Способ оценки тяжести течения сепсиса

Изобретение относится к области медицине и представляет собой способ оценки тяжести течения сепсиса, включающий подготовку образцов крови больных сепсисом для проведения флуоресцентной in situ гибридизации с последующим обнаружением бактерий в образцах крови с использованием люминесцентной микроскопии, отличающийся тем, что определяют количество адгезированных на поверхности эритроцитов и внутриэритроцитарно расположенных бактерий и рассчитывают интегральный показатель по формуле:

ИП=1,527+0,333×X1-1,116×Х2-0,137×Х3+0,033×Х4+0,061×Х5-0,184×Х6+3,242×Х7+0,71×Х8+0,888×Х9+0,336×Х10, где: X1 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo1;

Х2 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo2; Х3 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo3; Х4 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo4; Х5 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo5; Х6 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo1; Х7 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo2; Х8 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo3; Х9 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo4; Х10 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo5, при этом при значении интегрального показателя меньше 2,5 тяжесть течения сепсиса считают легкой, при значении от 2,5 до 5,6 - средней, а при значении больше 5,6 - тяжелой. Способ позволяет повысить точность ранней диагностики сепсиса и оценить тяжесть течения заболевания. 2 ил., 4 табл., 4 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано в клинической практике для оценки тяжести течения заболевания у септических больных.

Актуальность проблемы ранней диагностики бактериемии и сепсиса обуславливается тем, что генерализованные бактериальные инфекции являются тяжелыми осложнениями у больных.

Разработаны шкалы по оценке тяжести состояния пациентов такие, как Acute Physiology and Chronic Health Evaluation (APACHE) II, Simplified Acute Physiology Score (SAPS) II, SOFA, Surviving Sepsis Campaign (SSC), РАСХИ и др., которые включают для расчетов общепринятые клинические и лабораторные данные. Существующие шкалы для оценки тяжести и исхода сепсиса громоздки и неудобны, поэтому на практике чаще используют простые, сокращенные формулы прогнозирования, состоящие из 4-5 критериев [Рудное В.А. Сепсис: современные подходы к диагностике и интенсивной терапии // Вестник анестезиологии и реаниматологии, 2010. Т. 7, №1, С. 48-57].

В последнее время в клинической практике для ранней диагностики некоторых патологических процессов стали использовать определение специфических белков - биомаркеров [Рудное В.А. Сепсис: современные подходы к диагностике и интенсивной терапии // Вестник анестезиологии и реаниматологии, 2010, Т. 7, №1, С. 48-57].

Известно около 200 биомаркеров сепсиса, однако только немногие из них находят клиническое применение. [Чеботкевич В.К, Кайтанджан Е.И., Бурылев В.В., Щетинкина Е.Е. Современные методы лабораторной диагностики сепсиса // Клиническая микробиологическая антимикробная химиотерапия, 2013, Том 15, №4, С. 295-300].

Известен способ определения прокальцитонина при диагностике сепсиса, который начал применяться только в последние годы как маркер инфекционного процесса [Tang В.М., Eslick G.D., Craig J.С, McLean A.S. Accuracy of procalcitonin for sepsis diagnosis in critically ill patients: systematic review and metaanalysis // Lancet Infect Dis. 2007, Mar, 7 (3), p.210].

Недостатком использования определения прокальцитонина для диагностики сепсиса является несоответствие тяжести состояния, эффективности проводимой терапии и прогноза летального исхода. Отрицательным является его неспецифичность, так как прокальцитонин повышается не только при инфекционном процессе, но и при заболеваниях щитовидной железы и при некоторых опухолях [Cate С.С, Pettengill O.S., Sorenson G.D. Byosynthesis of Procalcitonin in small cell carcinoma of the lung Cancer Res. 1986, 46, p.812-8].

Известен способ обнаружения другого биомаркера инфекционного процесса - белка пресепсина, образующегося в результате бактериального фагоцитоза [Liu В, Chen YX, Yin Q, et al. Diagnostic value and prognostic evaluation of Presepsin for sepsis in an emergency department.// Crit Care, 2013, 17(5), R244]. Вместе с тем, известно о проникновении бактерий в эритроциты [Щуплова Е.А., Стадников А.А., Фадеев С.Б. Роль биологических свойств Staphylococcus epidermidis во внутриэритроцитарной инвазии и изменении активности каталазы и супероксиддисмутазы эритроцитов при экспериментальной генерализованной инфекции // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2015, №1, С. 79-82], которые не являются фагоцитирующими клетками и поэтому пресепсин не образуется. В связи с чем, данный биомаркер не является надежным критерием для диагностики сепсиса и оценки тяжести состояния больных, что говорит о недостатке данного способа.

Таким образом, с помощью биомаркеров определяют биохимическое состояние крови септических больных, но наличие возбудителей и идентификацию микроорганизмов биомаркеры не показывают, а также их значения могут повышаться при других заболеваниях. В связи с чем, для постановки точного диагноза и оценки тяжести состояния септических больных необходимо использовать методы обнаружения гемокультуры.

В настоящее время «золотым стандартом» лабораторной диагностики бактериемий и сепсиса является бактериологический метод выделения гемо-культур. При подозрении на инфекцию кровотока у пациента, еще до начала эмпирической терапии антибиотиками широкого спектра действия, производится забор крови для бактериального посева. Забор крови рекомендуется проводить 2-3 раза по 20-30 мл (по 10-15 мл для двух параллельных высевов на аэробные и анаэробные среды). Исследования показывают, что при меньшем объеме забираемой крови частота выявления возбудителей существенно снижается. [Lin Н. - H., Liu Y. - F., Tien N. at al. Evaluation of the blood volume effect on the diagnosis of bacteremia in automated blood culture system // Journal of Microbiology, Immunology and Infection., 2013., Vol. 46., p. 46-52]. Недостатком бактериологического метода является длительность культивирования посевов до 5-7 суток, длительное время для идентификации чистой культуры с помощью различных биохимических тестов, а также проведение теста на выявление резистентности к антибиотикам. Кроме того, эффективность бактериологического метода составляет около 45% [Рудное В.А. Сепсис: современные подходы к диагностике и интенсивной терапии // Вестник анестезиологии и реаниматологии, 2010. Т. 7, №1, С. 48-57] и данный метод не приемлем для прихотливых и некультивируемых бактерий, таких как микоплазмы, нокардии, риккетсии, хламидии и ряд других микроорганизмов [Киселева Е.Е. Алгоритм выявления и видовой идентификации бактерий в крови с использованием ПЦР // Вестник гематологии, 2017, Т. XIII, №1, С. 19-24]. Бактериологический метод диагностики сепсиса позволяет обнаружить возбудителя заболевания, но не выявляет критерии для оценки тяжести течения сепсиса.

По сравнению с бактериологическим методом, методы молекулярной диагностики, основанные на анализе белков или нуклеиновых кислот микроорганизмов лишены вышеуказанных недостатков. Примером молекулярно-генетических методов являются методы ПЦР-анализа гемокультуры, метод мультиплексного ПЦР-анализа в режиме реального времени. Главное преимущество данных методов в сокращении длительности анализов до 5-12 часов, возможность выявления некультивируемых форм возбудителей и одновременное выявление нескольких разных мишеней (как генетических маркеров патогенов, так и маркеров их антибиотикорезистентности) в одном клиническом образце [Гаврилое С.Н., Скачкова Т.С., Шипулина О.Ю., Савочкина Ю.А., Шипулин Г.А., Малеев В.В. Современные молекулярно-генетические методы, используемые для этиологической диагностики сепсиса // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2016,№2, С. 91-99].

Недостатком данного метода является выделение ДНК транзиторных микроорганизмов, не имеющих клинического значения, что приводит к ложноположительным результатам диагностики сепсиса, а также сложность при очистке бактериальной ДНК от генетического материала в образце крови больного человека. Для реализации методов ПЦР-анализа гемокультуры и мультиплексного ПЦР-анализа в режиме реального времени необходимо дорогостоящее оборудование и более трудоемкую подготовку исследуемого материала.

Известен современный молекулярно-генетический метод флуоресцентной in situ гибридизации (FISH), в котором используются флуоресцирующие молекулы для детекции специфических фрагментов ДНК и РНК [Sladjana Malic et. al. Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH). // Microbiology. 2009, 155, р. 2603-2611]. Материалом для исследования методом FISH может служить кровь, костный мозг, биоптат, плацента и др. В исследуемых образцах FISH позволяет выявлять нуклеиновые кислоты в клеточных структурах, морфологию и одновременно проводить идентификацию микроорганизмов.

В качестве прототипа изобретения выбран способ ранней диагностики сепсиса, основанный на методе FISH [Gosiewski Т, Pietrzyk A, Brzychczy-Wloch М, Heczko P.Use of PCR and FISH methods for rapid identification of bacterial bloodstream infections. // Ann Acad Med Siles 2011, 65, p. 14-22]. Недостатком данного способа является то, что авторы предлагают на основе обнаруженной бактериальной ДНК делать заключение о ранней диагностике развития сепсиса в отсутствии критериев оценки тяжести течения заболевания у септических больных, что затрудняет принятие решения лечения их эффективными антибактериальными препаратами.

Задачей заявляемого технического решения является создание способа оценки тяжести течения заболевания септических состояний у больных по количеству адгезированных на поверхности эритроцитов и внутриэритроцитарно расположенных бактерий с использованием метода FISH.

Для решения указанной задачи в заявляемом способе оценки тяжести течения сепсиса осуществляют подготовку образцов крови больных сепсисом для проведения флуоресцентной in situ гибридизации с последующим обнаружением бактерий в образцах крови с использованием люминесцентной микроскопии, определяют количество адгезированных на поверхности эритроцитов и внутриэритроцитарно расположенных бактерий и рассчитывают интегральный показатель по формуле:

ИП=1,527+0,333×X1-1,116×Х2-0,137×Х3+0,033×Х4+0,061×Х5-0,184×Х6+3,242×Х7+0,71×Х8+0,888×Х9+0,336×Х10,

где: X1 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo1;

Х2 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo2;

Х3 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo3;

Х4 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo4;

Х5 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo5;

Х6 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo1;

Х7 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo2;

Х8 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo3;

Х9 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo4;

Х10 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo5,

при этом при значении интегрального показателя меньше 2,5 - тяжесть течения сепсиса считают легкой, при значении от 2,5 до 5,6 - средней, а при значении больше 5,6 - тяжелой.

Технический результат от реализации изобретения выражается в создании способа оценки тяжести течения заболевания у больных сепсисом с возможностью обнаружения и одновременной идентификации микроорганизмов, находящихся на поверхности эритроцитов и внутри эритроцитов крови больных сепсисом.

Новым в заявляемом способе является то, что с использованием метода FISH установлена взаимосвязь между количеством адгезированных на поверхности эритроцитов и внутриэритроцитарно расположенных бактерий и степенью тяжести течения заболевания больных сепсисом.

Авторы с помощью метода FISH с использованием нескольких видов ДНК-зондов, представленных в таблице 1, обработали образцы крови больных с предварительным диагнозом: «Сепсис». Авторы для работы использовали характерные виды олигонуклеотидных зондов, комплементарных видоспецифическим участкам гена 16S рРНК микроорганизмов, как наиболее часто встречающихся возбудителей при сепсисе. В исследуемых образцах крови авторы подсчитывали количество адгезированных на поверхности эритроцитов и внутриэритроцитарно расположенных бактерий.

На фигуре 1 изображена адгезия бактерий к поверхности эритроцита в образце крови больного сепсисом.

На фигуре 2 представлено внутриэритроцитарное проникновение бактерий в исследуемом образце крови больного сепсисом.

Для выявления моно- или полимикробной инфекции авторы использовали одновременно все виды олигонуклеотидных зондов при обработке одного образца крови обследуемого больного.

В результате работы авторы определили процент бактериальных клеток адгезированных на поверхности эритроцитов и внутриэритроцитарно расположенных бактерий с использованием данных ДНК-зондов.

Далее полученные данные сопоставили с клиническим анамнезом больных сепсисом и получили три группы, отличающиеся по степени тяжести течения заболевания. Результаты представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2 с увеличением степени тяжести течения сепсиса возрастает доля адгезированных на поверхности эритроцитов и внутриэритроцитарно расположенных бактерий.

Далее авторы провели оценку тяжести течения сепсиса у больных согласно прототипу и заявляемому способу. Результаты представлены в таблице 3.

Как видно из таблицы 3, прототип изобретения позволяет только обнаружить микроорганизмы в образце крови септических больных, а с помощью заявляемого способа можно подсчитать количество как адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов, так и их внутриэритроцитарное расположение. Полученные данные можно использовать в качестве критерия для оценки тяжести течения заболевания.

Для комплексной оценки тяжести течения заболевания у больных сепсисом с использованием одновременно нескольких ДНК-зондов был проведен статистический анализ полученных данных, результаты которого позволили получить регрессионную модель, описывающую взаимосвязь количества адгезированных на поверхности эритроцитов и внутриэритроцитарно расположенных бактерий со степенью тяжести течения заболевания у больных сепсисом.

Регрессионная модель представляет собой интегральный показатель, значения которого позволили дифференцировать степень тяжести течения сепсиса.

Интегральный показатель (ИП) рассчитывается по формуле:

ИП=1,527+0,333×X1-1,116×Х2-0,137×Х3+0,033×Х4+0,061×Х5-0,184×Х6+3,242×Х7+0,71×Х8+0,888×Х9+0,336×Х10,

где: X1 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo1;

Х2 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo2;

Х3 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo3;

Х4 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo4;

Х5 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo5;

Х6 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo1;

Х7 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo2;

Х8 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo3;

Х9 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo4;

Х10 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo5.

По результатам значений ИП и клинически подтвержденных диагнозов авторы получили 3 группы, отличающиеся по степени тяжести течения сепсиса: легкая, средняя и тяжелая форма. Диапазоны дифференциации тяжести течения сепсиса представлены в таблице 4.

Как видно из таблицы 4, что чем выше значения интегрального показателя (количество адгезированных на поверхности эритроцитов и внутриэритроцитарно расположенных бактерий), тем тяжелее состояние больного.

Таким образом, авторы сделали заключение о том, что определение количества адгезированных на поверхности эритроцитов и внутриэритроцитарно расположенных бактерий с использованием метода FISH, а также расчет интегрального показателя позволяет оценить тяжесть течения заболевания у больных сепсисом. Необходимо отметить, что данный способ гораздо дешевле и более легкий в обработке исследуемого материала, чем ПЦР-анализ гемокультуры и метод мультиплексного ПЦР-анализа в режиме реального времени.

Эффективность заявляемого способа оценки тяжести течения заболевания у больных сепсисом составляет 99%.

Способ осуществляется следующим образом:

1) Кровь от обследуемого больного трехкратно отмывают фосфатно-солевым буфером (ФСБ) (рН=7,4) центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин и доводят до одномиллионной концентрации клеток в миллилитре.

2) Пробу объемом 1 мл осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин и ресуспендируют в 400 мкл 0,5% раствора глутарового альдегида, фиксируют в течение 30 мин при 25°С.

3) Фиксированные клетки промывают ФСБ (рН=7,4) и ресуспендируют в растворах этанола с восходящей концентрацией 50, 80 и 100% по 400 мкл каждого раствора с последующей инкубацией в течение 10 мин при 4°С.

4) Эритроциты промывают ФСБ (рН=7,4) центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин и ресуспендируют в 300 мкл дистиллированной воде.

5) Аликвоты по 100 мкл фиксированных клеток осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин и ресуспендируют в 100 мкл буферного раствора для гибридизации (0,9 М NaCl и 20 mM Tris-HCl, рН=7), содержащего 500 нМ соответствующего ДНК-зонда, меченного на 5'-конце флуо-ресцеина изотиоцианатом (FITC) (ООО «ДНК-синтез», Москва).

6) Проводят гибридизацию в течение 5 ч при температуре соответствующей температуре отжига для каждого вида зонда.

7) После гибридизации клетки центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин и добавляют 500 мкл промывочного раствора для удаления ДНК-зондов, не связавшихся с ДНК исследуемых бактерий, инкубируют в течение 30 мин при соответствующей температуре.

8) Пробу центрифугируют и ресуспендируют в 300 мкл ФСБ, эритроциты дополнительно окрашивают синим Эванса.

9) С помощью люминесцентной микроскопии определяют количество адгезированных на поверхности эритроцитов и внутриэритроцитарно расположенных бактерий, а также одновременно проводят идентификацию бактерий по соответствующим зондам в образцах крови обследуемого больного.

10)Рассчитывают интегральный показатель по формуле:

ИП=1,527+0,333×X1-1,116×Х2-0,137×Х3+0,033×Х4+0,061×Х5-0,184×Х6+3,242×Х7+0,71×Х8+0,888×Х9+0,336×Х10,

где: X1 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo1;

Х2 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo2;

Х3 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo3;

Х4 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo4;

Х5 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo5;

Х6 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo1;

Х7 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo2;

Х8 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo3;

Х9 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo4;

Х10 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo5.

11) Оценивают степень тяжести течения сепсиса, используя значения интегрального показателя (ИП): ИП меньше 2,5 - тяжесть течения сепсиса считают легкой, при значении ИП от 2,5 до 5,6 - средней, а при значении ИП больше 5,6 - тяжелой.

Примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1. Больной X., 1960 г.р. поступил в ООКБ №1 с предварительным диагнозом: «Менингит, сепсис». При осмотре отмечалась выраженная вялость, сероватый оттенок кожных покровов, отечность стоп. Тахипноэ достигало 96 в мин, что свидетельствовало о наличии дыхательной недостаточности. Температура тела в течение трех дней держалась в пределах 38,7-39°С. Лабораторные показатели общего анализа крови были значительно ниже нормы: Hb - 76 г/л, ц.п. - 0,82, эритроцитов - 2,89×1012/л, лейкоцитов - 2,94×106/л. При использовании заявляемого способа подготовки эритроцитов возможно выявление бактерий на поверхности и внутри эритроцитов, а также одновременная их идентификация, что позволит подтвердить поставленный диагноз у больного, а также с помощью расчета интегрального показателя оценить тяжесть течения заболевания. Для этого кровь от обследуемого больного трехкратно отмывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ) (рН=7,4) центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин и доводили до одномиллионной концентрации клеток в миллилитре. Пробу объемом 1 мл осаждали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин и ресуспендировали в 400 мкл 0,5% раствора глутарового альдегида, фиксировали в течение 30 мин при 25°С. Фиксированные клетки промывали ФСБ (рН=7,4) и ресуспендировали в растворах этанола с восходящей концентрацией 50, 80 и 100% по 400 мкл каждого раствора с последующей инкубацией в течение 10 мин при 4°С. Эритроциты промывали ФСБ (рН=7,4) центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин и ресуспендировали в 300 мкл дистиллированной воде. Аликвоты по 100 мкл фиксированных клеток осаждали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин и ресуспендировали в 100 мкл буферного раствора для гибридизации (0,9 М NaCl и 20 mM Tris-HCl, рН=7), содержащего 500 нМ соответствующего ДНК-зонда, меченного на 5'-конце флуоресцеина изотиоцианатом (FITC) (ООО «ДНК-синтез», Москва). Далее в исследуемой пробе проводили гибридизацию в течение 5 ч при температуре соответствующей температуре отжига для каждого вида зонда. После гибридизации клетки центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин и добавляли 500 мкл промывочного раствора для удаления ДНК-зондов, не связавшихся с ДНК исследуемых бактерий, инкубировали в течение 30 мин при соответствующей температуре. Пробу центрифугировали и ресуспендировали в 300 мкл ФСБ. Эритроциты дополнительно окрашивали синим Эванса. С помощью люминесцентной микроскопии определяли количество адгезированных на поверхности эритроцитов и внутриэритроцитарно расположенных бактерий, а также одновременно проводили идентификацию бактерий по соответствующим зондам в образцах крови обследуемого больного. Далее рассчитывали интегральный показатель по формуле:

ИП=1,527+0,333×X1-1,116×Х2-0,137×Х3+0,033×Х4+0,061×Х5-0,184×Х6+3,242×Х7+0,71×Х8+0,888×Х9+0,336×Х10,

где: X1=20 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo1;

Х2=0 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом O1igo2;

Х3=0 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом O1igo3;

Х4=0 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo4;

Х5=12 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo5;

Х6=5 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo1;

Х7=0 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo2;

Х8=0 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo3;

Х9=0 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo4;

Х10=16 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo5.

Полученные экспериментальные значения были использованы для расчета интегрального показателя по вышеуказанной формуле:

ИП=1,527+0,333×20-1,116×0-0,137×0+0,033×0+0,061×12-0,184×5+3,242×0+0,71×0+0,888×0+0,336×16=13,375

В результате расчета получили значение интегрального показателя равное 13,375, которое соответствует 3 группе - тяжелая степень заболевания. Специфическое свечение обнаружили с зондами Oligo1 и Oligo6, комплементарных видоспецифическим участкам гена 16S рРНК микроорганизмов Enterobacteriaceae и Staphylococcus spp. У больного выявили полимикробную инфекцию. Последующее наблюдение пациента на основе клинических и лабораторных показателей подтвердило раннее выставленный диагноз.

Было сделано заключение о том, что у больного подтвердился диагноз: «Сепсис», с помощью заявляемого способа оценили тяжелую степень течения заболевания и определили возбудителей сепсиса - Enterobacteriaceae и Staphylococcus spp.

Пример 2. Больная Ф., 1935 г.р. поступила в ООКБ №1 с диагнозом: «Септический эндокардит, ишемический инсульт». При поступлении состояние тяжелое, температура тела - 38,7°С. Пульс - 102 в минуту; частота дыхания - 34 в минуту. Лабораторные показатели общего анализа крови были ниже нормы: Hb - 102 г/л, ц.п. - 0,98, эритроциты - 4,34×1012/л, общее количество лейкоцитов - 18,5×109/л. У больной взяли образец крови и обработали согласно примеру 1. В результате применения заявляемого способа получили значение интегрального показателя равное 4,8, что соответствует 2 группе - средняя степень тяжести течения сепсиса. Специфическое свечение обнаружили с зондом Oligo3, комплементарного видоспецифическому участку гена 16S рРНК микроорганизма - Staphylococcus aureus. Последующее наблюдение пациентки на основе клинических и лабораторных показателей подтвердило раннее выставленный диагноз.

Было сделано заключение о средней тяжести течения заболевания по количеству адгезированных на поверхности эритроцитов и внутриэритроцитарно расположенных бактерий, возбудителем является S. aureus.

Пример 3. Больная Б., 1975 г.р. поступила в ООКБ №1 с диагнозом: «Гнойный перитонит, сепсис». При поступлении общее состояние средней тяжести, температура тела - 38,4°С, артериальное давление 130/90 мм рт.ст., пульс 88 в минуту. Показатели общего анализа крови находились в пределах нормы: Hb - 118 г/л; эр - 3,8×1012/л; ц.п.- 1,5. У больной взяли образец крови и обработали согласно примеру 1. В результате применения заявляемого способа получили значение интегрального показателя равное 2,009, что соответствует 1 группе - легкая степень тяжести течения сепсиса. Специфическое свечение обнаружили с зондом Oligo1, комплементарного видоспецифическому участку гена 16S рРНК микроорганизма - представителя Enterobacteriaceae. Последующее наблюдение пациента на основе клинических и лабораторных показателей подтвердило раннее выставленный диагноз.

Было сделано заключение о легкой степени тяжести течения заболевания по количеству адгезированных на поверхности эритроцитов и внутриэритроцитарно расположенных бактерий.

Пример 4. Больной Н., 1957 г.р. поступил в ООКБ №1 с предполагаемым диагнозом «Сепсис». При осмотре общее состояние удовлетворительное, температура тела - 37,4°С, артериальное давление 130/90 мм рт.ст., пульс 68 в минуту. Показатели общего анализа крови находились в пределах нормы: Hb - 133 г/л; эр - 4,46×1012/л; ц.п. - 0,9. У больного взяли образец крови и обработали согласно примеру 1. В результате исследования в образце крови специфического свечения не обнаружили. Было сделано заключение о том, что у больного диагноз не подтвердился.

Таким образом, заявляемый способ оценки тяжести течения сепсиса позволяет повысить точность ранней диагностики и по количеству адгезированных на поверхности эритроцитов и внутриэритроцитарно расположенных бактерий оценить тяжесть течения заболевания у больных сепсисом. Данный способ гораздо дешевле и более легкий в обработке исследуемого материала, чем ПЦР-анализ гемокультуры и метод мультиплексного ПЦР-анализа в режиме реального времени, а также может достаточно широко применяться в условиях клинико-диагностических лабораторий.

Способ оценки тяжести течения сепсиса, включающий подготовку образцов крови больных сепсисом для проведения флуоресцентной in situ гибридизации с последующим обнаружением бактерий в образцах крови с использованием люминесцентной микроскопии, отличающийся тем, что определяют количество адгезированных на поверхности эритроцитов и внутриэритроцитарно расположенных бактерий и рассчитывают интегральный показатель по формуле:

ИП=1,527+0,333×X1-1,116×Х2-0,137×Х3+0,033×Х4+0,061×Х5-0,184×Х6+3,242×Х7+0,71×Х8+0,888×Х9+0,336×Х10,

где: X1 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo1;

Х2 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo2;

Х3 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo3;

Х4 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo4;

Х5 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo5;

Х6 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo1;

Х7 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo2;

Х8 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo3;

Х9 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo4;

Х10 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo5,

при этом при значении интегрального показателя меньше 2,5 тяжесть течения сепсиса считают легкой, при значении от 2,5 до 5,6 - средней, а при значении больше 5,6 - тяжелой.



 

Похожие патенты:

Настоящее изобретение относится к дифференциальной диагностике острого аппендицита с клинической симптоматикой, имитирующей правостороннюю почечную колику. Описан способ диагностики острого аппендицита с клинической симптоматикой, имитирующей правостороннюю почечную колику, заключающийся в том, что у пациента с подозрением на острый аппендицит с клинической симптоматикой, имитирующей правостороннюю почечную колику, или с подозрением на правостороннюю почечную колику с клинической симптоматикой, имитирующей острый аппендицит, одновременно определяют концентрацию лактоферрина в образцах кала и мочи, и при концентрации фекального лактоферрина выше 7500 нг/г, а концентрации лактоферрина мочи от 0 до 60 нг/мл диагностируют острый аппендицит.

Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционным болезням и гепатологии, и может быть использовано для прогнозирования развития метаболического синдрома при хроническом вирусном гепатите С при отсутствии противовирусной терапии.

Изобретение относится к медицине и может быть применено для определения показаний к ранней повторной лапароскопической санации брюшной полости у пациентов с панкреатогенным перитонитом.

Изобретение относится к способу определения и расчета необходимой потребной дозы инсулина при сахарном диабете второго типа и сформировавшейся инсулиновой зависимости, включающему определение у пациента сформировавшейся потребности в проведении инсулинотерапии при наличии уровня глюкозы в крови натощак гликемии более 10 миллимолей/литр и уровня постпрандиальной гликемии выше 11,1 миллимолей/литр, установление отсутствия снижения уровня гликемии и необходимых значений гликированного гемоглобина после назначения таблетированной инсулинотерапии, после чего осуществляют непосредственный расчет дозы инсулина, при котором сначала определяют рост и массу тела пациента, на основании полученных данных вычисляют индекс массы тела ИМТ по формуле ИМТ=m/h2, где m - масса тела в кг, h - рост в метрах, далее устанавливают длительность заболевания сахарным диабетом и производят вычисление потребной дозы инсулина ПДИ в сутки с использованием следующей выведенной формулы: ПДИ=-56,7+3,2 ⋅ ИМТ - 0,2 ⋅ t, гдеПДИ - потребная доза инсулина в сутки; ИМТ - индекс массы тела; t - длительность заболевания сахарным диабетом в годах; -56,7, а также 3,2 и 0,2 - численные величины коэффициентов.

Изобретение относится к области экспериментальной медицины и микробиологии и описывает способ определения наличия газовых сигнальных молекул в метаболитах микробиоты человека.

Изобретение относится преимущественно к области физической химии и биофизикии, может быть использовано в медицине, а также биологии и физиологии человека и животных.

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано для определения содержания галогенорганических соединений в волосах человека и касается экологического контроля загрязнения внутренней среды человека.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу пролонгирования высвобождения альбумина из теней эритроцитов. Способ пролонгирования высвобождения альбумина из теней эритроцитов, включающий использование в качестве контейнеров теней эритроцитов, получаемых путем гипоосмотического шока нативных эритроцитов и инкубации их в растворе биологически активных веществ с последующим «замыканием» теней эритроцитов в изотонической среде, при этом «замыкание» теней эритроцитов осуществляют путем добавления к ним раствора глутарового альдегида с последующим отмыванием теней от находящегося вне теней глутарового альдегида.

Изобретение относится к области медицины, а именно к инфекционным болезням, терапии, медицинской генетике, и может быть использовано для прогнозирования риска развития рожи.

Изобретение относится к области медицины, а именно к хирургии, и предназначено для прогнозирования течения репаративного процесса лапаротомной раны при остром перитоните.

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к способу оценки функциональных резервов новорожденного организма на крупных и мелких животноводческих фермах. Способ включает исследование крови, при этом дополнительно проводят биологический тест. В качестве биологического теста используют реакцию лейкоцитоза крови материнского организма в присутствии сыворотки новорожденного животного. При показателе аллергической альтерации лейкоцитов 10% и более новорожденных животных относят к животным с пониженными показателями естественной резистентности. Использование данного способа позволяет прогнозировать развитие новорожденного животного путем оценки функциональных резервов организма. 3 пр., 2 табл.
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для оценки эффективности лечения генерализованной формы хронического урогенитального хламидиоза, вызванного Chlamydia trachomatis. Способ заключается в том, что у пациента с генерализованной формой хронического урогенитального хламидиоза через 10-14 дней после противохламидийного лечения определяют в реакции фагоцитоза с использованием лейкоконцентрата периферической крови пациента, взвесей штаммов Staphylococcus aureus 209 Р и Escherichia coli 14169 фагоцитарные индексы нейтрофилов, измеренные через 30 и 120 минут от начала реакции фагоцитоза, затем по формулам рассчитывают значения F1 и F2, далее полученные по формулам значения F1 и F2 округляют до второго знака после запятой и устанавливают наличие эффекта лечения генерализованной формы хронического урогенитального хламидиоза, если значение F2 больше значения F1, или устанавливают отсутствие эффекта лечения генерализованной формы хронического урогенитального хламидиоза, если значение F1 больше значения F2, или повторно оценивают эффективность лечения урогенитального хламидиоза, если значение F1 равно значению F2. 4 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, акушерству и гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования состояния микрофлоры кишечника у новорожденных детей. Способ прогнозирования состояния микробиоты кишечника новорожденных включает определение синдрома избыточного бактериального роста у беременных методом водородного дыхательного теста с лактулозой, и при обнаружении синдрома избыточного бактериального роста у матери прогнозируется нарушение формирования микробиоценоза кишечника новорожденного. 1 пр., 2 табл.

Изобретение относится к картриджу для обработки жидкой пробы, например, для выявления компонентов в пробе крови. Картридж содержит флюидальную систему с впускным (12) отверстием, ведущим через впускной (13) капиллярный канал в камеру (14) для хранения. Подающий (15) капиллярный канал ведет из камеры (14) для хранения в камеру (16) детектирования. Конструкция картриджа такова, что впускной (13) капиллярный канал, который соединяет впускное (12) отверстие с камерой (14) для хранения, имеет давление капиллярного всасывания, достаточно высокое для введения некоторой пробы из впускного отверстия в камеру для хранения, без необходимости в каком-либо дополнительном давлении. Кроме того, элемент (18, 19, 20) картриджа для контроля потока адаптирован для внешнего управления таким образом, чтобы пробу можно было вытягивать из камеры (14) для хранения в камеру (16) для обработки без какого-либо активного откачивания. Технический результат: обеспечение удобного и надежного управления пробами, ускорение получения проб. 5 н. и 13 з.п. ф-лы, 8 ил.

Изобретение относится к медицине, а именно к терапии и гепатологии, и может быть использовано для лечения неалкогольной жировой болезни печени при метаболическом синдроме. Для этого пациентам вводят урсодезоксихолевую килоту в дозе 15 мг/кг в течение 6 месяцев при повышении уровня трансаминаз более трех норм. Дополнительно проводят диетотерапию в течение 12 месяцев с ограничением жиров и использованием углеводсодержащих продуктов с гликемическим индексом менее 70, при этом уменьшая калорийность рациона на 500 ккал от исходного. Минимальное потребление калорий в сутки должно быть не менее 1200 ккал для женщин и не менее 1500 ккал для мужчин. Дополнительно рассчитывают индекс инсулинорезистентности HOMA-IR. При значении HOMA-IR выше 2,7 назначают Глюкофаж® лонг 1000 мг вечером после ужина в течение 12 месяцев. Затем определяют в сыворотке крови уровень ферритина. При значении ферритина 60 мкг/л и выше назначают Тиогамму в дозе 600 мг в течение 3 месяцев, затем в дозе 300 мг в течение последующих 3 месяцев. Способ обеспечивает уменьшение стеатоза печени, снижение степени абдоминального ожирения и метаболических нарушений за счёт гепатопротективного эффекта терапии, повышения чувствительности тканей к инсулину, снижения снизить уровня трансаминаз ACT, АЛТ и липидов, а именно, общего холестерина, холестерина липопротеидов низкой плотности, триглицеридов. 3 табл., 1 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для оценки активности инфекционного процесса, вызванного неферментирующими грамотрицательными бактериями (НФГОБ) в бронхолегочной системе у пациентов с муковисцидозом. Для этого собранную в стерильный одноразовый контейнер мокроту от пациента с муковисцидозом с помощью дозатора переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют в режиме 1700 G в течение 5 минут. Полученный супернатант переносят в эппендорф и проводят повторное центрифугирование материала в режиме 4500 G в течение 5 минут. Супернатант повторно переносят в пробирку и на автоматическом биохимическом анализаторе проводят определение содержания ферритина в мокроте с помощью иммунотурбодиметрического метода. При этом, если количество ферритина при исследовании ≤500 мкг/л, инфекционный процесс, вызванный неферментирующими грамотрицательными бактериями расценивается неактивным. При уровне ферритина от 500 до 1000 мкг/л инфекционный процесс умеренно активен, если уровень ферритина >1000 мкг/л то активность инфекционного процесса оценивается как выраженная. Изобретение позволяет получить данные о течении инфекционного процесса, вызванного НФГОБ в бронхолегочной системе у пациентов с муковисцидозом, по уровню ферритина в мокроте. 3 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования развития гестационного сахарного диабета у женщин с андроидным типом ожирения. Для этого у беременной определяют индекс массы тела (ИМТ), а в крови определяют содержание витамина D3 (холекальциферола) и адипонектина и при содержании витамина D3 (холекальциферола) в сыворотке крови менее 20 нг/мл и адипонектина менее 10 нг/мл и ИМТ более 30 кг/м2 прогнозируют развитие гестационного сахарного диабета. Способ позволяет упростить методику прогнозирования развития гестационного сахарного диабета за счет определения трех факторов при однократном посещении беременной врача акушера-гинеколога в рамках диспансерного наблюдения. 5 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии, и может быть использовано при лечении больных с мышечными дистониями. Для этого проводят комплексное клиническое обследование пациента и назначают ботулинотерапию. Перед инъекцией для определения ЭФПЭ, ИНА и ЯИ у пациента забирается 2 мл венозной крови. Через месяц после инъекции ботулотоксина исследуют ЭФПЭ, ИНА и ЯИ, если полученные значения ЭФПЭ ниже 1,00 мкм×см/В×с, ИНА выше 0,5 усл.ед. и ЯИ в диапазоне больше 0,15 и меньше 0,35 усл.ед. назначают препараты анксиолитического действия, а при ЭФПЭ ниже 1,00 мкм×см/В×с, ИНА ниже 0,45 усл.ед. или ЯИ выше или равно 0,35 усл.ед. назначают препараты метаболического действия. Через 3 месяца после инъекции исследуют ЭФПЭ, ИНА и ЯИ, если ЭФПЭ, ИНА и ЯИ соответствуют или приближаются по сравнению с исходными значениями к физиологической норме и не происходит нарастания гиперкинеза, то принимают решение о переносе следующей инъекции ботулотоксина на два месяца позднее ранее запланированного. Способ позволяет повысить стабильность эффекта от лечения и способствует продлению периода ремиссии у пациентов. 4 пр.

Изобретение относится к медицине, а более конкретно к лабораторной диагностике, и может быть использовано в амбулаторной и стационарной стоматологической практике. Способ прогнозирования результатов дентальной имплантации осуществляют следующим образом: до проведения дентальной имплантации и через 3 месяца после установки имплантатов у пациента производят забор 1,0 мл смешанной слюны в стерильную пробирку, центрифугируют ее в течение 10 минут при 3000 об/мин, 0,02 мл надосадочной жидкости центрифугированной смешанной слюны наносят на обезжиренное предметное стекло, установленное в строго горизонтальном положении по осям X и Y относительно горизонта с образованием стандартной капли округлой формы высотой 1,0 мм и диаметром 4-5,0 мм, высушивают ее в течение 24 ч при температуре 20-25°С. Определяют методом световой микроскопии характеристики фации: выраженность отдельных зон фации (Z), индекс структурности (ИС), равномерность распределения кристаллических и аморфных элементов фации (R), минерализующий потенциал слюны (МПС), ширину промежуточной зоны, количество радиальных трещин в краевой зоне капли слюны (КТКЗ), степень деструкции фации (СДФ) и выраженность краевой зоны (Кз) в баллах в соответствии с критериями оценки фации смешанной слюны по Таблице 1. При получении 21-30 баллов до и через 3 месяца после установки имплантатов судят о завершении процессов репарации, что ассоциируют с хорошим прогнозом дентальной имплантации. При получении 21-30 баллов до и 14-20 баллов через 3 месяца после установки имплантатов делают вывод о том, что прогноз в целом благоприятный, но требуется дополнительная терапия, направленная на усиление репаративных процессов костной ткани. При получении 21-30 баллов до и ≤13 баллов через 3 месяца после установки имплантатов делают вывод о неблагоприятном прогнозе, продолжении воспаления и отсутствии репарации кости и остеоинтеграции в нее зубного имплантата. Преимущества способа - неинвазивность, простота метода, безопасность проведения исследований у человека. Использование способа позволяет не только оценить результативность проведенной дентальной имплантации, но и отследить сроки завершения интеграции зубного имплантата в кость, а также динамику данного процесса. 4 табл., 2 пр., 3 ил.
Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ диагностики степени тяжести гнойного холангита у больных механической желтухой с установлением оптимальной хирургической тактики лечения, заключающийся в обследовании больного, отличающийся тем, что в крови больного газохроматографическим методом определяют количество уксусной кислоты и при концентрации уксусной кислоты, равной 0,31-0,34 ммоль/л, устанавливают наличие легкой степени тяжести гнойного холангита, при которой билиарная декомпрессия не показана, при концентрации уксусной кислоты, равной 0,35-0,41 ммоль/л, устанавливают наличие средней степени тяжести гнойного холангита, при которой билиарная декомпрессия показана при отсутствии эффекта от терапевтического лечения, а при концентрации уксусной кислоты, равной 0,42 ммоль/л или более, устанавливают наличие тяжелой степени гнойного холангита, при которой показана неотложная билиарная декомпрессия. Изобретение обеспечивает повышение объективности и точности диагностики степени тяжести гнойного холангита при механической желтухе. 3 пр.

Изобретение относится к области медицине и представляет собой способ оценки тяжести течения сепсиса, включающий подготовку образцов крови больных сепсисом для проведения флуоресцентной in situ гибридизации с последующим обнаружением бактерий в образцах крови с использованием люминесцентной микроскопии, отличающийся тем, что определяют количество адгезированных на поверхности эритроцитов и внутриэритроцитарно расположенных бактерий и рассчитывают интегральный показатель по формуле:ИП1,527+0,333×X1-1,116×Х2-0,137×Х3+0,033×Х4+0,061×Х5-0,184×Х6+3,242×Х7+0,71×Х8+0,888×Х9+0,336×Х10, где: X1 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo1;Х2 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo2; Х3 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo3; Х4 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo4; Х5 - количество адгезированных бактерий на поверхности эритроцитов в образце крови больного, обработанных зондом Oligo5; Х6 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo1; Х7 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo2; Х8 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo3; Х9 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo4; Х10 - количество внутриэритроцитарно расположенных бактерий в образце крови больного, обработанных зондом Oligo5, при этом при значении интегрального показателя меньше 2,5 тяжесть течения сепсиса считают легкой, при значении от 2,5 до 5,6 - средней, а при значении больше 5,6 - тяжелой. Способ позволяет повысить точность ранней диагностики сепсиса и оценить тяжесть течения заболевания. 2 ил., 4 табл., 4 пр.

Наверх