Способы инактивации вирусов и бактерий в клеточной культуральной среде

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии. Предложен способ уменьшения преципитации в клеточной культуральной среде, содержащей кальций и фосфат, в то время как среда сохраняет пригодность для культивирования клеток, причем указанный способ включает регулировку рН, ограничение общего количества кальция и/или ограничение общего количества фосфата в клеточной культуральной среде до проведения кратковременной высокотемпературной (HTST) обработки так, что подавляется формирование комплексов, состоящих из кальция и фосфата, таким образом, что образование преципитата и отложение преципитата понижается и/или минимизируется. 33 з.п. ф-лы, 16 ил., 5 табл., 5 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] По этой заявке испрашивается приоритет патентной заявки США № 13/844051, поданной 15 марта 2013 года, и временной патентной заявки США № 61/662349, поданной 20 июня 2012 года, которые полностью включены посредством ссылки в настоящее описание.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0002] Изобретение относится к способам инактивации вирусов с использованием кратковременной высокотемпературной (HTST) обработки и регулировки различных параметров таким образом, чтобы уменьшить и/или минимизировать образование и отложения преципитата.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0003] Вирусы являются потенциальными контаминантами в процессах производства лекарственных средств, в частности в случаях, когда биологические лекарственные средства получают из клеточных культур млекопитающих. Источником вирусных контаминантов могут быть среды, используемые для клеточной культуры или клеточных линий, производящих представляющие интерес биопрепараты. Современные подходы к предотвращению вирусной контаминации биологических лекарственных средств во время производственного процесса включают высокотемпературную кратковременную (HTST) обработку клеточной среды для инактивации вирусов, которые могут вводиться в клеточную культуральную среду исходными материалами и амплифицироваться во время процесса культивирования (Schleh, M. С соавт. 2009. Biotechnol. Prog. 25(3):854-860 и Kiss, R. 2011. PDA J Pharm Sci and Tech. 65:715-729). Сообщалось, что для того, чтобы HTST являлся эффективным способом инактивации вирусов, необходимы температуры, превышающие приблизительно 85°C, при этом для инактивации парвовируса, обычного вирусного контаминанта клеточных культур, существование которого в процессах культивирования клеток подтверждено документально, и который является устойчивым к многочисленным химическим и физическим инактивирующим средствам, необходимы температуры, превышающие приблизительно 95°C (Schleh с соавт.).

[0004] Хотя было подтверждено, что HTST-обработка является высокоэффективной для инактивации вирусов, когда различные клеточные культуральные среды подвергают данной обработке, в них может происходить преципитация или образование преципитатов. Эта преципитация приводит к накоплению осадка на поверхностях внутри HTST-системы и может вносить вклад в загрязнение оборудования, так что оно более не может нагревать среды до намеченной температуры для надлежащей инактивации вирусных контаминантов. Кроме того, подобная преципитация также может загрязнять фильтры, обычно используемые на выходе из HTST-системы для заключительной обработки с целью удаления из среды микроорганизмов, таких как бактерии. Подобное загрязнение фильтра может приводить к невозможности завершения стадии обработки среды перед процессом культивирования клеток. В некоторых случаях преципитат также может влиять на функционирование клеточных культуральных сред и препятствовать эффективному получению биологических лекарственных средств из культивируемых клеточных линий. Для предотвращения преципитации можно понижать температуру, но это может неблагоприятно влиять на успешную инактивацию вирусов. Кроме того, результатом образования преципитата во время HTST-обработки клеточной среды может быть частая чистка или ремонт оборудования, используемого для HTST-обработки во время производственного процесса, что вносит значительный вклад в стоимость обработки. Вследствие этого, существует потребность в способах предотвращения образования преципитата во время HTST-обработки, не оказывающих неблагоприятного влияния на эффективность данной обработки при удалении или инактивации вирусных контаминантов.

[0005] Изобретение, описанное в настоящей заявке, удовлетворяет данные потребности посредством предоставления способов эффективной инактивации вирусных контаминантов в клеточной культуральной среде с использованием HTST-обработки с регулируемыми параметрами обработки, результатом которых является уменьшение или предотвращение образования преципитата.

[0006] Все ссылки, приводимые в настоящем описании, включая патентные заявки и публикации, полностью включены посредством ссылки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0007] Изобретение относится к способам, процессам, системам и композициям для инактивации вирусной контаминации и/или других контаминантов в клеточной культуральной среде за счет использования кратковременной высокотемпературной (HTST) обработки в комбинации с регулировками различных параметров, таких как pH и/или концентрация в средах кальция и/или фосфата. Кроме того, изобретение также относится к способам, процессам, системам и композициям, уменьшающие загрязнение оборудования и фильтров, используемых для HTST-обработки.

[0008] Соответственно, в одном аспекте, изобретение относится к способам инактивации вирусных или занесенных агентов в клеточной культуральной среде в то время, как среды сохраняют пригодность для культивирования клеток, при этом указанный способ включает (a) подвергание клеточных культуральных сред кратковременной высокотемпературной (HTST) обработке; и (b) регулирование одного или более параметров, выбранных из группы, состоящей из pH, уровня кальция и уровня фосфата.

[0009] В других аспектах, изобретение относится к способам инактивации вирусов в клеточной культуральной среде, включающим подвергание клеточных культуральных сред кратковременной высокотемпературной (HTST) обработке, при этом во время HTST-обработки среда имеет pH между приблизительно pH 5,0 и приблизительно pH 6,9. В еще одном аспекте, изобретение относится к способам инактивации вирусов в клеточной культуральной среде, включающие подвергание клеточных культуральных сред кратковременной высокотемпературной (HTST) обработке, при этом во время HTST-обработки среда имеет pH между приблизительно pH 5,0 и приблизительно pH 7,2. В некоторых вариантах осуществления, во время HTST-обработки среда имеет pH между приблизительно pH 5,3 и приблизительно pH 6,3. В других вариантах осуществления, во время HTST-обработки среда имеет pH, равный приблизительно pH 6,0. В любом из вариантов осуществления, для инактивации вирусов или потенциальных вирусов в средах HTST-обработка включает повышение температуры среды по меньшей мере до приблизительно 85 градусов по Цельсию на протяжении достаточного количества времени. В некоторых вариантах осуществления, для инактивации вирусов или потенциальных вирусов в средах температуру среды повышают по меньшей мере до приблизительно 93 градусов по Цельсию на протяжении достаточного количества времени. В некоторых вариантах осуществления, для инактивации вирусов или потенциальных вирусов в средах температуру среды повышают по меньшей мере до приблизительно 95, 97, 99, 101 или 103 градусов по Цельсию на протяжении достаточного количества времени. В некоторых вариантах осуществления, pH среды понижают до между приблизительно pH 5,0 и приблизительно pH 6,9 во время HTST-обработки перед фазой выработки полипептида. В некоторых вариантах осуществления, pH среды затем доводят до между приблизительно 6,9-7,2 для фазы выработки полипептида.

[0010] В еще одном аспекте, изобретение относится к способам инактивации вирусов в клеточной культуральной среде, включающие ограничение общего количества фосфата и кальция в средах во время HTST-обработки до менее, чем приблизительно 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления, общая концентрация фосфата и кальция в средах во время HTST-обработки ограничена менее, чем до приблизительно 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, общее количество фосфата и кальция в средах во время HTST-обработки перед фазой выработки полипептида ограничено менее, чем приблизительно 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления, затем общее количество фосфата и кальция в средах повышают до уровня, достаточного для выработки полипептида во время фазы выработки белка.

[0011] В еще одном аспекте, изобретение относится к способам уменьшения загрязнения оборудования, используемого для HTST-обработки для инактивации вирусов, при этом способ включает подвергание клеточных культуральных сред, используемых в оборудовании, кратковременной высокотемпературной (HTST) обработке, при этом во время HTST-обработки среда имеет pH между приблизительно pH 5,0 и приблизительно pH 6,9. В некоторых вариантах осуществления, во время HTST-обработки среда имеет pH между приблизительно pH 5,3 и приблизительно pH 6,3. В некоторых вариантах осуществления, во время HTST-обработки среда имеет pH, равный приблизительно pH 6,0. В некоторых вариантах осуществления, загрязнение включает преципитацию на оборудовании, используемом для HTST-обработки. В любом из вариантов осуществления, HTST-обработка включает повышение температуры среды по меньшей мере до приблизительно 85 градусов по Цельсию на протяжении достаточного количества времени для инактивации вирусов в средах. В некоторых вариантах осуществления, температуру среды повышают по меньшей мере до приблизительно 93 градусов по Цельсию на протяжении достаточного количества времени для инактивации вирусов в средах. В некоторых вариантах осуществления, температуру среды повышают по меньшей мере до приблизительно 95, 97, 99, 101 или 103 градусов по Цельсию на протяжении достаточного количества времени для инактивации вирусов в средах.

[0012] В еще одном аспекте, изобретение относится к способам уменьшения загрязнения оборудования, используемого для HTST-обработки для инактивации вирусов, при этом способ включает ограничение общего количества фосфата и кальция в клеточной культуральной среде, используемой в оборудовании во время HTST-обработки, до менее, чем приблизительно 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления, общая концентрация фосфата и кальция в средах во время HTST-обработки ограничена менее, чем до приблизительно 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, загрязнение включает преципитацию на оборудовании, используемом для HTST-обработки. В любом из вариантов осуществления, вирус выбирают из группы, состоящей из парвовирусов, парамиксовирусов, ортомиксовирусов, буньявирусов, рабдовирусов, реовирусов, тогавирусов, калицивирусов и пикорнавирусов. В любом из вариантов осуществления, вирусом является вирус в оболочке. В любом из вариантов осуществления, вирусом является вирус без оболочки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0013] Фигура 1 представляет собой схематичное изображение типового HTST-модуля, используемого в производстве.

[0014] Фигура 2 представляет собой график, изображающий профили нагревания из метода песочной ванны и HTST-обработки до намеченной заданной величины 102°C. Кривые показывают профили нагревания в минуты, когда конечная точка каждой кривой была описана посредством времени и температуры в конечной точке (например, значение в конечной точке, составляющее «6,2, 102» = значение в конечной точке в 6,2 минуты было при 102°C).

[0015] Фигура 3 представляет собой картину образцов сред, которые, как известно, выпадают в осадок во время HTST-обработки после тепловой обработки методом песочной ванны. A) Нецентрифугированные образцы среды 1 с pH 7,0 или pH 6,4, и среды 2 с pH 7,0 или pH 6,7 в сосудах для термообработки под давлением. B) Центрифугированные аликвоты среды 1 с pH 7,0 или pH 6,4, и среды 2 с pH 7,0 или pH 6,7 из сосудов для обработки под давлением.

[0016] Фигура 4 изображает отсортированные оценки параметров из составов сред на основе среды 4 для показателей параметров, которые коррелировали с более большим уровнем мутности образца, обработанного в песочной ванне.

[0017] Фигура 5 представляет собой серию графиков, изображающих характеристическая поверхность преципитации, которую измеряют по мутности (НЕФ) с 3 перспективных изображений для составов на основе среды 4 с варьируемыми уровнями кальция, фосфата и pH в процессе тепловой обработки в песочной ванне. Участки каждой плоскости в перспективе, где видна решетка, показывают область, где мутность была ниже, чем 5 НЕФ, коррелировали с не видимой преципитацией в тестируемых образцах сред и представляли безопасный режим работы. A) Вид сбоку графика, показывающего измерения мутности в средах с изменяющимися концентрациями фосфата и кальция. Вид сверху графика, показывающего измерения мутности в средах с B) изменяющимися концентрациями фосфата и кальция, C) изменяющимися концентрациями фосфата и уровнями pH, и D) изменяющимися концентрациями кальция и уровнями pH.

[0018] Фигура 6 представляет собой график, изображающий составы сред, расположенных на характеристической поверхности среды 4, для pH 7,0 относительно их известных и оцененных концентраций кальция и фосфата. Несмотря на другие композиционные различия среди всех составов, концентрации кальция и фосфата тесно коррелировали с потенциалом преципитации при тепловой обработке. Стрелка обозначает сдвиг среды в режим преципитации вследствие добавления гидролизата, содержащего дополнительные уровни фосфата и/или кальция.

[0019] Фигура 7 изображает график с усредненным профилем нагревания для четырех составов сред в системе песочной ванны. Взяли пять конечных точек с различными температурами (обозначены 2 цифрами, где, например, «2,5, 75,9» = образцы, взятые на 2,5 минуте с полученной в результате средней температурой, составляющей 75,9°C). На фотографии справа наложены заполненные или пустые круги, коррелирующие с видимой преципитацией, наблюдаемой либо в нецентрифугированных, либо в центрифугированных образцах. Пустой круг = преципитация не была обнаружена визуальным методом в нецентрифугированных или центрифугированных образцах. Заполненный круг = преципитация была обнаружена визуальным методом либо в обоих, либо в одном из образцов.

[0020] Фигура 8 представляет собой график, изображающий значения мутности (НЕФ) для 5 образцов с различными температурами в конечных точках, взятых из 4 различных составов сред. Значения мутности больше чем ~8 НЕФ коррелировали с идентификацией видимой преципитации либо посредством прямого визуального осмотра, либо посредством осмотра центрифугированных образцов.

[0021] Фигура 9 представляет собой серию графиков, показывающих потерю железа (левая панель) и меди (правая панель) при HTST-обработке, где операции HTST-обработки и фильтрования были успешными.

[0022] Фигура 10 представляет собой серию графиков, демонстрирующих графики основных реакций на восстановление железа вследствие варьирования A) уровней pH, B) концентраций кальция (Ca), C) концентраций фосфата (PO4), D) концентраций железа (Fe) и E) концентраций меди (Cu) в процессе тепловой обработки.

[0023] Фигура 11 изображает серию графиков, демонстрирующих график взаимодействия из результатов статистически спланированных экспериментов (планирование экспериментов (DoE)), показывающий эффекты взаимодействия между pH, Ca, PO4 и Fe на восстановление железа в процессе тепловой обработки.

[0024] Фигура 12 представляет собой график, показывающий зависимость итоговой концентрации Fe от первоначальной концентрации Fe в термообработанной среде. Все другие компоненты среды были на нормальных 1,5x уровнях среды 4.

[0025] Фигура 13 представляет собой график, показывающий зависимость восстановления Fe от регулировки нескольких параметров в термообработанной среде. A) Зависимость восстановления Fe от уровней pH, и B) зависимость восстановления Fe от концентраций кальция и фосфата в термообработанной среде. Все другие компоненты среды были на нормальных 1,5x уровнях среды 4. Стандартные концентрации для Среды 4 обозначены 1 в масштабе оси х.

[0026] Фигура 14 представляет собой график, демонстрирующий взаимосвязь восстановления кальция и фосфата с восстановлением Fe, вслед за тепловой обработкой. Базовые точки внутри красного круга обозначают образцы, которые показывали видимую преципитацию и повышенную мутность (НЕФ). Линия обозначает взаимосвязь через базовые точки кальция.

[0027] Фигура 15 представляет собой график, демонстрирующий уровни железа в составах различных клеточных культуральных сред перед и после HTST-обработки. Для конкретных клеточных культуральных сред (например, для среды 14), левый столбик обозначает ожидаемые уровни железа в клеточной культуральной среде после HTST-обработки, средний столбик обозначает фактические уровни железа в клеточной культуральной среде перед HTST-обработкой (Pre-HTST), а правый столбик обозначает фактические уровни железа в клеточной культуральной среде после HTST-обработки (После HTST).

[0028] Фигура 16 представляет собой график, демонстрирующий что добавление железа в HTST обработанные среды полезно для роста клеточной линии гибридомы NS0 в клеточной культуре. HTST + обозначает клеточные культуральные среды, подвергнутые HTST-обработке. HTST - обозначает клеточные культуральные среды, не подвергнутые HTST-обработке. Fe обозначает присутствие дополнительного железа.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0029] Авторы изобретения совершили неожиданное открытие, что регулирование pH клеточных культуральных сред, регулирование концентрации кальция, регулирование концентрации фосфата, регулирование концентрации как кальция, так и фосфата и/или ограничение общего количества фосфата и кальция в клеточной культуральной среде или регулирование комбинации pH, концентрации кальция и концентрации фосфата, и подвергание клеточных культуральных сред HTST-обработке в конкретном температурном диапазоне на протяжении достаточного количества времени является эффективным для инактивирования вирусов (или других инфекционных и/или занесенных агентов) в средах, а также уменьшает загрязнение оборудования за счет минимизации или предотвращения образования преципитата.

[0030] Представленное изобретение предоставляет способы уменьшения преципитата на оборудовании, используемом для кратковременной высокотемпературной (HTST) обработки для инактивации вирусов, при этом способ включает подвергание клеточных культуральных сред, используемых в оборудовании, HTST-обработке, при этом во время HTST-обработки среда имеет pH между приблизительно pH 5,0 и приблизительно pH 6,9 или между приблизительно pH 5,0 и приблизительно pH 7,2. В еще одном аспекте, изобретение предоставляет способы уменьшения преципитата на оборудовании, используемом для кратковременной высокотемпературной (HTST) обработки для инактивации вирусов, при этом способ включает подвергание клеточных культуральных сред, используемых в оборудовании, HTST-обработке, при этом во время HTST-обработки среда имеет pH между приблизительно pH 5,0 и приблизительно pH 7,2. В других аспектах, представленное изобретение предоставляет способы уменьшения преципитата на оборудовании, используемом для HTST-обработки для инактивации вирусов, при этом способ включает ограничение общего количества фосфата и кальция в клеточной культуральной среде, используемой в оборудовании во время HTST-обработки, до менее, чем приблизительно 10 мМ.

[0031] В еще одном аспекте, представленное изобретение предоставляет способы инактивации вирусов в клеточной культуральной среде, включающие подвергание клеточных культуральных сред HTST-обработке, при этом во время HTST-обработки среда имеет pH между приблизительно pH 5,0 и приблизительно pH 6,9. В еще одном аспекте, представленное изобретение предоставляет способы инактивации вирусов в клеточной культуральной среде, включающие подвергание клеточных культуральных сред HTST-обработке, при этом во время HTST-обработки среда имеет pH между приблизительно pH 5,0 и приблизительно pH 7,2. В третьих аспектах изобретения, во время HTST-обработки pH среды понижают до между приблизительно pH 5,0 и приблизительно pH 6,9 перед фазой выработки полипептида культуры клеток. В некоторых аспектах, pH среды затем доводят до между приблизительно pH 6,9 до приблизительно pH 7,2 для фазы выработки полипептида культуры клеток. В других аспектах, представленное изобретение предоставляет способы инактивации вирусов в клеточной культуральной среде, включающие ограничение общего количества фосфата и кальция в клеточной культуральной среде во время HTST-обработки до менее, чем приблизительно 10 мМ.

I. Общие методы

[0032] Методы и методики, описанные или упоминаемые в данном описании, в общем являются хорошо понятными и широко задействуются квалифицированными специалисты в данной области с использованием общепринятой методологии, такой как, например, широко используемые методологии, описанные у Sambrook с соавт., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, с соавт. eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and М.P. Calos, eds., 1987); PCR: Polymerase Chain Reaction, (Mullis с соавт., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan с соавт., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); and Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita с соавт., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).

II. Определения

[0033] «Культивирование» клетки относится к контактированию клетки с клеточной культуральной средой в условиях, подходящих для выживания и/или роста клетки и/или пролиферации клетки.

[0034] «Культура одного производственного цикла» относится к культуре, в которой все компоненты для культивирования клетки (включая клетки и все питательные вещества для культуры) подаются в сосуд для культивирования в начале процесса культивирования.

[0035] Фраза «подаваемая клеточная культура одного производственного цикла», как используется в данном описании, относится к культуре одного производственного цикла, в которой клетки и культуральная среда подаются в сосуд для культивирования вначале, а дополнительные питательные вещества для культуры подаются в культуру, непрерывно или отдельными порциями, во время процесса культивирования, с или без периодического сбора клеток и/или продуктов перед завершением культивирования.

[0036] «Перфузионной культурой» является культура, с помощью которой клетки задерживают в культуре, например, посредством фильтрования, инкапсуляции, закрепления в микроносители и т.д., при этом культуральную среду непрерывно или с перерывами вводят и удаляют из сосуда для культивирования.

[0037] «Сосуд для культивирования» относится к контейнеру, используемому для культивирования клетки. Сосуд для культивирования может быть любого размера при условии, что он является пригодным для культивирования клеток.

[0038] Термины «среда» и «клеточная культуральная среда» относятся к источнику питательных веществ, используемому для выращивания или сохранения клеток. Как должно быть понятно квалифицированному специалисту в данной области, источник питательных веществ может содержать компоненты, необходимые клетке для роста и/или выживания, или может содержать компоненты, которые помогают клеточному росту и/или выживанию. Витамины, незаменимые или заменимые аминокислоты и присутствующие в небольших количествах элементы являются примерами компонентов среды. Должно быть понятно, что «среда» и «среды» на протяжении данного описания используются взаимозаменяемо.

[0039] «Клеточной культуральной средой определенного химического состава» или «CDM» является среда с заданным составом, которая не содержит неопределенные продукты или продукты животного происхождения, такие как животная сыворотка и пептон. Как должно быть понятно квалифицированному специалисту в данной области, CDM может использоваться в процессе выработки полипептида, посредством чего клетка находится в контакте с CDM и секретирует в нее полипептид. Таким образом, должно понятно, что состав может содержать CDM и полипептидный продукт и что наличие полипептидного продукта не делает CDM химически неопределенной.

[0040] «Клеточная культуральная среда неопределенного химического состава» относится к среде, химический состав которой может быть не задан и которая может содержать один или более продуктов животного происхождения или неопределенных продуктов, таких как животная сыворотка и пептон. Как должно быть понятно квалифицированному специалисту в данной области, клеточная культуральная среда неопределенного химического состава в качестве источника питательных веществ может содержать продукт животного происхождения.

[0041] Термины «полипептид» и «белок» в данном описании используются взаимозаменяемо для ссылки на полимеры аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты, и он может прерываться неаминокислотами. Термины также охватывают аминокислотный полимер, который был модифицирован естественным образом или посредством вмешательства; например, посредством образования дисульфидной связи, гликозилирования, липидизации, ацетилирования, фосфорилирования или посредством любой другой манипуляции или модификации, такой как конъюгирование с меченым компонентом. Также в пределах определения содержаться, например, полипептиды, содержащие один или более аналогов аминокислоты (включая, например, неприродные аминокислоты и т.д.), а также другие модификации, известные в данной области. Термины «полипептид» и «белок», как используется в данном случае, специфически охватывают антитела.

[0042] «Изолированный полипептид» означает полипептид, который был восстановлен из клетки или клеточной культуры, из которой он был экспрессирован.

[0043] «Нуклеиновая кислота», как взаимозаменяемо используется в данном описании, относиться к полимерам нуклеотидов любой длины и включает ДНК и РНК. Нуклеотидами могут быть дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды, модифицированные нуклеотиды или основания, и/или их аналоги, или любой субстрат, который может быть включен в полимер с помощью ДНК или РНК полимеразы, или с помощью реакции синтеза. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. Если присутствует, модификация нуклеотидной структуре может быть придана перед или после сборки полимера.

[0044] «Изолированная нуклеиновая кислота» означает и охватывает последовательность неестественного происхождения, рекомбинантную или естественного происхождения за пределами или отделенную от своего обычного контекста.

[0045] «Очищенный» полипептид означает, что чистота полипептида была повышена таким образом, что он существует в форме, которая является более чистой, чем он существует в своем естественном окружении и/или когда первоначально получен и/или синтезирован и/или амплифицирован в лабораторных условиях. Чистота представляет собой относительный термин и не обязательно означает абсолютную чистоту.

[0046] Термин «антитело» или «антитела» используется в самом широком смысле и конкретно охватывает, например, единичные моноклональные антитела (включая агонист, антагонист и нейтрализующие антитела), композиции антител с полиэпитопной специфичностью, поликлональные антитела, одноцепочечные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), иммуноадгезины и фрагменты антител при условии, что они проявляют необходимую биологическую или иммунологическую активность. Термин «иммуноглобулин» (Ig) в данном описании используется взаимозаменяемо с антителом.

[0047] «Фрагменты антитела» содержат часть непроцессированного антитела, как правило, его антиген связывающую или вариабельную область. Примеры фрагментов антитела включают Fab, Fab', F(ab')2, и Fv фрагменты; молекулы одноцепочечного антитела; диантитела; линейные антитела; и полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антитела.

[0048] Термин «моноклональное антитело», как используется в данном описании, относится к антителу, полученному из популяции по существу однородных антител, т.е., индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными за исключением возможных мутаций естественного происхождения, которые могут иметься в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высоко специфическими, направленными против единственного иммунодоминантного сайта. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против единственной детерминанты на антиген. В дополнение к своей специфичности, моноклональные антитела имеют преимущество в том, что они могут быть синтезированы незараженными другими антителами. Определение «моноклональный» не следует истолковывать, как требующий получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, используемые в представленном изобретении, могут быть получены по методологии гибридома, впервые описанной Kohler с соавт., Nature, 256:495 (1975), или могут быть получены, используя методы рекомбинантной ДНК в бактериальных, эукариотических, животных или растительных клетках (см., например, патент США № 4816567). «Моноклональные антитела» также могут быть изолированы из библиотек фаговых антител с использованием методов, описанных, например, у Clackson с соавт., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks с соавт., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991).

[0049] Моноклональные антитела в данном описании включают «химерные» антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, происходящих из конкретных видов или относящихся к конкретному классу или подклассу антител, в то время, как оставшаяся часть цепи (цепей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, происходящих из других видов или относящихся к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты подобных антител, при условии, что они проявляют необходимую биологическую активность (см. патент США № 4816567; и Morrison с соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Химерные антитела, представляющие интерес в данном описании, включают «приматизированные» антитела, содержащие связывающие антигены последовательности вариабельных доменов, происходящие из не относящихся к человеку приматов (например, Old World Monkey, Ape и т.д.), и последовательности постоянной области человека.

[0050] «Гуманизированные» антитела являются формами нечеловеческих антител (например, грызунов), которые представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, происходящую из нечеловеческого антитела. По большей части, гуманизированными антителами являются иммуноглобулины человека (реципиентное антитело), в которых остатки из гипервариабельной области реципиента заменены остатками из гипервариабельной области не относящихся к человеку видов (донорское антитело), таких как мышь, крыса, кролик или не относящихся к человеку приматов, обладающих необходимой специфичностью, аффинностью и емкостью антител. В некоторых случаях, остатки каркасной области (FR) человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими нечеловеческими остатками. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаружены в реципиентном антителе или в донорском антителе. Данные модификации сделаны для дополнительного улучшения эффективности антител. Как правило, гуманизированное антитело будет содержать по существу все из по меньшей мере одного, а обычно двух, вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют петлям нечеловеческого иммуноглобулина, и все или по существу все FR представляют собой FR последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело необязательно также будет содержать по меньшей мере часть постоянной области (Fc) иммуноглобулина, обычно часть постоянной области человеческого иммуноглобулина. Для дополнительных подробностей, см. Jones с соавт., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann с соавт., Nature 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

[0051] «Контаминанты» относится к материалам, которые отличаются от необходимого полипептидного продукта. Контаминант включает, без ограничения: материалы клетки хозяина, такие как CHOP; выщелоченный белок A; нуклеиновую кислоту; вариант, фрагмент, агрегат или дериватив необходимого полипептида; еще один полипептид; эндотоксин; вирусный контаминант; компонент клеточной культуральной среды и т.д.

[0052] Как используется в данном описании, термин «преципитат» относится к образованию твердых или нерастворимых частиц в растворе. Существуют различные виды преципитата, а в данной заявке описаны иллюстративные преципитаты. Неограничивающие примеры включают: преципитацию фосфата кальция, нерастворимый витлокит, оксиды, преципитаты фосфата железа и фосфата железа кальция. Преципитацией фосфата кальция может быть процесс, в котором кальций и фосфаты в растворе образуют нерастворимые частицы, т.е., преципитат. Нерастворимые частицы могут упоминаться, как фосфаты кальция. Фосфаты кальция включают, без ограничения: монокальцийфосфат, двузамещенный фосфат кальция, трикальцийфосфат, витлокит и гидроксиапатит. Нерастворимые частицы могут включать дополнительные компоненты, т.е. полипептиды, нуклеиновые кислоты, липиды, ионы, хелатирующие агенты и металлы. Также в определение включен рост подобных частиц за счет дополнительной преципитации или за счет аггрегирования, флокуляции и/или реаранжировки.

[0053] Как используется в данном описании, термин «загрязнение» относится к накоплению и образованию нежелательных материалов на поверхностях обрабатывающего оборудования. Загрязнение может быть охарактеризовано, как комбинированная, неустановившаяся, импульсная, проблема переноса массы и тепла с также происходящими химическими, биологическими процессами и с процессами растворимости и коррозии. Загрязнение может происходить вследствие преципитации, т.е., преципитации фосфата кальция.

[0054] Как используется в данном описании, «занесенный агент» охватывает вирусы и бактерии (включая бактерии, которые могут проходить через фильтры стерилизующей категории). «Инфекционный агент» является типом «занесенного агента».

[0055] Должно понятно, что аспекты и варианты осуществления изобретения, описанного в данной заявке, включают «содержащий», «состоящий из» и «состоящий по существу из» аспектов и вариантов осуществления.

[0056] Для использования в данном описании, до тех пор, пока ясно не указано иное, использование терминов «a», «an», и тому подобное относится к одному или более.

[0057] Ссылка на «приблизительное» значение или параметр в данном описании включает (и описывает) варианты осуществления, которые направлены на данное значение или параметр как таковой. Например, описание со ссылкой на «приблизительно X» включает описание «X». Числовые диапазоны указаны с включением чисел, образующих диапазон.

III. Клеточные культуральные среды

[0058] Способы инактивации вирусов, инфекционных агентов, и/или занесенных агентов в клеточной культуральной среде могут применяться для любого типа клеточных культуральных сред, где существует проблема вирусной контаминации, с возможным вирусным загрязнением или с загрязнением другими инфекционными агентами или загрязнением занесенными агентами. Должно быть понятно, что изобретение предусматривает композиции и способы, применимые к клеточным культурам и клеточным культуральным средам, где существует возможное вирусное загрязнение, а также фактическое вирусное загрязнение.

[0059] Способы инактивирования вирусов, уменьшения образования преципитата и уменьшения загрязнение оборудования, используемого для HTST-обработки, могут использоваться для получения композиции клеточных культуральных сред, где были инактивированы вирусы, занесенные агенты и другие инфекционные агенты. В связи с этим, в данном описании предусматриваются и детально описываются любые композиции клеточных культуральных сред и их промежуточных продуктов по мере их прохождения через систему инактивации вирусов, инактивации занесенных агентов, и/или инактивации инфекционных агентов. Регулировка конкретных параметров клеточных культуральных сред (pH, уровней кальция и уровней фосфата) была идентифицирована, как возможность уменьшения или предотвращения образования преципитатов в средах после подвергания HTST-обработке при температурах, эффективных для инактивации вирусных контаминантов и других контаминантов, присутствующих в средах.

[0060] Независимые регулировки параметров клеточных культуральных сред, таких как pH, концентрации или количества кальция и концентрации или количества фосфата (и любые их комбинации) могут использоваться с HTST-обработкой для уменьшения преципитатов (например, комплекса, содержащего кальций и фосфат), для уменьшения загрязнения HTST оборудования, для уменьшения загрязнения фильтра, и все это при сохранении пригодности для клеточной культуры. Клеточные культуральные среды, которые сохраняют пригодность для культивирования клеток, обеспечивают клеткам возможность размножения, роста, выживаемости, выработки любого полипептида, белка или соединения, секретирования любых подобных продуктов в среды, и любые другие признаки, которые квалифицированный специалист в данной области должен понимать, как включенные в цели пригодности клеточной культуры.

[0061] независимые регулировки параметров клеточной культуры, описанных в данной заявке, применимы к любому процессу культивирования клеток и могут быть полезны для выработки полипептидов и/или белков, но также для создания других продуктов, таких как клетки, среды и другие компоненты в средах. Регулировка параметров данных клеточных культуральных сред для уменьшения или предотвращения преципитатов в клеточной культуральной среде является полезной для выработки биологических лекарственных средств, таких как полипептидный лекарственный продукт. Использование клеточных культуральных сред с данными регулируемыми параметрами или компонентами является эффективным для удаления вирусных контаминантов из биологического лекарственного продукта, а также для уменьшения или предотвращения преципитатов, которые могут влиять на функционирование клеточных культуральных сред, препятствовать эффективному получению биологических лекарственных средств из культивируемых клеточных линий и вносить вклад в загрязнение HTST оборудования. Любая среда, подробно описанная в данном документе, может быть использована на любой стадии клеточного роста, поддержания и выработки биологического лекарственного средства и может использоваться в базовой среде и/или в подаваемой среде. Среды, как описано в данном описании, в одном варианте приводят к приемлемым уровням мутности или преципитата композиции, содержащей биологическое лекарственное средство, изолированное из клеточной культуры, выращиваемой в средах, подвергнутых HTST-обработке.

[0062] Предоставлена клеточная культуральная среда, содержащая один или более следующих компонентов: (a) кальций и (b) фосфат. В некоторых вариантах, клеточная культуральная среда содержит компоненты (a) или (b), или компоненты (a) и (b). В других вариантах, клеточная культуральная среда не содержит компоненты (a) и (b). В некоторых аспектах, клеточной культуральной средой является клеточная культуральная среда определенного химического состава. В других аспектах, клеточной культуральной средой является клеточная культуральная среда неопределенного химического состава. В любых из аспектов, клеточная культуральная среда используется для инактивации вирусов во время HTST-обработки. В любых из аспектов, клеточную культуральную среду обрабатывают посредством HTST для инактивации вирусов потенциально присутствующих в исходных материалах, используемых с обработкой для приготовления среды.

[0063] Компоненты среды можно добавлять в композицию в формах, которые являются известными в данной области. Например, кальций может быть предоставлен в виде, но без ограничения, хлорида кальция, дегидрата хлорида кальция, карбоната кальция, фосфата кальция, трикальцийфосфата, гидрата L-лактата кальция, фолината кальция и тетрагидрата нитрата кальция. Например, фосфат может быть предоставлен в виде, но без ограничения, фосфата натрия, мононатрийфосфата, динатрийфосфата, калия фосфата однозамещенного, забуференного фосфатом физиологического раствора, фосфата кальция и двузамещенного фосфата кальция.

[0064] Соотношение фосфата и кальция можно регулировать для HTST-обработки таким образом, чтобы не образовывались комплексы, содержащие кальций и фосфат (например, комплексы фосфата кальция (CaPO4)). В одном варианте, общее количество фосфата и кальция регулируют или ограничивают таким образом, чтобы не образовывались комплексы, содержащие кальций и фосфат (например, комплексы фосфата кальция (CaPO4)). В еще одном варианте, общее количество фосфата и кальция ограничивают таким образом, что образование комплексов CaPO4 допускает успешную HTST операцию (например, не загрязняя HTST и фильтрующее оборудование). Установление способов для проблемных условий обычно включает непрямые измерения преципитации, включая мутность, рабочие осмотры HTST и фильтрующего оборудования, и визуальные осмотры HTST и фильтрующего оборудования (например, посредством использования бороскопа). В одном аспекте, средой является клеточная культуральная среда, содержащая ограничение общего количества фосфата и кальция до менее, чем приблизительно 10 мМ. В еще одном варианте, общий фосфат и кальций находится в концентрации в средах до менее, чем приблизительно 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 мМ. В еще одном варианте, общий фосфат и кальций находится в концентрации в средах от приблизительно 1 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 2 мМ до приблизительно 8 мМ; от приблизительно 3 мМ до приблизительно 7 мМ; от приблизительно 4 мМ до приблизительно 6 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 8 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 7 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 6 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 5 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 4 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 3 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 2 мМ; от приблизительно 2 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 3 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 4 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 5 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 6 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 7 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 8 мМ до приблизительно 9 мМ; приблизительно любой из 9 или 8 или 7 или 6 или 5 или 4 или 3 или 2 или 1 мМ; по меньшей мере приблизительно любой из 1 или 2 или 3 или 4 или 5 или 6 или 7 или 8 и не более чем приблизительно 9 мМ. В варианте, общий фосфат и кальций находится в концентрации в средах от приблизительно 1 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 2 мМ до приблизительно 8 мМ; от приблизительно 3 мМ до приблизительно 7 мМ; от приблизительно 4 мМ до приблизительно 6 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 8 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 7 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 6 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 5 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 4 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 3 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 2 мМ; от приблизительно 2 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 3 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 4 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 5 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 6 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 7 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 8 мМ до приблизительно 9 мМ; приблизительно любой из 9 или 8 или 7 или 6 или 5 или 4 или 3 или 2 или 1 мМ; по меньшей мере приблизительно любой из 1 или 2 или 3 или 4 или 5 или 6 или 7 или 8 и не более чем приблизительно 9 мМ во время HTST-обработки перед фазой выработки полипептида клеточной культуры. В любых из аспектов изобретения, общее количество кальция и фосфата в средах ограничено менее, чем до приблизительно 10 мМ во время HTST-обработки перед фазой выработки полипептида клеточной культуры. В дополнительных аспектах изобретения, общее количество кальция и фосфата в средах затем повышают до уровня, достаточного для выработки полипептида во время фазы выработки полипептида клеточной культуры. В некоторых аспектах, клеточная культуральная среда не содержит кальций и фосфат.

[0065] уровень кальция в клеточной культуральной среде можно регулировать, когда среда содержит фосфат. Регулировкой может быть увеличение или уменьшение уровня кальция. В некоторых вариантах осуществления, уровень кальция уменьшают (включая удаление кальция). В других вариантах осуществления, уровень кальция уменьшают таким образом, что подавляется образование комплексов, состоящих из кальция и фосфата. В других вариантах осуществления, перед HTST-обработкой из среды удаляют кальций. В любых данных вариантах осуществления, pH регулируют таким образом, что подавляется образование комплексов, состоящих из кальция и фосфата (например, понижается количество по сравнению с комплексами, которые образовывались бы, если бы не проводились данные регулировки). В других вариантах осуществления, уровень кальция может дополнительно регулироваться вслед за HTST-обработкой до уровня, подходящего для клеточной культуры. Синхронизация между HTST-обработкой и регулировкой уровней кальция вслед за HTST до уровня, подходящего для клеточной культуры, может изменяться. В пределах объем правовых притязаний изобретения предусматривается протекание времени порядка секунд, минут, дней, недель, месяцев или лет.

[0066] В еще одном варианте, средой является клеточная культуральная среда, содержащая ограничение общего количества кальция до менее, чем приблизительно 10 мМ. В еще одном варианте, общий кальций находится в концентрации в средах до менее, чем приблизительно 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 мМ. В еще одном варианте, общий кальций находится в концентрации в средах от приблизительно 1 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 2 мМ до приблизительно 8 мМ; от приблизительно 3 мМ до приблизительно 7 мМ; от приблизительно 4 мМ до приблизительно 6 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 8 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 7 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 6 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 5 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 4 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 3 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 2 мМ; от приблизительно 2 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 3 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 4 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 5 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 6 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 7 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 8 мМ до приблизительно 9 мМ; приблизительно любой из 9 или 8 или 7 или 6 или 5 или 4 или 3 или 2 или 1 мМ; по меньшей мере приблизительно любой из 1 или 2 или 3 или 4 или 5 или 6 или 7 или 8 и не более чем приблизительно 9 мМ. В еще одном варианте, общий кальций находится в концентрации в средах от приблизительно 1 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 2 мМ до приблизительно 8 мМ; от приблизительно 3 мМ до приблизительно 7 мМ; от приблизительно 4 мМ до приблизительно 6 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 8 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 7 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 6 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 5 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 4 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 3 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 2 мМ; от приблизительно 2 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 3 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 4 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 5 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 6 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 7 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 8 мМ до приблизительно 9 мМ; приблизительно любой из 9 или 8 или 7 или 6 или 5 или 4 или 3 или 2 или 1 мМ; по меньшей мере приблизительно любой из 1 или 2 или 3 или 4 или 5 или 6 или 7 или 8 и не более чем приблизительно 9 мМ во время HTST-обработки перед фазой выработки полипептида клеточной культуры. В любых из аспектов изобретения, общее количество кальция в средах ограничено менее, чем до приблизительно 10 мМ во время HTST-обработки перед фазой выработки полипептида клеточной культуры. В дополнительных аспектах изобретения, общее количество кальция в средах затем повышают до уровня, достаточного для выработки полипептида во время фазы выработки полипептида клеточной культуры. В некоторых аспектах клеточная культуральная среда не содержит фосфата.

[0067] В еще одном аспекте, уровень фосфата можно регулировать, когда среда содержит кальций. Регулировкой может быть увеличение или уменьшение уровня фосфата. В некоторых вариантах осуществления, уровень фосфата уменьшается. В некоторых вариантах осуществления, уровень фосфата уменьшается таким образом, что образование комплексов, состоящих из кальция и фосфата, подавляется. В некоторых вариантах осуществления, перед HTST-обработкой из среды удаляют фосфат. В некоторых вариантах осуществления, pH регулируют таким образом, что образование комплексов, состоящих из кальция и фосфата, подавляется. В некоторых вариантах осуществления, уровень фосфата дополнительно регулируют вслед за HTST-обработкой до уровня, подходящего для клеточной культуры. Синхронизация между HTST-обработкой и регулировкой уровней фосфата вслед за HTST до уровня, подходящего для клеточной культуры, может изменяться. В пределах объем правовых притязаний изобретения предусматривается протекание времени порядка секунд, минут, дней, недель, месяцев или лет.

[0068] В еще одном варианте, средой является клеточная культуральная среда, содержащая ограничение общего количества фосфата до менее, чем приблизительно 10 мМ. В еще одном варианте, общий фосфат находится в концентрации в средах до менее, чем приблизительно 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 мМ. В еще одном варианте, общий фосфат находится в концентрации в средах от приблизительно 1 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 2 мМ до приблизительно 8 мМ; от приблизительно 3 мМ до приблизительно 7 мМ; от приблизительно 4 мМ до приблизительно 6 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 8 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 7 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 6 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 5 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 4 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 3 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 2 мМ; от приблизительно 2 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 3 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 4 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 5 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 6 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 7 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 8 мМ до приблизительно 9 мМ; приблизительно любой из 9 или 8 или 7 или 6 или 5 или 4 или 3 или 2 или 1 мМ; по меньшей мере приблизительно любой из 1 или 2 или 3 или 4 или 5 или 6 или 7 или 8 и не более чем приблизительно 9 мМ. В еще одном варианте, общий фосфат находится в концентрации в средах от приблизительно 1 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 2 мМ до приблизительно 8 мМ; от приблизительно 3 мМ до приблизительно 7 мМ; от приблизительно 4 мМ до приблизительно 6 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 8 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 7 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 6 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 5 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 4 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 3 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 2 мМ; от приблизительно 2 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 3 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 4 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 5 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 6 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 7 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 8 мМ до приблизительно 9 мМ; приблизительно любой из 9 или 8 или 7 или 6 или 5 или 4 или 3 или 2 или 1 мМ; по меньшей мере приблизительно любой из 1 или 2 или 3 или 4 или 5 или 6 или 7 или 8 и не более чем приблизительно 9 мМ во время фазы выработки полипептида клеточной культуры. В любых из аспектов изобретения, общее количество фосфата в средах ограничено менее, чем до приблизительно 10 мМ во время HTST-обработки перед фазой выработки полипептида клеточной культуры. В дополнительных аспектах изобретения, общее количество фосфата в средах затем повышают до уровня, достаточного для выработки полипептида во время фазы выработки полипептида клеточной культуры. В некоторых аспектах клеточная культуральная среда не содержит кальция.

[0069] В одном варианте, клеточная культуральная среда содержит 1 или 2 или каждый из компонентов (a) и (b) в концентрациях, приводимых в данном описании, содержащих ограничение общего количества (a) или (b), или (a) и (b) до менее, чем приблизительно 10 мМ. Должно быть понятно, что клеточная культуральная среда может содержать комбинацию компонентов (a) и (b) в любом из диапазонов концентраций, предоставленных в данном описании, такой же, как если бы каждая в отдельности концентрация была перечислена конкретно и индивидуально. Например, должно быть понятно, что среда в одном варианте содержит компоненты (a) и (b), в которых кальций составляет приблизительно 0,5 мМ, а фосфат составляет от приблизительно 2,5 мМ. В некоторых аспектах, клеточной культуральной средой является клеточная культуральная среда определенного химического состава. В других аспектах, клеточной культуральной средой является клеточная культуральная среда неопределенного химического состава. В любых из аспектов, клеточная культуральная среда используется для инактивации вирусов во время HTST-обработки. В любом аспекте, среда не содержит кальций во время HTST-обработки. В дополнительном аспекте, кальций добавляют в клеточные культуральные среды после HTST-обработки. В любом аспекте, среда не содержит фосфат во время HTST-обработки. В дополнительном аспекте, фосфат добавляют в клеточные культуральные среды после HTST-обработки.

[0070] В одном варианте, средой является клеточная культуральная среда, содержащая концентрацию фосфата от приблизительно 0 мМ до приблизительно 1 мМ, и концентрацию кальция от приблизительно 0,5 мМ до приблизительно 3 мМ. В еще одном варианте, концентрация фосфата составляет от приблизительно 1 мМ до приблизительно 1,25 мМ, а концентрация кальция составляет от приблизительно 0 мМ до приблизительно 2,5 мМ. В дополнительном варианте, концентрация фосфата составляет от приблизительно 1,25 мМ до приблизительно 1,5 мМ, а концентрация кальция составляет от приблизительно 0 мМ до приблизительно 2,25 мМ. В еще одном варианте, концентрация фосфата составляет от приблизительно 1,5 мМ до приблизительно 1,75 мМ, а концентрация кальция составляет от приблизительно 0 мМ до приблизительно 2 мМ. В одном варианте, концентрация фосфата составляет от приблизительно 1,75 мМ до приблизительно 2 мМ, а концентрация кальция составляет от приблизительно 0 мМ до приблизительно 1,75 мМ. В еще одном варианте, концентрация фосфата составляет от приблизительно 2 мМ до приблизительно 2,25 мМ, а концентрация кальция составляет от приблизительно 0 мМ до приблизительно 1,5 мМ. В дополнительном варианте, концентрация фосфата составляет от приблизительно 2 мМ до приблизительно 2,25 мМ, а концентрация кальция составляет от приблизительно 0 мМ до приблизительно 1,5 мМ. В еще одном варианте, концентрация фосфата составляет от приблизительно 2,25 мМ до приблизительно 2,5 мМ, а концентрация кальция составляет от приблизительно 0 мМ до приблизительно 1,25 мМ. В еще одном варианте, концентрация фосфата составляет от приблизительно 2,5 мМ до приблизительно 2,75 мМ, а концентрация кальция составляет от приблизительно 0 мМ до приблизительно 1,15 мМ. В еще одном варианте, концентрация фосфата составляет от приблизительно 2,75 мМ до приблизительно 3 мМ, а концентрация кальция составляет от приблизительно 0 мМ до приблизительно 1 мМ. В дополнительном варианте, концентрация фосфата составляет от приблизительно 3 мМ до приблизительно 3,5 мМ, а концентрация кальция составляет от приблизительно 0 мМ до приблизительно 0,8 мМ. В еще одном дополнительном варианте, концентрация фосфата составляет от приблизительно 3,5 мМ до приблизительно 4,5 мМ, а концентрация кальция составляет от приблизительно 0 мМ до приблизительно 0,6 мМ. В одном варианте, концентрация фосфата составляет от приблизительно 4,5 мМ до приблизительно 5 мМ, а концентрация кальция составляет от приблизительно 0 мМ до приблизительно 0,5 мМ. В еще одном варианте, концентрация фосфата составляет от приблизительно 5 мМ до приблизительно 5,5 мМ, а концентрация кальция составляет от приблизительно 0 мМ до приблизительно 0,25 мМ. В дополнительном варианте, концентрация фосфата составляет от приблизительно 5,5 мМ до приблизительно 6 мМ, а концентрация кальция составляет от приблизительно 0 мМ до приблизительно 0,1 мМ. В еще одном аспекте, параметры pH, кальция и фосфата можно независимо регулировать, как показано на иллюстративной Фигуре 5 (такой как Фигура 5B, Фигура 5C и Фигура 5D), таким образом, что мутность (в виде непрямого измерения преципитации на основе фосфата кальция) остается в области сетки (где область сетки представляет значения мутности на или ниже серьезного нарушения порогового значения мутности, составляющего в данном примере 5 НЕФ) и избегает диапазонов преципитации, которые показаны в области без сетки (где области без сетки представляют реакцию мутности выше серьезного нарушения порогового значения мутности, составляющего 5 НЕФ). Характеристическая поверхность, изображенная на фигуре 5, показывает многофакторное влияние pH, концентраций кальция и концентраций фосфата на мутность (в виде непрямого измерения преципитации на основе фосфата кальция). Вследствие этого, характеристическая поверхность демонстрирует, как факторы можно регулировать в комбинации, а не только в виде одного фактора зараз для нахождения приемлемой HTST-обработки, управляя заданными величинами для pH в комбинации с приемлемыми концентрациями кальция и фосфата в средах, подлежащих обработке.

[0071] Еще одним независимым параметром (в дополнение к кальцию и фосфату в качестве других независимых параметров), который можно регулировать, является pH. В связи с этим, pH можно регулировать, когда среда содержит кальций и фосфат. В некоторых вариантах осуществления, pH регулируют до подходяще низкого уровня при подготовке среды перед HTST-обработкой. В некоторых вариантах осуществления, pH регулируют за счет понижения до подходящего уровня. В некоторых вариантах осуществления, pH регулируют до менее, чем приблизительно 7,2. В некоторых вариантах осуществления, pH регулируют до приблизительно 5,0-7,2. В некоторых вариантах осуществления, pH дополнительно регулируют вслед за HTST-обработкой до уровня, подходящего для клеточной культуры. В некоторых вариантах осуществления, pH регулируют до приблизительно 6,9-7,2. Синхронизация между HTST-обработкой и регулировкой уровней pH вслед за HTST до уровня, подходящего для клеточной культуры, может изменяться. В пределах объема правовых притязаний изобретения предусматривается протекание времени порядка секунд, минут, дней, недель, месяцев или лет.

[0072] В других аспектах, предоставлена клеточная культуральная среда, содержащая pH между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 7,2. В одном аспекте, предоставлена клеточная культуральная среда, содержащая pH между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9. В некоторых аспектах, клеточной культуральной средой является клеточная культуральная среда определенного химического состава. В других аспектах, клеточной культуральной средой является клеточная культуральная среда неопределенного химического состава. В любом из аспектов, клеточная культуральная среда используется для инактивации вирусов во время HTST-обработки. В любом из аспектов, во время HTST-обработки pH среды находится между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 7,2. Это может быть перед фазой выработки полипептида клеточной культуры. Необязательно, квалифицированный специалист в данной области может регулировать pH среды после HTST-обработки таким образом, что среда имеет pH, который подходит для процессов культивирования клеток. В любом из аспектов, pH среды понижают до между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9 во время HTST-обработки перед фазой выработки полипептида клеточной культуры. В дополнительных аспектах, pH среды затем доводят до между pH приблизительно 6,9 и pH приблизительно 7,2 для фазы выработки полипептида клеточной культуры. В одном аспекте, pH среды затем доводят до между pH приблизительно 6,9 и pH приблизительно 7,2 после HTST-обработки для фазы выработки полипептида клеточной культуры.

[0073] В одном варианте, средой является клеточная культуральная среда, содержащая pH между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 7,2. В еще одном варианте, средой является клеточная культуральная среда, содержащая pH между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9. В еще одном варианте, pH среды составляет pH от приблизительно 5,0 до приблизительно 7,2; от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,9; от приблизительно 5,2 до приблизительно 6,7; от приблизительно 5,4 до приблизительно 6,5; от приблизительно 5,6 до приблизительно 6,3; от приблизительно 5,8 до приблизительно 6,1; от приблизительно 5,9 до приблизительно 6,0; от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,7; от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,5; от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,3; от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,1; от приблизительно 5,0 до приблизительно 5,9; от приблизительно 5,0 до приблизительно 5,7; от приблизительно 5,0 до приблизительно 5,5; от приблизительно 5,0 до приблизительно 5,3; от приблизительно 5,0 до приблизительно 5,1; от приблизительно 5,2 до приблизительно 6,9; от приблизительно 5,4 до приблизительно 6,9; от приблизительно 5,6 до приблизительно 6,9; от приблизительно 5,8 до приблизительно 6,9; от приблизительно 6,0 до приблизительно 6,9; от приблизительно 6,0 до приблизительно 6,9; от приблизительно 6,2 до приблизительно 6,9; от приблизительно 6,4 до приблизительно 6,9; от приблизительно 6,6 до приблизительно 6,9; приблизительно любой из 5,0 или 5,2 или 5,4 или 5,6 или 5,8 или 6,0 или 6,2 или 6,4 или 6,6 или 6,8 или 6,9; по меньшей мере приблизительно любой из 5,0 или 5,2 или 5,4 или 5,6 или 5,8 или 6,0 или 6,2 или 6,4 или 6,6 или 6,8 и не более чем приблизительно 6,9. В одном варианте, средой является клеточная культуральная среда, содержащая pH между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 7,2. В еще одном варианте, pH среды составляет pH от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,9; от приблизительно 5,2 до приблизительно 6,7; от приблизительно 5,4 до приблизительно 6,5; от приблизительно 5,6 до приблизительно 6,3; от приблизительно 5,8 до приблизительно 6,1; от приблизительно 5,9 до приблизительно 6,0; от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,7; от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,5; от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,3; от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,1; от приблизительно 5,0 до приблизительно 5,9; от приблизительно 5,0 до приблизительно 5,7; от приблизительно 5,0 до приблизительно 5,5; от приблизительно 5,0 до приблизительно 5,3; от приблизительно 5,0 до приблизительно 5,1; от приблизительно 5,2 до приблизительно 6,9; от приблизительно 5,4 до приблизительно 6,9; от приблизительно 5,6 до приблизительно 6,9; от приблизительно 5,8 до приблизительно 6,9; от приблизительно 6,0 до приблизительно 6,9; от приблизительно 6,0 до приблизительно 6,9; от приблизительно 6,2 до приблизительно 6,9; от приблизительно 6,4 до приблизительно 6,9; от приблизительно 6,6 до приблизительно 6,9; приблизительно любой из 5,0 или 5,2 или 5,4 или 5,6 или 5,8 или 6,0 или 6,2 или 6,4 или 6,6 или 6,8 или 6,9; по меньшей мере приблизительно любой из 5,0 или 5,2 или 5,4 или 5,6 или 5,8 или 6,0 или 6,2 или 6,4 или 6,6 или 6,8 и не более чем приблизительно 6,9 во время HTST-обработки перед фазой выработки полипептида клеточной культуры. В любом из аспектов, во время HTST-обработки pH среды находится между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 7,2. Это может быть перед фазой выработки полипептида клеточной культуры. После HTST-обработки среду можно по необходимости регулировать до подходящего pH для процессов культивирования клеток. В любом из аспектов, pH среды понижают до между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9 во время HTST-обработки перед фазой выработки полипептида клеточной культуры. В любом из аспектов, pH среды находится между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9 во время HTST-обработки перед фазой выработки полипептида клеточной культуры.

[0074] В одном варианте, средой является клеточная культуральная среда, содержащая pH между pH приблизительно 6,9 и pH приблизительно 7,2. В еще одном варианте, pH среды составляет pH от приблизительно 6,9 до приблизительно 7,2; от приблизительно 7,0 до приблизительно 7,1; от приблизительно 6,9 до приблизительно 7,1; от приблизительно 6,9 до приблизительно 7,0; от приблизительно 7,0 до приблизительно 7,2; от приблизительно 7,1 до приблизительно 7,2; приблизительно любой из 6,9 или 7,0 или 7,1 или 7,2; по меньшей мере приблизительно любой из 6,9 или 7,0 или 7,1 и не более чем приблизительно 7,2. В одном варианте, средой является клеточная культуральная среда, содержащая pH между pH приблизительно 6,9 и pH приблизительно 7,2. В еще одном варианте, pH среды составляет pH от приблизительно 6,9 до приблизительно 7,2; от приблизительно 7,0 до приблизительно 7,1; от приблизительно 6,9 до приблизительно 7,1; от приблизительно 6,9 до приблизительно 7,0; от приблизительно 7,0 до приблизительно 7,2; от приблизительно 7,1 до приблизительно 7,2; приблизительно любой из 6,9 или 7,0 или 7,1 или 7,2; по меньшей мере приблизительно любой из 6,9 или 7,0 или 7,1 и не более чем приблизительно 7,2 для фазы выработки полипептида клеточной культуры. В любом из аспектов, pH среды доводят до между pH приблизительно 6,9 и pH приблизительно 7,2 для фазы выработки полипептида клеточной культуры. В любом из аспектов, pH среды доводят до между pH приблизительно 6,9 и pH приблизительно 7,2 после HTST-обработки для фазы выработки полипептида клеточной культуры. В любом из аспектов, pH среды находится между pH приблизительно 6,9 и pH приблизительно 7,2 после HTST-обработки для фазы выработки полипептида клеточной культуры.

[0075] В одном варианте, средой является клеточная культуральная среда, содержащая pH между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9 и общее количество фосфата и кальция менее, чем приблизительно 10 мМ. В одном варианте, средой является клеточная культуральная среда, содержащая pH H между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9 и общее количество фосфата и кальция менее, чем приблизительно 10 мМ во время HTST-обработки. В любом варианте, pH и количеством кальция и фосфата является любое количество, подробно описанное в данном документе. В любом аспекте, среда не содержит кальций во время HTST-обработки. В дополнительном аспекте, кальций добавляют в клеточные культуральные среды после HTST-обработки. В любом аспекте, среда не содержит фосфат во время HTST-обработки. В дополнительном аспекте, фосфат добавляют в клеточные культуральные среды после HTST-обработки. В дополнительном аспекте, pH среды доводят до между pH приблизительно 6,9 и pH приблизительно 7,2 для фазы выработки полипептида клеточной культуры. В любом из аспектов, pH среды доводят до между pH приблизительно 6,9 и pH приблизительно 7,2 после HTST-обработки для фазы выработки полипептида клеточной культуры.

[0076] В одном варианте, средой является клеточная культуральная среда, содержащая концентрацию фосфата от приблизительно 0 мМ до приблизительно 0,5 мМ, и pH от приблизительно 6,4 до приблизительно 7,4. В еще одном варианте, концентрация фосфата составляет от приблизительно 0,5 мМ до приблизительно 0,75 мМ, а pH составляет от приблизительно 6,4 до приблизительно 7,35. В дополнительном варианте, концентрация фосфата составляет от приблизительно 0,75 мМ до приблизительно 1 мМ, а pH составляет от приблизительно 6,4 до приблизительно 7,25. В еще одном варианте, концентрация фосфата составляет от приблизительно 1 мМ до приблизительно 1,25 мМ, а pH составляет от приблизительно 6,4 до приблизительно 7,2. В одном варианте, концентрация фосфата составляет от приблизительно 1,25 мМ до приблизительно 1,5 мМ, а pH составляет от приблизительно 6,4 до приблизительно 7,1. В еще одном варианте, концентрация фосфата составляет от приблизительно 1,5 мМ до приблизительно 1,75 мМ, а pH составляет от приблизительно 6,4 до приблизительно 7,05. В дополнительном варианте, концентрация фосфата составляет от приблизительно 1,75 мМ до приблизительно 2 мМ, а pH составляет от приблизительно 6,4 до приблизительно 7. В еще одном варианте, концентрация фосфата составляет от приблизительно 2 мМ до приблизительно 2,25 мМ, а pH составляет от приблизительно 6,4 до приблизительно 6,9. В одном варианте, концентрация фосфата составляет от приблизительно 2,25 мМ до приблизительно 2,5 мМ, а pH составляет от приблизительно 6,4 до приблизительно 6,85. В еще одном варианте, концентрация фосфата составляет от приблизительно 2,5 мМ до приблизительно 2,75 мМ, а pH составляет от приблизительно 6,4 до приблизительно 6,75. В дополнительном варианте, концентрация фосфата составляет от приблизительно 2,75 мМ до приблизительно 3 мМ, а pH составляет от приблизительно 6,4 до приблизительно 6,7. В еще одном дополнительном варианте, концентрация фосфата составляет от приблизительно 3 мМ до приблизительно 3,25 мМ, а pH составляет от приблизительно 6,4 до приблизительно 6,6. В одном варианте, концентрация фосфата составляет от приблизительно 3,25 мМ до приблизительно 3,5 мМ, а pH составляет от приблизительно 6,4 до приблизительно 6,5. В еще одном варианте, концентрация фосфата составляет от приблизительно 3,5 мМ до приблизительно 3,75 мМ, а pH составляет от приблизительно 6,4 до приблизительно 6,45.

[0077] В одном варианте, концентрация кальция составляет от приблизительно 0 мМ до приблизительно 1 мМ, а pH составляет от приблизительно 6,65 до приблизительно 7,4. В еще одном варианте, концентрация кальция составляет от приблизительно 0,1 мМ до приблизительно 0,25 мМ, а pH составляет от приблизительно 6,55 до приблизительно 7,4. В дополнительном варианте, концентрация кальция составляет от приблизительно 0,25 мМ до приблизительно 0,5 мМ, а pH составляет от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,4. В еще одном варианте, концентрация кальция составляет от приблизительно 0,5 мМ до приблизительно 0,6 мМ, а pH составляет от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,2. В одном варианте, концентрация кальция составляет от приблизительно 0,6 мМ до приблизительно 0,75 мМ, а pH составляет от приблизительно 6,5 до приблизительно 7. В еще одном варианте, концентрация кальция составляет от приблизительно 0,75 мМ до приблизительно 1 мМ, а pH составляет от приблизительно 6,4 до приблизительно 6,9. В дополнительном варианте, концентрация кальция составляет от приблизительно 1 мМ до приблизительно 1,1 мМ, а pH составляет от приблизительно 6,4 до приблизительно 6,8. В еще одном дополнительном варианте, концентрация кальция составляет от приблизительно 1,1 мМ до приблизительно 1,25 мМ, а pH составляет от приблизительно 6,4 до приблизительно 6,7. В одном варианте, концентрация кальция составляет от приблизительно 1,25 мМ до приблизительно 1,5 мМ, а pH составляет от приблизительно 6,4 до приблизительно 6,65. В еще одном варианте, концентрация кальция составляет от приблизительно 1,5 мМ до приблизительно 1,75 мМ, а pH составляет от приблизительно 6,4 до приблизительно 6,55. В дополнительном варианте, концентрация кальция составляет от приблизительно 1,75 мМ до приблизительно 2 мМ, а pH составляет от приблизительно 6,4 до приблизительно 6,5. В одном варианте, концентрация кальция составляет от приблизительно 2 мМ до приблизительно 2,25 мМ, а pH составляет от приблизительно 6,4 до приблизительно 6,45. В еще одном варианте, концентрация кальция составляет от приблизительно 2,25 мМ до приблизительно 2,5 мМ, а pH составляет от приблизительно 6,4 до приблизительно 6,43. В дополнительном варианте, концентрация кальция составляет от приблизительно 2,5 мМ до приблизительно 2,6 мМ, а pH составляет от приблизительно 6,4 до приблизительно 6,41.

[0078] Индивидуальные компоненты среды могут иметься в количествах, которые приводят к одному или более предпочтительных свойств, таких как инактивация вирусов, уменьшение образования преципитата и уменьшение загрязнения оборудования, используемого для HTST-обработки. В одном варианте, клеточная культуральная среда, которая предоставлена в данном описании, содержит параметры среды, как описано в таблице 1. Должно быть понятно, что состав среды может содержать любые один или более компонентов среды таблицы 1 (например, любые один или более компонентов (a)-(c), например, состав среды, содержащий каждый из компонентов (a), (b) и (c), или состав среды, содержащий каждый из компонентов (a), (b) и (d), или состав среды, содержащий компоненты (a) и (b), или состав среды, содержащий каждый из компонентов (a) и (c), или состав среды, содержащий каждый из компонентов (b) и (c), или состав среды, содержащий каждый из компонентов (a) и (d), или состав среды, содержащий каждый из компонентов (b) и (d) в любых из количеств, перечисленных в таблице 1, такой же, как если бы каждая в отдельности комбинация компонентов и количеств была перечислена конкретно и индивидуально. В некоторых аспектах, клеточной культуральной средой является клеточная культуральная среда определенного химического состава. В других аспектах, клеточной культуральной средой является клеточная культуральная среда неопределенного химического состава. В любом из аспектов, клеточная культуральная среда используется для инактивации вирусов во время HTST-обработки. В любом аспекте, среда не содержит кальций во время HTST-обработки. В дополнительном аспекте, кальций добавляют в клеточные культуральные среды после HTST-обработки. В любом аспекте, среда не содержит фосфат во время HTST-обработки. В дополнительном аспекте, фосфат добавляют в клеточные культуральные среды после HTST-обработки. В дополнительном аспекте, pH среды доводят до между pH приблизительно 6,9 и pH приблизительно 7,2 для фазы выработки полипептида клеточной культуры. В любом из аспектов, pH среды доводят до между pH приблизительно 6,9 и pH H приблизительно 7,2 после HTST-обработки для фазы выработки полипептида клеточной культуры.

Таблица 1
Иллюстративные уровни компонентов или параметров среды
Компоненты или параметры среды Уровень компонента или параметра среды
(а) кальций от приблизительно 1 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 2 мМ до приблизительно 8 мМ; от приблизительно 3 мМ до приблизительно 7 мМ; от приблизительно 4 мМ до приблизительно 6 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 8 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 7 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 6 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 5 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 4 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 3 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 2 мМ; от приблизительно 2 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 3 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 4 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 5 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 6 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 7 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 8 мМ до приблизительно 9 мМ; приблизительно любой из 9 или 8 или 7 или 6 или 5 или 4 или 3 или 2 или 1 мМ; по меньшей мере приблизительно любой из 1 или 2 или 3 или 4 или 5 или 6 или 7 или 8 и не более чем приблизительно 9 мМ.
(b) фосфат от приблизительно 1 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 2 мМ до приблизительно 8 мМ; от приблизительно 3 мМ до приблизительно 7 мМ; от приблизительно 4 мМ до приблизительно 6 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 8 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 7 мМ;

от приблизительно 1 мМ до приблизительно 6 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 5 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 4 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 3 мМ; от приблизительно 1 мМ до приблизительно 2 мМ; от приблизительно 2 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 3 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 4 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 5 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 6 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 7 мМ до приблизительно 9 мМ; от приблизительно 8 мМ до приблизительно 9 мМ; приблизительно любой из 9 или 8 или 7 или 6 или 5 или 4 или 3 или 2 или 1 мМ; по меньшей мере приблизительно любой из 1 или 2 или 3 или 4 или 5 или 6 или 7 или 8 и не более чем приблизительно 9 мМ.
(с) pH (перед фазой выработки полипептида) от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,9; от приблизительно 5,2 до приблизительно 6,7; от приблизительно 5,4 до приблизительно 6,5; от приблизительно 5,6 до приблизительно 6,3; от приблизительно 5,8 до приблизительно 6,1; от приблизительно 5,9 до приблизительно 6,0; от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,7; от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,5; от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,3; от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,1; от приблизительно 5,0 до приблизительно 5,9; от приблизительно 5,0 до приблизительно 5,7; от приблизительно 5,0 до приблизительно 5,5; от приблизительно 5,0 до приблизительно 5,3; от приблизительно 5,0 до приблизительно 5,1; от приблизительно 5,2 до приблизительно 6,9; от приблизительно 5,4 до приблизительно 6,9; от приблизительно 5,6 до приблизительно 6,9; от

приблизительно 5,8 до приблизительно 6,9; от приблизительно 6,0 до приблизительно 6,9; от приблизительно 6,0 до приблизительно 6,9; от приблизительно 6,2 до приблизительно 6,9; от приблизительно 6,4 до приблизительно 6,9; от приблизительно 6,6 до приблизительно 6,9; приблизительно любой из 5,0 или 5,2 или 5,4 или 5,6 или 5,8 или 6,0 или 6,2 или 6,4 или 6,6 или 6,8 или 6,9; по меньшей мере приблизительно любой из 5,0 или 5,2 или 5,4 или 5,6 или 5,8 или 6,0 или 6,2 или 6,4 или 6,6 или 6,8 и не более чем приблизительно 6,9; от приблизительно 5,0 до приблизительно 7,2; от приблизительно 5,2 до приблизительно 6,9; от приблизительно 5,4 до приблизительно 6,6; от приблизительно 5,6 до приблизительно 6,3; от приблизительно 5,8 до приблизительно 6,0; от приблизительно 5,2 до приблизительно 7,2; от приблизительно 5,4 до приблизительно 7,2; от приблизительно 5,6 до приблизительно 7,2; от приблизительно 5,8 до приблизительно 7,2; от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,2; от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,2; от приблизительно 6,2 до приблизительно 7,2; от приблизительно 6,4 до приблизительно 7,2; от приблизительно 6,6 до приблизительно 7,2; приблизительно любой из 5,0 или 5,2 или 5,4 или 5,6 или 5,8 или 6,0 или 6,2 или 6,4 или 6,6 или 6,8 или 6,9 или 7,0 или 7,1 или 7,2; по меньшей мере приблизительно любой из 5,0 или 5,2 или 5,4 или 5,6 или 5,8 или 6,0 или 6,2 или 6,4 или 6,6 или 6,8 или 7,0 и не более чем приблизительно 7,2.

(d) pH (для фазы выработки полипептида от приблизительно 6,9 до приблизительно 7,2; от приблизительно 7,0 до приблизительно 7,1; от приблизительно полипептид 6,9 до приблизительно 7,1; от приблизительно 6,9 до приблизительно 7,0; от приблизительно 7,0 до приблизительно производство 7,2; от приблизительно 7,1 до приблизительно 7,2; приблизительно любой из 6,9 или 7,0 или 7,1 или 7,2; фаза) по меньшей мере приблизительно любой из 6,9 или 7,0 или 7,1 и не более чем приблизительно 7,2.

[0079] Среда, предоставленная в данном описании в одном варианте, содержит кальций и фосфат. В одном варианте, средой, содержащей кальций и фосфат, является подаваемая среда. В еще одном варианте, средой, содержащей кальций и фосфат, является базовая среда. В некоторых аспектах, подаваемой средой является продуцирующая среда. В некоторых аспектах, клеточной культуральной средой является клеточная культуральная среда определенного химического состава. В других аспектах, клеточной культуральной средой является клеточная культуральная среда неопределенного химического состава. В любом из аспектов, клеточная культуральная среда используется для инактивации вирусов во время HTST-обработки. В любом из аспектов, общее количество фосфата и кальция в средах во время HTST-обработки перед фазой выработки полипептида клеточной культуры ограничено менее, чем приблизительно 10 мМ. В любом из аспектов, общее количество фосфата и кальция в средах повышают до уровня, достаточного для экспрессии белка во время фазы выработки полипептида клеточной культуры. В любом из аспектов, во время HTST-обработки pH среды находится между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9. В любом из аспектов, pH среды понижают до между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9 во время HTST-обработки перед фазой выработки полипептида клеточной культуры. В дополнительных аспектах, pH среды затем доводят до между pH приблизительно 6,9 и pH приблизительно 7,2 для фазы выработки полипептида клеточной культуры. В одном аспекте, pH среды затем доводят до между pH приблизительно 6,9 и pH приблизительно 7,2 после HTST-обработки для фазы выработки полипептида клеточной культуры.

[0080] Среда, предоставленная в данном описании в одном варианте, содержит клеточные культуральные среды, при этом среда имеет pH между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9. В одном варианте, средой, содержащей кальций и фосфат, является подаваемая среда. В еще одном варианте, средой, содержащей кальций и фосфат, является базовая среда. В некоторых аспектах, клеточной культуральной средой является клеточная культуральная среда определенного химического состава. В других аспектах, клеточной культуральной средой является клеточная культуральная среда неопределенного химического состава. В любом из аспектов, клеточная культуральная среда используется для инактивации вирусов во время HTST-обработки. В любом из аспектов, клеточная культуральная среда используется для инактивации вирусов во время HTST-обработки. В любом из аспектов, pH среды понижают до между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9 во время HTST-обработки перед фазой выработки полипептида клеточной культуры. В дополнительных аспектах, pH среды затем доводят до между pH приблизительно 6,9 и pH приблизительно 7,2 для фазы выработки полипептида клеточной культуры. В дополнительных аспектах, pH среды затем доводят до между pH приблизительно 6,9 и pH приблизительно 7,2 после HTST-обработки для фазы выработки полипептида клеточной культуры. В любом из аспектов, общее количество фосфата и кальция в средах ограничено менее, чем приблизительно 10 мМ во время HTST-обработки. В любом из аспектов, общее количество фосфата и кальция в средах во время HTST-обработки перед фазой выработки полипептида клеточной культуры ограничено менее, чем приблизительно 10 мМ. В любом из аспектов, общее количество фосфата и кальция в средах повышают до уровня, достаточного для выработки полипептида во время фазы выработки полипептида клеточной культуры.

[0081] В варианте, изобретение предоставляет среду, при этом компоненты клеточной среды регулируют, используя характеристическая поверхность, как подробно изложено в примере 2. В еще одном варианте, изобретение предоставляет среду, при этом компоненты клеточной среды регулируют, используя характеристическая поверхность на фигуре 5 и Фигуре 6.

[0082] В варианте, изобретение предоставляет среду, при этом после того, как среду подвергают HTST-обработке, в среду добавляют металлы, содержащиеся в следовых количествах. В одном аспекте, металлом, содержащимся в следовых количествах, является по меньшей мере один или более металл, содержащийся в следовых количествах, выбранный из группы, состоящей из железа или меди. В варианте, изобретение предоставляет среду, при этом после того, как среду подвергают HTST-обработке, в среду добавляют железо в количестве между от приблизительно 1 мкм до приблизительно 125 мкм. В еще одном варианте, в среде железо находится в концентрации от приблизительно 1 мкм до приблизительно 125 мкм; от приблизительно 10 мкм до приблизительно 120 мкм; от приблизительно 20 мкм до приблизительно 110 мкм; от приблизительно 30 мкм до приблизительно 100 мкм; от приблизительно 40 мкм до приблизительно 90 мкм; от приблизительно 50 мкм до приблизительно 80 мкм; от приблизительно 60 мкм до приблизительно 70 мкм; от 1 мкм до приблизительно 120 мкм; от 1 мкм до приблизительно 110 мкм; от 1 мкм до приблизительно 100 мкм; от 1 мкм до приблизительно 90 мкм; от 1 мкм до приблизительно 80 мкм; от 1 мкм до приблизительно 70 мкм; от 1 мкм до приблизительно 60 мкм; от 1 мкм до приблизительно 50 мкм; от 1 мкм до приблизительно 40 мкм; от 1 мкм до приблизительно 30 мкм; от 1 мкм до приблизительно 20 мкм; от 1 мкм до приблизительно 10 мкм; от 10 мкм до приблизительно 125 мкм; от 20 мкм до приблизительно 125 мкм; от 30 мкм до приблизительно 125 мкм; от 40 мкм до приблизительно 125 мкм; от 50 мкм до приблизительно 125 мкм; от 60 мкм до приблизительно 125 мкм; от 70 мкм до приблизительно 125 мкм; от 80 мкм до приблизительно 125 мкм; от 90 мкм до приблизительно 125 мкм; от 100 мкм до приблизительно 125 мкм; от 110 мкм до приблизительно 125 мкм; от 120 мкм до приблизительно 125 мкм; приблизительно любой из 1 или 10 или 20 или 30 или 40 или 50 или 60 или 70 или 80 или 90 или 100 или 110 или 120 или 125 мкм; по меньшей мере приблизительно любой из 1 или 10 или 20 или 30 или 40 или 50 или 60 или 70 или 80 или 90 или 100 или 110 или 120 и не более чем приблизительно 125 мкм после того, как среду подвергают HTST-обработке.

[0083] Среда, предоставленная в данном описании, в одном аспекте приводит к одному или более благоприятных свойств при использовании в способе инактивации вирусов во время HTST-обработки по сравнению со свойствами, когда для инактивации вирусов во время HTST-обработки используется иная среда. Образование преципитата в клеточной культуральной среде, подвергнутой HTST-обработке для инактивации вирусов для выработки биологического лекарственного продукта (например, продукта антитела) может влиять на качественные свойства биологического лекарственного продукта, такие как активность биологического лекарственного продукта. В дополнение, образование преципитата в клеточной культуральной среде во время HTST-обработки может вызывать загрязнение HTST оборудования. Загрязнение HTST оборудования может влиять на способность HTST-обработки эффективно инактивировать вирусы. В одном аспекте, загрязнение включает преципитацию на оборудовании, используемом для HTST-обработки. В одном варианте, среда, которая предоставлена в данном описании, уменьшает преципитацию в клеточной культуральной среде при использовании в способе инактивации вирусов в клеточной культуре во время HTST-обработки по сравнению с преципитацией в иной среде, используемой для инактивации вирусов во время HTST-обработки. В еще одном варианте, среда, которая предоставлена в данном описании, уменьшает загрязнение HTST оборудования при использовании в способе инактивации вирусов во время HTST-обработки по сравнению с загрязнением HTST оборудования иными средами, используемыми для инактивации вирусов во время HTST-обработки. В еще одном варианте, среда, которая предоставлена в данном описании, уменьшает преципитат на оборудовании, используемом для HTST-обработки при использовании в способе инактивации вирусов во время HTST-обработки среды по сравнению с преципитатом на оборудовании, используемом для HTST-обработки иных сред. В еще одном варианте, среда, которая предоставлена в данном описании, инактивирует вирус в клеточной культуральной среде при использовании в способе HTST-обработки среды по сравнению с инактивацией вирусов в иных средах. В еще одном варианте, среда, которая предоставлена в данном описании, уменьшает преципитацию, результатом которой является загрязнение фильтра в способе HTST-обработки среды по сравнению с инактивацией вирусов в иных средах.

[0084] Одно наблюдение состоит в том, что металлы, содержащиеся в следовых количествах, такие как медь и железо, которые могут быть важными для клеточной культуры (включая выработку полипептидов/белков, клеточный рост, выживание и/или пролиферацию) уменьшаются в ходе HTST-обработки. В связи с этим, изобретение также предусматривает способы инактивации вирусных или занесенных агентов в клеточной культуральной среде в то время, как среды сохраняют пригодность для культивирования клеток, при этом указанный способ включает (a) подвергание клеточных культуральных сред кратковременной высокотемпературной (HTST) обработке; и (b) регулирование одного или более параметров, выбранных из группы, состоящей из pH, уровня кальция и уровня фосфата, при этом существует дополнительная регулировка концентраций металлов, содержащихся в следовых количествах. Металлами, содержащимися в следовых количествах, могут быть железо или медь. Концентрации железа и/или меди в среде перед HTST-обработкой можно регулировать независимо. В некоторых случаях, если ожидается уменьшение концентрации железа и/или меди, и количество как правило известно, то железо и/или медь можно добавлять в среду перед HTST-обработкой. В других случаях, когда величина уменьшения не известна, тогда железо и/или медь может быть понижено (в том числе удалено) из среды перед HTST-обработкой. Затем железо и/или медь могут быть дополнены в среду вслед за HTST-обработкой до уровня, подходящего для клеточной культуры.

IV. Композиции и способы изобретения

[0085] Клеточные культуральные среды, подробно описанные в данном документе, могут использоваться в способе инактивации вирусов, инфекционных агентов и/или занесенных агентов в клеточной культуральной среде во время HTST-обработки. Среда может использоваться в способе культивирования клеток, культурой ли одного производственного цикла, подпитываемой ли культурой одного производственного цикла или перфузионной культурой. Среда может использоваться в способе культивирования клеток для получения полипептидов, включая антитела. Среда может использоваться в способе культивирования клеток для получения продуктов на основе клеток, включая продукты, используемые для вариантов применения с замещением ткани или генной терапией. Среда может использоваться в любом варианте применения клеточной культуры, в котором предотвращение потенциального вирусной контаминации получает пользу от использования тепловой обработки, которая инактивирует вирус, сохраняя в то же время среду способной к культивированию клеток. Среда может использоваться в способе инактивации вирусов, инфекционных агентов и/или занесенных агентов в клеточной культуральной среде, подвергнутой любым вариантам или вариантам осуществления тепловой обработки, описанной в данной заявке.

[0086] Предоставлены способы инактивации вирусов, инфекционных агентов и/или занесенных агентов в клеточной культуральной среде, которые подробно описаны в данном документе, в которых клеточные культуральные среды подвергают HTST-обработке. В одном варианте, способ включает подвергание клеточных культуральных сред HTST-обработке, при этом среда содержит один или более компонентов среды, которые описаны в таблице 1 (например, среда, содержащая компоненты (a) и (b), или среда, содержащая компоненты (a) и (c), или среда, содержащая компоненты (b) и (c), или среда, содержащая компоненты (a) и (d), или среда, содержащая компоненты (b) и (d), или среда, содержащая каждый из компонентов (a)-(c), или (a), (b) и (d) в любых из количеств, перечисленных в таблице 1).

[0087] Способы уменьшения загрязнения оборудования, используемого для HTST-обработки для инактивации вирусов, инфекционных агентов и/или занесенных агентов, в которых клеточные культуральные среды, которые подробно описаны в данном документе, используют в оборудовании и подвергают HTST-обработке. В одном варианте, способ включает подвергание клеточных культуральных сред HTST-обработке, при этом среда содержит один или более компонентов среды, которые описаны в таблице 1 (например, среда, содержащая компоненты (a) и (b), или среда, содержащая компоненты (a) и (c), или среда, содержащая компоненты (b) и (c), или среда, содержащая компоненты (a) и (d), или среда, содержащая компоненты (b) и (d), или среда, содержащая каждый из компонентов (a)-(c), или (a), (b) и (d) в любых из количеств, перечисленных в таблице 1). В конкретном варианте, загрязнением является загрязнение преципитатом. В одном варианте, загрязнением является загрязнение фильтра.

A. Способы инактивации вирусов и инактивации инфекционных агентов и/или занесенных агентов в клеточной культуральной среде

[0088] В некоторых вариантах, изобретение предоставляет способы инактивации вирусов, инфекционных агентов и/или занесенных агентов в клеточной культуральной среде, подвергнутой высокотемпературной обработке, при этом среда является совместимой с тепловой обработкой по сравнению с несовместимой средой. Например, тепловая обработка несовместимой среды дает осадок или приводит к преципитации при температурах, необходимых для эффективной инактивации вирусов, инфекционных агентов и/или занесенных агентов. Как обеспечивается в среде, раскрытой в данном описании, тепловая обработка совместимой среды не дает осадок или имеет пониженную преципитацию при температуре, необходимой для эффективной инактивации вирусов, инфекционных агентов и/или занесенных агентов. В некоторых аспектах, тепловой обработкой является HTST-обработка. В других аспектах, тепловой обработкой является тепловая обработка одного производственного цикла, включая, но без ограничения, обработку в песочной ванне и метод в масляной ванне.

[0089] В варианте, изобретение предоставляет способ инактивации вирусов в клеточной культуральной среде, включающий подвергание клеточных культуральных сред HTST-обработке, при этом среда во время HTST-обработки имеет pH между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9. В некоторых аспектах, во время HTST-обработки среда имеет pH между pH приблизительно 5,3 и pH приблизительно 6,3. В других аспектах, во время HTST-обработки среда имеет pH, равный приблизительно 6,0. В некоторых аспектах, во время HTST-обработки pH среды понижают до между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9 перед фазой выработки полипептида клеточной культуры. В дополнительном аспекте, затем pH среды доводят до между pH приблизительно 6,9 и pH приблизительно 7,2 для фазы выработки полипептида клеточной культуры. В одном аспекте, pH среды затем доводят до между pH приблизительно 6,9 и pH приблизительно 7,2 после HTST-обработки для фазы выработки полипептида клеточной культуры. В еще одном варианте, изобретение предоставляет способ инактивации вирусов в клеточной культуральной среде, включающий ограничение общего количества фосфата и кальция в среде во время HTST-обработки до менее, чем приблизительно 10 мМ. В дополнительном аспекте, во время HTST-обработки общую концентрацию фосфата и кальция в среде доводят до менее, чем приблизительно 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 мМ. В некоторых аспектах, общее количество фосфата и кальция в среде во время HTST-обработки перед фазой выработки полипептида клеточной культуры ограничено менее, чем приблизительно 10 мМ. В дополнительном аспекте, затем общее количество фосфата и кальция в среде повышают до уровня, достаточного для выработки полипептида во время фазы выработки полипептида клеточной культуры. В еще одном варианте, изобретение предоставляет способ инактивации вирусов в клеточной культуральной среде, включающий подвергание клеточных культуральных сред HTST-обработке, при этом среда имеет pH между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9 и включающий ограничение общего количества фосфата и кальция в среде во время HTST-обработки до менее, чем приблизительно 10 мМ. В некоторых аспектах, pH среды понижают до между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,0, а общее количество фосфата и кальция в среде во время HTST-обработки перед фазой выработки полипептида клеточной культуры ограничено менее, чем приблизительно 10 мМ. В дополнительном аспекте, pH среды затем доводят до между pH приблизительно 6,9 и pH приблизительно 7,2, а общее количество фосфата и кальция в среде повышают до уровня, достаточного для выработки полипептида во время фазы выработки полипептида клеточной культуры. Вирусом любого из способов, подробно описанных в данном документе, может быть любой вирус, подробно описанный в данном документе (например, парвовирус), а средой способа может быть любая среда, подробно описанная в данном документе, такая как среда, содержащая параметры среды, которые подробно изложены в таблице 1.

a) Температура и время выдержки температуры

[0090] В любом из способов, подробно описанных в данном документе, для инактивации вирусов в среде тепловая обработка включает повышение температуры среды по меньшей мере до приблизительно 85°C на протяжении достаточного количества времени. В дополнительном аспекте, для инактивации вирусов в среде температуру среды повышают по меньшей мере до приблизительно 90°C на протяжении достаточного количества времени. В дополнительном аспекте, температуру среды повышают по меньшей мере до приблизительно 93°C на протяжении продолжительности времени, достаточной для инактивации вирусов в среде. В еще одном дополнительном аспекте, температуру среды повышают по меньшей мере до приблизительно 95, 97, 99, 101, или 103 градуса по Цельсию на протяжении продолжительности времени, достаточной для инактивации вирусов в среде. В еще одном дополнительном аспекте, температуру среды повышают по меньшей мере до приблизительно 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115 или 117 градусов по Цельсию на протяжении продолжительности времени, достаточной для инактивации вирусов в среде. В еще одном дополнительном аспекте, температуру среды повышают по меньшей мере до приблизительно 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 100, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 или 120 градусов по Цельсию на протяжении продолжительности времени, достаточной для инактивации вирусов в среде. В еще одном дополнительном аспекте, температуру среды повышают по меньшей мере до приблизительно 121, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 или 150 градусов по Цельсию на протяжении продолжительности времени, достаточной для инактивации вирусов в среде. В некоторых аспектах, температуру среды повышают до приблизительно 95°C. В других аспектах, температуру среды повышают до приблизительно 102°C. В одном варианте, температуру среды повышают до между приблизительно 85°C и приблизительно 120°C на протяжении продолжительности времени, достаточной для инактивации вирусов в среде. В еще одном варианте, температуру среды повышают от приблизительно 85°C до приблизительно 120°C; от приблизительно 87°C до приблизительно 118°C; от приблизительно 89°C до приблизительно 116°C; от приблизительно 91°C до приблизительно 114°C; от приблизительно 93°C до приблизительно 112°C; от приблизительно 95°C до приблизительно 110°C; от приблизительно 97°C до приблизительно 108°C; от приблизительно 99°C до приблизительно 106°C; от приблизительно 101°C до приблизительно 104°C; от приблизительно 85°C до приблизительно 118°C; от приблизительно 85°C до приблизительно 116°C; от приблизительно 85°C до приблизительно 114°C; от приблизительно 85°C до приблизительно 112°C; от приблизительно 85°C до приблизительно 110°C; от приблизительно 85°C до приблизительно 108°C; от приблизительно 85°C до приблизительно 106°C; от приблизительно 85°C до приблизительно 104°C; от приблизительно 85°C до приблизительно 102°C; от приблизительно 85°C до приблизительно 100°C; от приблизительно 85°C до приблизительно 98°C; от приблизительно 85°C до приблизительно 96°C; от приблизительно 85°C до приблизительно 94°C; от приблизительно 85°C до приблизительно 92°C; от приблизительно 85°C до приблизительно 90°C; от приблизительно 85°C до приблизительно 88°C; от приблизительно 87°C до приблизительно 120°C; от приблизительно 89°C до приблизительно 120°C; от приблизительно 91°C до приблизительно 120°C; от приблизительно 93°C до приблизительно 120°C; от приблизительно 95°C до приблизительно 120°C; от приблизительно 97°C до приблизительно 120°C; от приблизительно 99°C до приблизительно 120°C; от приблизительно 101°C до приблизительно 120°C; от приблизительно 103°C до приблизительно 120°C; от приблизительно 105°C до приблизительно 120°C; от приблизительно 107°C до приблизительно 120°C; от приблизительно 109°C до приблизительно 120°C; от приблизительно 111°C до приблизительно 120°C; от приблизительно 113°C до приблизительно 120°C; от приблизительно 115°C до приблизительно 120°C; от приблизительно 117°C до приблизительно 120°C; приблизительно до любой из 85°C или 86°C или 88°C или 90°C или 92°C или 94°C или 96°C или 98°C или 100°C или 102°C или 104°C или 106°C или 108°C или 110°C или 112°C или 114°C или 116°C или 118°C или 120°C; по меньшей мере приблизительно до любой из 85°C или 86°C или 88°C или 90°C или 92°C или 94°C или 96°C или 98°C или 100°C или 102°C или 104°C или 106°C или 108°C или 110°C или 112°C или 114°C или 116°C или 118°C и не более чем приблизительно 120°C на протяжении продолжительности времени, достаточной для инактивации вирусов в среде. В любом из аспектов, температуру среды охлаждают до между приблизительно 15°C и приблизительно 40°C для выработки полипептида во время фазы выработки полипептида клеточной культуры.

[0091] Температуру тепловой обработки поддерживают в течение времени выдержки температуры для инактивации вирусов в среде. Временем выдержки температуры является количество времени, достаточное для инактивации вирусов. В любом аспекте, количество времени, достаточное для инактивации вирусов в среде, составляет по меньшей мере от приблизительно 1 секунды. В дополнительном аспекте, количество времени, достаточное для инактивации вирусов в среде, составляет по меньшей мере приблизительно до 2 секунд, 3 секунд или 4 секунд. В еще одном дополнительном аспекте, количество времени, достаточное для инактивации вирусов в среде, составляет по меньшей мере приблизительно до 5, 8, 10, 12, 14, 16, 18 или 20 секунд. В еще одном дополнительном аспекте, количество времени, достаточное для инактивации вирусов в среде, составляет по меньшей мере приблизительно до 5, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 или 60 секунд. В некоторых аспектах, количество времени, достаточное для инактивации вирусов в среде, составляет 10 секунд. В других аспектах, количество времени, достаточное для инактивации вирусов в среде, составляет 2 секунды. В еще одном варианте, количество времени, достаточное для инактивации вирусов в среде, составляет от приблизительно 1 до приблизительно 60 секунд; от приблизительно 2 до приблизительно 58 секунд; от приблизительно 6 до приблизительно 54 секунд; от приблизительно 10 до приблизительно 50 секунд; от приблизительно 14 до приблизительно 46 секунд; от приблизительно 18 до приблизительно 42 секунд; от приблизительно 22 до приблизительно 38 секунд; от приблизительно 26 до приблизительно 34 секунд; от приблизительно 30 до приблизительно 34 секунд; от приблизительно 1 до приблизительно 56 секунд; от приблизительно 1 до приблизительно 52 секунд; от приблизительно 1 до приблизительно 48 секунд; от приблизительно 1 до приблизительно 44 секунд; от приблизительно 1 до приблизительно 40 секунд; от приблизительно 1 до приблизительно 36 секунд; от приблизительно 1 до приблизительно 32 секунд; от приблизительно 1 до приблизительно 28 секунд; от приблизительно 1 до приблизительно 22 секунд; от приблизительно 1 до приблизительно 18 секунд; от приблизительно 1 до приблизительно 14 секунд; от приблизительно 1 до приблизительно 10 секунд; от приблизительно 1 до приблизительно 6 секунд; от приблизительно 1 до приблизительно 3 секунд; от приблизительно 4 до приблизительно 60 секунд; от приблизительно 8 до приблизительно 60 секунд; от приблизительно 12 до приблизительно 60 секунд; от приблизительно 16 до приблизительно 60 секунд; от приблизительно 20 до приблизительно 60 секунд; от приблизительно 24 до приблизительно 60 секунд; от приблизительно 28 до приблизительно 60 секунд; от приблизительно 32 до приблизительно 60 секунд; от приблизительно 36 до приблизительно 60 секунд; от приблизительно 40 до приблизительно 60 секунд; от приблизительно 44 до приблизительно 60 секунд; от приблизительно 48 до приблизительно 60 секунд; от приблизительно 52 до приблизительно 60 секунд; от приблизительно 56 до приблизительно 60 секунд; приблизительно любое из 1 или 2 или 4 или 6 или 8 или 10 или 12 или 14 или 16 или 18 или 20 или 22 или 24 или 26 или 28 или 30 или 32 или 34 или 36 или 38 или 40 или 42 или 44 или 46 или 48 или 50 или 52 или 54 или 56 или 58 или 60 секунд; по меньшей мере приблизительно любое из 1 или 2 или 4 или 6 или 8 или 10 или 12 или 14 или 16 или 18 или 20 или 22 или 24 или 26 или 28 или 30 или 32 или 34 или 36 или 38 или 40 или 42 или 44 или 46 или 48 или 50 или 52 или 54 или 56 или 58 и не более чем приблизительно 60 секунд. В других аспектах, количество времени, достаточное для инактивации вирусов в среде, составляет от по меньшей мере приблизительно 1 минуты. В дополнительном аспекте, количество времени, достаточное для инактивации вирусов в среде, составляет по меньшей мере приблизительно до 2,5 минут. В еще одном дополнительном аспекте, количество времени, достаточное для инактивации вирусов в среде, составляет по меньшей мере приблизительно до 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 10,5 или 11 минут. В еще одном варианте, количество времени, достаточное для инактивации вирусов в среде, составляет от приблизительно 1 до приблизительно 11 минут; 2 до приблизительно 10 минут; 4 до приблизительно 8 минут; от приблизительно 1 до приблизительно 10 минут; от приблизительно 1 до приблизительно 8 минут; от приблизительно 1 до приблизительно 6 минут; от приблизительно 1 до приблизительно 4 минут; от приблизительно 1 до приблизительно 2 минут; от приблизительно 2 до приблизительно 11 минут; от приблизительно 4 до приблизительно 11 минут; от приблизительно 6 до приблизительно 11 минут; от приблизительно 8 до приблизительно 11 минут; приблизительно любое из 1 или 2 или 3 или 4 или 5 или 6 или 7 или 8 или 9 или 10 или 11 минут; по меньшей мере приблизительно любое из 1 или 2 или 3 или 4 или 5 или 6 или 7 или 8 или 9 или 10 и не более чем приблизительно 11 минут.

b) Инфекционные агенты

[0092] Изобретение предоставляет способы инактивации вирусов и/или занесенных агентов в клеточной культуральной среде, включающие подвергание среды тепловой обработке. Вирусом может быть любой вирус, подробно описанный в данном документе (например, парвовирус), а клеточной культуральной средой может быть любая клеточная культуральная среда, подробно описанная в данном документе, например, среда с компонентами, подробно описанными в таблице 1. Вирусом, инактивируемым в клеточной культуральной среде в процессе тепловой обработки, может быть любой вирус, который имеет отношение к получению в промышленном масштабе продуктов (например, полипептидов, клеток, тканей). Промышленно релевантные вирусы известны квалифицированным специалистам в данной области. Неограничивающими примерами промышленно релевантных вирусов являются: парвовирусы, парамиоксивирусы, ортомиксовирусы, буньявирусы, рабдовирусы, реовирусы, тогавирусы, калицивирусы и пикорнавирусы. Формальная номенклатура для класса вирусов (например, парвовирус) используется взаимозаменяемо по всему описанию с менее формальной номенклатурой (например, парвовирус). Должно быть понятно, что каждая номенклатура относится к одному и тому же классу вирусов (т.е., парвовирусы охватывают тот же самый класс вирусов, что и парвовирус). В одном варианте, вирусом является вирус без оболочки. В некоторых аспектах, вирус без оболочки включает, но без ограничения, вирус с односпиральной ДНК, вирус с двухспиральной ДНК, вирус с двухспиральной РНК и вирус с односпиральной РНК. В дополнительных аспектах, вирус без оболочки включает, но без ограничения, парвовирус, реовирус или пикорнавирус. В одном варианте, вирусом является вирус в оболочке. В некоторых аспектах, вирус в оболочке включает, но без ограничения, вирус с односпиральной ДНК, вирус с двухспиральной ДНК, вирус с двухспиральной РНК и вирус с односпиральной РНК. В дополнительных аспектах, вирус в оболочке включает, но без ограничения, ретровирус, вирус герпеса или гепаднавирус. В любом варианте изобретения, вирус выбирают из группы, состоящей из аденовирус, вирус африканской лихорадки свиней, аренавирус, артеривирус, астровирус, бакуловирус, баднавирус, барнавирус, бирнавирус, бромовирус, буньявирус, калицивирус, капилловирус, карлавирус, каулимовирус, цирковирус, клостеровирус, комовирус, коронавирус, котриковирус, цистовирус, дельтавирус, диантовирус, энамовирус, филовирус, флавивирус, фуровирус, фузелловирус, геминивирус, гепаднавирус, герпесвирус, хордейвирус, гиповирус, идеаовирус, иновирус, иридовирус, левивирус, липотриксвирус, лутеовирус, макломовирус, марафивовирус, микровирус, миовирус, некровирус, нодавирус, ортомиксовирус, паповавирус, парамиксовирус, партитивирус, парвовирус, фикоднавирус, пикорнавирус, пламавирус, подовирус, полиднавирус, потексвирус, потивирус, поксвирус, реовирус, ретровирус, рабдовирус, ризидиовирус, секвивирус, сифовирус, собемовирус, тективирус, тенуивирус, тетравирус, тобамавирус, тобравирус, тогавирус, томбусвирус, тотивирус, триховирус, тимовирус и умбравирус. В некоторых аспектах, вирусы включают, но без ограничения, вирус эпизоотической геморрагической болезни (EHDV), мелкий вирус мышей (MMV), парвовирус-1 мышей (MPV), вирус долины КЭШ, везивирус 2117, свиной цирковирус (PCV 1), свиной цирковирус 2 (PCV 2), собачий парвовирус (CPV), коровий парвовирус (BPV) или вирус синего языка (BTV). В отдельном аспекте, вирусом является парвовирус, таких как мелкий вирус мышей. В варианте, изобретение предоставляет способы инактивации субвирусного агента в клеточной культуральной среде, включающие подвергание среды тепловой обработке. В некоторых аспектах, субвирусным агентом является вироид или сателлит. В еще одном варианте, изобретение предоставляет способы инактивации вирусоподобного агента в клеточной культуральной среде, включающие подвергание среды тепловой обработке.

[0093] В еще одном варианте, изобретение предоставляет способы инактивации инфекционного агента в клеточной культуральной среде, включающие подвергание среды тепловой обработке. В некоторых аспектах, инфекционным агентом является бактерия. В дополнительном аспекте, бактерией является микоплазма. В еще одном аспекте, инфекционным агентом являются бактерии, которые являются достаточно маленькими, чтобы проходить через фильтры, включая любые фильтры, описанные в данной заявке. В еще одном аспекте, инфекционным агентом являются грибы. В еще одном аспекте, инфекционным агентом является паразит. В еще одном аспекте, инфекционным агентом является компонент инфекционного агента. Квалифицированному специалисту в данной области должно быть понятно, что компонентом инфекционного агента может быть любой компонент, который происходит из инфекционного агента, который является нежелательным в клеточной культуральной среде.

[0094] В еще одном варианте, изобретение предоставляет способы инактивации занесенного агента в клеточной культуральной среде, включающие подвергание среды тепловой обработке. Квалифицированному специалисту в данной области должно быть понятно, что любой занесенный агент, который восприимчив к инактивации тепловой обработкой, может быть инактивирован посредством любого из способов, подробно описанных в данном документе, с использованием любой клеточной культуральной среды, подробно описанной в данном документе, такой как среда с компонентами, подробно описанными в таблице 1. В любых из вариантов, по меньшей мере один или более типов инфекционного и/или занесенного агента инактивируется в клеточной культуральной среде во время HTST-обработки. В некоторых аспектах, одним или более типами инфекционного и/или занесенного агента является вирус, субвирусный агент, вирусоподобный агент, бактерии, грибы, паразит или компонент инфекционного и/или занесенного агента. В любых из вариантов, тепловой обработкой является HTST-обработка. Квалифицированному специалисту в данной области должно быть понятно, что любой из способов, подробно описанных в данном документе для инактивации инфекционного и/или занесенного агента тепловой обработкой, включает подвергание любой клеточной культуральной среды, подробно описанной в данном документе, такой как среда с компонентами, подробно описанными в таблице 1, любой HTST-обработке, подробно описанной в данном документе.

[0095] Инактивацию вирусов измеряют с помощью анализов, известных квалифицированным специалистам в данной области. Например, инактивацию вирусов определяют посредством измерения или оценки заданного значения логарифмического уменьшения (LRV) активного вируса. В одном аспекте, вирусные нагрузки со значением логарифмического уменьшения больше или равно 3 в клеточной культуральной среде с использованием HTST-обработки при температурах больше чем 95°C в течение 2 секунд определяют, как инактивацию вирусов в среде. В еще одном аспекте, значение логарифмического уменьшения приблизительно 3 в вирусных нагрузках в клеточной культуральной среде с использованием HTST-обработки при температуре 100°C в течение 60 секунд определяют, как инактивацию вирусов в среде. В любом из аспектов, вирусной нагрузкой является MVM нагрузка.

c) Системы тепловой обработки

[0096] Способы тепловой обработки клеточных культуральных сред для инактивации инфекционных агентов, известные квалифицированным специалистам в данной области, такие как, например, методологии, описанные у Schleh, М. С соавт. 2009. Biotechnol. Prog. 25(3):854-860 и Kiss, R. 2011. PDA J Pharm Sci and Tech. 65:715-729, раскрытия которых включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте, могут использоваться для тепловой обработки любой клеточной культуральной среды, подробно описанной в данном документе, такой как среда с компонентами, подробно описанными в таблице 1. Например, кратковременная высокотемпературная (HTST) обработка используется в производственных процессах для инактивации вирусов. В варианте, изобретение предоставляет способ инактивации вирусов в клеточной культуральной среде, включающий подвергание клеточных культуральных сред HTST-обработке, при этом во время HTST-обработки среда имеет pH между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9. В еще одном варианте, изобретение предоставляет способ инактивации вирусов в клеточной культуральной среде, включающий ограничение общего количества фосфата и кальция в среде во время HTST-обработки до менее, чем приблизительно 10 мМ. В еще одном варианте, изобретение предоставляет способ инактивации вирусов в клеточной культуральной среде, включающий подвергание клеточных культуральных сред HTST-обработке, при этом среда имеет pH между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9, и включающий ограничение общего количества фосфата и кальция в среде во время HTST-обработки до менее, чем приблизительно 10 мМ. HTST-обработка может включать HTST цикл, в котором клеточные культуральные среды нагревают от окружающей температуры или 37°C до приблизительно 102°C, при этом клеточные культуральные среды содержат при 102°C в течение времени выдержки температуры, равном приблизительно 10 секунд, и при этом клеточные культуральные среды затем охлаждают приблизительно до окружающей температуры или приблизительно 37°C. В некоторых аспектах, окружающая температура составляет между от приблизительно 15°C до приблизительно 30°C. В других аспектах, окружающая температура составляет между от приблизительно 18°C до приблизительно 25°C. HTST-обработка может представлять собой непрерывный проточный процесс, в котором используют два теплообменника, один для нагревания текучей среды и один для охлаждения текучей среды, с системой труб между ними для обеспечения необходимого времени выдержки температуры для заданной скорости протекания. В одном аспекте, инактивация вирусов в клеточной культуральной среде включает подвергание клеточных культуральных сред одному циклу HTST-обработки. В еще одном аспекте, инактивация вирусов в клеточной культуральной среде включает подвергание клеточных культуральных сред по меньшей мере двум или более циклам HTST-обработки. В одном аспекте скорость протекания составляет 100 л/мин. В еще одном аспекте скорость протекания составляет 125 л/мин. В еще одном аспекте, скоростью протекания может быть любая скорость протекания, которая подходит для обеспечения соответствующей температуры и времени выдержки при температуре для инактивации вирусов и/или занесенных агентов. В любом аспекте, клеточные культуральные среды нагревают от приблизительно 37°C до приблизительно 102°C, при этом клеточные культуральные среды содержат при 102°C на протяжении продолжительности времени, достаточной для инактивации вирусов, и при этом клеточные культуральные среды затем охлаждают до приблизительно 37°C. В дополнительном аспекте, количество времени, достаточное для инактивации вирусов, составляет приблизительно 10 секунд. В любом из аспектов, количеством времени, достаточным для инактивации вирусов, является любое время выдержки температуры, которая подробно описана в данном документе. В любом из аспектов, температурой для инактивации вирусов в течение времени выдержки температуры является любая температура, подробно описанная в данном документе. В одном аспекте, температура для инактивации вирусов составляет между от приблизительно 85°C до приблизительно 120°C. В одном варианте, клеточные культуральные среды нагревают от приблизительно 15°C до приблизительно 102°C, при этом клеточные культуральные среды содержат при 102°C в течение времени выдержки температуры, равном приблизительно 10 секунд, и при этом клеточные культуральные среды затем охлаждают до приблизительно 37°C. В еще одном варианте, клеточные культуральные среды нагревают от приблизительно 37°C до приблизительно 102°C, при этом клеточные культуральные среды содержат при 102°C в течение времени выдержки температуры, равном приблизительно 10 секунд, и при этом клеточные культуральные среды затем охлаждают до приблизительно 37°C.

[0097] Для HTST-обработки, объем клеточной культуральной среды, составляющий от между приблизительно 0,5 до приблизительно 20000 литров (л), обрабатывают с помощью оборудования, используемого для HTST-обработки для инактивации вирусов. Квалифицированному специалисту в данной области должно быть понятно, что объем клеточной культуральной среды менее, чем приблизительно 0,5 л или более, чем приблизительно 20000 л может быть обработан с помощью оборудования, используемого для HTST-обработки в любом из способов, подробно описанных в данном документе с использованием любой клеточной культуральной среды, подробно описанной в данном документе, такой как среда с компонентами, подробно описанными в таблице 1. В одном аспекте, объем клеточной культуральной среды, составляющий от между приблизительно 0,5 л до приблизительно 20000 л, обрабатывают за один HTST сеанс. В других аспектах, объем клеточной культуральной среды, составляющий от между приблизительно 0,5 л до приблизительно 20000 л, обрабатывают по меньшей мере за два или более HTST сеансов. Как используется в данном описании, термин «HTST сеанс» может относиться к процессу, в котором заданное количество среды подвергают HTST-обработке в оборудовании (например, HTST-модуле), используемом для HTST-обработки в течение по меньшей мере одного цикла (например, нагревания, содержания, охлаждения) HTST-обработки. Квалифицированному специалисту в данной области должно быть понятно, что любое оборудование, такое как HTST-модуль, используемое для HTST-обработки, может использоваться для тепловой обработки любых клеточных культуральных сред, подробно описанных в данном документе, таких как среда с компонентами, подробно описанными в таблице 1. В одном аспекте, HTST сеанс может включать непрерывную обработку по меньшей мере одного или более объемов клеточной культуральной среды, составляющих от между приблизительно 0,5 л до приблизительно 20000 л. В еще одном аспекте, HTST сеанс может включать периодическую обработку по меньшей мере одного или более объемов клеточной культуральной среды от приблизительно 0,5 л до приблизительно 20000 л. В любом аспекте, по меньшей мере один или более объемов клеточной культуральной среды может относиться к одному и тому же типу клеточной культуральной среды (например, среды 1). В любом аспекте, по меньшей мере один или более объемов клеточной культуральной среды может относиться по меньшей мере к одному или более типам клеточной культуральной среды (например, среды 1 и среды 2). В любом из аспектов способов, подробно описанных в данном документе, объем клеточной культуральной среды, составляющий от между по меньшей мере приблизительно 0,5 л, обрабатывают с помощью оборудования для HTST-обработки для инактивации вирусов. В дополнительном аспекте, объем клеточной культуральной среды, составляющий от между по меньшей мере приблизительно 2 л, обрабатывают с помощью оборудования для HTST-обработки для инактивации вирусов. В еще одном дополнительном аспекте, количество времени, достаточное для инактивации вирусов в среде, составляет по меньшей мере приблизительно до 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000 или 15000 литров. В некоторых аспектах, объем клеточной культуральной среды, составляющий 2 л, обрабатывают с помощью оборудования для HTST-обработки для инактивации вирусов. В других аспектах, объем клеточной культуральной среды, составляющий 12000 л, обрабатывают с помощью оборудования для HTST-обработки для инактивации вирусов. В еще одном варианте, объем клеточной культуральной среды от приблизительно 0,5 до приблизительно 20000; от приблизительно 2 до приблизительно 18000; от приблизительно 10 до приблизительно 16000; от приблизительно 20 до приблизительно 14000; от приблизительно 40 до приблизительно 12000; от приблизительно 80 до приблизительно 10000; от приблизительно 100 до приблизительно 8000; от приблизительно 200 до приблизительно 6000; от приблизительно 400 до приблизительно 4000; от приблизительно 800 до приблизительно 2000; от приблизительно 0,5 до приблизительно 18000; от приблизительно 0,5 до приблизительно 16000; от приблизительно 0,5 до приблизительно 14000; от приблизительно 0,5 до приблизительно 12000; от приблизительно 0,5 до приблизительно 10000; от приблизительно 0,5 до приблизительно 8000; от приблизительно 0,5 до приблизительно 6000; от приблизительно 0,5 до приблизительно 4000; от приблизительно 0,5 до приблизительно 2000; от приблизительно 0,5 до приблизительно 800; от приблизительно 0,5 до приблизительно 600; от приблизительно 0,5 до приблизительно 400; от приблизительно 0,5 до приблизительно 200; от приблизительно 0,5 до приблизительно 100; от приблизительно 0,5 до приблизительно 50; от приблизительно 0,5 до приблизительно 20; от приблизительно 0,5 до приблизительно 10; от приблизительно 0,5 до приблизительно 5; от приблизительно 0,5 до приблизительно 2; от приблизительно 2 до приблизительно 20000; от приблизительно 10 до приблизительно 20000; от приблизительно 100 до приблизительно 20000; от приблизительно 500 до приблизительно 20000; от приблизительно 1000 до приблизительно 20000; от приблизительно 1500 до приблизительно 20000; от приблизительно 2000 до приблизительно 20000; от приблизительно 5000 до приблизительно 20000; от приблизительно 1000 до приблизительно 20000; от приблизительно 15000 до приблизительно 20000; от приблизительно 1750 до приблизительно 20000 литров; приблизительно любое из 0,5 или 2 или 10 или 100 или 1000 или 10000 или 20000 литров; по меньшей мере приблизительно любой из 0,5 или 2 или 10 или 100 или 1000 или 10000 и не более, чем приблизительно 20000 литров, обрабатывают с помощью оборудования для HTST-обработки для инактивации вирусов.

[0098] Квалифицированным специалистам в данной области известны способы инактивации вирусов во время обработки клеточной культуры, такие как, например, методологии, описанные у Kiss, R. 2011. PDA J Pharm Sci and Tech. 65:715-729, раскрытие которых включено в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте, могут использоваться в комбинации с HTST-обработкой любой клеточной культуральной среды, подробно описанной в данном документе, такой как среда с компонентами, подробно описанными в таблице 1. Например, кратковременная высокотемпературная (HTST) обработка может использоваться в комбинации по меньшей мере с одной или более вирусными барьерными обработками в производственных процессах для удаления вирусов из клеточной культуральной среды. В некоторых аспектах, одна или более вирусная барьерная обработка включает, но без ограничения, тепловую стерилизацию, облучение УФ светом, гамма излучение и фильтрование. В некоторых аспектах, вирусной барьерной обработкой является фильтрование. Представленное изобретение предоставляет способы удаления и/или инактивации вирусов в клеточной культуральной среде, подвергнутой HTST-обработке, при этом вирусы удаляют из клеточной культуральной среды посредством фильтрования на стадии после того, как клеточные культуральные среды подвергают HTST-обработке. В некоторых аспектах фильтрованием является ультрафильтрование. Перед ультрафильтрованием, в клеточные культуральные среды, подвергнутые HTST-обработке, добавляют один или более компонентов среды, таких как компоненты, перечисленные в таблице 1. В некоторых аспектах, перед ультрафильтрованием, в клеточные культуральные среды, подвергнутые HTST-обработке, добавляют один или более компонентов среды, таких как металлы, содержащиеся в следовых количествах (например, железо или медь).

[0099] Ультрафильтрационные мембраны могут быть образованы из регенерированной целлюлозы, полиэфирсульфона, полиакрилсульфонов, полисульфона, полиимида, полиамида, поливинилидендифторида (PVDF) и тому подобное. Типовые ультрафильтрационные мембраны включают, но без ограничения мембраны Viresolve®, мембраны Viresolve®Pro, мембраны Viresolve®180, мембраны Viresolve®70, мембраны Viresolve®NFP, мембраны Viresolve®NFR, мембраны Retropore™, мембраны Virosart CPV, мембраны Planova 75, мембраны Planova 35, мембраны Planova 20, мембраны Planova 15N, мембраны VAG 300, мембраны Ultipor DVD, мембраны Ultipor DV50, мембраны Ultipor DV20 и фильтры DVD Zeta Plus VR™. В некоторых аспектах, ультрафильтрационная мембрана способна удалять парвовирусные частицы. В некоторых аспектах, ультрафильтрационной мембраной является удерживающая парвовирус мембрана.

[0100] Размер пор ультрафильтрационных мембран должен быть достаточно маленьким для удерживания нежелательных вирусных частицы обеспечивая в то же время возможность прохождения одного или более белков в водном растворе через мембрану. В некоторых вариантах осуществления изобретения, размер пор ультрафильтрационной мембраны менее, чем 10 нм, 10 нм, 20 нм, 30 нм, 40 нм, 50 нм, 60 нм, 70 нм, 80 нм, 90 нм, 100 нм, 125 нм, 150 нм, 175 нм или 200 нм. В некоторых вариантах осуществления, размер пор ультрафильтрационной мембраны составляет 20 нм или меньше.

[0101] Ультрафильтрационные мембраны могут отличаться отсечкой по молекулярной массе, которая представляет среднюю молекулярную массу наименьшего белка, который задерживается ультрафильтрационной мембраной. Например, большинство глобулярных белков с молекулярной массой более, чем 1000 кД будет задерживаться ультрафильтрационной мембраной с отсечкой по молекулярной массе 1000 кД с нормой, составляющей 80-90%, тогда как большинство глобулярных белков с молекулярной массой менее, чем 1000 кД будут проходить через ультрафильтрационную мембрану. В некоторых аспектах изобретения, отсечка по молекулярной массе ультрафильтрационной мембраны составляет между 200 кД и 1000 кД. В некоторых аспектах изобретений, ультрафильтрационная мембрана имеет отсечку по молекулярной массе, равную 200 кД, 300 кД, 400 кД, 500 кД, 600 кД, 700 кД, 900 кД или 1000 кД.

[0102] Фильтрация может осуществляться одной или более ультрафильтрационными мембранами либо посредством тупиковой (нормальной) проточной фильтрации (NFF), либо посредством тангенциальной проточной фильтрации (TFF). В NFF поток поступающего материала пропускают через мембрану, и вещества с большой молекулярной массой улавливаются в фильтре в то время, как фильтрат высвобождается на другом конце. В TFF большая часть потока поступающего материала движется по касательной поперек поверхности фильтра, а не в фильтр. В связи с этим, фильтрационный осадок по существу вымывается во время процесса фильтрации, увеличивая продолжительность времени, когда фильтрующий блок может быть рабочим. Ультрафильтрационные мембраны для каждого режима фильтрации могут поставляться либо в виде картриджа (NFF), такого как вирусные фильтры VIRES OLVE® NFP, либо в виде кассет (для TFF), таких как кассеты PELLICON®. В предпочтительном варианте осуществления, фильтрацией является нормальная проточная фильтрация.

[0103] В способах изобретения может использоваться более, чем одна ультрафильтрационная мембрана. В некоторых вариантах осуществления, с водным раствором параллельно контактирует более чем одна ультрафильтрационная мембрана. HTST-обработка в комбинации с еще одной вирусной барьерной обработкой может использоваться для обработки любых клеточных культуральных сред, раскрытых в данном описании, таких как клеточная культуральная среда с компонентами, подробно описанными в таблице 1, для выработки в промышленном масштабе белковых и полипептидных терапевтических средств.

[0104] Клеточными культуральными средами, используемыми во время HTST-обработки для инактивации инфекционных агентов, могут быть HTST-совместимые среды или HTST-несовместимые среды. Как используется в данном описании, термин «HTST-совместимые среды» может относиться к клеточным культуральным средам, которые не имеют или имеют пониженную преципитацию во время HTST-обработки. Как используется в данном описании, термин «HTST-несовместимые среды» может относиться к клеточным культуральным средам, которые имеют измеряемую или выявляемую преципитацию во время HTST-обработки. В одном варианте, изобретение предоставляет способы скрининга HTST-совместимых клеточных культуральных сред для использования в инактивации вирусов во время HTST-обработки, в котором HTST-совместимая среда имеет пониженную преципитацию по сравнению с преципитацией в HTST несовместимых средах. В одном аспекте, HTST-совместимая клеточная культура не имеет преципитации по сравнению с преципитацией в HTST несовместимых средах во время HTST-обработки. В любом варианте, HTST-совместимая среда имеет более высокие уровни металла, содержащегося в следовых количествах, по сравнению с HTST несовместимыми средами вслед за HTST-обработкой. В аспекте, металлом, содержащимся в следовых количествах, является по меньшей мере один или более металл, содержащийся в следовых количествах, выбранный из группы, состоящей из железа или меди. В любом варианте, HTST-совместимая среда имеет более низкие уровни металла, содержащегося в следовых количествах, по сравнению с другой HTST-совместимой средой. В аспекте, металлом, содержащимся в следовых количествах, является по меньшей мере один или более металл, содержащийся в следовых количествах, выбранный из группы, состоящей из железа или меди. Изобретение предусматривает способы преобразования HTST несовместимых сред в HTST-совместимые среды. В варианте, изобретение предоставляет способ преобразования HTST несовместимых сред в HTST-совместимые среды, в котором компоненты клеточной среды регулируют, как подробно изложено в таблице 1. В еще одном варианте, изобретение предоставляет способ преобразования HTST несовместимых сред в HTST-совместимые среды, в котором компоненты клеточной среды регулируют, используя характеристическая поверхность, как подробно изложено в примере 2. В варианте, изобретение предоставляет способ преобразования HTST несовместимых сред в HTST-совместимые среды, в котором pH среды регулируют до между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9. В еще одном варианте, изобретение предоставляет способ преобразования HTST несовместимых сред в HTST-совместимые среды, в котором pH H среды регулируют до между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 7,2. В некоторых аспектах, pH HTST несовместимых сред регулируют до между pH приблизительно 5,3 и pH приблизительно 6,3 для преобразования HTST несовместимых сред в HTST-совместимые среды. В дополнительном аспекте, pH HTST несовместимых сред доводят до pH 6,0 для преобразования HTST несовместимых сред в HTST-совместимые среды. В некоторых аспектах, pH HTST несовместимых сред понижают до между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9 во время HTST-обработки перед фазой выработки полипептида клеточной культуры. В дополнительном аспекте, pH HTST несовместимых сред затем доводят до между pH приблизительно 6,9 и pH приблизительно 7,2 для фазы выработки полипептида клеточной культуры. В дополнительном аспекте, pH HTST несовместимых сред затем доводят до между pH приблизительно 6,9 и pH приблизительно 7,2 после HTST-обработки для фазы выработки полипептида клеточной культуры. В некоторых аспектах, pH HTST несовместимых сред находится между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 7,2 во время HTST-обработки перед фазой выработки полипептида клеточной культуры. В варианте, изобретение предоставляет способ преобразования HTST несовместимых сред в HTST-совместимые среды, в котором общее количество фосфата и кальция в среде регулируют до менее, чем приблизительно 10 мМ. В дополнительном аспекте, общую концентрацию фосфата и кальция в HTST несовместимых средах регулируют до менее, чем приблизительно 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 мМ. В некоторых аспектах, общее количество фосфата и кальция в HTST несовместимых средах регулируют до менее, чем приблизительно 10 мМ перед фазой выработки полипептида клеточной культуры. В дополнительном аспекте, общее количество фосфата и кальция в HTST несовместимых средах затем повышают до уровня, достаточного для выработки полипептида во время фазы выработки полипептида клеточной культуры.

d) Уменьшение образования преципитата

[0105] В одном варианте, изобретение предоставляет способы уменьшения преципитации в клеточной культуральной среде в процессе тепловой обработки для инактивации вирусов. Способы включают регулирование одного или более уровней кальция, фосфата и pH в клеточной культуральной среде, подвергнутой тепловой обработке. В одном аспекте, тепловой обработкой является HTST-обработка. В варианте, изобретение предоставляет способ уменьшения преципитации в клеточной культуральной среде во время HTST-обработки для инактивации вирусов, в котором во время HTST-обработки среда имеет pH между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9. В еще одном варианте, изобретение предоставляет способ уменьшения преципитации в клеточной культуральной среде во время HTST-обработки для инактивации вирусов, в котором во время HTST-обработки среда имеет pH между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 7,2. В некоторых аспектах, во время HTST-обработки среда имеет pH H между pH приблизительно 5,3 и pH приблизительно 6,3. В других аспектах, во время HTST-обработки среда имеет pH, равный pH приблизительно 6,0. В некоторых аспектах, pH среды понижают до между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9 во время HTST-обработки перед фазой выработки полипептида клеточной культуры. В некоторых аспектах, pH среды понижают до между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 7,2 во время HTST-обработки перед фазой выработки полипептида клеточной культуры. В дополнительном аспекте, pH среды затем доводят до между pH приблизительно 6,9 и pH приблизительно 7,2 для фазы выработки полипептида клеточной культуры. В дополнительном аспекте, pH среды затем доводят до между pH приблизительно 6,9 и pH приблизительно 7,2 после HTST-обработки для фазы выработки полипептида клеточной культуры. В одном варианте, во время HTST-обработки pH среды находится между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 7,2 перед фазой выработки полипептида клеточной культуры. В еще одном варианте, изобретение предоставляет способ уменьшения преципитации в клеточной культуральной среде во время HTST-обработки для инактивации вирусов, включающий ограничение общего количества фосфата и кальция в среде во время HTST-обработки до менее, чем приблизительно 10 мМ. В дополнительном аспекте, общая концентрация фосфата и кальция в среде составляет менее, чем приблизительно 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 мМ во время HTST-обработки. В некоторых аспектах, общее количество фосфата и кальция в среде во время HTST-обработки перед фазой выработки полипептида клеточной культуры ограничено менее, чем приблизительно 10 мМ. В дополнительном аспекте, затем общее количество фосфата и кальция в среде повышают до уровня, достаточного для выработки полипептида во время фазы выработки полипептида клеточной культуры. В еще одном варианте, изобретение предоставляет способ уменьшения преципитации в клеточной культуральной среде во время HTST-обработки для инактивации вирусов, в котором среда имеет pH между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9, включающий ограничение общего количества фосфата и кальция в среде во время HTST-обработки до менее, чем приблизительно 10 мМ. В некоторых аспектах, pH среды понижают до между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,0, а общее количество фосфата и кальция в среде во время HTST-обработки перед фазой выработки полипептида клеточной культуры ограничено менее, чем приблизительно 10 мМ. В дополнительном аспекте, pH среды затем доводят до между pH приблизительно 6,9 и pH приблизительно 7,2, а общее количество фосфата и кальция в среде повышают до уровня, достаточного для выработки полипептида во время фазы выработки полипептида клеточной культуры.

[0106] В некоторых аспектах изобретения, любые среды, подробно описанные в данном документе, такие как среда с конкретными компонентами, подробно изложенными в таблице 1, уменьшают преципитацию во время HTST-обработки для инактивации инфекционных агентов. В одном аспекте, конкретные компоненты в среде уменьшают преципитацию на по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 100%, по сравнению с количеством преципитации, имеющейся в той же самой среде без конкретных компонентов среды во время HTST-обработки. Количественное определение количества преципитации в среде может быть проделано с использованием хорошо известных методов в данной области. В одном варианте, изобретение предоставляет способ уменьшения преципитации в клеточной культуральной среде, подвергнутой HTST-обработке, в котором среда имеет pH, равный pH приблизительно 5,0 до pH приблизительно 6,9 и в котором среда имеет пониженную преципитацию по меньшей мере приблизительно на любое из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%, по сравнению с преципитацией в среде, не имеющей pH, равного pH приблизительно 5,0 до pH приблизительно 6,9 во время HTST-обработки. В одном аспекте, среда имеет pH, равный pH приблизительно 5,3 до pH приблизительно 6,3 во время HTST-обработки, и при этом среда имеет пониженную преципитацию на по меньшей мере приблизительно любое из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%, по сравнению с преципитацией в среде, не имеющей pH, равного pH приблизительно 5,3 до pH приблизительно 6,3 во время HTST-обработки. В еще одном аспекте, во время HTST-обработки среда имеет pH, равный pH приблизительно 6,0, и при этом среда имеет пониженную преципитацию на по меньшей мере приблизительно любое из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%, по сравнению с преципитацией в среде, не имеющей pH, равного pH приблизительно 5,3 до pH приблизительно 6,0 во время HTST-обработки. В одном варианте, изобретение предоставляет способ уменьшения преципитации в клеточной культуральной среде, включающий ограничение общего количества фосфата и кальция в среде во время HTST-обработки до менее, чем приблизительно 10 мМ, и при этом среда имеет пониженную преципитацию на по меньшей мере приблизительно любое из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%, по сравнению с преципитацией в среде, имеющей общее количество фосфата и кальция более, чем приблизительно 10 мМ во время HTST-обработки. В одном аспекте, общая концентрация фосфата и кальция в среде составляет менее, чем приблизительно 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, или 1 мМ во время HTST-обработки, и при этом среда имеет пониженную преципитацию на по меньшей мере приблизительно любое из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%, по сравнению с преципитацией в среде, не имеющей общую концентрацию фосфата и кальция менее, чем приблизительно 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, или 1 мМ во время HTST-обработки. В одном варианте, изобретение предоставляет способ уменьшения преципитации в клеточной культуральной среде, подвергнутой HTST-обработке, в котором среда имеет pH, равный pH приблизительно 5,0 до pH приблизительно 6,9 и включающий ограничение общего количества фосфата и кальция в среде во время HTST-обработки до менее, чем приблизительно 10 мМ, и при этом среда имеет пониженную преципитацию на по меньшей мере приблизительно любое из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%, по сравнению с преципитацией в среде, не имеющей pH, равного pH приблизительно 5,0 до pH приблизительно 6,9 и имеющей общее количество фосфата и кальция более, чем приблизительно 10 мМ во время HTST-обработки.

[0107] Инфекционным агентом любого из способов, подробно описанных в данном документе, может быть любой вирус, подробно описанный в данном документе (например, парвовирус), а средой способов может быть любая среда, подробно описанная в данном документе, такая как среда с компонентами, подробно описанными в таблице 1.

B. Способы уменьшения загрязнения оборудования, используемого для тепловой обработки

[0108] Представленное изобретение предоставляет способы уменьшения загрязнения оборудования, используемого для HTST-обработки для инактивации вирусов в клеточной культуральной среде. Авторы изобретения раскрыли, что регулирование уровней конкретных компонентов или параметров в клеточной культуральной среде, подвергнутой HTST-обработке, уменьшает загрязнение оборудования, используемого для HTST-обработки для инактивации вирусов. Любая клеточная культуральная среда, подробно описанная в данном документе, такая как среда с компонентами, подробно описанными в таблице 1, может использоваться в любом из способов, подробно описанных в данном документе для уменьшения загрязнения оборудования, используемого для HTST-обработки для инактивации вирусов. В любом из способов, подробно описанных в данном документе, загрязнение включает преципитацию на оборудовании, используемом для HTST-обработки.

[0109] В одном варианте, представленное изобретение предоставляет способ уменьшения загрязнения оборудования, используемого для HTST-обработки, при этом способ включает подвергание клеточных культуральных сред, используемых в оборудовании, HTST-обработке, при этом во время HTST-обработки среда имеет pH между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9. В одном аспекте, во время HTST-обработки среда имеет pH между pH приблизительно 5,3 и pH приблизительно 6,3. В еще одном аспекте, во время HTST-обработки среда имеет pH, равный pH приблизительно 6,0. В еще одном аспекте, загрязнение включает преципитацию на оборудовании, используемом для HTST-обработки. В любом из аспектов, HTST-обработка включает повышение температуры по меньшей мере до приблизительно 85 градусов по Цельсию на протяжении продолжительности времени, достаточной для инактивации вирусов в среде. В дополнительном аспекте, температуру среды повышают по меньшей мере до приблизительно 93 градусов по Цельсию на протяжении продолжительности времени, достаточной для инактивации вирусов в среде. В еще одном дополнительном аспекте, температуру среды повышают по меньшей мере до приблизительно 95, 97, 99, 101 или 103 градуса по Цельсию на протяжении продолжительности времени, достаточной для инактивации вирусов в среде. В одном варианте, представленное изобретение предоставляет способ уменьшения загрязнения оборудования, используемого для HTST-обработки, при этом способ включает ограничение общего количества фосфата и кальция в клеточной культуральной среде, используемой в оборудовании во время HTST-обработки, до менее, чем приблизительно 10 мМ. В одном аспекте, общая концентрация фосфата и кальция в среде составляет менее, чем приблизительно 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 мМ во время HTST-обработки. В дополнительном аспекте, загрязнение включает преципитацию на оборудовании, используемом для HTST-обработки.

[0110] В любом аспекте, при использовании HTST-совместимой среды загрязнение оборудования, используемого для HTST-обработки, уменьшается по сравнению с HTST несовместимыми средами. В одном аспекте, HTST-совместимая среда содержит pH между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9 во время HTST-обработки. В еще одном аспекте, HTST-совместимая среда содержит общее количество фосфата и кальция менее, чем приблизительно 10 мМ. В еще одном аспекте, HTST-совместимая среда содержит pH между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9, а общее количество фосфата и кальция менее, чем приблизительно 10 мМ во время HTST-обработки. HTST-совместимой средой является любая клеточная культуральная среда, подробно описанная в данном документе, такая как среда с компонентами, подробно описанными в таблице 1.

[0111] Квалифицированным специалистам в данной области известны способы измерения и мониторинга загрязнения различного оборудования, используемого в производственных процессах, такие как, например, методологии, описанные у Awad, М. 2011. Heat Transfer: Theoretical Analysis, Experimental Investigations and Industrial Systems. Chapter 20, page 505-542, раскрытие которой включено в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте, которые могут использоваться для мониторинга и измерения загрязнения оборудования, используемого для HTST-обработки любых клеточных культуральных сред, раскрытых в данном описании, таких как среда с компонентами, подробно описанными в таблице 1, и среды, подробно описанные в примерах. Например, загрязнение оборудования может быть измерено посредством измерения изменений давления пара в теплообменнике, необходимого для достижения намеченного заданного значения температуры среды или посредством измерения изменений (уменьшения) достигнутой температуры. В любом из аспектов, загрязнение включает преципитацию на оборудовании, используемом для HTST-обработки. В одном аспекте, одно или более оборудований, чувствительных к загрязнению вследствие использования HTST несовместимых сред, включает, но без ограничения, HTST-модуль, теплообменник, систему труб, фильтрационное устройство и фильтрационную мембрану.

C. Способы выработки полипептидов с помощью термообработанных клеточных культуральных сред

a) Клетки

[0112] Предоставленные способы и композиции могут использовать любые клетки, которые подходят для выращивания и/или выработки полипептида (например, антитела) в среде, описанной в данной заявке, включая клетки животных, дрожжей или насекомых. В одном аспекте, клетками способов и композиций являются клетки или типы клеток любых млекопитающих, подходящие для клеточной культуры и для экспрессии полипептидов. В способах, предоставленных в данном описании (например, способах инактивации вирусов в клеточной культуральной среде), и композициях, вследствие этого, можно использовать любой подходящий тип клеток, включая животные клетки. В одном аспекте, в способах и композициях используют клетки млекопитающих. В способах и композициях также можно использовать гибридомные клетки. В одном варианте, клетками млекопитающих являются негибридомные клетки млекопитающих, которые были трансформированы экзогенной изолированной нуклеиновой кислотой, кодирующей требуемый полипептид, такой как антитело, фрагмент антитела (включая связывающий лиганд фрагмент) и химерные антитела. В одном варианте, в способах и композициях используют клетки млекопитающих, выбранные из группы, состоящей из ретинобластов человека (PER.C6 (CruCell, Leiden, Netherlands)); линии CV1 почек обезьяны, трансформированной SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); эмбрионная линия почек человека (клетки 293 или 293, субклонированные для выращивания в суспензионной культуре, Graham с соавт., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); клетки почки новорожденного хомяка (BHK, ATCC CCL 10); овариальные клетки китайского хомячка/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); клетки Сертоли мыши (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почки африканской зеленой обезьяны (VERO-76, ATCC CRL-1 587); клетки карциномы шейки матки человека (HeLa, ATCC CCL 2); клетки почки собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени серой крысы (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клетки легкого человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, HB 8065); опухоль молочной железы мыши (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI клетки (Mather с соавт., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); MRC 5 клетки; FS4 клетки; и линия гепатомы человека (Hep G2). В конкретном варианте, в способах и композициях используются CHO клетки. В конкретном варианте, используют культивирование клеточных линий CHO и экспрессию полипептидов (например, антител) из клеточных линий CHO. Полипептиды (например, антитела) могут секретироваться в среду, раскрытую в данном описании, из которой полипептиды могут быть изолированы и/или очищены, или полипептид может высвобождаться в среду, раскрытую в данном описании, за счет лизиса клеток, содержащих изолированную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид.

[0113] Способы, векторы и клетки-хозяева, подходящие для адаптации к синтезу представляющего интерес полипептида в рекомбинантной клеточной культуре позвоночных, известны в данной области и описаны, например, у Gething с соавт., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei с соавт., Nature, 281:40-46 (1979); Levinson с соавт.; EP 117060; и EP 117058. Особенно полезной плазмидой для экспрессии полипептида клеточной культуры млекопитающих является pRK5 (EP публикация № 307247) или pSVKB (PCT публикация № WO 91/08291, опубликованная 13 января 1991 года).

[0114] Клетки-хозяева трансформируют экспрессионным или клонирующими векторами и культивируют в подаваемой среде, модифицированной по необходимости для индуцирования промотеров, выбора трансформантов или амплифицирования генов, кодирующих требуемые последовательности. Для клеток млекопитающих, предпочтительными являются метод преципитации фосфата кальция Graham and van der Erb, Virology, 52:456-457 (1978), или метод липофектамин.TM. (Gibco BRL) Hawley-Nelson, Focus 15:73 (1193). Общие аспекты трансформаций системы клеток-хозяев млекопитающих известны в данной области и были описаны, например, у Axel в патенте США № 4399216 опубликованном 16 августа 1983 года. Для различных методов для трансформации клеток млекопитающих, см. Например, Keown с соавт., Methods in Enzymology (1989), Keown с соавт., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) и Mansour с соавт., Nature, 336:348-352 (1988).

[0115] Способы и композиции также охватывают использование гибридом, которые секретируют моноклональные антитела в клеточной культуре. Моноклональные антитела получают посредством извлечения иммунных клеток (обычно клеток селезенки или лимфоцитов из ткани лимфатического узла) из иммунизированных животных и иммортализации клеток общепринятым образом, например, путем слияния с клетками миеломы или посредством трансформации вируса Эпштейн-Барра (EB) и скрининга клонов, экспрессирующих требуемые антитела. Гибридомная методика, первоначально описанная Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol., 6:511 (1976), а также описанная Hammerling с соавт., в: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp. 563-681 (1981) широко применяется для получения гибридных клеточных линий, которые секретируют высокие уровни моноклональных антител против множества конкретных антигенов.

b) Полипептиды

[0116] Полипептиды, вырабатываемые с помощью композиций (например, клетками) и способов, подробно описанных в данном документе, и присутствующие в композициях, предоставленных в данном описании, могут быть гомологичны клетке-хозяину, или предпочтительно, могут быть экзогенными, что означает, что они являются гетерологичными, т.е., чужеродными используемой клетке-хозяину, например, человеческий белок, вырабатываемый овариальной клеткой китайского хомячка, или дрожжевой полипептид, вырабатываемый клетками млекопитающих. В одном варианте, полипептидом является полипептид млекопитающих (такой как антитело), секретируемый непосредственно в среду клеткой-хозяином. В еще одном варианте, полипептид высвобождается в среду за счет лизиса клетки, содержащей изолированную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид.

[0117] В одном варианте, полипептидом является последовательность аминокислот, для которых длина цепи является достаточной для получения более высоких уровней третичной и/или четвертичной структуры. В одном аспекте, полипептид будет иметь молекулярную массу, равную по меньшей мере приблизительно 5-20 кД, в качестве альтернативы по меньшей мере приблизительно 15-20 кД, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 20 кД.

[0118] Любой полипептид, который экспрессируется в клетке-хозяине, может вырабатываться в соответствии с представленным раскрытием и может иметься в предоставленных композициях. Полипептид может экспрессироваться от гена, который является эндогенным клетке-хозяину, или от гена, которой вводят в клетку-хозяин посредством генной инженерии. Полипептидом может быть полипептид, которой существует в природе, или в качестве альтернативы может иметь последовательность, которая была сконструирована или выбрана человеком вручную. Сконструированный полипептид может быть собран из других полипептидных сегментов, которые существуют в природе по отдельности, или может включать один или более сегментов, которые не существуют в природе.

[0119] Полипептиды, которые могут быть по желанию экспрессированы в соответствии с представленным изобретением, часто будут выбираться на основе интересующей биологической или химической активности. Например, представленное изобретение может быть использовано для экспрессии любого фармацевтически или коммерчески уместного фермента, рецептора, антитела, гормона, фактора регулирования, антигена, связывающего агента и т.д.

[0120] Различные полипептиды могут вырабатываться согласно способам, предоставленным в данном описании, и присутствовать в композициях, предоставленных в данном описании. Примеры бактериальных полипептидов включают, например, щелочную фосфатазу и бета-лактамазу. Примеры полипептидов млекопитающих включают молекулы, такие как ренин, гормон роста, в том числе человеческий гормон роста; коровий гормон роста; фактор высвобождения гормона роста; паратироидный гормон; тиреостимулирующий гормон; липопротеины; альфа-1-антитрипсин; A-цепь инсулина; B-цепь инсулина; проинсулин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; коагулирующие факторы, такие как фактор VIIIC, фактор IX, тканевый фактор, и фактор фон Виллебранда; противокоагулирующие факторы, такие как Белок C; предсердный натрийуретический фактор; легочный сурфактант; активатор плазминогена, такой как урокиназа или активатор плазминогена человека урокиназного или тканевого типа (t-PA); бомбезин; тромбин; гемопоэтический фактор роста; альфа и бета фактор некроза опухоли; энкефалиназа; RANTES (хемокин, экспрессируемый и секретируемый T-клетками при активации); макрофаговый воспалительный белок человека (MIP-1-альфа); сывороточный альбумин, такой как человеческий сывороточный альбумин; мюллерова ингибирующая субстанция; A-цепь релаксина; B-цепь релаксина; прорелаксин; связанный с гонадотропином пептид мыши; микробный белок, такой как бета-лактамаза; ДНКаза; ингибин; активин; фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF); рецепторы для гормонов или факторов роста; интегрин; белок А или D; ревматоидные факторы; нейротропный фактор, такой как мозговой нейротрофический фактор (BDNF), нейротрофин-3,-4,-5 или-6 (NT-3, NT-4, NT-5 или NT-6), или нейротрофический фактор роста, такой как NGF-бета; тромбоцитарный фактор роста (PDGF); фактор роста фибробластов, такой как aFGF и bFGF; эпидермальный фактор роста (EGF); трансформирующий фактор роста (TGF), такой как TGF-альфа и TGF-бета, включая TGF-бета 1, TGF-бета 2, TGF-бета 3, TGF-бета 4 или TGF-бета 5; инсулиноподобный фактор роста-I и-II (IGF-I и IGF-II); des(1-3)-IGF-I (мозговой IGF-I), белки, связывающие инсулиноподобный фактор роста; CD белки, такие как CD-3, CD-4, CD-8 и CD-19; эритропоэтин; остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины; костный морфогенетический белок (BMP); интерферон, такой как интерферон-альфа, -бета, и-гамма; колониестимулирующие факторы (CSF), например, M-CSF, GM-CSF и G-CSF; интерлейкины (IL), например, от IL-1 до IL-10; супероксид дисмутаза; T-клеточные рецепторы; белки мембранной поверхности; комплементзависимый стимулятор гемолиза; вирусный антиген, такой как, например, участок оболочки СПИДа; транспортные белки; «хоминг»-рецепторы; адрес; регуляторные белки; антитела; и фрагменты любого из перечисленных выше полипептидов.

[0121] Антитела являются примерами полипептидов млекопитающих, вырабатываемых согласно способам, предоставленным в данном описании, и которые могут иметься в предоставленных композициях. Антитела представляют собой предпочтительный класс полипептидов, которые проявляют специфичность связывания с конкретным антигеном. Нативные антитела обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины, равные приблизительно 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, в то время как количество дисульфидных связей варьирует между тяжелыми цепями различных изотипов иммуноглобулина. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеет равномерно распределенные внутрицепные дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (V.sub.H), за которым следует ряд константных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен на одном конце (V.sub.L) и константный домен на другом своем конце; константный домен легкой цепи выровнен с первым константным доменом тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи выровнен с вариабельным доменом тяжелой цепи. Есть основания полагать, что отдельные аминокислотные остатки образуют поверхность раздела между вариабельными доменами легкой и тяжелой цепей.

[0122] Антитела представляют собой существующие в природе молекулы иммуноглобулина, которые имеют варьирующие структуры, которые все основаны на укладке цепи иммуноглобулина. Например, IgG антитела имеют две «тяжелые» цепи и две «легкие» цепи, которые соединены дисульфидными связями с образованием функционального антитела. Каждая тяжелая и легкая цепь сама содержит «константную» (C) и «вариабельную» (V) область. V области определяют антиген связывающую специфичность антитела, в то время, как C области обеспечивают структурную опору и функционирование в неантиген-специфических взаимодействиях с иммунными эффекторами. Антиген связывающей специфичностью антитела или связывающим антиген фрагментом антитела является способность антитела специфически связываться с конкретным антигеном.

[0123] Антиген связывающая специфичность антитела определяется структурными характеристиками V области. Вариабельность не распределена равномерно на протяжении 110-аминокислотного диапазона вариабельных доменов. Вместо этого, V области состоят из относительно неизменных удлинений, называемых каркасные области (FR), из 15-30 аминокислот, разделенных более короткими областями с экстремальной вариабельностью, называемыми «гипервариабельные области», каждая из которых имеет длину в 9-12 аминокислот. Каждый из вариабельных доменов нативных тяжелых и легких цепей содержит четыре FR, принимающих в основном конфигурацию β-листа, соединенного тремя гипервариабельными областями, которые образуют петли, соединяющие и в некоторых случаях образующие часть β-листовой структуры. гипервариабельные области в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости посредством FR а, с гипервариабельными областями из другой цепи, участвуют в образовании связывающего антиген сайта антител (см. Kabat с соавт., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). константные домены непосредственно не вовлечены в связывание антитела с антигеном, но демонстрируют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в зависимой от антитела клеточной цитотоксичности (ADCC).

[0124] Каждая V область обычно содержит три определяющие комлементарность области («CDR», каждая из которых содержит «гипервариабельную петлю») и четыре каркасные области. Антителосвязывающий участок, минимальная структурная единица, необходимая для связывания с существенной аффинностью с конкретным необходимым антигеном, будет вследствие этого обычно содержать три CDR, и по меньшей мере три, предпочтительно четыре, каркасные области, вкрапленные между ними для содержания и наличия CDR в соответствующей конформации. Классические антитела с четырьмя цепями имеют антигенсвязывающие участки, которые образуются VH и VL доменами во взаимодействии. В некоторых антителах, таких как верблюжьи и акульи антитела, отсутствуют легкие цепи, и они основаны на связывающих участках, образованных только тяжелыми цепями. Могут быть получены сконструированные с единственным доменом иммуноглобулины, в которых связывающие участки образованы единственно тяжелыми цепями или легкими цепями, в отсутствии взаимодействия между VH и VL.

[0125] Термин «вариабельный» относится к тому факту, что определенные участки вариабельных доменов сильно отличаются по последовательности среди антител и используются в связывании и специфичности каждого конкретного антитела для своего конкреатного антигена. Однако вариабельность распределена не равномерно по всем вариабельным доменам антител. Она сконцентрирована в трех сегментах, называемых гипервариабельные области в вариабельных доменах как легкой цепи, так и тяжелой цепи. Более высоко консервативные участки вариабельных доменов называются каркасные области (FR). Каждый из вариабельных доменов нативных тяжелых и легких цепей содержит четыре FR, принимающих в основном конфигурацию β-листа, соединенного тремя гипервариабельными областями, которые образуют петли, соединяющие, и в некоторых случаях образующие часть структуры β-листа. Гипервариабельные области в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости посредством FR и, с гипервариабельными областями из другой цепи, вносят вклад в образование антигенсвязывающего участка антител (см. Kabat с соавт., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Константные домены не вовлечены непосредственно в связывание антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в зависимой от антитела клеточной цитотоксичности (ADCC).

[0126] Термин «гипервариабельная область» при использовании в данном описании относится к аминокислотным остаткам антитела, которые являются ответственными за связывание антигена. Гипервариабельная область может содержать аминокислотные остатки из «определяющей комлементарность области» или «CDR» (например, приблизительно вокруг остатков 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в VL, и приблизительно вокруг 31-35B (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) в VH (Kabat с соавт., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) и/или эти остатки из «гипервариабельной петли» (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в VL, и 26-32 (H1), 52A-55 (H2) и 96-101 (H3) в VH (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)).

[0127] «Каркасные» или «FR» остатки представляют собой такие остатки вариабельного домена, которые не являются остатками гипервариабельной области по определению данного описания.

[0128] Папаиновое разрушение антител создает два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых «Fab» фрагменты, каждый с единственным антигенсвязывающим участком, и остаточный «Fc» фрагмент, название которого отражает его способность легко кристаллизоваться. Обработка пепсином дает F(ab')2 фрагмент, который имеет два антигенсвязывающих участка и все-таки допускает перекрестное связывание антигена.

[0129] «Fv» представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит участок распознавания полного антигена и связывания антигена. Данная область состоит из димера одной тяжелой цепи и вариабельного домена одной легкой цепи в тесной, нековалентной связи. Именно в данной конфигурации три гипервариабельные области каждого вариабельного домена взаимодействуют с образованием антигенсвязывающего участка на поверхности VH-VL димера. Совместно, шесть гипервариабельных областей придают антителу антигенсвязывающую специфичность. Однако, даже единственный вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три гипервариабельные области, специфические к антигену) имеет способность к распознаванию и связыванию антигена, хотя с более низкой аффинностью, чем весь участок связывания.

[0130] Fab фрагмент также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (CHI) тяжелой цепи. Fab' фрагменты отличаются от Fab фрагментов добавлением нескольких остатков на карбоксильном конце домена CHI тяжелой цепи, включая один или более цистеинов из шарнирной области антитела. В данном описании Fab'-SH является обозначением для Fab', в котором цистеиновый остаток (остатки) константных доменов несут по меньшей мере одну свободную тиольную группу. F(ab')2 фрагменты антитела первоначально получали в виде пар Fab' фрагментов, которые имеют шарнирные цистеины между ними. Также известны другие химические соединения фрагментов антитела.

[0131] «Легкие цепи» антител (иммуноглобулинов) из любых видов позвоночных могут быть отнесены к одному из двух явно различающихся видов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ), на основе аминокислотных последовательностей их константных доменов.

[0132] В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей, антитела могут быть отнесены к различным классам. Существуют пять главных классов интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Константные домены тяжелых цепей, которые соответствуют различным классам антител, называются α, δ, ε, γ и μ, соответственно. Хорошо известны структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов.

[0133] «Одноцепочечные Fv» или «scFv» фрагменты антитела содержат VH и VL домены антитела, при этом данные домены присутствуют в единственной полипептидной цепи. В некоторых вариантах осуществления, Fv полипептид дополнительно содержит полипептидный линкер между VH и VL доменами, который позволяет scFv образовать требуемую структуру для связывания антигена. Для обзора scFv см. Pliickthun in the Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

[0134] Термин «диантитела» относится к маленьким фрагментам антитела с двумя антигенсвязывающими участками, причем данные фрагменты содержат вариабельный домен (VH) тяжелой цепи, соединенный с вариабельным доменом (VL) легкой цепи в той же самой полипептидной цепи (VH-VL). За счет использования линкера, который является слишком коротким, чтобы обеспечить возможность спаривания между двумя доменами в одной и той же цепи, домены принуждаются к спариванию с комплементарными доменами другой цепи и создают два антигенсвязывающих участка. Диантитела описаны более полно, например, в EP 404097; WO 93/11161; и у Hollinger с соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

[0135] Для целей данного описания, «интактным антителом» является антитело, содержащее тяжелый и легкий вариабельные домены, а также Fc область. Константные домены могут быть нативной последовательностью константных доменов (например, нативной последовательностью константных доменов человека), или вариантом его аминокислотной последовательности. Предпочтительно, интактное антитело имеет одну или более эффекторные функции.

[0136] «Нативными антителами» обычно являются гетеротетрамерные гликопротеины, равные приблизительно 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, при том что количество дисульфидных связей изменяется среди тяжелых цепей различных изотипов иммуноглобулина. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеет равномерно распределенные внутрицепные дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VH), за которым следует ряд константных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен на одном конце (VL) и константный домен на другом своем конце; константный домен легкой цепи выровнен с первым константным доменом тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи выровнен с вариабельным доменом тяжелой цепи. Есть основания полагать, что отдельные аминокислотные остатки формируют поверхность раздела между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи.

[0137] «Голым антителом» (по определению данного описания) является антитело, которое не конъюгировано с гетерологической молекулой, такой как цитотоксическая молекула или радиометка.

[0138] Антитело направлено против представляющего интерес антигена. Предпочтительно, антигеном является биологически важный полипептид, и введение антитела индивидууму, страдающему от заболевания или состояния, может приводить к терапевтической пользе для данного млекопитающего. Однако также могут использоваться антитела, направленные против неполипептидных антигенов (таких как связанные с опухолью гликолипидные антигены; см. патент США № 5091178).

[0139] Когда антигеном является полипептид, это может быть трансмембранная молекула (например, рецептор), или лиганд, такой как фактор роста. Иллюстративные антигены включают молекулы, такие как ренин, гормон роста, в том числе человеческий гормон роста; коровий гормон роста; фактор высвобождения гормона роста; паратироидный гормон; тиреостимулирующий гормон; липопротеины; альфа-1-антитрипсин; A-цепь инсулина; B-цепь инсулина; проинсулин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; коагулирующие факторы, такие как фактор VIIIC, фактор IX, тканевый фактор, и фактор фон Виллебранда; противокоагулирующие факторы, такие как Белок C; предсердный натрийуретический фактор; легочный сурфактант; активатор плазминогена, такой как урокиназа или активатор плазминогена человека урокиназного или тканевого типа (t-PA); бомбезин; тромбин; гемопоэтический фактор роста; альфа и бета фактор некроза опухоли; энкефалиназа; RANTES (хемокин, экспрессируемый и секретируемый T-клетками при активации); макрофаговый воспалительный белок человека (MIP-1-альфа); сывороточный альбумин, такой как человеческий сывороточный альбумин; мюллерова ингибирующая субстанция; A-цепь релаксина; B-цепь релаксина; прорелаксин; связанный с гонадотропином пептид мыши; микробный белок, такой как бета-лактамаза; ДНКаза; IgE; антиген цитотоксических Т лимфоцитов (CTLA), такой как CTLA-4; ингибин; активин; фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF); рецепторы для гормонов или факторов роста; белок А или D; ревматоидные факторы; нейротропный фактор, такой как мозговой нейротрофический фактор (BDNF), нейротрофин-3,-4,-5, или-6 (NT-3, NT-4, NT-5, или NT-6), или нейротрофический фактор роста, такой как NGF-бета; тромбоцитарный фактор роста (PDGF); фактор роста фибробластов, такой как aFGF и bFGF; эпидермальный фактор роста (EGF); трансформирующий фактор роста (TGF), такой как TGF-альфа и TGF-бета, включая TGF-.бета.1, TGF-.бета.2, TGF-.бета.3, TGF-.бета.4 или TGF-.бета.5; инсулиноподобный фактор роста-I и-II (IGF-I и IGF-II); des(1-3)-IGF-I (мозговой IGF-I), белки, связывающие инсулиноподобный фактор роста; CD белки, такие как CD3, CD4, CD8, CD18, CD19, CD20 и CD40; эритропоэтин; остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины; костный морфогенетический белок (BMP); интерферон, такой как интерферон-альфа, -бета, и -гамма; колониестимулирующие факторы (CSF), например, M-CSF, GM-CSF, и G-CSF; интерлейкины (IL), например, от IL-1 до IL-10; супероксид дисмутаза; T-клеточные рецепторы; белки мембранной поверхности; комплементзависимый стимулятор гемолиза; вирусный антиген, такой как, например, участок оболочки СПИДа; транспортные белки; «хоминг»-рецепторы; адрес; регуляторные белки; интегрины, такие как CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 и VCAM; связанный с опухолью антиген, такой как рецептор HER2, HER3 или HER4; и фрагменты любого из перечисленых выше полипептидов.

[0140] Предпочтительные молекулярные мишени для антител, подробно описанные в данном документе, включают CD белки, такие как CD3, CD4, CD8, CD18, CD19, CD20, CD34 и CD40; члены семейства рецепторов ErbB, такие как рецептор EGF, рецептор HER2, HER3 или HER4; молекулы клеточной адгезии, такие как LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, .альфа.4/.бета.7 интегрин, и .альфа.v/.бета.3 интегрин, включая либо .альфа., либо .бета. Его субъединицы (например, антитела анти-CD11a, анти-CD18 или анти-CD11b); факторы роста, такие как VEGF; тканевой фактор (TF); альфа интерферон (.альфа.-IFN); интерлейкин, такой как IL-8; IgE; антигены группы крови; рецептор flk2/flt3; рецептор ожирения (OB); рецептор mp1; CTLA-4; белок C и тому подобное.

[0141] Антитела (включая их фрагменты, в свою очередь включая их антигенсвязывающие фрагменты), которые могут быть получены с помощью способов данного описания, включают без ограничения анти-HER2, антитело 2C4, анти-VEGF, антитело C2B8, антиCD11a, анти-тканевой фактор, IgG4b, анти-CD40, анти-CD20, анти-IgE, E25 и E26, анти-PCSK9 и анти-Бета7.

c) Клеточный рост и выработка полипептидов

[0142] Как правило, клетки объединяют (вводят в контакт) с любыми клеточными культуральными средами, описанными в данной заявке, при одном или более условиях, которые способствуют любому из клеточного роста, поддержания и/или выработки полипептидов. В способах выращивания клеток и выработки полипептидов используют сосуд для культивирования (биореактор) для содержания клеток и клеточной культуральной среды. Сосуд для культивирования может состоять из любого материала, который подходит для культивирования клеток, включая стекло, пластмассу или металл. Обычно, сосуд для культивирования будет составлять по меньшей мере 1 литр и может составлять 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10000 литров или более. Условия культивирования, которые можно регулировать во время процесса культивирования, включают, но без ограничения, pH и температуру.

[0143] Клеточную культуру как правило содержат на начальной фазе роста в условиях, способствующих выживанию, росту и жизнеспособности (поддержанию) клеточной культуры. Точные условия будут варьировать в зависимости от типа клетки, организма, из которого была получена клетка, и природы и характера экспрессируемого полипептида.

[0144] Температура клеточной культуры на начальной фазе роста будут выбирать в первую очередь на основании диапазона температур, при которых клеточная культура остается жизнеспособной. Например, во время начальной фазы роста, CHO клетки растут хорошо при 37°C. Как правило, клетки большинства млекопитающих хорошо растут в пределах диапазона, составляющего приблизительно от 25°C до 42°C. Предпочтительно, клетки млекопитающих хорошо растут в пределах диапазона, составляющего приблизительно от 35°C до 40°C. Рядовые специалисты в данной области будут в состоянии выбрать соответствующую температуру или температуры, при которых растут клетки, в зависимости от потребностей клеток и требований выработки.

[0145] В одном варианте осуществления представленного изобретения, температуру начальной фазы роста поддерживают при единственной, постоянной температуре. В еще одном варианте осуществления, температуру начальной фазы роста поддерживают в пределах диапазона температур. Например, во время начальной фазы роста температуру можно постепенно повышать или понижать. В качестве альтернативы, температуру можно повышать или понижать дискретными количествами в различные моменты времени во время начальной фаза роста. Рядовой специалист в данной области будет в состоянии определить должна ли использоваться единственную или множество температур, и надо ли регулировать температуру постепенно или дискретными количествами.

[0146] Клетки можно выращивать во время начальной фаза роста в течение большего или меньшего количества времени. В одном варианте, клетки выращивают в течение периода времени, достаточного для достижения плотности жизнеспособных клеток, которая является заданным процентным значением максимальной плотности жизнеспособных клеток, которую клетки достигли бы в конце концов, если им обеспечить возможность расти без помех. Например, клетки могут расти в течение периода времени, достаточного для достижения необходимой плотности жизнеспособных клеток, равной 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99 процентов максимальной плотности жизнеспособных клеток.

[0147] В еще одном варианте осуществления клеткам предоставляют возможность расти в течение предварительно заданного периода времени. Например, в зависимости от начальной концентрации клеточной культуры, температуры, при которой клетки выращивают, и свойственной скорости роста клеток, клетки могут расти в течение 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более дней. В некоторых случаях, клеткам можно предоставлять возможность расти в течение месяца или более.

[0148] Клеточную культуру можно взбалтывать или встряхивать во время первоначальной фазы культивирования для того, чтобы увеличить насыщение кислородом и распространение питательных веществ в клетки. В соответствии с представленным изобретением, рядовому специалисту в данной области будет понятно, что может быть полезно управлять или регулировать некоторые внутренние условия биореактора во время начальной фаза роста, включая, но без ограничения pH, температуру, насыщение кислородом и т.д. Например, pH можно регулировать за счет подачи соответствующего количества кислоты или основания, а насыщение кислородом можно регулировать устройствами барботирования, которые хорошо известны в данной области.

[0149] Первоначальной стадией культивирования является фаза роста, на которой условия клеточной культуры одного производственного цикла модифицируют, чтобы усилить рост рекомбинантных клеток, для получения системы посевных ферментеров. Фаза роста как правило относится к периоду экспоненциального роста, когда клетки обычно быстро делятся, например, растут. Во время данной фазы, клетки культивируют в течение периода времени, обычно от 1 до 4 дней, например, 1, 2, 3 или 4 дня, и в таких условиях, чтобы клеточный рост был оптимальным. Определение цикла роста для клетки-хозяина может быть определено для конкретной клетки-хозяина способами, известными квалифицированным специалистам в данной области.

[0150] В фазе роста, базовую культуральную среду и клетки можно подавать в сосуд для культивирования отдельными порциями. Культуральная среда в одном аспекте содержит менее, чем приблизительно 5% или менее, чем 1% или менее, чем 0,1% сыворотки и других белков животного происхождения. Однако если необходимо, можно использовать сыворотку и белки животного происхождения. В конкретном варианте, для инактивации вирусов во время HTST-обработки базовая среда имеет pH между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9. В одном аспекте, pH базовой среды понижают до между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9 во время HTST-обработки для инактивации вирусов перед фазой выработки полипептида клеточной культуры. В дополнительном аспекте, pH среды затем доводят до между pH приблизительно 6,9 и pH приблизительно 7,2 для фазы выработки полипептида клеточной культуры. В дополнительном аспекте, pH среды затем доводят до между pH приблизительно 6,9 и pH приблизительно 7,2 после HTST-обработки для фазы выработки полипептида клеточной культуры. В еще одном особом варианте, базовая среда содержит ограничение общего количества фосфата и кальция во время HTST-обработки до менее, чем приблизительно 10 мМ для инактивации вирусов. В одном аспекте, общее количество фосфата и кальция в среде ограничено менее, чем приблизительно 10 мМ во время HTST-обработки для инактивации вирусов перед фазой выработки полипептида клеточной культуры. В дополнительном аспекте, затем общее количество фосфата и кальция в среде повышают до уровня, достаточного для выработки полипептида во время фазы выработки полипептида клеточной культуры. В еще одном варианте, базовая среда имеет pH между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9, а общее количество фосфата и кальция во время HTST-обработки до менее, чем приблизительно 10 мМ для инактивации вирусов. В одном аспекте, pH базовой среды понижают до между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9, и она содержит общее количество фосфата и кальция во время HTST-обработки до менее, чем приблизительно 10 мМ для инактивации вирусов перед фазой выработки полипептида клеточной культуры. В дополнительном аспекте, pH среды затем доводят до между pH приблизительно 6,9 и pH приблизительно 7,2, а общее количество фосфата и кальция в среде повышают до уровня, достаточного для выработки полипептида во время фазы выработки полипептида клеточной культуры. В любом из аспектов, базовой средой является среда определенного химического состава. В любом из аспектов, базовой средой является среда неопределенного химического состава. Аминокислоты, витамины, присутствующие в небольших количествах элементы и другие компоненты среды можно использовать за один или два раза, диапазоны оговорены в Европейском патенте EP 307247 или патенте США № 6180401, причем данные документы включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.

[0151] В качестве альтернативы, коммерчески доступные среды, такие как Ham's F10 (Sigma), минимальная поддерживающая среда ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) и модифицированная по способу Дульбекко среда Игла ([DMEM], Sigma), подходят для культивирования клеток животных и могут быть добавлены с химически образованными составляющими среды, которые подробно описаны в данном документе, (например, посредством использования предоставленного набора). В дополнение, в качестве культуральных сред для клеток-хозяев могут использоваться любые среды, описанные у Ham and Wallace, Meth. Enz., 58:44 (1979), Barnes и Sato, Anal. Biochem., 102:255 (1980), в патентах США №№ 4767704; 4657866; 4927762; или 4560655; WO 90/03430; WO 87/00195; патенте США № Re. 30985; или патенте США № 5122469, раскрытия которых включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте, каждая из которых может быть дополнена химически образованными составляющими среды, которые подробно описаны в данном документе, (например, посредством использования предоставленного набора).

[0152] Любые среды, предоставленные в данном описании, также по необходимости могут быть дополнены гормонами и/или другими факторами роста (такими как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), ионами (такими как натрий, хлорид, кальций, магний и фосфат), буферами (такими как HEPES), нуклеозидами (такими как аденозин и тимидин), присутствующими в небольших количествах элементами (образованными в виде неорганических соединений, обычно присутствующих в итоговых концентрациях в микромолярном диапазоне), металлами, содержащимися в следовых количествах, (такими как железо и медь) и глюкозой или эквивалентным источником энергии. Любые другие необходимые добавки также могут содержаться в соответствующих концентрациях, которые должны быть известны квалифицированным специалистам в данной области.

[0153] В конкретный момент своего роста, клетки могут образовывать инокулум для инокуляции культуральной среды в начале культивирования в фазе выработки. В качестве альтернативы, фаза выработки может продолжаться фазой роста. За фазой клеточного роста как правило следует фаза выработки полипептида.

[0154] Во время фазы выработки полипептида, клеточная культура может содержаться при втором наборе условий культивирования (по сравнению с фазой роста), способствующих выживанию и жизнеспособности клеточной культуры и подходящей для экспрессии необходимого полипептида. Например, во время последующей фазы выработки, CHO клетки хорошо экспрессируют рекомбинантные полипептиды и белки в пределах диапазона, составляющего от 25°C до 35°C. Множество отдельных температурных сдвигов могут быть использованы для увеличения клеточной плотности или жизнеспособности или для увеличения экспрессии рекомбинантного полипептида или белка. Как используется в данном описании, термин «фаза выработки полипептида» или «фаза экспрессии белка» могут относиться к фазе культивирования клеток, в которой клеточная культура вырабатывает биологический лекарственный продукт (например, полипептид).

[0155] Клетки можно содержать в последующей фазе выработки до тех пор, пока не будет достигнута необходимая клеточная плотность или титр выработки. В одном варианте осуществления, клетки содержат в последующей фазе выработки до тех пор, пока титр для рекомбинантного полипептида не достигнет максимального. В других вариантах осуществления, культуру можно собирать до этого момента. Например, клетки можно содержать в течение периода времени, достаточного для достижения плотности жизнеспособных клеток, равной 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99 процентов максимальной плотности жизнеспособных клеток. В некоторых случаях, может быть необходимо обеспечить возможность плотности жизнеспособных клеток для достижения максимума, а затем обеспечить возможность снижения плотности жизнеспособных клеток до некоторого уровня перед сбором культуры.

[0156] В некоторых случаях, может быть полезно или необходимо дополнить клеточную культуру во время последующей фазы выработки полипептида питательными веществами или другими компонентами среды, которые были исчерпаны или метаболизированы клетками. Например, может быть предпочтительно дополнить клеточную культуру питательными веществами или другими компонентами среды, исчерпывание которых наблюдается во время мониторинга клеточной культуры. В некоторых аспектах, один или более исчерпанных компонентов включают кальций, фосфат, железо и медь перед последующей фазой выработки. В некоторых аспектах, добавленные компоненты среды включают кальций, фосфат, железо и медь. В качестве альтернативы или дополнительно, может быть полезно или необходимо дополнить клеточную культуру перед последующей фазой выработки полипептида. В некоторых аспектах, клеточную культуру дополняют одним или более компонентами среды, включая кальций, фосфат, железо и медь перед последующей фазой выработки. В качестве неограничивающих примеров, может быть полезно или необходимо дополнить клеточную культуру гормонами и/или другими факторами роста, отдельными ионами (такими как натрий, хлорид, кальций, магний и фосфат), буферами, витаминами, нуклеозидами или нуклеотидами, присутствующими в небольших количествах элементами (неорганическими соединениями, обычно присутствующими в очень низких итоговых концентрациях), металлами, содержащимися в следовых количествах, (такими как железо и медь), аминокислотами, липидами или глюкозой или другим источником энергии. Как используется в данном описании, термин «подаваемая среда» или «продуцирующая среда» относится к клеточной культуральной среде, используемой во время фазы выработки полипептида клеточной культуры.

[0157] В конкретном варианте, во время HTST-обработки подаваемая среда имеет pH между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9 для инактивации вирусов. В некоторых аспектах, pH подаваемой среды затем доводят до между pH приблизительно 6,9 и pH приблизительно 7,2 для фазы выработки полипептида клеточной культуры. В некоторых аспектах, pH подаваемой среды затем доводят до между pH приблизительно 6,9 и pH приблизительно 7,2 после HTST-обработки для фазы выработки полипептида клеточной культуры. В еще одном особом варианте, во время HTST-обработки для инактивации вирусов подаваемая среда содержит ограничение общего количества фосфата и кальция до менее, чем приблизительно 10 мМ. В некоторых аспектах, общее количество фосфата и кальция в подаваемой среде затем повышают до уровня, достаточного для выработки полипептида во время фазы выработки полипептида клеточной культуры. В еще одном варианте, подаваемая среда имеет pH между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9, а общее количество фосфата и кальция во время HTST-обработки до менее, чем приблизительно 10 мМ для инактивации вирусов. В некоторых аспектах, pH среды затем доводят до между pH приблизительно 6,9 и pH приблизительно 7,2, а общее количество фосфата и кальция в среде повышают до уровня, достаточного для выработки полипептида во время фазы выработки полипептида клеточной культуры. В любом из аспектов, подаваемой средой является среда определенного химического состава. В любом из аспектов, подаваемой средой является среда неопределенного химического состава. Аминокислоты, витамины, присутствующие в небольших количествах элементы и другие компоненты среды могут быть использованы за один или два раза в диапазонах, указанных в Европейском патенте EP 307247 или патент США № 6180401, причем данные документы включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.

D. Наборы

[0158] Описан набор для дополнения клеточной культуральной среды химически определенными составляющими. Набор может содержать высушенные составляющие, подлежащие восстановлению, а также может содержать инструкции по применению (например, для использования для дополнения среды составляющими набора). Набор может содержать составляющие среды, предоставленные в данном описании в количествах, подходящих для дополнения клеточной культуральной среды. В одном варианте, набор содержит компоненты среды таблицы 1. В еще одном варианте, набор содержит составляющие среды для доведения pH среды до уровней pH, раскрытых в таблице 1.

E. Композиции

[0159] Также предоставлены композиции, содержащие клеточную культуральную среду и один или более других компонентов, таких как клетки или требуемые полипептиды (например, антитела). В одном варианте предоставлена композиция, содержащая: (a) клетки, содержащие изолированную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид; и (b) клеточную культуральную среду, которая предоставлена в данном описании. В еще одном варианте предоставлена композиция, содержащая: (a) полипептид; и (b) клеточную культуральную среду, которая предоставлена в данном описании, при этом в одном аспекте полипептид секретируется в среду клетками, содержащими изолированную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид. В еще одном варианте предоставлена композиция, содержащая: (a) полипептид; и (b) клеточную культуральную среду, которая предоставлена в данном описании, при этом в одном аспекте полипептид высвобождается в среду за счет лизиса клеток, содержащих изолированную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид. Клетками композиции могут быть любые клетки, подробно описанные в данном документе (например, CHO клетки), а средой композиции может быть любая среда, подробно описанная в данном документе, такая как среда, содержащая компоненты среды, которые подробно изложены в таблице 1. Аналогичным образом, полипептидом композиции может быть любой полипептид, подробно описанный в данном документе, такой как антитело.

F. Системы инактивации вирусов

[0160] Изобретение предусматривает системы и/или способы инактивации вирусов для клеточной культуральной среды. Система может содержать, но без ограничения: среду, блок (блоки) выдерживания среды, измеритель pH (или другое средство для измерения pH), средство для измерения и/или количественного определения концентрации и/или количества кальция и/или фосфата; средство для переноса среды (например, трубки), источник (источники) тепла для повышения температуры среды, средство для регулировки намеченной заданной величины (например, температуры), блоки содержания контаминантов (например, трубки выдерживания), источник (источники) охлаждения для уменьшения температуры среды, воздухоснабжение, средство ввода вывода давления (например, клапаны давления, перистальтический насос, центробежный насос, поршневой насос), средство ввода и вывода среды, средство ввода и вывода газа, средство фильтрации, средство регулировки скорости протекания и другие аспекты, связанные с динамикой жидкостей и газов, и необязательно, связанные с биореактором, где осуществляют выработку необходимых полипептидов или клеточной культуры или клеточных культуральных сред.

[0161] Система инактивации вирусов, содержащая приведенные выше элементы, также может содержать систему тепловой обработки. На фигуре 1 показана иллюстративная система тепловой обработки, которая может быть использована с различными параметрами (например, pH, концентрации кальция и/или фосфата), описанными в данной заявке. Подобные системы, описанные в данной заявке, применяются для осуществления способов инактивации вирусов в клеточной культуральной среде таким образом, чтобы среды могли использоваться для выработки различных конечных продуктов (например, полипептидов, антител и т.д.).

G. Иллюстративные варианты осуществления

[0162] В одном аспекте, изобретение предусматривает способы инактивации вирусов или занесенных агентов в клеточной культуральной среде в то время, как среды сохраняют пригодность для культивирования клеток, при этом указанный способ включает (a) подвергание клеточных культуральных сред кратковременной высокотемпературной (HTST) обработке; и (b) регулирование одного или более параметров, выбранных из группы, состоящей из pH, уровня кальция и уровня фосфата.

[0163] В любом из вариантов осуществления выше, способы дополнительно включают регулирование концентраций металлов, содержащихся в следовых количествах.

[0164] В любом из вариантов осуществления выше, металлы, содержащиеся в следовых количествах, выбирают из группы, состоящей из железа и меди.

[0165] В любом из вариантов осуществления выше, перед HTST-обработкой в среде регулируют концентрации железа и/или меди.

[0166] В любом из вариантов осуществления выше, перед HTST-обработкой из среды удаляют железо и/или медь.

[0167] В любом из вариантов осуществления выше, способы дополнительно включают добавление железа и/или меди в среду вслед за HTST-обработкой до уровня, подходящего для клеточной культуры.

[0168] В любом из вариантов осуществления выше, pH регулируют, когда среда содержит кальций и фосфат.

[0169] В любом из вариантов осуществления выше, pH регулируют при подготовке среды перед HTST-обработкой до подходяще низкого уровня.

[0170] В любом из вариантов осуществления выше, pH регулируют за счет понижения до подходящего уровня.

[0171] В любом из вариантов осуществления выше, pH регулируют до менее, чем приблизительно 7,2.

[0172] В любом из вариантов осуществления выше, pH регулируют до приблизительно 5,0-7,2.

[0173] В любом из вариантов осуществления выше, способ дополнительно включают регулирование pH вслед за HTST-обработкой до уровня, подходящего для клеточной культуры.

[0174] В любом из вариантов осуществления выше, pH регулируют до приблизительно 6,9-7,2.

[0175] В любом из вариантов осуществления выше, уровень кальция регулируют, когда среда содержит фосфат.

[0176] В любом из вариантов осуществления выше, уровень кальция уменьшают.

[0177] В любом из вариантов осуществления выше, уровень кальция уменьшают таким образом, чтобы подавить образование комплексов, состоящих из кальция и фосфата.

[0178] В любом из вариантов осуществления выше, перед HTST-обработкой из среды удаляют кальций.

[0179] В любом из вариантов осуществления выше, pH регулируют таким образом, чтобы подавить образование комплексов, состоящих из кальция и фосфата.

[0180] В любом из вариантов осуществления выше, способы дополнительно включают регулирование уровня кальция вслед за HTST-обработкой до уровня, подходящего для клеточной культуры.

[0181] В любом из вариантов осуществления выше, уровень фосфата регулируют, когда среда содержит кальций.

[0182] В любом из вариантов осуществления выше, уровень фосфата уменьшают.

[0183] В любом из вариантов осуществления выше, уровень фосфата уменьшают таким образом, чтобы подавить образование комплексов, состоящих из кальция и фосфата.

[0184] В любом из вариантов осуществления выше, перед HTST-обработкой из среды удаляют фосфат.

[0185] В любом из вариантов осуществления выше, pH регулируют таким образом, чтобы подавить образование комплексов, состоящих из кальция и фосфата.

[0186] В любом из вариантов осуществления выше, способы дополнительно включают регулирование уровня фосфата вслед за HTST-обработкой до уровня, подходящего для клеточной культуры.

[0187] В любом из вариантов осуществления выше, общая концентрация фосфата и кальция в среде составляет менее, чем приблизительно 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 мМ во время HTST-обработки.

[0188] В любом из вариантов осуществления выше, регулируют уровни кальция и фосфата.

[0189] В любом из вариантов осуществления выше, регулируют уровни pH, кальция и фосфата.

[0190] В еще одном аспекте, изобретение предусматривает способы инактивации вирусов или занесенных агентов в клеточной культуральной среде в то время, как среды сохраняют пригодность для культивирования клеток, при этом указанный способ включает подвергание клеточных культуральных сред кратковременной высокотемпературной (HTST) обработке, при этом среда имеет pH между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 7,2 перед и/или во время HTST-обработки. В некоторых вариантах осуществления, перед или во время HTST-обработки pH находится между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9, между pH приблизительно 5,3 и pH приблизительно 6,3, или между pH приблизительно 6,9 и pH приблизительно 7,2. В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает регулирование pH вслед за HTST-обработкой до уровня, подходящего для клеточной культуры. В некоторых вариантах осуществления, среда содержит кальций и фосфат. В некоторых вариантах осуществления, перед HTST-обработкой в среде регулируют концентрацию металлов, содержащихся в следовых количествах, (например, железа и/или меди). В некоторых вариантах осуществления, перед или во время HTST-обработки среда не содержит железо и/или медь. В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает добавление железа и/или меди в среду вслед за HTST-обработкой до уровня, подходящего для клеточной культуры.

[0191] В еще одном аспекте, изобретение предусматривает способы инактивации вирусов или занесенных агентов в клеточной культуральной среде в то время, как среды сохраняют пригодность для культивирования клеток, при этом указанный способ включает подвергание клеточных культуральных сред кратковременной высокотемпературной (HTST) обработке, при этом перед и/или во время HTST-обработки общее количество фосфата и кальция в среде составляет менее, чем приблизительно 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления, перед или во время HTST-обработки общее количество фосфата и кальция в среде составляет менее, чем приблизительно 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, перед или во время HTST-обработки среда не содержит фосфат. В некоторых вариантах осуществления, перед или во время HTST-обработки среда не содержит кальций. В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает регулирование уровень фосфата и/или кальция вслед за HTST-обработкой до уровня, подходящего для клеточной культуры. В некоторых вариантах осуществления, перед HTST-обработкой в среде регулируют концентрацию металлов, содержащихся в следовых количествах, (например, железа и/или меди). В некоторых вариантах осуществления, перед HTST-обработкой среда не содержит железо и/или медь. В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает добавление железа и/или меди в среду вслед за HTST-обработкой до уровня, подходящего для клеточной культуры.

[0192] В любом из вариантов осуществления выше, подавляют образование преципитата.

[0193] В любом из вариантов осуществления выше, уменьшают загрязнение оборудования, используемого для HTST-обработки.

[0194] В любом из вариантов осуществления выше, подавляют загрязнение фильтра.

[0195] В любом из вариантов осуществления выше, HTST-обработка включает повышение температуры среды по меньшей мере до приблизительно 85 градусов по Цельсию на протяжении продолжительности времени, достаточной для инактивации вирусов или занесенных агентов в среде.

[0196] В любом из вариантов осуществления выше, температуру среды повышают по меньшей мере до приблизительно 93, 95, 97, 99, 101, 102 или 103 градуса по Цельсию на протяжении продолжительности времени, достаточной для инактивации вирусов в среде.

[0197] В любом из вариантов осуществления выше, температуру повышают в течение по меньшей мере приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 секунд.

[0198] В любом из вариантов осуществления выше, вирус выбирают из группы, состоящей из парвовирусов, парамиоксивирусов, ортомиксовирусов, буньявирусов, рабдовирусов, реовирусов, тогавирусов, кальцивирусов и пикорнавирусов.

[0199] В любом из вариантов осуществления выше, вирусом является вирус в оболочке.

[0200] В любом из вариантов осуществления выше, вирусом является вирус без оболочки.

[0201] В любом из вариантов осуществления выше, занесенными агентами являются бактерии.

[0202] Все признаки, раскрытые в данном описании, могут быть объединены в любой комбинации. Каждый признак, раскрытый в данном описании, может быть заменен альтернативным признаком, служащим для той же самой, эквивалентной или аналогичной цели. Таким образом, до тех пор, пока явно не утверждается иное, каждый раскрытый признак, представляет собой только пример общей серии эквивалентных или аналогичных признаков.

[0203] Следующие примеры предоставлены для пояснения, но не для ограничения изобретения.

[0204] Все ссылки, раскрытые в данном описании, включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

ПРИМЕРЫ

[0205] Вирусный агент загрязнения процессов культивирования клеток несет угрозу для получения биологических лекарственных средств (например, рекомбинантных белков) из клеточных линий и повышает потенциальные опасения по поводу безопасности, касающиеся способности очищать вирусные агенты во время очистки продукта. Для минимизации риска попадания занесенных агентов в и через производственные процессы, включающие применение кратковременной высокотемпературной (HTST) обработки клеточных культуральных сред, могут быть взяты несколько подходов. Однако хотя и эффективная для инактивации вирусов при правильном функционировании, заданная среда может быть несовместима с использованием HTST-обработки для инактивации вирусных частиц (Schleh, М. С соавт. 2009. Biotechnol. Prog. 25(3):854-860 и Kiss, R. 2011. PDA J Pharm Sci and Tech. 65:715-729). Несовместимость среды может приводить к загрязнению контактирующих в процессе поверхностей в HTST оборудовании. Одним участником загрязнения является преципитация среды в результате операций нагревания и охлаждения HTST-обработки. Преципитация приводит к отложению осадка, который загрязняет теплообменники и приводит к неисправности HTST-модуля вследствие неспособности системы поддерживать заданные значения температуры. Кроме того, преципитация в среде, которая несовместима с тепловой обработкой, может вызывать загрязнение технологических фильтров, используемых для удаления бактерий, которые не были инактивированы в среде посредством HTST условия. Загрязнение фильтра вследствие преципитации может приводить к технологическим нарушениям и значительному увеличению стоимости фильтрации. Кроме того, преципитация в среде, несовместимой с тепловой обработкой, может пагубно влиять на эффективность культивирования клеток (например, титр продукта, клеточный рост, клеточную жизнеспособность) и качество продукта.

[0206] Как описано в данном описании, были идентифицированы несколько модификаций к среде, которые делают ее совместимой для использования во время HTST-обработки или другой тепловой обработки для инактивации вирусов. Было идентифицировано несколько составов сред, которые уменьшают или предотвращают преципитацию на оборудовании, используемом для HTST-обработки для инактивации вирусов. Способы инактивации вирусов в среде, предоставленные в данном описании, описаны в виде способов уменьшения преципитата на оборудовании, используемом для HTST-обработки для инактивации вирусов. В одном аспекте во время HTST-обработки для использования в инактивации вирусов среда может иметь pH между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9. В еще одном аспекте среда может иметь pH между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9 во время HTST-обработки для использования в инактивации вирусов перед фазой экспрессии белка клеточной культуры. В дополнительном аспекте среда может иметь pH, доведенный до между pH приблизительно 6,9 и pH приблизительно 7,2 для фазы экспрессии белка клеточной культуры. В одном аспекте среда может содержать ограничение общего количества фосфата и кальция во время HTST-обработки до менее, чем приблизительно 10 мМ для использования в инактивации вирусов. В еще одном аспекте среда может содержать ограничение общего количества фосфата и кальция во время HTST-обработки до менее, чем приблизительно 10 мМ для использования в инактивации вирусов перед фазой экспрессии белка клеточной культуры. В дополнительном аспекте среда может иметь общее количество фосфата и кальция, поднятое до уровня, достаточного для экспрессии белка во время фазы экспрессии белка клеточной культуры. В любом из аспектов, среда может содержать pH между pH приблизительно 5,0 и pH приблизительно 6,9, а общее количество фосфата и кальция во время HTST-обработки до менее, чем приблизительно 10 мМ для использования в инактивации вирусов в клеточной культуральной среде. Среды находят применение во всех фазах культивирования клеток и могут использоваться в базовой и/или подаваемой среде. Среда находит применение для уменьшения преципитата на оборудовании, используемом для HTST-обработки для инактивации вирусов. Также предусматриваются наборы для дополнения клеточной культуральной среды химически определенными составляющими.

[0207] Пример 1: Аттестация скринингового метода песочной ванны для произведения наблюдений при работе HTST-модуля.

[0208] Во время HTST-обработки в промышленном масштабе, жидкие препараты клеточных культуральных сред нагревают до 102°C в течение 10 секунд в непрерывном проточном процессе, в котором используют два теплообменника, один для нагревания текучей среды и один для охлаждения текучей среды, с системой труб между ними для обеспечения необходимого времени содержания для заданной скорости протекания (Фиг. 1). Скрининговый метод песочной ванны использовали для более быстрого тестирования композиций сред с требованиями объема среды в лабораторном масштабе (-20 мл) к поведению следующей тепловой обработки. Данный способ был основан на тепловом воздействии «в худшем случае» для скрининга и идентификации совместимой среды для использования HTST-модулей в пилотном и в промышленном масштабе (Таблица 2).

Таблица 2
Ключевые различия между устройством песочной ванны и HTST-модулем в двух масштабах работы
Характеристика Песочная ванна HTST-модуль в пилотном масштабе HTST-модуль в промышленном масштабе
Масштаб объема достаточного для протекания процесса 20 мл ~50-400 л ~1000 л
Протекание текучей среды (скорость переноса тепла на стороне образца) Статическое (конвекция, приводимая в действие за счет нагревания) ~1-2 л/мин, поршневое течение ~100 л/мин, поршневое течение
Материал (сопротивление переносу тепла) стекло 316 л нержавеющая сталь 316 л нержавеющая сталь
Профиль теплового воздействия Медленная ступенчатая функция (возрастание в течение 5-8 минут с 19-25°C или 37°C до 102°C, выдерживание 10 с, затем охлаждение за счет заливания водой в течение нескольких минут) Почти мгновенная ступенчатая функция (внешний или 37°C до 102°C выдерживание в течение 10 с, затем назад до 37°C Почти мгновенная ступенчатая функция (внешний или 37°C до 102°C выдерживание в течение 10 с, затем назад до 37°C

Материалы и способы

Получение среды

[0209] Среда, используемая в данном исследовании, содержит базовую среду для выработки и добавляемую партиями среду с варьирующими уровнями pH (Таблица 3). Все среды были получены с использованием очищенной деионизированной воды, пропущенной через систему очистки для получения сверхчистой воды Millipore SuperQ. Среды были получены с использованием соответствующих запасов порошка для среды (SAFC и Life Technologies). В процессе приготовления жидкостей применяли стеклянный pH-метрический электрод (Mettler Toledo) и осмометр (Advanced Instruments), чтобы обеспечить намеченный pH и осмоляльность для заданного приготовления. При полном растворении компонентов и установке итоговых pH и осмоляльности, среды отфильтровывали с использованием PES мембранных фильтров с размером пор 0,1 мкм в бутыли, варьирующие от 250 мл до 1 л (Corning) для приготовления в небольших масштабах.

Таблица 3
Составы сред, тестируемых на стабильность при тепловой обработке
Описание среды Намеченный pH
Среда 1 (подаваемая, неопределенная по составу) 6,40
7,00
Среда 2 (базовая, неопределенная по составу) 6,70
7,00

Регулировка pH

[0210] Скорректировали сдвиг pH вследствие насыщения газами, которое происходит в течение времени между завершением получения среды и когда была применена тепловая обработка. Перед тепловой обработкой 30 мл аликвоты из каждого получения среды перенесли в 50 мл пробирки (Falcon), а оригинальные крышки для пробирок Falcon заменили на крышки с отверстием от 250 мл колб Corning Erlenmeyer. Затем пробирки поместили в термостат с покрытием CO2 в течение 30 минут с целью снижения pH (15% CO2 для образцов с pH 6,2 и 12% CO2 для всех других образцов, 200 об/мин, 37°C); данная стадия была способна сдвигать pH ниже намеченного. Во время pH-мониторинга с использованием стеклянного pH-метрического электрода и измерителя (Mettler Toledo) пробирки встряхивали вручную до тех пор, пока pH не опускался назад до намеченного pH. Итоговые измерения pH получили с помощью биопрофайлера NOVA.

Метод песочной ванны

[0211] Для метода песочной ванны 22 мл полученной жидкой среды перенесли в 20 мл стеклянные сосуды высокого давления (Ace glassware). Сосуды закупоривали резьбовой крышкой с каналом для ввода термопары таким образом, чтобы в сосуде не оставалось воздушного пространства за счет полного его заполнения и предоставления возможности для вытеснения избыточной среды посредством крышки и канала для ввода термопары. Наружную часть контейнера очищали для предотвращения загрязнения наружной поверхности средой, непосредственно подвергаемой воздействию матрицы-источника нагревания. Тефлоновую ленту использовали для покрывания границы между краем стеклянного сосуда и резьбовой крышкой для большей герметизации сосуда высокого давления и защиты от попадания песка или масла из канала термопары в образцы для тепловой обработки. Ванну с флюидизированным песком (Techne SBS-4) с контроллером температуры (Techne TC-8D) конфигурировали (давление на впуске сжатого воздуха = 5 фунт/кв. дюйм, температура ванны = 110°C) и обеспечили возможность уравновешивания в течение 30 минут. Термопары, соединенные с единственным VWR цифровым термометром, вставляли каналы для ввода термопары сосуда образца, расположенного геометрически в центре радиального размера пробирки. В канал термопары добавили силиконовое масло для предоставления среды переноса тепла между стеклянной стенкой канала термопары и термопарой. Сосуды с образцами помещали в песочную ванну и включали таймер. Данные динамики температуры регистрировали приблизительно каждые 30-60 секунд. После того, как сосуд достигал 102°C при считывании термометром, его выдерживали в песочной ванне в течение 10 секунд. После стадии нагревания и выдерживания сосуды переносили в водяную ванну с комнатной температурой до тех пор, пока считывание температуры термометра не достигало 35°C. После тепловой обработки 15 мл каждого образца перенесли в пузырек для измерения мутности и визуальных измерений.

Измерения преципитации

[0212] Образцы сред анализировали на преципитацию перед и после тепловой обработки двумя способами: 1) мутность посредством турбидиметра (2100Q Hach); и 2) центрифугированием образцов в 50 мл пробирках Falcon при 10000×g в течение 10 минут (Sorvall RC 6 plus, SS-34 rotor) для отстаивания преципитатов с целью визуальной идентификации и количественного определения преципитации на основании размера пеллет (например, невидимый, малый, средний, большой). Нецентрифугированные образцы также анализировали с целью визуальной идентификации преципитации.

Результаты

[0213] Было два основных наблюдения из профилей песочной ванны и HTST-нагревания: 1) профиль нагревания для системы тепловой обработки в песочной ванне был значительно длиннее, чем для операций с крупномасштабным HTST-модулем и 2) песочная ванна была способна достигать намеченной заданной величины, составляющей 102°C приблизительно за 6,5 минут (Фиг. 2). Профили нагревания методом песочной ванны последовательно колебались от 5 до 8 минут со средним временем от ~6 до ~6,5 минут для нагревания от окружающей (~21-25°C), или 37°C до намеченной 102°C в течение 10 секундного удержания перед охлаждением образцов в водяной ванне. В отношении HTST-систем с непрерывным протеканием в промышленном или пилотном масштабе площадь под кривой для нагревания, содержания и охлаждения была значительно большей в методе песочной ванны. Было определено, что образцы сред в методе песочной ванны представляли наихудший случай для общего теплового воздействия относительно HTST-операций в пилотном и промышленном масштабе. Вследствие этого, любые значительные изменения компонентов в заданном составе среды, управляемые главным образом тепловым воздействием в методе песочной ванны, должны предоставлять релевантные данные для HTST-обработок в более крупных масштабах.

[0214] Наблюдалось, что во время HTST-обработки, понижение pH состава подаваемой среды 1 от pH 7,0 до pH 6,4 могло бы смягчить любые рабочие проблемы для HTST (Таблица 3). Аналогичным образом было обнаружено, что для состава базовой среды 2 обработка среды с pH, равным 6,7 вместо pH 7,0, также будет ослаблять любые рабочие проблемы (Таблица 3). Каждую из данных сред обрабатывали при двух уровнях pH по методу песочной ванны для определения, точно ли может отражать метод песочной ванны поведение преципитации, которая происходила в масштабных операциях HTST-обработки. Измерения видимости перед и после тепловой обработки показали, что система песочной ванны точно демонстрировала поведение преципитации вследствие того, что известно, что тепловая обработка среды имеет проблемы совместимости с HTST при обработке с нейтральным pH (Фиг. 3A и B). В соответствии с «наихудшим случаем» для изменения в среде на основе теплового воздействия, среда 2 все-таки показывала преципитации при pH 6,7 в песочной ванне, даже хотя она была значительно ослаблена относительно образца той же самой среды, обработанного при pH 7,0. В общем, данные результаты обосновали применение метода песочной ванны для скрининга и идентификации составов среды, которые были бы сопоставимы при использовании HTST-обработки в пилотном и в промышленном масштабе.

[0215] Пример 2: уровни pH, кальция и фосфата вносят вклад в преципитацию в среде в процессе тепловой обработки для инактивации вирусов.

Материалы и способы

Получение среды

[0216] Среда, используемая в данном исследовании, включает базовую среду для выработки и добавляемую порциями среду с уровнями pH, колеблющимися от приблизительно pH 5,9 до приблизительно pH 7,5, с диапазонами концентрации кальция от приблизительно 0 ммоль до приблизительно 3,5 ммоль (или более в средах неопределенного химического состава) и с диапазонами концентрации фосфата от приблизительно 0 ммоль до приблизительно 6,5 ммоль (или более в средах неопределенного химического состава). Все среды были получены с использованием очищенной деионизированной воды, пропущенной через систему очистки для получения сверхчистой воды Millipore SuperQ. Среды были получены с использованием соответствующих запасов порошка для среды (SAFC и Life Technologies). В процессе приготовления жидкостей применяли стеклянный pH-метрический электрод (Mettler Toledo) и осмометр (Advanced Instruments), чтобы обеспечить намеченный pH и осмоляльность для заданного приготовления. При полном растворении компонентов и установке итоговых pH и осмоляльности, среды отфильтровывали с использованием PES мембранных фильтров с размером пор 0,1 мкм в бутыли, варьирующие от 250 мл до 1 л (Corning) для приготовления в небольших масштабах.

Регулировка pH

[0217] Скорректировали сдвиг pH вследствие насыщения газами, которое происходит в течение времени между завершением получения среды и когда была применена тепловая обработка. Перед тепловой обработкой 30 мл аликвоты из каждого получения среды перенесли в 50 мл пробирки (Falcon), а оригинальные крышки для пробирок Falcon заменили на крышки с отверстием от 250 мл колб Corning Erlenmeyer. Затем пробирки поместили в термостат с покрытием CO2 в течение 30 минут с целью снижения pH (15% CO2 для образцов с pH 6,2 и 12% CO2 для всех других образцов, 200 об/мин, 37°C); данная стадия была способна сдвигать pH ниже намеченного. Во время pH-мониторинга с использованием стеклянного pH-метрического электрода и измерителя (Mettler Toledo) пробирки встряхивали вручную до тех пор, пока pH не опускался назад до намеченного pH. Итоговые измерения pH получили с помощью биопрофайлера NOVA.

Метод песочной ванны

[0218] Для метода песочной ванны 22 мл полученной жидкой среды перенесли в 20 мл стеклянные сосуды высокого давления (Ace glassware). Сосуды закупоривали резьбовой крышкой с каналом для ввода термопары таким образом, чтобы в сосуде не оставалось воздушного пространства за счет полного его заполнения и предоставления возможности для вытеснения избыточной среды посредством крышки и канала для ввода термопары. Наружную часть контейнера очищали для предотвращения загрязнения наружной поверхности средой, непосредственно подвергаемой воздействию матрицы-источника нагревания. Тефлоновую ленту использовали для покрывания границы между краем стеклянного сосуда и резьбовой крышкой для большей герметизации сосуда высокого давления и защиты от попадания песка или масла из канала термопары в образцы для тепловой обработки. Ванну с флюидизированным песком (Techne SBS-4) с контроллером температуры (Techne TC-8D) конфигурировали (давление на впуске сжатого воздуха = 5 фунт/кв. дюйм, температура ванны = 110°C) и обеспечили возможность уравновешивания в течение 30 минут. Термопары, соединенные с единственным VWR цифровым термометром, вставляли каналы для ввода термопары сосуда образца, расположенного геометрически в центре радиального размера пробирки. В канал термопары добавили силиконовое масло для предоставления среды переноса тепла между стеклянной стенкой канала термопары и термопарой. Сосуды с образцами помещали в песочную ванну и включали таймер. Данные динамики температуры регистрировали приблизительно каждые 30-60 секунд. После того, как сосуд достигал 102°C при считывании термометра, его выдерживали в песочной ванне в течение 10 секунд. После стадии нагревания и выдерживания сосуды переносили в водяную ванну с комнатной температурой до тех пор, пока считывание температуры термометра не достигало 35°C. После тепловой обработки 15 мл каждого образца перенесли в пузырек для измерения мутности и визуальных измерений.

Измерения преципитации

[0219] Образцы сред анализировали на преципитацию перед и после тепловой обработки двумя способами: 1) мутность посредством турбидиметра (2100Q Hach); и 2) центрифугированием образцов в 50 мл пробирках Falcon при 10000×g в течение 10 минут (Sorvall RC 6 plus, SS-34 rotor) для отстаивания преципитатов с целью визуальной идентификации и количественного определения преципитации на основании размера пеллет (например, невидимый, малый, средний, большой). Нецентрифугированные образцы также анализировали с целью визуальной идентификации преципитации.

Результаты

[0220] Получили несколько составов среды с варьирующими уровнями значений pH, а также концентрациями кальция и фосфата (Таблица 4). Полученную среду оценивали на преципитацию перед и после тепловой обработки посредством визуальных осмотров нецентрифугированных и центрифугированных образцов и посредством измерений мутности.

Таблица 4
Составы сред, тестируемых на преципитацию в методе песочной ванны
Описание среды Фактический pH Намеченный pH Преципитация (да/нет) Мутность (NTU) [Ca] Ммоль [РО4] Ммоль Соотношение [Ca]/[РО4]
Среда 1 (подаваемая, неопределенная по составу) 7,00 7,00 Да 50,7 3,5 3,17 1,10
N/A 6,90 Да N/A 3,5 3,17 1,10
N/A 6,50 Да N/A 3,5 3,17 1,10
6,40 6,40 Нет 1,2 3,5 3,17 1,10
N/A 6,20 Нет N/A 3,5 3,17 1,10
Среда 2† (базовая, неопределенная по составу) 7,00 7,00 Да 100,2 2,1 1,9 1,11
6,68 6,70 Да 37,5 2,1 1,9 1,11
Среда 3 (базовая, определенная по составу) 7,05 7,00 Да 8,3 1,5 3 0,50
Среда 4 (базовая, определенная по составу) N/A 7,20 Да N/A 1,5 3 0,50
7,11 7,10 Да 23,0 1,5 3 0,50
6,93 6,70 Нет 19,11 1,5 3 0,50
6,35 6,30 Нет 2,94 1,5 3 0,50
Среда 5† (базовая, неопределенная по составу) 7,02 7,00 Да 20,5 1,3 2,6 0,5
Среда 6 (базовая, определенная по составу) 7,07 7,10 Нет 1,0 0,42 2,54 0,17

Среда 7 (базовая, определенная по составу) 7,00 7,00 Нет 0,5 0,4 4,15 0,10
Среда 8 (подаваемая, определенная по составу) 7,04 7,00 Нет 0,2 0 30 0
Среда 9 (подаваемая, определенная по составу) 6,90 7,20 Нет 0,2 0 30 0
6,50 6,50 Нет 1,1 0 30 0
Среда 10 (базовая, неопределенная по составу) N/A Да N/A 2,3 2,9 N/A
N/A Да N/A 2,3 2,9 N/A
N/A Да N/A 2,3 2,9 N/A
† = для среды 1, 2, 5, и 10 для оценки концентраций кальция и фосфата не исключено участие гидролизат/пептон
N/A обозначает недоступно

[0221] Измерение преципитации образцов показало, что данные, полученные методом песочной ванны, отражают возможный сценарий общего теплового воздействия относительно операций HTST-обработки, поскольку составы среды 4 и среды 5, которые прежде не показали рабочих проблем в HTST пилотного или промышленного масштаба, в методе песочной ванны показали измеряемую мутность и видимую преципитацию. Посредством метода песочной ванны было определено, что концентрации кальция и фосфата и уровни pH являются компонентами составов сред, которые вносят вклад в значительные изменения среды во время теплового воздействия, составляющего по меньшей мере 102°C. В нескольких составах понижение уровней pH без модификаций концентраций кальция и фосфата приводило к более низкой мутности (Таблица 4). В дополнение, составы без кальция или с низкими концентрациями кальция также не продемонстрировали явлений преципитация и не имели высоких измерений мутности даже при нейтральном pH (Таблица 4). В дополнение к более низким концентрациям кальция и фосфата имелась корреляция между пониженной преципитацией и более низкими соотношениями кальция и фосфата (Таблица 4). Данные наблюдения привели к определению, что образование фосфатнокальциевых преципитатов при нагревании и охлаждении в процессе тепловой обработки представляет собой функцию концентрации кальция, концентрации фосфата и уровней pH.

[0222] Среда 4 была выбрана для полнофакторного дизайна экспериментов (DoE) для мультивариантного анализа термообработанных составов в системе песочной ванны, при этом для генерирования характеристической поверхности преципитации использовали показатель реакции мутности (НЕФ). Варьируемыми переменными были концентрации кальция (от 0,1 до 2,9 ммоль), концентрации фосфата (0,1, 5,9 ммоль) и pH (от 6,0 до 7,2). Отсортированные оценки параметров, которые определяли посредством измерения мутности и подтверждали посредством визуальных наблюдений, идентифицировали, что образование pH-зависимого фосфата кальция при тепловой обработке состава среды, содержащего как кальций, так и фосфат, приводили к преципитации в среде (Фиг. 4). Наиболее выраженным эффектом, влияющим на преципитацию среды, обладает комбинационная составляющая концентрации кальция и фосфата (Фиг. 4). Это согласуется с ожидаемой кинетикой реакции нерастворимых форм фосфата кальция с зависимостью от концентрации как кальция, так и фосфата. В дополнение, оценка мутности за счет составляющей концентраций кальция и фосфата также согласуется с наблюдением, что когда концентрации либо кальция, или фосфата равны нулю, увеличение мутности будет незначительным (в качестве оценки совместимости с HTST).

[0223] В последующем характеристическая поверхность была смоделирована из данных мутности и входных параметров DoE (концентрация кальция, концентрация фосфата и pH). Границу между хорошим и плохим рабочим режимом в наихудшем случае тепловой обработки в песочной ванне выбрали, чтобы мутность составляла 5 НЕФ на основе анализа всех значений мутности относительно видимой преципитации из визуального осмотра центрифугированных и нецентрифугированных термически обработанных образцов сред. Данные предполагают, что были возможными множественные опции или рычаги для модифицирования состава среды, чтобы обеспечить HTST-совместимость. В частности, снижение концентраций кальция, концентраций фосфата, pH или некая комбинация трех параметров все являлись потенциальными рычагами для создания состава среды, совместимого с HTST-обработкой или другими способами тепловой обработки (Фиг. 5).

[0224] На основании смоделированной характеристической поверхности, сгенерированной из данных о подвергшейся тепловой обработке среде 4, стабильность среды в исследованиях тепловой обработки в песочной ванне была особенно зависимой от концентраций кальция и фосфата, а также уровней pH. Для определения модификаций в других составах сред, которые могли бы превращать их из HTST-несовместимых в совместимые среды, другие составы сред, не содержащие гидролизата (среда 3, среда 4, среда 6, среда 7, среда 8, среда 9, среда 11, среда 12 и среда 13) были построены в виде графика модельной характеристической поверхности на основе концентрации в них кальция и фосфата при pH, равном 7,0 (Фиг. 6). Среды, содержащие гидролизаты, добавляли комплексность анализам благодаря вариабельным уровням кальция и фосфата. Среда 11 попала в область характеристической поверхности, которая продемонстрировала, что она была за пределами диапазона преципитации, и вследствие этого было определено, что она, вероятно, является HTST-совместимой (Фиг. 6, точка C). Добавление гидролизата в среду 11 для получения среды 5 (Таблица 4) и на основании известных оценок уровней фосфата и кальция в гидролизате привели к сдвигу среды в диапазон преципитации, и вследствие этого было вероятно, что она является HTST-несовместимой (Фиг. 6, стрелка от точки С). Среда 12 находилась в пределах диапазона преципитации, и на основании модели было спрогнозировано, что добавление гидролизата для получения среды 2 (Таблица 4) должно сдвинуть среду дальше в диапазон преципитации (Фиг. 6, стрелка от точки D). Прогноз попадания или непопадания составов в диапазон преципитации на основании характеристической поверхности модели коррелировал с видимой преципитацией при тепловой обработке в песочной ванне с включением двух составов, которые имели проблемы с загрязнением теплообменников при работе HTST-модуля в производственном масштабе. Использование созданных моделей характеристической поверхности показало, что имелась сильная корреляция преципитации в составе среды для клеточной культуры при тепловой обработке относительно высоких концентраций кальция и фосфата при приблизительно нейтральном pH (Фиг. 5 и 6). Кроме того, модели характеристической поверхности на основании данных песочной ванны могут быть созданы для предоставления рекомендации с целью изменений составов для преобразования HTST-несовместимых сред в HTST-совместимые среды.

[0225] Пример 3: Действие температуры на поведение преципитации среды во время инактивации вирусов.

Материалы и способы

Получение среды

[0226] Среда, используемая в данном исследовании, включает базовую среду для выработки и добавляемую порциями среду. Все среды были получены с использованием очищенной деионизированной воды, пропущенной через систему очистки для получения сверхчистой воды Millipore SuperQ. Среды получали с использованием соответствующих запасов порошка для среды (SAFC и Life Technologies). В процессе приготовления жидкостей применяли стеклянный pH-метрический электрод (Mettler Toledo) и осмометр (Advanced Instruments), чтобы обеспечить намеченный pH и осмоляльность для заданного приготовления. При полном растворении компонентов и установке итоговых pH и осмоляльности, среды отфильтровывали с использованием PES мембранных фильтров с размером пор 0,1 мкм в бутыли, варьирующие от 250 мл до 1 л (Corning) для приготовления в небольших масштабах.

Регулировка pH

[0227] Сдвиг pH скорректировали вследствие насыщения газами, которое происходит в течение времени между завершением получения среды и когда была применена тепловая обработка. Перед тепловой обработкой 30 мл аликвоту из каждого получения среды перенесли в 50 мл пробирки (Falcon), а оригинальные крышки для пробирок Falcon заменили на крышки с отверстием от 250 мл колб Corning Erlenmeyer. Затем пробирки поместили в термостат с покрытием CO2 в течение 30 минут с целью снижения pH (15% CO2 для образцов с pH 6,2 и 12% CO2 для всех других образцов, 200 об/мин, 37°C); данная стадия была способна сдвигать pH ниже намеченного. Во время pH-мониторинга с использованием стеклянного pH-метрического электрода и измерителя (Mettler Toledo) пробирки встряхивали вручную до тех пор, пока pH не опускался назад до намеченного pH. Итоговые измерения pH получили с помощью биопрофайлера NOVA.

Метод песочной ванны

[0228] Для метода песочной ванны 22 мл полученной жидкой среды перенесли в 20 мл стеклянные сосуды высокого давления (Ace glassware). Сосуды закупоривали резьбовой крышкой с каналом для ввода термопары таким образом, чтобы в сосуде не оставалось воздушного пространства за счет полного его заполнения и предоставления возможности для вытеснения избыточной среды посредством крышки и канала для ввода термопары. Наружную часть контейнера очищали для предотвращения загрязнения наружной поверхности средой, непосредственно подвергаемой воздействию матрицы-источника нагревания. Тефлоновую ленту использовали для покрывания границы между краем стеклянного сосуда и резьбовой крышкой для большей герметизации сосуда высокого давления и защиты от попадания песка или масла из канала термопары в образцы для тепловой обработки. Ванну с флюидизированным песком (Techne SBS-4) с контроллером температуры (Techne TC-8D) конфигурировали (давление на впуске сжатого воздуха = 5 фунт/кв. дюйм, температура ванны = 110°C) и обеспечили возможность уравновешивания в течение 30 минут. Термопары, соединенные с единственным VWR цифровым термометром, вставляли в каналы для ввода термопары сосуда образца, расположенного геометрически в центре радиального размера пробирки. В канал термопары добавили силиконовое масло для предоставления среды переноса тепла между стеклянной стенкой канала термопары и термопарой. Сосуды с образцами помещали в песочную ванну и включали таймер. Данные динамики температуры регистрировали приблизительно каждые 30-60 секунд. После того, как сосуд достигал 102°C при считывании термометра, его выдерживали в песочной ванне в течение 10 секунд. После стадии нагревания и выдерживания сосуды переносили в водяную ванну с комнатной температурой до тех пор, пока считывание температуры термометра не достигало 35°C. После тепловой обработки 15 мл каждого образца перенесли в пузырек для измерения мутности и визуальных измерений.

Измерения преципитации

[0229] Образцы сред анализировали на преципитацию перед и после тепловой обработки двумя способами: 1) мутность посредством турбидиметра (2100Q Hach); и 2) центрифугированием образцов в 50 мл пробирках Falcon при 10000×g в течение 10 минут (Sorvall RC 6 plus, SS-34 rotor) для отстаивания преципитатов с целью визуальной идентификации и количественного определения преципитации на основании размера пеллет (например, невидимый, малый, средний, большой). Нецентрифугированные образцы также анализировали с целью визуальной идентификации преципитации.

Результаты

[0230] Действие температуры на преципитацию среды дополнительно исследовали посредством изменения намеченной заданной величины для нагревания в системе песочной ванны. Измерения выполняли при температурах, составляющих приблизительно 75, 85, 90, 97 и 102°C для среды 1 (подаваемой, неопределенной по составу), среды 2 (базовой, неопределенной по составу), среды 4 (базовой, определенной по составу) и среды 10 (базовой, неопределенной по составу), которые все составлены при нейтральном pH 7,0. Визуальный осмотр нецентрифугированных и центрифугированных образцов, выполненный по кривой нагревания, демонстрировал, что во всех четырех различных составах сред имелись явления преципитации к тому моменту, когда образцы достигали 90°C (Фиг. 7, заполненные круги). Среды 4 и 10 продолжали демонстрировать явления преципитации при нижних температурах 85°C и 75°C (Фиг. 7, заполненные круги). Среда 2 демонстрировала явления преципитации при 85°C в процессе тепловой обработки, но не образовывала видимых преципитатов при 75°C, показывая, что среда 2 является совместимой с тепловой обработкой при температуре приблизительно 75°C или менее (Фиг. 7, пустой круг). Среда 1 не образовывала преципитатов при 85°C, показывая, что среда 1 является совместимой с тепловой обработкой при температурах приблизительно 85°C или менее (Фиг. 7, пустой круг). Данные наблюдения получили подтверждения измерениями мутности, которые показали, что все четыре различных состава сред имели измерение мутности, составляющее приблизительно 20 НЕФ или более к тому моменту, когда образцы достигали 90°C (Фиг. 8). Значения мутности сред, подвергнутых тепловой обработке, понижались при движении от 97°C до 102°C для сред 2, 4 и 10 (Фиг. 8). Мутность в среде, подобной раствору, является функцией распределения размера частиц и в частности специфический диапазон размеров коллоидных частиц будет более активным в измерении, чем другие части распределения размеров. Вследствие этого, возможно, что уменьшение измеряемой мутности при самой высокой температуре является результатом поведения флокуляции/аггрегирования частиц, приводящим к изменению в распределении размера частиц, производящих ложное искажение данных мутности (например, увеличенные размеры частиц, но уменьшенные количества). Данные результаты показали, что незначительное уменьшение температуры при поддерживании в то же время инактивации вирусов незначительно уменьшает мутность.

[0231] Температуры свыше от 85°C до 90°C при соответствующем удержании времени для HTST-операций в больших масштабах являются необходимыми для эффективного способа инактивации вирусов, а температуры, превышающие 95°C, являются необходимыми для достижения необходимого логарифмического уменьшения для парвовирусов, имеющих значение в промышленном аспекте. Хотя метод песочной ванны является более жестким для наблюдений за явлениями преципитации среды, происходящей в тепловой обработке, данные предполагают работу при пониженной, чем существующая в настоящее время намеченная заданная величина HTST-обработки, составляющая 102°C, что может использоваться для того, чтобы избежать явлений преципитации, которые приводят к загрязнению теплообменников. Поскольку цель HTST-обработки заключается в инактивации вирусов, является очевидным, что уменьшение намеченной заданной величины температуры не является опцией и что для нескольких составов сред преципитация является потенциальной рабочей проблемой для HTST-вариантов применения среды. Вследствие этого, концентрации кальция и фосфата, а также уровни pH являются компонентами, которые можно регулировать для уменьшения или предотвращения явлений преципитации во время инактивации вирусов в среде посредством HTST-обработки при температурах, составляющих по меньшей мере 90°C.

[0232] Пример 4: уровни pH, кальция и фосфата вносят вклад в преципитацию в среде в пилотном и промышленном масштабе HTST-обработки среды с целью инактивации вирусов.

Материалы и способы

HTST в пилотном масштабе

[0233] Для исследований с использованием пилотных масштабов HTST составы сред были обработаны от наиболее низкой концентрации до самых высоких концентраций кальция или фосфата для того, чтобы минимизировать возможный осадок на фильтре для последующих производственных циклов. Для каждого HTST-цикла требовалось от 15 л до 20 л среды для промывания деионизированной промывочной водой, используемой между циклами, и для уравновешивания нагревательной спирали до рабочей температуры, составляющей 102°C (приемлемый диапазон: 97°C-110°C) для HTST-процесса. После уравновешивания, приблизительно 20 л среды пропускали через HTST-модуль, и выходной проток собирали в пластмассовый кубический контейнер. Образцы собирали из среды перед HTST-обработкой из резервуара для перемешивания среды и выходной среды в кубический контейнер и фильтровали через 0,1 мкм PVDF капсульный мембранный фильтр (Millipore) в пакет для хранения среды для использования в качестве образцов «Pre-HTST» и «После HTST». Все обработанные и необработанные отфильтрованные образцы сред затем хранили при 2-8°C перед использованием для анализов эффективности культивирования клеток и аналитических тестов.

HTST в промышленном масштабе

[0234] 1800 л препарата среды 4 или среды 1 использовали для крупномасштабного технического цикла для тепловой обработки среды с помощью HTST-модуля промышленного масштаба. Цель данного получения среды состояла в определении: 1) являлись ли условия промышленного перемешивания среды 4 достаточными для соответствия заданным периодам рецептурного перемешивания с целью контроля качества, и 2) в генерировании данных эффективности HTST-обработки в промышленном масштабе со средой 4. Образцы сред перед и после HTST-обработки собирали посредством асептического соединения 6x20-L манифольдов с пакетами для среды (Sartorius Stedim Biotech) с отверстиями для отбора образцов в резервуаре для перемешивания среды и биореактором назначения. Для образцов, взятых перед HTST-обработкой, перед сбором среду фильтровали через 0,1 мкм PVDF капсульный мембранный фильтр (Millipore), а для образцов, взятых после HTST, перед сбором среда проходила через промышленный фильтровальный тракт, который состоит из PVDF предварительного фильтра 0,5/0,2 мкм с фильтром с двухслойным картриджем (Millipore) и 0,1 мкм нейлонного итогового фильтра (Pall). Затем образцы использовали для анализов эффективности клеточной культуры и аналитических тестов.

Результаты

[0235] Для HTST-операций как в пилотном, так и в промышленном масштабе, не было явлений в процессе выполнения, приводящих к прекращению работы HTST-модуля или к трудностям в регулировании выходной температуры при обработке необходимых объемов среды 4. Вследствие этого, не было указания на явления преципитации достаточно значительные, чтобы приводить к загрязнению поверхностей теплообменника или последующей фильтрации. Обработанная в пилотном масштабе среда 4 визуально не содержала частиц перед заключительной фильтрацией и использованием в клеточной культуре. Из обработанной в промышленном масштабе среды 4 нельзя было отобрать образцы перед заключительной фильтрацией вследствие расположения отверстий для взятия образцов для системы. Аналитическое тестирование и тестирование эффективности культивирования клеток проводили на среде 4 с HTST-обработкой и без нее. Аналитические тесты для среды 4 показали, что потери металлов, содержащихся в следовых количествах, происходили при HTST-обработке с предположением, что происходили явления преципитации, которые изменяют концентрации составов сред, не приводя к достаточной преципитации для рабочих трудностей в процессе HTST-обработки. Для HTST-обработки в промышленном масштабе среды 4, данные из анализов масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS) и оптической эмиссионной спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (ICP-OES) показали 24% потерю Fe (железа) и 16% потерю Cu (меди) при тепловой обработке относительно среды 4 без тепловой обработки (Фиг. 9).

[0236] Для HTST-операций как в пилотном, так и в промышленном масштабе, имелись явления в процессе выполнения, приводившие к прекращению работы HTST-модуля и трудностям в регулировании выходной температуры при обработке необходимых объемов среды 1 с pH 7,10. Явления преципитации были достаточно значительные, чтобы приводить к загрязнению поверхностей теплообменника. Обработанная в пилотном масштабе среда 1 имела частицы перед заключительной фильтрацией и использованием в клеточной культуре. Из обработанной в промышленном масштабе среды 1 нельзя было отобрать образцы перед заключительной фильтрацией вследствие расположения отверстий для взятия образцов для системы. Доведение pH в среде 1 до pH приблизительно 6,34 уменьшало преципитацию. Для HTST-операций как в пилотном, так и в промышленном масштабе, не было явлений в процессе выполнения, приводящих к прекращению работы HTST-модуля или трудностям в регулировании заданной величины выходной температуры, при обработке необходимых объемов среды 1 с pH 6,34. Вследствие этого, не было указания на явления преципитации достаточно значительные, чтобы приводить к загрязнению поверхностей теплообменника. Обработанная в пилотном масштабе среда 1 визуально не содержала частиц перед заключительной фильтрацией и использованием в клеточной культуре. Из обработанной в промышленном масштабе среды 1 нельзя было отобрать образцы перед заключительной фильтрацией вследствие расположения отверстий для взятия образцов для системы.

[0237] Пример 5: уровни pH, кальция и фосфата принимают участие в потере металлов, содержащихся в следовых количествах, в среде в процессе тепловой обработки с целью инактивации вирусов.

Материалы и способы

Получение среды

[0238] Среда, используемая в данном исследовании, включает базовую среду для выработки и добавляемую порциями среду с уровнями pH, колеблющимися от приблизительно pH 5,9 до приблизительно pH 7,5, с диапазонами концентрации кальция от приблизительно 0 ммоль до приблизительно 3,5 ммоль (или более в средах неопределенного химического состава) и с диапазонами концентрации фосфата от приблизительно 0 ммоль до приблизительно 6,5 ммоль (или более в средах неопределенного химического состава) и с диапазонами концентрации железа от приблизительно 0 мкмоль до приблизительно 125 мкмоль (или более в средах неопределенного химического состава). Все среды были получены с использованием очищенной деионизированной воды, пропущенной через систему очистки для получения сверхчистой воды Millipore SuperQ. Среды были получены с использованием соответствующих запасов порошка для среды (SAFC и Life Technologies). В процессе приготовления жидкостей применяли стеклянный pH-метрический электрод (Mettler Toledo) и осмометр (Advanced Instruments), чтобы обеспечить намеченный pH и осмоляльность для заданного приготовления. При полном растворении компонентов и установке итоговых pH и осмоляльности, среды отфильтровывали с использованием PES мембранных фильтров с размером пор 0,1 мкм в бутыли, варьирующие от 250 мл до 1 л (Corning) для приготовления в небольших масштабах.

Регулировка pH

[0239] Скорректировали сдвиг pH вследствие насыщения газами, которое происходит в течение времени между завершением получения среды и когда была применена тепловая обработка. Перед тепловой обработкой 30 мл аликвоты из каждого получения среды перенесли в 50 мл пробирки (Falcon), а оригинальные крышки для пробирок Falcon заменили на крышки с отверстием от 250 мл колб Corning Erlenmeyer. Затем пробирки поместили в термостат с покрытием CO2 в течение 30 минут с целью снижения pH (15% CO2 для образцов с pH 6,2 и 12% CO2 для всех других образцов, 200 об/мин, 37°C); данная стадия была способна сдвигать pH ниже намеченного. Во время pH-мониторинга с использованием стеклянного pH-метрического электрода и измерителя (Mettler Toledo) пробирки встряхивали вручную до тех пор, пока pH не опускался назад до намеченного pH. Итоговые измерения pH получили с помощью биопрофайлера NOVA.

Метод песочной ванны

[0240] Для метода песочной ванны 22 мл полученной жидкой среды перенесли в 20 мл стеклянные сосуды высокого давления (Ace glassware). Сосуды закупоривали резьбовой крышкой с каналом для ввода термопары таким образом, чтобы в сосуде не оставалось воздушного пространства за счет полного его заполнения и предоставления возможности для вытеснения избыточной среды посредством крышки и канала для ввода термопары. Наружную часть контейнера очищали для предотвращения загрязнения наружной поверхности средой, непосредственно подвергаемой воздействию матрицы-источника нагревания. Тефлоновую ленту использовали для покрывания границы между краем стеклянного сосуда и резьбовой крышкой для большей герметизации сосуда высокого давления и защиты от попадания песка или масла из канала термопары в образцы для тепловой обработки. Ванну с флюидизированным песком (Techne SBS-4) с контроллером температуры (Techne TC-8D) конфигурировали (давление на впуске сжатого воздуха = 5 фунт/кв. дюйм, температура ванны = 110°C) и обеспечили возможность уравновешивания в течение 30 минут. Термопары, соединенные с единственным VWR цифровым термометром, вставляли каналы для ввода термопары сосуда образца, расположенного геометрически в центре радиального размера пробирки. В канал термопары добавили силиконовое масло для предоставления среды переноса тепла между стеклянной стенкой канала термопары и термопарой. Сосуды с образцами помещали в песочную ванну и включали таймер. Данные динамики температуры регистрировали приблизительно каждые 30-60 секунд. После того, как сосуд достигал 102°C при считывании термометра, его выдерживали в песочной ванне в течение 10 секунд. После стадии нагревания и выдерживания сосуды переносили в водяную ванну с комнатной температурой до тех пор, пока считывание температуры термометра не достигало 35°C. После тепловой обработки 15 мл каждого образца перенесли в пузырек для измерения мутности и визуальных измерений.

HTST в пилотном масштабе

[0241] Для исследований с использованием пилотных масштабов HTST составы сред были обработаны от наиболее низкой концентрации до самых высоких концентраций кальция или фосфата для того, чтобы минимизировать возможный осадок на фильтре для последующих производственных циклов. Для каждого HTST-цикла требовалось от 15 л до 20 л среды для промывания деионизированной промывочной водой, используемой между циклами, и для уравновешивания нагревательной спирали до рабочей температуры, составляющей 102°C (приемлемый диапазон: 97°C-110°C) для HTST-процесса. После уравновешивания, приблизительно 20 л среды пропускали через HTST-модуль, и выходной проток собирали в пластмассовый кубический контейнер. Образцы собирали из среды перед HTST-обработкой из резервуара для перемешивания среды и выходной среды в кубический контейнер и фильтровали через 0,1 мкм PVDF капсульный мембранный фильтр (Millipore) в пакет для хранения среды для использования в качестве образцов «Pre-HTST» и «После HTST». Все обработанные и необработанные отфильтрованные образцы сред затем хранили при 2-8°C перед использованием для анализов эффективности культивирования клеток и аналитических тестов.

HTST в промышленном масштабе

[0242] Получение среды 4 во время 1800-литрового производственного цикла выполняли для операции выработки антител и для обработки среды использовали HTST-модуль U1281 промышленного масштаба. Целью данного получения среды было определение: 1) являлись ли условия среды 4 достаточными для соответствия указанным рецептурным периодам перемешивания и 2) сгенерировать данные эффективности HTST-обработки в промышленном масштабе со средой 4. Образцы сред перед и после HTST-обработки собирали посредством асептического соединения 6x20-L манифольдов с пакетами для среды (Sartorius Stedim Biotech) с отверстиями для отбора образцов в резервуаре для перемешивания среды и биореактором назначения. Для образцов, взятых перед HTST-обработкой, перед сбором среду фильтровали через 0,1 мкм PVDF капсульный мембранный фильтр (Millipore), а для образцов, взятых после HTST, перед сбором среда проходила через GMP фильтровальный тракт, который состоит из PVDF предварительного фильтра 0,5/0,2 мкм с фильтром с двухслойным картриджем (Millipore) и 0,1 мкм нейлонного итогового фильтра (Pall). Затем образцы использовали для анализов эффективности клеточной культуры и аналитических тестов.

Измерения преципитации

[0243] Образцы сред анализировали на преципитацию перед и после тепловой обработки двумя способами: 1) мутность посредством турбидиметра (2100Q Hach); и 2) центрифугированием образцов в 50 мл пробирках Falcon при 10000xg в течение 10 минут (Sorvall RC 6 plus, SS-34 rotor) для отстаивания преципитатов с целью визуальной идентификации и количественного определения преципитации на основании размера пеллет (например, невидимый, малый, средний, большой). Нецентрифугированные образцы также анализировали с целью визуальной идентификации преципитации.

Анализ изменений концентраций компонентов среды

[0244] Для скрининга каких-либо значительных изменений измеримых концентраций компонентов среды исследовали содержимое супернатанта перед и после HTST-обработки. Используемые исследования включали: измерение водорастворимых витамин, измерение аминокислот и измерение неорганического фосфата. Присутствующие в небольших количествах элементы анализировали, используя два различных анализа масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS). В дополнение, образцы для железа, меди и цинка измеряли посредством анализа оптической эмиссионной спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (ICP-OES) с целью количественного определения более высокой выработки данных элементов. При возможности применения все статистические анализы были проведены, а графики построены с использованием программного обеспечения JMP и Excel.

Результаты

[0245] Для того, чтобы лучше понять потери металлов, содержащихся в следовых количествах, происходящие при более крупных промышленных масштабах, провели исследование в песочной ванне с использованием среды 4 в качестве модельного состава среды. Для определения, были ли потери металлов, содержащихся в следовых количествах, связанные с явлениями преципитации фосфата кальция в среде содержащей данные компоненты и обработанной при нейтральном или более высоком pH, сгенерировали план полуреплики факторного эксперимента для оценки воздействия изменения pH, кальция (Ca), неорганического фосфата (РО4), железа (Fe) и меди (Cu) на уровни восстановленного Fe и Cu после тепловой обработки (Таблица 5).

Таблица 5
Концентрации тестируемых компонентов
Факторы Концентрации
pH 5,9-7,5
Ca (ммоль) 0-3,5
РО4 (ммоль) 0-6,5
Fe (мкмоль) 0-125
Cu (нмоль) 0-1750
Примечание: за исключением факторов, приведенных выше, другие компоненты в среде 4 имели нормальные уровни.

[0246] Анализ восстановления металлов, содержащихся в следовых количествах, продемонстрировали, что высокие уровни pH, Ca и РО4 были основными факторами, ответственными за потери Fe (Фиг.10). Повышенные уровни любого из данных трех факторов приводит к более низкому восстановлению Fe. Первоначальные концентрации Fe показывают аналогичные, но менее выраженное основное воздействие по сравнению с pH, Ca и РО4, тогда как Cu фактически не показывает влияние на восстановление Fe. Важность pH, Ca и РО4 согласуется с возможностью, что потери Fe связаны с явлениями преципитации фосфата кальция, которые не могут быть замеченными в рабочем ракурсе (например, недостаточно значительные, чтобы вызывать рабочие проблемы HTST-модуля), но заметные с точки зрения неблагоприятных эффектов эффективности клеточных культуральных сред (например, титр продукта, клеточный рост, жизнеспособность клеток и качество продуктов).

[0247] Для того, чтобы объяснить отклонение или распределение графиков основных эффектов, из данных использующих четыре наиболее сильных фактора (pH, Ca, РО4 и Fe) сгенерировали полнофакторную модель. Графики взаимодействия из данного анализа демонстрируют два эффекта взаимодействия, которые влияют на восстановление Fe после тепловой обработки: 1) pH*Ca и 2) pH*РО4 (Фиг. 11). Данные результаты предполагают, что уменьшение концентраций кальция и фосфата, понижение уровней pH, или понижение некоторой комбинации трех данных факторов необходимы для того, чтобы составы сред, в которых при тепловой обработке избегают потерь Fe. В дополнение, эти данные демонстрируют, что потеря Fe происходит, даже когда не наблюдается видимая преципитация и повышенная мутность.

[0248] Среду с уровнями сульфата железа, колеблющимися от 75-150 мкм (но все другое эквивалентно Среде 4) тестировали для определения степени, в которой уровни Fe после HTST являлись функцией первоначальных уровней Fe. Данные показывают неожиданную нелинейную взаимосвязь между первоначальной концентрацией Fe и концентрацией Fe после HTST (Фиг. 12). Однако было обнаружено, что 125 мкм образец Fe испытал сдвиг pH относительно трех других образцов. В обоих наборах образцов, 125 мкм образец Fe имел самый высокий pH перед HTST-тестированием. pH колебался от 7,08 до 7,17 и от 7,09 до 7,14 для наборов образцов для Анализа 1 и Анализа 2.

[0249] Результаты эксперимента DoE предполагали, что среда при pH 7,0 была близка к неудаче в системе тепловой обработки в песочной ванне и что потеря Fe начинает происходить выше pH 6,7. Получение среды 4 с уровнями pH, колеблющимися от 6,6 до 7,2, тестировали для получения характеристики данного режима. Подтверждение, что любой сдвиг pH (даже настолько маленький, как доля единицы pH) может быть значительным в системе тепловой обработке в песочной ванне, было показано в данных титрования pH высокого разрешения (Фиг. 13A). После pH 6,8, восстановление Fe было высоко чувствительным к pH, быстро падая и достигая плато при pH 7,2. такая острая pH-зависимость предполагала, что результаты титрования сульфата железа, наиболее вероятно, были искажены изменчивостью pH. Это также предполагает, что очень малое изменение pH (т.е. 0,2 единицы pH) может ввести составы среды в режим, где не происходит потерь Fe.

[0250] Результаты эксперимента DoE также предположили, что могут быть получены большие улучшения в восстановлении Fe с относительно небольшими изменениями уровней Ca и РО4 (Фиг. 13B). Получение среды 4 с уровнями Ca и РО4, колеблющихся от 0,5-1,17x стандартных уровней Среды 4 тестировали на более хорошее количественное определение изменений Ca и РО4, которое потребовалось бы для получения наблюдаемого ранее преимущества. Для данного титрования, соотношение уровней Ca и РО4 поддерживали постоянным при 0,5. Графический анализ данных продемонстрировал кривой профиль, при этом увеличение потерь Fe коррелировало с повышением уровней Ca и РО4 (Фиг. 13B). Состав среды 4 находится на крутой части наклона, где большие улучшения восстановления Fe возможны с небольшими изменениями концентраций Ca и РО4. Например, уменьшение концентраций Ca и РО4 на 30% (и сохранение соотношения таким же) может давать тепловую обработку в песочной ванне со 100% восстановлением Fe, которую можно транслировать на HTST-обработку.

[0251] Если бы потери металлов, содержащихся в следовых количествах, коррелировали с преципитацией фосфата кальция, возникала бы связь восстановления кальция и фосфата с восстановлением Fe. Данные анализа продемонстрировали, что восстановление фосфата не образует четкую связь с восстановлением Fe, при этом восстановление Fe было низким, а преципитация была идентифицирована (Фиг. 14, ромбы внутри круга). Возможно, что выявление небольших различий в концентрации в образце с относительно высокой начальной концентрацией фосфата было трудным вследствие отношения сигнала к помехе. Связывая это с возможностью, что фосфат кальция взаимодействовал с железом, относительно небольшое количество фосфата можно было бы удалить стехиометрическим составом с железом 1:1 и было бы трудно выявить потерю фосфата. Еще одна потенциальная причина может быть связана с тем фактом, что анализ выявляет только конкретные формы неорганического фосфата. Восстановление кальция происходило в диапазоне 60-80%, и было похоже на линейную связь с восстановлением Fe в диапазоне, составляющем 10-30%, при этом восстановление Fe было низким, и была идентифицирована преципитация (Фиг. 14, квадраты в круге). Анализ данного подмножества регрессией наименьших квадратов продемонстрировал, что 69% колебаний восстановления Ca могло объясняться восстановлением Fe. Эти данные показывает, что Fe непосредственно связано с восстановлением Ca.

[0252] Также были проведены циклы HTST-обработки в пилотном масштабе и в промышленном масштабе для среды 4 (и вариантов среды 4) и среды 9. Данные собрали из циклов аналитических исследований и для исследований эффективности клеточной культуры для оценки влияния HTST-обработки на эффективность клеточной культуры и качество продукта. Из аналитических тестов не было идентифицировано никаких значительных потерь любых компонентов, за исключением железа и меди. В дополнение, не наблюдалось никаких значительных изменений в ключевых параметрах эффективности клеточной культуры (титр, рост, жизнеспособность), или качества продукта (включая основные варианты). Потеря меди не приводила к изменениям эффективности клеточной культуры или уровней основных вариантов, потому что потери не были достаточно большими, чтобы устранить изменения в линии клеток-хозяев, используемых для тестирования на основе титрований меди для данной линии клеток. Вследствие относительно маленьких количеств металлов, содержащихся в следовых количествах, наподобие железа и меди (75 мкм и 1 мкм, соответственно) по сравнению с кальцием и фосфатом (1,5 мМ и 3 мМ, соответственно) в составах среды 4, стало возможно, что образовались очень маленькие фосфатно-кальциевые (комплексы CaPO4) преципитаты, которые не приводили к значительному загрязнению теплообменников, но которые могли взаимодействовать с железом и медью, присутствующими в жидкой среде. Данные взаимодействия комплексов CaPO4 могут некоторым образом образовывать хелатные соединения железа и меди для того, чтобы изолировать их от жидкой среды и отложить их где-нибудь в пределах протекания процесса, наряду с осаждающимися комплексами CaPO4. Независимо от механизма, остается факт, что при HTST-обработке среды наблюдаются потери железа и меди, в том числе, когда среду успешно обрабатывают для инактивации вирусов. Уменьшения концентрации железа и меди при HTST-обработке может отрицательно влиять на успешное использование HTST-обработанной среды в последующей фазе выработки, если потери являются значительными относительно требуемых концентраций железа и меди для фазы выработки.

[0253] Циклы HTST-обработки в пилотном масштабе и в промышленном масштабе проводили для семи различных составов среды. Уровни железа в составе среды измеряли перед HTST-обработкой и определяли ожидаемые уровни железа после HTST-обработки. Анализ уровней железа в среде после HTST-обработки (после HTST) продемонстрировал, что HTST-обработка приводила к потере уровней железа. Потеря железа составляла 44% в среде 14, 42% в среде 15, 20% в среде 16, 1,3% в среде 17 и 42% в среде 18 (Фиг. 15). Среду 19 и среду 20 после HTST-обработки дополняли железом.

[0254] Анализировали рост NS0 клеток, клеточной линии миеломы мышей, в клеточной культуральной среде, которая была подвергнута HTST-обработке и была дополнена железом. Анализ клеточного роста продемонстрировал, что клетки, выращиваемые в клеточной культуральной среде, не обработанной посредством HTST, которая была либо дополнена, либо не дополнена железом, росли в сравнимых количествах с течением времени (Фиг. 16). Для сравнения клетки росли в более низких количествах, при культивировании в среде, обработанной HTST и не дополненной железом. Добавление железа в HTST обработанную клеточную культуру обеспечило возможность восстановления клеточного роста до более высоких уровней по сравнению с клеточными культуральными средами, не обработанными с помощью HTST (Фиг. 16).

[0255] В общем, эти данные продемонстрировали, что потери Fe коррелировали с уровнями кальция, фосфата и pH, предполагая тесную взаимосвязь между потерями металла, содержащегося в следовых количествах, и явлениями преципитации фосфата кальция в процессе тепловой обработки, включая те явления, которые не обязательно выявляются в качестве видимых преципитатов, значительных изменений мутности или рабочих проблем. Потеря металлов, содержащихся в следовых количествах, таких как Fe, может пагубно влиять на эффективность культивирования клеток в различных клеточных линиях и качество продуктов.

1. Способ уменьшения преципитации в клеточной культуральной среде, содержащей кальций и фосфат, в то время как среда сохраняет пригодность для культивирования клеток, причем указанный способ включает (a) регулировку рН, ограничение общего количества кальция и/или ограничение общего количества фосфата в клеточной культуральной среде до проведения кратковременной высокотемпературной (HTST) обработки так, что подавляется формирование комплексов, состоящих из кальция и фосфата; и (b) подвергание клеточной культуральной среды кратковременной высокотемпературной (HTST) обработке, причем клеточная культуральная среда содержит:

(i) фосфат в концентрации от 0 мМ до 4,5 мМ и кальций в концентрации от 0 мМ до 0,5 мМ;

(ii) фосфат в концентрации от 0 мМ до 1 мМ и кальций в концентрации от 0 мМ до 2,75 мМ;

(iii) фосфат в концентрации от 1 до 3 мМ и кальций в концентрации от 0 до 1 мМ;

(iv) фосфат в концентрации от 2 до 2,5 мМ и кальций в концентрации от 0 до 1,5 мМ;

(v) фосфат в концентрации от 1 до 2 мМ и pH от 6,4 до 6,9;

(vi) фосфат в концентрации от 0 до 1 мМ и pH от 6,4 до 7,2;

(vii) фосфат в концентрации от 0 мМ до 0,5 мМ и pH от 6,4 до 7,4;

(viii) фосфат в концентрации от 0 мМ до 3 мМ и pH от 6,4 до 6,7;

(ix) кальций в концентрации от 0 до 1 мМ и pH от 6,4 до 6,9;

(x) кальций в концентрации от 1 до 2 мМ и pH от 5,4 до 6,5;

(xi) кальций в концентрации от 0 мМ до 0,5 мМ и pH от 6,4 до 7,2;

(xii) кальций в концентрации от 0 мМ до 1,3 мМ и pH от 6,4 до 6,7; или

(xiii) pH от 5,0 до 6,9 и общее количество кальция и фосфата менее 10 мМ.

2. Способ по п.1, дополнительно включающий регулирование концентраций металлов, содержащихся в следовых количествах, в котором металлы, содержащиеся в следовых количествах, выбирают из группы, состоящей из железа и меди.

3. Способ по п.2, в котором перед HTST-обработкой в среде регулируют концентрации железа и/или меди.

4. Способ по п.3, в котором перед HTST-обработкой из среды удаляют железо и/или медь.

5. Способ по п.3, дополнительно включающий добавление железа и/или меди в среду вслед за HTST-обработкой до уровня, подходящего для клеточной культуры.

6. Способ по п.1, в котором pH регулируют до HTST-обработки, когда среда содержит кальций и фосфат.

7. Способ по п.6, в котором pH регулируют до HTST-обработки до менее чем приблизительно 7,2.

8. Способ по п.7, в котором pH регулируют до HTST-обработки до приблизительно от 5,0 до 7,2.

9. Способ по п.8, в котором pH регулируют до рН от 5,0 до 6,9 до HTST-обработки.

10. Способ по п.9, в котором pH регулируют до рН от 5,2 до 6,7 до HTST-обработки.

11. Способ по п.1, в котором pH регулируют до приблизительно от 6,9 до 7,2 после HTST-обработки.

12. Способ по п.1, в котором уровень кальция регулируют до HTST-обработки, когда среда содержит фосфат.

13. Способ по п.12, в котором уровень кальция уменьшают до HTST-обработки.

14. Способ по п.1, в котором перед HTST-обработкой из среды удаляют кальций.

15. Способ по п.13, в котором концентрация кальция составляет менее 4 мМ перед HTST-обработкой.

16. Способ по п.15, в котором концентрация кальция составляет менее 2 мМ перед HTST-обработкой.

17. Способ по п.1, в котором уровень фосфата регулируют до HTST-обработки, когда среда содержит кальций.

18. Способ по п.17, в котором концентрация фосфата составляет менее 4 мМ перед HTST-обработкой.

19. Способ по п.18, в котором концентрация фосфата составляет менее 2 мМ перед HTST-обработкой.

20. Способ по п.1, в котором уровень фосфата уменьшают до HTST-обработки.

21. Способ по п.20, в котором перед HTST-обработкой из среды удаляют фосфат.

22. Способ по п.1, в котором общая концентрация фосфата и кальция в среде составляет менее чем приблизительно 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 мМ во время HTST-обработки.

23. Способ по п.1, в котором до HTST-обработки регулируют уровни кальция и фосфата.

24. Способ по п.1, в котором до HTST-обработки регулируют уровни pH, кальция и фосфата.

25. Способ по п.1, в котором HTST-обработка включает повышение температуры среды по меньшей мере до приблизительно 85 градусов по Цельсию на протяжении продолжительности времени, достаточной для инактивации вирусов или занесенных агентов в среде.

26. Способ по п.25, в котором температуру среды повышают по меньшей мере до приблизительно 93, 95, 97, 99, 101, 102 или 103 градусов по Цельсию на протяжении продолжительности времени, достаточной для инактивации вирусов в среде.

27. Способ по п.26, в котором температуру повышают в течение по меньшей мере приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 секунд.

28. Способ по п.26, в котором температуру повышают в течение от приблизительно 1 до приблизительно 18 секунд.

29. Способ по п.26, в котором температуру повышают в течение от приблизительно 1 до приблизительно 60 секунд.

30. Способ по п.26, в котором температуру повышают до 102 градусов Цельсия в течение 10 секунд.

31. Способ по п.1, в котором вирус выбирают из группы, состоящей из парвовирусов, парамиоксивирусов, ортомиксовирусов, буньявирусов, рабдовирусов, реовирусов, тогавирусов, кальцивирусов и пикорнавирусов.

32. Способ по п.1, в котором вирусом является вирус в оболочке.

33. Способ по п.1, в котором вирусом является вирус без оболочки.

34. Способ по п.1, в котором клеточная культуральная среда представляет собой культуральную среду для клеток млекопитающих.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение относится к вирусоподобной частице (ВПЧ) вируса гриппа, предназначенной для создания антигриппозной вакцины, построенной из белков вируса гриппа: гемагглютинина, нейраминидазы и матриксного белка M1, где белки нейраминидазы и матриксного белка M1 являются белками штамма A/California/04/2009, а гемагглютинина - штамма A/California/04/2009, A/Michigan/45/2015(H1N1), A/Novosibirsk/01/2014, A/HongKong/4801/2014(H3N2), B/Phuket/3073/2013 или B/Brisbane/60/2008, a также к способу ее получения.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно генной инженерии. Предложена рекомбинантная вакцина для профилактики папилломавирусной инфекции человека и способ ее получения.

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются живого аттенуированного рекомбинантного герпесвируса кои (KHV), вектора экспрессии, включающего геном такого вируса, выделенной клетки, вакцины, способа профилактики у рыбы заболевания, вызываемого KHV, и иммуногенной композиции.

Предложенное изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ индукции иммунного ответа у индивидуума на чужеродный белковый антиген.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается нового штамма вируса ящура Aphtae epizooticae типа О сем. Picornaviridae, рода Aphtovirus, депонированного в коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером штамм ВЯ О №2311/Забайкальский/2016 (производственный), (контрольный КРС - К-КРС), (контрольный свиной - К-СВ).
Изобретения касаются модифицированной клетки СНО и способа размножения ортопоксвируса при ее использовании. Представленная клетка модифицирована таким образом, чтобы включать последовательность, кодирующую CP77 под контролем конститутивного промотора, и последовательность, кодирующую D13L и/или K1L также под контролем конститутивного промотора.

Предложенная группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены способы получения вирусоподобной частицы вируса бешенства (VLP) в растении или части растения, вирусоподобные частицы (VLP), полученные с их помощью, композиция, содержащая указанные вирусоподобные частицы (VLP), и способ индукции иммунитета к инфекции, вызванной вирусом бешенства.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложены рекомбинантный полипептид гемагглютинин (НА) вируса гриппа для вызова иммунного ответа на вирус гриппа H3N2, молекула нуклеиновой кислоты, его кодирующая, и вектор экспрессии, слитый белок и вирусоподобная частица (VLP), содержащие указанный полипептид НА, и выделенная клетка для выработки и экспрессии указанной VLP, а также композиция, содержащая указанные полипептид, VLP и слитый белок, и способ вызова иммунного ответа в отношении вируса гриппа H3N2.

Изобретения относятся к выделению экспрессированных бакуловирусами вирусоподобных частиц (VLP)безоболочечных вирусов из клеток насекомых и касаются способа выделения экспрессированных бакуловирусом VLP цирковируса свиней 2-го типа (PCV2) в клетках насекомых и способа получения экспрессированных бакуловирусами VLP PCV2.

Группа изобретений относится к биотехнологии и медицине. Предложены химерная вирусоподобная частица (VLP) папилломавируса человека (HPV), способ ее получения и извлечения, способы профилактики или лечения инфекции HPV или рака шейки матк, и индукции иммунного ответа у пациента, включающие введение предложенной HPV VLP, а также применение предложенной HPV VLP в указанных способах и в получении лекарственных средств для осуществления указанных способов.
Изобретение относится к области биохимии, в частности к композиционному материалу для замещения костных дефектов, состоящему из смеси гранулированного остеопластического материала Bio-Oss и мезенхимальных стволовых клеток пациента, имбибированных мезенхимальными стволовыми клетками, культивированными из прикрепленной десны пациента.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к химерным антигенным рецепторам (CAR), и может быть использовано в медицине для лечения заболевания плазматических клеток, которые характеризуются экспрессией антигена созревания B-клеток (BCMA) и рецептора трансмембранного активатора, модулятора кальция и активатора лиганда циклофилина (TACI).

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой культуральную среду для выращивания субстратзависимых клеток, содержащую аминокислоты: L-аргинин; L-цистин; L-цистеин; L-глютамин; глицин; L-гистидин; L-изолейцин; L-лейцин; L-лизин; L-метионин; L-фенилаланин; L-серин; L-треонин; L-триптофан; L-тирозин; L-валин; L-аланин; L-аспарагин, L-аспарагиновая кислота; L-глютаминовая кислота; L-пролин и L-таурин; витамины: D-кальций пантотенат; холина хлорид; фолиевая кислота; I-инозитол; ниацинамид; пиридоксаль; рибофлавин; тиамин; d-биотин; пиридоксин и витамин B12 (цианокобаламин); соли: кальция хлорид; калия хлорид; магнезии сульфат; натрия хлорид и одну или несколько солей натрия фосфата; один или несколько дополнительных микроэлементов, сульфат меди и сульфат цинка, путресцин, стабилизатор и/или противовспенивающий агент, глюкозу или натрия пируват.

Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, а именно к получению клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток и увеличению выхода β-клеток.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложен иммортализованный альвеолярный макрофаг свиней (PAM) для репликации вируса PRRS.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Раскрыт способ скрининга веществ, обладающих противовоспалительной активностью, включающий смешивание исследуемого вещества с фиксированным количеством человеческого ФНО-альфа и добавление этой смеси к культуре клеток хондрального ряда с последующим измерением экспрессии биологического маркера.

Изобретение относится к медицине, а именно к гепатологии, и может быть использовано для поддержания функционального состояния цирротически измененной печени у пациентов в листе ожидания трансплантации органа.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению противоопухолевых пептидных вакцин, и может быть использовано в медицине для лечения или профилактики злокачественных опухолей, сопровождающихся повышенной экспрессией гена WT1.
Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ определения степени раздражающего действия дезинфекционных средств на кожу человека, заключающийся в том, что культуру клеток Chang conjunctiva рассеивают на 96-луночную панель по 100 мкл в каждую лунку в концентрации 1×105 клеток/мл в питательной среде Игла-MEM с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС).

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен биореактор для культивирования мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток (ММСК).

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к подготовке аутологичных моноцитов человека для терапии ожоговых ран. Способ включает выделение моноцитов венозной крови методами градиентного центрифугирования (на градиенте фиколла и двойном градиенте перколла). Затем осуществляют стимулирование 100 мкМ негидролизуемого аналога аденозина 5’-N-этилкарбоксамидоаденозном в присутствии 20 нг/мл IL-4 и 20 нг/мл GM-CSF, культивирование в течение 72 ч в CO2-инкубаторе во влажной атмосфере 5% CO2 при +37°C, после чего замораживают в бессывороточной среде Bambanker с последующим хранением 24 ч при температуре -80˚С и далее в жидком азоте при -196°С. Изобретение позволяет расширить арсенал средств. 5 ил., 1 пр.

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии. Предложен способ уменьшения преципитации в клеточной культуральной среде, содержащей кальций и фосфат, в то время как среда сохраняет пригодность для культивирования клеток, причем указанный способ включает регулировку рН, ограничение общего количества кальция иили ограничение общего количества фосфата в клеточной культуральной среде до проведения кратковременной высокотемпературной обработки так, что подавляется формирование комплексов, состоящих из кальция и фосфата, таким образом, что образование преципитата и отложение преципитата понижается иили минимизируется. 33 з.п. ф-лы, 16 ил., 5 табл., 5 пр.

Наверх