Способ прогнозирования риска развития ишемического инсульта

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ прогнозирования риска развития ишемического инсульта. Способ может быть использован для выявления риска развития острого нарушения мозгового кровообращения у индивидуумов русской национальности, являющихся жителями Центрального Черноземья. Способ включает установление статуса употребления алкоголя, выделение ДНК из периферической венозной крови, анализ генетических полиморфизмов rs909253 Ltα и rs1800629 TNFα. Сочетание генотипа АА rs909253 Ltα с генотипом GG rs1800629 TNFα и злоупотребление алкоголем является фактором риска развития ишемического инсульта. 3 ил., 3 пр.

 

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития ишемического инсульта у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья.

Ишемический инсульт – это клинический синдром, характеризующийся быстро возникшими клиническими жалобами и/или симптомами утраты очаговых и общемозговых функций, длящимися дольше 24 часов или приводящими к смерти [Хронические сосудистые заболевания головного мозга [Текст] / А.С. Кадыков, Л.С. Манвелов [и др.] // М.: ГЭОТАР-Медиа. – 2013. – 232 с.]. В настоящее время инсульт занимает первые позиции по заболеваемости, инвалидизации и смертности, поэтому исследование молекулярно-генетических механизмов предрасположения к данному заболеванию остается актуальной проблемой современной генетики человека. Установлено, что инсульт – это этиологически гетерогенное заболевание, возникающее в результате взаимодействия внешнесредовых и генетических факторов [Факторы риска, первичная и вторичная профилактика острых нарушений мозгового кровообращения [Текст] / Л.А. Цукурова, Ю.А. Бурса // Российский медицинский журнал, 2012. – №10. – С. 494-499]. В крупномасштабных эпидемиологических исследованиях выявлено, что чрезмерное употребление алкоголя является серьезным фактором риска развития инсульта. Этанол ухудшает регуляцию нейрогенеза, индуцирует возникновение воспалительных процессов в головном мозге, снижает способность клеток и тканей мозга к репарации [New insights on neurobiological mechanisms underlying alcohol addiction [Text] / C. Cui, A. Noronha, H. Morikawa [et al.] // Neuropharmacology, 2013. – Vol. 67. – Р. 223-232].

Наряду со средовыми факторами риска, идентифицированы гены-кандидаты, ассоциированные с восприимчивостью к инсульту, среди которых важное значение имеют гены цитокинов [Insulin-like growth factor I serum levels influence ischemic stroke outcome [Text] / A. De Smedt, R. Brouns, M. Uyttenboogaart [et al.] // Stroke, 2011. – Vol. 42, №8. – Р. 2180-2185]. Цитокины продуцируются нейронами, микроглией, макрофагами, моноцитами, и отвечают за модуляцию размера ишемического повреждения при инсульте [Polymorphisms of IGFI contribute to the development of ischemic stroke [Text] / H.J. Kim, S.K. Kim, H.J. Park [et al.] // Exp Ther Med., 2012. – Vol. 3, №1. – Р. 93-98].

Фактор некроза опухоли альфа (TNFα) – провоспалительный цитокин с молекулярной массой 17 кДа, в состав которого входят 157 аминокислотных остатков [The TNF Superfamily: Methods and Protocols [Text] / B. Jagadeesh // Springer, Berlin; Springer New York; Humana Press. – 2016. – 240 P.]. Установлено, что TNFα выступает в качестве вазоактивного медиатора – ингибирует синтез NO эндотелиоцитами, вызывает вазоконстрикцию сосудов и повышение артериального давления [Tumоr nесrоsis fасtоr-α rеduсеs аrgininоsuссinаtе synthаsе ехрrеssiоn аnd nitriс охidе рrоduсtiоn in аоrtiс еndоthеliаl сеlls [Tехt] / B.L. Gооdwin, L.С. Реndlеtоn, M.M. Lеvy [еt аl.] // Аm. J. Рhysiоl. Hеаrt Сirс. Рhysiоl. – 2007. – Vоl. 293, № 2. – Р. 1115-1121].

Ген, кодирующий TNFα, расположен на коротком плече шестой хромосомы, в области главного комплекса гистосовместимости HLA (6р21.1-6р21.3). При изучении греческой и мексиканской популяций показано, что полиморфизм rs1800629 TNFα вовлечен в формирование таких сердечно-сосудистых заболеваний, как ишемическая болезнь сердца и инфаркт миокарда [Inflammatory cytokine gene variants in coronary artery disease patients in Greece [Text] / A. Manginas, A. Tsiavou, A. Chaidaroglou [еt аl.] // Artery Dis. – 2008. – №19. – Р. 575-582].

Лимфотоксин альфа (Ltα, TNFβ) – плейотропный цитокин, гомологичный по структуре и функциям TNFα, участвующий в процессах сосудистого воспаления, поддержания Т-клеточного гомеостаза и отвечающий за иммуномодуляцию, пролиферацию и дифференцировку клеток [Ассоциация генов TNF и Ltα с осложнениями атеросклероза у больных, перенесших обострение ишемической болезни сердца [Текст] / Д.А. Затейщиков, А.А. Пушков, А.Г. Никитин [и др.] // Клиническая практика. – 2013. – №1 (13). – С. 4-11]. Цитогенетическое расположение гена, кодирующего Ltα – 6р21.1-6р21.3. Установлено, что замена аллеля А на G по локусу rs909253 Ltα приводит к повышению экспрессии соответствующего гена. Исследования показали, что полиморфизм rs909253 Ltα ассоциирован с развитием осложнений гипертонической болезни [Tumor necrosis factor beta NcoI polymorphism (rs909253) is associated with inflammatory and metabolic markers in acute ischemic stroke [Text] / J. de Sousa Parreira, A.P. Kallaur, M.F. Lehmann [еt аl.] // Metab Brain Dis. – 2015. – Vol. 30 (1). – Р. 169].

В Российской Федерации исследования вовлеченности генов цитокинов в формирование предрасположенности к ишемическому инсульту единичны и фрагментарны, а данные о роли генетических вариантов rs909253 Ltα, rs1800629 TNFα и злоупотребления алкоголем в развитии ишемического инсульта отсутствуют.

В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития ишемического инсульта на основе данных о сочетаниях генетических полиморфизмов rs909253 Ltα, rs1800629 TNFα и злоупотребления алкоголем.

Из области техники известен способ прогнозирования развития острого ишемического инсульта по патенту РФ №2012134988 от 20.02.2014. Способ включает учет показателей ферментов антиокислительной защиты в периферической крови, при этом в качестве ферментов антиокислительной защиты определяют каталазу, пероксидазу и показатель перекисного окисления липидов. При увеличении показателей пероксидазы и перекисной резистентности эритроцитов и снижении показателя каталазы более, чем на 70% от референтных значений, судят о высоком риске развития ишемического инсульта. Однако данный способ не является достаточно информативным, так как не включает генетические маркеры и применим только на клиническом этапе, что исключает раннюю диагностику и проведение профилактических мероприятий по предотвращению развития инсульта.

За прототип выбран патент РФ № 2422523 от 22.04.2010 «Аллель SNP41 гена PDE4D, его применение для прогнозирования индивидуальной предрасположенности к инсульту в русской популяции, применение молекулярно-генетического маркера индивидуальной предрасположенности к инсульту и способ прогнозирования индивидуальной предрасположенности к инсульту». Способ включает анализ полиморфизма гена PDE4D на наличие аллеля А SNP41 и в случае выявления наличия указанного аллельного варианта прогноз предрасположенности к инсульту в русской популяции. Изобретение позволяет диагностировать предрасположенность к инсульту в русской популяции и своевременно назначать соответствующие медикаменты. Недостатками указанного способа являются использование в качестве маркера только одного генетического полиморфизма, что снижает статистическую мощность проведенного исследования; а также то, что при прогнозировании риска развития инсульта не используются средовые факторы риска.

Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования развития ишемического инсульта на основе комбинации генов цитокинов при условии злоупотребления алкоголем.

Технический результат использования изобретения – получение критериев оценки риска развития ишемического инсульта у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья на основе данных о сочетаниях генетических вариантов локусов rs909253 Ltα, rs1800629 TNFα при условии злоупотребления алкоголем.

Способ прогнозирования развития ишемического инсульта в русской популяции, включающий

- выделение ДНК из периферической венозной крови;

- анализ полиморфизмов генов,

содержит следующие новые признаки:

- проводят анализ полиморфизмов генов цитокинов rs909253 Ltα и rs1800629 TNFα;

- устанавливают наличие средовых факторов риска развития ишемического инсульта, а именно – выявление злоупотребления алкоголем;

- прогнозируют высокий риск развития ишемического инсульта у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья при выявлении сочетания генотипа АА rs909253 Ltα с генотипом GG rs1800629 TNFα при условии злоупотребления алкоголем.

Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза риска развития ишемического инсульта по наличию сочетания генетических вариантов полиморфных маркеров цитокинов rs909253 Ltα и rs1800629 TNFα и злоупотребления алкоголем.

Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществляют методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew, 1984) в два этапа. На первом этапе к 4 мл крови с ЭДТА добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5мМ MgCl2, 10мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°С, 4000 об./мин. в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10мг/мл) и инкубируют образец при 37ºС в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин. в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. После лиофилизации полученную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°С. Выделенную ДНК используют для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.

Анализ полиморфизма гена rs909253 Ltα проводят методом ПЦР-синтеза ДНК на амплификаторе СFX96 (Bio-Rad) с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей. Реакционная смесь объемом 25 мкл включает: 67 мМ трис-HCl (pH=8,8), 2,5мМ MgCl2, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 5 пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (5 мин при 95°С) выполняют 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров – 1 мин. при t=54°С; денатурация – 15 сек при t=95°С. При проведении ПЦР в амплификаторе (CFX96) с флюоресцентной детекцией генотипирование осуществляют методом Tag Man зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции). Для rs909253 Ltα зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю А, зонд с красителем FAM – аллелю G (фиг.1).

Для исследования полиморфизма rs1800629 TNFα используют наборы 2,5х реакционной смеси для проведения ПЦР-РВ в объеме 25 мкл на 1 образец, включающие 2,5х реакционную смесь (2,5х ПЦР буфер: (KСl, ТрисHСl (рH 8,8), 6,25 мМ MgСl2), SynTаq ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты, глицерол, Twееn 20) в объеме 10мкл, 25мМ MgСl2 в объеме 1,5 мкл, ddH2О (деионизированная вода), по 10 пкмоль каждого праймера и по 5 пкмоль каждого зонда. При проведении ПЦР в амплификаторе с флюоресцентной детекцией (на амплификаторе CFX96) генотипирование осуществляют методом Tag Man зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции). Для rs1800629 TNFα зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю G, зонд с красителем FAM – аллелю A (фиг.2).

Выделенную ДНК подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров [Hulkkonen J., 2002; Mirjam M. de Jong et al., 2003].

Изобретение характеризуется фигурами.

Фиг. 1. Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма Ltα (rs909253): - GG, - АА, - AG, ■ - отрицательный контроль.

Фиг. 2. Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма TNFα (rs1800629): - АА, - GG, - GA, ■ - отрицательный контроль.

Фиг. 3. Диаграмма взаимодействий локусов цитокинов и злоупотребления алкоголем (ALK) в трехфакторной модели при формировании инсульта, полученная методом GMDR с коррекцией на коварианты, где столбики слева соответствуют группе больных, столбики справа соответствуют контрольной группе.

Генотипирование полиморфизмов rs909253 Ltα и rs1800629 TNFα осуществляют методом детекции TagMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени.

Анализ ассоциаций сочетаний генетических вариантов и злоупотребления алкоголем с ишемическим инсультом проводят с помощью методов MDR (Multifactor Dimensionality Reduction) и его модификации GMDR (Generalized Multifactor Dimensionality Reduction) с использованием соответствующего программного обеспечения (MDR версии 3.0.2, http://www.epistasis.org/ mdr.html, и GMDR версии 0.9, http://www.ssg.uab.edu/gmdr/) (фиг. 3). В основе использованных методов лежит общий принцип выявления переменной, содержащей информацию о нескольких локусах, и формирование кластеров, содержащих комбинации генотипов высокого и низкого риска развития изучаемой патологии.

Возможность использования предложенного способа для оценки риска возникновения и развития ишемического инсульта подтверждает анализ результатов наблюдений 303 пациентов с инсультом и 527 индивидуумов контрольной группы. Общий объем исследуемой выборки составил 830 человек. Средний возраст пациентов с инсультом составил 59,58±8,21 лет, а средний возраст представителей контрольной группы – 58,81±7,74 лет. В группе больных с инсультом оказались 201 мужчина и 102 женщины, а в контрольной группе – 322 мужчины и 205 женщин. В исследуемые выборки включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья России и не имеющие родства между собой. Группа больных с инсультом и контрольная группа полностью сопоставимы по возрасту, полу, месту рождения и национальности.

Все клинические и клинико-лабораторные исследования проводили на базе неврологического и кардиологического отделений Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа, с информированного согласия пациентов на использование материалов лечебно-диагностических мероприятий, проводимых за период госпитализации и после нее для научно-исследовательских целей. В работе использовалась анкета-опросник, включающая антропометрические, социально-демографические показатели, а также сведения о наличии у респондентов средовых факторов риска цереброваскулярных заболеваний, таких как курение, злоупотребление алкоголем, низкий уровень физической активности, особенности питания, стрессовые ситуации [Полоников, А.В. Промоторный полиморфизм -1293G>C гена CУР2E1 увеличивает риcк развития гипертоничеcкой болезни у мужчин, злоупотребляющих алкоголем [Текcт] / А.В. Полоников, В.П. Иванов, М.А. Cолодилова // Бюллетень экcпериментальной биологии и медицины. – 2013. – Т. 155, № 6. – C. 695-698]. Пациентов, употребляющих алкогольные напитки несколько раз в неделю и чаще, относили в группу с высоким употреблением алкоголя (что соответствует ≥40 г этанола в день для мужчин и ≥20 г этанола в день для женщин). Пациенты, не употребляющие или употребляющие алкогольные напитки не чаще 1 раза в неделю, относились в группу с умеренным/низким употреблением алкоголя. Полученные материалы протоколировали по стандартам этического комитета Российской Федерации.

Анализ ассоциаций сочетаний генетических вариантов цитокинов и статуса употребления алкоголя с ишемическим инсультом проводили с помощью методов MDR (Multifactor Dimensionality Reduction) и его модификации GMDR (Generalized Multifactor Dimensionality Reduction) с использованием соответствующего программного обеспечения (MDR версии 3.0.2, http://www.epistasis.org/ mdr.html, и GMDR версии 0.9, http://www.ssg.uab.edu/gmdr/), с коррекцией на индекс массы тела, уровни холестерина, триглицеридов, липопротеидов низкой плотности, липопротеидов высокой плотности, низкую физическую активность, предпочтение к жирной пище, редкое употребление овощей и фруктов. Для валидации полученных результатов проводили пермутационный тест – выполнено 1000 пермутаций при 10 кросс-валидациях, что обеспечивает рperm<0,001

Установлены особенности «конституции» больных с ишемическим инсультом на основе комбинаций генов цитокинов и злоупотребления алкоголем. Выявлена модель генно-средовых взаимодействий полиморфизмов rs909253 Ltα, rs1800629 TNFα и злоупотребления алкоголем, ассоциированная с высоким риском развития ишемического инсульта: воспроизводимость модели (CVC) составила 100%, точность предсказания модели (Test.Bal.Acc.=53,72), отношение шансов OR=2,56 (95% CI 1,42-4,61) при уровне значимости р=0,01 (рреrm<0,001). В рамках данной модели выявлена комбинация, являющаяся фактором риска развития ишемического инсульта: сочетание генотипа АА rs909253 Ltα с генотипом GG rs1800629 TNFα и злоупотреблением алкоголем наблюдается у 6,93% пациентов с инсультом и у 1,52% индивидуумов контрольной группы (Х2=15,15, р=0,001). Наличие данного сочетания генотипов со злоупотреблением алкоголем является фактором риска развития ишемического инсульта (ОR=4,83, 95% СI 2,01-12,03) независимо от влияния прочих средовых факторов.

В качестве примеров конкретного применения разработанного способа приведено обследование добровольцев русской национальности, являющихся жителями Центрального Черноземья и не являющихся родственниками между собой: определен статус злоупотребления алкоголем и проведено генетическое обследование по локусам rs909253 Ltα и rs1800629 TNFα.

Пример 1. У пациента П. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров было выявлено, что генотип мужчины по локусу rs909253 Ltα – АА, генотип по локусу rs1800629 TNFα – GG. При анкетировании установлено, что пациент П. употребляет крепкие спиртные напитки 2-3 раза в неделю (что соответствует злоупотреблению алкоголем). Сочетание генотипа АА rs909253 Ltα, генотипа GG rs1800629 TNFα и злоупотребление алкоголем позволило отнести пациента в группу больных с высоким риском развития ишемического инсульта. Дальнейшее наблюдение и результаты ультразвукового дуплексного сканирования (УЗДС) выявили у пациента окклюзивное заболевание сонных артерий, а именно, нарушение мозгового кровоснабжения, что подтвердило высокий риск развития инсульта по ишемическому типу.

Пример 2. У пациентки С. произведен забор венозной крови, при генотипировании ДНК-маркеров выявлено, что ее генотип по локусу rs909253 Ltα – GG, генотип по локусу rs1800629 TNFα – GG. При анкетировании установлено, что пациентка С. Употребляет алкоголь не чаще одного раза в месяц. По данным генотипирования и отрицательному статусу злоупотребления алкоголем пациентка С. не включается в группу больных с высоким риском развития инсульта. При дальнейшем наблюдении не было зафиксировано нарушений мозгового кровообращения.

Пример 3. У пациента Е. после забора венозной крови из локтевой вены и последующего генотипирования выявлен генотип GG по локусу rs909253 Ltα и генотип АА по локусу rs1800629 TNFα. При анкетировании установлено, что пациент Е. употребляет более 40 грамм алкоголя в сутки (что соответствует злоупотреблению алкоголем). По данным генотипирования пациент Е. не включается в группу больных с высоким риском развития ишемического инсульта. Дальнейшее обследование и результаты компьютерной томографии показали, что мозговое кровообращение пациента Е. соответствует норме.

Применение данного способа позволит на доклиническом этапе формировать среди индивидуумов группы риска и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития ишемического инсульта.

Способ прогнозирования риска развития ишемического инсульта в русской популяции, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови, анализ полиморфизмов генов, отличающийся тем, что проводят анализ генетических полиморфизмов цитокинов rs909253 Ltα и rs1800629 TNFα, устанавливают наличие средовых факторов риска развития ишемического инсульта, а именно – выявление злоупотребления алкоголем, прогнозируют высокий риск развития ишемического инсульта у индивидуумов русской национальности, являющихся жителями Центрального Черноземья, при выявлении сочетания генотипа АА rs909253 Ltα с генотипом GG rs1800629 TNFα и злоупотреблении алкоголем.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к ветеринарии, а именно к способу изготовления эритроцитарного диагностикума для диагностики пуллороза-тифа птиц. Способ включает получение бактериальной массы Salmonella gallinarum pullorum, выделение из нее антигенной фракции, Обработку бактериальной массы поверхностно-активным веществом с добавлением соды или щелочи в дистиллированной воде при 93-96°C с дальнейшей сенсебилизацией формалинизированных эритроцитов, их очисткой и получением целевого продукта в виде 10%-ной суспензии.

Изобретение относится к области биотехнологии, биохимии, молекулярной биологии, микробиологии и медицине. Предложен ДНК-чип и набор для идентификации генетических детерминант резистентности микроорганизмов - возбудителей инфекций, приводящих к нарушению репродуктивных функций человека: Treponema pallidum, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Gardnerella vaginalis, Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealiticum, Atopobium vaginae, Enterococcus faecalis, Trichomonas vaginalis, Escherichia coli, Mobiluncus mulieris, Streptococcus anginosus, Fusobacterium nucleatum, Staphylococcus epidermidis, Bacteroides fragilis, к антимикробным препаратам, включающим антибиотики пенициллинового ряда, цефалоспорины, тетрациклины, фторхинолоны, макролиды, нитроимидазолы, спектиномицин.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ обнаружения генетических факторов (генов), определяющих функционирование ДНК-структур клетки - теломер, обуславливающих, в свою очередь, продолжительность жизни клетки эукариот.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ обнаружения генетических факторов (генов), определяющих функционирование ДНК-структур клетки - теломер, обуславливающих, в свою очередь, продолжительность жизни клетки эукариот.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ быстрой и надежной детекции микобактерий туберкулеза генотипа Beijing В0-кластер.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях медицинского профиля и службах Роспотребнадзора. Сущность изобретения заключается в обеспечении быстрой и надежной дифференциации штаммов средневекового биовара от штаммов Y.

Изобретение относится к области медицины, в частности к молекулярной биологии и онкологии. Предложена тест-система для прогнозирования развития метастазов у больных раком желудка на основании определения числа копий HV2 мтДНК, содержащая высокоспецифичные праймеры для генов HV2 и В2М с концентрацией 1,8 мкМ каждого в водном растворе.

Изобретение относится к области медицины, в частности к молекулярной биологии и онкологии. Предложена тест-система для прогнозирования развития метастазов у больных раком желудка на основании определения числа копий HV2 мтДНК, содержащая высокоспецифичные праймеры для генов HV2 и В2М с концентрацией 1,8 мкМ каждого в водном растворе.

Предложенная группа изобретений относится к области биомедицины, в частности молекулярной и клинической онкологии. Предложен способ диагностики светлоклеточного почечно-клеточного рака (скПКР), при котором у обследуемых лиц берут образцы ткани почки, производят выделение и очистку ДНК из взятых образцов и производят методом МС-ПЦР анализ метилирования фрагментов ДНК с применением праймеров.

Предложенная группа изобретений относится к области биомедицины, в частности молекулярной и клинической онкологии. Предложен способ диагностики светлоклеточного почечно-клеточного рака (скПКР), при котором у обследуемых лиц берут образцы ткани почки, производят выделение и очистку ДНК из взятых образцов и производят методом МС-ПЦР анализ метилирования фрагментов ДНК с применением праймеров.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Описан способ выявления в крови больных циркулирующих мишеней, ассоциированных с определенным диагнозом. Обрабатывают твердую фазу биоспецифическими реагентами, отделяют непрореагировавшую жидкую фазу, инкубируют с мишенью, ассоциированной с определенным диагнозом. Далее обрабатывают твердую фазу репортером, разделяют жидкую и твердую фазы. Проводят анализ твердой фазы. В качестве твердой фазы используют магнитные микрочастицы с ковалентно иммобилизованными молекулами стрептавидина, в качестве биоспецифического реагента для первой обработки твердой фазы используют ДНК-аптамер, связывающийся с поверхностью за счет гибридизации с меченным биотином олигонуклеотидом 5'-CGTGGTTACAGTCAGAGGAG-3'-Вio, комплементарным константному концевому участку ДНК-аптамера, а в качестве репортера - другой ДНК-аптамер, меченный конъюгатом того же олигонуклеотида с Са2+-регулируемым фотопротеином обелином. Техническим результатом изобретения является разработка более чувствительного, универсального, экспрессного и технологичного биолюминесцентного способа выявления мишеней, ассоциированных с определенным диагнозом, в крови пациентов. 3 ил., 2 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Описан способ выявления в крови больных циркулирующих мишеней, ассоциированных с определенным диагнозом. Обрабатывают твердую фазу биоспецифическими реагентами, отделяют непрореагировавшую жидкую фазу, инкубируют с мишенью, ассоциированной с определенным диагнозом. Далее обрабатывают твердую фазу репортером, разделяют жидкую и твердую фазы. Проводят анализ твердой фазы. В качестве твердой фазы используют магнитные микрочастицы с ковалентно иммобилизованными молекулами стрептавидина, в качестве биоспецифического реагента для первой обработки твердой фазы используют ДНК-аптамер, связывающийся с поверхностью за счет гибридизации с меченным биотином олигонуклеотидом 5'-CGTGGTTACAGTCAGAGGAG-3'-Вio, комплементарным константному концевому участку ДНК-аптамера, а в качестве репортера - другой ДНК-аптамер, меченный конъюгатом того же олигонуклеотида с Са2+-регулируемым фотопротеином обелином. Техническим результатом изобретения является разработка более чувствительного, универсального, экспрессного и технологичного биолюминесцентного способа выявления мишеней, ассоциированных с определенным диагнозом, в крови пациентов. 3 ил., 2 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и биохимии. Предложен способ секвенирования нуклеиновых кислот. Данный способ включает катализируемое полимеразой включение нуклеотидов в образующуюся нить нуклеиновой кислоты относительно матрицы нуклеиновой кислоты, где полимераза присоединена к сенсору заряда, который обнаруживает события включения нуклеотидов. Для уникальной идентификации разных нуклеотидов в матричной нуклеиновой кислоте может быть использован один или более чем один тип неприродного нуклеотида, каждый из которых дает уникальные сигнатуры на сенсоре заряда. Изобретение позволяет более эффективно считывать длинные фрагменты нуклеиновых кислот, что может быть использовано в различных научных и прикладных областях. 3 н. и 39 з.п. ф-лы, 10 ил.

Изобретение относится к области медицины, в частности к молекулярной онкологии, и предназначено для прогнозирования развития метастазов в печени у больных раком толстой кишки. Осуществляют выделение суммарной РНК из тканевых проб с помощью метода гуанидин-тиоционат-фенол-хлороформной экстракции. Проводят амплификацию в режиме реального времени генов MAGEB1, SSX2, SCP1, GAPDH и GUSB. Рассчитывают относительную экспрессию генетических локусов и среднее геометрическое референсных генов GAPDH и GUSB. Вычисляют коэффициент экспрессии генов - КMAGEB1, КSSX2, КSCP1. При значениях КMAGEB1>2,2±0,5, КSSX2>2,2±0,4 и КSCP1<2,7±0,6 прогнозируют отсутствие метастазов. При значениях КMAGEB1<0,4±0,2, КSSX2<0,7±0,3 и КSCP1>8,5±0,8 прогнозируют развитие метастазов. При значениях между указанными интервалами считают результат не определенным. Изобретение обеспечивает создание нового, простого в исполнении, не дорогостоящего и более точного способа прогнозирования развития метастазов в печени у больных раком толстой кишки. 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и ветеринарии и предназначено для дифференциальной диагностики случной болезни и сурры лошадей. Для этого сначала из крови больных лошадей или из крови мышей и кроликов, которым трехкратно вводили трипаносомный антиген с адьювантом (гидроокись алюминия) и которых тотально обескровливали на 25-30 день, получают высокоактивные и высокоспецифичные ДНК-содержащие антигены Т. evansi и Т. equiperdum, которые лиофилизируют, а затем используют при постановке полимеразной цепной реакции с праймерами к гену RoTat1.2 VSG, гену субъединицы 5 NADH дегидрогеназы (nad5) с последующим электрофоретическим определением размера амплифицируемого фрагмента нуклеотидной последовательности. При наличии на электрофореграмме фрагмента длиной 410 н.п. диагностируют наличие в образцах ДНК-содержащих антигенов ДНК Т. evansi, а при наличии фрагмента длиной 724 н.п. диагностируют наличие в образцах ДНК-содержащих антигенов ДНК Т. equiperdum соответственно. Способ позволяет достоверно дифференцировать трипаносомы видов Т. evansi и Т. equiperdum. 6 ил.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ прогнозирования риска развития ишемического инсульта. Способ может быть использован для выявления риска развития острого нарушения мозгового кровообращения у индивидуумов русской национальности, являющихся жителями Центрального Черноземья. Способ включает установление статуса употребления алкоголя, выделение ДНК из периферической венозной крови, анализ генетических полиморфизмов rs909253 Ltα и rs1800629 TNFα. Сочетание генотипа АА rs909253 Ltα с генотипом GG rs1800629 TNFα и злоупотребление алкоголем является фактором риска развития ишемического инсульта. 3 ил., 3 пр.

Наверх