Способ выявления мишеней, ассоциированных с определенным диагнозом, в крови пациентов на основе днк-аптамеров

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Описан способ выявления в крови больных циркулирующих мишеней, ассоциированных с определенным диагнозом. Обрабатывают твердую фазу биоспецифическими реагентами, отделяют непрореагировавшую жидкую фазу, инкубируют с мишенью, ассоциированной с определенным диагнозом. Далее обрабатывают твердую фазу репортером, разделяют жидкую и твердую фазы. Проводят анализ твердой фазы. В качестве твердой фазы используют магнитные микрочастицы с ковалентно иммобилизованными молекулами стрептавидина, в качестве биоспецифического реагента для первой обработки твердой фазы используют ДНК-аптамер, связывающийся с поверхностью за счет гибридизации с меченным биотином олигонуклеотидом 5'-CGTGGTTACAGTCAGAGGAG-3'-Вio, комплементарным константному концевому участку ДНК-аптамера, а в качестве репортера - другой ДНК-аптамер, меченный конъюгатом того же олигонуклеотида с Са2+-регулируемым фотопротеином обелином. Техническим результатом изобретения является разработка более чувствительного, универсального, экспрессного и технологичного биолюминесцентного способа выявления мишеней, ассоциированных с определенным диагнозом, в крови пациентов. 3 ил., 2 пр.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к способу выявления в крови больных циркулирующих мишеней, ассоциированных с определенным диагнозом, путем иммобилизации биоспецифического ДНК-аптамера (группы биоспецифических ДНК-аптамеров) на поверхности магнитных частиц, последовательных процедур промывки и инкубации анализируемого образца, промывки и инкубации универсального репортера - конъюгата Са2+-регулируемого фотопротеина обелина с олигонуклеотидом, комплементарным константной концевой последовательности ДНК-аптамера (группы биоспецифических ДНК-аптамеров). Биолюминесцентный сигнал репортера регистрируется при добавлении раствора CaCl2.

Известен микроскопический способ выявления циркулирующих опухолевых клеток (микроэмбол и апоптотических телец) в крови больных раком легкого человека с помощью пары аптамеров, меченных флуоресцентными метками [патент РФ №2571821, МПК G01N 33/18 (2006.01), опубл. 20.12.2015].

Недостатками способа являются низкая производительность и высокая стоимость флуоресцентной микроскопии.

Известен способ биолюминесцентного микроанализа с использованием специфических конъюгатов Са2+-регулируемого фотопротеина обелина и его производных с иммуноглобулинами и олигонуклеотидами [патент РФ №2497128, МПК G01N 33/532 (2006.01), опубл. 17.10.2013].

Недостатком способа является необходимость синтезировать биоспецифические конъюгаты в зависимости от природы выявляемой мишени.

В качестве прототипа взята диагностическая тест-система на основе аптамеров [патент РФ №117150, МПК С12М 1/18 (2006.01), опубл. 06.06.2012], включающая n-луночный планшет, лунки которого покрыты слоем немеченых аптамеров, специфичных к заданной биологической мишени. Выявление мишени в образце проводилось после серии процедур последовательной инкубации исследуемого образца, раствора другого аптамера, меченного флуоресцентным красителем, (репортера) и промывки. Регистрация проводилась с помощью планшетного спектрофлуориметра.

Недостатками системы является использование поверхности пластиковых планшет, обладающих ограниченной поверхностной активностью, низкая чувствительность флуоресцентной метки, а также высокая стоимость планшетного спектрофлуориметра.

Техническим результатом изобретения является разработка более чувствительного, экспрессного и технологичного биолюминесцентного способа выявления мишеней, ассоциированных с определенным диагнозом, в крови пациентов.

Технический результат достигается тем, что в способе выявления мишеней, ассоциированных с определенным диагнозом, в крови пациентов на основе ДНК-аптамеров, включающем обработку твердой фазы биоспецифическими реагентами, отделение непрореагировавшей жидкой фазы, инкубацию с мишенью, ассоциированной с определенным диагнозом, дальнейшую обработку твердой фазы репортером, разделение жидкой и твердой фаз и анализ твердой фазы, новым является то, что в качестве твердой фазы для анализа используют магнитные микрочастицы с ковалентно иммобилизованными молекулами стрептавидина, обладающие более высокой площадью по сравнению с поверхностью лунок пластиковых планшетов, в качестве биоспецифического реагента для первой обработки твердой фазы используют ДНК-аптамер, связывающийся с поверхностью за счет гибридизации с меченным биотином олигонуклеотидом 5'-CGTGGTTACAGTCAGAGGAG-3'-Bio, комплементарным константному концевому участку аптамера, а в качестве репортера -другой ДНК-аптамер, меченный коньюгатом того же олигонуклеотида с Са2+-регулируемым фотопротеином обелином.

Отличие заявляемого способа от прототипа заключается в том, что в заявляемом изобретении в качестве твердой фазы используют магнитные микрочастицы с ковалентно иммобилизованными молекулами стрептавидина, в качестве биоспецифического реагента для первой обработки твердой фазы используют ДНК-аптамер, связывающийся с поверхностью за счет гибридизации с меченным биотином олигонуклеотидом 5'-CGTGGTTACAGTCAGAGGAG-3'-Bio, комплементарным константному концевому участку аптамера, а в качестве репортера - другой ДНК-аптамер, меченный коньюгатом того же олигонуклеотида с Са2+-регулируемым фотопротеином обелином.

Перечисленные выше отличительные от прототипа признаки позволяют сделать вывод о соответствии заявляемых технических решений критерию «новизна».

Признаки, отличающие заявляемые технические решения от прототипа, не выявлены в других технических решениях и, следовательно, обеспечивают заявляемому решению соответствие критерию «изобретательский уровень»

Заявленный способ диагностики иллюстрируется примерами, описывающими предел обнаружения биолюминесцентной метки для выявления мишеней, ассоциированных с раком легкого, и результаты анализа образцов крови пациентов с диагнозом рак легкого, другими заболеваниями легкого, а также здоровых доноров.

В настоящее время для диагностики рака легкого применяют иммуноферментный анализ ряда белковых онкомаркеров с использованием моноклональных антител. Как правило, эти онкомаркеры могут выявляться при различных типах рака [Sung, H.J., Cho, J.Y. Biomarkers for the lung cancer diagnosis and their advances in proteomics // В MB Reports. - 2008. - V. 41. - №9. - P. 615-625], и потому остается актуальным поиск новых способов специфичной лабораторной диагностики рака легкого. В данном подходе в качестве альтернативы антителам предлагается использовать аптамеры.

Аптамеры - короткие одноцепочечные рибо- либо дезоксирибо-олигонуклеотиды, обладающие определенной пространственной структурой благодаря образованию внутримолекулярных локальных дуплексов и стэкинг-взаимодействий. С помощью технологии SELEX получают высокоспецифичные аптамеры практически к любой мишени. По сравнению с антителами аптамеры как биоспецифические аффинные молекулы имеют ряд определенных преимуществ, главными из которых являются возможность их химического синтеза и модификации, а также стабильность при хранении.

К постоперационной ткани аденокарциномы легкого была получена группа ДНК-аптамеров, характеризующихся высоким связыванием с элементами опухолевой ткани и отрицательным связыванием со здоровой тканью легкого и клетками крови [Zamay, G.S. Aptamers selected to postoperative lung adenocarcinoma detect circulating tumor cells in human blood / O.S. Kolovskaya, T.N. Zamay, Y.E. Glazyrin, A.V. Krat, O. Zubkova, E. Spivak, M. Wehbe, A. Gargaun, D. Muharemagic, M. Komarova, V. Grigorieva, A. Savchenko, A.A. Modestov, M.V. Berezovski, A.S. Zamay // Molecular Therapy. - 2015. - V. 23. - №9. - P. 1486-1496].

Данные аптамеры длинной в 80 нуклеотидных оснований (н.о) имеют константные участки с 5' и 3'- концов (20 н.о) и вариабельную часть (40 н.о), отвечающую за специфическое связывание аптамера со своими мишенями.

Для обеспечения высокой чувствительности анализа в качестве репортера в работе использовали новый, полученный сайт-направленным мутагенезом вариант рекомбинантного Са2+-регулируемого фотопротеина обелина (22,2 кДа) гидроидного полипа Obelia longissima А6С, имеющего цистеиновый остаток на доступном для синтеза NH2-конце молекулы. Это позволило увеличить выход целевого конъюгата до 83% [Krasitskaya V.V. Mutants of Ca2+-regulated photoprotein obelin for site-specific conjugation / V.V. Krasitskaya, L.P. Burakova, A.A. Komarova, E.E. Bashmakova, L.A. Frank // Photochemistry and Photobiology. - 2017. - V. 93. - №2. - P. 553-557]. Биолюминесцентный сигнал этого белка инициируется присоединением Са2+, не зависит от дополнительных субстратов, кислорода и пр. и всегда пропорционален количеству белка.

На основе данного белка был получен конъюгат с олигонуклеотидом, комплементарным 5'-константному участку аптамеров, который может быть использован для выявления всей группы аптамеров, полученных к аденокарциноме легкого. Предел обнаружения конъюгата - около 20 амоль, обеспечивает высокую чувствительность биолюминесцентного анализа с использованием данного конъюгата в качестве метки.

Ранее был описан конъюгат обелина с РНК-аптамером [Vorobjeva М. A. RNA aptamer against autoantibodies associated with multiple sclerosis and bioluminescent detection probe on its basis / M.A. Vorobjeva V.V. Krasitskaya, A.A. Fokina, V.V. Timoshenko, G.A. Nevinsky, A.G. Venyaminova, L.A. Frank // Analytical Chemistry. -2014. - V. 86. - №5. - P. 2590-2594], обладающий специфичностью к единственной мишени - патогенному аутоантителу при рассеянном склерозе. В заявленном способе предлагается использовать конъюгат обелина с олигонуклеотидом, комплементарным константному участку группы аптамеров связанными с одним диагнозом. Например, в работе [Zamay, G.S. Aptamers selected to postoperative lung adenocarcinoma detect circulating tumor cells in human blood / O.S. Kolovskaya, T.N. Zamay, Y.E. Glazyrin, A.V. Krat, O. Zubkova, E. Spivak, M. Wehbe, A. Gargaun, D. Muharemagic, M. Komarova, V. Grigorieva, A. Savchenko, A.A. Modestov, M.V. Berezovski, A.S. Zamay // Molecular Therapy. - 2015. -V. 23. - №9. - P. 1486 - 1496] описано 10 аптамеров, полученных на мишени, ассоциированной с раком легкого, и все они имеют одинаковые концевые участки. Таким образом, предложенный нами способ пригоден для выявления не только одной мишени (при использовании одной пары аптамеров), но и группы мишеней, ассоциированных с данным заболеванием (при использовании смеси аптамеров).

Получение конъюгата фотопротеина обелина с олигонуклеотидом, комплементарным константным участкам на 5' концах ДНК-аптамеров, проводили химическим синтезом с небольшими модификациями способа, разработанного ранее для РНК-аптамера [Vorobjeva М.A. RNA aptamer against autoantibodies associated with multiple sclerosis and bioluminescent detection probe on its basis / M.A. Vorobjeva V.V. Krasitskaya, A.A. Fokina, V.V. Timoshenko, G.A. Nevinsky, A.G. Venyaminova, L.A. Frank // Analytical Chemistry. - 2014. - V. 86. - №5. - P. 2590-2594].

Олигонуклеотид 5'-CGTGGTTACAGTCAGAGGAG-3'-(CH2)6-NH2, комплементарный 5'-константным участкам аптамеров, несущий свободную NH2-группу (10 нмоль), модифицировали 50-кратным молярным избытком сукцинимидного эфира 4-(N-малеимидометил-) циклогексановой кислоты (SMCC) (Thermo Scientific, США) (свежеприготовленный раствор в диметилсульфоксиде) в течение 1,5 часов при комнатной температуре в 0,1 М NaHCO3. Избыток реагентов удаляли с помощью гель-фильтрации на колонке HiTrap Desalting Columns (GE Healthcare, Великобритания), уравновешенной буфером 20 мМ Tris-HCl, рН 7.0, 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), на хроматографической системе АKТА purifier (GE Healthcare, Великобритания). SMCC-активированный олигонуклеотид инкубировали с 3-х кратным молярным избытком мутантного варианта фотопротеина обелина с заменой Ala6→Cys в течение 12-14 часов при 4°С.

Полученный конъюгат выделяли анион-обменной хроматографией на колонке Mono Q (GE Healthcare, Великобритания), уравновешенной 20 мМ Tris-HCl, рН 7.0, 5 мМ ЭДТА. Элюцию полученного конъюгата проводили линейным градиентом NaCl (0-1 М), выход целевого конъюгата - 71±12%.

Для определения предела обнаружения конъюгата в лунки планшета вносили раствор конъюгата разной концентрации (по 100 мкл в 20 мМ Tris-HCl, рН 7.0, 5 мМ ЭДТА и 0,1% бычьего сывороточного альбумина) и измеряли биолюминесцентный сигнал сразу после быстрого добавления раствора СаС12 (100 мкл, 0,1 М в 0,1 М Tris-HCl, рН 8.8) с помощью планшетного люминометра LB 940 Multimode Reader Mithras (Berthold, Германия). Сигнал интегрировали 5 с. В контрольную лунку вносили буфер без конъюгата. Все измерения проводили в трех параллелях. Предел обнаружения определяли, как количество конъюгата, при котором отношение сигнала к контролю составляет 3. Предел обнаружения конъюгата составил 20,8 амоль (фиг. 1).

Для осуществления заявляемого способа растворы ДНК-аптамеров перед использованием прогревали при температуре 95°С в течение 5 минут и охлаждали 5 минут на льду. Образцы плазмы крови человека перед исследованием инкубировали с маскирующей дрожжевой РНК (0,1 нг/мкл), встряхивая 30 мин при комнатной температуре.

Полученную плазму инкубировали с магнитными микрочастицами с ковалентно иммобилизованными молекулами стрептавидина (Promega, США) (30 мкг/анализ), эквимолярной смесью ДНК- аптамера и биотинилированным олигонуклеотидом 5'-CGTGGTTACAGTCAGAGGAG-3'-Bio в течение 30 мин при встряхивании, при комнатной температуре (конечная концентрация аптамера и олигонуклеотида 250 нМ).

Частицы промывали трижды, суспендируя в растворе 20 мМ Трис-HCl, рН 7.0, 5 мМ ЭДТА, фиксируя частицы магнитом на стенке пробирки и удаляя надосадочную жидкость. К частицам добавляли раствор аптамера в конечной концентрации 250 нМ, инкубировали и промывали аналогичным образом. Далее к частицам добавляли конъюгат обелина с олигонуклеотидом, комплементарным 5'-константным участкам аптамеров. Инкубировали и промывали.

Суспензию частиц в 60 мкл буфера (20 мМ Tris-HCl, рН 7.0, 5 мМ ЭДТА) переносили в лунки непрозрачного 96-луночного микропланшета (Costar, США) и биолюминесцентный сигнал образовавшихся комплексов на их поверхности измеряли с помощью планшетного люминометра Mithras LB 940 Multimode Reader (Berthold, Германия) сразу после добавления 0,1 М СаСl2, в 0,1 М Tris-HCl рН 7,0 в течение 5 с.

Пример 1.

Образцы плазмы крови человека перед исследованием инкубировали с маскирующей дрожжевой РНК (0,1 нг/мкл) при встряхивании 30 мин.

Перед использованием растворы ДНК-аптамеров LC-17 и LC-18, прогревали при 95°С в течение 5 мин и охлаждали 5 мин на льду.

240 мл полученной плазмы инкубировали с магнитными микрочастицами с ковалентно иммобилизованными молекулами стрептавидина (Promega, США) (30 мкг/анализ), эквимолярной смесью аптамера LC-18 и биотинилированным олигонуклеотидом 5'-CGTGGTTACAGTCAGAGGAG-3'-Bio (конечная концентрация аптамера и олигонуклеотида 250 нМ) в течение 30 мин при встряхивании, при комнатной температуре.

Частицы промывали трижды, суспендируя в растворе 20 мМ Трис-HCl, рН 7.0, 5 мМ ЭДТА, фиксируя частицы магнитом на стенке пробирки и удаляя надосадочную жидкость. К частицам добавляли раствор ДНК-аптамера LC-17 в конечной концентрации 250 нМ, инкубировали и промывали аналогичным образом. Далее к частицам добавляли конъюгат обелина с олигонуклеотидом, который связывался с константной областью ДНК-аптамера LC-17. Инкубировали и промывали.

Суспензию частиц в 60 мкл буфера (20 мМ Tris-HCl, рН 7.0, 5 мМ ЭДТА) переносили в лунки непрозрачного 96-луночного микропланшета (Costar, США) и биолюминесцентный сигнал образовавшихся комплексов на их поверхности измеряли с помощью планшетного люминометра Mithras LB 940 Multimode Reader (Berthold, Германия) сразу после добавления 0,1 М СаСl2, в 0,1 М Tris-HCl рН 7,0 в течение 5 с.

Пример 2.

Образцы плазмы крови человека перед исследованием инкубировали с маскирующей дрожжевой РНК (0,1 нг/мкл) при встряхивании 30 мин.

Перед использованием раствор ДНК-аптамера LC-17 и LC-18 прогревали при 95°С в течение 5 мин и охлаждали 5 мин на льду.

240 мл полученной плазмы инкубировали с магнитными микрочастицами с ковалентно иммобилизованными молекулами стрептавидина (Promega, США) (30 мкг/анализ), эквимолярной смесью ДНК-аптамера LC-17 и биотинилированным олигонуклеотидом 5'-CGTGGTTACAGTCAGAGGAG-3'-Bio (конечная концентрация аптамера и олигонуклеотида 250 нМ) в течение 30 мин при встряхивании, при комнатной температуре.

Частицы промывали трижды, суспендируя в растворе 20 мМ Трис-HCl, рН 7.0, 5 мМ ЭДТА, фиксируя частицы магнитом на стенке пробирки и удаляя надосадочную жидкость. К частицам добавляли раствор ДНК-аптамера LC-18 в конечной концентрации 250 нМ, инкубировали и промывали аналогичным образом. Далее к частицам добавляли конъюгат обелина с олигонуклеотидом, который связывался с константной областью аптамера LC-18. Инкубировали и промывали.

Суспензию частиц в 60 мкл буфера (20 мМ Tris-HCl, рН 7.0, 5 мМ ЭДТА) переносили в лунки непрозрачного 96-луночного микропланшета (Costar, США) и биолюминесцентный сигнал образовавшихся комплексов на их поверхности измеряли с помощью планшетного люминометра Mithras LB 940 Multimode Reader (Berthold, Германия) сразу после добавления 0,1 М CaCl2, в 0,1 М Tris-HCl рН 7,0 в течение 5 с. Схема проведения анализа приведена на фигуре 2.

Представленные исследования выполнены в соответствии с документами, регламентирующими этические нормы проведения исследований с использованием биологического материала человеческого происхождения (решение Локального этического комитета КККОД №8/2011 от 16.03.2011).

Венозная кровь пациентов, перенесших полную резекцию опухоли, отобрана до операций и предоставлена сотрудниками КГБУЗ «Красноярский краевой клинический онкологический диспансер им. А.И. Крыжановского». Образцы плазмы крови 56 пациентов взяты перед проведением операции по удалению образований в легких. Диагнозы пациентов были верифицированы морфологически. В эксперименте использовали образцы пациентов без диагноза рак легкого (здоровые доноры), а также с другими заболеваниями легких и видами рака.

Сигналы, полученные от образцов крови здоровых доноров, достоверно отличались от сигналов остальных пациентов (р<0,05).

Результаты проведенных исследований образцов плазмы крови по примеру 1 представлены на фигуре 3, где 1, 2, 3 - среднее значение сигнала в группе с железистоклеточным (n=22), плоскоклеточным (n=23) раком легкого и в контрольной группе ± SD (n=19), соответственно, 4 - метастазы в легкое (n=3); 5 - туберкулез (n=2); 6 - хондрогамартома (n=1); отн.свет.ед. - относительные световые единицы.

Преимущества заявляемого способа заключаются в том, что в качестве твердой фазы используются магнитные частицы с ковалентно иммобилизованными молекулами стрептавидина, обладающие более высокой площадью поверхности по сравнению с поверхностью лунок пластиковых планшетов, и в использовании высокочувствительного биолюминесцентного репортера - конъюгата Са2+-регулируемого фотопротеина обелина с олигонуклеотидом, позволяющего выявлять одновременно несколько мишеней, связанных с диагностикой данного заболевания, при использовании группы ДНК-аптамеров со специфичностью к разным мишеням, но одинаковой константой концевой областью.

Способ выявления мишеней, ассоциированных с определенным диагнозом, в крови пациентов на основе ДНК-аптамеров, включающий обработку твердой фазы биоспецифическими реагентами, отделение непрореагировавшей жидкой фазы, инкубацию с мишенью, ассоциированной с определенным диагнозом, дальнейшую обработку твердой фазы репортером, разделение жидкой и твердой фаз и анализ твердой фазы, отличающийся тем, что в качестве твердой фазы используют магнитные микрочастицы с ковалентно иммобилизованными молекулами стрептавидина, в качестве биоспецифического реагента для первой обработки твердой фазы используют ДНК-аптамер, связывающийся с поверхностью за счет гибридизации с меченным биотином олигонуклеотидом 5'-CGTGGTTACAGTCAGAGGAG-3'-Bio, комплементарным константному концевому участку ДНК-аптамера, а в качестве репортера - другой ДНК-аптамер, меченный конъюгатом того же олигонуклеотида с Са2+-регулируемым фотопротеином обелином.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к ветеринарии, а именно к способу изготовления эритроцитарного диагностикума для диагностики пуллороза-тифа птиц. Способ включает получение бактериальной массы Salmonella gallinarum pullorum, выделение из нее антигенной фракции, Обработку бактериальной массы поверхностно-активным веществом с добавлением соды или щелочи в дистиллированной воде при 93-96°C с дальнейшей сенсебилизацией формалинизированных эритроцитов, их очисткой и получением целевого продукта в виде 10%-ной суспензии.

Изобретение относится к области биотехнологии, биохимии, молекулярной биологии, микробиологии и медицине. Предложен ДНК-чип и набор для идентификации генетических детерминант резистентности микроорганизмов - возбудителей инфекций, приводящих к нарушению репродуктивных функций человека: Treponema pallidum, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Gardnerella vaginalis, Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealiticum, Atopobium vaginae, Enterococcus faecalis, Trichomonas vaginalis, Escherichia coli, Mobiluncus mulieris, Streptococcus anginosus, Fusobacterium nucleatum, Staphylococcus epidermidis, Bacteroides fragilis, к антимикробным препаратам, включающим антибиотики пенициллинового ряда, цефалоспорины, тетрациклины, фторхинолоны, макролиды, нитроимидазолы, спектиномицин.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ обнаружения генетических факторов (генов), определяющих функционирование ДНК-структур клетки - теломер, обуславливающих, в свою очередь, продолжительность жизни клетки эукариот.

Группа изобретений относится к медицине и касается иммобилизованного белкового материала, содержащего носитель и по меньшей мере один белок, иммобилизованный на носителе.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ быстрой и надежной детекции микобактерий туберкулеза генотипа Beijing В0-кластер.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях медицинского профиля и службах Роспотребнадзора. Сущность изобретения заключается в обеспечении быстрой и надежной дифференциации штаммов средневекового биовара от штаммов Y.

Изобретение относится к области экспериментальной медицины и микробиологии и описывает способ определения наличия газовых сигнальных молекул в метаболитах микробиоты человека.

Изобретение относится к области медицины, в частности к молекулярной биологии и онкологии. Предложена тест-система для прогнозирования развития метастазов у больных раком желудка на основании определения числа копий HV2 мтДНК, содержащая высокоспецифичные праймеры для генов HV2 и В2М с концентрацией 1,8 мкМ каждого в водном растворе.

Предложенная группа изобретений относится к области биомедицины, в частности молекулярной и клинической онкологии. Предложен способ диагностики светлоклеточного почечно-клеточного рака (скПКР), при котором у обследуемых лиц берут образцы ткани почки, производят выделение и очистку ДНК из взятых образцов и производят методом МС-ПЦР анализ метилирования фрагментов ДНК с применением праймеров.

Изобретение относится к области ветеринарии, микробиологии и биотехнологии. Предложен способ выявления и количественной оценки содержания ДНК U.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ прогнозирования риска развития ишемического инсульта. Способ может быть использован для выявления риска развития острого нарушения мозгового кровообращения у индивидуумов русской национальности, являющихся жителями Центрального Черноземья.
Изобретение относится к ветеринарии, а именно к способу изготовления эритроцитарного диагностикума для диагностики пуллороза-тифа птиц. Способ включает получение бактериальной массы Salmonella gallinarum pullorum, выделение из нее антигенной фракции, Обработку бактериальной массы поверхностно-активным веществом с добавлением соды или щелочи в дистиллированной воде при 93-96°C с дальнейшей сенсебилизацией формалинизированных эритроцитов, их очисткой и получением целевого продукта в виде 10%-ной суспензии.

Изобретение относится к области биотехнологии, биохимии, молекулярной биологии, микробиологии и медицине. Предложен ДНК-чип и набор для идентификации генетических детерминант резистентности микроорганизмов - возбудителей инфекций, приводящих к нарушению репродуктивных функций человека: Treponema pallidum, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Gardnerella vaginalis, Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealiticum, Atopobium vaginae, Enterococcus faecalis, Trichomonas vaginalis, Escherichia coli, Mobiluncus mulieris, Streptococcus anginosus, Fusobacterium nucleatum, Staphylococcus epidermidis, Bacteroides fragilis, к антимикробным препаратам, включающим антибиотики пенициллинового ряда, цефалоспорины, тетрациклины, фторхинолоны, макролиды, нитроимидазолы, спектиномицин.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ обнаружения генетических факторов (генов), определяющих функционирование ДНК-структур клетки - теломер, обуславливающих, в свою очередь, продолжительность жизни клетки эукариот.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ обнаружения генетических факторов (генов), определяющих функционирование ДНК-структур клетки - теломер, обуславливающих, в свою очередь, продолжительность жизни клетки эукариот.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ быстрой и надежной детекции микобактерий туберкулеза генотипа Beijing В0-кластер.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях медицинского профиля и службах Роспотребнадзора. Сущность изобретения заключается в обеспечении быстрой и надежной дифференциации штаммов средневекового биовара от штаммов Y.

Изобретение относится к области медицины, в частности к молекулярной биологии и онкологии. Предложена тест-система для прогнозирования развития метастазов у больных раком желудка на основании определения числа копий HV2 мтДНК, содержащая высокоспецифичные праймеры для генов HV2 и В2М с концентрацией 1,8 мкМ каждого в водном растворе.

Изобретение относится к области медицины, в частности к молекулярной биологии и онкологии. Предложена тест-система для прогнозирования развития метастазов у больных раком желудка на основании определения числа копий HV2 мтДНК, содержащая высокоспецифичные праймеры для генов HV2 и В2М с концентрацией 1,8 мкМ каждого в водном растворе.

Предложенная группа изобретений относится к области биомедицины, в частности молекулярной и клинической онкологии. Предложен способ диагностики светлоклеточного почечно-клеточного рака (скПКР), при котором у обследуемых лиц берут образцы ткани почки, производят выделение и очистку ДНК из взятых образцов и производят методом МС-ПЦР анализ метилирования фрагментов ДНК с применением праймеров.

Изобретение относится к процессам и устройству для выделения этанола из ферментированной биомассы. Способ выделения этанола из ферментированной биомассы, при этом указанный способ включает стадии: (a) предоставления ферментированной биомассы с высоким содержанием этанола; (b) набивки указанной ферментированной биомассы с высоким содержанием этанола в вертикальную дистилляционную колонну; (c) добавления воды в нижнюю часть указанной вертикальной дистилляционной колонны; (d) нагревания нижней части указанной вертикальной дистилляционной колонны для кипячения указанной воды с получением таким образом пара из нижней части; (e) охлаждения верхней части указанной вертикальной дистилляционной колонны для конденсации пара с верхней части с получением таким образом жидкости с верхней части с высоким содержанием этанола и (f) повторного введения фракции указанной жидкости с верхней части с высоким содержанием этанола в верхнюю часть указанной вертикальной дистилляционной колонны, при этом стадии с (d) по (f) выполняют одновременно.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Описан способ выявления в крови больных циркулирующих мишеней, ассоциированных с определенным диагнозом. Обрабатывают твердую фазу биоспецифическими реагентами, отделяют непрореагировавшую жидкую фазу, инкубируют с мишенью, ассоциированной с определенным диагнозом. Далее обрабатывают твердую фазу репортером, разделяют жидкую и твердую фазы. Проводят анализ твердой фазы. В качестве твердой фазы используют магнитные микрочастицы с ковалентно иммобилизованными молекулами стрептавидина, в качестве биоспецифического реагента для первой обработки твердой фазы используют ДНК-аптамер, связывающийся с поверхностью за счет гибридизации с меченным биотином олигонуклеотидом 5-CGTGGTTACAGTCAGAGGAG-3-Вio, комплементарным константному концевому участку ДНК-аптамера, а в качестве репортера - другой ДНК-аптамер, меченный конъюгатом того же олигонуклеотида с Са2+-регулируемым фотопротеином обелином. Техническим результатом изобретения является разработка более чувствительного, универсального, экспрессного и технологичного биолюминесцентного способа выявления мишеней, ассоциированных с определенным диагнозом, в крови пациентов. 3 ил., 2 пр.

Наверх