Штамм clostridium histolyticum - продуцент коллагеназы

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Штамм Clostridium histolyticum SK, обладающий способностью синтезировать коллагеназу, депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - Оболенск» ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека под регистрационным номером В-8362 и может быть использован в промышленном производстве ферментных препаратов. Изобретение позволяет повысить выход коллагеназы. 2 пр.

 

Область техники.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к получению штамма Clostridium histolyticum SK В-8362, способного продуцировать коллагеназу, используемую для дальнейшего промышленного производства ферментных препаратов.

Уровень техники.

На протяжении многих лет протеолитический фермент коллагеназа привлекает внимание ученых всего мира своей способностью гидролизовать тройную спираль молекулы нерастворимого природного белка коллагена. Коллагеназа используется в косметологии и медицине для профилактики и лечения рубцовых образований, в том числе контрактуры Дюпюитрена (заболевание кисти, связанное с рубцовым перерождением и укорачиванием ладонных сухожилий), а также в диагностических и лабораторных целях, например, для дезинтеграции тканей in vitro.

Известен способ получения коллагеназы из морского животного сырья, а именно гепатопанкреаса промысловых видов крабов (патент RU 2280076 С1, 20.07.2006, Артюков А.А., Мензорова Н.И., Козловская Э.П., Кофанова Н.Н., Козловский А.С, Рассказов В.А. «Ферментный препарат из гепатопанкреаса промысловых видов крабов и способ его получения»). Недостатками такого способа получения коллагеназы является неспособность полученных ферментов расщеплять нативный коллаген, что сужает сферу их применения. Кроме того, использование такого сырья усложняет получение высокоочищенных коллагеназ.

Известно, что истинные коллагеназы, то есть ферменты, способные расщеплять нативный коллаген, синтезируют микроорганизмы (грибы, бактерии). От продуктивности штамма, затрат на его культивирование, скорости его роста и накопления целевого продукта, а также себестоимости питательных сред зависит эффективность промышленного производства любых продуктов микробного синтеза.

Известен лабораторный штамм Aeromonas salmonicida AS1, для которого была доказана достаточно высокая экспрессия гена, отвечающего за синтез коллагеназы (Махова А.А., Курбаков К.А., Минаев М.Ю. Изучение коллагенолитической активности перспективного штамма Aeromonas salmonieida методом измерения экспрессии генов для оценки возможности использования его в качестве продуцента коллагеназ // Все о мясе. - 2017. - Т. 5. - С. 42-47).

В патенте (ЕР 0468411 А2, 29.01.1992 «А mutant of bacterium Clostridium histolyticum, a process for the obtaining thereof, and its use in the production of clostripain-free collagenase») описан мутантный штамм Clostridium histolyticum K26 clo 88, полученный путем обработки исходного дикого штамма мутагенным агентом, и способный к синтезу коллагеназы на среде с протеозопептоном, соевым пептоном, неорганическими солями, витаминами. Недостатком использования мутантного штамма в производственном процессе является его нестабильность.

Наиболее близким аналогом заявляемого изобретения является штамм Clostridium histolyticum 468, синтезирующий коллагеназу при культивировании на среде, содержащей гидролизат казеина и соевого шрота, неорганические соли, витамины (RU 2180002 С2, 27.02.2002 «Способ получения коллагеназы»). Данный штамм растет на сложной питательной среде, компоненты которой требуют предварительной подготовки, что является недостатком. Кроме того, время культивирования штамма достаточно продолжительное (72±1 ч). Штамм 468 при культивировании на бульоне Рамона с кровяным порошком синтезирует коллагеназу с не достаточно высокой активностью - 800-1000 КЕ/мл в реакции с окрашенным коллагеном.

Раскрытие сущности изобретения

Чтобы устранить указанные недостатки, мы предлагаем штамм Clostridium histolyticum SK, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - Оболенск» ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека под номером В-8362 10 от 26 января 2018 года как продуцент коллагеназы. Справка о депонировании №10 от 26 января 2018 года.

Техническими результатами, достигаемыми при осуществлении изобретения, являются:

- в отличии от аналогов предлагаемый штамм Clostridium histolyticum SK В-8362 (синоним: Hathewaya histolytica SK (Lawson and Rainey 2016), в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - Оболенск» ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека) синтезирует коллагеназу с более высокой активностью (1500-2000 КЕ/мл в реакции с окрашенным коллагеном),

- предлагаемый штамм достигает максимальных показателей синтеза и роста за более короткий промежуток времени (44 ч), является диким штаммом с неизменными свойствами и адаптирован под лабораторные и промышленные питательные среды.

Первичная идентификация культуры Clostridium histolyticum SK В-8362 была проведена по фенотипическим признакам на базе ФГУП «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов» ФМБА России.

Вторичная идентификация была проведена по фенотипическим и генотипическим признакам на базе Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Изучение биохимических свойств проводили с использованием тест-системы АНАЭРОтест 23, исследование генетических - с помощью масс-спектрометра MALDI-Biotyper (Bruker, Германия), выделения ДНК, приготовления библиотеки фрагментированной ДНК, секвенирования на системе Illumina MiSeq, биоинформационного анализа (сборка de Novo с использованием программного обеспечения SPAdes и Newbler).

Морфологические признаки Clostridium histolyticum SK В-8362.

Культура представлена подвижными грамположительными палочками, расположенными изолированно, попарно или небольшими цепочками размером 0,5-0,7×3,0-5,0 мкм. Клетки подвижны, имеют перетрихиально расположенные жгутики. Образует овоидные центральные и субтермальные споры, в аэробных условиях спор не образует. По отношению к кислороду микроорганизм - аэротолерантный.

Культуральные особенности Clostridium histolyticum SK В-8362.

На твердой питательной среде кровяной агар с добавлением 5% стерильной дефибринированной крови барана образует округлые мелкие (0,5-1,0 мм) гладкие выпуклые полупрозрачные колонии серо-белого цвета с волнообразным краем. Гемолитическая активность слабовыраженная. При культивировании данного штамма на жидких питательных средах (полужидкая среда Рамона с мясным фаршем, бульон Рамона с кровяным порошком) культура растет в виде комочков ваты или образует ветвистые колонии, при этом наблюдается рыхлый осадок на дне или в толще питательной среды. Цвет среды - от желтого до темно-коричневого с помутнением.

Биохимические свойства Clostridium histolyticum SK В-8362.

Штамм оксидазо- и каталазоотрицательный, лецитиназная и липазная активность отрицательные, индол не образует, однако наблюдается образование газа, гидролизирует желатин.

Ферментативные свойства Clostridium histolyticum SK В-8362. Штамм синтезирует фермент коллагеназу.

Генетические характеристики Clostridium histolyticum SK В-8362. При исследовании культуры Clostridium histolyticum SK В-8362 с помощью масс-спектрометра MALDI-Biotyper (Bruker, Германия) исследуемая культура была идентифицирована как Clostridium histolyticum с высокой степенью достоверности. Так, согласно проведенным исследованиям, наиболее высокий показатель подобия (Score Value) - 2,422 был зарегистрирован между изучаемой культурой и культурой Clostridium histolyticum DSM 1126. Высокие показатели подобия были зарегистрированы также между изучаемой культурой и культурами Clostridium histolyticum DSM 2158Т и Clostridium histolyticum 1036_NCTC 503T.

Полногеномное секвенирование и биоинформационный анализ подтвердили, что гомология участка гена 16S рРНК штамма с геном 16S рРНК референсного штамма Clostridium histolyticum (Hathewaya histolytica) JCM 1403 (NR_113187.1) составляет 100%.

Картирование контигов исследуемого штамма Clostridium histolyticum на нуклеотидную последовательность кластера генов Clostridium histolyticum (Hathewaya histolytica) JCM 1403 (ABO 14075.1) подтвердило 99% гомологию, что позволило заключить, что у изучаемого микроорганизма присутствует ген коллагеназы Clostridium histolyticum.

Штамм Clostridium histolyticum SK В-8362 хранят в условиях криозаморозки при температуре - (80±3)°С в бульоне Рамона в смеси с 80% глицерином (соотношение 1:4); в лиофильно высушенном состоянии (высушивание в присутствии сахарозо-желатиновой защитной среды) при температуре (5±3)°С; при низкой температуре (5±3)°С в среде мясо-пептонный агар 0,7%. Срок хранения не зависимо от выбранных условий - 10 лет.

Осуществление изобретения.

Подробно этап культивирования штамма Clostridium histolyticum SK В-8362 с целью получения коллагеназы описан в примере 1.

Пример 1. Синтез коллагеназы штаммом Clostridium histolyticum SK В-8362 в жидкой питательной среде.

Посевной материал получали в пробирках на среде Рамона с фаршем (объем питательной среды по 20 мл, производитель ФГУП СПбНИИВС ФМБА России). Для пересева использовали восстановленную культуру Clostridium histolyticum SK В-8362.

Стерильной одноразовой серологической пипеткой отбирали по 10 мл культуры и асептически вносили в питательную среду в пробирках. Получили 8 засеянных пробирок. Пробирки отправили на инкубацию в термостат при температуре 37°С на 24 ч. После подтверждения отсутствия контаминации (окраска по Граму и микроскопия) готовили 16 л питательной среды, содержащей среду Рамона с кровяным порошком (производитель ФГУП СПбНИИВС ФМБА России), разливали по 4 л в 4 бутыли вместимостью 5 л. Затем стерильной одноразовой серологической пипеткой вносили по 80 мл 50% раствора глюкозы. Бутыли перемешивали вручную круговыми движениями. Затем проводили засев бутылей посевным материалом из пробирок объемом 20,0 мл, полученным на предыдущем этапе. Для этого стерильной одноразовой серологической пипеткой отбирали весь посевной материал из одной пробирки и вносили в одну бутыль с питательной средой. Аналогично проводили засев оставшихся бутылей. Бутыли поместили в термостат при температуре 37°С для культивирования на протяжении 44 ч.

Визуально оценивали рост культуры на 24 и 44 ч. Культура росла интенсивно, культуральные свойства характерны для Clostridium histolyticum SK В-8362.

По завершению процесса культивирования отбирали пробы для проведения окраски по Граму и микроскопии, а также определения коллагеназной активности.

Выявлены характерные по морфологии клетки Clostridium histolyticum SK В-8362, образующие споры.

Пример 2. Определение активности коллагеназы, синтезируемой штаммом Clostridium histolyticum SK В-8362.

Определение коллагеназной активности проводили в соответствии с ГФ XIII ОФС.1.2.4.0013.15 «Определение активности ферментных препаратов».

За единицу коллагеназной активности (ЕД) принимается количество (микро или нано) моль красителя, выделившегося в реакционную среду в результате ферментативного расщепления 1 мг коллагена, окрашенного красителем R016 (или ЖТ), при 37°С в течение 1 мин. Метод основан на способности коллагеназы лизировать окрашенный коллаген.

В полученных образцах по примеру 1 коллагеназная активность составила 1500-2000 КЕ/мл. У ближайшего аналога штамма Clostridium histolyticum 468 коллагеназная активность культуральной жидкости после выращивания продуцента на бульоне Рамона с кровяным порошком составила 800-1000 КЕ/мл.

Таким образом, полученный нами штамм Clostridium histolyticum SK В-8362 позволяет за сравнительно небольшой промежуток времени получить коллагеназу с высокой активностью, используя при этом стандартизированные промышленные и лабораторные питательные среды.

Штамм Clostridium histolyticum, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека под номером В-8362, - продуцент коллагеназы.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к биотехнологии и сельскому хозяйству. Предложены штаммы эндофитного гриба эпихлое Epichloe/Neotyphodium spp., который представляет собой NRRL# 50716, NRRL# 50576, NRRL#50577, NRRL# 50578, NRRL# 50718, NRRL# 50719, NRRL# 50720, NRRL# 50721, NRRL# 50722, NRRL# 50723 или NRRL# 50724, или их комбинации, для искусственного заражения растения Secale spp.

Изобретение относится к вариантам штамма молочнокислых бактерий рода Lactobacillus и применению указанных штаммов. Предложен штамм молочнокислых бактерий рода Lactobacillus DSM 25906, штамм молочнокислых бактерий рода Lactobacillus DSM 25907, штамм молочнокислых бактерий рода Lactobacillus DSM 25908, штамм молочнокислых бактерий рода Lactobacillus DSM 25914, штамм молочнокислых бактерий рода Lactobacillus DSM 25915.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены препарат для биодеградации нефтепродуктов, включающий ассоциацию бактерий Bacillus megaterium ВКПМ В-607, Bacillus subtilis ВКПМ В-5328, Pseudomonas putida ВКПМ В-5624, Rhodococcus erythropolis ВКПМ АС-1269, иммобилизованную на глауконитсодержащем носителе в заданном количестве, и способ его получения.

Предложена группа изобретений, относящихся к биотехнологии - штамм Streptomyces hygroscopicus ВКПМ Ас-2079 - продуцент антибиотиков астолидов А и В и способ получения антибиотиков астолида А и астолида В с применением указанного штамма.
Изобретение относится к микробиологии, а именно к приготовлению плотных питательных сред, которые создают оптимальные условия для культивирования микроорганизмов.
Изобретение относится к санитарной микробиологии и, в частности, к способу контроля качества кисломолочной продукции. Способ включает проведение анализа на наличие бактерий группы кишечной палочки (БГКП).

Изобретение относится к молочнокислой бактерии Lactobacillus brevis, предназначенной для использования в качестве пищевого консерванта. Указанная молочнокислая бактерия депонирована в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур под регистрационным номером DSM 22721.
Изобретение относится к биотехнологии. Питательная среда плотная для культивирования бруцелл вида Brucella neotomae содержит печеночный отвар, пептон сухой ферментативный, сыворотку крови плодов коровы жидкую, натрий хлористый, глюкозу, глицерин, метабисульфит натрия, микробиологический агар и питьевую воду при заданном соотношении компонентов.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен штамм Komagataeibacter hansenii ВКПМ В-12950 – продуцент бактериальной целлюлозы.
Изобретение относится к микробиологии, в частности к питательным средам для микроорганизмов. Питательная среда плотная для хранения микроба чумы содержит ферментативный гидролизат кукурузного экстракта сгущенный, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный, агар микробиологический и питьевую воду при заданном содержании компонентов.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложена плазмидная ДНК pQE30-A2.1, обеспечивающая экспрессию щелочной сериновой протеиназы, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую рекомбинантную щелочную сериновую протеиназу семейства S1 из Streptomyces avermitilis VKM Ac-1301.

Изобретение относится к биохимии. Предложен способ получения мультиспецифической связывающей молекулы, содержащей по меньшей мере две связывающих группировки, такой как антитело, где способ включает культивирование клетки, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую растворимую сортазу А из S.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая полинуклеотид, кодирующий нейротоксический полипептид BoNT/E, вектор для экспрессии вышеуказанного полинуклеотида, клетку-хозяина для экспрессии полинуклеотида, нейротоксический полипептид BoNT/E, способ получения нейротоксического полипептида BoNT/E, способ получения лекарственного средства.

Группа изобретений относится к способам и композициям для предотвращения, контроля и разрушения бактериальных биопленок с использованием лизина, имеющего способность к лизису стафилококковых и стрептококковых бактерий, включая резистентные к лекарственным средствам.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложено применение варианта субтилизина 309, имеющего 80% идентичность по сравнению с аминокислотной последовательностью исходного субтилизина и содержащего замены 9R, 15T, 68A, 245R, 218D, а также композиции, содержащей указанный вариант субтилизина, для удаления пятен от вареных яиц на твердой поверхности.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к саморасщепляющемуся химерному белку для очистки целевого белка, нуклеиновой кислоте, его кодирующей, а также к вектору и клетке-хозяину, содержащим вышеуказанную нуклеиновую кислоту.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к полинуклеотиду, который кодирует полипептидный клостридиальный нейротоксин, а также к векторам и клеткам-хозяевам, содержащим указанный полинуклеотид.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к выделенному варианту сериновой протеазы, содержащему, по меньшей мере, от пяти до восьми аминокислотных замен в положениях, выбранных из группы, состоящей из положений 12, 14, 15, 16, 24, 35, 36, 39, 49, 54, 61, 63, 64, 65, 67, 69, 75, 76, 78, 79, 81, 86, 92, 93, 99, 109, 112, 121, 123, 125, 127, 143, 159, 179, 181, 184, 189, где заменяющая аминокислота в указанном положении выбрана из группы, состоящей из F, G, L, V, I, S, A, Y, K, W, M, P, N, Q, T, E, H, R, C, N и D, где указанные замены сделаны в положениях, эквивалентных положениям в протеазе Cellulomonas 69 В4, а также к молекуле нуклеиновой кислоты, ее кодирующей.

Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии прокариотической клетки и касается способа получения положительно заряженных белковых фракций с ингибирующей в отношении трипсина активностью в растущей популяции Escherichia coli.

Изобретение относится к области биотехнологии. .

Изобретение относится к области экспериментальной медицины и микробиологии и описывает способ определения наличия газовых сигнальных молекул в метаболитах микробиоты человека.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Штамм Clostridium histolyticum SK, обладающий способностью синтезировать коллагеназу, депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - Оболенск» ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека под регистрационным номером В-8362 и может быть использован в промышленном производстве ферментных препаратов. Изобретение позволяет повысить выход коллагеназы. 2 пр.

Наверх