Набор для мультиплексного иммунохимического анализа антител и антигенов в препаратах крови



Набор для мультиплексного иммунохимического анализа антител и антигенов в препаратах крови
Набор для мультиплексного иммунохимического анализа антител и антигенов в препаратах крови
Набор для мультиплексного иммунохимического анализа антител и антигенов в препаратах крови
Набор для мультиплексного иммунохимического анализа антител и антигенов в препаратах крови
Набор для мультиплексного иммунохимического анализа антител и антигенов в препаратах крови
Набор для мультиплексного иммунохимического анализа антител и антигенов в препаратах крови
G01N2800/26 - Исследование или анализ материалов путем определения их химических или физических свойств (разделение материалов вообще B01D,B01J,B03,B07; аппараты, полностью охватываемые каким-либо подклассом, см. в соответствующем подклассе, например B01L; измерение или испытание с помощью ферментов или микроорганизмов C12M,C12Q; исследование грунта основания на стройплощадке E02D 1/00;мониторинговые или диагностические устройства для оборудования для обработки выхлопных газов F01N 11/00; определение изменений влажности при компенсационных измерениях других переменных величин или для коррекции показаний приборов при изменении влажности, см. G01D или соответствующий подкласс, относящийся к измеряемой величине; испытание

Владельцы патента RU 2686490:

Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) (RU)

Изобретение относится к наборам для иммунохимического анализа антител и антигенов в препаратах крови и может быть использовано в медицинской диагностике. Раскрыт набор для мультиплексного иммунохимического анализа антител и антигенов в препаратах крови, включающий устройство в виде гребенчатой подложки с набором дискретно нанесенных на поверхности зубцов подложки реагентов захвата маркеров инфекционных заболеваний и дополнительно блокированной неспецифическими природными или синтетическими полимерами; емкость для проведения анализа, содержащую несколько рядов изолированных ячеек, выполненных с возможностью введения каждого зубца подложки в отдельную ячейку ванны; растворы для разведения образца и отмывок; конъюгат для детекции; встроенные положительный контроль и отрицательный контроль. При этом реагенты захвата содержат антигены и антитела к маркерам одного или нескольких возбудителей инфекционных заболеваний; иммобилизованные на каждом зубце подложки; конъюгат для детекции содержит многокомпонентный состав, включающий несколько видов детекторных антител против иммуноглобулинов человека и против выявляемых антигенов, связанных с каталитически активными золями золота; положительные контроли предусматривают оценку работоспособности всех специфических компонентов конъюгата, расположены на отдельных сегментах иммуночипа и включают зону для контроля работоспособности антивидовых детекторных антител, зоны для контроля специфических детекторных антител к каждому выявляемому антигену и зону отрицательного контроля, свободную от специфических белков; проявитель иммуночипа содержит сухой таблетированный и жидкий компоненты и снабжен усилителем и стабилизатором окраски проявленных иммуночипов. Изобретение обеспечивает повышение информативности мультиплексного анализа и диагностику ранних стадий инфекции за счет одновременного выявления в образцах интересующих спектров антител и антигенов. 4 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к наборам для иммунохимического анализа и направлено на усовершенствование тест-систем для выявления специфических маркеров инфекционных заболеваний в препаратах крови, в частности маркеров гемотрансмиссивных инфекций (ГТИ): гепатитов В и С, сифилиса и инфекции вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) и может быть использовано в медицинской диагностике. В России приняты и реализуются национальные программы по борьбе с этими заболеваниями, в которых одним из наиболее важных мероприятий является систематическое обследование доноров и населения из групп риска на наличие следующих маркеров: поверхностного белка (антигена) вируса гепатита В (HBsAg); раннего белка (антигена) р24 и антител к белкам gp41, gp120 и gp36 ВИЧ; антител к белкам Core, NS3, NS4 и NS5 вируса гепатита С (ВГС); а также суммарных антител к белкам возбудителя сифилиса {Treponema pallidum). В настоящее время такое обследование проводится с использованием моноспецифических (определяющих один маркер) тест-систем для иммуноферментного анализа (ИФА) и требует выполнения ряда тестов, что предполагает одновременное наличие всех необходимых тест-наборов и немалые затраты времени и средств.

Известны наборы ИФА для определения суммарных антител к 4 инфекциям [1, 2]. В наборах используют смесь конъюгатов 4 антигенов с пероксидазой, выявляя антитела ко всем 4 инфекциям в одной лунке.

Недостатком этих наборов является невозможность дифференцированного выявления отдельных возбудителей.

Известен также набор "Orgenics immunocomb HIV 1+2 bi-spot" фирмы «Orgenics» (Франция) для определения антител на непористых носителях [3]. Этот набор позволяет проводить одновременно выявление антител к вирусам имунодефицита человека 1 и 2 типов (HIV 1+2) в одном из вариантов дот-иммуноанализа на поверхности непористого носителя. Его рабочий элемент (твердая фаза) представлен в виде плоской пластиковой гребенки, на каждом зубце которой нанесены в виде отдельных пятен антигены HIV 1 и 2, а также человеческие иммуноглобулины - контроль для проверки работы конъюгата. Набор содержит все рабочие растворы, готовые к применению. При положительном результате анализа в месте нанесения антигена образуются визуально определяемые синие пятна. Эту тест-систему можно рассматривать как набор для дифференциального, мультиплексного анализа, но только на две близкородственные инфекции.

Известен набор, описанный в патенте США №5486452 [4], где антигены или иммуноглобулины или оба из них связаны прямым применением в любой подходящей геометрии, например, как анализ точек или линий. Такие пористые носители подходят для осуществления неограниченного количества реакций антитело-антиген одновременно и за одну операцию. В состав набора входит устройство для иммунологического анализа, представляющее собой пористую подложку, содержащую множественные ограниченные области адсорбированных на ее поверхности различных антигенов, представленные в виде точек, микроточек или линий, расположенных в определенном геометрическом порядке, и полученные путем нанесения аликвот антигенов на подложку дозирующими устройствами. Свободные от антигенов участки подложки блокированы неспецифическим белком. Набор содержит также реактивы индикаторной системы, позволяющей выявлять комплексы антиген-антитело.

Приведенный выше набор имеет следующие недостатки. В качестве плотной подложки устройства используется пористая матрица, предпочтительно из нитроцеллюлозы, с толщиной листа, предпочтительно, 0,1 мм. Такие матрицы отличаются хрупкостью и малой механической прочностью, что значительно затрудняет их рутинное использование.

Другим недостатком таких подложек является сложность удаления не связавшихся компонентов реакции из мелких пор матрицы (длительная, многократная отмывка с активацией), что значительно усложняет методику и повышает вероятность фоновых явлений.

С целью миниатюризации описанного устройства, зоны адсорбции антигенов представлены в виде пятен диаметром менее 2 мм или линиями с шириной менее 2 мм (получаемые нанесением аликвот антигенов в объеме менее 1 мкл), что предполагает использование специальных считывающих устройств, и не позволят проводить достоверный прямой визуальный учет результатов анализа.

В качестве детекторной системы используются антитела или белок комплемента, конъюгированные с изотопной, флюоресцентной или ферментной (пероксидазой хрена) меткой. Работа с изотопами требует обеспечения специальных условий безопасности и не может широко использоваться в рутинных анализах. Использование флюоресцентных меток требует специального оборудования для инструментального учета результатов анализа. Для анализов с применением в качестве метки пероксидазы хрена в сочетании с субстратами, дающими нерастворимые продукты (4-хлоро-1-нафтол или 3,3-диаминобензидин) характерна относительно невысокая чувствительность, примерно на порядок уступающая чувствительности планшетного варианта иммунопероксидазного теста с использованием субстратов, дающих растворимые окрашенные продукты [5].

Известен способ многопрофильного иммунохимического выявления антигенов в жидких образцах, описанный в патенте РФ №2296995 [6]. Сущность такого выявления заключается в специфической иммобилизации антигенов исследуемого образца набором известных антител (первичных иммунореагентов), в определенном порядке дискретно зафиксированных на плотной подложке аналитического устройства. Иммобилизованные антигены обрабатываются смесью антител, специфичных ко всему спектру анализируемых антигенов, (вторичный иммунореагент), в результате чего образуется тройной комплекс: первичный иммунореагент - антиген - вторичный иммунореагент. Образовавшиеся комплексы затем обнаруживаются с помощью конъюгата - антител, специфичных к вторичному иммунореагенту и связанных с легко выявляемой меткой.

Недостатками такого подхода являются подбор первичных и вторичных иммунореагентов не только по специфичности, но и по виду животного, в которых они были наработаны, а также многостадийность и длительность процедуры анализа.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является набор для многопрофильного иммунологического анализа антител в препаратах крови, описанный в патенте РФ №2495434 [7], в состав которого входит подложка с набором дискретно нанесенных на ее поверхность антигенами возбудителей инфекционных заболеваний и дополнительно блокированной неспецифическими природными или синтетическими полимерами, а также емкость для проведения анализа. Подложка представляет собой пластину с зубцами в виде гребня, на поверхности каждого зубца (иммуночипа) которой расположены дискретно нанесенные антигены возбудителей вирусных инфекций и контроль (иммуноглобулины человека) для контроля качества антивидового конъюгата и проявляющей системы. В качестве отрицательного контроля один из сегментов зубца подложки оставлен свободным от специфических белков для оценки фоновых явлений. Зона нанесения антигенов и контролей на каждом иммуночипе очерчена контрастной рамкой для позиционирования при инструментальном учете результатов анализа. Емкость для проведения анализа выполнена в виде многоячеистой аналитической ванны с возможностью введения каждого зубца подложки в отдельную ячейку. Ванна заполнена готовыми рабочими растворами: для отмывок и разведения образца, конъюгата и системы проявления. Ячейки ванны герметизированы.

В качестве антигенов возбудителей вирусных инфекций в наборе используют антигены возбудителей вакциноуправляемых инфекций: краснухи, эпидемического паротита, кори и полиомиелита или их рекомбинантные или синтетические аналоги.

В качестве конъюгата используют вторичные иммунореагенты: антитела к иммуноглобулинам человека, или стафилококковый белок А, связанный со щелочной фосфатазой, (например, Protein A, Alkaline Phosphatase Conjugate фирмы «Мегск», кат. №539251), а в качестве проявляющей системы - субстрат для выявления щелочной фосфатазы (предпочтительно, BCIP/NBT Liquid Substrate System фирмы «SIGMA-ALDRICH» кат. №В1911). В альтернативном варианте конъюгата используют вторичные иммунореагенты (антитела к иммуноглобулинам человека или стафилококковый белок А), связанные с каталитически активными золями золота, а в качестве проявляющей системы - раствор "физического проявителя", включающий: 0,2% - метола; 0,2% - азотнокислого серебра; 0,5% - лимонной кислоты, бидистиллированную воду - остальное до 100%. Частным примером прототипа является описаный в статье A. Poltavchenko et all. «А Kit for Multiplexed Detection of Antibodies to Agents of Hemotransmissible Infections». OnLine Journal of Biological Sciences 2016, 16 (3): 137.144 (DOI: 10.3844/ojbsci.2016.137.144) [8] набор для выявления антител к возбудителям гемотрансмиссвных инфекционных заболеваний. На иммуночипах этого набора нанесены антигены 6 возбудителей ГТИ: ВИЧ, ВГС, ВГВ, сифилиса, цитомегаловирусной инфекции и токсоплазмоза, а также контроль работоспособности системы детекции - IgG из крови человека; в качестве конъюгата используются антитела против IgG человека, связанные с наночастицами золота.

Описанные выше наборы-аналоги, в том числе прототип, автономны (содержат все необходимые для анализа компоненты и не нуждается в энергообеспечении), но позволяют выявлять только спектры антител.

Техническим результатом заявляемого изобретения является повышение информативности мультиплексного анализа и обеспечение диагностики ранних стадий инфекции за счет одновременного выявления в образцах интересующих спектров, как антител, так и антигенов.

Указанный технический результат достигается тем, что в наборе для мультиплексного иммунохимического анализа антител и антигенов в препаратах крови, включающем устройство в виде гребенчатой подложки - иммуночипа с набором дискретно нанесенных на поверхности зубцов подложки реагентов захвата маркеров инфекционных заболеваний и дополнительно блокированной неспецифическими природными или синтетическими полимерами; емкость для проведения анализа, содержащая несколько рядов изолированных ячеек, выполненных с возможностью введения каждого зубца подложки в отдельную ячейку ванны; растворы для разведения образца и отмывок; конъюгат для детекции; встроенные положительный контроль для контроля качества конъюгата и отрицательный контроль для оценки фоновых явлений и проявитель иммуночипа, согласно изобретению, набор нанесенных на подложку-иммуночип реагентов захвата содержит антигены и антитела к маркерам одного или нескольких возбудителей инфекционных заболеваний; иммобилизованные на каждом зубце подложки антигены представлены отдельными натуральными, или синтетическими, или рекомбинантными белками, или комбинацией белков или химерными антигенами, содержащими наборы эпитопов антигенов соответствующих белков возбудителей инфекций. Антитела захвата представлены аффинно очищенными иммуноглобулинами из поликлональных сывороток или моноклональными антителами, не конкурирующими за сайты связывания эпитопов антигенов с детекторными антителами и не реагирующими с антивидовыми иммуноглобулинами в конъюгате. Конъюгат для детекции содержит многокомпонентный состав, включающий несколько видов детекторных антител к иммуноглобулинам человека (a/Hum IgG) и к выявляемым антигенам, связанных с каталитически активными золями золота. Положительные контроли предусматривают оценку работоспособности всех специфических компонентов конъюгата. Они расположены на отдельных сегментах иммуночипа и включают: зоны для контроля работоспособности антивидовых детекторных антител, зоны для контроля специфических детекторных антител к каждому выявляемому антигену и зону отрицательного контроля, свободную от специфических белков. Проявляющая система набора включает сухой таблетированный, а также жидкий компоненты и снабжена усилителем и стабилизатором окраски проявленных иммуночипов.

Конъюгат представлен смесью золей золота связанных с отдельными видами детекторных антител или золем золота связанным одновременно с несколькими детекторными антителами. Последний вариант предпочтительней, поскольку обеспечивает больший срок хранения разведенного (готового к применению) конъюгата.

Сухой таблетированный компонент проявителя содержит смесь лимонной кислоты и метола в соотношении 5:2 соответственно, а жидкий компонент представлен раствором, содержащим 0,4% азотнокислого серебра в бидистиллированной воде.

Усилитель и стабилизатор окраски проявленных иммуночипов представлен раствором, содержащим 1% тиомочевины и 1% гидроокиси натрия в дистиллированной воде.

В отличие от прототипа позиционирование иммуночипа при инструментальном учете результатов анализа осуществляется путем сканирования его на фоне листа темной бумаги, что позволяет избежать дополнительных операций и устройств для нанесения на иммуночип контрастной рамки.

Для иллюстрации изобретения приведены графические фигуры.

На фиг. 1 приведены основные элементы набора для комплексного первичного тестирования препаратов крови на наличие антител к возбудителям ГТИ (см. пример 1) и схема размещения на иммуночипе тестовых и контрольных зон (реагентов захвата):

К- - зона контроля фоновых явлений (без реагентов захвата);

К1 - зона контроля работоспособности антивидовых детекторных антител (IgG человека);

К2 - зона контроля работоспособности детекторных антител к HBsAg (HBsAg);

К3 - зона контроля работоспособности детекторных антител к раннему белку р24 ВИЧ (антиген р24 ВИЧ);

Т1 - зона теста на антитела к ВИЧ (комбинация антигенов gp41, gpl20 и gp36 ВИЧ);

Т2 - зона теста на антитела к ВГС (комбинация антигенов Core, NS3, NS4 и NS5 ВГС);

Т3 - зона теста на антитела к Т. pallidum (комбинация антигенов р17, ТтрА и р47 Т. pallidum);

Т4 - зона теста на HBsAg (антитела к HBsAg);

Т5 - зона теста на ранний белок р24 ВИЧ (антитела к белку р24 ВИЧ)

На фиг. 2 приведен пример результатов мультиплексного анализа сыворотки крови на маркеры гемотрансмиссивных инфекций, полученных с использованием предлагаемого набора (цифрами на иммуночипах обозначены номера образцов, соответствующих образцам, приведенным в таблице).

На фиг. 3 приведена схема размещения на иммуночипе для дифференцированного выявления маркеров ВИЧ (см. пример 2) тестовых и контрольных зон (реагентов захвата):

Т1 - зона теста на суммарные антитела к ВИЧ 1 и 2 (химерный белок, содержащий эпитопы антигенов gp41, gpl20 ВИЧ 1 и gp36 ВИЧ 2)

Т2 - зона теста на антитела к ВИЧ 1 (рекомбинантный белок, содержащий этитопы антигена gp41 ВИЧ 1);

Т3 - зона теста на антитела к ВИЧ 1 (рекомбинантный белок, содержащий этитопы антигена gpl20 ВИЧ 1);

Т4 - зона теста на антитела к ВИЧ 2 (рекомбинантный белок, содержащий этитопы антигена gp36 ВИЧ 2);

Т5 - зона теста на ранний белок р24 ВИЧ (антитела к белку р24 ВИЧ);

К- - зона контроля фоновых явлений (без реагентов захвата);

К1 - зона контроля работоспособности антивидовых детекторных антител (IgG человека);

К2 - зона контроля работоспособности детекторных антител к раннему белку р24 ВИЧ (антиген р24 ВИЧ);

На фиг. 4 приведен пример результатов мультиплексного анализа сыворотки крови на отдельные маркеры ВИЧ (см. пример 2): 1 - отрицательный результат; 2 - результат, положительный по раннему белку р24 ВИЧ; 3 и 4 - результат, положительный по антителам к ВИЧ 1; 5 - результат, положительный по антителам к ВИЧ 2.

Предлагаемый набор включает следующие основные элементы:

- плоскую подложку 1 для иммунологического анализа, выполненную в виде гребня, каждый зубец (иммуночип) 2 которого на своей поверхности содержит набор зон с нанесенными в виде пятен 3 реагентами захвата и положительными контролями и является аналитическим устройством; в качестве отрицательного контроля зона «К-» каждого зубца 2 подложки 1 оставлена свободной от специфических белков для оценки фоновых явлений;

- аналитическую многоячеечную ванну 4 с изолированными ячейками 5, заполненными готовыми рабочими растворами и герметизированными пленкой;

- перфоратор (на чертежах не показан) для вскрытия ячеек 5 аналитической ванны 4;

Описание конкретного выполнения заявляемого набора.

Подложка 1 изготавливается из непористого синтетического материала (предпочтительно из синтетической бумаги) в виде плоского гребня, например, с пятью зубцами (иммуночипами) 2, на каждом из которых в определенном порядке нанесен набор (в виде пятен 3) из реагентов захвата (антигенов и антител). Встроенные контроли расположены на отдельных сегментах иммуночипа и включают зону с нанесенными IgG человека (контроль работоспособности антивидовых детекторных антител), зону с нанесенными выявляемыми антигенами (контроль работоспособности детекторных антител) и свободную от специфических белков зону для оценки фоновых явлений. Антигены на подложке могут быть представлены отдельными нативными, синтетическими, рекомбинантными белками, их комбинацией или химерными конструкциями, содержащими наборы антигенов соответствующих возбудителей. Антитела захвата могут быть представлены аффинно очищенными иммуноглобулинами из поликлональных сывороток или моноклональными антителами и не должны конкурировать за сайты связывания (эпитопы) антигенов с детекторными антителами, а также реагировать с антивидовыми иммуноглобулинами в конъюгате.

Реагенты захвата и контроли на поверхности подложки наносятся в концентрации 5-20 мкг/мл (предпочтительно 10 нг/мл) аликвотами по 1,5-3 мкл (предпочтительно 2 мкл) в виде расположенных в определенном порядке отдельных точек (пятен 4) с диаметром от 2 до 5 мм (предпочтительно 3 мм), что позволяет прямой визуальный учет результатов анализа.

Аналитическая ванна 4 выполнена из инертной пластмассы и имеет несколько рядов, состоящих из пяти ячеек 5 каждый. Каждый ряд ячеек 5 заполнен определенным готовым к применению рабочим раствором и герметизирован пленкой.

В качестве конъюгата в наборе используются детекторные антитела к иммуноглобулинам человека и детекторные антитела к выявляемым антигенам, связанные с каталитически активными золями золота. Конъюгат может быть представлен в виде смеси золей золота, связанных с отдельными видами детекторных антител, или золем золота, связанным одновременно с несколькими детекторными молекулами. Последний вариант предпочтительней, поскольку обеспечивает больший срок хранения разведенного (готового к применению) конъюгата.

В качестве проявляющей системы применяется состав "физического проявителя", включающий: 0,2% - метола; 0,2% - серебра азотнокислого; 0,5% - лимонной кислоты в бидистиллированной воде. Принцип проявления заключается в каталитическом осаждении серебра из проявителя на поверхности частиц золота из конъюгата, связанных на поверхности подложки. Раствор проявителя нестабилен, поэтому в наборе проявитель используется в виде двух компонентов: сухого - таблетированной смеси лимонной кислоты и метола в соотношении 5:2 и жидкого - 0,4% азотнокислого серебра в бидистиллированной воде. Таблетки сухой смеси помещаются в ячейки 5 девятого ряда ванны 4. В ходе анализа в эти ячейки добавляют по х/г объема ячейки бидистиллированной воды для растворения таблеток, а непосредственно перед проявлением - Уг объема ячейки раствора азотнокислого серебра. Время проявления - 8 мин. Для усиления и стабилизации окраски проявленных пятен используется раствор, содержащий 1% тиомочевины и 1% гидроокиси натрия в дистиллированной воде. Принцип усиления и стабилизации заключается в переводе осажденного серебра в химически устойчивый сульфид серебра, имеющий интенсивную черную окраску.

Дополнительно набор комплектуется:

- перфоратором;

- флаконом с бидистиллированной водой для растворения таблеток проявителя;

- непрозрачным флаконом с жидким компонентом проявителя - 0,4% раствор AgNO3 в бидистиллированной воде;

- листом черной бумаги, использующейся в качестве темного фона для позиционирования иммуночипа при учете и документировании результатов.

Описание процесса использования заявляемого набора.

При выполнении анализа ячейки 5 вскрывают перфоратором, в первый ряд ячеек 5 вносят исследуемые образцы сыворотки крови (15 мкл) и погружают зубцы 2 подложки 1. Затем, через определенные интервалы времени подложку 1 передвигают и погружают в ячейки 5 следующего ряда ванны 4 и, после выемки из последнего ряда ячеек 5 визуально учитывают результат по наличию или отсутствию темных пятен в местах нанесения антигенов. Для одиночных анализов используют отдельные зубцы 2, которые ножницами отделяют от гребенки подложки 1. Анализ осуществляют при комнатной температуре.

Далее приведены примеры конкретного применения набора.

Пример 1. Сравнение эффективности выявления маркеров гемотрансмессивныж инфекций в сыворотке крови в планшетных ИФА-тест-системах и мультиплексном дот-иммуноанализе.

В пробных экспериментах используют:

Зубцы (иммуночипы) 2 с нанесенными по схеме, приведенной на Фиг.1, реагентами захвата и контролями:

T1 - химерным белком, содержащим этитопы антигенов gp41, gpl20 ВИЧ 1 и gp36 ВИЧ 2;

Т2 - химерным белком, содержащим этитопы антигенов Core, NS3, NS4 и NS5 ВГС;

Т3 - смесью рекомбинантных антигенов р17, ТтрА и р47 Т. pallidum;

Т4 - антителами захвата против антигена р24 ВИЧ;

Т5 - антителами захвата против HBsAg;

K1 - IgG из сыворотки крови человека - контроль работоспособности антивидовых детекторных антител;

К2 - поверхностным антигеном вируса гепатита В (HBsAg) - контроль работоспособности детекторных антител к HBsAg;

К3 - антигеном р24 ВИЧ - контроль работоспособности детекторных антител к белку р24 ВИЧ;

Один из сегментов (К-) зубцов (иммуночипов) 2 оставлен свободным от специфических белков для оценки фоновых явлений.

Аналитическую ванну 4 с 12 рядами ячеек 5 заполняют растворами:

- ряд 1 - раствор для разведения образцов - ТСБ-Т (0,1 М Трис-HCl с 0,15 М NaCl и 0,1% твин-20, рН 7,2-7,4) с 0,05% (в/о) казеина, рН 8,0;

- ряды 2, 3, 5 и 6 - раствор для отмывок - ТСБ-Т;

- ряд 4 - конъюгат коллоидного золота (20 нм) со смесью детекторных антител (против иммуноглобулинов человека, против антигена р24 ВИЧ и против HBsAg);

- ряды 7, 8, 10 и 12 - бидистиллированная вода.

- ряд 11 - раствор усилителя и стабилизатора окраски - 1% тиомочевины и 1% NaOH в дистиллированной воде.

- в ячейки ряда 9 вносят по 1 таблетке (3 мг) сухой смеси проявителя -лимонная кислота и метол в соотношении 5:2, соответственно.

Заполненную ванну герметизируют пленкой. При выполнении анализа герметизирующее покрытие вскрывают перфоратором.

Выполнение анализа. Мультиплексный анализ пяти образцов сывороток крови проводят с использованием предлагаемого набора. Все операции выполняются при температуре не ниже 20°С. В ячейки первого ряда пипеткой вносят по 15 мкл исследуемых сывороток крови, перемешивают, помещают в них зубцы (иммуночипы) 2 и инкубируют 20 мин. В ячейки 5 девятого ряда добавляют 200 мкл бидистиллированной воды из флакона. Затем иммуночипы 2 подложки 1 переносят из ячеек 5 первого ряда в ячейки 5 следующих рядов с инкубациями: 4 ряд - 20 мин; 2, 3 и 5-8 ряды - 2 мин, 9 ряд - 8 мин, 10-12 ряды - 1 мин. Перед внесением иммуночипов в ячейки девятого ряда в них добавляют по 200 мкл раствора азотнокислого серебра из флакона. После выемки иммуночипов 2 из ячеек 5 последнего ряда визуально учитывают результаты анализа. Результат считают положительным, если в месте нанесения соответствующего реагента захвата визуально определяется четко различимое темное пятно, все контроли работоспособности системы имеют интенсивную темную окраску, а зона К- не имеет окраски или слабо окрашена.

Примечания:

Положительные результаты ИФА выделены жирным шрифтом.

+ отчетливо определяемое пятно в месте нанесения антигена (положительный результат).

- слабо определяемое пятно в месте нанесения антигена или чистый фон подложки (отрицательный результат).

Для сравнения иммунопероксидазный планшетный анализ проводят на моноспецифических тест-системах для определения маркеров отдельных инфекций, серийно выпускающихся ЗАО «Вектор Бест» (г. Новосибирск). Выполнение иммуноанализа и учет результатов проводят в соответствии с инструкциями производителя. Результаты, полученные с использованием предлагаемого набора, в сравнении с данными моноспецифического иммуноферментного анализа приведены в таблице.

Вид иммуночипов с результатами анализа образцов 1-5 приведен на фиг. 2.

Пример 2. Дифференцированное выявление маркеров ВИЧ инфекции в сыворотке крови в мультиплексном дот-иммуноанализе.

В пробных экспериментах используют:

Зубцы (иммуночипы) 2 подложки 1 с нанесенными по схеме, приведенной на фиг. 3, реагентами захвата и контролями:

Т1 - химерный белок, содержащий эпитопы антигенов gp41, gpl20 ВИЧ 1 и gp36 ВИЧ 2 (выявление суммарных антител к ВИЧ 1 и 2)

Т2 - рекомбинантный белок, содержащий этитопы антигена gp41 ВИЧ 1 (выявление специфических антител к ВИЧ 1);

Т3-рекомбинантный белок, содержащий этитопы антигена gpl20 ВИЧ 1 (выявление специфических антител к ВИЧ 1);

Т4 - рекомбинантный белок, содержащий этитопы антигена gp36 ВИЧ 2 (выявление специфических антител к ВИЧ 2);

Т5 - антитела захвата против антигена р24 ВИЧ (выявление раннего белка р24 ВИЧ);

K1 - IgG из сыворотки крови человека - контроль работоспособности антивидовых детекторных антител;

К2 - антиген р24 ВИЧ - контроль работоспособности детекторных антител к белку р24 ВИЧ;

Один из сегментов (К-) иммуночипов 2 оставлен свободным от специфических белков для оценки фоновых явлений.

Аналитическую ванну 4 с 12 рядами ячеек 5, заполненными так же, как в примере 1 за исключением того, что конъюгат содержит два вида детекторных антител (против иммуноглобулинов человека и против антигена р24 ВИЧ).

Выполнение мультиплексного анализа производят так же, как описано в примере 1. Результат считают положительным, если в месте нанесения соответствующего реагента захвата визуально определяется четко различимое темное пятно, все контроли работоспособности системы имеют интенсивную темную окраску, а зона К- не имеет окраски или слабо окрашена.

Результаты анализа пяти сывороток, содержащих разные маркеры ВИЧ приведены на фиг. 4.

Применение в заявляемом изобретении набора нанесенных на иммуночип реагентов захвата, пре дставленных ка к антигенами, так и антителами; а также использование в качестве системы детекции сложных многокомпонентных конъюгатов, представляющих собой антитела к иммуноглобулинам человека (a/Hum IgG) и антитела к антигенам выявляемых возбудителей, связанные с каталитически активными золями золота, позволяет повысить точность анализа, определять ранние маркеры (например, белок р24 ВИЧ) обеспечивающие осуществление диагностики на ранних стадиях развития инфекции (до выработки специфических антител). Предлагаемый набор позволяет за счет определения в одном анализе сразу ряда маркеров значительно сократить время на обследование пациента. Кроме того, поскольку один анализ с использованием предлагаемого набора эквивалентен нескольким анализам в моноспецифических системах и по стоимости эти анализы близки, использование изобретения в широкой медицинской практике может дать значительный экономический эффект. Предлагаемый набор содержит полный комплект компонентов, автономен и может использоваться не только в клинических лабораториях, но и во внелабораторных условиях для выполнения, как групповых, так и индивидуальных анализов. Чувствительность мультиплексного анализа с использованием предлагаемого набора не уступает чувствительности серийно выпускающихся планшетных моноспецифических иммунопероксидазных тестов (см. пример 1).

Источники патентной и научно-технической информации

1. Патент Китая №1286403, МПК G01N 33/53.

2. Патент Китая №1340712, МПК G01N 33/569.

3. www.biograd.ru; www.orgenics.com.

4. Патент США №5486452, МПК G01N 033/548.

5. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. и др. Теория и практика иммуноферментного анализа. - М.: Высш. школа, 1991. - с. 360.

6. Патент РФ №2296995, МПК G01N 33/53.

7. РФ №2495434, МПК G01N 33/53 (прототип).

8. A. Poltavchenko et all. «А Kit for Multiplexed Detection of Antibodies to Agents of Hemotransmissible Infections». OnLine Journal of Biological Sciences 2016, 16 (3): 137.144 (DOI: 10.3844/ojbsci.2016.137.144).

1. Набор для мультиплексного иммунохимического анализа антител и антигенов в препаратах крови, включающий устройство в виде гребенчатой подложки с набором дискретно нанесенных на поверхности зубцов (иммуночипов) подложки реагентов захвата маркеров инфекционных заболеваний и дополнительно блокированной неспецифическими природными или синтетическими полимерами; емкость для проведения анализа, содержащая несколько рядов изолированных ячеек, выполненных с возможностью введения каждого зубца подложки в отдельную ячейку ванны; растворы для разведения образца и отмывок; конъюгат для детекции; встроенные положительный контроль для контроля качества конъюгата и отрицательный контроль для оценки фоновых явлений и проявитель иммуночипа, отличающийся тем, что набор нанесенных на подложку-иммуночип реагентов захвата содержит антигены и антитела к маркерам одного или нескольких возбудителей инфекционных заболеваний; иммобилизованные на каждом зубце подложки антигены представлены отдельными натуральными, или синтетическими, или рекомбинантными белками, или комбинацией белков или химерными антигенами, содержащими наборы эпитопов соответствующих белков, а антитела захвата представлены аффинно очищенными иммуноглобулинами из поликлональных сывороток или моноклональными антителами, не конкурирующими за сайты связывания (эпитопы) антигенов с детекторными антителами и не реагирующими с антивидовыми иммуноглобулинами в конъюгате; конъюгат для детекции содержит многокомпонентный состав, включающий несколько видов детекторных антител против иммуноглобулинов человека и против выявляемых антигенов, связанных с каталитически активными золями золота; положительные контроли предусматривают оценку работоспособности всех специфических компонентов конъюгата, расположены на отдельных сегментах иммуночипа и включают зону для контроля работоспособности антивидовых детекторных антител, зоны для контроля специфических детекторных антител к каждому выявляемому антигену и зону отрицательного контроля, свободную от специфических белков; проявитель иммуночипа содержит сухой таблетированный и жидкий компоненты и снабжен усилителем и стабилизатором окраски проявленных иммуночипов.

2. Набор по п. 1, отличающийся тем, что конъюгат представлен золем золота, связанным одновременно с несколькими детекторными антителами.

3. Набор по п. 1, отличающийся тем, что конъюгат представлен смесью золей золота, связанных с отдельными видами детекторных антител.

4. Набор по п. 1, отличающийся тем, что сухой таблетированный компонент проявителя содержит смесь лимонной кислоты и метола в соотношении 5:2 соответственно, а жидкий компонент представляет собой раствор, содержащий 0,4% азотнокислого серебра в бидистиллированной воде.

5. Набор по п. 1, отличающийся тем, что усилитель и стабилизатор окраски проявленных иммуночипов представляет собой раствор, содержащий 1% тиомочевины и 1% натрия гидроокиси в дистиллированной воде.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области лабораторной диагностики, медицинской иммунологии и микробиологии и предназначено для определения общей антимикробной активности и совокупной активности антимикробных пептидов (АМП) в клинических образцах сыворотки крови.

Группа изобретений относится к устройствам и системам для обработки яиц. Раскрыта система идентификации лотка с яйцами, содержащая первое измерительное устройство, предназначенное для определения первого значения параметра яиц, содержащихся в яичном лотке в группе таких лотков, процессор, связанный с первым измерительным устройством и выполненный с возможностью приема первых значений параметра от первого измерительного устройства и создания и хранения первой картины образцов данных для яичных лотков, основанной на указанных первых значениях параметра и привязываемой к каждому соответствующему лотку с яйцами в указанной группе таких лотков, и второе измерительное устройство, предназначенное для определения второго значения указанного параметра яиц, находящихся в яичных лотках, при этом указанное устройство расположено за первым измерительным устройством и связано с процессором таким образом, что процессор может принимать вторые значения параметра с получением сравнительной картины образцов данных для яичных лотков, исходя из указанных вторых значений параметра соответствующего лотка с яйцами.

Объектом настоящего изобретения является способ прогнозирования риска развития у субъекта сахарного диабета или метаболического синдрома, где у указанного субъекта нет диабета.
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для оценки эффективности лечения генерализованной формы хронического урогенитального хламидиоза, вызванного Chlamydia trachomatis.

Изобретение относится к экологии, а именно определению остаточного загрязнения твердого материала после обработки его моющей жидкостью. Для этого образец чистого материала с известным начальным весом помещают в водный раствор хлористого натрия с весовой концентрацией 5±0,05% на 2 часа, а затем высушивают и загрязняют композицией, состоящей из материалов, имитирующих загрязнение.

Изобретение относится к области контроля качества топлив и может быть использовано для определения температуры помутнения дизельных топлив. Способ заключается в том, что анализируемый образец вводят в измерительную ячейку, размещают ее в криостатированную камеру, в которой образец предварительно нагревают, а затем подвергают не менее пяти циклам «охлаждение-нагрев», поддерживая в каждом цикле разную скорость изменения температуры и записывая для каждого цикла «охлаждение-нагрев» кривую зависимости, показывающую изменение удельного теплового потока, поступающего из образца при его охлаждении и получаемого образцом при его нагревании, как функцию температуры, на каждой из которых фиксируют температуру начала кристаллизации (ТнкVi) анализируемого образца, температуру застывания (ТзVi) и температуру окончания плавления твердой фазы (ТопVi).

Настоящее изобретение относится к датчику для определения свойств газа, в частности горючего газа. Газовый датчик для измерения свойств газа включает в себя датчик вязкости газа, содержащий взаимодействующую с газом часть, находящуюся в контакте с газом, подлежащим измерению, и систему измерительной камеры, содержащую измерительную камеру, первый проход с высоким сопротивлением, соединяющий по текучей среде измерительную камеру с взаимодействующей с газом частью, генератор давления, выполненный с возможностью создания изменения давления в измерительной камере, и датчик давления, выполненный с возможностью измерения изменяющегося во времени отклонения давления газа в измерительной камере, причем изменяющееся во времени отклонение давления в измерительной камере вследствие течения газа через проход с высоким сопротивлением коррелировано с вязкостью газа, датчик вязкости газа дополнительно содержит систему эталонной камеры, содержащую эталонную камеру и второй проход с высоким сопротивлением, соединяющий между собой по текучей среде эталонную камеру и взаимодействующую с газом часть, причем эталонная камера связана с датчиком давления измерительной камеры так, что датчик давления выполнен с возможностью измерения перепада давления между давлением в измерительной камере и давлением в эталонной камере.

Данное изобретение относится к биотехнологии. Предложены способы in vitro прогнозирования риска смерти в течение одного года, основанные на использовании антител, которые связываются с растворимым белком человека, продуктом гена 2, экспрессируемым при стимуляции роста (ST2), или их антигенсвязывающих фрагментов.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ обнаружения генетических факторов (генов), определяющих функционирование ДНК-структур клетки - теломер, обуславливающих, в свою очередь, продолжительность жизни клетки эукариот.

Изобретение относится к экологии, а именно к оценке состояния жилых помещений, включающий определение уровней загрязнения, по нескольким загрязняющим факторам. Для этого отбирают пробы воды и воздуха в помещениях обследуемого объекта, измеряют уровни радиационного фона, электромагнитных полей, шума, температуры, влажности и скорости движения воздуха в помещении.

Группа изобретений относится к устройству для диагностики in vitro и применению этого устройства для идентификации и определения групп крови. Раскрыто устройство (10) для диагностики in vitro для детекции по меньшей мере одной реакции между антигеном эритроцитарного фенотипа и антителом, содержащее подложку (12) и гидрофобную пористую мембрану (14) толщиной от 0,05 до 1,5 мм с диаметром пор от 2 до 30 мкм, причем указанная мембрана содержит по меньшей мере одну гидрофильную область реакции (16), предназначенную для получения указанного образца, и поверхность гидрофильной области реакции (16) меньше поверхности гидрофобной пористой мембраны (14).

Изобретение относится к области ветеринарии. Предложен способ определения специфических антител к вирусу гепатита утят типа I путем проведения ИФА, включающий получение антигена.

Изобретение относится к области ветеринарии. Предложен способ определения специфических антител к вирусу гепатита утят типа I путем проведения ИФА, включающий получение антигена.

Группа изобретений относится к биотехнологии, медицине и биохимии, в частности к аналитической биохимии и иммунохимическому анализу. Раскрыт биологический микрочип для обнаружения экзосом в сыворотке крови человека, представляющий собой массив трехмерных гидрогелевых элементов полусферической формы диаметром 100 мкм на поверхности стеклянного слайда, причем гидрогелевые элементы получены путем полимеризации смеси, содержащей гелеобразующие мономеры на основе метакриламида и моноклональные антитела CD81, CD147, А33, при этом биологический микрочип включает гидрогелевые элементы, в каждом из которых иммобилизовано индивидуальное антитело, а также пустые гидрогелевые элементы, не содержащие иммобилизованных молекулярных зондов, для контроля неспецифических взаимодействий.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению конъюгатов люминесцентных наночастиц диоксида кремния с антителами, и может быть использовано в диагностике для выявления гиперэкспрессирующегося на поверхности опухолевых клеток рецептора эпидермального фактора роста человека 2 (HER2/neu).

Изобретение относится к области медицины, молекулярной биологии и микробиологии. Предложен способ определения генетических детерминант резистентности возбудителя туберкулеза к бедаквилину и линезолиду, включающий мультиплексную амплификацию генов Rv0678, atpE, 23S рРНК, rplC, обеспечение олигонуклеотидного микрочипа для установления наличия/отсутствия точечных мутаций, инсерций, делеций в указанных генах, гибридизацию амплифицированных флуоресцентно-меченных продуктов на олигонуклеотидном микрочипе и регистрацию результатов гибридизации.

Изобретение относится к медицине и касается способа выявления продуктов протеолиза MUC-1, имеющих С-концевой лизин в жидкости, при котором приводят в контакт исследуемую жидкость с тест-системой для выявления продуктов протеолиза MUC-1, имеющих С-концевой лизин, которая включает по крайней мере выбранную одну из: полноразмерная молекула плазминогена, ее фрагмент, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1-4, 6-20.

Группа изобретений относится к области техники, раскрывающей биологические или химические исследования. Биодатчик содержит основу устройства, имеющую матрицу светочувствительных датчиков и матрицу световодов.

Группа изобретений относится к области подготовки поверхности планарного волновода, способной связывать испытуемые образцы. Способ подготовки внешней поверхности планарного волновода, способной связывать испытуемые образцы вдоль множества заранее заданных линий, содержит этапы: предоставления планарного волновода, имеющего внешнюю поверхность, приспособленную для присоединения линкерных молекул к внешней поверхности; последовательного нанесения по меньшей мере одного множества линкерных молекул на внешнюю поверхность, причем каждое множество из по меньшей мере одного множества линкерных молекул компонуют, формируя индивидуальный слой линкерных молекул, причем индивидуальные слои формируют один над другим, начиная от внешней поверхности планарного волновода, причем каждая линкерная молекула содержит функциональную группу и головную группу, причем головная группа способна присоединяться к внешней поверхности планарного волновода или к функциональным группам предыдущего слоя линкерных молекул, в котором функциональные группы линкерных молекул из самого верхнего слоя связывают с фотолабильными защитными группами, так чтобы каждая функциональная группа самого верхнего слоя, связанная с упомянутой фотолабильной защитной группой, была не способна присоединять комплементарную функциональную группу дополнительной молекулы; и экспонирования этих фотолабильных защитных групп самого верхнего слоя, расположенных вдоль множества заранее заданных линий, светом заранее заданной длины волны для удаления экспонированных фотолабильных защитных групп из функциональных групп для придания этим функциональным группам способности присоединять комплементарную функциональную группу дополнительной молекулы, причем дополнительная молекула является молекулой захвата, модифицированной молекулой захвата или линкерной молекулой.

Изобретение относится к области генетики, молекулярной биологии и медицины. Предложен способ выявления соматических мутаций Q209P (с.

Изобретение относится к аналитической химии и метрологическому обеспечению средств измерений состава твердых и жидких веществ и материалов. Проводят определение катионов и анионов методом капиллярного электрофореза, затем измерение массовых долей примесей методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой и определение массовой доли органического компонента и кристаллизационной воды методом термогравиметрии с дифференциально-сканирующей калориметрией с масс-спектрометрическим детектором.

Изобретение относится к наборам для иммунохимического анализа антител и антигенов в препаратах крови и может быть использовано в медицинской диагностике. Раскрыт набор для мультиплексного иммунохимического анализа антител и антигенов в препаратах крови, включающий устройство в виде гребенчатой подложки с набором дискретно нанесенных на поверхности зубцов подложки реагентов захвата маркеров инфекционных заболеваний и дополнительно блокированной неспецифическими природными или синтетическими полимерами; емкость для проведения анализа, содержащую несколько рядов изолированных ячеек, выполненных с возможностью введения каждого зубца подложки в отдельную ячейку ванны; растворы для разведения образца и отмывок; конъюгат для детекции; встроенные положительный контроль и отрицательный контроль. При этом реагенты захвата содержат антигены и антитела к маркерам одного или нескольких возбудителей инфекционных заболеваний; иммобилизованные на каждом зубце подложки; конъюгат для детекции содержит многокомпонентный состав, включающий несколько видов детекторных антител против иммуноглобулинов человека и против выявляемых антигенов, связанных с каталитически активными золями золота; положительные контроли предусматривают оценку работоспособности всех специфических компонентов конъюгата, расположены на отдельных сегментах иммуночипа и включают зону для контроля работоспособности антивидовых детекторных антител, зоны для контроля специфических детекторных антител к каждому выявляемому антигену и зону отрицательного контроля, свободную от специфических белков; проявитель иммуночипа содержит сухой таблетированный и жидкий компоненты и снабжен усилителем и стабилизатором окраски проявленных иммуночипов. Изобретение обеспечивает повышение информативности мультиплексного анализа и диагностику ранних стадий инфекции за счет одновременного выявления в образцах интересующих спектров антител и антигенов. 4 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 2 пр.

Наверх