Биопрепарат для профилактики и лечения эндометритов у коров

Изобретение относится к биотехнологии. Препарат для лечения и профилактики послеродовых эндометритов коров для внутриматочного введения содержит бактерии Bacillus subtilis и бактерии Bacillus licheniformis с титром спор 10⁸-10¹¹ в соотношении 1:1, 0,5-1,5% раствор хитозана со степенью дезацетилирования не менее 70% и вязкостью 20-200 сП и вспомогательные вещества, такие как лактоза, СаСО₃, молочная сыворотка или свекольный сок в заданном соотношении компонентов. При этом в качестве бактерий используются штамм Bacillus subtilis УКМ В-5007 и штамм Bacillus licheniformis УКМ В-5514 или Bacillus subtilis ВКПМ В-10172 и штамм Bacillus licheniformis ВКПМ В-10135 или Bacillus subtilis СН201 и штамм Bacillus licheniformis СН200, а рН находится в пределах 3,5-5,8. Изобретение позволяет улучшить эффективность лечения или профилактики послеродовых эндометритов коров. 3 з.п. ф-лы, 2 табл., 15 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, ветеринарной медицине, в частности – к гинекологии, и может быть использовано для предупреждения и лечения патологии репродуктивных органов в послеродовом периоде.

Послеродовые эндометриты коров стали масштабным явлением. Они по нарастающей сопровождают весь период промышленного скотоводства, и в среднесрочной перспективе снижение их масштабов не просматривается. Если раньше эндометриты наблюдались у 30% рожениц, то сейчас отмечают до 80% случаев, причем особенно часто – у высокопродуктивных коров.

Первопричина эндометритов может быть разной, но в родовых путях больных животных всегда отмечается массированное развитие микрофлоры. Отсюда следует, что эффективным лечебно-профилактическим средством при послеродовых эндометритах должны быть этиотропные препараты с выраженным антимикробным действием. Обычно это антибиотики, и их применение действительно позволяет устранить клинические признаки послеродового эндометрита. Однако у многих животных заболевание переходит в скрытую форму, без клинических проявлений. В результате следствием монотерапии антибиотиками часто оказывается бесплодие.

В качестве альтернативы антибиотикам предлагается использовать препараты на основе йода, для внутриматочного применения. /1, 2/. Недостатком такой монотерапии, заметно ограничивающим применение йодсодержащих препаратов, является сильное раздражающее действие йода на слизистую оболочку матки.

Другим подходом к лечению послеродовых эндометритов является комплексное лечение, когда наряду с антимикробной терапией одновременно применяют иммуностимулирующую, гормональную, витаминную и другие варианты терапии. Эффективность такого лечения выше, т.к. число бесплодий значительно меньше, чем при монотерапии. Однако необходимость вводить корове целый ряд препаратов заметно увеличивает трудоемкость процесса.

Дальнейшим развитием принципа комплексного лечения является применение многокомпонентных препаратов, содержащих два и более действующих начала различной фармакологической направленности: антибактериальные, иммуностимулирующие, миотропные, общеукрепляющие и другие.

Так, известен препарат Метролек, обладающий противовоспалительным, противомикробным, регенеративным и миотоническим свойствами благодаря наличию в его составе таких действующих начал, как облепиховое масло, тилозин тартрат, фуразолидон, β-каротин, метилурацил, метронидазол, миотоническое средство, масло растительное. Препарат представляет собой эмульсию и вводится больной эндометритом корове внутриматочно, в количестве от 20 до 60 см³ 1 раз в сутки с интервалом в 24 часа /3, 4/.

Известен также препарат Метролек-Е, отличающийся от Метролека тем, что он вместо тилозин тартрата содержит в своем составе энрофлоксацин.

Недостатком указанных препаратов является то, что в их состав обязательно входит антибиотик, со всеми вытекающими отсюда последствиями (привыкание микрофлоры, возможность аллергических реакций, невозможность использования молока для пищевых целей).

Известно средство для лечения эндометритов у коров в виде суппозиториев, содержащих фуразолидон и дополнительно биологически активное вещество Био-Мос, диметилсульфоксид и карбахолин /5/.

Недостатком данного средства является то, что входящее в его состав антимикробное средство фуразолидон оказывает на раневую поверхность слизистой оболочки матки раздражающее действие, аналогично действию йодных препаратов.

Несмотря на то, что в целом применение многокомпонентных препаратов имеет свои преимущества, как менее трудоемкое по сравнению с комплексным лечением, заметного повышения эффективности лечения и в этом случае не наблюдается.

Все большее распространение приобретает использование для лечения послеродовых эндометритов пробиотических препаратов на основе спорообразующих бактерий. Их применение позволяет не только добиться высокого лечебного эффекта без отрицательного воздействия на организм животного, но также нормализовать состояние его репродуктивной системы после применения противомикробных препаратов. К тому же спорообразующие пробиотики самоэлиминируются из организма после оказания пробиотического действия.

Пробиотические препараты на основе бактерий рода Bacillus оказывают на патогенную и условно-патогенную микрофлору как прямое, так и опосредованное действие. Первый вариант осуществляется за счет синтеза биологически активных веществ, таких как различные гидролитические ферменты и антибиотикоподобные вещества (например, дипиколиновая кислота). Второй вариант связан с активацией иммунного ответа организма: бактерии рода Bacillus оказывают стимулирующее воздействие на регионарные лимфатические узлы и лимфоциты крови, что значительно повышает уровень защитных реакций организма. Также установлен факт повышения продукции эндогенного интерферона уже в первые минуты после введения пробиотика на основе Bacillus. Споровые пробиотические препараты обладают высоким профилем безопасности. Об этом свидетельствует многолетний опыт их клинического применения в медицине и ветеринарии для нормализации микрофлоры кишечного тракта, а также результаты экспериментальных работ. В ходе многочисленных морфологических, биохимических, бактериологических и иммунологических исследований побочных явлений не выявлено, следовательно, споровые пробиотические препараты можно считать достаточно безопасными /6/.

Для лечения эндометритов у коров предложено немало споровых пробиотиков. Известен препарат под названием Гипролам для профилактики послеродовых эндометритов у коров. Он представляет собой суспензию светло-коричневого цвета, содержащую жизнеспособные штаммы молочнокислых бактерий Lactobacillus fermentum 44/1 (ВКПМ В-2940) и Lactococcus lactis subsp. lactis 574 (ВКПМ В-3145) в количестве не менее 1х108 КОЕ/см³ и вспомогательные вещества: вода, сыворотка молочная, глюкоза, экстракт дрожжевой. Предлагается применять Гипролам интравагинально по двум схемам: до родов, за 5-7 дней до отела, ежедневно в дозе 100 мл /7/ и после родов, не позднее 12 часов, дважды с интервалом 24 часа. Применение его до отела профилактирует развитие у коров послеродового эндометрита в 71,4-80,0%, а после отела – поддерживает на оптимальном уровне содержание в родовых путях и молозиве индигенной микрофлоры /7, 8, 9/.

Недостатком препарата Гипролам является его невысокая эффективность, в среднем– 75%, и незначительный срок его хранения, всего 45 дней /3/.

Известен пробиотический препарат под названием Моноспорин для лечения коров с хроническим эндометритом. Моноспорин представляет собой суспензию со взвешенными частицами от светло-коричневого до кремового цвета, содержащую микробную массу спорообразующих бактерий Bacillus subtilis 945 (B-5225) в количестве 1х10⁸ КОЕ/см³. Препарат вводят внутриматочно по 5 мл 1 раз в день на 9, 10, 11, 12 и 13 дни после отела. В результате период от родов до восстановления половой цикличности сокращается на 17,36 дней, индекс оплодотворения сократился на 0,56 /10/.

Известен препарат под названием Эндоспорин для лечения и профилактики эндометритов животных, представляющий собой лиофилизированную биомассу Bacillus subtilis 39 и Bacillus subtilis 51 в соотношениях клеток 1:1 при следующем соотношении компонентов на 1 г сухого препарата: штамм Bacillus subtilis 39 4-5х10¹¹ клеток и штамм Bacillus subtilis 51 4-5х10¹¹ клеток, стабилизатор сахароза 40 мг, желатина 10 мг, остальное сухой остаток среды роста и метаболиты бактерий. В 0,5 г сухого препарата содержится не менее 400-500 млрд. клеток. /11,12/.

Известен препарат ветеринарного назначения «Ирилис», в состав которого входит штамм B.subtilis ВКПМ В-8611 и штамм B.licheniformis ВКПМ В-8610. Штаммы характеризуются широким спектром антагонистической активности, могут использоваться как в равных, так и в различных соотношениях /13/.

Известен препарат, названный Ветомгин, который представляет собой гинекологические свечи весом 2 г и является иммобилизированной высушенной споровой биомассой бактерий Bacillus subtilis ВКПМ-7048 и Bacillus licheniformis ВКПМ-7038 на пенной основе. Препарат используется как в профилактических, так и в лечебных целях, включая хронический эндометрит, путем внутриматочного введения по 1 суппозиторию 1 или 2 раза в сутки в течение трех дней. При увеличении числа суппозиториев до 2 или даже 3 суппозиториев одновременно продолжительность лечения до выздоровления составляет от 3 до 8 дней, а сервис период уменьшается на 20-40 дней в зависимости от количества введенных суппозиториев и схемы их введения в течение суток /14/. Тем не менее препарат не нашел широкого применения у практикующих ветеринарных специалистов из-за его недостаточной эффективности.

Из представленного материала следует, что все перечисленные пробиотические препараты оказывают при послеродовых эндометритах у коров как профилактическое, так и лечебное действие. Однако их эффективность является недостаточной, что связано с использованием лекарственных форм с невысоким титром бактерий и с неоптимальными схемами введения препаратов.

Так, например, препарат Гипролам, введенный за 5-7 дней до родов, показывает заметно бóльшую лечебно-профилактическую эффективность, чем он же, введенный в послеродовой период.

В последнее время в разных областях медицины, ветеринарии и косметологии наблюдается повышенный интерес к хитозану.

Хитозан является производным натурального соединения хитина, что определяет его особую ценность. Он, будучи продуктом жизнедеятельности живых организмов, безвреден для животных и человека. Для сравнения: LD50 хитозана для мышей составляет 16000 мг/кг веса, а, например, сахара – 12000 мг/кг.

Хитозан предлагается использовать в качестве мягкого лечебного средства, обладающего разнообразными физиологическими свойствами. В связи с тем, что характер и величина его физиологической активности в значительной степени зависят от его физико- химической структуры, целесообразно рассмотреть особенности строения самого хитозана и его низкомолекулярных производных, а также хитина, как исходного материала для его получения.

Хитин по химической структуре близок к целлюлозе и только ей уступает по распространенности в природе. Хитин является природным линейным кристаллическим полисахаридом с высокой молекулярной массой, состоящим из β-(1-4) связанных остатков N-ацетил-D-глюкозамина. Его официальное название поли[(1-4)-2-ацетамидо-2-дезокси-D-глюкоза].

Большая длина молекулы хитина и ограниченная гибкость макромолекул являются предпосылками для образования биополимерами сложных надмолекулярных структур, особенно в тканях живых организмов. Для хитина основным элементом такой структуры являются фибриллы – высокоориентированные агрегаты макромолекулы диаметром 25-50 нм, в свою очередь состоящие из микрофибрилл диаметром 2,5-2,8 нм. В научной литературе имеются данные, что выделенный, в частности, из панцирей ракообразных, хитин представляет собой высокомолекулярный полимер с молекулярной массой 2-2,5 млн. дальтон со степенью полимеризации 10-14 тыс.

Хитин получают из измельченных ракообразных, насекомых, грибов. Получение качественного хитина, а затем и его производного хитозана, является непростой задачей и требует знания композиционного состава полимера, в частности – доли его белковой составляющей, т.к. композиционная неоднородность, присущая хитину, сохраняется и для хитозана.

Хитин по сути своей является гликопротеином, он имеет аморфно-кристаллическое строение, образует надмолекулярные структуры в виде глобул, растворим только в концентрированных кислотах и специальных растворителях. С одной стороны, хитин в форме гликопротеина представляет самостоятельный интерес, а с другой – является источником для получения хитозана.

Хитозан – самое известное и самое простое производное хитина, можно сказать, что это искусственный аминополисахарид (2-амино-2-дезокси-β-D-глюкан). Его получают в результате реакции дезацетилирования хитина. Отщепление ацетамидных групп удается осуществить только в жестких условиях (воздействие на хитин 40-50% раствором NaOH при температуре 110-140ºС в течение 4-6 часов). Доля отщепившихся в этих условиях ацетамидных групп в расчете на одно элементарное звено не достигает единицы, составляя обычно 0,8-0,9. При этом, во время процесса дезацетилирования происходит распад главной молекулярной цепи, о чем свидетельствует уменьшение молекулярной массы хитина. Как и хитин, хитозан в твердом состоянии представляет собой аморфно- кристаллический полимер, для которого также характерно явление полиморфизма по молекулярному весу, причем количество структурных модификаций при переходе от хитина к хитозану увеличивается до 6. Конформация макромолекул при переходе от хитина к хитозану существенно не меняется. В то же время, в процессе дезацетилирования хитина его молекулярная масса заметно уменьшается. Общая упорядоченность структуры (степень кристалличности) снижается до 40-50%. Одним из важнейших свойств полимеров вообще и хитозана в частности является их растворимость, определяющая возможность их переработки и применения. В отличие от хитина, получаемый в результате реакции дезацетилирования хитозан растворяется даже в разбавленных органических кислотах, например, в водном растворе уксусной кислоты. Появление свободной аминогруппы в каждом элементарном звене макромолекулы придает хитозану свойство полиэлектролита. Это свойство позволяет получать различные модификации хитозана (сукцинат-, лактат-хитозан и др.). Существенное различие между молекулярными массами хитина и хитозана свидетельствует о протекании на стадии дезацетилирования заметной деструкции полимерных цепей. Так, если молекулярный вес хитина составляет 2,0-2,5 млн. кДА, то после его деструкции молекулярный вес хитозана составляет 10-14 тыс. кДА.

Благодаря своей химической природе, хитозан способен к различным видам химического взаимодействия с образование 4-х основных типов связей: ионных, водородных, гидрофобных и связей по типу комплексообразования. Тем не менее, некоторые физико-химические свойства высокомолекулярных хитозанов, такие как нерастворимость в очищенной воде и высокая вязкость нейтральных и щелочных водных растворов, плохая всасываемость из желудочно-кишечного тракта, ограничивают их применение в медицине и ветеринарии, что диктует необходимость поиска производных хитозана, лишенных этих недостатков.

Одним из подходов для получения водорастворимых хитозанов, сохраняющих при этом необходимую биологическую активность хитозана, является уменьшение его молекулярной массы, вплоть до получения олигохитозанов с молекулярной массой от 5 до 30 кДА. Для этого применяют различные способы: химические, физические, электрохимические и различные типы ферментативного гидролиза.

Приоритетными направлениями использования низкомолекулярного хитозана при разработке лекарственных препаратов являются его применение для иммобилизации лекарств, коррекции антимикробного, антивирусного, противоопухолевого, противотуберкулезного действий, для разработки наносистем как носителей лекарственных средств и др.

Из перечисленного следует, что сам хитозан и его низкомолекулярные производные, включая олигохитозаны, в зависимости от молекулярной массы, степени ацетилирования и дезацетилирования, расположения ацетилированных звеньев вдоль полимерной цепи, полидисперстности, вязкости, значения рКа – обладают множественными свойствами и могут оказывать на организм полифункциональное действие /15, 16, 17, 18/.

Из уровня техники известны попытки использования хитозана в медицине и ветеринарии и для лечения послеродовых эндометритов.

Известен способ лечения послеродовых эндометритов у женщин на основе хитозана. Для этого матку санируют раствором фурациллина 1:5000, а затем однократно внутриматочно струйно вводят 10 мл препарата, состоящего из хлоргидрата хитозана с молекулярной массой 300-700 кДа, степенью дезацетилирования 89%, метронидазола и диоксидина. Один литр такого геля содержит хлоргидрата хитозана 10 г, метронидазола 1,250-1,668 г и диоксидина 2,5 г, остальное – вода дистиллированная. Способ обеспечивает пролонгированное антимикробное, антисептическое и противовоспалительное действия, позволяя при однократном введении геля купировать воспалительный процесс, снизить эндогенную интоксикацию, нормализовать состав вагинальной микрофлоры. При этом лечение осуществляют, не прерывая грудного вскармливания /19/.

Известен способ использования хитозана в комплексном лечении эндометрита после кесарева сечения в медицине. Группе женщин (27 человек) с эндометритом после кесарева сечения на первом этапе перорально назначали гелевую форму хитозана «Амидан» в комплексе с общепринятой тактикой ведения болезни. Кроме того, интравагинально на ночь вводили 20 мл 1% геля аскорбата хитозана. Контрольная группа женщин (31 пациентка) получала всё то же лечение, но без препарата «Амидан». Для оценки эффективности лечения использовали клинический, лабораторный и инструментальный мониторинг, включающий развернутый анализ крови с подсчетом показателей красной крови, лейкограммы, СОЭ, лейкоцитарного индекса интоксикации, биохимического исследования крови и др. Было показано, что включение хитозановой терапии в комплекс лечения эндометрита после кесарева сечения снижало проявления воспалительного процесса и уменьшало возможность возникновения тяжелых гнойно-септических осложнений /20/.

Известна работа, где изучали лечебную эффективность препаратов, созданных на основе хитозана, при гнойно-катаральном эндометрите у коров. Было сформировано 5 групп коров, больных эндометритом, красно-степной породы, 4-5-летнего возраста, по 10 голов в каждой. Животным первой группы (контрольная группа) для лечения эндометритов применяли внутриматочно фуразолидоновые палочки по 3 штуки через день до полного выздоровления. Животных второй группы лечили препаратом хитомаст, который состоял из 3% хитозана и гелеобразующей основы. Животных третьей группы лечили препаратом хитомаст-2, который состоял из гентамицина 20 мг/мл в 1,5% растворе хитозана. Четвертая группа животных получала хитомаст-3 (20 мг/мл цефалексина в 1,5% растворе хитозана) и, наконец, пятая группа получала хитомаст-4 (мирасепт 0,02% в 1,5% растворе хитозана). Все препараты вводили внутриматочно в дозе 30 мл. Дополнительно всем группам животных однократно инъецировали по 10 мл тривитамина. Показано, что период выздоровления коров после применения фуразолидоновых палочек составлял 19,2 суток, что на 52%, 53%, 53% и 56 дней больше, чем у животных, которых лечили хитомастом, хитомастом-2, хитомастом-3 и хитомастом-4 соответственно. Сервис-период у экспериментальных групп животных по сравнению с контрольной группой сократился на 47%, 52%, 48% и 49% у второй, третьей, четвертой и пятой групп животных соответственно, Индекс осеменения у экспериментальных групп животных уменьшился в 2 и более раз /21/.

Таким образом, установлено, что хитозан и его различные модификации обладают антибактериальными свойствами и могут подавлять рост любых бактерий. Однако авторами настоящего изобретения было показано, что только немодифицированный хитозан с вязкостью 20-200 сП позволяет не подавлять рост бактерий B.subtilis и B.liheniformis. Таким образом, получена композиция, состоящая из двух начал, дополняющих и усиливающих друг друга. Так, бактерии обладают антагонистическими свойствами, а хитозан – антибактериальными, антигрибковыми и антистимулирующими свойствами, а общими свойствами являются иммуностимулирующее и противовоспалительное.

К тому же растворы немодифицированного хитозана с вязкостью 20-200 сП позволяют равномерно распределить споры бактерий в препарате, благодаря чему длительно сохраняется жизнеспособность спор, а в организме животного проявляется максимальная биологическая активность.

При этом авторами было также экспериментально установлено, что растворы именно немодифицированного хитозана проявляют значимо более высокую антибактериальную активность.

Таким образом, был получен высокоэффективный препарат, состоящий из хитозана и пробиотика на основе бактерий B.subtilis и B.liheniformis, обладающий полифункциональными свойствами. Имеющиеся компоненты в заявляемом лекарственном препарате обеспечивают высокую терапевтическую эффективность лечения и профилактику эндометритов у коров. Этот лекарственный препарат получил название «Биометрин».

Технический результат заключается в повышении эффективности действия препарата для профилактики и лечения послеродовых эндометритов коров за счет объединения двух активных действующих компонентов, которые усиливают действия друг друга, позволяя получить полифункциональный препарат с антагонистическими, антибактериальными, антигрибковыми, антивирусными, иммуностимулирующими и противовоспалительными свойствами.

Технический результат достигается путем получения препарата для лечения или профилактики послеродовых эндометритов коров для внутриматочного введения, содержащего бактерии Bacillus subtilis и бактерии Bacillus licheniformis с титром спор 108-10¹¹ в соотношении 1:1, 0,5%-1,5% раствор хитозана со степенью дезацетилирования не менее 70% и вязкостью 20-200сП, вспомогательные вещества, такие как лактоза, СаСО₃, молочная сыворотка или свекольный сок, причем рН находится в пределах 3,5-5,8.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Получение препарата «биометрин» и изучение его антимикробной активности

Авторами настоящего изобретения была исследована антибактериальная активность хитозанов.

В настоящем исследовании проводилось изучение антибактериального действия модифицированного и немодифицированного хитозана (7 образцов) на тест-культуру Staphylococcus aureus.

Исследуемые растворы 1% хитозана вносили в испытуемых концентрациях и через 4 часа производили высевы из каждого разведения на МПА (мясопептонный агар). Отсутствие роста при высеве из пробирки с максимальным разведением определяли как минимальную ингибирующую концентрацию.

Результаты исследования приведены в таблице 1.

Таблица 1.

№ п/п	Образец хитозана	Производитель	Степень диацетилирова-ния, %	рН	Минимальная ингибирующая концентрация хитозана относительно Staphylococcus aureus, %
1	Хитозан гидрохлорид	Xi’an Beihe Biological Technology Co., Ltd. (Китай)	85,6	4,66	>0,5
2	Хитозан нитрат	Xi’an Beihe Biological Technology Co., Ltd. Китай)	92,4	5,17	>0,5
3	Хитозан Agriculture grade	Qingdao Jingling Ocean Technology Co.,LTD(Китай)	86,1	7,0	0,0018
4	Хитозан Pharmaceutical grade	Qingdao Yunzhou Biochemistry Co., LTD(Китай)	91,5	5,2	0,003
5	Хитозан пищевой	ООО «Биопрогресс» (Россия)	89,0	3,6	0,003
6	Хитозан сукцинат	ООО «Биопрогресс» (Россия)	75,1	7,67	>0,5
7	Хитозан Carboxyl methyl grade	Xi'an Ceres Biotech Co., Ltd (Китай)	80,0		>0,5

Проведенные исследования показали, что образцы немодифицированного хитозана (№№3-5) обладают высокой антибактериальной активностью. Минимальная ингибирующая концентрация хитозана (образцы №№4, 5) относительно Staphylococcus aureus составляет 0,003%. Минимальная ингибирующая концентрация образцов модифицированного хитозана (№№1, 2, 6, 7) составляет >0,5%.

Пример 1.

Шаг 1. Получение 1% раствора хитозана.

Берут навеску кислоторастворимого хитозана одного из нижеуказанных производителей (ЗАО Биопрогресс, Россия; Sigma-Aldrich, USA; Qingdao Jingding Ocean Technology Co., LTD Китай) или, по другой классификации, хитозана с молекулярной массой 1000000-700000 Да и степенью дезацетилирования не менее 80%, и растворяют в 2% уксусной кислоте с целью получения 1% раствора хитозана.

Полученный раствор при необходимости фильтруют через капроновую ткань для сит 61/69 ПА 122. Динамическая вязкость полученного хитозана составляет 300+120 сП. Его разливают в стеклянные флаконы по 300 мл и подвергают автоклавированию в следующем режиме: 121ºС при 0,8 атм в течение 30 мин. Динамическая вязкость стерильного раствора хитозана составляет 75±25 сП. Полученный раствор хитозана проверяют на антимикробную активность в тест-системах с грамотрицательными и грамположительными микроорганизмами в соответствии с общепринятыми методами; антимикробная активность в среднем составляла не менее 30 мкг/мл.

Шаг 2. Получение раствора культур Bacillus subtilis СН 201 и Bacillus licheniformis СН 200 в 1% хитозане.

Культуры микроорганизмов рода Bacillus выращивают по общепринятой технологии на скошенном агаре МПА, затем смывают с помощью 1% стерильного раствора хитозана.

Шаг 3. Получение препарата «Биометрин»

Берут 880 мл стерильного 1% раствора хитозана и добавляют к нему по 60 мл раствора культуры Bacillus subtilis СН 201 в 1%-ом хитозане и культуры Bacillus licheniformis СН 200 в 1%-ом хитозане до конечной концентрации каждого штамма 3х10⁹КОЕ/см³. Динамическая вязкость Биометрина составляет 75+25 сП. Водородный показатель составляет 3,8-5,2.

Шаг 4. Изучение жизнеспособности спор входящих в состав «Биометрина» культур Bacillus subtilis СН 201 и Bacillus licheniformis СН 200, в зависимости от концентрации в нем хитозана и разных значений рН раствора.

Смесь культур Bacillus subtilis СН 201 и Bacillus licheniformis СН 200 в соотношении 1:1 вносят в питательный бульон с разными концентрациями хитозана (см. таблицу 2) и инкубируют при температуре 37ºС в течение 18 часов, после чего по 0,1 мл бульона высевают на чашки Петри с агаром и подсчитывают количество выживших клеток. Как видно, количество жизнеспособных клеток обоих штаммов в бульоне с разными концентрациями хитозана от 1% до 0,007% остается на уровне того же порядка, что и до начала инкубации. Из этого следует, что оба штамма рода Bacillus в этих условиях не подвергаются спороцидному действию хитозана. Жизнеспособность спор составляет около 100%.

Таблица 2

Концентрация хитозана в питательном бульоне, %	Количество жизнеспособных клеток, КОЕ/ см3
	Инкубация без хитозана	Инкубация с хитозаном
Bacillus subtilis	Bacillus licheniformis	Bacillus subtilis	Bacillus licheniformis
1,00	6,1х106	5,7х106	5,0 х106	5,0 х106
0,50	6,1х106	5,7х106	3,5 х106	4,6 х106
0,25	6,1х106	5,7х106	5,4 х106	4,2 х106
0,12	6,1х106	5,7х106	3,1 х106	3,5 х106
0,06	6,1х106	5,7х106	2,0 х106	5,7 х106
0,03	6,1х106	5,7х106	4,4 х106	3,9 х106
0,015	6,1х106	5,7х106	2,7 х106	2,9 х106
0,007	6,1х106	5,7х106	5,1 х106	3,7 х106

Аналогичные результаты получают при изучении жизнеспособности спор штаммов Bacillus subtilis СН 201 и Bacillus licheniformis СН 200 в зависимости от разных концентраций хитозана при рН 2,0, рН 4,5 и рН 5,3. Таким образом, интервал жизнеспособности спор Bacillus subtilis СН 201 и Bacillus licheniformis СН 200 в препарате биометрин находится в пределах рН 2,0 – 5,3.

Шаг 5. Изучение антимикробного действия препарата «биометрин» на микроорганизмы цервикальной слизи коров на 2-7 день после отела.

Цервикальную слизь берут от коров с помощью ложки Панкова на 2-7-й день после родов и помещают в две стерильные пробирки с транспортной средой Стюарда MS 306 (Miculture Transport Swabs/Stuard Transport in polysterene tube).

Одну пробирку в течение 2-6 часов доставляют в ветлабораторию ООО «Пастер» Москва для идентификации микроорганизмов. Были идентифицированы следующие микроорганизмы:

1. E. coli – 50% случаев;

2. St. aureus – 23.3% случаев;

3. Corynobacterium -16.6% случаев;

4. Дрожжеподобные культуры и грибы – 13,3% случаев;

5. Candida, Klebciella pneumonia – 10% случаев;

6. Плесень Aspergillus – 13.33% случаев;

7. Bac. subtilis – 10% случаев;

8. Streptococcus faecalis – 20% случаев.

Вторую пробирку используют для культивирования микроорганизмов цервикальной жидкости. Для этого часть цервикальной слизи (по 2 мл) помещают в пробирки с МПБ с добавлением Биометрина и без него и часть в пробирки со средой Сабуро с Биометрином и без него.

Культивирование осуществляют при температуре 37ºС в течение 24 часов для роста бактерий, и при температуре 28ºС в течение 48 часов для роста грибов. Затем берут по 0,1 мл ферментата из каждой пробирки, вносят на чашки Петри с МПА и тщательно растирают. При посеве ферментата из пробирок без препарата наблюдают интенсивный рост разных штаммов микроорганизмов, а в случаях с добавлением препарата «Биометрин» – только рост колоний Bacillus subtilis СН 201 и Bacillus licheniformis СН 200, особенно при тестировании цервикальной слизи, полученной на 2-3-й день после родов; наряду с такой картиной на фоне колоний Bacillus subtilis СН 201 и Bacillus licheniformis СН 200 встречаются единичные колонии из цервикальной жидкости коров.

Таким образом, препарат «Биометрин» в модельных условиях резко подавляет рост микроорганизмов из цервикальной жидкости коров, взятой на 2-7-й день после отела.

Пример 2. Все процедуры выполняют так, как описано в примере 1, за исключением того, что в «Биометрине» вместо 1% хитозана используют хитозан в количестве 0,5% со степенью дезацетилирования не менее 70%, а рН раствора составляет 3,8. После культивирования цервикальной слизи с биометрином такого состава в течение 18 часов и высева на МПА наблюдается эффективность на уровне антимикробной активности, равной 75% от активности «Биометрина» с хитозаном в дозе 1%.

Пример 3. Все процедуры выполняют так, как в примере 1, за исключением того, что для приготовления «Биометрина» используют хитозан в дозе 1,5%. Антимикробная активность такого «биометрина» составляет 100%.

Таким образом, экспериментальным путем установлено, что наиболее эффективными дозами хитозана со степенью дезацетилирования более 70% и вязкостью 75±25 сП являются 0,5-1,5%. Дальнейшее увеличение дозы хитозана нецелесообразно, так как это увеличивает расход хитозана без увеличения антимикробной эффективности.

Изучение влияния динамической вязкости хитозана на антимикробную активность «биометрина»

Пример 4. Поступают, как описано в примере 1, но для приготовления «Биометрина» вместо хитозана с динамической вязкостью 75 сП берут хитозан с динамической вязкостью 20 сП. В этом случае антимикробная активность биометрина соразмерна с активностью, полученной в примере 1 (хитозан с динамической вязкоситью вязкостью 75 сП).

Пример 5. Поступают, как описано в примере 1, но исследуют антимикробную активность «Биометрина» с хитозаном с динамической вязкостью 150 сП. И в этом случае наблюдают антимикробную активность, близкую к 100%.

Пример 6. Поступают, как описано в примере 1, но для изучения берут «Биометриин» на основе хитозана с динамической вязкостью 200 сП. Наблюдается снижение антимикробной активности Биометрина до 85% при использовании хитозана с динамической вязкостью 200 сП.

Дальнейшие испытания зависимости антимикробной активности биометрина от динамической вязкости хитозана нецелесообразны, так как наблюдаются трудности в приготовлении «Биометрина» из-за расхода большого количества хитозана и высокой вязкости приготовленных растворов.

Изучение эффективности «Биометрина» в зависимости от использования разных штаммов Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis

Пример 7. Готовят «Биометрин» так, как описано в примере 1, но вместо штаммов Bacillus subtilis СН 201 и Bacillus licheniformis СН 200 берут штаммы Bacillus subtilis УКМ В 5007 и Bacillus licheniformis УКМ В 5514, а дальше проводят испытания, как описано в примере 1, Эффективность препарата равна полученной в примере 1.

Пример 8. Готовят «Биометрин» так, как описано в примере 1, но используют штаммы Bacillus subtilis ВКПМ 10172 и Bacillus licheniformis ВКПМ 10135, все остальные процедуры проводят, как описано в примере 1. Эффективность препарата не отличается от эффективности Биометрина, наблюдаемой в примере 1.

Таким образом, проверка эффективности «Биометрина», полученного с использованием трех разных пар штаммов культур Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis, проведенная в модельных условиях in vitro, никаких различий между этими парами штаммов не выявляет.

Изучение терапевтической эффективности «Биометрина» на коровах разных пород в разных хозяйствах с целью профилактики и лечения эндометритов

Применение «Биометрина» с профилактической целью

Пример 9. Опыт по определению терапевтической эффективности биометрина проводили в хозяйстве ОНО ХОСЖиР с 15 сентября 2006 г. по 15 ноября 2006 г. В эксперименте участвовало 20 коров голштино-фризской породы в возрасте от 3 до 5 лет общей массой 450-480 кг после отела. Содержание животных было стойлово-пастбищное. Рацион состоял из объёмистых кормов (силос и сенаж) с добавлением концентратов (размолотый ячмень и пшеница) + пастбище. Коровы, находящиеся в эксперименте, не подвергались обработке другими лекарственными препаратами в период проведения опыта. Каждое животное имело индивидуальную ушную бирку.

10 коров первой группы были обработаны Биометрином в дозе 150 мл с помощью шприца Жане с профилактической целью однократно через сутки после отела.

Животные второй группы (10 коров) были без обработки и служили контролем.

У коров, обработанных «Биометрином», патологические изменения матки после отела отсутствовали при наблюдении в течение двух месяцев. Ветеринарными врачами хозяйства коровы были признаны здоровыми и были осеменены.

В контрольной группе у трех из 10-ти животных на 10-й день после отела появился выраженный острый эндометрит, сопровождавшийся гнойными выделениями. Этим трем животным Биометрин был введен с лечебной целью в дозе 150 мл трехкратно с интервалом 24 часа. В течение 14 дней наступило полное выздоровление животных.

Пример 10. Определяли терапевтическую эффективность «Биометрина» в колхозе «Русь» Юхновского района Калужской области. Биометрином были обработаны 12 коров голштино-фризской породы в возрасте 4-8 лет и массой 460-480 кг с профилактической целью в дозе 150 мл однократно через 24 часа после отела.

Содержание животных было стойлово-пастбищное. Рацион состоял из объёмистых кормов (силос и сенаж) с добавлением концентратов (размолотый ячмень и пшеница) + пастбище. Коровы, находящиеся в эксперименте, не подвергались обработке другими лекарственными препаратами в период проведения опыта. Каждое животное имело индивидуальную ушную бирку.

Заболеваний эндометритом у этой группы коров не наблюдали. Все животные были признаны здоровыми, пришли в охоту и были осеменены.

Пример 11. В колхозе «Пламя революции» Московской области было исследовано 25 коров черно-пестрой породы, массой тела 420 – 450 кг в возрасте от 3 до 8 лет, у которых отделение последа происходило вручную. Содержание животных стойлово-пастбищное, кормление на пастбище + объемистые корма с добавлением концентратов. Сразу после отела и через 24 часа вводили Биометрин с профилактической целью в дозе 150 мл/животное. Положительный эффект был получен у всех 25-ти обработанных животных. Животные оставались здоровыми и были осеменены в положенные сроки.

Пример 12. Исследования проводили в ООО «Сосновка» Озерского района Ярославской области. В исследовании было задействовано 100 голов голштино-фризской породы в возрасте 3-5 лет массой 500-600 кг с продуктивностью 5,5 тысяч литров молока в год. Содержались животные в стойлах без привязи. Для кормления использовали силос кукурузный, сенаж, концентраты.

Биометрин вводили с профилактической целью всем животным после отела на 5-е и 10-е сутки по 150 мл на голову. Контролем служило остальное стадо коров, которым после отела вводили гормон просольвин. Из 100 животных, обработанных «Биометрином», оставались здоровыми 80 коров, т.е. эффективность «Биометрина» в качестве профилактического средства составила 80%.

В контрольной группе животных, получивших только просольвин, с клиническим проявлением острого катарального эндометрита оказались 90 голов, т.е. 90% животных заболело.

Применение «Биометрина» при лечении острого послеродового эндометрита

Пример 13. Опыт проводили в ЗАО СП «Жилевское» Ступинского района Московской области. Исследования проводили на коровах черно-пестрой породы в возрасте 3-6 лет и массой 480-560 кг. Животные находились на привязном содержании, кормление было силосно-концентратное (60%/40%). «Биометрин» вводили 20-ти коровам с диагнозом острый катаральный эндометрит. Препарат вводили в дозе 150 мл/голову внутриматочно 3-6 раз с интервалом 48 часов.

В качестве препарата сравнения использовали тилозинокар. Им было обработано 40 голов с диагнозом острый катаральный эндометрит.

При лечении «Биометрином» коров с диагнозом острый катаральный эндометрит выздоровело 17 голов из 20-ти, что составило 85%. При лечении животных препаратом сравнения – 75%.

Пример 14. Исследования проводили в ГУП МСС Московской области на коровах голштино-фризской породы массой 560-600 кг, первотелки. В хозяйстве наблюдался высокий уровень заболеваемости коров эндометритом, что связано с их высокой продуктивностью и стойловым содержанием. Рацион состоял из объёмистых кормов (силос и сенаж) с добавлением концентратов (размолотый ячмень и пшеница). Потребление воды было не ограниченным. Каждое животное имело индивидуальную ушную бирку.

Было сформировано три группы коров. Первая группа состояла из 165 голов с признаками острого послеродового эндометрита, которые обрабатывались «Биометрином» с третьего дня после отела внутриматочно из расчета 150 мл/голову. В зависимости от состояния матки количество введений составляло 3-5 раз с интервалом 48 часов. Диагноз и эффективность лечения устанавливали путем исследования слизи с шейки матки. Слизь получали при помощи ложки Панкова. Важным показателем служил приход животного в охоту.

Вторая группа состояла из 100 голов и получала лечение по схеме, принятой в хозяйстве. Это комплексная схема, включающая как инъекционные, так и внутриматочные препараты ежедневного введения в течение 7 дней: в первый день инъекции гормона просольвина, мультивитамина и внутриматочно йодопен, во второй день антибиотик окситетрациклин внутримышечно в разные точки в виде препарата энгимицин 10% (Intervet, Нидерланды). В третий день снова энгимицин и дополнительно ихгдюковит 50 мл в прямокишечную ямку. В четвертый день животные не обрабатываются. В пятый день применяется внутриматочно антибиотик тилозин в виде препарата тилозинокара (ООО Биоспектр, Россия) в дозе 150 мл/голову. В шестой день животных лечению не подвергали, а на седьмой день снова вводили тилозинокар в дозе 150 мл/голову. Эта группа считалась контрольной.

Также была организована третья группа животных, с клиническим проявлением острого послеродового эндометрита, в количестве 157 голов, которых в течение трех дней лечили по схеме хозяйства, а на 5-й и 7-й день вводили «Биометрин».

Были получены следующие результаты. В первой группе, из 165 голов здоровыми оказались 136, т.е. эффективность лечения «биометрином» составила 82%.

Во второй группе, где животные обрабатывались по стандартной схеме, используемой в хозяйстве, эффективность лечения составила 80% (из 100 голов здоровыми оказались 80).

В третьей группе, где животные получали комбинированную схему лечения, животные на 5 сутки были переведены в общее стадо, продолжали получать лечение, но при этом молоко можно было использовать без ограничений. Эффективность данной схемы лечения составила 96%.

Применение «Биометрина» при лечении скрытого эндометрита

Пример 15. Опыт проводили в ЗАО СП «Жилевское» Ступинского района Московской области. Исследования проводили на коровах черно-пестрой породы в возрасте 3-6 лет и массой 480-560 кг. Животные находились на привязном содержании, кормление было силосно-концентратное (60%/40%). Препарат «Биометрин» вводили 10-ти коровам с диагнозом хронический эндометрит (животные были клинически здоровы, но не осеменялись) в дозе 50 мл/голову внутриматочно двукратно с интервалом 48 часов.

8 из 10-ти обработанных животных пришли в охоту и были удачно осеменены, что составило 80%. На основании данного примера можно сделать вывод о том, что лекарственный препарат «биометрин» может быть использован в качестве средства восстановительной терапии после применения антибиотиков.

Список литературы

1. Микулич. Е.А Эффективность применения препаратов «йодомастин» и «йодометрин» для лечения маститов и эндометритов у коров. Животноводство и ветеринарная медицина.2012, №6.

2. Сидоркин В.В., Якунин К.А., Клищенко Е.А. Комплексный подход к профилактике и лечению эндометрита у коров. Журнал Зооиндустрия, 2007, №5.

3. Инструкция по применению Метролека для лечения и профилактики послеродовых осложнений, острых и хронических эндометритов, цервицитов и вагинитов у коров. № регистрационного удостоверения ПВР-1-35.13/02987/См. система Ирена Минсельхоз РФ.

4. Регистрационное удостоверение на препарат Метролек за №12-3-10.14-2313 № 1713Р-3-10/03071.

5. Патент РФ №2085207 на изобретение Ветеринарная композиция для профилактики и лечения различных форм эндометрита, содержащая пропранолол в сочетании с антибактериальным компонентом и ветеринарное лекарственное средство для профилактики и лечения различных форм эндометрита. Дата публикации 27.07.1997.

6. Скрыпник И.Н., Маслова А.С. Современные спорообразующие пробиотики. Сучасна гастроентерология, 2009, №3 (47), 81-90.

7. Патент РФ №2538804 на изобретение Способ профилактики послеродового эндометрита у коров. Дата публикации 10.01.2015.

8. Инструкция по применению биологического препарата Гипролам для профилактики эндометрита у коров. 2012 № регистрационного удостоверения ПВР=1=35.13/02987.

9. Заявка на изобретение РФ №2012147670. Способ лечения эндометритов у высокопродуктивных коров. Дата публикации 20.05.2014.

10. Ряпосова М.В., Степанов И.1 В., Заузолкова О.И., Сивкова У.В. Опыт применения пробиотического препарата «Моноспорин» в схемах лечения коров с хроническим эндометритом. Ветеринария Кубани, 2016, №2.

11. Патент Украины №UA14569. Биопрепарат для лечения и профилактики эндометритов животных. Дата публикации 15.05.2006.

12. Сафронова Л.А., Осадчая А.И. Эффективный биопрепарат для лечения и профилактики послеродовых заболеваний у сельскохозяйственных животных. «Наука та iновацii», 2008, т.5, №1, 85-90.

13. Патент РФ №2264453 на изобретение Биопрепарат «Ирилис» ветеринарного назначения. Дата публикации 20.11.2005.

14. Патент РФ №45289 на полезную модель Суппозитории «ветомгин» для профилактики и лечения урогенитальных заболеваний. Дата публикации 10.05.2005

15. Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение. Изд-во «Наука», Москва, 2000. Под редакцией акад Скрябина и др.

16. Степанова Е.А. Получение производных высоко- и низкомолекулярного хитозана: физико-химические свойства и биологическая активность. Дисс. на соискание канд. химических наук. Москва, 2009.

17. Гамзазаде А.И. Производные хитина/хитозана контролируемой структуры в качестве потенциальных новых биоматериалов. Дисс. на соискание доктора хим.наук, Москва, 2005.

18. Алаа Эльдин Мухамед Мухамед Юнес. Разработка технологии получения хитозана с заданными свойствами из панциря ракообразных. Дисс. на соискание кандидата технических наук. Астрахань, 2010.

19. Патент РФ №2309744 на изобретение Способ лечения послеродового эндометрита. Дата публикации 10.11.2007.

20. Островская А.Э. Использование хитозана в комплексном лечении эндометрита после кесарева сечения. Дисс. на соискание канд. медицинских наук. Иркутск, 2006.

21. Топурия А.Ю. Структурно-функциональная и клиническая оценка влияния иммуномодуляторов природного происхождения на организм животных. Дисс. На соискание доктора биол.наук. Оренбург, 2008.

1. Препарат для лечения или профилактики послеродовых эндометритов коров для внутриматочного введения, содержащий:

- бактерии Bacillus subtilis и бактерии Bacillus licheniformis с титром спор 10⁸-10¹¹ в соотношении 1:1,

- 0,5-1,5% раствор хитозана со степенью дезацетилирования не менее 70% и вязкостью 20-200 сП,

- вспомогательные вещества, такие как лактоза, СаСО₃, молочная сыворотка или свекольный сок,

причем рН находится в пределах 3,5-5,8.

2. Препарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве бактерий используются штамм Bacillus subtilis УКМ В-5007 и штамм Bacillus licheniformis УКМ В-5514.

3. Препарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве штаммов бактерий используются штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-10172 и штамм Bacillus licheniformis ВКПМ В- 10135.

4. Препарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве штаммов бактерий используются штамм Bacillus subtilis СН201 и штамм Bacillus licheniformis СН200.