Способ исследования эндотелия сосудов при плацентарной недостаточности

Авторы патента:

Дзагоева Зарина Леонидовна (RU)

Цаллагова Лариса Владимировна (RU)

Сагкаева Светлана Юрьевна (RU)

Майсурадзе Лиана Васильевна (RU)

G01N33/52 - использование соединений или составов для колориметрического, спектрофотометрического или флуорометрического анализа, например реактивной бумаги

Владельцы патента RU 2687109:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Северо-Осетинская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)

Изобретение относится к акушерству, а именно к диагностике плацентарной недостаточности у беременных. Предложен способ ранней диагностики плацентарной недостаточности, включающий определение маркеров дисфункции эндотелия в сыворотке крови беременной. Новым в способе является определение концентрации оксида азота и его стабильных метаболитов в сыворотке крови. При значении оксида азота менее 50 мкмоль/л судят о дисфункции эндотелия. 1 ил., 3 табл., 1 пр.

Изобретение относится к акушерству, а именно к диагностике плацентарной недостаточности.

Известен способ определения маркера дисфункции эндотелия при артериальной гипертензии у пациенток в перименопаузе [автор Калоева А.Э. «Функциональные особенности течения артериальной гипертензии у женщин в перименопаузе, 2014 г], заключающийся в определении концентрации оксида азота и его стабильных метаболитов в сыворотке крови. Проводился спектрофотометрический метод определения нитрит-иона, в присутствии реактива Грисса, с которым взаимодействовали нитриты. Реактив Грисса это смесь 1% раствора сульфаниламида и 0,05% водного раствора N-нафтилэтилендиамина в уксусной кислоте. Перед этим к 1 мл плазмы добавляли 96° этиловый спирт, для достижения ее депротеинизации, далее центрифугировали 20 минут. Под действием азотистой кислоты первично ароматические амины образуют окрашенные диазосоединения. Розовая окраска образовавшегося нитрита определяется спектрофотометрическим методом. В результате определяем нитрит-ионы. Для того чтобы перевести нитраты в нитриты необходимо к нитрат-ионам добавить хлорид ванадия (III) - летучий порошок. В итоге определяем суммарный NO, количество нитритов определяли при добавлении реактива Грисса, количество нитратов, получали путем вычитания количество нитритов из концентрации суммарных метаболитов NO. Недостатком данного метода является то, что он применялся только у пациенток с артериальной гипертензией.

Также известен способ изучения содержания маркеров дисфункции эндотелия (ЭТ- 1, оксида азота, Е- селектин) в периферической крови женщин с ранними репродуктивными потерями, (автор Айени Д.О. «Современные аспекты потерь ранней беременности», 2012 г. ),

заключающийся в том, что основными признаками дисфункции эндотелия сосудов является снижение уровней оксида азота и Е-селектина и увеличение ЭТ-1. Предикторами микротромбозов в формирующемся межворсинчатом пространстве при ранних репродуктивных потерях является изменение уровне маркеров дисфункции эндотелия (оксида азота, Е-селектина, ЭТ-1) в сочетании с гетерогенностью циркулирующей популяции тромбоцитов (повышение содержания активированных клеток, увеличение их размерных параметров), что усугубляет становление адекватного маточно-плацентарного кровотока. Определены наиболее значимые корреляционные связи между морфофункциональными изменениями эндотелия спиральных артерий, маркерами его функционального состояния и нарушениями тромбоцитарного звена гемостаза. Недостатком этого метода можно считать то, что он характеризует состояние эндотелия сосудов плацентарного кровотока только в первом триместре беременности.

Наиболее близким техническим решением является (автор Мозговая Е.В. «Диагностика и медикаментозная коррекция эндотелиальной дисфункции при гестозе», 2004 г. ) определение количества циркулирующих эндотелиоцитов методом подсчета клеток в камере Горяева при фазово-контрастной микроскопии. Предварительно 1 мл плазмы смешивался с 0,2 мл натриевой соли аденозиндифосфата (АДФ) в концентрации 1 мг/мл в течение 10 минут, после чего производилось центрифугирование, полученный осадок суспензировался в 0,1 мл 0,9% раствора NaC 1 и помещался в камеру Горяева. При условии, что одна сетка камеры Горяева помещает 0,1 мл содержимого, подсчет количества эндотелиальных клеток производился из расчета • 104/ л. Результаты исследования маркеров эндотелиальюй дисфункции Количество циркулирующих в крови эндотелиоцитов. У беременных с преэклампсией выявлено достоверное повышение в крови количества свободных эндотелиальных клеток, при этом отмечено увеличение их количества при возрастании тяжести преэклампсии (г=0,71). У беременных с преэклампсией, не имеющих сочетанной патологии, количество

эндотелиоцитов было достоверно выше, чем при физиологической беременности (11,9±1,3-104/л), но несколько ниже, чем во всей группе беременных с преэклампсией в целом (соответственно 18,2±1,1 и 37,3±2,3-104/л). При преэклампсии на фоне заболеваний почек отмечен более высокий уровень десквамированных эндотелиальных клеток и при легкой преэклампсии, и при тяжелом ((нефропатия И-Ш), соответственно 22,5±1,8 и 40,1±2,0-104/л. При преэклампсии на фоне АГ этот маркер был достоверно выше, чем при чистой преэклампсии (соответственно 26,9±1,9; р<0,01 и 45,1±2,2-104/л; р<0,05). Недостатком предложенного метода являлось отсутствие данных маркеров эндотелия фетоплацентарного комплекса.

Цель изобретения - ранняя диагностика плацентарной недостаточности у беременных при помощи изучения показателей эндотелия.

Поставленная цель достигается тем, что определение концентрации оксида азота и его стабильных метаболитов в сыворотке крови при помощи спектрофотометрического метода определения нитрит-иона в присутствии реактива Грисса, который представляет собой смесь 1% раствора сульфаниламида и 0,05% водного раствора N-нафтилэтилендиамина в уксусной кислоте. Предварительно, к 1 мл плазмы добавляли 96° этиловый спирт, для достижения ее депротеинизации, затем центрифугировали в течение 20 минут. Под действием азотистой кислоты при помощи спектрофотометрического методапервично ароматические амины образуют окрашенные диазосоединения розовой окраски, в результате чего определяются нитрит-ионы. Для того чтобы перевести нитраты в нитриты необходимо к нитрат-ионам добавить хлорид ванадия (III). Таким образом, определяем суммарный NO, количество нитритов выявляли при добавлении реактива Грисса. Количество нитратов получали путем вычитания количество нитритов из концентрации суммарных метаболитов NO.

Нами было проведено комплексное обследование 50 беременных основной группы с выявленной фетоплацентарной недостаточностью во II и Ш триместре. Из них 1 подгруппу составили 25 беременных с выявленными нарушениями ФПК I степени, во 2 подгруппу вошли 25 беременных с нарушениями кровотока II степени. Контрольная группа состояла из 50 беременных, с физиологически протекающей беременностью и без нарушений в фетоплацентарной системе.

Всем пациентам проводились общеклинические, акушерско-гинекологические, микробиологические, микроскопические, иммунологические и инструментальные методы исследования (УЗИ плода, допплерометрия ФПК, кардиотокография плода). Определение количества циркулирующих эндотелиоцитов производилось методом подсчета клеток в камере Горяева при фазово-контрастной микроскопии. Предварительно 1 мл плазмы смешивался с 0,2 мл натриевой соли аденозиндифосфата (АДФ-№) в концентрации 1 мг/мл в течение 10 минут, после чего производилось центрифугирование, полученный осадок суспензировался в 0,1 мл 0,9% раствора №С1 и помещался в камеру Горяева. При условии, что одна сетка камеры Горяева помещает 0,1 мл содержимого, подсчет количества эндотелиальных клеток производился из расчета • 104/ л. Клинико-лабораторное обследование беременных, включающее клинические и биохимические анализы крови, общий анализ мочи, суточную потерю белка и функциональные почечные пробы, проводилось по общепринятым методикам. Агрегационная активность тромбоцитов определялась методом фотометрирования плазмы крови по Вогп-у.

Ультразвуковые (УЗ) исследования фето-плацентарного комплекса у пациенток исследуемых групп проводили при помощи аппаратов «Aloka - SD 500» (Япония) и «Sim - 500 Uplus» (Италия».

Определение кровотока в сосудах плода и маточной артерии проводилось при помощи ультразвукового диагностического прибора «ALOKA 2000»; основным параметром исследования являлось систоло-диастолическоеотношение (СДО) сосудов, представляющее собой отношение величин максимальной, систолической и конечной диастолической скоростей кровотока.

Кардиотокография плода осуществлялась на кардиомониторе «Partecust» фирмы «Siemens» ФРГ. Определение биофизического профиля плода включало в себя: двигательную активность плода, дыхательные движения, мышечный тонус, объем околоплодных вод, степень зрелости плаценты. Гистологическое исследование плацент проводили на микротоме (MR 2055, Leica, Германия) путем окрашивания срезов гематоксилином и эозином использовали набор реактивов SigmaDiagnosticsTrichromeStains (Masson).

Статистическая обработка результатов исследования производилась на персональном компьютере с применением стандартных пакетов программ прикладного статистического анализа (GraphPadInstat, StatisticaforWindows v.4.0, Exel 2000 и др.). Проверку гипотез о равенстве двух средних проводили с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты исследования.

В результате проведенной кардиотокографии было выявлено, что в основной группе беременных сердцебиение плода составило 139,4±2,0 уд./мин. (Р>0,05), частота шевелений плода за 30 мин. была 7,6±0,3 (Р<0,05), величина сердечных осцилляций равнялась 9,2±07 уд. мин. (Р<0,05), миокардиальный рефлекс составил 19,8±1,1 уд./мин. (Р<0,05). В тоже время в группе сравнения средняя частота сердцебиения плода составила 137,7±1,3 уд/мин. (Р>0,05), частота шевелений плода за 30 мин. была 7,7±0,3 (Р<0,05), величина сердечных осцилляций равнялась 9,3±06 уд./мин. (Р<0,05), миокардиальный рефлекс составил 20,8±0,8 уд./мин. (Р<0,05). Биофизический профиль плодов у беременных с фетоплацентарной недостаточностью был оценен в 7 и >баллов) в 89% случаев (Р<0,05). В группе сравнения данный показатель отмечался в 78% случаев. Анализ эхографической оценки плаценты выявил, что у беременных основной группы с высокой частотой выявлялся кальциноз плаценты различной степени выраженности (52,1%), преждевременное созревание плаценты (69,3%). Следует отметить, что у пациенток данной группы толщина плацент составляла 42,3±2,2 мм В группе сравнения показатель толщины плаценты составил 32,6±0,4 мм.

При допплерометрическом исследовании проводилось изучение характера гемодинамики с определением индексов сосудистого сопротивления, позволяющего судить о функционировании всего фетоплацентарного комплекса (табл. 1).

Примечание: р- достоверность показателей основной группы и группы сравнения с нормативными показателями

Результаты проведенного исследования выявили, что у беременных основной группы в большинстве случаев (74%), отмечались наличие двухфазных кривых с положительной диастолической скоростью кровотока (средние значения СДО-2,83±0,2; ИР-0,71±0,12; ПИ-1,5±0,63). При сопоставлении с показателями пациенток с I степенью нарушениями фетоплацентарного кровотока (r=0,54; р0,001); со II-ой степенью нарушения ФПК (r=0,71; р0,001) корреляционный анализ определил положительнную связь между NO и степенью нарушения кровотока при допплерометрическом исследовании. Известно, что прогрессирующее снижение продукции оксида азота и его метаболитов приводит к эндотелийзависимойконстрикции и, как следствие, способствует нарушению кровотока в системе мать- плацента-плод (табл. 2)

Примечание: * р>0,05; * * р0,05 степень достоверности различий между основной и контрольной группами

При определении количества циркулирующих эндотелиальных клеток (ЦЭК) в плазме крови в I группе уровень ЦЭК составил 4,23±1,7 (10⁴) (р>0,05); во II группе - 10,6±0,7(10⁴) (р0,001), что указывало на начальные признаки эндотелиальной дисфункции у беременных основной группы.

Анализ патоморфологических исследований плаценты показал, что у беременных основной группы аномалии развития последа проявлялись соответственно в 58,3% и 62,5% случаев в виде диспластического развития ворсин плаценты (34% и 42,6%), избыточного отложения межворсинчатогофибриноида и массивных кальцификатов в ткани плаценты (49,8% и 61,3%). Необходимо заметить, что распространение возбудителя в интервиллезное пространство привело к развитию виллузита (56% и 72,4% соответственно). Исходом гематогенного инфицирования являлся облитерирующий васкулит и склерозирующийвиллузит (Фиг. 1).

Гистоструктура плацент женщин группы сравнения выявила массивные фибриноидные межворсинчатые отложения и кальцификаты. (табл. 3).

Примечание: * - p<0,05; ** - р<0,01

Инфекционный компонент был представлен в основном трансмуральным воспалением плодных оболочек, диффузным или крупноочаговым интервиллезитом, базальным децидуитом и/или виллузитом, поражением спиральных артерий и сосудов ворсин, что создает благоприятные условия для реализации внутриутробного инфицирования.

Пример 1.

Беременная Е., 28 лет.

Жалобы на тянущие боли внизу живота, повышенную двигательную активность плода.

Анамнез: менструации с 16 лет, по 4-5 дней, через 28-30 дней, регулярные, умеренные, безболезненые. Половая жизнь с 23 лет. Первая беременность завершилась преждевременными родами в сроке 30 недель, гибелью плода. Настоящая беременность II, роды предстоят первые.

Данная беременность протекала в первой половине на фоне угрозы прерывания, по поводу чего находилась на стационарном лечении в сроке 10-11 недель. В сроке 33 недель выявлено нарушение маточно-плацентарного и плодово-плацентарного кровотока 2-й А степени.

Объективно: среднего телосложения, умеренного питания. Общее состояние удовлетворительное, АД-100/70 мм. рт.ст., ps 79 уд. в мин. Живот овоидной формы, увеличен за счет беременности. Матка возбудима при пальпации. Положение плода продольное, предлежит головка над входом в малый таз.

Сердцебиение плода несколько приглушено, ритмичное 140 уд. в мин. Воды целы. Отеков нет. Физиологические оправления в норме. Высота стояния дна матки 32. Окружность живота 102 см.

Гинекологический статус: НПО развиты правильно, гиперемированы; оволосение по женскому типу.

В зеркалах: шейка матки синюшного цвета. Наружный зев закрыт.Выделения слизистые.

Обследована: 17.03.15 г. Данные допплерометрии (нарушение маточно-плацентарного и плодово-плацентарного кровотока 2-й А степени), кардиотокографическое исследование (задержка внутриутробного развития плода на 2 недели, по Фишеру 6-7 баллов).

Исследование маркера (оксида азота и его стабильных метаболитов):

NO_хмкмоль/л - 27,3

NO₂ мкмоль/л - 5,1

NO₃-мкмоль/л - 22,21

Диагноз: Беременность 34 недели. Головное предлежание. Угроза преждевременных родов. Плацентарная недостаточность II ст. ЗВУР плода. ОАА (антенатальная гибель плода).

ВЫВОД. В результате собственных комплексных исследований эндотелия у беременных раскрыты ряд патогенетически важных механизмов, лежащих в основе плацентарной недостаточности (снижение продукции оксида азота и его метаболитов), что позволит проводить раннюю диагностику данного осложнения беременности с целью проведения своевременной коррекции.

Медико-социальная эффективность. Данный метод приводит к более ранней диагностике плацентарной недостаточности у беременных, и, следовательно, способствует своевременному эффективному лечению данной патологии, а так же к сокращению койко-дней (7 дней) и снижению затрат.

Способ ранней диагностики плацентарной недостаточности, включающий определение маркеров дисфункции эндотелия в сыворотке крови беременной, отличающийся тем, что к 1 мл сыворотки крови добавляют 1-2 мл 96% этилового спирта, центрифугируют 18-22 мин и к получившимся нитрат-ионам добавляют хлорид ванадия (III), и из полученного суммарного количества метаболитов оксида азота вычитают количество нитритов и при значении оксида азота менее 50 мкмоль/л судят о дисфункции эндотелия.

Изобретение относится к медицине и касается способа определения длительного темпа наступления смерти, включающего проведение комплексных исследований биологического материала, взятого от трупа, в том числе морфологического, микро- и макроскопического исследования, анализ секционной картины, гистохимическое исследование.

Флуоресцентный оптический днк-сенсор // 2684276

Изобретение относится к аналитической химии, а именно для изучения различных биомолекул методом люминесцентной визуализации клеток и их компонент. Для этого используют флуоресцентный оптический ДНК сенсор, состоящий из подложки и адсорбированной на ней тонкой пленки комплекса ДНК-люминофор.

Способ выбора метода лечения острого деструктивного панкреатита // 2683291

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, анестезиологии и реаниматологии, и может быть использовано для выбора метода лечения острого деструктивного панкреатита (ОДП).

Способ поддержания функционального состояния цирротически измененной печени у пациентов в листе ожидания трансплантации органа // 2682874

Изобретение относится к медицине, а именно к гепатологии, и может быть использовано для поддержания функционального состояния цирротически измененной печени у пациентов в листе ожидания трансплантации органа.

Способ оценки токсичности жидкости // 2682673

Изобретение относится к экологии и может быть использовано для оценки токсичности жидкостей-загрязнителей в водных объектах. Для этого культивируют одноклеточные водоросли в контакте с тестируемой жидкостью и освещают смесь лазером.

Способ определения ртути в рыбе и рыбных продуктах // 2681650

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для определения ртути в рыбе и рыбных продуктах. Для этого гомогенизируют мясо рыбы или рыбных продуктов и помещают образец в смесь 1% раствора перманганата калия, азотной, хлорной и серной кислот, деионизированной воды в соотношении 1:10:10:50:200.

Способ изготовления однокодовых и бескодовых тест-полосок // 2680140

Группа изобретений относится к области диагностических тест-элементов. Диагностический тест-элемент для определения аналита, содержащегося в пробе крови, имеет тестовое поле, содержащее прозрачную пленку, нанесенный на прозрачную пленку по меньшей мере один детекторный слой и расположенный поверх детекторного слоя по меньшей мере один разделительный слой для отделения эритроцитов и кровяных пигментов от исследуемой пробы, причем по меньшей мере один разделительный слой содержит SiO2 в количестве от 1,0 до 1,6 г/м2 и твердые компоненты, включающие способствующий набуханию агент и по меньшей мере один рассеивающий свет пигмент, из насыщенной ими дисперсной системы, полученные диспергированием твердых компонентов в композиции покрытия, образующей разделительный слой.

Способ оценки генетической полноценности сперматозоидов // 2679312

Изобретение относится к области ветеринарии и животноводства и может быть использовано при искусственном осеменении для выявления генетически неполноценных сперматозоидов, их выбраковки и недопустимости использования для искусственного осеменения.

Способ детекции последовательностей нуклеотидов методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с универсальным зондом // 2675378

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу детекции последовательности нуклеотидов при проведении полимеразной цепной реакции. Раскрыт способ детекции специфических нуклеотидных последовательностей с помощью ПЦР в реальном времени, включающий приготовление реакционной смеси, при этом прямой праймер имеет в своем составе с 3' конца участок, комплементарный детектируемой нуклеотидной последовательности, следующий за ним участок, имеющий идентичную флуоресцентному зонду последовательность, участок в области 5' конца, представляющий собой две комплементарные друг другу последовательности, разделенные некомплементарным участком и гибридизующиеся во время реакции, за счет чего ампликон, полученный с помощью обратного праймера с матрицы, содержащей в своем составе прямой праймер, получает участок для отжига флуоресцентного зонда, а также две комплементарные друг другу последовательности уже на 3' конце, одна из которых после гибридизации выступает в роли праймера и запускает амплификацию с гидролизом зонда, достраивая последовательность на ампликоне с образованием на его 3' конце участка для отжига обратного праймера, что позволяет уже этому праймеру в последующих циклах запускать амплификацию с гидролизом отжигающихся на ампликоне флуоресцентных зондов, что сопровождается нарастанием флуоресценции, путем оценки которой выполняется детекция наличия специфических нуклеотидных последовательностей.

Способ количественного анализа клеточной составляющей скаффолда // 2675376

Изобретение относится к медицине, биотехнологии, регенеративной медицине, в частности к способам количественной оценки клеток в составе клеточно-инженерной конструкции (скаффолда).

Способ определения α-фарнезена и продуктов его окисления в атмосфере хранения для оценки восприимчивости плодов к загару // 2687597

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано для оценки восприимчивости партий плодов к загару в садоводческих предприятиях, занимающихся хранением яблок. Способ определения α-фарнезена и продуктов его окисления в атмосфере хранения для оценки восприимчивости плодов яблок к загару заключается в том, что подготавливают сорбирующие ленты путем пропитывания полосок бумаги вазелиновым маслом, размещают их в камерах хранения без контакта с плодами, а содержание α-фарнезена и продуктов его окисления определяют спектрофотометрическим методом в сорбирующих лентах, что косвенным образом отражает их содержание в атмосфере хранения. Предлагаемый способ определения содержания α-фарнезена и продуктов его окисления позволяет оценивать восприимчивость к загару всей партии плодов (50-200 т и более), размещенной в камере, при этом способ отличается высокой производительностью, высокой точностью, не требует дорогостоящего оборудования и высокой квалификации оператора, может быть использован для проведения массовых анализов. 3 табл., 2 пр.

Способ оценки состава биопленок грамположительных бактерий // 2688215

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, инфекционным болезням, дезинфектологии, и может быть использовано для изучения действия факторов на биопленку и биопленкообразующую способность грамположительных микроорганизмов. Способ оценки состава биопленок грамположительных бактерий, сформированных в полистироловых планшетах, осуществляют с помощью 0,1% водного раствора генцианвиолета с его экстракцией спиртом и фотометрированием проб при длине волны 560 нм, при этом окраску генцианвиолетом осуществляют в течение 5 минут с последующей фиксацией красителя в бактериальных клетках раствором Люголя, растворяют окрашенные продукты 70% спиртом: компоненты матрикса в течение 1 минуты, совокупной биопленки в течение 15 минут, после чего оценивают состав биопленок по формулам М=(ОПбв / ОП15) × 100; Кб=100-М, где М - доля матрикса, %; Кб - доля клеточной составляющей, %; ОПбв - оптическая плотность проб, когда спирт для растворения окрашенного продукта выдерживают не более 1 минуты; ОП15 - оптическая плотность проб, когда спирт для растворения окрашенного продукта выдерживают 15 минут. Способ позволяет отдифференцировать клеточную составляющую и матрикс биопленки, при сокращении времени исследования. 3 пр.