Способ дифференциальной диагностики случной болезни (t. equiperdum) и сурры (t. evansi) лошадей

Изобретение относится к области молекулярной биологии и ветеринарии и предназначено для дифференциальной диагностики случной болезни и сурры лошадей. Для этого сначала из крови больных лошадей или из крови мышей и кроликов, которым трехкратно вводили трипаносомный антиген с адьювантом (гидроокись алюминия) и которых тотально обескровливали на 25-30 день, получают высокоактивные и высокоспецифичные ДНК-содержащие антигены Т. evansi и Т. equiperdum, которые лиофилизируют, а затем используют при постановке полимеразной цепной реакции с праймерами к гену RoTat1.2 VSG, гену субъединицы 5 NADH дегидрогеназы (nad5) с последующим электрофоретическим определением размера амплифицируемого фрагмента нуклеотидной последовательности. При наличии на электрофореграмме фрагмента длиной 410 н.п. диагностируют наличие в образцах ДНК-содержащих антигенов ДНК Т. evansi, а при наличии фрагмента длиной 724 н.п. диагностируют наличие в образцах ДНК-содержащих антигенов ДНК Т. equiperdum соответственно. Способ позволяет достоверно дифференцировать трипаносомы видов Т. evansi и Т. equiperdum. 6 ил.

 

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики паразитарных болезней животных, научных исследований в ветеринарии и молекулярной биотехнологии и может быть использовано в диагностических исследованиях в научно-исследовательских институтах, ветеринарных лабораториях, животноводческих хозяйствах.

Трипаносомы - одноклеточные простейшие жгутиковые паразиты класса кинетопластид. На территории России встречаются возбудители случной болезни (Т. equiperdum) и сурры (Т. evansi) лошадей.

По данным Международного Эпизоотическое Бюро случную болезнь, вызываемую Trypanosoma equiperdum, регистрируют в Южной Африке, на юге Западной Европы, в Южной Америке, КНР, Среднем Востоке, Средней Азии (Киргизии, Узбекистане) и в России (Сибири). У лошадей случная болезнь протекает наиболее тяжело с высоким уровнем смертности (30…50%).

Tr. evansi широко распространена в Азии, Северной Африке, Центральной и Южной Америке. К ней восприимчивы большинство видов домашних и многие виды диких животных. У непривитых лошадей вызываемая этой трипаносомой болезнь - сурра (суауру), - как правило, заканчивается летально.

Согласно утвержденным Международным Эпизоотическим Бюро Правилам, ввоз лошадей из неблагополучных по случной болезни стран разрешен только при условии полного исключения у них данного трипаносомоза. С этой целью в основном применяют серологические тесты (чаще всего реакцию связывания комплемента и дополнительно иммуноферментный анализ), микроскопию мазков и биопробу на лабораторных животных.

При проведении диагностических исследований особую сложность представляет видовая дифференциация Tr. equiperdum и Tr. evansi, поскольку они неразличимы морфологически, имеют перекрестно реагирующие антигены и многочисленные сходные участки генома (фиг. 1 и фиг. 2).

Вместе с тем, разработка достоверных методов, позволяющих дифференцировать возбудителей этих двух болезней, является важной задачей для ветеринарной медицины, так как от правильности постановки диагноза зависит выбор дальнейшей стратегии. При случной болезни лошадей убивают, а при суре - лечат.

Принцип полимеразной цепной реакции (ПЦР) заключается в многократном увеличении (амплификации) определенного участка ДНК выявляемого объекта путем его копирования с помощью фермента ДНК-полимеразы и специфических праймеров. Специфические праймеры (прямой и обратный) ограничивают определенный фрагмент нуклеотидной последовательности таким образом, что элонгация новой цепи ДНК при амплификации в ПЦР происходит только между ними. Основными параметрами эффективного прохождения реакции амплификации, обеспечивающими специфичность и чувствительность, являются правильный выбор области генома идентифицируемого агента, структура и температурный режим отжига олигонуклеотидных праймеров.

До сих пор никому не удалось создать универсальную тест-систему для дифференциации трипаносом видов Т. evansi и Т. equiperdum методом ПЦР.

Уровень техники

Известен способ дифференциальной диагностики Т. evansi и Т. equiperdum серологическими методами с применение реакции связывания комплемента со специфическими трипаносомными антигенами в разведениях от 1:10 до 1:160. Данный метод позволяет дифференцировать возбудителей друг от друга, но при этом остается вероятность перекрестной реакции ввиду близкородственных генетических связей обеих трипаносом и похожести их некоторых поверхностных антигенов (Георгиу X. Получение высокоактивных и высокоспецифичных трипаносомных сывороток. ВЕТКОРМ» №1/2014 Москва стр. 26-28)

За прототип мы взяли способ диагностики Т. evansi и Т. equiperdum методом ПЦР с использованием одной пары праймеров. Однако эти праймеры позволяют установить лишь принадлежность трипаносомы из исследуемого материала к подроду Trypanozoon, и позволяет только выявить в образце сразу по меньшей мере три вида трипаносом (Т. equiperdum, Т. brucei и Т. evansi) без видовой дифференциации. В случае случной болезни и сурры это не приемлемо, так как позволяет только обнаружить возбудителя в образце, но не может различить их по видовой принадлежности. (Ломакина Н.Ф., Георгиу X., Гулюкин М.И. Трудности дифференциации трипаносом Т. evansi и Т. equiperdum // Сборник трудов VIII сероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика». Том II. Москва. Март 2014 г. стр. 491-492.)

Раскрытие изобретения

Техническим результатом является достоверная дифференциация трипаносомы видов Т. evansi и Т. equiperdum.

Сущность предполагаемого изобретения заключается в том, что для дифференциальной диагностики сначала из крови больных лошадей или из крови мышей и кроликов, которым трехкратно вводили трипаносомный антиген с адьювантом (гидроокись алюминия) и которых тотально обескровливали на 25-30 день, получают высокоактивные и высокоспецифичные ДНК-содержащие антигены Т. evansi и Т. equiperdum (Фиг. 3), которые лиофилизируют, а затем используют при постановке полимеразной цепной реакции с специально разработанными праймерами: ACGAAGTGGCTTCTGAAGG и AGCTAATCCCAACCTTGCC, AGGAGGAGCCAGAGTGGA и CCAGAGATTCCGCACCACT (Фиг. 4) - к гену RoTat1.2 VSG, гену субъединицы 5 NADH дегитрогеназы (nad5) с последующим электрофоретическим (Фиг. 5 и Фиг. 6) определением размера амплифицируемого фрагмента нуклеотидной последовательности, где по наличию на электрофораграмме фрагментов соответствующей длины в исследуемом образце диагностируют наличие в ДНК-содержащих антигенах паразитов Т. evansi или Т. equiperdum.

Осуществление изобретения.

Предлагаемое изобретение может быть проиллюстрировано следующим примером:

Нами было выявлено, что для выявления Т. evansi и Т. equiperdum целесообразно использовать праймеры к специфичному для обоих возбудителей участку гена RoTat1.2 VSG, гену субъединицы 5 NADH дегитрогеназы (nad5) как наиболее консервативной области генома. При конструировании праймеров и оценке их специфичности использовали нуклеотидные последовательности и программу BLAST, доступные в Интернете на сайте NCBI.

Предложенный способ заключается в следующем: с помощью компьютерной программы DNASTAR (Lasergene Co., USA) на основании программы, предоставленной в базах данных Интернет ресурсов GenBank (CLUA), по генотипам возбудителей выбирают рефернс - последовательность. Праймеры проверяют на отсутствие гомологии с последовательностями других микроорганизмов и генома человека программой BLAST с помощью веб-ресурса Национального центра биотехнологической информации (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). На основании проведенного компьютерного анализа были подобраны пары праймеров ACGAAGTGGCTTCTGAAGG и AGCTAATCCCAACCTTGCC, AGGAGGAGCCAGAGTGGA и CCAGAGATTCCGCACCACT, которые являются главным компонентом ПЦР и обеспечивают ее специфичность и чувствительность.

Праймеры имеют следующую характеристику: комлементарность выбранной области гена, отсутствие самокомлементарных участков внутри каждого праймера и между прямым и обратным, фланкируют область фрагментов гена RoTat1.2 VSG, гену субъединицы 5 NADH дегитрогеназы (nad5). Синтез разработанных олигонуклеотидных праймеров заказывается в коммерческом сервисном центре.

Амплификация специфических фрагментов ДНК анаплазм с помощью разработанных праймеров для дифференциальной диагностики случной болезни и суры лошадей.

В процессе проведения практических экспериментов подбирают оптимальные условия прохождения полимеразной цепной реакции с разработанными праймерами.

ДНК прогревают при 95° в течение 3 минут и используют для постановки ПЦР. Состав реакционной смеси указан в таблице 4. В качестве положительного контроля и ПЦР используют референтный штамм Альфорт. Предварительно штамм был исследован серологическими методами (РСК и ИФА). В качестве отрицательного контроля используют дистиллированную воду.

Полимеразную цепную реакцию проводят в объеме реакционной смеси 25 мкл на 1 пробу ДНК. Температурно-временной режим проведения реакции для амплификатора «Терцик» («ДНК-технология», Россия) представлен в фиг. 4.

После проведения реакции амплификации продукты ПЦР анализируют методом электрофоретического разделения в 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия.

В процессе ПЦР были получены продукты амплификации ДНК фрагмента специфичного участка гена RoTat1.2 VSG, гену субъединицы 5 NADH дегитрогеназы (nad5), кодирующего ДНК трипаносом. При обнаружении амплифицируемых фрагментов нуклеотидной последовательности соответствующей длины на электрофореграмме в исследуемом образце диагностируют наличие в исследуемом образце трипаносом Т. evansi или Т. equiperdum.

При учете результатов ПЦР в первую очередь оценивали контрольные образцы. В электрофоретической дорожке с положительным контрольным образцом (K+) присутствовала светящаяся полоса на уровне соответствующем фрагменту длиной 410 н.п. (Т. evansi) или 724 н.п. (Т. equiperdum) В отрицательных пробах полоса отсутствовала.

Опытные пробы оценивали по наличию в соответствующей дорожке специфической полосы, которая в положительных образцах располагалась на том же уровне, что и полоса в положительной контрольной пробе.

Заявляемое изобретение апробировано с положительным результатом и регулярной воспроизводимостью в 2015-2017 годах на 50 пробах, полученных из сохраняемых в криобанке лаборатории референтных штаммов Т. evansi и Т. equiperdum и от больных лошадей, поступивших из различных регионов.

Предлагаемое изобретение найдет применение в диагностических исследованиях в научно-исследовательских институтах, ветеринарных лабораториях, животноводческих хозяйствах.

Список литературы.

1. Георгиу X. Получение высокоактивных и высокоспецифичных трипаносомных сывороток. ВЕТКОРМ» №1/2014 Москва стр. 26-28.

2. Ломакина Н.Ф., Георгиу X., Гулюкин М.И. Трудности дифференциации трипаносом Т. evansi и Т. equiperdum // Сборник трудов VIII сероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика». Том II. Москва. Март 2014 г. стр. 491-492.

На фиг. 1 изображена дендрограмма фрагмента в 410 н.п. из области миникольца кинетопласта, построенная методом ближайшего соседа с повторной выборкой n=1000 в бутстрепном анализе в программе Mega 4. Статистическая достоверность соответствующих узлов дерева представлена в процентах. Шкала делений отражает эволюционное расстояние - число замен нуклеотидов на сайт. Эволюционное расстояние рассчитано методом максимального правдоподобия. Кружками помечены пробы, исследованные в настоящей работе.

На Фиг. 2. изображена дендрограмма фрагмента в 724 н.п. из области миникольца кинетопласта. Статистическая достоверность соответствующих узлов дерева представлена в процентах. Шкала делений отражает эволюционное расстояние - число замен нуклеотидов на сайт. Эволюционное расстояние рассчитано методом максимального правдоподобия. Кружками помечены пробы, исследованные в настоящей работе.

Способ дифференциальной диагностики случной болезни Т. Equiperdum и сурры Т. evansi лошадей, включающий в себя постановку полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами и отличающийся тем, что для дифференциальной диагностики сначала из крови больных лошадей или из крови мышей и кроликов, которым трехкратно вводят трипаносомный антиген с гидроокисью алюминия и которых тотально обескровливают на 25-30 день, получают высокоактивные и высокоспецифичные ДНК-содержащие антигены Т. evansi и Т. equiperdum, которые лиофилизируют, а затем используют при постановке полимеразной цепной реакции с праймерами ACGAAGTGGCTTCTGAAGG и AGCTAATCCCAACCTTGCC, AGGAGGAGCCAGAGTGGA и CCAGAGATTCCGCACCACT к гену RoTat1.2 VSG, гену субъединицы 5 NADH дегидрогеназы (nad5) с последующим электрофоретическим определением размера амплифицируемого фрагмента нуклеотидной последовательности, где по наличию на электрофореграмме фрагмента длиной 410 н.п.диагностируют наличие в образцах ДНК-содержащих антигенов ДНК Т. evansi, а при наличии фрагмента длиной 724 н.п. диагностируют наличие в образцах ДНК-содержащих антигенов ДНК Т. equiperdum соответственно.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ оценки нарушений имплантации эмбриона на ранней стадии беременности до 12 недель, осложненной цитомегаловирусной инфекцией, заключающийся в исследовании гомогената ворсинчатого хориона иммуноферментным методом, где в гомогенате ворсинчатого хориона определяют содержание СОХ-2 и при значении СОХ-2 более 16,85 нг/мл делают заключение о нарушении имплантации эмбриона.
Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии, и может быть использовано для прогнозирования развития осложнения при черепно-мозговой травме у пострадавших в экстремальных условиях Арктики.
Изобретение относится к ветеринарии, а именно к способу изготовления эритроцитарного диагностикума для диагностики пуллороза-тифа птиц. Способ включает получение бактериальной массы Salmonella gallinarum pullorum, выделение из нее антигенной фракции, Обработку бактериальной массы поверхностно-активным веществом с добавлением соды или щелочи в дистиллированной воде при 93-96°C с дальнейшей сенсебилизацией формалинизированных эритроцитов, их очисткой и получением целевого продукта в виде 10%-ной суспензии.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ обнаружения генетических факторов (генов), определяющих функционирование ДНК-структур клетки - теломер, обуславливающих, в свою очередь, продолжительность жизни клетки эукариот.

Группа изобретений относится к медицине и касается иммобилизованного белкового материала, содержащего носитель и по меньшей мере один белок, иммобилизованный на носителе.

Группа изобретений относится к медицине и касается способа повышения специфического захвата нейротоксического полипептида клетками, включающего инкубацию с нейротоксическим полипептидом клеток, восприимчивых к интоксикации нейротоксином, в течение времени и в условиях, которые позволяют нейротоксическому полипептиду проявить свою биологическую активность, причем инкубация включает по меньшей мере два из следующих этапов: (i) K+-опосредованную деполяризацию клеток, (ii) уменьшенное время воздействия нейротоксического полипептида, составляющее по меньшей мере 24 часа и меньше 96 часов, и/или (iii) встряхивание клеток во время воздействия нейротоксического полипептида, что приводит к повышению специфического захвата нейротоксического полипептида указанными клетками, причем специфический захват нейротоксического полипептида в клетку повышен по меньшей мере в 1,5 раза по сравнению со способом с применением условий культивирования клеток, которые не включают (i), (ii) и/или (iii).

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ прогнозирования риска развития псориаза 2 типа у женщин в постменопаузе, характеризующийся тем, что в сыворотке крови определяют уровень фолликулостимулирующего гормона методом иммунофлуоресценции и рассчитывают коэффициент прогноза риска развития псориаза 2 типа по формуле К=у×100%, где К - коэффициент прогноза риска развития псориаза 2 типа,у=ехр(-7,5+(0,17)*ФСГ)/(1+ехр(-7,5+(0,17)*ФСГ)), где у - коэффициент множественной регрессии, ФСГ - концентрация фолликулостимулирующего гормона в сыворотке крови в мМе/мл, при этом если K≥60%, то прогноз риска развития псориаза 2 типа у женщин в постменопаузе высокий, а если K<60%, то прогноз риска развития псориаза 2 типа низкий.

Изобретение относится к аналитической химии, а именно для изучения различных биомолекул методом люминесцентной визуализации клеток и их компонент. Для этого используют флуоресцентный оптический ДНК сенсор, состоящий из подложки и адсорбированной на ней тонкой пленки комплекса ДНК-люминофор.
Изобретение относится к области медицины, а именно клинической иммунологии, и может найти применение для оценки эффективности назначаемой общепринятой терапии заместительными внутривенными иммуноглобулинами согласно стандартным режимам у больных с общевариабельной иммунной недостаточностью (ОВИН).

Группа изобретений относится к области биотехнологии и предназначена для исследования ферментативной активности ботулинического нейротоксина. Предложена репортерная конструкция, которая содержит участок заякоривания в мембране, сайт расщепления и репортерную область, содержащую два идентичных репортерных пептида.

Изобретение относится к области медицины, в частности к молекулярной онкологии, и предназначено для прогнозирования развития метастазов в печени у больных раком толстой кишки.

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и биохимии. Предложен способ секвенирования нуклеиновых кислот.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Описан способ выявления в крови больных циркулирующих мишеней, ассоциированных с определенным диагнозом.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Описан способ выявления в крови больных циркулирующих мишеней, ассоциированных с определенным диагнозом.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ прогнозирования риска развития ишемического инсульта. Способ может быть использован для выявления риска развития острого нарушения мозгового кровообращения у индивидуумов русской национальности, являющихся жителями Центрального Черноземья.
Изобретение относится к ветеринарии, а именно к способу изготовления эритроцитарного диагностикума для диагностики пуллороза-тифа птиц. Способ включает получение бактериальной массы Salmonella gallinarum pullorum, выделение из нее антигенной фракции, Обработку бактериальной массы поверхностно-активным веществом с добавлением соды или щелочи в дистиллированной воде при 93-96°C с дальнейшей сенсебилизацией формалинизированных эритроцитов, их очисткой и получением целевого продукта в виде 10%-ной суспензии.

Изобретение относится к области биотехнологии, биохимии, молекулярной биологии, микробиологии и медицине. Предложен ДНК-чип и набор для идентификации генетических детерминант резистентности микроорганизмов - возбудителей инфекций, приводящих к нарушению репродуктивных функций человека: Treponema pallidum, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Gardnerella vaginalis, Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealiticum, Atopobium vaginae, Enterococcus faecalis, Trichomonas vaginalis, Escherichia coli, Mobiluncus mulieris, Streptococcus anginosus, Fusobacterium nucleatum, Staphylococcus epidermidis, Bacteroides fragilis, к антимикробным препаратам, включающим антибиотики пенициллинового ряда, цефалоспорины, тетрациклины, фторхинолоны, макролиды, нитроимидазолы, спектиномицин.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ обнаружения генетических факторов (генов), определяющих функционирование ДНК-структур клетки - теломер, обуславливающих, в свою очередь, продолжительность жизни клетки эукариот.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ обнаружения генетических факторов (генов), определяющих функционирование ДНК-структур клетки - теломер, обуславливающих, в свою очередь, продолжительность жизни клетки эукариот.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ быстрой и надежной детекции микобактерий туберкулеза генотипа Beijing В0-кластер.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и ветеринарии и предназначено для дифференциальной диагностики случной болезни и сурры лошадей. Для этого сначала из крови больных лошадей или из крови мышей и кроликов, которым трехкратно вводили трипаносомный антиген с адьювантом и которых тотально обескровливали на 25-30 день, получают высокоактивные и высокоспецифичные ДНК-содержащие антигены Т. evansi и Т. equiperdum, которые лиофилизируют, а затем используют при постановке полимеразной цепной реакции с праймерами к гену RoTat1.2 VSG, гену субъединицы 5 NADH дегидрогеназы с последующим электрофоретическим определением размера амплифицируемого фрагмента нуклеотидной последовательности. При наличии на электрофореграмме фрагмента длиной 410 н.п. диагностируют наличие в образцах ДНК-содержащих антигенов ДНК Т. evansi, а при наличии фрагмента длиной 724 н.п. диагностируют наличие в образцах ДНК-содержащих антигенов ДНК Т. equiperdum соответственно. Способ позволяет достоверно дифференцировать трипаносомы видов Т. evansi и Т. equiperdum. 6 ил.

Наверх