способ дополнительно включает изменение процесса изготовления на основании анализа.

В другом воплощении способ включает оценку процесса, например, процесса изготовления препарата SDAB молекулы, например молекулы TNF нанотела, полученной посредством выбранного процесса, который включает вынесение заключения о процессе, основанного на способе или анализе, описанном в данной заявке. В одном из воплощений способ дополнительно включает поддержание или изменение процесса изготовления, основанного, по меньшей мере частично, на указанном способе или анализе. Таким образом, в другом воплощении оценивающая сторона не практикует способ или анализ, описанный в данной заявке, но лишь учитывают результаты, которые получены с помощью способа или анализа, описанного в данной заявке.

В другом воплощении способ включает сравнение двух или более препаратов в способе мониторинга или контролирования различия между партиями или для сравнения препарата с эталонным стандартом.

В еще одном воплощении способ может дополнительно включать вынесение решение, например, для классификации, отбора, приема или отбраковки, выпуска или приостановки, переработки в лекарственный продукт, транспортировки, перемещения в другое место, приготовления в виде препарата, маркировки, упаковки, выпуска в торговый оборот, продажи или предложения для продажи препарата, основанных, по меньшей мере частично, на заключении.

В другом аспекте в изобретении предложен способ оценки качества препарата SDAB молекулы, например молекулы TNF нанотела, как описано в данной заявке, например, в анализе контроля качества или спецификации для выпуска. Способ включает обеспечение анализа препарата SDAB молекулы в отношении параметра, такого как цвет (например, от бесцветного до слегка желтого или от бесцветного до желтого), прозрачность (например, от прозрачного до слегка опалесцирующего или от прозрачного до опалесцирующего) или вязкость (например, от приблизительно 1 до 5 сП, когда измерено при температуре окружающей среды, такой как при 20°C-30°C, например, 25°C). Анализ может включать оценку одного или более из вышеуказанных параметров. Способ также включает возможно определение, удовлетворяет ли разрешающий параметр предварительно выбранным критериям, например, присутствуют ли предварительно выбранные критерии, или присутствуют ли они в предварительно выбранном диапазоне. Если наблюдаемый разрешающий параметр находится в пределах предварительно выбранного диапазона значений или удовлетворяет предварительно выбранным стандартным критериям, то препарат отбирают, например, для упаковки, применения, продажи, выпуска в оборот, отбраковки и т.д.

В другом аспекте в изобретении предложен способ соблюдения обязательного требования, например, пострегистрационного требования регулирующего органа, например FDA (Управление США по надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств). Способ включает обеспечение оценки препарата антител относительно параметра, как описано в данной заявке. Пострегистрационное требование может включать измерение одного или более из вышеуказанных параметров. Способ также включает, возможно, определение того, удовлетворяет ли наблюдаемый разрешающий параметр предварительно выбранным критериям, или находится ли параметр в предварительно выбранном диапазоне; возможно, документальное фиксирование значения или результата анализа или установление связи с органом, например, посредством передачи значения или результата в регулирующий орган.

В другом аспекте в изобретении предложен способ изготовления партии препарата SDAB молекулы, например молекулы TNF нанотела, имеющего предварительно выбранное свойство, например, удовлетворяющего спецификации для выпуска, требованию маркировки или фармакопейному требованию, например свойству, описанному в данной заявке. Способ включает обеспечение тестируемого препарата; анализ тестируемого препарата согласно способу, описанному в данной заявке; определение, удовлетворяет ли тестируемый препарат предварительно выбранным критериям, например, имеет ли он предварительно установленную взаимосвязь с эталонным значением, например, одним или более эталонными значениями, раскрытыми в данной заявке, и отбор тестируемого препарата антитела для изготовления партии продукта.

В другом аспекте в изобретении предложены множественные партии препарата SDAB молекулы, например молекулы TNF нанотела, где один или более параметров (например, значение или разрешающий параметр, определенные способом, описанным в данной заявке) для каждой партии варьируют меньше чем предварительно выбранный диапазон от предварительно выбранного желаемого эталонного значения или критериев, например, диапазона или критериев, описанных в данной заявке. В некоторых воплощениях определяют один или более параметров для одной или более партий препарата, и партию или партии, выбранные в результате данного определения. Некоторые воплощения включают сравнение результатов определения с предварительно выбранным значением или критериями, например, стандартом сравнения. Другие воплощения включают корректировку дозы из партии, подлежащей введению, например, на основании результата определения данного значения или параметра.

В другом аспекте в изобретении предложен способ одного или более из: предоставления отчета органу, принимающему отчет, оценки образца препарата SDAB молекулы, например молекулы TNF нанотела, в отношении соответствия эталонному стандарту, например требованию FDA, поиска указания от другой стороны, что препарат SDAB молекулы удовлетворяет некоторому предписанному требованию, или предоставления информации о препарате SDAB молекулы другой стороне. Типичные получающие организации или другие стороны включают правительство, например, федеральное правительство США, например, государственный орган, например, FDA. Способ включает одну или более (или все) из следующих стадий: изготовление и/или тестирование водного препарата SDAB молекулы в первой стране, например, США; отправку по меньшей мере аликвоты образца за пределы первой страны, например, отправку ее из Соединенных Штатов во вторую страну; приготовление или прием отчета, который включает данные о структуре препарата SDAB молекулы, например, данные, относящиеся к структуре и/или цепи, описанной в данной заявке, например, данные, полученные с помощью одного или более способов, описанных в данной заявке; и предоставление указанного отчета организации, получающей отчет.

В одном из воплощений организация, получающая отчет, может определить, удовлетворяют ли эти данные установленному требованию или стандартному значению, и, возможно, получают ли ответ из организации, получающей отчет, например, производитель, дистрибьютор или продавец препарата SDAB молекулы. В одном из воплощений после получения одобрения из организации, получающей отчет, препарат SDAB молекулы отбирают, упаковывают или помещают в торговый оборот.

В другом аспекте в изобретении предложен способ оценки препарата SDAB молекулы. Способ включает получение данные относительно присутствия или уровня SDAB молекулы, например, где данные получали одним или более способами, описанными в данной заявке; предоставление документа, который включает указанные данные и возможно включает идентификатор партии SDAB молекулы; предоставление указанного документа лицу принимающему решение, например, государственному органу, например, FDA; возможно, получение отчета от указанного лица, принимающего решение; возможно, принятие решения о выпуске или продаже партии SDAB молекулы на основании отчета от лица, принимающего решение. В одном из воплощений способ дополнительно включает выпуск образца.

Все публикации, заявки на патент, патенты и другие ссылки, упомянутые в данной заявке, включены посредством ссылки во всей их полноте.

Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют такое же значение, что и обычно понятные среднему специалисту в данной области, к которой относится это изобретение. Хотя способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данной заявке, могут быть использованы на практике или при тестировании настоящего изобретения, подходящие способы и материалы описаны ниже. Кроме того, материалы, способы и примеры являются лишь иллюстративными и не предназначены быть ограничивающими.

Другие признаки и преимущества изобретения будут очевидны из подробного описания, графических материалов и из формулы изобретения.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг.1 представлены результаты биологической активности лиофилизированного препарата 10⁶ ед./мг TNF-связывающего нанотела (ATN-103), хранящегося в виде высушенного порошкового (DP) препарата в течение вплоть до шести месяцев. Препарат хранили при указанных температурах.

На Фиг.2 представлены результаты связывающей активности в отношении человеческого сывороточного альбумина (HSA) лиофилизированного препарата TNF-связывающего нанотела (ATN-103). Результаты показаны в виде процента (%) от эталонного стандарта TNF-связывающего нанотела.

На Фиг.3 представлены результаты эксклюзионной-HPLC (SE-HPLC) в отношении % высокомолекулярных (HMW) компонентов для лиофилизированного препарата.

На Фиг.4 представлены результаты для SDS (додецилсульфат натрия)-капиллярного электрофореза (SDS-CE) в отношении % TNF-связывающего нанотела для лиофилизированного препарата.

На Фиг.5 представлены результаты SE-HPLC для % HMW компонентов для препарата, подвергнутого контрольному циклу лиофилизации и циклу лиофилизации на устойчивость.

На Фиг.6 представлены результаты биологической активности 10⁶ ед./мг TNF-связывающего нанотела после хранения в течение вплоть до шести месяцев в высококонцентрированном жидком препарате.

На Фиг.7 представлены результаты связывающей активности в отношении человеческого сывороточного альбумина (HSA) (процент эталонного стандарта TNF-связывающего нанотела) высококонцентрированного жидкого препарата, хранящегося в течение вплоть до шести месяцев при указанных температурах.

На Фиг.8 представлены результаты SE-HPLC для % HMW компонентов высококонцентрированного жидкого препарата после хранения в течение вплоть до шести месяцев при указанных температурах.

На Фиг.9 представлены результаты SE-HPLC для % LMW компонентов высококонцентрированного жидкого препарата после хранения в течение вплоть до шести месяцев при указанных температурах.

На Фиг.10 представлены результаты SDS-CE для % ATN-103 высококонцентрированного жидкого препарата после хранения в течение вплоть до шести месяцев при указанных температурах.

На Фиг.11 представлены результаты SE-HPLC для % HMW компонентов высококонцентрированного жидкого препарата в предварительно заполненном шприце.

На Фиг.12 представлены результаты SE-HPLC для % LMW компонентов высококонцентрированного жидкого препарата в предварительно заполненном шприце.

На Фиг.13 представлены результаты CEX-HPLC для % кислотных компонентов высококонцентрированного жидкого препарата в предварительно заполненном шприце.

На Фиг.14 представлены результаты CEX-HPLC для % щелочных компонентов высококонцентрированного жидкого препарата в предварительно заполненном шприце.

На Фиг.15 представлены результаты SE-HPLC для % HMW компонентов высококонцентрированных жидких препаратов - других препаратов (идентификация других стабилизирующих и дестабилизирующих эксципиентов).

На Фиг.16 представлены результаты SE-HPLC для % HMW компонентов для высококонцентрированного жидкого препарата TNF-связывающего нанотела.

На Фиг.17 представлены результаты SE-HPLC для % LMW компонентов для высококонцентрированного жидкого препарата TNF-связывающего нанотела.

На Фиг.18 представлены результаты CEX-HPLC для % кислотных компонентов для высококонцентрированного жидкого препарата TNF-связывающего нанотела.

На Фиг.19 представлены результаты CEX-HPLC для % щелочных компонентов для высококонцентрированного жидкого препарата TNF-связывающего нанотела.

На Фиг.20 представлены результаты SE-HPLC для % HMW компонентов для высококонцентрированного жидкого препарата TNF-связывающего нанотела после 10X циклов замораживания-оттаивания.

На Фиг.21 представлены результаты SE-HPLC для % LMW компонентов для высококонцентрированного жидкого препарата TNF-связывающего нанотела после 10X циклов замораживания-оттаивания.

На Фиг.22 представлены результаты мутности (поглощение при 455 нм) для высококонцентрированного жидкого препарата TNF-связывающего нанотела после 10X циклов замораживания-оттаивания.

На Фиг.23 представлены результаты концентрации (по УФ поглощению при 280 нм) для высококонцентрированного жидкого препарата TNF-связывающего нанотела после 10X циклов замораживания-оттаивания.

На Фиг.24 представлен высококонцентрированный жидкий препарат TNF-связывающего нанотела: % HMW согласно SE-HPLC после кратковременных термических воздействий, возможно встречающихся в процессах изготовления.

На Фиг.25 представлены результаты SE-HPLC для % HMW компонентов низкоконцентрированного жидкого препарата в зависимости от рН и препарата (40°C).

На Фиг.26 представлены результаты SE-HPLC для % LMW компонентов низкоконцентрированного жидкого препарата в зависимости от рН и препарата (40°C).

На Фиг.27 представлены результаты SE-HPLC для % HMW компонентов низкоконцентрированного жидкого препарата в зависимости от рН и препарата (4°C).

На Фиг.28 представлены результаты SE-HPLC для % HMW компонентов низкоконцентрированного жидкого препарата в зависимости от рН и препарата после встряхивания.

На Фиг.29 представлена схема предсказанной структуры ATN-103.

На Фиг.30 представлена аминокислотная последовательность полипептидной цепи ATN-103 (SEQ ID NO: 1).

На Фиг.31 представлены гистограммы, демонстрирующие % HMW компонентов, определенных посредством SE-HPLC, указанных препаратов, содержащих приблизительно 100 мг/мл ATN-103 (HST, HSGT, HSGMT, HSorb и контроль), хранящихся в указанных условиях.

На Фиг.32 представлены гистограммы, демонстрирующие % LMW компонентов, определенных посредством SE-HPLC, указанных препаратов, содержащих приблизительно 100 мг/мл ATN-103 (HST, HSGT, HSGMT, HSorb и контроль), хранящихся в указанных условиях. Никаких LMW компонентов не было определено в начальной временной точке или после двух недель при 4°C.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Были идентифицированы стабильные препараты, которые включают SDAB молекулу, например молекулу нанотела (например, молекулу TNF-связывающего нанотела), которые являются подходящими для хранения высоких и низких концентраций SDAB молекулы ("препарат"). SDAB молекула, которую готовят в виде препарата, является предпочтительно по существу чистой и желательно по существу гомогенной (т.е. свободной от загрязняющих белков и т.д.). "По существу чистый" белок означает композицию, содержащую по меньшей мере примерно 90% по массе белка, исходя из общей массы композиции, предпочтительно по меньшей мере примерно 95% по массе. "По существу гомогенный" белок означает композицию, содержащую по меньшей мере примерно 99% по массе белка, исходя из общей массы композиции.

Целостность SDAB молекулы в препарате обычно поддерживается после долговременного хранения в виде жидкости или в виде лиофилизированного продукта в различных условиях. Например, целостность SDAB молекулы удовлетворительно поддерживается после воздействия широкого диапазона температур хранения (например, от -80°C до 40°C), напряжения сдвига (например, встряхивания) и напряжения на поверхности раздела (циклов замораживания-оттаивания).

Дополнительно, для лиофилизированного материала, целостность SDAB молекулы удовлетворительно поддерживается во время процесса восстановления влагосодержания. Кроме того, целостность SDAB молекулы в достаточной степени поддерживается для применения в качестве лекарственного средства, как продемонстрировано относительно низкими накоплениями LMW компонентов и HMW компонентов, биоактивностью in vitro, связывающей активностью in vitro, после длительного хранения (например, вплоть до 12 месяцев) при различных температурах (например, от -80°C до 40°C).

Для того чтобы настоящее изобретение можно было легче понять, сначала определяют некоторые термины. Дополнительные определения изложены в подробном описании.

Как использовано в данной заявке, единственное число относится к одному или более чем одному (например, к по меньшей мере одному) грамматическому объекту.

Термин "или" используют в данной заявке для обозначения термина "и/или" и используют взаимозаменяемо с ним, если контекст ясно не указывает иное.

Термины "белки" и "полипептиды" используются взаимозаменяемо в данной заявке.

"Примерно" и "приблизительно" должны, как правило, обозначать приемлемый уровень ошибки для измеренного количества с учетом характера или точности измерений. Примерные уровни ошибки находятся в пределах 20 процентов (%), типично в пределах 10%, и более типично в пределах 5% от заданного значения или диапазона значений.

"Стабильный" препарат SDAB молекулы демонстрирует небольшую или не демонстрирует никаких признаков одного или более из следующего: агрегация, фрагментация, дезаминирование, окисление или изменение биологической активности в течение продолжительного периода времени, например, 6, 12 месяцев, 24 месяцев, 36 месяцев или дольше. Например, в одном из воплощений менее 10% SDAB молекулы подвергается агрегации, фрагментации или окислению. Агрегацию, осаждение и/или денатурацию можно оценить известными способами, такими как визуальный контроль цвета и/или прозрачности, или посредством рассеяния УФ света или эксклюзионной хроматографии. Способность белка сохранять свою биологическую активность можно оценить посредством обнаружения и количественного определения химически измененных форм антитела. Модификацию размера (например, усечение) можно оценить с использованием эксклюзионной хроматографии и/или SDS-PAGE (полиакриламидный гель с додецилсульфатом натрия), например. Другие типы химического изменения включают изменение заряда (например, происходящее в результате дезаминирования), которое можно оценить посредством ионобменной хроматографии, например.

Молекула SDAB "сохраняет свою биологическую активность" в фармацевтическом препарате, если биологическая активность молекулы в определенное время находится в пределах примерно 50% или выше биологической активности, продемонстрированной во время получения фармацевтического препарата, как определено в антигенсвязывающем анализе, например.

"Восстановленный" препарат представляет собой препарат, который был получен путем растворения лиофилизированного белкового препарата в разбавителе, так что белок распределяется в восстановленном препарате. Восстановленный препарат является подходящим для введения (например, парентерального или периферического введения) пациенту, которого лечат интересующим белком, и в некоторых воплощениях изобретения может представлять собой препарат, который является подходящим для подкожного введения.

Под "изотоническим" или "изоосмотическим" подразумевают, что интересующий препарат имеет сходное или по существу такое же осмотическое давление, как кровь человека. Изотонические или изоосмотические препараты будут обычно иметь осмотическое давление от примерно 250 до 350 мОсм. Изотоничность может быть измерена с использованием давления насыщенного пара или осмометра с охлаждением льдом, например.

"Агент, регулирующий тоничность" относится к соединению, которое делает препарат по существу изотоническим или изоосмотическим человеческой крови. Примерные агенты, регулирующие тоничность, представляют собой: сахарозу, сорбит, глицин, метионин, маннит, декстрозу, инозит, хлорид натрия, аргинин или гидрохлорид аргинина. Обычно агенты, регулирующие тоничность, добавляют в таком количестве, что весь препарат оказывает осмотическое сопротивление, аналогичное осмотическому сопротивлению человеческой крови. Например, человеческая кровь содержит приблизительно 300 мМ растворенных веществ. Как правило, фармацевтические продукты приводят к общей молярности 300 мМ. Это соответствует осмотическому давлению от приблизительно 300 до 310 мОсм, с типичным диапазоном от 250 мОсм до 350 мОсм. Количество необходимого агента, регулирующего тоничность, можно оценить первоначально путем вычисления. Вклад в общую молярность можно оценить на основании молекулярной массы молекулы эксципиента и известных свойств молекулы, например, диссоциирует ли молекула на два ионных компонента или молекула является неионной (не диссоциирует). Дополнительно, необходимо понимать осмотический вклад конкретной белковой молекулы в зависимости от концентрации белка. Этот параметр может быть определен экспериментально.

Например, исходя из препарата (тоничность не скорректирована) 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% полисорбата 80, с концентрацией белка анти-TNF нанотела 100 мг/мл, в качестве первой стадии, предполагаемая молярность исходного препарата может быть вычислена следующим образом:

10 мМ гистидина = 10 мМ

5% сахарозы соответствует приблизительно 146 мМ

5%=5 г/100 мл=50 г/л→(50 г/л)/(342,3 г/моль)=0,146 моль/л=146 мМ

0,01% полисорбата 80 создает по существу нулевую молярность и может не приниматься во внимание.

100 мг/мл белка: Определили посредством экспериментирования, что 100 мг/мл белка анти-TNF нанотела создает осмотическое давление, которое соответствует приблизительно 48 мМ.

Поэтому, суммируя все вклады в молярность в первоначальном препарате:

10 мМ+146 мМ+48 мМ=204 мМ

Если целевая молярность составляет 310 мМ, то соответствующая количественная молярность для формирования целевого остатка составляет:

310 мМ-204 мМ=106 мМ

Таким образом, рекомендованное количество агента, регулирующего тоничность, составляет 106 мМ неионного агента, регулирующего тоничность, или 53 мМ ионного агента, регулирующего тоничность, который полностью диссоциирует на два ионных компонента.

После проведения первоначальной оценки агента, регулирующего тоничность, рекомендуется протестировать препарат экспериментально. Таким образом, в предложенном примере в первоначальный препарат добавляли 100 мМ глицина. (Рекомендованные 106 мМ округляли до 100 мМ для простоты). Ожидаемая осмолярность будет составлять:

10 мМ гистидина + 146 мМ сахарозы + 48 мМ белка + 100 мМ глицина = 304 мМ

Значение экспериментального осмотического давления препарата = 305 мОсм.

"Лиопротектор" представляет собой молекулу, которая, при объединении с интересующим белком, в значительной степени предупреждает или уменьшает химическую и/или физическую нестабильность белка при лиофилизации и последующем хранении. Примерные лиопротекторы включают сахара, такие как сахароза, сорбит или трегалоза; аминокислоту, такую как мононатрия глутамат или гистидин; метиламин, такой как бетаин; лиотропную соль, такую как сульфат магния; полиол, такой как трехосновные или высшие сахарные спирты, например глицерин, эритрит, глицерол, арабит, ксилит, сорбит и маннит; пропиленгликоль; полиэтиленгликоль; Pluronics и их комбинации. Обычно лиопротектор представляет собой нередуцирующий сахар, такой как трегалоза или сахароза. Лиопротектор добавляют к предварительно лиофилизированному препарату в "лиопротектирующем количестве", что означает, что после лиофилизации белка в присутствии лиопротектирующего количества лиопротектора белок по существу сохраняет свою физическую и химическую стабильность и целостность при лиофилизации и хранении.

"Стабилизатор" относится к молекуле, которая, при объединении с интересующим белком {например, SDAB молекулой), по существу предупреждает или уменьшает химическую и/или физическую нестабильность интересующего белка в лиофилизированной, восстановленной, жидкой форме или форме для хранения. Примерные стабилизаторы включают сахарозу, сорбит, глицин, инозит, хлорид натрия, метионин, аргинин и гидрохлорид аргинина.

"Разбавитель", представляющий интерес в данной заявке, представляет собой разбавитель, который является фармацевтически приемлемым (безопасным и нетоксичным для введения человеку) и является полезным для получения восстановленного препарата. Примерные разбавители включают стерильную воду, бактериостатическую воду для инъекции (BWFI), pH-забуференный раствор (например, забуференный фосфатами физиологический раствор), стерильный физиологический раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы.

"Консервант" представляет собой соединение, которое может быть добавлено к разбавителю для существенного уменьшения бактериального действия в восстановленном препарате, облегчая таким образом производство восстановленного препарата многоразового использования, например. Примеры потенциальных консервантов включают октадецилдиметилбензиламмония хлорид, гексаметония хлорид, бензалкония хлорид (смесь алкилбензилдиметиламмония хлоридов, в которых алкильные группы представляют собой соединения с длинной цепью), и бензэтония хлорид. Другие типы консервантов включают ароматические спирты, такие как феноловый, бутиловый и бензиловый спирт, алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен, катехин, резорцин, циклогексанол, 3-пентанол и м-крезол. Наиболее предпочтительным консервантом в данной заявке является бензиловый спирт.

"Наполнитель" представляет собой соединение, который добавляет массу в лиофилизированную смесь и вносит вклад в физическую структуру лиофилизированной таблетки (например, облегчает производство по существу однородной лиофилизированной таблетки, которая сохраняет открытую пористую структуру). Примерные наполнители включают маннит, глицин, полиэтиленгликоль и сорбит.

Способы и композиции по настоящему изобретению охватывают полипептиды и нуклеиновые кислоты, имеющие указанные последовательности, или последовательности, по существу идентичные или аналогичные им, например, последовательности, по меньшей мере на 85%, 90%, 95% идентичные или больше указанной последовательности. В контексте аминокислотной последовательности термин "по существу идентичный" используют в данной заявке для ссылки на первую аминокислоту, которая содержит достаточное или минимальное число аминокислотных остатков, которые являются: 1) идентичными, или 2) консервативными заменами выровненных аминокислотных остатков во второй аминокислотной последовательности, так что первая и вторая аминокислотные последовательности могут иметь общий структурный домен и/или общую функциональную активность. Например, аминокислотные последовательности, содержащие общий структурный домен, имеющий по меньшей мере примерно 85%-ную, 90%-ную, 91%-ную, 92%-ную, 93%-ную, 94%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную или 99%-ную идентичность эталонной последовательности. В других воплощениях аминокислотная последовательность может содержать одну или более аминокислотных вставок, делеций или замен (например, консервативных замен) для достижения процента идентичности по меньшей мере примерно 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности эталонной последовательности.

В контексте нуклеотидной последовательности термин "по существу идентичный" используют в данной заявке в отношении первой последовательности нуклеиновой кислоты, которая содержит достаточное или минимальное количество нуклеотидов, которые идентичны выровненным нуклеотидам во второй последовательности нуклеиновой кислоты, так что первая и вторая нуклеотидные последовательности кодируют полипептид, имеющий общую функциональная активность, или кодируют общий структурный полипептидный домен или общую функциональную полипептидную активность. Например, нуклеотидные последовательности, имеющие по меньшей мере примерно 85%-ную, 90%-ную, 91%-ную, 92%-ную, 93%-ную, 94%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную или 99%-ную идентичность эталонной последовательности.

Также в качестве полипептидов по настоящему изобретению включены фрагменты, производные, аналоги или варианты вышеуказанных полипептидов и любая их комбинация. Термины "фрагмент", "вариант", "производное" и "аналог", когда ссылаются на белки по настоящему изобретению, включают любые полипептиды, которые сохраняют по меньшей мере некоторые из функциональных свойств соответствующего нативного антитела или полипептида. Фрагменты полипептидов по настоящему изобретению включают протеолитические фрагменты, а также делеционные фрагменты, в дополнение к специфическим фрагментам антител, обсуждавшимся в данной заявке в другом месте. Варианты полипептидов по настоящему изобретению включают фрагменты, описанные выше, а также полипептиды с измененными аминокислотными последовательностями вследствие аминокислотных замен, делеций или вставок. Варианты могут встречаться в природе или не встречаться в природе. Не встречающиеся в природе варианты могут быть получены с использованием известных в области техники методов мутагенеза. Вариантные полипептиды могут содержать консервативные или неконсервативные аминокислотные замены, делеций или добавления. Производные фрагментов по настоящему изобретению представляют собой полипептиды, которые были изменены так, чтобы демонстрировать дополнительные признаки, не обнаруженные в нативном полипептиде. Примеры включают слитые белки. Вариантные полипептиды также могут быть упомянуты в данной заявке как "полипептидные аналоги". Как использовано в данной заявке, "производное" полипептида относится к рассматриваемому полипептиду, имеющему один или более остатков, химически модифицированных путем взаимодействия функциональной боковой группы. Также в качестве "производных" включены такие полипептиды, которые содержат одно или более встречающихся в природе аминокислотных производных двадцати стандартных аминокислот. Например, пролин может быть замещен 4-гидроксипролином; лизин может быть замещен 5-гидроксилизином; гистидин может быть замещен 3-метилгистидином; серин может быть замещен гомосерином; и лизин может быть замещен орнитином.

Термин "функциональный вариант" относится к полипептидам, которые имеют аминокислотную последовательность, по существу идентичную природной последовательности, или кодируются по существу идентичной нуклеотидной последовательностью и способны иметь одну или более активностей природной последовательности.

Расчеты гомологии или идентичности между последовательностями (термины используются взаимозаменяемо в данной заявке) осуществляют следующим образом.

Для определения процента идентичности двух аминокислотных последовательностей, или двух последовательностей нуклеиновой кислоты, последовательности выравнивают для целей оптимального сравнения (например, могут быть введены бреши в одну или обе первую и вторую аминокислотную последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты для оптимального выравнивания, и негомологичные последовательности могут не приниматься во внимание для целей сравнения). В предпочтительном воплощении длина эталонной последовательности, выровненной для целей сравнения, составляет по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, 60%, и еще более предпочтительно по меньшей мере 70%, 80%, 90%, 100% от длины эталонной последовательности. Аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях аминокислот или нуклеотидов затем сравнивают. Когда положение в первой последовательности занято таким же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, тогда молекулы идентичны по этому положению (как использовано в данной заявке, "идентичность" аминокислоты или нуклеиновой кислоты эквивалентна "гомологии" аминокислоты или нуклеиновой кислоты).

Процент идентичности между двумя последовательностями зависит от количества идентичных положений, общих для данных последовательностей, с учетом количества брешей и длины каждой бреши, которые должны быть введена для оптимального выравнивания этих двух последовательностей.

Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может быть осуществлено с использованием математического алгоритма. В предпочтительном воплощении процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями определяют с использованием алгоритма Needleman и Wunsch ((1970) J. Mot. Biol. 48: 444-453), который был включен в программу GAP в пакете программ GCG (доступен на http://www.gcg.com), используя либо матрицу Blossum 62, либо матрицу PAM250, и массу бреши 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и массу длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В еще одном предпочтительном воплощении процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями определяют с использованием программы GAP в пакете программ GCG (доступен на http://www.gcg.com), используя матрицу NWSgapdna. CMP и массу бреши 40, 50, 60, 70 или 80 и массу длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Особенно предпочтительным набором параметров (и который следует использовать, если не определено иначе) является балльная матрица Blossum 62 со штрафом за брешь 12, штрафом за удлинение бреши 4 и штрафом за брешь со сдвигом рамки считывания 5.

Процент идентичности между двумя аминокислотными или нуклеотидными последовательностями может быть определена с использованием алгоритма Е. Meyers и W. Miller ((1989) CABIOS, 4: 11-17), который был включен в программу ALIGN (версия 2.0), с использованием таблицы массы остатков РАМ 120, штрафа за длину бреши 12 и штрафа за брешь 4.

Последовательности нуклеиновой кислоты и белковые последовательности, описанные в данной заявке, могут быть использованы в качестве "запросной последовательности" для проведения поиска по общедоступным базам данных, например, для идентификации других членов семейства или родственных последовательностей. Такие поиски могут быть осуществлены с использованием программ NBLAST и XBLAST (версия 2.0) из Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. Поиски нуклеотидов в BLAST могут быть осуществлены с помощью программы NBLAST, шкала = 100, длина слова = 12, для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 1) по изобретению. Поиски белков в BLAST могут быть осуществлены с помощью программы XBLAST, шкала = 50, длина слова = 3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных белковым молекулам (SEQ ID NO: 1) по изобретению. Для получения выравниваний с брешами для целей сравнения может быть использована Gapped BLAST, как описано в Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST могут быть использованы значения параметров по умолчанию из соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST).

"Консервативная аминокислотная замена" представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, определены в данной области. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).

Различные аспекты изобретения описаны более подробно ниже. Однодоменные антигенсвязывающие (SDAB) молекулы

Однодоменные антигенсвязывающие (SDAB) молекулы включают молекулы, определяющие комплементарность области которых являются частью однодоменного полипептида. Примеры включают, но не ограничиваются этим, вариабельные домены тяжелой цепи, связывающие молекулы, естественно лишенные легкой цепи, единичные домены, происходящие из традиционных 4-цепочечных антител, сконструированные домены и однодоменные каркасы, отличные от происходящих из антител. SDAB молекулы могут быть любыми из уровня техники или любыми будущими однодоменными молекулами. SDAB молекулы могут происходить из любых видов, включая, но не ограничиваясь этим, мышь, человека, верблюда, ламу, рыбу, акулу, козу, кролика и быка. Этот термин также включает природные однодоменные антительные молекулы из видов, отличных от Camelidae и акул.

В одном аспекте изобретения SDAB молекула может происходить из вариабельной области иммуноглобулина, обнаруженного у рыбы, такого как, например, который происходит из иммуноглобулинового изотипа, известного как новый антигенный рецептор (NAR от англ. Novel Antigen Receptor), обнаруженный в сыворотке акулы. Способы продукции однодоменных молекул, происходящих из вариабельной области NAR ("IgNARs"), описаны в WO 03/014161 и Streltsov (2005) Protein Sci. 14: 2901-2909.

Согласно другому аспекту изобретения, SDAB молекула представляет собой природную однодоменную антигенсвязывающую молекулу, известную как тяжелая цепь, лишенная легких цепей. Такие однодоменные молекулы раскрыты в WO 9404678 и Hamers-Casterman, С. et al. (1993) Nature 363:446-448, например. Для ясности, этот вариабельный домен, происходящий из молекулы тяжелой цепи, естественно лишенной легкой цепи, известен в данной заявке как VHH или нанотело, для того чтобы отличать его от традиционного VH четырехцепочечных иммуноглобулинов. Такая молекула VHH может происходить из видов Camelidae, например верблюда, ламы, дромадера, альпака и гуанако. Другие виды, кроме Camelidae, могут продуцировать молекулы тяжелой цепи, естественно лишенные легкой цепи; такие VHHs находятся в пределах объема изобретения.

SDAB молекулы могут быть рекомбинантными, CDR-привитыми, гуманизированными, верблюдизированными, деиммунизированными и/или полученными in vitro (например, выбранными посредством фагового дисплея), как описано более подробно ниже.

Термин "антигенсвязывающий" предназначен для включения части полипептида, например однодоменной молекулы, описанной в данной заявке, которая содержит детерминанты, образующие область контакта, которая связывается с антигеном-мишенью или его эпитопом. Что касается белков (или белков-миметиков), то антигенсвязывающий участок обычно включает одну или более петель (из по меньшей мере четырех аминокислот или аминокислотных миметиков), которые образуют область контакта, которая связывается с антигеном-мишенью. Типично, антигенсвязывающий участок полипептида, например, молекула однодоменного антитела, включает по меньшей мере одну или две CDR, или более типично по меньшей мере три, четыре, пять или шесть CDR.

Термин "иммуноглобулиновый вариабельный домен" часто понимают в данной области как являющийся идентичным или по существу идентичным VL-или VH-домену человеческого или животного происхождения. Следует понимать, что иммуноглобулиновый вариабельный домен, возможно, эволюционировал у некоторых видов, например акул и ламы, чтобы отличаться по аминокислотной последовательности от VL или VH человека или млекопитающего. Однако эти домены первично вовлечены в связывание антигена. Термин "иммуноглобулиновый вариабельный домен" типично включает по меньшей мере одну или две CDR или более типично по меньшей мере три CDR.

"Константный домен иммуноглобулина" или "константная область" предназначены для включения иммуноглобулинового домена, который является идентичным или по существу аналогичным CL-, CH1-, CH2-, CH3- или CH4-домену человеческого или животного происхождения. См., например, Charles A Hasemann and J. Donald Capra, Immunoglobulins: Structure and Function, in William E. Paul, ed., Fundamental Immunology, Second Edition, 209, 210-218 (1989). Термин "Fc-область" относится к Fc-участку константного иммуноглобулинового домена, который включает иммуноглобулиновые домены CH2 и CH3 или иммуноглобулиновые домены, по существу аналогичные им.

В некоторых воплощениях SDAB молекула представляет собой одновалентную или полиспецифическую молекулу {например, двухвалентную, трехвалентную или четырехвалентную молекулу). В других воплощениях SDAB молекула представляет собой моноспецифическую, биспецифическую, триспецифическую или тетраспецифическую молекулу. Является ли молекула "моноспецифической" или "полиспецифической", например "биспецифической", относится к количеству различных эпитопов, с которыми реагирует связывающий полипептид. Полиспецифические молекулы могут быть специфическими в отношении различных эпитопов полипептида-мишени, описанного в данной заявке, или могут быть специфическими в отношении полипептида-мишени, а также в отношении гетерологичного эпитопа, такого как гетерологичный полипептид или твердый материал-подложка.

Как использовано в данной заявке, термин "валентность" относится к числу потенциальных связывающих доменов, например антигенсвязывающих доменов, присутствующих в SDAB молекуле. Каждый связывающий домен специфически связывает один эпитоп. Когда SDAB молекула содержит более чем один связывающий домен, тогда каждый связывающий домен может специфически связываться с одним и тем же эпитопом, для антитела с двумя связывающими доменами, названного "двухвалентным моноспецифическим", или с различными эпитопами, для SDAB молекулы с двумя связывающими доменами, названной "двухвалентной биспецифической". SDAB молекула может быть также биспецифической и двухвалентной для каждой специфичности (названной "биспецифической четырехвалентной молекулой"). Биспецифические двухвалентные молекулы и способы их получения описаны, например, в пат. США №№5731168; 5807706; 5821333; и пат. публ. США №№2003/020734 и 2002/0155537, описания которых включены посредством ссылки в данную заявку. Биспецифические четырехвалентные молекулы и способы их получения описаны, например, в WO 02/096948 и WO 00/44788, описания которых включены посредством ссылки в данную заявку. См., как правило, публикации РСТ WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt et al., J, Immunol. 147: 60-69 (1991); пат. США №№4474893; 4714681; 4925648; 5573920; 5601819; Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992).

В некоторых воплощениях SDAB молекула представляет собой одноцепочечный слитый полипептид, содержащий одну или более однодоменных молекул (например нанотел), лишенных комплементарного вариабельного домена или иммуноглобулиновой константной, например Fc, области, который связывается с одним или более антигенами-мишенями. Примерный антиген-мишень, распознаваемый антигенсвязывающими полипептидами, включает фактор некроза опухолей α (TNFα). В некоторых воплощениях антигенсвязывающая однодоменная молекула связывается с сывороточным белком, например, человеческими сывороточными белками, выбранными из одного или более из сывороточного альбумина (человеческого сывороточного альбумина (HSA)) или трансферина.

TNFα

Фактор некроза опухолей альфа, как известно в данной области, ассоциирован с воспалительными расстройствами, такими как ревматоидный артрит, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит и рассеянный склероз. Как TNFα, так и рецепторы (CD120a и CD120b) были исследованы очень подробно. TNFα в своей биоактивной форме представляет собой тример. Несколько стратегий антагонизации действия TNFα с использованием антител против TNFα были разработаны и в настоящее время коммерчески доступны, такие как Remicade® и Humira®. Молекулы антител против TNFα известны. Многочисленные примеры TNFa-связывающих однодоменных антигенсвязывающих молекул (например нанотел) раскрыты в WO 2004/041862, WO 2004/041865, WO 2006/122786, содержание которых включено посредством ссылки в данную заявку во всей их полноте. Дополнительные примеры однодоменных антигенсвязывающих молекул раскрыты в US 2006/286066, US 2008/0260757, WO 06/003388, US 05/0271663, US 06/0106203, содержание которых включено посредством ссылки в данную заявку во всей их полноте. В других воплощениях моно-, би-, три- и другие полиспецифические однодоменные антитела против TNFα и сывороточного белка, например HSA, раскрыты в этих ссылках.

В конкретных воплощениях молекула TNFα-связывающего нанотела содержит одно или более нанотел, раскрытых в WO 2006/122786. Например, молекула TNFα-связывающего нанотела может быть одновалентной, двухвалентной, трехвалентной молекулой TNFα-связывающего нанотела, раскрытой в WO 2006/122786. Примерные TNFα-связывающие нанотела включают, но не ограничиваются этим, TNF1, TNF2, TNF3, их гуманизированные формы (например, TNF29, TNF30, TNF31, TNF32, TNF33). Дополнительные примеры одновалентных TNFa-связывающих нанотел раскрыты в Таблице 8 из WO 2006/122786. Примерные двухвалентные молекулы TNFa-связывающего нанотела включают, но не ограничиваются этим, TNF55 и TNF56, которые содержат два нанотела TNF30, связанных через пептидный линкер с образованием единого слитого полипептида (раскрытого в WO 2006/122786). Дополнительные примеры двухвалентных молекул TNFα-связывающего нанотела раскрыты в Таблице 19 из WO 2006/122786 как TNF4, TNF5, TNF6, TNF7, TNF8.

В других воплощениях молекула HSA-связывающего нанотела содержит одно или более нанотел, раскрытых в WO 2006/122786. Например, молекула HSA-связывающего нанотела может быть одновалентной, двухвалентной, трехвалентной молекулой HSA-связывающего нанотела, раскрытой в WO 2006/122786. В других воплощениях молекула HSA-связывающего нанотела может быть моноспецифической или полиспецифической молекулой, имеющей по меньшей мере одну из связывающих специфичностей, которая связывается с HSA. Примерные TNFa-связывающие нанотела включают, но не ограничиваются этим, ALB1, его гуманизированные формы (например, ALB6, ALB7, ALB8, ALB9, ALB10), раскрытые в WO 06/122786.

В других воплощениях две или более однодоменных молекул нанотела слиты, со связывающей группой или без нее, в виде генетического или полипептидного слияния. Связывающая группа может представлять собой любую связывающую группу, известную специалистам в данной области. Например, связывающая группа может представлять собой биосовместимый полимер длиной от 1 до 100 атомов. В одном из воплощений связывающая группа включает или состоит из остатков полиглицина, полисерина, полилизина, полиглутамата, полиизолейцина или полиаргинина или их комбинации. Например, полиглициновые или полисериновые линкеры могут включать по меньшей мере пять, семь, восемь, девять, десять, двенадцать, пятнадцать, двадцать, тридцать, тридцать пять и сорок остатков глицина и серина. Примерные линкеры, которые могут быть использованы, включают Gly-Ser повторы, например, (Gly)₄-Ser (SEQ ID NO: 8) повторы в одном, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи или более повторах. В воплощениях линкер имеет следующие последовательности: (Gly)₄-Ser-(Gly)₃-Ser (SEQ ID NO: 9) или ((Gly)₄-Ser)n (SEQ ID NO: 10), где n равно 4, 5 или 6.

В одном примерном воплощении антигенсвязывающий полипептид, состоящий из одноцепочечного полипептидного слияния двух однодоменных антительных молекул (например, двух вариабельных областей верблюдовых), которые связываются с антигеном-мишенью, например, фактором некроза опухолей альфа (TNFα), и одной однодоменной антительной молекулы (например, вариабельной области верблюдовых), которая связывается с сывороточным белком, например, HSA, названный в данной заявке "ATN-103", как показано, связывается с белком А или его функциональным вариантом. ATN-103 представляет собой гуманизированный, трехвалентный, биспецифический, TNFα-ингибирующий слитый белок. Антигеном для этого белка является фактор некроза опухолей альфа (TNF). На Фиг.29 представлено схематическое изображение предсказанной структуры ATN-103. Этот слитый белок имеет верблюжье происхождение и высокую степень гомологии последовательностей и структурной гомологии с VH-доменами человеческих иммуноглобулинов. Его единичная полипептидная цепь состоит из двух связывающих доменов для TNFα и одного для человеческого сывороточного альбумина (HSA), с двумя состоящими из девяти аминокислот G-S линкерами, соединяющими данные домены. Подробное описание ATN-103 представлено в WO 06/122786.

Полная аминокислотная последовательность полипептидной цепи ATN-103, предсказанной на основании ДНК последовательности соответствующего экспрессирующего вектора, показана на Фиг.30 (остатки пронумерованы, начиная с NH₂-конца как Остаток номер 1 из SEQ ID NO: 1). Последний аминокислотный остаток, кодируемый последовательностью ДНК, представляет собой S³⁶³ и образует COOH-конец белка. Предсказанная молекулярная масса дисульфид-связанного ATN-103 (без каких-либо посттрансляционных модификаций) составляет 38434,7 Да. ATN-103 не содержит N-связанную консенсусную последовательность для гликозилирования. Молекулярная масса, наблюдаемая для основной изоформы посредством квадрупольной времяпролетной масс-спектрометрии с ионизацией наноэлектрораспылением, соответствует 38433,9 Да, что подтверждает отсутствие посттрансляционных модификаций.

На Фиг.30, области, определяющие комплементарность (CDR), подчеркнуты. Предсказанные внутримолекулярные дисульфидные связи проиллюстрированы посредством соединений вовлеченных цистеиновых остатков. Домены, связывающиеся с TNF, выделены жирным шрифтом, а домен, связывающийся с HSA, выделен жирным курсивом. Аминокислотные линкеры, соединяющие эти связывающие домены, выделены курсивом. Для данной полипептидной цепи также показан сигнальный пептид (^-19MGW…VHS^-1).

Получение SDAB молекул

SDAB молекулы могут состоять из одной или более однодоменных молекул (например, нанотел), которые являются рекомбинантными, CDR-привитыми, гуманизированными, верблюдизированными, деиммунизированными и/или полученными in vitro (например, выбранными посредством фагового дисплея). Методы получения антител и SDAB молекул и их рекомбинантная модификация известны в данной области и описаны подробно ниже.

Для получения антител доступны многочисленные способы, известные специалистам в данной области. Например, моноклональные антитела могут быть получены путем создания гибридом в соответствии с известными способами. Гибридомы, созданные таким образом, затем подвергают скринингу с использованием стандартных способов, таких как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и анализ методом поверхностного плазменного резонанса (BIACORE™), для идентификации одной или более гибридом, которые продуцируют нанотело, которое специфически связывается с заданным антигеном. Любая форма заданного антигена может быть использована в качестве иммуногена, например, рекомбинантный антиген, природные формы, любые его варианты или фрагменты, а также его антигенный пептид.

Один примерный способ создания антител и SDAB молекул включает скрининг белковых экспрессиющих библиотек, например, фаговых или рибосомных дисплейных библиотек. Фаговый дисплей описан, например, в Ladner et al., патенте США №5223409; Smith (1985) Science 228: 1315-1317; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690 и WO 90/02809.

В дополнение к применению дисплейных библиотек, заданный антиген может быть использован для иммунизации животного, не являющегося человеком, например грызуна, например мыши, хомяка или крысы. В одном из воплощений животное, не являющееся человеком, включает по меньшей мере часть человеческого иммуноглобулинового гена. Например, можно сконструировать мышиные линии, дефектные по продукции мышиных антител, с большими фрагментами человеческих Ig локусов. С использованием гибридомной технологии могут быть получены и выбраны антиген-специфические моноклональные антитела, происходящие из генов с желаемой специфичностью. См., например, XENOMOUSE™, Green et al. (1994) Nature Genetics 7: 13-21, US 2003-0070185, WO 96/34096, опубликованную 31 октября 1996 г., и заявку РСТ №PCT/US96/05928, поданную 29 апреля 1996 г.

В другом воплощении SDAB молекула, полученная из животного, не являющегося человеком, и затем модифицированная, например гуманизированная, деиммунизированная, химерная, может быть получена с использованием методов рекомбинантной ДНК, известных в данной области. Были описаны различные подходы для создания химерных антител и SDAB молекул. См., например, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 6851, 1985; Takeda et al., Nature 314:452, 1985, Cabilly et al., патент США №4816567;

Boss et al., патент США №4816397; Tanaguchi et al., Европейскую патентную публикацию ЕР 171496; Европейскую патентную публикацию 0173494, патент Великобритании GB 2177096 В. Гуманизированные антитела и SDAB молекулы могут быть также получены, например, с использованием трансгенных мышей, которые экспрессируют человеческие гены тяжелой и легкой цепи, но не способны экспрессировать эндогенные мышиные гены тяжелой и легкой цепи иммуноглобулинов. Winter описывает примерный способ CDR-прививки, который может быть использован для получения гуманизированных антител и SDAB молекулы, описанной в данной заявке (патент США №5225539). Все CDR из конкретного человеческого антитела могут быть заменены по меньшей мере частью нечеловеческого CDR, или только некоторые из CDR могут быть заменены нечеловеческими CDR. Необходимо заменить только номер CDR, необходимый для связывания гуманизированного антитела и SDAB молекулы с заранее определенным антигеном.

Гуманизированные антитела могут быть получены путем замены последовательностей Fv-вариабельного домена, которые не вовлечены непосредственно в связывание антигена с эквивалентными последовательностями из человеческих Fv-вариабельных доменов. Примерные способы получения гуманизированных антител или их фрагментов предложены в Morrison (1985) Science 229: 1202-1207; в Oi et al. (1986) Bio Techniques 4:214; и в US 5585089; US 5693761; US 5693762; US 5859205 и US 6407213. Такие способы включают выделение, манипулирование и экспрессирование последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют все или часть Fv-вариабельных доменов иммуноглобулина по меньшей мере из одной тяжелой или легкой цепи. Такие нуклеиновые кислоты могут быть получены из гибридомы, продуцирующей нанотело против заранее определенной мишени, как описано выше, а также из других источников. Рекомбинантная ДНК, кодирующая гуманизированную SDAB молекулу, например молекулу нанотела, затем может быть клонирована в подходящий экспрессирующий вектор.

В некоторых воплощениях гуманизированная SDAB молекула, например молекула нанотела, оптимизирована путем введения консервативных замен, замен из консенсусных последовательностей, замен из зародышевой линии и/или обратных мутаций. Такие измененные иммуноглобулиновые молекулы могут быть созданы посредством любого из нескольких методов, известных в данной области (например, Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982), и могут быть созданы согласно идеям публикации PCT WO92/06193 или ЕР 0239400).

Методы гуманизации SDAB молекул, например молекул нанотел, раскрыты в WO 06/122786.

SDAB молекула, например молекула нанотела, может быть также модифицирована посредством специфической делеции человеческих T-клеточных эпитопов или "деиммунизации" с помощью способов, раскрытых в WO 98/52976 и WO 00/34317. Кратко, вариабельные домены тяжелой и легкой цепи, например нанотела, могут быть проанализированы в отношении пептидов, которые связываются с МЫС класса II; эти пептиды представляют потенциальные T-клеточные эпитопы (как определено в WO 98/52976 и WO 00/34317). Для выявления потенциальных T-клеточных эпитопов может быть использован подход компьютерного моделирования, названный "пептидным протягиванием" ("peptide threading"), и, кроме того, база данных человеческих связывающих пептидов MHC класса II может быть исследована в отношении мотивов, присутствующих в последовательностях V_H и V_L, как описано в WO 98/52976 и WO 00/34317. Эти мотивы связываются с любым из 18 основных аллотипов DR MHC класса II и, таким образом, представляют потенциальные T-клеточные эпитопы. Обнаруженные потенциальные T-клеточные эпитопы могут быть устранены посредством замещения небольшого числа аминокислотных остатков в вариабельных доменах, или предпочтительно, посредством единичных аминокислотных замен. Как правило, делают консервативные замены. Часто, но не исключительно, может быть использована аминокислота, характерная для положения в последовательностях человеческих антител эмбрионального типа. Человеческие последовательности эмбрионального типа, например, раскрыты в Tomlinson, et al. (1992) J. Mol. Biol. 227: 776-798; Cook, G.P. etal. (1995) Immunol. Today Vol. 16(5): 237-242; Chothia, D, et al. (1992) J. Mol. Biol. 227: 799-817; и Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14: 4628-4638. Каталог V BASE представляет всеобъемлющий справочник последовательностей вариабельных областей иммуноглобулинов человека (составленное Tomlinson, I.A. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK). Эти последовательности могут быть использованы в качестве источника человеческой последовательности, например, для каркасных областей и CDR. Консенсусные человеческие каркасные области также могут быть использованы, например, как описано в US 6300064.

SDAB молекулы, например, молекулы нанотел, могут продуцироваться живыми клетками-хозяевами, которые были генетически сконструированы для продуцирования белка. Способы генетического конструирования клеток для продуцирования белков хорошо известны в данной области. См., например, Ausabel et al., eds. (1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, New York). Такие способы включают введение нуклеиновых кислот, которые кодируют и делают возможной экспрессию белка в живых клетках-хозяевах. Эти клетки-хозяева могут представлять собой бактериальные клетки, грибковые клетки, или предпочтительно животные клетки, растущие в культуре. Бактериальные клетки-хозяева включают, но не ограничиваются этим, клетки Escherichia coli. Примеры подходящих штаммов Е. coli включают: HB101, DH5a, GM2929, JM109, KW251, NM538, NM539 и любой штамм Е. coli, который не может расщеплять чужеродную ДНК. Грибковые клетки-хозяева, которые могут быть использованы, включают, но не ограничиваются этим, клетки Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris и Aspergillus. Некоторые примеры животных клеточных линий, которые могут быть использованы, представляют собой CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, ЗТЗ и WI38. Новые животные клеточные линии могут быть установлены с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области (например, посредством трансформации, вирусной инфекции и/или селекции). Возможно, белок может секретироваться клетками-хозяевами в среду.

Модифицированные SDAB молекулы

Препараты по изобретению могут содержать по меньшей мере одну SDAB молекулу, например молекулу нанотела, имеющую аминокислотную последовательность, которая отличается по меньшей мере одним аминокислотным положением в одной из каркасных областей от аминокислотной последовательности природного домена, например VH-домена.

Следует понимать, что аминокислотные последовательности некоторых SDAB молекул по изобретению, таких как гуманизированные SDAB молекулы, могут отличаться по меньшей мере одним аминокислотным положением по меньшей мере в одной из каркасных областей от аминокислотных последовательностей природного домена, например, природных доменов VHI-I.

Изобретение также включает препараты производных SDAB молекул. Такие производные обычно могут быть получены посредством модификации и, в частности, посредством химической и/или биологической (например, ферментативной) модификации, SDAB молекул и/или одного или более аминокислотных остатков, которые образуют SDAB молекулы, раскрытые в данной заявке.

Примеры таких модификаций, а также примеры аминокислотных остатков в пределах последовательности SDAB молекулы, которая может быть модифицирована таким способом (т.е. либо на белковом скелете, но предпочтительно на боковой цепи), способы и методы, которые могут быть использованы для введения таких модификаций, и возможные применения и преимущества таких модификаций будут понятны специалисту.

Например, такая модификация может включать введение (например, посредством ковалентного связывания или другим подходящим способом) одной или более функциональных групп, остатков или группировок в SDAB молекулу или на SDAB молекуле и, в частности, одной или более функциональных групп, остатков или группировок, которые придают одно или более желаемых свойств или функциональных активностей SDAB молекулам. Пример таких функциональных групп будут понятны специалисту.

Например, такая модификация может включать введение (например, посредством ковалентного связывания или любым другим подходящим способом) одной или более функциональных групп, которые увеличивают период полувыведения, растворимость и/или абсорбцию SDAB молекулы, которые уменьшают иммуногенность и/или токсичность SDAB молекулы, которые устраняют или ослабляют любые нежелательные побочные эффекты SDAB молекулы и/или которые придают другие благоприятные свойства и/или уменьшают нежелательные свойства SDAB молекулы; или любую комбинацию двух или более из вышеуказанных. Примеры таких функциональных групп и способов их введения будут очевидны специалисту и обычно могут включать все функциональные группы и способы, упомянутые в общем уровне техники, процитированном в данной заявке выше, а также функциональные группы и способы, известные сами по себе для модификации фармацевтических белков и, в частности, для модификации антител или фрагментов антител (включая ScFv’s и -148-однодоменные антитела), на которые сделана ссылка, например, в Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16^th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980). Такие функциональные группы могут быть связаны, например, непосредственно (например ковалентно) с нанотелом по изобретению или возможно через подходящий линкер или спейсер, что также будет понятно специалисту.

Один из широко используемых способов увеличения периода полувыведения и/или уменьшения иммуногенности фармацевтических белков включает присоединение подходящего фармакологически приемлемого полимера, такого как поли(этиленгликоль) (PEG) или его производных (таких как метоксиполи(этиленгликоль) или mPEG). Обычно можно использовать любую подходящую форму пэгилирования, такую как пэгилирование, используемое в данной области для антител и фрагментов антител (включая, но не ограничиваясь этим, (одно)доменные антитела и ScFv’s); ссылка сделана, например, на Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002); Veronese and Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003), Harris and Chess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, (2003) и WO 04/060965. Различные реагенты для пэгилирования белков также имеются в продаже, например, от Nektar Therapeutics, USA.

Предпочтительно, используют сайт-направленное пэгилирование, в частности, через цистеиновый остаток (см., например, Yang et al., Protein Engineering, 16, 10, 761-770 (2003). Например, для этой цели PEG может быть присоединен к цистеиновому остатку, который естественно встречается в SDAB молекуле, SDAB молекула может быть модифицирована так, чтобы соответствующим образом ввести один или более цистеиновых остатков для присоединения PEG, или аминокислотная последовательность, содержащая один или более цистеиновых остатков для присоединения PEG, может быть слита с N-и/или С-концом нанотела по изобретению, где все используемые способы конструирования белков известны специалисту сами по себе.

Предпочтительно, для SDAB молекулы используют PEG с молекулярной массой более 5000, такой как более 10000, и менее 200000, такой как менее 100000; например, в диапазоне 20000-80000.

Что касается пэгилирования, то следует отметить, что обычно изобретение также охватывает любую SDAB молекулу, которая была пэгилирована в одном или более аминокислотных положениях, предпочтительно таким способом, что указанное пэгилирование или (1) увеличивает период полувыведения in vivo; (2) уменьшает иммуногенность; (3) обеспечивает одно или более дополнительных полезных свойств, известных для пэгилирования как такового; (4) по существу не оказывает влияния на аффинность SDAB молекулы (например, не уменьшает указанную аффинность более чем на 90%, предпочтительно более чем на 50% и более чем на 10%, как определено подходящим анализом, таким как описанные в Примерах ниже); и/или (4) не влияет на любое из других желаемых свойств SDAB молекулы. Подходящие PEG-группы и способы их присоединения, либо специфического, либо неспецифического, будут понятны специалисту.

Другая, обычно менее предпочтительная модификация включает N-связанное или O-связанное гликозилирование, обычно как часть котрансляционной и/или посттрансляционной модификации, в зависимости от клетки-хозяина, используемого для экспрессирования SDAB молекулы.

Препараты

Препарат SDAB молекулы, например молекулы нанотела, включает SDAB молекулу, соединение, которое может служить в качестве криопротектора, и буфер. РН препарата составляет обычно рН 5,5-7,0. В некоторых воплощениях препарат хранят в виде жидкости. В других воплощениях препарат готовят в виде жидкости и затем сушат, например, посредством лиофилизации или сушки распылением, перед хранением. Высушенный препарат может быть использован в виде сухого соединения, например, в виде аэрозоля или порошка, или восстановлен до его первоначальной или другой концентрации, например, с использованием воды, буфера или другой подходящей жидкости.

Процесс очистки SDAB молекулы предназначен для обеспечения переноса SDAB молекулы в препарат, подходящий для долговременного хранения в виде замороженной жидкости и затем для лиофилизации (например, с использованием гистидин/сахарозного препарата). Препарат лиофилизируют с белком в определенной концентрации. Лиофилизированный препарат затем может быть восстановлен, при необходимости, подходящим разбавителем {например, водой) для повторного растворения первоначальных компонентов препарата до желаемой концентрации, обычно такой же или более высокой концентрации по сравнению с концентрацией до лиофилизации.

Лиофилизированный препарат может быть восстановлен для получения препарата, который имеет концентрацию, отличную от первоначальной концентрации (т.е. до лиофилизации), в зависимости от количества воды или разбавителя, добавленных к лиофилизату относительно объема жидкости, который первоначально лиофилизировали. Подходящие препараты могут быть идентифицированы посредством анализа одного или более параметров целостности антитела. Анализируемые параметры представляют собой обычно процентное содержание HMW компонентов или процентное содержание LMW компонентов.

Процентное содержание HMW компонентов или LMW компонентов определяют либо в виде процентного содержания общего белка в препарате, либо в виде изменения процентного увеличения в течение периода времени (т.е. во время хранения). Общее процентное содержание HMW компонентов в приемлемом препарате составляет не более 10% HMW компонентов после хранения в виде лиофилизата или жидкости в диапазоне от -20°C до 40°C (например, от -20°C до 25°C, от -20°C до 15°C, от 2°C до 8°C, при примерно 2°C, или при примерно 25°C) в течение по меньшей мере одного года, или не более примерно 10% LMW компонентов после хранения в виде лиофилизата или жидкости в диапазоне от -20°C до 40°C в течение по меньшей мере одного года. Под "примерно" подразумевают ±20% от процитированного числового значения. Таким образом, "примерно 20°C" означает от 16°C до 24°C.

Обычно профиль стабильности составляет менее 10% HMW/LMW в диапазоне от 2° до 8°C для охлажденного продукта, и 25°C для продукта при комнатной температуре. HMW компоненты или LMW компоненты анализируют в препарате, хранящемся в виде лиофилизата, после того как лиофилизат восстановлен. 40°C представляет собой ускоренное условие, которое обычно используют для тестирования стабильности и определения стабильности для кратковременных воздействий в условиях нехранения, например, которые могут встречаться в процессе переноса продукта во время транспортировки.

Когда анализируемый параметр представляет собой процентное изменение HMW компонентов или LMW компонентов, тогда процентное содержание общего белка в одном или обоих компонентах после хранения сравнивают с процентным содержанием общего белка в одном или обоих компонентах перед хранением (например, при получении препарата). Определяют разницу в процентных содержаниях. В общем, изменение в процентном содержании белка в HMW компонентах или LMW компонентах в жидких препаратах составляет не более 10%, например, не более чем примерно 8%, не более чем примерно 7%, не более чем примерно 6%, не более чем примерно 5%, не более чем примерно 4%, или не более чем примерно 3% после хранения при 2°C-8°C или 25°C в течение от примерно восемнадцати до двадцати четырех месяцев. Под "примерно" подразумевают ±20% от процитированного числового значения, типично, в пределах 10%, и более типично, в пределах 5% от заданного значения или диапазона значений. Таким образом, примерно 10% означает от 8% до 12%. Препараты, хранящиеся в виде лиофилизированного продукта, обычно имеют менее примерно 5%, менее примерно 4%, менее примерно 3%, менее примерно 2%, или менее примерно 1% HMW компонентов или менее примерно 5%, менее примерно 4%, менее примерно 3%, или менее примерно 2%, или менее примерно 1% LMW компонентов после восстановления влагосодержания, или в жидком препарате, после хранения в диапазоне от -30°C до 8°C (например, при 4°C или -20°C) в течение примерно шести, девяти, десяти, двенадцати, пятнадцати, восемнадцати до двадцати четырех месяцев.

Препараты SDAB молекул (например, молекул TNF-связывающего нанотела) можно хранить в виде замороженного жидкого препарата или лиофилизата в течение, например, по меньшей мере шести, девяти, десяти, двенадцати месяцев или по меньшей мере двух лет, по меньшей мере трех лет, по меньшей мере четырех лет или по меньшей мере пяти лет. В одном примере препарат молекулы TNF-связывающего нанотела содержит 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% полисорбата 80, 50 мг/мл молекулы TNF-связывающего нанотела и имеет рН 6,0. В другом примере препарат молекулы TNF-связывающего нанотела содержит 20 мМ гистидина, 7,5% сахарозы, 0,01% полисорбата 80, 50 мг/мл молекулы TNF-связывающего нанотела и имеет рН 6,0. В другом примере препарат содержит 20 мМ гистидина, 10% сахарозы, 0,02% полисорбата 80, 100 мг/мл молекулы TNF-связывающего нанотела и имеет рН 6,0. В другом примере препарат содержит 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 50 мг/мл молекулы TNF-связывающего нанотела и имеет рН 6,0. В еще одном примере препарат содержит 20 мМ гистидина, 10% сахарозы, 100 мг/мл TNF-связывающего нанотела и имеет рН 6,0. В другом примере препарат содержит 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% полисорбата 80, приблизительно 80 мг/мл молекулы TNF-связывающего нанотела и имеет рН 6.0. В еще одном примере препарат содержит 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% полисорбата 80, 100 мМ аргинина (основания), от 88 до 100 мг/мл молекулы TNF-связывающего нанотела и имеет рН 5,8. В другом примере препарат содержит 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% полисорбата 80, 55 мМ NaCl, от 88 до 100 мг/мл молекулы TNF-связывающего нанотела и имеет рН 6.1. В еще одном примере препарат содержит 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% полисорбата 80, 55 мМ аргинин HCl, от 88 до 100 мг/мл молекулы TNF-связывающего нанотела и имеет рН 6,1. В другом примере препарат содержит 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% полисорбата 80, 100 мМ глицина, от 88 до 100 мг/мл молекулы TNF-связывающего нанотела и имеет рН 6,0. В еще одном примере препарат содержит 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% полисорбата 80, 100 мМ метионина, от 88 до 100 мг/мл молекулы TNF-связывающего нанотела и имеет рН 6,0. В другом примере препарат содержит 10 мМ гистидина, 8% сахарозы, 0,01% полисорбата 80, от 88 до 100 мг/мл молекулы TNF-связывающего нанотела и имеет рН 6,0. В еще одном примере препарат содержит 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% полисорбата 80, от 88 до 100 мг/мл молекулы TNF-связывающего нанотела и имеет рН 6,0. В другом примере препарат содержит 20 мМ гистидина, 5% сахарозы, 118 мг/мл молекулы TNF-связывающего нанотела и имеет рН 6,0. В еще одном примере препарат содержит 20 мМ Трис, 5% сахарозы, 117 мг/мл молекулы TNF-связывающего нанотела и имеет рН 7,2. В другом примере препарат содержит 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% полисорбата 80, приблизительно 80 мг/мл молекулы TNF-связывающего нанотела и имеет рН 6,0. В еще одном примере препарат содержит 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% полисорбата 80, приблизительно 50 мг/мл молекулы TNF-связывающего нанотела и имеет рН 6,0. В одном примере препарат содержит 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% Tween-80, приблизительно 1 мг/мл молекулы TNF-связывающего нанотела и имеет рН 5,5. В другом примере препарат содержит 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% Tween-80, 150 мМ аргинин HCl, приблизительно 1 мг/мл молекулы TNF-связывающего нанотела и имеет рН 5,5. В еще одном примере препарат содержит 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% Tween-80, 75 мМ хлорида натрия, приблизительно 1 мг/мл молекулы TNF-связывающего нанотела и имеет рН 5,5. В одном примере препарат содержит 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% Tween-80, приблизительно 1 мг/мл молекулы TNF-связывающего нанотела и имеет рН 6,0. В другом примере препарат содержит 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% Tween-80, 150 мМ аргинин HCl, приблизительно 1 мг/мл TNF-связывающего нанотела и имеет рН 6,0. В еще одном примере препарат содержит 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% Tween-80, 75 мМ хлорида натрия, приблизительно 1 мг/мл молекулы TNF-связывающего нанотела и имеет рН 6,0. В одном примере препарат содержит 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% Tween-80, приблизительно 1 мг/мл молекулы TNF-связывающего нанотела и имеет рН 6,5. В другом примере препарат содержит 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% Tween-80, 150 мМ аргинин HCl, приблизительно 1 мг/мл молекулы TNF-связывающего нанотела и имеет рН 6,5. В еще одном примере препарат содержит 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% Tween-80, 75 мМ хлорида натрия, приблизительно 1 мг/мл молекулы TNF-связывающего нанотела и имеет рН 6,5. В одном примере препарат содержит 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% Tween-80, приблизительно 1 мг/мл молекулы TNF-связывающего нанотела и имеет рН 7,0. В другом примере препарат содержит 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% Tween-80, 150 мМ аргинин HCl, приблизительно 1 мг/мл молекулы TNF-связывающего нанотела и имеет рН 7,0. В еще одном примере препарат содержит 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% Tween-80, 75 мМ хлорида натрия, приблизительно 1 мг/мл молекулы TNF-связывающего нанотела и имеет рН 7,0. В еще одном примере препарат молекулы TNF-связывающего нанотела содержит 20 мМ гистидина, 7,5% сахарозы, 0,01% полисорбата 80, 250 мг/мл молекулы TNF-связывающего нанотела и имеет рН 6,0.

Дополнительные детали, относящиеся к компонентам препаратов и способов анализа целостности SDAB молекулы, например молекулы TNF-связывающего нанотела, в препарате предложены ниже.

Концентрации SDAB молекулы в препаратах составляют обычно от примерно 0,1 мг/мл до примерно 350 мг/мл, например, от 0,5 мг/мл до примерно 350 мг/мл, от примерно 0,5 мг/мл до примерно 300 мг/мл, от примерно 0,5 мг/мл до примерно 250 мг/мл, от примерно 0,5 мг/мл до примерно 150 мг/мл, от примерно 1 мг/мл до примерно 130 мг/мл, от примерно 10 мг/мл до примерно 130 мг/мл, от примерно 50 мг/мл до примерно 120 мг/мл, от примерно 80 мг/мл до примерно 120 мг/мл, от примерно 88 мг/мл до примерно 100 мг/мл, или примерно 10 мг/мл, примерно 25 мг/мл, примерно 50 мг/мл, примерно 80 мг/мл, примерно 100 мг/мл, примерно 130 мг/мл, примерно 150 мг/мл, примерно 200 мг/мл, примерно 250 мг/мл или примерно 300 мг/мл. В контексте диапазонов, "примерно" означает -20% от нижнего процитированного числового значения данного диапазона и +20% от верхнего процитированного числового значения данного диапазона. В контексте диапазонов, например, от примерно 10 мг/мл до примерно 100 мг/мл, это означает от 8 мг/мл до 120 мг/мл. В некоторых случаях концентрации SDAB молекулы в препаратах могут составлять, например, от 0,1 мг/мл до 200 мг/мл, например, от 0,5 мг/мл до 100 мг/мл, от 0,5 мг/мл до 1,0 мг/мл, от 0,5 мг/мл до 45 мг/мл, от 1 мг/мл до 10 мг/мл, от 10 мг/мл до 40 мг/мл, от 10 мг/мл до 50 мг/мл, от 50 мг/мл до 100 мг/мл, от 100 мг/мл до 200 мг/мл. Такие препараты SDAB молекулы могут быть использованы в качестве терапевтических агентов. Соответственно, концентрация SDAB молекулы в препарате является достаточной для обеспечения таких дозировок в объеме препарата, который переносится субъектом, которого лечат, и является подходящим для способа введения. В одном неограничивающем примере для того, чтобы обеспечить подкожно высокую дозировку, в которой ограничение объема является небольшим (например, от примерно 1 мл до 1,2 мл на инъекцию), концентрация SDAB молекулы составляет обычно по меньшей мере 100 мг/мл или больше, например, от 100 мг/мл до 500 мг/мл, от 100 мг/мл до 250 мг/мл или от 100 мг/мл до 150 мг/мл. Такие высокие концентрации могут быть достигнуты, например, путем восстановления влагосодержания лиофилизированного препарата в подходящем объеме разбавителя (например, стерильной воды для инъекции, забуференного физиологического раствора). В некоторых случаях восстановленный препарат имеет концентрацию от примерно 100 мг/мл до 300 мг/мл (например, 100 мг/мл, 125 мг/мл, 150 мг/мл, 175 мг/мл, 200 мг/мл, 250 мг/мл, 275 мг/мл, 300 мг/мл). Высокие концентрации, например, вплоть до 250 мг/мл, могут быть использованы для длительного хранения, например, хранения в замороженном состоянии крупных препаратов SDAB молекулы.

Для доставки посредством ингаляции, препарат обычно до некоторой степени концентрируют (например, от примерно 100 мг/мл до 500 мг/мл) для обеспечения достаточной дозы в ограниченном объеме аэрозоля для вдыхания. В некоторых случаях используют низкие концентрации (например, от примерно 0,05 мг/мл до 1 мг/мл). В данной области известны способы адаптации доставляемой дозировки к способу доставки, например, струйный небулайзер или дозированный аэрозоль.

Буферы и криопротекторы

рН препарата, как описано в данной заявке, составляет обычно от примерно рН 5,0 до примерно 7,0, например, от примерно рН 5,5 до примерно 6,5, от примерно рН 5,5 до примерно 6,0, от примерно рН 6,0 до примерно 6,5, рН 5,5, рН 6,0 или рН 6,5. В общем, для получения препарата используют буфер, который может поддерживать раствор при рН от 5,5 до 6,5, например, буфер, имеющий pKA примерно 6,0. Подходящие буферы включают, без ограничения, гистидиновый буфер, ТРИС, 2-(N-морфолино)этансульфоновую кислоту (MES), какодилат, фосфат, ацетат, сукцинат и цитрат. Концентрация буфера составляет от примерно 4 мМ до примерно 60 мМ, например, от примерно 5 мМ до примерно 25 мМ, например, гистидин обычно используют в концентрации вплоть до 60 мМ. В некоторых случаях гистидиновый буфер используют в концентрации примерно 5 мМ, примерно 10 мМ или примерно 20 мМ. В других случаях ацетатный или сукцинатный буфер используют в концентрации примерно 5 мМ или примерно 10 мМ.

Криопротекторы известны в данной области и включают, например, сахарозу, трегалозу и глицерин. Обычно используют криопротектор, демонстрирующий низкую токсичность в биологических системах. Криопротектор включают в препарат в концентрации от примерно 0,5% до 15%, от примерно 0,5% до 2%, от примерно 2% до 5%, от примерно 5% до 10%, от примерно 10% до 15%, и примерно 5% (масса/объем).

Гистидиновый буфер, который может быть использован в качестве буфера в препарате TNF-связывающего нанотела, может иметь криопротекторные свойства. В некоторых воплощениях изобретения гистидиновый буфер используют вместе с таким криопротектором, как сахар, например, сахароза. Препарат по изобретению может специально исключать применение гистидина в любом значительном количестве, например, ни буферный, ни криопротекторный компонент препарата не является гистидином.

Вязкость препарата представляет собой обычно вязкость, которая совместима с путем введения препарата. В некоторых воплощениях вязкость препарата составляет от 1 сП до 4 сП, например, от примерно 2 сП до 3,5 сП. В других воплощениях вязкость препарата составляет от примерно 5 сП до примерно 40 сП. В конкретных воплощениях вязкость препарата составляет примерно 1 сП, 2 сП, от 2,4 сП до 2,8 сП, 3 сП, от 3,1 сП до 3,2 сП, 4 сП, 5 сП, 10 сП, 15 сП, 20 сП, 25 сП, 30 сП, 35 сП или 40 сП.

Поверхностно-активные вещества

В некоторых воплощениях в препарат включено поверхностно-активное вещество. Примеры поверхностно-активных веществ включают, без ограничения, неионные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбаты (например, полисорбат-20, полисорбат-40, полисорбат-60, полисорбат-65, полисорбат-80 или полисорбат-85); Triton™; додецилсульфат натрия (SDS); лаурилсульфат натрия; октилгликозид натрия; лаурил-сульфобетаин, миристил-сульфобетаин, линолеил-сульфобетаин, стеарил-сульфобетаин, лаурил-саркозин, миристил-саркозин, линолеил-саркозин, стеарил-саркозин, линолеил-бетаин, миристил-бетаин, цетил-бетаин, лауроамидопропил-бетаин, кокамидопропил-бетаин, линолеамидопропил-бетаин, миристамидопропил-бетаин, пальмидопропил-бетаин, изостеарамидопропил-бетаин (например лауроамидопропил), миристамидопропил-, пальмидопропил- или изостеарамидопропил-диметиламин; натрия метилкокоил- или динатрия метилолеил-таурат; и серию Monaquat™ (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), полиэтилгликоль, полипропилгликоль и сополимеры этилен- и пропиленгликоля, например полоксамеры (например, полоксамер 188).

Количество добавленного поверхностно-активного вещества является таким, что оно уменьшает агрегацию восстановленного белка до приемлемого уровня, как проанализировано с использованием, например, SEC-HPLC HMW компонентов или LMW компонентов, и минимизирует образование частиц после восстановления влагосодержания лиофилизата препарата TNF-связывающего нанотела. Также было показано, что добавление поверхностно-активного вещества уменьшает время восстановления влагосодержания лиофилизированного препарата TNF-связывающих антител и способствует дегазации раствора. Например, поверхностно-активное вещество может присутствовать в препарате (жидком или до лиофилизации) в количестве от примерно 0,001% до 0,6%, например, от примерно 0,005% до 0,05%, от примерно 0,005% до примерно 0,2%, и от примерно 0,01% до 0,2%.

Добавления в препараты

Препараты хранят в виде стерильных растворов или стерильных лиофилизатов. Предотвращение действия микроорганизмов в препаратах также может быть достигнуто путем включения в препарат по меньшей мере одного антибактериального и/или противогрибкового агента, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимеросала и тому подобного. В некоторых случаях лиофилизат разбавляют бактериостатической водой (например, водой, содержащей 0,9% бензилового спирта). Соображения для включения консерванта в препарат известны в данной области, так же как и способы определения консервантов, которые совместимы с конкретным препаратом и способом доставки (например, см. Gupta, et al. (2003), AAPS Pharm. Sci. 5: article 8, p.1-9).

В некоторых случаях препарат является изотоническим. В общем, в препарат может быть добавлен любой компонент, известный в данной области, который вносит вклад в осмолярность/тоничность раствора (например, соли, сахара, полиспирты или их комбинация). Изотоничность обычно достигается с использованием либо компонента щелочного препарата (такого как сахароза) в изотонической концентрации, либо путем добавления дополнительного компонента, такого как сахар, полиспирт, такой как маннит или сорбит, или соль, такая как хлорид натрия.

В некоторых случаях соль используют в препарате TNF-связывающего нанотела, например, для достижения изотоничности или для повышения целостности препарата TNF-связывающего нанотела. Соли, подходящие для применения, обсуждаются выше. Концентрация соли может составлять от 0 мМ до примерно 300 мМ.

В некоторых случаях препарат получают с Tween (например, Tween® 20, Tween® 80) для уменьшения деградации поверхности. Концентрация Tween может составлять от примерно 0,001% до примерно 0,05%. В одном примере Tween 80 используют в препарате в концентрации 0,01%.

В некоторых других случаях препарат получают с аргинином. Концентрация аргинина в препарате может составлять от примерно 0,01% до примерно 5%. В одном примере аргинин используют в препарате в концентрации 2%. В некоторых случаях в TNF-связывающие препараты, описанные в данной заявке, добавляют как Tween, так и аргинин.

В других случаях препарат может быть получен с по меньшей мере одним из: сорбита, глицина, метионина или хлорида натрия. Если в препарат включен сорбит, то он может быть добавлен до концентрации от примерно 1% до примерно 10%. В одном примере сорбит находится в препарате в концентрации 5%. Если в препарат включен глицин, то он может быть добавлен до концентрации от примерно 0,1% до примерно 2%. В одном примере глицин находится в препарате в концентрации 1%. Если в препарат включен метионин, то он может быть добавлен до концентрации от примерно 5 мМ до примерно 150 мМ. В одном примере метионин добавляют к препарату в концентрации 100 мМ. В другом примере метионин добавляют к препарату в концентрации примерно 10 мМ, примерно 20 мМ или примерно 70 мМ. Если в препарат включен хлорид натрия, то он может быть добавлен до концентрации от примерно 5 мМ до примерно 100 мМ. В одном примере хлорид натрия добавляют к препарату в концентрации 55 мМ.

Способы хранения и получения

Замораживание

В некоторых случаях препараты, содержащие антитела, замораживают для хранения. Соответственно, желательно, чтобы препарат был относительно стабильным в таких условиях, в том числе в циклах замораживания-оттаивания. Один из способов определения пригодности препарата состоит в том, чтобы подвергнуть образец препарата по меньшей мере двум, например, трем, четырем, пяти, восьми, десяти или более циклам замораживания (например, при -20°C или -80°C) и оттаивания (например, быстрого оттаивания в водяной бане при 37°C или медленного оттаивания при 2°-8°C), определение количества LMW компонентов и/или HMW компонентов, которые накапливаются после циклов замораживания-оттаивания, и сравнение его с количеством LMW компонентов или HMW компонентов, присутствующих в образце перед процедурой замораживания-оттаивания. Увеличение LMW или HMW компонентов указывает на пониженную стабильность.

Лиофилизация

Препараты можно хранить после лиофилизации. Поэтому тестирование препарата в отношении стабильности белкового компонента препарата после лиофилизации является полезным для определения пригодности препарата. Способ аналогичен способу, описанному выше для замораживания, за исключением того, что образец препарата лиофилизируют вместо замораживания, восстанавливают до его первоначального объема и тестируют на наличие LMW компонентов и/или HMW компонентов. Лиофилизированный образец препарата сравнивают с соответствующим образцом препарата, который не был лиофилизирован. Увеличение LMW или HMW компонентов в лиофилизированном образце по сравнению с соответствующим образцом указывает на пониженную стабильность в лиофилизированном образце.

В общем, протокол лиофилизации включает загрузку образца в лиофилизатор, период предварительного охлаждения, замораживание, вакуумное инициирование, постепенное увеличение до температуры первичной сушки, первичная сушка, постепенное увеличение до температуры вторичной сушки, вторичная сушка и закупоривание образца. Дополнительные параметры, которые могут быть выбраны для протокола лиофилизации, включают вакуум (например, в микронах) и температуру конденсатора. Подходящие скорости изменения температуры составляют от примерно 0,1°C/мин до 2°C/мин, например, от 0,1°C/мин до 1,0°C/мин, от 0,1°C/мин до 0,5°C/мин, от 0,2°C/мин до 0,5°C/мин, 0,1°C/мин, 0,2°C/мин, 0,3°C/мин, 0,4°C/мин, 0,5°C/мин, 0,6°C/мин, 0,7°C/мин, 0,8°C/мин, 0,9°C/мин и 1,0°C/мин. Подходящие температуры полки во время замораживания для цикла лиофилизации составляют обычно от примерно -55°C до -5°C, от -25°C до -5°C, от -20°C до -5°C, от -15°C до -5°C, от -10 C до -5°C, -10°C, -11°C, -12°C, -13°C, -14°C, -15°C, -16°C, -17°C, -18°C, -19°C, -20°C, -21°C, -22°C, -23°C, -24°C или -25°C. Температуры полки могут различаться для первичной сушки и вторичной сушки, например, первичная сушка может осуществляться при более низкой температуре, чем вторичная сушка. В неограничивающем примере первичная сушка может проводиться при 0°C, а вторичная сушка при 25°C.

В некоторых случаях во время замораживания и перед вакуумным инициированием используют протокол отжига. В таких случаях должно быть выбрано время отжига, и температура обычно является выше температуры стеклования композиции. В общем, время отжига составляет от примерно 2 до 15 часов, от примерно 3 до 12 часов, от примерно 2 до 10 часов, от примерно 3 до 5 часов, от примерно 3 до 4 часов, примерно 2 часа, примерно 3 часа, примерно 5 часов, примерно 8 часов, примерно 10 часов, примерно 12 часов или примерно 15 часов. Температура отжига составляет обычно от примерно -35°C до примерно -5°C, например, от примерно -25°C до примерно -8°C, от примерно -20°C до примерно -10°C, примерно -25°C, примерно -20°C, примерно -15°C, примерно 0°C или примерно -5°C. В некоторых случаях температура отжига составляет обычно от -35°C до 0°C, например, от -25°C до -8°C, от -20°C до -10°C, -25°C, -20°C, -15°C, 0°C.

Стабильность препаратов, описанных в данной заявке, можно протестировать с использованием различных параметров лиофилизации, включающих: температуры полки для первичной сушки от -25°C до 30°C, и продолжительность вторичной сушки от 2 часов до 9 часов в диапазоне от 0° до 30°C.

В одном неограничивающем примере препарат 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% полисорбата 80, рН 6,0, с концентрацией белка 50 мг/мл TNF-связывающего нанотела, готовили в виде нефасованного препарата и лиофилизировали. После лиофилизации продукт восстанавливали приблизительно до половины объема для заполнения для обеспечения концентрации белка 100 мг/мл. TNF антитело продемонстрировало, что является устойчивым после лиофилизации для крайних значений температуры продукта. Профиль стабильности при хранении при 50°C в течение четырех недель был идентичен для материала, который был получен с использованием различных циклов лиофилизации (например, см. Фиг.16-20), некоторые из которых имели различия почти 10°C в температуре продукта во время первичной сушки (например, Фиг.13). В общем, цикл лиофилизации может идти от 10 часов до 100 часов, например, от 20 часов до 80 часов, от 30 часов до 60 часов, от 40 часов до 60 часов, от 45 часов до 50 часов, от 50 часов до 65 часов.

Неограничивающие примеры температурного диапазона для хранения препарата антител составляют от примерно -20°C до примерно 50°C, например, от примерно -15°C до примерно 30°C, от примерно -15°C до примерно 20°C, от примерно 5°C до примерно 25°C, от примерно 5°C до примерно 20°C, от примерно 5°C до примерно 15°C, от примерно 2°C до примерно 12°C, от примерно 2°C до примерно 10°C, от примерно 2°C до примерно 8°C, от примерно 2°C до примерно 6°C, или примерно 2°C, 3°C, 4°C, 5°C, 6°C, 7°C, 8°C, 10°C, 15°C, 25°C или 30°C. Несмотря на указанные температуры хранения, в некоторых случаях образцы являются стабильными при изменениях температуры, которые могут временно встречаться во время хранения и условий транспортировки, которые могут ожидаться для таких композиций.

Сушка распылением

В некоторых случаях препарат сушат распылением и затем хранят. Сушку распылением проводят с использованием способов, известных в данной области, и можно модифицировать для применения сушки распылением жидкого или замороженного продукта (например, с использованием способов, таких как способы из Niro Inc. (Madison, WI), Upper-ton Particle Technologies (Nottingham, England), или Buchi (Brinkman Instruments Inc., Westbury, NY), или патентные публ. США №№20030072718 и 20030082276).

Определение целостности SDAB молекулы

Накопление LMW компонентов и HMW компонентов являются полезными критериями стабильности антитела. Накопление либо LMW, либо HMW в препарате является показателем нестабильности белка, хранящегося в виде части препарата. Эксклюзионная хроматография с HPLC может быть использована для определения присутствия LMW и HMW компонентов. Подходящие системы для таких измерений известны в данной области, например, HPLC системы (Waters, Milford, MA). Для оценки целостности антитела в препарате могут быть использованы и другие системы, известные в данной области, например, SDS-PAGE (для контроля HMW и LMW компонентов), биоанализы активности антитела, твердофазный иммуноферментный анализ, способность связывать очищенный белок-мишень (например, TNFα), и катионообменная-HPLC (CEX-HPLC; для обнаружения вариантов и контроля поверхностного заряда). В одном примере биоанализ представляет собой анализ на основе клеток, в котором ингибирование TNFα-зависимой активности исследуют в присутствии различных концентраций приготовленной в виде препарата молекулы нанотела для демонстрации биологической активности.

Изделия

В настоящей заявке также предложено изделие, которое включает препарат, как описано в данной заявке, и предложены инструкции для применения препарата.

Препараты, используемые для введения субъекту, например, в виде фармацевтического препарата, должны быть стерильными. Это осуществляют с использованием способов, известных в данной области, например, путем фильтрации через стерильные фильтрационные мембраны до или после приготовления жидкости или лиофилизации и восстановления влагосодержания. Альтернативно, если это не будет разрушать структуру, то компоненты препарата могут быть простерилизованы путем автоклавирования и затем объединены с компонентами, простерилизованными на фильтре или посредством облучения, с получением препарата.

Фармацевтический препарат можно вводить с помощью устройства для чрескожной доставки, такого как шприц, включая шприц для подкожных инъекций или многокамерный шприц. В одном из воплощений устройство представляет собой предварительно заполненный шприц с надетой или съемной иглой. В других воплощениях устройство представляет собой предварительно заполненный шприц, не имеющий надетой иглы. Игла может быть упакована вместе с предварительно заполненным шприцом. В одном из воплощений устройство представляет собой устройство для автоинъекции, например, автоинжекторный шприц. В другом воплощении устройство для инъекции представляет собой ручку-инжектор. В еще одном воплощении шприц представляет собой шприц с несъемной иглой, шприц Луер Лок (luer lock) или шприц Луер Слип (luer slip). Другие подходящие устройства для доставки включают стенты, катетеры, микроиглы и имплантируемые устройства для контролируемого высвобождения. Композицию можно вводить внутривенно с помощью стандартного в/в оборудования, включая, например, в/в трубки, со встроенными фильтрами или без них.

В некоторых воплощениях шприц является подходящим для применения вместе с автоинжекторным устройством. Например, автоинжекторное устройство может включать систему с одним флаконом, такую как устройство ручка-инжектор для доставки раствора. Такие устройства имеются в продаже от производителей, таких как BD Pens, BD Autojector®, Humaject®, NovoPen®, B-D®Pen, AutoPen® и OptiPen®, GenotropinPen®, Genotronorm Pen®, Humatro Pen®, Reco-Pen®, Roferon Pen®, Biojector®, Iject®, J-tip Needle-Free Injector®, DosePro®, Medi-Ject®, например, изготовленные или разработанные фирмой Becton Dickensen (Franklin Lakes, N.J.), Ypsomed (Burgdorf, Switzerland, www.ypsomed.com; Bioject, Portland, Oreg.; National Medical Products, Weston Medical (Peterborough, UK), Medi-Ject Corp (Minneapolis, Minn.) и Zogenix, Inc, Emeryville, CA. Признанные устройства, содержащие двухфлаконную систему, включают такие системы ручка-инжектор для восстановления влагосодержания лиофилизированного лекарственного средства в картридже для доставки восстановленного раствора, как HumatroPen®.

Изделие может включать контейнер, подходящий для содержания в нем препарата. Подходящий контейнер может представлять собой, без ограничения, устройство, баллон, флакон, шприц, пробирку, небулайзер (например, ультразвуковые небулайзеры или небулайзеры с вибрирующей сеткой (vibrating mesh)), пакет для в/в раствора или ингалятор (например, дозирующий ингалятор (MDI) или сухой порошковый ингалятор (DPI)). Контейнер может быть изготовлен из любого подходящего материала, такого как стекло, металл или пластик, такой как поликарбонат, полистирол или полипропилен. Например, контейнер (например, шприц или флакон) может быть изготовлен из стекла, пластика, циклического олефинового сополимера или циклического олефинового полимера. Возможно, контейнер (например, шприц или флакон) имеет пробку, например, резинову пробку. Конкретные воплощения контейнеров для хранения препаратов по настоящему изобретению включают: (1) жидкость в стеклянном флаконе с резиновой пробкой; (2) жидкость в стеклянном предварительно заполняемом шприце с резиновой пробкой; и (3) жидкость в предварительно заполняемом полимерном шприце, например, из циклического олефинового сополимера (COC) или циклического олефинового полимера (COP), с резиновой пробкой.

В общем, контейнер изготовлен из материала, которые не адсорбирует значительных количеств белка из препарата и не реагирует с компонентами препарата.

В некоторых воплощениях контейнер представляет собой прозрачный стеклянный флакон с пробкой, например, силиконизированной серой пробкой West 4432/50 1319 или пробкой West 4023 Durafluor. В некоторых воплощениях контейнер представляет собой шприц. В конкретных воплощениях препарат содержит 100 мг/мл TNF-связывающего нанотела, 20 мМ гистидина, 7,5% сахарозы, 0,01% полисорбата-80, рН 6,0, в предварительно заполненном шприце. В другом воплощении препарат содержит примерно 10 мг/мл, примерно 100 мг/мл TNF-связывающего нанотела, 20 мМ гистидина, 7,5% сахарозы, 0,01% полисорбата-80, рН 6, в предварительно заполняемом шприце из циклического олефина с силиконизированным серым резиновым плунжером West 4432/50. В других воплощениях препараты включают примерно 10 мг/мл, примерно 50 мг/мл, примерно 100 мг/мл TNF-связывающего нанотела, 20 мМ гистидина, 7,5% сахарозы, 0,01% полисорбата-80, рН 6, в предварительно заполняемом стеклянном шприце с силиконизированным серым резиновым плунжером West 4432/50 или покрытым резиной плунжером West 4023/50 Daikyo Flourotec/B2.

Изделия, описанные в данной заявке, могут дополнительно включать упаковочный материал. Упаковочный материал обеспечивает, в дополнение к информация для применения или введения, например, информацию, требуемую регулирующим органом, относительно условий, при которых данный продукт может быть использован. Например, упаковочный материал может обеспечить инструкции для пациента о том, как вводить предварительно заполненный шприц, содержащий препараты, описанные в данной заявке, или как растворить лиофилизированный препарат в водном разбавителе с образованием раствора в пределах заданного периода времени, например, в течение 2-24 часов или более. Заявленные в настоящем изобретении препараты полезны для применения фармацевтических продуктов у человека.

В некоторых воплощениях препараты можно вводить с помощью небулайзеров. Примеры небулайзеров включают, в неограничивающих примерах, струйные небулайзеры, ультразвуковые небулайзеры и небулайзеры с вибрирующей сеткой. Эти классы используют различные способы создания аэрозоля из жидкости. В общем, любое аэрозоль-генерирующее устройство, которое может поддерживать целостность белка в этих препаратах, является подходящим для доставки препаратов, как описано в данной заявке.

В других воплощениях фармацевтические композиции можно вводить с помощью медицинских устройств. Например, фармацевтические композиции можно вводить с помощью бузыгольного устройства для подкожной инъекции, такого как устройства, раскрытые в пат. США №№5399163, 5383851, 5312335, 5064413, 4941880, 4790824 или 4596556. Примеры хорошо известных имплантатов и модулей включают: пат. США №4487603, в котором раскрыт имплантируемый микроинфузионный насос для распределения лекарственного средства с контролируемой скоростью; пат. США №4486194, в котором раскрыто терапевтическое устройство для введения лекарственных средств через кожу; пат. США №4447233, в котором раскрыт насос для инфузии лекарственного средства с целью доставки лекарственного средства с определеннной скоростью инфузии; пат. США №4447224, в котором раскрыт имплантируемый инфузионный аппарат с переменным потоком для постоянной доставки лекарственного средства; пат. США №4439196, в котором раскрыта осмотическая система для доставки лекарственного средства, имеющая многокамерные отсеки; и пат. США №4475196, в котором раскрыта осмотическая система для доставки лекарственного средства. Терапевтическая композиция также может находиться в форме биодеградируемого или небиодеградируемого препарата с замедленным высвобождением для подкожного или внутримышечного введения. См., например, пат. США №№3773919 и 4767628 и РСТ заявка №WO 94/15587. Непрерывное введение также может быть достигнуто с использованием имплантируемого или внешнего насоса. Введение также можно осуществлять с перерывами, например, посредством единичной суточной инъекции, или непрерывно при низкой дозе, например, с помощью препарата с замедленным высвобождением. Устройство для доставки может быть модифицировано для оптимально подходящего введения SDAB молекулы. Например, шприц может быть силиконизирован в той степени, которая является оптимальной для хранения и доставки SDAB молекулы. Конечно, также известны и многие другие такие имплантаты, системы для доставки и модули.

В изобретении также предложено устройство для введения первого и второго агента. Устройство может включать, например, один или более кожухов для хранения фармацевтических препаратов и может быть сконфигурировано для доставки единичных доз первого и второго агента. Первый и второй агенты можно хранить в одном и том же или отдельных отсеках. Например, устройство может объединять агенты перед введением. Для введения первого и второго агента также можно использовать различные устройства.

Способ введения и лечения

Препараты по изобретению вводят субъекту (например, субъекту-человеку) отдельно или в комбинации со вторым агентом, например, вторым терапевтически или фармакологически активным агентом, для лечения или предупреждения (например, уменьшения или облегчения одного или более симптомов, ассоциированных с) TNFα-ассоциированного расстройства, например, воспалительных или аутоиммунных расстройств. Термин "лечение" относится к применению терапии в количестве, методом и/или способом, эффективным для улучшения состояния, симптома или параметра, ассоциированного с расстройством, или для предупреждения развития расстройства, либо в статистически значимой степени, либо в степени, обнаружимой специалистом в данной области. Эффективное количество, метод или способ могут варьировать в зависимости от субъекта и могут быть адаптированы к субъекту.

Неограничивающие примеры иммунных расстройств, которые можно лечить, включают, но не ограничиваются этим, аутоиммунные расстройства, например артрит (включая ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, остеоартрит, псориатический артрит, артрит, ассоциированный с волчанкой, или анкилозирующий спондилоартрит), склеродермию, системную красную волчанку, синдром Шегрена, васкулит, рассеянный склероз, аутоиммунный тиреоидит, дерматит (включая атопический дерматит и экзематозный дерматит), астенический бульбарный паралич, воспалительное заболевание кишечника (IBD), болезнь Крона, колит, сахарный диабет (I типа); воспалительные состояния, например, кожи (например, псориаз); острые воспалительные состояния (например, эндотоксикоз, сепсис и септицемию, синдром токсического шока и инфекционное заболевание); отторжение трансплантата и аллергия. В одном из воплощений TNFa-ассоциированное расстройство представляет собой артритическое расстройство, например, расстройство, выбранное из одного или более из ревматоидного артрита, ювенильного ревматоидного артрита (RA) (например, ревматоидного артрита от умеренного до тяжелого), остеоартрита, псориатического артрита или анкилозирующего спондилоартрита, ювенильного идиопатического полиартрита (JIA); или псориаз, неспецифический язвенный колит, болезнь Крона, воспалительное заболевание кишечника и/или рассеянный склероз.

В некоторых воплощениях препараты включают второй терапевтический агент. Например, для TNF-нанотел, второй агент может представлять собой анти-TNF антитело или его TNF-связывающий фрагмент, где второе TNF антитело имеет другую эпитопную специфичность, чем TNF-связывающая SDAB молекула препарата. Другие неограничивающие примеры агентов, которые могут быть приготовлены вместе с TNF-связывающей SDAB, включают, например, ингибитор цитокина, ингибитор фактора роста, иммунодепрессант, противовоспалительный агент, метаболический ингибитор, ингибитор фермента, цитотоксический агент и цитостатический агент. В одном из воплощений дополнительный агент представляет собой стандартное лечение артрита, включая, но не ограничиваясь этим, нестероидные противовоспалительные агенты (NSAIDs); кортикостероиды, включая преднизолон, преднизон, кортизон и триамцинолон; и модифицирующие заболевание противоревматические препараты (DMARDs), такие как метотрексат, гидроксихлорохин (Plaquenil) и сульфасалазин, лефлуномид (Arava®), ингибиторы фактора некроза опухолей, включая этанерцепт (Enbrel®), инфликсимаб (Remicade®) (с метотрексатом или без него) и адалимумаб (Humira®), анти-CD20 антитело (например, Rituxan®), растворимый рецептор интерлейкина-1, такой как анакинра (Kineret), золото, миноциклин (Minocin®), пеницилламин, и цитотоксические агенты, включая азатиоприн, циклофосфамид и циклоспорин. В таких комбинированных терапиях можно преимущественно использовать более низкие дозы вводимых терапевтических агентов, что позволит избежать возможных токсических эффектов или осложнений, связанных с различными монотерапиями.

Препараты по изобретению могут находиться в форме жидкого раствора (например, растворов для инъекции и инфузии). Такие композиции можно вводить парентеральным способом (например, подкожной, интраперитонеальной или внутримышечной инъекцией), или посредством ингаляции. Фразы "парентеральное введение" и "вводимый парентерально", как использовано в данной заявке, означают иные способы введения, чем энтеральное и местное введение, обычно посредством инъекции, и включают подкожное или внутримышечное введение, а также внутривенную, внутрисуставную, внутриглазничную, внутрисердечную, интрадермальную, интраперитонеалычую, транстрахеальную, подкожную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и интрастернальную инъекцию и инфузию. В одном из воплощений препараты, описанные в данной заявке, вводят подкожно.

Фармацевтические препараты являются стерильными и стабильными в условиях изготовления и хранения. Фармацевтическая композиция также может быть протестирована для гарантии того, что она удовлетворяет регулятивным и промышленным нормам введения.

Фармацевтический препарат может быть приготовлен в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосомы или другой организованной структуры, подходящей для высокой концентрации белка. Стерильные растворы для инъекции могут быть получены посредством включения агента, описанного в данной заявке, в необходимом количестве в подходящем растворителе с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости, с последующей стерилизацией путем фильтрования. Обычно дисперсии получают посредством включения агента, описанного в данной заявке, в стерильный носитель, который содержит щелочную среду для дисперсии и другие необходимые ингредиенты из тех, что перечислены выше. Надлежащую текучесть раствора можно поддерживать, например, путем применения покрытия, такого как лецитин, путем поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсии и путем применения поверхностно-активных веществ. Длительная абсорбция инъецируемых композиций может быть обусловлена включением в композицию агента, который замедляет абсорбцию, например, моностеаратных солей и желатина.

В некоторых воплощениях охарактеризованы параметры, которые описывают препараты, например параметры, которые могут появляться на маркировке продукта. Такие параметры включают, например, цвет (типично от бесцветного до слегка желтого или от бесцветного до желтого), прозрачность (типично от прозрачного до слегка опалесцирующего или от прозрачного до опалесцирующего) и вязкость (типично от примерно 1 до 5 сП, когда измерено при температуре окружающей среды, такой как при 20°C-30°C). Такие параметры могут быть измерены способами, известными в данной области. Например, прозрачность может быть измерена с использованием имеющихся в продаже стандартов опалесценции (доступных, например, от Hach Company, Loveland, CO 80539).

ПРИМЕРЫ

Изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами. Примеры предложены только для иллюстративных целей. Они не предназначены ограничивать объем или содержание изобретения каким-либо образом.

Пример 1: Стабильность высококонцентрированного лиофилизированного препарата ATN-103 (продолжительность 6 месяцев)

Один способ хранения антитела, используемого, например, для терапевтических применений, состоит в высушенном порошке, полученном путем лиофилизации. Соответственно, исследовали долговременную стабильность лиофилизированного TNF-связывающего препарата.

Кратко, препарат, содержащий гуманизированное TNF-связывающее нанотело (50 мг/мл), 10 мМ гистидина, 5% сахарозы (масса/объем), 0,01% полисорбата 80, рН 6,0, получали посредством стерильной фильтрации и переносили в 5 мл апирогенный стеклянный трубчатый флакон, и затем лиофилизировали. Препарат хранили при 4°C, 25°C или 40°C в течение одного месяца, трех месяцев и шести месяцев, затем восстанавливали в стерильной воде (USP) с получением восстановленного препарата, так что препарат содержал 100 мг/мл TNF-связывающего нанотела, 20 мМ гистидина, 10% сахарозы, 0,02% полисорбата 80, рН 6,0.

Стабильность высококонцентрированной жидкости оценивали по биологической активности, связыванию человеческого сывороточного альбумина (HSA), процентному содержанию HMW и процентному содержанию LMW посредством SE-HPLC, процентному содержанию TNF-связывающего нанотела и процентному содержанию примеси непродукта посредством SDS-СЕ, и определению посредством CEX-HPLC относительного времени удерживания и сравнимости профиля элюции с эталонным стандартом TNF-связывающего нанотела.

Лиофилизированные препараты TNF-связывающего нанотела анализировали в отношении биологической активности, используя анализ, описанный в WO 2006/122786. Фиг.1 иллюстрирует данные из такой совокупности биоанализов. Данные выражали в виде единиц на миллиграмм. Образцы содержали примерно 5-5,5×10⁶ ед./мг до хранения и примерно 4,5-5,5×10⁶ ед./мг после инкубации. В общем, не наблюдалось никакого значительного изменения в количестве биоактивности после шести месяцев хранения в любом из образцов. Таким образом, препарат, как определено по биологической активности, является подходящим для хранения лиофилизированного препарата в течение по меньшей мере шести месяцев.

Лиофилизированные препараты TNF-связывающего нанотела также анализировали в отношении связывающей активности человеческого сывороточного альбумина (HSA). Фиг.2 иллюстрирует данные из такой совокупности анализов связывания. Первоначальная связывающая активность препарата составляла примерно 100% эталонного образца и по существу не изменялась для любого из образцов в течение шестимесячного периода тестирования. Таким образом, препарат, как определено по HSA-связывающей активности, является подходящим для хранения лиофилизированного препарата в течение по меньшей мере шести месяцев.

Процентное содержание HMW компонентов анализировали с использованием SE-HPLC. Процентное содержание HMW компонентов в препарате до лиофилизации и восстановления влагосодержания составляло примерно 0,1% общего белка в препарате, а также от примерно 0,1% до 0,2% во всех образцах, хранившихся при 4°C и 25°C (Фиг.3). После шести месяцев хранения при 40°C препараты содержали примерно 0,35% HMW компонентов (Фиг.3). Таким образом, не наблюдалось никакого значительного увеличения в уровне HMW компонентов в образцах, хранившихся при 4°C и 25°C в течение шести месяцев.

Процентное содержание LMW компонентов анализировали с использованием SE-HPLC. Процентное содержание LMW компонентов в препарате было ниже предела обнаружения (т.е. 0,0%) при температурах 4°C, 25°C и 40°C в течение вплоть до шести месяцев.

Процентное содержание TNF-связывающего нанотела анализировали с использованием SDS-CE. Первоначальное процентное содержание TNF-связывающего нанотела в препарате составляло примерно 100% и по существу не изменялось для любого из образцов в течение шестимесячного периода тестирования (Фиг.4).

Процентное содержание примеси непродукта анализировали с использованием SDS-СЕ. Незначительную примесь непродукта наблюдали посредством SDS-CE для препарата при температурах 4°C, 25°C и 40°C в течение вплоть до шести месяцев.

Лиофилизированные препараты TNF-связывающего нанотела также тестировали в отношении идентичности с использованием CEX-HPLC. Профиль элюции для препарата сравнивали с эталонным стандартом при температурах 4°C, 25°C и 40°C в течение вплоть до шести месяцев. Относительное время удерживания предполагаемого пика не изменялось по 1,00 стандарту при температурах 4°C, 25°C и 40°C в течение вплоть до шести месяцев.

Также тестировали эффект добавления полисорбата-80 на свойства восстановления влагосодержания лиофилизированного препарата TNF-связывающего нанотела. Добавление полисорбата 80 к лиофилизированному продукту улучшает качество продукта посредством улучшения внешнего вида и растворения лиофилизированного порошка, как можно видеть в Таблице ниже.

Таблица 1
	С полисорбатом-80	Без полисорбата-80
Время восстановления	2 мин, 39 с	3 мин, 16 с
Время возврата в исходное состояние	Сразу	<5 мин
Вспенивание	Мало пены	Слегка больше пены
Исчезновение пузырьков	Сразу	<3 мин

Данные, описанные в данной заявке, демонстрируют ограниченные изменения в продуктах деградации в зависимости от времени хранения при различных температурах.

Пример 2: Устойчивость препарата TNF-связывающего нанотела к лиофилизации

В дополнение к препарату, лиофилизированному путем применения целевого цикла лиофилизации (Пример 1), получали две дополнительные партии лекарственного продукта путем применения к одному и тому же препарату двух дополнительных циклов лиофилизации на "устойчивость". Два цикла лиофилизации на "устойчивость" имитируют значительные отклонения в процессе, которые могут наблюдаться в промышленной установке. Один и тот же препарат лекарственного продукта использовали в исследовании устойчивости и в исследовании целевого (контрольного) цикла лиофилизации: 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% полисорбата 80, 50 мг/мл TNF-связывающего нанотела, при рН 6,0. При восстановлении влагосодержания (с использованием объема разбавителя для восстановления, составляющего приблизительно половину объема заполненного продукта перед лиофилизацией) препарат ATN-103 представляет собой следующее: 20 мМ гистидина, 10% сахарозы, 0,02% полисорбата 80, 100 мг/мл TNF-связывающего нанотела, при рН 6,0.

Два цикла лиофилизации на устойчивость, которые имитируют значительные отклонения в процессе, называются "высокая влажность" и "агрессивный". На Фиг.5 показано, что препарат, подвергнутый циклам лиофилизации на устойчивость, демонстрирует сравнимую стабильность со стабильностью в целевом (контрольном) цикле. Флаконы с препаратом для лиофилизации на устойчивость помещали на ускоренную стабильность параллельно с контрольным циклом лиофилизации и анализировали посредством SE-HPLC.

Эти данные демонстрируют, что лиофилизированный препарат ATN-103 является устойчивым к значительным отклонениям в процессе без влияния на продукт.

Процентное содержание LMW компонентов для препарата, подвергнутого контрольному циклу лиофилизации и циклам лиофилизации на устойчивость, анализировали с использованием SE-HPLC. Процентное содержание LMW компонентов согласно SE-HPLC для лиофилизированного TNF-связывающего нанотела было ниже предела обнаружения (т.е. 0,0%) при t₀ и 50°C в течение вплоть до одного месяца в течение всех трех циклов.

Инструкции по лиофилизации

Во всех прогонах использовали экран из алюминиевой фольги перед дверью и высоту полки 63 мм для минимизации излучения внутри лиофилизатора. Во всех прогонах один поддон полностью заполняли для поддержания согласованной нагрузки на лиофилизатор. Пробки автоклавировали и сушили для всех флаконов для белка. Все флаконы для образцов белка промывали деионизированной водой и подвергали депирогенизации. Флаконы и пробки, которые использовали для заполнения оставшейся части поддона, не обрабатывали.

Флаконы, заполненные препаратом TNF-связывающего нанотела, получали в асептических условиях в боксе с биозащитой с концентрацией 160 мг/флакон. Флаконы для исследований стабильности заполняли 3,2 мл свежего препарата перед каждым прогоном (материал, который не был предварительно лиофилизирован). Во время лиофилизации дополнительные флаконы заполняли подходящими буферами, которые были совместимы с целевым циклом лиофилизации, для поддержания согласованной нагрузки на лиофилизатор. Лиофилизацию контролировали путем применения термопар в пределах белкового ряда.

Модулированная дифференциальная сканирующая калориметрия (mDSC)

Все образцы для mDSC вводили в модулированном режиме с амплитудой 0,5°C и периодом 100 секунд. Для порошков после лиофилизации, образцы нагревали при 2°C/мин до 150°C. Все образцы порошков получали с использованием продуваемой азотом перчаточной камеры. Для жидких образцов все температурные повышения проводили при 0,5°C/мин и температуры подгоняли к температурам, используемые в циклах лиофилизации. Конечное линейное изменение нагревания осуществляли при 2°C/мин для увеличения стеклования. Жидкие образцы получали на лабораторном столе.

Анализ влажности

Для анализа влажности в лиофилизированных образцах использовали титрование по Карлу Фишеру. Лиофилизированные образцы разбавляли 3 мл метанола.

Осуществляли двойные или тройные инжекции по 500 мкл. 1% водный стандарт инжектировали после применения в качестве контроля пригодности.

Инфракрасная спектроскопия с Фурье-преобразованием (FTIR)

Посредством FTIR измеряли вторичную структуру антитела в сухом порошковом состоянии. Осадок, содержащий приблизительно 1 мг приготовленного в виде препарата, высушенного белка, диспергированного в 300 мг KBr, уплотняли и сканировали 200 раз. После сбора данных анализ включал спектральное вычитание сахарозного плацебо, корректировку базовой линии, сглаживание, вторую производную и нормализацию по площади.

Стабильность

Стабильность лиофилизированного антитела в препаратах оценивали в зависимости от времени хранения и температуры. Образцы лиофилизированного TNF-связывающего нанотела анализировали после лиофилизации, после четырех недель хранения при 2°C-8°C и после двух недель и четырех недель хранения при 50°C. Охлажденные образцы хранили в малой холодильной комнате. Высокотемпературные образцы хранили в термостате Lab Line Imperial, установленном на 50°C. В соответствующие временные точки образцы извлекали из хранения и оставляли нагреваться или охлаждаться до комнатной температуры перед анализом.

Восстановление влагосодержания и внешний вид

Флаконы с лиофилизированными препаратами из постлиофилизационного анализа и анализа стабильности при хранении тщательно осматривали до, во время и после восстановления с 1,3 мл стерильной воды для инъекции. Флаконы осматривали в световом коробе против как черного, так и белого фона в отношении цвета таблетки, целостности, влажности, частиц и дефектов перед восстановлением влагосодержания. После визуального осмотра лиофилизированной таблетки колпачок и обжимное укупорочное средство удаляли из флакона с помощью разжимных щипцов. Пробку удаляли и стерильную воду для инъекции медленно переносили во флакон, используя подходящую пипетку. Разбавитель добавляли, используя вихревое движение для обеспечения полного смачивания таблетки. Как только разбавитель был полностью добавлен, время восстановления влагосодержания запускали стандартным лабораторным таймером и флакон снова закрывали пробкой. Восстановление влагосодержания было полным, когда растворялся последний кусок твердого вещества. Вращая флакон между руками, облегчали восстановление влагосодержания. Когда лиофилизированная таблетка подвергалась процессу восстановления влагосодержания, записывали наблюдения о состоянии растворяющего раствора, таком как прозрачность, образование пузырьков и образование пены. После завершения восстановления влагосодержания записывали время восстановления влагосодержания и флаконы оставляли на столе на несколько минут для того, чтобы полученный раствор мог отстояться и большая часть пузырьков, образовавшихся во время восстановления влагосодержания, смогла исчезнуть. Восстановленной раствор затем осматривали в световом коробе против как черного, так и белого фона в отношении цвета, прозрачности и частиц.

Высокоэффективная эксклюзионная хроматография (SEC-HPLC)

Два микролитра неразведенных образцов препарата TNF-связывающего нанотела впрыскивали в колонку G3000swxl с предколонкой (TosoHaas Part №№08541 и 08543). Подвижная фаза представляла собой забуференный фосфатами физиологический раствор (PBS) с добавлением 250 мМ хлорида натрия. Скорость потока составляла 0,75 мл/мин и время прогона составляло 30 минут. Ультрафиолетовое поглощение контролировали при длине волны 280 нм. Хроматограмму интегрировали для отделения основного пика TNF-связывающего нанотела от высоко- и низкомолекулярных компонентов с использованием программного обеспечения Waters Empower™.

Спектроскопия поглощения в ультрафиолетовой и видимой области для определения концентрации (A₂₈₀)

Образцы препарата, имеющего антитело в концентрации 100 мг/мл, разбавляли до приблизительно 0,5 мг/мл и 0,25 мг/мл путем добавления 10 мкл образца до 1990 мкл и 3990 мкл 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, рН 6,0, соответственно. Двести микролитров полученных растворов помещали в отдельные лунки на 96-луночном микропланшете вместе с пробой в буфере. Планшет считывали в планшет-ридере Spectramax® Plus на ультрафиолетовое поглощение при длинах волн 280 нм и 320 нм. Вычитание поглощения при 320 нм из поглощения при 280 нм и деление на коэффициент поглощения (1,405 мл/мг-см), умноженное на длину пути (1 см), определяло концентрации белка в растворе в каждой лунке. Использовали подходящий фактор разведения и определяли среднюю концентрацию белка.

Спектроскопия поглощения в ультрафиолетовой и видимой области для светорассеяния (A₄₂₀)

Двести микролитров каждого образца TNF-связывающего нанотела, подлежащего анализу, вносили в отдельные лунки на 96-луночном микропланшете. Проба с буфером служила в качестве контроля. Планшет считывали в планшет-ридере Spectramax Plus на видимое поглощение при длине волны 420 нм.

Стратегия развития цикла

Ряд последовательных стадий (описанных ниже) использовали для развития цикла лиофилизации.

Идентификация критической температуры продукта

Критическую температуру продукта TNF-связывающего нанотела идентифицировали посредством модулированной дифференциальной сканирующей калориметрии (mDSC). Этот способ используют для идентификации температуры стеклования замороженного продукта (mDSC). Цикл лиофилизации, который поддерживает продукт ниже этой температуры во время первичной сушки, должен давать интактную структуру таблетки. Предположили, что самая низкая подходящая температура составляет -25°C, и поэтому эту температуру обычно включают в процедуры, предназначенные для тестирования условий и препаратов при разработке препарата и способов лиофилизации антитела, как описано в данной заявке.

Проведение цикла лиофилизации

Основываясь на результатах описанных выше исследований, проводили три различных цикла лиофилизации для изучения трех интересующих параметров в развитии подходящей процедуры лиофилизации для получения лиофилизированного препарата, подходящего для хранения или других процедур. Первый исследуемый параметр представлял собой контрольный цикл, который повторяет циклы из предыдущих исследований стабильности. Этот цикл использовали во всех предшествующих экспериментальных циклах на стабильность, поэтому он служил в качестве исходной точки для этого анализа.

Второй тестируемый параметр представлял собой влияние непроведения стадии вторичной сушки с целью получения лиофилизированных таблеток с высоким содержанием остаточной влажности. Этот цикл лиофилизации служит для оценки чувствительности препарата TNF-связывающего нанотела к высокому содержанию остаточной влажности и может быть использован в оценке производственных отклонений в начальных клинических партиях перед проведением формальных исследований устойчивости к лиофилизации.

Третий тестируемый параметр представлял собой агрессивный цикл. Увеличение температуры первичной сушки существенно выше заданной величины контрольного цикла может значительно увеличить температуру продукта препарата TNF-связывающего нанотела во время первичной сушки. Этот цикл лиофилизации служит для оценки чувствительности препарата TNF-связывающего нанотела к температуре продукта во время лиофилизации и может быть использован в оценке производственных отклонений в начальных клинических партиях перед проведением формальных исследований устойчивости к лиофилизации.

Оценка циклов лиофилизации

Оценка выбранных циклов лиофилизации в отношении препаратов TNF-связывающего нанотела разделилась на два аспекта: непосредственное сравнение на основе тестов, проводимых после лиофилизации, и возможное длительное влияние, вызванное инкубацией в ускоренных условиях.

Идентификация критической температуры продукта

Продукт препарат TNF-связывающего нанотела содержал почти 50% белка. Ожидается, что сам белок влияет на физические свойства замороженного и лиофилизированного состояний. Перед лиофилизацией низкотемпературная модулированная дифференциальная сканирующая калориметрия (mDSC) выявила температуру стеклования концентрированной вымораживанием аморфной фазы препарата. Основываясь на данных агрессивного цикла лиофилизации, выбрали температуру продукта -12°C в качестве критической температуры, которая должна быть ниже во время лиофилизации.

Пример 3: Стабильность высококонцентрированного жидкого препарата TNF-связывающего нанотела (продолжительность 6 месяцев)

В некоторых случаях желательно хранить препарат TNF-связывающего нанотела в жидком формате. Соответственно, исследовали долговременную стабильность жидкого TNF-связывающего препарата, содержащего относительно высокую концентрацию TNF-связывающего нанотела. Кратко, препарат, содержащий гуманизированное TNF-связывающее нанотело (приблизительно 80 мг/мл), 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% полисорбата 80, рН 6,0, получали для хранения посредством стерильной фильтрации препарата в апирогенных сосудах из нержавеющей стали. Препарат хранили при -20°C или 4°C в течение примерно трех месяцев и шести месяцев. Стабильность высококонцентрированной жидкости оценивали по биологической активности, связыванию человеческого сывороточного альбумина (HSA), процентному содержанию HMW и процентному содержанию LMW посредством SE-HPLC, процентному содержанию ATN-103 и процентному содержанию примеси непродукта посредством SDS-CE и определению посредством СЕХ-HPLC относительного времени удерживания и сравнимости профиля элюции с эталонным стандартом TNF-связывающего нанотела.

Анализ биологической активности использовали в качестве параметра стабильности для высококонцентрированного жидкого препарата TNF-связывающего нанотела. Анализ проводили, как описано выше в Примере 1. Образцы хранили при -20°C и 4°C в течение примерно трех месяцев и шести месяцев. Данные выражали в виде единиц на миллиграмм (Фиг.6). Образцы содержали примерно 6×10⁶ ед./мг до хранения и примерно 4,5-5×10⁶ ед./мг после инкубации. Это отражает по существу отсутствие изменений в биоактивности образцов во время хранения. Вариабельность в значениях отражает вариабельность, характерную для анализа. Поскольку не наблюдается уменьшения количества биологической активности в образцах, эти данные обеспечивают дополнительное подтверждение пригодности препарата для хранения TNF-связывающего нанотела.

Еще один параметр стабильности исследовали с использованием высококонцентрированного жидкого препарата TNF-связывающего нанотела: связывающую активность. В этих экспериментах процент связывающей активности препарата определяли, сравнивая с контролем после хранения при -20° и 4°C в течение шести месяцев. Анализ специфически контролирует аффинность связывания TNF-связывающего с человеческим сывороточным альбумином (HSA). Первоначальная связывающая активность препарата составляла примерно 100% от эталонного образца и по существу не изменялась для любого из образцов во время шестимесячного периода тестирования (Фиг.7). Измеренная связывающая активность составляла вплоть до примерно 110% от эталона, который, с учетом ошибки, обычно наблюдающейся в этом анализе, отражает по существу отсутствие изменений в связывающей активности образцов с течением времени и отсутствие зависимости от температуры в результатах связывания.

Процентное содержание HMW компонентов анализировали с использованием SEC-HPLC, Процентное содержание высокомолекулярных компонентов в высококонцентрированном жидком препарате до хранения составляло от 0,1% до 0,15% общего белка в препарате и составляло примерно 0,1% в образцах, хранившихся при -20°C, и примерно 0,2% в образцах, хранившихся при 4°C, вплоть до шести месяцев хранения (Фиг.8). Таким образом, не наблюдалось никакого значительного увеличения в уровне HMW компонентов в образцах, хранившихся при -20°C и 4°C в течение по меньшей мере шести месяцев.

Процентное содержание LMW компонентов в высококонцентрированном жидком препарате TNF-связывающего нанотела также анализировали в жидком препарате TNF-связывающего нанотела. Процентное содержание LMW компонентов в препарате было ниже предела обнаружения (т.е. 0,0%) при температуре -20°C и составляло примерно 0,1% в образцах, хранившихся при 4°C в течение вплоть до шести месяцев (Фиг, 9). Таким образом, не наблюдалось никакого значительного увеличения в уровне LMW компонентов в образцах, хранившихся при -20°C и 4°C в течение по меньшей мере шести месяцев.

Процентное содержание LMW компонентов анализировали с использованием SE-HPLC. Процентное содержание LMW компонентов в высококонцентрированном жидком препарате было ниже предела обнаружения (т.е. 0,0%) при температурах 4°C, 25°C и 40°C в течение вплоть до шести месяцев.

Процентное содержание TNF-связывающего нанотела анализировали с использованием SDS-CE. Первоначальные процентное содержание TNF-связывающего нанотела в высококонцентрированном жидком препарате составляло примерно 100% и по существу не изменялось для любого из образцов в течение шестимесячного периода тестирования (Фиг.10).

Процентное содержание примеси непродукта анализировали с использованием SDS-CE. Незначительную примесь непродукта наблюдали посредством SDS-CE для жидкого высококонцентрированного препарата TNF-связывающего нанотела при температурах -20°C и 4°C в течение вплоть до шести месяцев.

Высококонцентрированные жидкие препараты также тестировали на идентичность с использованием CEX-HPLC. CEX-HPLC используют в качестве теста на идентичность. Профиль элюции для TNF-связывания высококонцентрированного жидкого препарата был сравним с эталонным стандартом при температурах -20°C и 4°C в течение вплоть до шести месяцев. Относительное время удерживания предполагаемого пика не изменялось по 1,00 стандарту при температурах -20°C и 4°C в течение вплоть до шести месяцев.

Данные, описанные в данной заявке, демонстрируют ограниченные изменения в продуктах деградации в зависимости от времени хранения при различных температурах.

Пример 4: Стабильность высококонцентрированного жидкого препарата TNF-связывающего нанотела в шприце, предварительно заполненном жидкостью (продолжительность 12 месяцев)

Стабильность высококонцентрированного жидкого TNF-связывающего нанотела, загружаемого в предварительно заполняемый шприц в следующем препарате: 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% полисорбата 80, приблизительно 80 мг/мл TNF-связывающего нанотела, при рН 6,0, оценивали по процентному содержанию HMW и процентному содержанию LMW посредством SE-HPLC и процентному содержанию кислотных и щелочных компонентов посредством CEX-HPLC, и определению относительного времени удерживания и сравнимости профиля элюции с эталонным стандартом TNF-связывающего нанотела. Препарат хранили при 4°C в течение двенадцати месяцев, при 25°C в течение трех месяцев и при 40°C в течение двух месяцев.

В первоначальной временной точке наблюдалось примерно 0,7% HMW компонентов. Через двенадцать месяцев при 4°C наблюдалось минимальное увеличение до примерно 0,8% HMW компонентов. Через три месяца при 25°C HMW компоненты увеличивались до примерно 1,8%. Через два месяца при 40°C HMW компоненты увеличивались с течением времени до примерно 27% (Фиг.11).

В первоначальной временной точке наблюдалось примерно 0,1% LMW компонентов. Через двенадцать месяцев при 4°C наблюдалось минимальное увеличение до 0,25% LMW компонентов. Через три месяца при 25°C наблюдалось небольшое увеличение до примерно 0,5% LMW. Через два месяца при 40°C деградация увеличивалась с течением времени до примерно 1,4% LMW компонентов (Фиг.12).

В первоначальной временной точке наблюдалось примерно 6% кислотных компонентов. Через двенадцать месяцев при 4°C наблюдалось примерно 7,5% кислотных компонентов. Через три месяца при 25°C наблюдалось примерно 7,3% кислотных компонентов, с увеличением кислотных компонентов с течением времени. Через два месяца при 40°C кислотные компоненты увеличивались с течением времени до примерно 8,3% (Фиг.13).

В первоначальной временной точке наблюдалось примерно 1,7% щелочных компонентов. Через двенадцать месяцев при 4°C наблюдалось примерно 2,9% щелочных компонентов. Через три месяца при 25°C наблюдалось примерно 2,9% щелочных компонентов, с увеличением щелочных компонентов с течением времени. Через два месяца при 40°C щелочные компоненты увеличивались с течением времени до примерно 27% (Фиг.14).

Относительные времена удерживания и профили элюции для всех образцов сравнивали с эталонным стандартом TNF-связывающего нанотела.

Данные демонстрируют ограниченные изменения в продуктах деградации в зависимости от времени хранения при 4°C и 25°C, что указывает на то, что препарат является подходящим в виде жидкости в предварительно заполненном шприце. Некоторые заметные изменения в продуктах деградации наблюдали при 40°C, что является напряженным состоянием для жидкости.

Пример 5: Стабильность высококонцентрированных жидкостей ATN-103-других препаратов (идентификация других стабилизирующих и дестабилизирующих эксципиентов)

С целью скрининга возможных эксципиентов для жидкого препарата TNF-связывающего нанотела исследовали стабильность других высококонцентрированных жидких препаратов TNF-связывающего нанотела. Дополнительную работу осуществляли, используя различные эксципиенты для обеспечения дополнительной стабильности и для изготовления изотонического препарата (подходящего для инъекции субъектам-людям). Концентрация TNF-связывающего нанотела находится в диапазоне от 88 мг/мл до 100 мг/мл.

Исследуемые препараты представляли собой:

1. 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% полисорбата-80, 100 мМ аргинина (основание), рН 5,8

2. 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% полисорбата-80, 55 мМ NaCl, рН 6,1

3. 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% полисорбата-80, 55 мМ аргинина HCl, pH 6,1

4. 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% полисорбата-80, 100 мМ глицина, pH 6,0

5. 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% полисорбата-80, 100 мМ метионина, рН 6,0

6. 10 мМ гистидина, 8% сахарозы, 0,01% полисорбата-80, рН 6,0

CTL: 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% полисорбата-80, рН 6,0

Первоначальные свойства раствора анализировали в отношении рН, осмотической концентрации раствора, концентрации, мутности и вязкости. Все препараты давали в результате изотонические растворы и демонстрировали приемлемую прозрачность при измерении A455 и низкую вязкость (от 2,4 сП до 3,1 сП), демонстрируя пригодность предварительно заполненного шприца и автоинжектора.

Таблица 2
Первоначальные свойства раствора
Препарат	мОсм	рН	МГ/МЛ	Мутность	Вязкость (сП)
1	356	5,82	98	<III	3,1
2	312	6,13	88	<III	2,6
3	303	6,12	89	<III	2,6
4	305	6,05	88	<III	2,4
5	309	5,97	99	<III	2,8
6	306	6,03	88	<III	2,6
CTL/0	197	6,01	100	<III	2,8

Стабильность высококонцентрированной жидкости оценивали по процентному содержанию HMW и процентному содержанию LMW посредством SE-HPLC. Эти вещества исследовали на стабильность при 5°C, 25°C и 40°C в течение 3 месяцев. Данные для 40°C в течение 2 недель показаны на Фиг.15.

Некоторые заметные изменения в продуктах деградации наблюдали при 40°C, что является напряженным состоянием для жидкости. Краткая ускоренная стабильность (2 недели при 40°C) показывает, что препараты 4, 5 и 6 обеспечивают сравнимую или улучшенную стабильность по сравнению с контролем (10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% полисорбата-80, рН 6,0). Препараты 1, 2 и 3, по-видимому, оказывают негативное влияние на стабильность.

Данные показывают, что глицин, метионин и повышенная сахароза являются стабилизирующими для высококонцентрированных жидких препаратов TNF-связывающего нанотела. Данные показывают, что основание аргинина, гидрохлорид аргинина и хлорид натрия могут быть дестабилизирующими для высококонцентрированных жидких препаратов TNF-связывающего нанотела в некоторых условиях.

Пример 6: Стабильность TNF-связывающего нанотела из высококонцентрированного жидкого препарата, кратковременная (продолжительность 2 недели), гистидин и Трис-буферы

Стабильность TNF-связывающего нанотела в виде жидкости проиллюстрирована на следующих Фиг.16-19. Исследовали два препарата: ATN-103 при 118 мг/мл в 20 мМ гистидина, 5% сахарозы, рН 6,0; и ATN-103 при 117 мг/мл в 20 мМ Трис, 5% сахарозы, рН 7,2. Стабильность препаратов оценивали по процентному содержанию HMW и процентному содержанию LMW посредством SE-HPLC, и процентному содержанию кислотных и процентному содержанию щелочных компонентов посредством CEX-HPLC. Данные демонстрируют ограниченные изменения в продуктах деградации в зависимости от времени хранения при 4°C. Некоторые заметные изменения в продуктах деградации наблюдали при 40°C, что является напряженным состоянием для жидкости. Данные показывают, что стабильность TNF-связывающего нанотела в гистидиновом и Трис-буферах является по существу сходной в этих условиях приготовления, где использование гистидина несколько более предпочтительно (несколько меньше LMW). Активности предварительного препарата позже показали, что повышенный рН (7 или больше) в большей степени приводит к образованию LMW, объясняя наблюдаемое ниже преимущество.

Пример 7: Стабильность высококонцентрированного жидкого препарата TNF-связывающего нанотела: Оценка напряжений на поверхности раздела (замораживание/оттаивание)

На Фиг.20-23 продемонстрирована стабильность жидкого препарата TNF-связывающего нанотела при приблизительно 80 мг/мл в 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% полисорбата 80, рН 6,0. Оценка основана на эксклюзионной-HPLC, мутности и оценке концентрации после многократных циклов замораживания-оттаивания от -80°C до 37°C.

Данные демонстрируют ограниченное изменение в стабильности в зависимости от многократных циклов замораживания-оттаивания от -80°C до 37°C.

Пример 8: Стабильность высококонцентрированного жидкого препарата TNF-связывающего нанотела: оценка кратковременных термических воздействий, потенциально встречающихся в процессах изготовления

На Фиг.24 продемонстрировано, что жидкое TNF-связывающее нанотело является устойчивым к кратковременным термическим воздействиям, которые могли бы потенциально встретиться во время процессов изготовления лекарственного вещества и лекарственного продукта. Высококонцентрированную жидкость исследовали в 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% полисорбата 80, рН 6,0, при приблизительно 80 мг/мл и 50 мг/мл. Оценка основана на процентном содержании HMW и процентном содержании LMW посредством эксклюзионной-HPLC после воздействия в течение 8 часов при 40°C, 7 суток при 25°C и 29 суток при 5°C. Данные демонстрируют ограниченные изменения в агрегатах в зависимости от времени хранения при 5°C и 25°C. Некоторые изменения в агрегатах наблюдали при 40°C, что является напряженным состоянием для жидкости.

Процентное содержание LMW компонентов согласно SE-HPLC для высококонцентрированного жидкого TNF-связывающего нанотела была ниже предела обнаружения (т.е. 0,0%) при указанных температурах и продолжительностях.

Пример 9: Стабильность низкоконцентрированного жидкого препарата ATN-103: оценка оптимального рН и препарата

На Фиг.25-28 продемонстрирована стабильность жидких препаратов TNF-связывающего нанотела при низкой концентрации (приблизительно 1 мг/мл), забуференных при рН 5,5, 6,0, 6,5 и 7,0. Стабильность низкоконцентрированного жидкого TNF-связывающего нанотела исследовали в зависимости от препарата и рН, в ответ на напряжение, такое как воздействие температуры 40°C (Фиг.25 и 26), встряхивание (Фиг.28) и замораживание/оттаивание. Четыре значения рН оценивали для каждого из трех следующих препаратов: 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% Tween-80; 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% Tween-80, 150 мМ аргинина HCl; и 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% Tween-80, 75 мМ хлорида натрия. В этой совокупности данных Tween-80 используют в качестве синонима полисорбата-80. Образцы для исследования оценивали, используя SE-HPLC и УФ (в отношении и концентрации, и мутности - измеряя при A455).

Коды для графических материалов:

HST: 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% Tween-80

HSTA: 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% Tween-80, 150 мМ аргинина HCl

HSTS: 10 мМ гистидина, 5% сахарозы, 0,01% Tween-80, 75 мМ хлорида натрия

Результаты показывают, что диапазон рН от 5,5 до 7,0 является подходящим для препарата. Данные показывают, что в некоторых условиях рН 7,0 может продемонстрировать некоторые нежелательные эффекты (повышенное количество низкомолекулярных компонентов). Данные показывают, что нет значительной пользы от добавления аргинина HCl или хлорида натрия в препарат лекарственного вещества, а в некоторых случаях это может быть дестабилизирующим.

На Фиг.27 показано процентное содержание HMW компонентов согласно SE-HPLC для TNF-связывающего нанотела после хранения при 4°C, где через 4 недели по существу не наблюдалось никакого изменения. Процентное содержание LMW компонентов согласно SE-HPLC для низкой концентрации TNF-связывающего нанотела было ниже предела обнаружения (т.е. 0,0%) при 4°C для всех тестируемых состояний раствора. В результате многократных циклов замораживания-оттаивания не наблюдалось никаких значительных изменений в HMW или LMW компонентах согласно SE-HPLC, или УФ A280, или A455.

Пример 10: Низкоконцентрированное жидкое TNF-связывающее нанотело: оценка эффекта встряхивания в зависимости от рН и препарата

Представлены данные, которые также показывают, что TNF-связывающее нанотело является чувствительным к встряхиванию при 300 об/мин в течение 4 часов (при 15°C) в пределах этого рН диапазона (Фиг.28). Препараты, содержащие хлорид натрия и аргинин, являются особенно чувствительными к встряхиванию. Препарат, содержащий гистидин, сахарозу, tween-80, показал наименьшую деградацию высокомолекулярных компонентов в пределах каждой рН группы. Препарат, содержащий гистидин, сахарозу, tween-80, при рН 6,0 и 7,0 показал наименьшую деградацию.

УФ поглощение низкоконцентрированного TNF-связывающего нанотела после встряхивания контролировали при 280 нм (для контроля концентрации) и 455 нм (для контроля мутности). В результате встряхивания не наблюдалось никаких значительных изменений.

Низкоконцентрированные растворы TNF-связывающего нанотела исследовали после многократных циклов замораживания-оттаивания посредством SE-HPLC и УФ анализа при 280 нм (для контроля концентрации) и 455 нм (для контроля мутности). В результате многократных циклов замораживания-оттаивания не наблюдалось никаких значительных изменений при SE-HPLC или УФ A280 или A455.

Пример 11: Стабильность высококонцентрированного жидкого препарата TNF-связывающего нанотела, кратковременная (продолжительность 2 недели), исследование агентов, регулирующих тоничность

Стабильность TNF-связывающего нанотела в виде жидкости проиллюстрирована в следующем:

Пять препаратов исследовали, как показано на Фиг.31 и 32, названных в данной заявке как HST, HSGT, HSGMT, HSorb и Контроль. Каждый из исследуемых препаратов описан ниже.

Фиг.31 и 32	Препараты
HST	100 мг/мл TNF-связывающего нанотела, 20 мМ гистидина, 8% сахарозы, 0,01% полисорбата 80
HSGT	100 мг/мл TNF-связывающего нанотела, 20 мМ гистидина, 5% сахарозы, 80 мМ глицина, 0,01% полисорбата 80
HSGMT	100 мг/мл TNF-связывающего нанотела, 20 мМ гистидина, 5% сахарозы, 80 мМ глицина, 10 мМ метионина, 0,01% полисорбата 80
HSorb	100 мг/мл TNF-связывающего нанотела, 20 мМ гистидина, 5% сорбита
Контроль	100 мг/мл TNF-связывающего нанотела, 20 мМ гистидина, 5% сахарозы

Препараты хранили в виде жидкости в течение двух недель при 4°C и 40°C (состояние напряжения) в полипропиленовых пробирках и в предварительно заполненном шприце из циклического олефинового сополимера с резиновой пробкой.

Стабильность препаратов оценивали по процентному содержанию HMW и процентному содержанию LMW посредством SE-HPLC, как изображено на Фиг.31 и 32. Данные демонстрируют ограниченные изменения в продуктах деградации в зависимости от времени хранения при 4°C. Для образцов, показанных на Фиг.32, никаких LMW не определено ни в начальной временной точке, ни после двух недель при 4°C. LMW определялись только в образцах при 40°C (подвергнутых напряжению). Данные показывают, что все пять препаратов демонстрируют сравнимые изменения в продуктах деградации в зависимости от времени хранения в напряженном состоянии при 40°C. Таким образом, данные показывают, что все препараты являются подходящими для жидкой лекарственной формы.

Пример 12: Стабильность TNF-связывающего нанотела в низкоконцентрированном и высококонцентрированном жидком препарате, подтверждающая целевой препарат, и анализ контейнеров для первичной упаковки

Стабильность TNF-связывающего нанотела в виде жидкости проиллюстрирована в следующем:

Исследовали три препарата:

(а) 10 мг/мл TNF-связывающего нанотела, 20 мМ гистидина, 7,5% сахарозы, 0,01% полисорбата 80;

(б) 50 мг/мл TNF-связывающего нанотела, 20 мМ гистидина, 7,5% сахарозы, 0,01% полисорбата 80;

(в) 100 мг/мл TNF-связывающего нанотела, 20 мМ гистидина, 7,5% сахарозы, 0,01% полисорбата 80.

Препарат получали в следующих контейнерах первичной упаковки:

(а) предварительно заполняемый стеклянный шприц I типа фармацевтической категории от одного поставщика и силиконизированная серая резиновая пробка West 4432,

(б) предварительно заполняемый стеклянный шприц I типа фармацевтической категории от второго поставщика и силиконизированная серая резиновая пробка West 4432,

(в) предварительно заполняемый циклический олефиновый сополимер и силиконизированная серая резиновая пробка West 4432.

Препараты анализировали при t=0 и нашли, что они являются удовлетворительными. Препарат хранили при 4°C, 25°C и 40°C в течение трех месяцев.

Эквиваленты

Все ссылки, процитированные в данной заявке, включены в данную заявку посредством ссылки во всей их полноте и для всех целей в такой же степени, как если бы каждая отдельная публикация, или патент, или заявка на патент были специально и индивидуально указаны для включения посредством ссылки во всей их полноте для всех целей.

Объем настоящего изобретения не следует ограничивать конкретными воплощениями, описанными в данной заявке. Действительно, различные модификации изобретения в дополнение к модификациям, описанным в данной заявке, станут очевидными специалистам в данной области из вышеуказанного описания и сопровождающих графических материалов. Такие модификации будут находиться в пределах объема прилагаемой формулы изобретения.

1. Способ получения стабильного фармацевтического препарата SDAB молекулы, содержащего:

(а) указанную однодоменную антигенсвязывающую молекулу (SDAB) в концентрации от примерно 1 мг/мл до примерно 250 мг/мл, содержащую по меньшей мере две однодоменных молекулы, где одна однодоменная молекула связывается с человеческим сывороточным альбумином (HSA) и по меньшей мере одна другая однодоменная молекула связывается с другим антигеном-мишенью человека или его эпитопом;

(б) лиопротектор, выбранный из сахара и полиола, в концентрации от 5% до 10% (масса/объем); и

(в) гистидиновый буфер в концентрации от 10 до 20 мМ, так что рН препарата составляет от примерно 5,5 до 7,2,

где по меньшей мере одна однодоменная молекула, которая связывается с HSA содержит три CDR, имеющие аминокислотные последовательности: SFGMS (SEQ ID NO: 5) (CDR1), SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 6) (CDR2) и GGSLSR (SEQ ID NO: 7) (CDR3), или имеет CDR, которая отличается менее чем 3, 2 или 1 аминокислотными заменами (например консервативными заменами) от одной из указанных CDR, например 1 консервативной аминокислотной заменой от одной из указанных CDR,

включающий: экспрессирование SDAB молекулы в клеточной культуре; очистку SDAB молекулы путем пропускания SDAB молекулы через по меньшей мере одну стадию хроматографической очистки или стадии ультрафильтрации/диафильтрации; корректирование концентрации SDAB молекулы до 1-250 мг/мл в препарате, содержащем лиопротектор, выбранный из сахара и полиола, в концентрации от 5% до 10%; и гистидиновый буфер в концентрации от 10 до 20 мМ, так что рН препарата составляет от 5,5 до 7,2.

2. Способ по п. 1, где сахар представляет собой сахарозу.

3. Способ получения стабильного фармацевтического препарата SDAB молекулы, восстановленного после лиофилизации, содержащего:

(а) указанную однодоменную антигенсвязывающую молекулу (SDAB) в концентрации от примерно 1 мг/мл до примерно 250 мг/мл, содержащую по меньшей мере две однодоменных молекулы, где одна однодоменная молекула связывается с человеческим сывороточным альбумином (HSA) и по меньшей мере одна другая однодоменная молекула связывается с другим антигеном-мишенью человека или его эпитопом;

(б) лиопротектор, выбранный из сахара и полиола, в концентрации от 5% до 10% (масса/объем); и

(в) гистидиновый буфер в концентрации от 10 до 20 мМ, так что рН препарата составляет от примерно 5,5 до 7,2,

где по меньшей мере одна однодоменная молекула, которая связывается с HSA содержит три CDR, имеющие аминокислотные последовательности: SFGMS (SEQ ID NO: 5) (CDR1), SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 6) (CDR2) и GGSLSR (SEQ ID NO: 7) (CDR3), или имеет CDR, которая отличается менее чем 3, 2 или 1 аминокислотными заменами (например консервативными заменами) от одной из указанных CDR, например 1 консервативной аминокислотной заменой от одной из указанных CDR,

включающий: лиофилизацию смеси SDAB молекулы, лиопротектора, выбранного из сахара и полиола, и гистидинового буфера, посредством этого образование лиофилизированной смеси; и восстановление влагосодержания лиофилизированной смеси в разбавителе с получением препарата, содержащего: (a) SDAB молекулу в концентрации от 1 мг/мл до 250 мг/мл; (б) лиопротектор, выбранный из сахара и полиола в концентрации от 5% до 10%; (в) гистидиновый буфер в концентрации от 10 до 20 мМ, так что рН препарата составляет от 5,5 до 7,2.

4. Способ по п. 3, где сахар представляет собой сахарозу или трегалозу.