Композиции и способы ингибирования экспрессии гена alas1

Изобретение относится к биотехнологии. Описана двунитевая рибонуклеиновая кислота (днРНК) для ингибирования экспрессии ALAS1. Указанная днРНК содержит смысловую нить и антисмысловую нить. Антисмысловая нить комплементарна по меньшей мере нуклеотидам 871-889 последовательности SEQ ID NO: 1 и включает SEQ ID NO: 1296. Смысловая нить содержит по меньшей мере 15 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов последовательности SEQ ID NO: 1295. Каждая из смысловой и антисмысловой нитей имеет длину от 19 до 24 нуклеотидов. днРНК включает один или более нуклеотидов с модификацией, выбранной из 2’-O-метил-модифицированного нуклеотида, 2’-фтор-модифицированного нуклеотида или обоих. Также представлена фармацевтическая композиция для ингибирования экспрессии гена ALAS1, содержащая терапевтически эффективное количество днРНК. Представлены способы ингибирования экспрессии ALAS1 в клетке, лечения расстройства и снижения уровня порфирина или предшественника порфирина в клетке, связанного с экспрессией ALAS1, включающие введение днРНК. Изобретение позволяет ингибировать экспрессию гена ALAS1. 8 н. и 37 з.п. ф-лы, 15 ил., 20 табл., 12 пр.

 

Родственные заявки

Настоящая заявка является частичным продолжением заявки на выдачу патента США №13/835613, поданной 15 марта 2013, а также притязает на приоритет на основании предварительной заявки на выдачу патента США №61/622288, поданной 10 апреля 2012. Полное содержание каждой из вышеупомянутых заявок включено в настоящее описание в полном объеме.

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к специфичному ингибированию экспрессии гена ALAS1.

Уровень техники

Наследственные порфирии представляют собой семейство расстройств, возникающих в результате недостаточной активности специфичных ферментов в пути биосинтеза гема, также называемого в настоящем описании путем порфиринов. Недостаточность ферментов пути порфиринов приводит к недостаточной продукции гема и к накоплению предшественников порфирина и порфиринов, которые являются токсичными для ткани в высоких концентрациях.

Среди наследственных порфирий острую интермиттирующую порфирию (AIP, например, аутосомно-доминантную AIP), смешанную порфирию (VP, например, аутосомно-доминантную VP), наследственную копропорфирию (копропорфирию или HCP, например, аутосомно-доминантную HCP) и порфирию вследствие недостаточности дегидратазы 5'-аминолевулиновой кислоты (также известной как δ-аминолевулиновая кислота или ALA) (ADP, например, аутосомно-доминантную ADP) классифицируют как острые печеночные порфирии, и они проявляются острыми неврологическими приступами, которые могут угрожать жизни. Острые приступы характеризуются симптомами автономной, периферической и центральной нервной систем, включая тяжелую боль в области живота, гипертонию, тахикардии, запор, моторную слабость, паралич и судороги. В отсутствие правильного лечения может наступить квадриплегия, нарушение функции дыхания и смерть. Различные факторы, включая индуцирующие цитохром P450 лекарственные средства, диета и гормональные изменения, могут провоцировать острые приступы за счет повышения активности печеночной синтазы 5'-аминолевулиновой кислоты 1 (ALAS1), первого и лимитирующего скорость фермента пути биосинтеза гема. При острых порфириях, например, AIP, VP, HCP и ADP, недостаточности соответствующих ферментов приводят к продукции и накоплению в печени одного или нескольких веществ (например, порфиринов и/или предшественников порфиринов, например, ALA и/или PBG), которые могут быть нейротоксичными и могут приводить к возникновению острых приступов. См., например, Balwani M. and Desnick, R.J., Blood, 120: 4496-4504, 2012.

Современная терапия острых неврологических приступов заключается во внутривенном введении гемина (пангематин®, Lundbeck или нормосанг®, Orphan Europe), который обеспечивает экзогенный гем для ингибирования ALAS1 по принципу отрицательной обратной связи, и тем самым снижает продукцию ALA и PBG. Гемин применяют для лечения во время острого приступа и для профилактики приступов, в частности, у женщин с острыми порфириями, которые страдают от частых атак, с гормональными изменениями во время их менструальных циклов. Хотя пациенты обычно хорошо реагируют, его эффект является медленным, обычно занимающим от двух до четырех дней или дольше для нормализации концентраций ALA и PBG в моче до нормальных уровней. Так как внутривенно вводимый гемин быстро метаболизируется, обычно требуется от трех до четырех инфузий для эффективного лечения или профилактики острого приступа. Кроме того, многократные инфузии могут вызывать перенасыщение железом и флебит, который может нарушать доступ к периферическим венам. Хотя для лечения используют ортотропную трансплантацию печени, такая процедура связана со значительной заболеваемостью и смертностью и наличие доноров печени ограничено. Таким образом, необходим альтернативный терапевтический способ, который является более эффективным, быстродействующим и безопасным. Было бы особенно предпочтительно, чтобы такое лечение могло быть осуществлено путем подкожного введения, так как это могло бы исключить необходимость в инфузиях и длительной госпитализации.

AIP, также называемая недостаточностью дезаминазы порфобилиногена (PBGD) или недостаточностью синтазы гидроксиметилбилана (HMBS), является наиболее распространенной из острых печеночных порфирий. Она является аутосомно-доминантным расстройством, вызванным мутациями в гене HMBS, которые приводят к пониженной активности, например, активности, пониженной наполовину по сравнению с нормальной активностью фермента. Ранее с использованием гомологичной рекомбинации была создана мышиная модель AIP, в которой выявлено ~30% от активности HMBS дикого типа. Подобно больным людям у таких мышей повышена активность ALAS1 печени и накапливаются большие количества ALA и PBG в плазме и моче при введении порфириногенных лекарственных средств, таких как фенобарбитал. Таким образом, такие мыши служат в качестве прекрасной модели для оценки эффективности новых терапевтических средств для лечения острых печеночных порфирий.

Сущность изобретения

В настоящем изобретении описаны способы и композиции и-РНК для модулирования экспрессии гена ALAS1. В некоторых вариантах экспрессию гена ALAS1 снижают или ингибируют, используя ALAS1-специфичную и-РНК. Такое ингибирование может быть полезным для лечения расстройств, связанных с экспрессией ALAS1 экспрессия, таких как порфирии.

Соответственно, в настоящей публикации описаны композиции и способы, которые вызывают опосредованное РНК-индуцируемым комплексом сайленсинга (RISC) расщепление РНК-транскриптов гена ALAS1, например, в клетке или у субъекта (например, у млекопитающего, такого как человек). Также описаны композиции и способы лечения расстройства, связанного с экспрессией гена ALAS1, такого как порфирия, например, X-сцепленная сидеробластная анемия (XLSA), порфирия вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ночная порфирия или ADP), острая интермиттирующая порфирия (AIP), врожденная эритропоэтическая порфирия (CEP), поздняя кожная порфирия (PCT), наследственная копропорфирия (копропорфирия или HCP), смешанная порфирия (VP), эритропоэтическая протопорфирия (EPP) или временная эритропорфирия новорожденных. В некоторых вариантах расстройство представляет собой острую печеночную порфирию, например, порфирию вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP), AIP, HCP или VP. В некоторых вариантах расстройство представляет собой порфирию вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP) или AIP.

В некоторых вариантах порфирия представляет собой печеночную порфирию, например, порфирию, выбранную из острой интермиттирующей порфирии (AIP), наследственной копропорфирии (HCP), смешанной порфирии (VP), порфирии вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP) и гепатоэритропоэтической порфирии. В некоторых вариантах порфирия представляет собой гомозиготную доминантную печеночную порфирию (например, гомозиготную доминантную AIP, HCP или VP) или гепатоэритропоэтическую порфирию. В некоторых вариантах порфирия представляет собой двойную порфирию.

В используемом в настоящем описании смысле термин «и-РНК», «РНК-и», «и-РНК-средство» или «РНК-и-средство» относится к средству, которое содержит РНК, которая определена в настоящем описании и которая опосредует целенаправленное расщепление РНК-транскрипта, например, посредством пути РНК-индуцируемого комплекса сайленсинга (RISC). В одном варианте и-РНК, которая описана в настоящей публикации, осуществляет ингибирование экспрессии ALAS1 в клетке или в организме млекопитающего.

И-РНК, входящие в состав композиций, охарактеризованных в настоящем описании, охватывают днРНК, имеющие нить РНК (антисмысловую нить), имеющую область, например, область длиной 30 нуклеотидов или меньше, обычно 19-24 нуклеотида, которая в значительной степени комплементарна, по меньшей мере, части транскрипта мРНК гена ALAS1 (например, гена ALAS1 мыши или человека) (также называемую в настоящем описании «ALAS1-специфичной и-РНК»). Альтернативно или вместе с тем, и-РНК охватывают днРНК, имеющие нить РНК (антисмысловую нить), имеющую область, которая имеет длину 30 нуклеотидов или меньше, обычно 19-24 нуклеотида, которая значительной степени комплементарна, по меньшей мере, части транскрипта мРНК гена ALAS1 (например, гена ALAS1 варианта 1 или 2 человека) (также называемую в настоящем описании «ALAS1- специфичной и-РНК»).

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК), описанная в настоящей публикации, содержит антисмысловую нить, имеющую область, которая в значительной степени комплементарна области ALAS1 человека. В некоторых вариантах ALAS1 человека имеет последовательность NM_000688.4 (SEQ ID NO: 1) или NM_000688.5 (SEQ ID NO: 382).

В других вариантах и-РНК охватывает днРНК, имеющую нить РНК (антисмысловую нить), имеющую область, которая в значительной степени комплементарна части мРНК ALAS1 согласно любой из таблиц 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 или 20. В одном варианте и-РНК охватывает днРНК, имеющую нить РНК (антисмысловую нить), имеющую область, которая в значительной степени комплементарна части мРНК ALAS1, например, мРНК ALAS1 человека (например, мРНК ALAS1 человека, которая представлена в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 382).

В одном варианте и-РНК для ингибирования экспрессии гена ALAS1 включает в себя, по меньшей мер, две последовательности, которые комплементарны друг другу. и-РНК включает в себя смысловую нить, имеющую первую последовательность, и антисмысловую нить, имеющую вторую последовательность. Антисмысловая нить содержит нуклеотидную последовательность, которая в значительной степени комплементарна, по меньшей мере, части мРНК, кодирующей транскрипт ALAS1, и область комплементарности имеет длину 30 нуклеотидов или меньше, и по меньшей мере, 15 нуклеотидов. Обычно и-РНК имеет длину 19-24 нуклеотида.

В некоторых вариантах и-РНК имеет длину 19-21 нуклеотид. В некоторых вариантах и-РНК имеет длину 19-21 нуклеотид и входит в состав липидного препарата, например, препарата в виде липидных наночастиц (LNP) (например, препарата LNP11).

В некоторых вариантах и-РНК имеет длину 21-23 нуклеотида. В некоторых вариантах и-РНК имеет длину 21-23 нуклеотида и находится в форме конъюгата, например, конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, которые описаны в настоящей публикации.

В некоторых вариантах и-РНК имеет длину примерно от 15 до примерно 25 нуклеотидов, и в других вариантах и-РНК имеет длину примерно от 25 до примерно 30 нуклеотидов. и-РНК, мишенью которой является ALAS1, при контакте с клеткой, экспрессирующей ALAS1, ингибирует экспрессию гена ALAS1, по меньшей мере, на 10%, по меньшей мере, на 20%, по меньшей мере, на 25%, по меньшей мере, на 30%, по меньшей мере, на 35% или, по меньшей мере, на 40% или больше, так как в анализе способом, который описан в настоящей публикации. В одном варианте и-РНК, мишенью которой является ALAS1, приготовлена в виде стабильной частицы, состоящей из нуклеиновой кислоты и липида (SNALP).

В одном варианте и-РНК (например, днРНК), охарактеризованная в настоящем описании, содержит первую последовательность днРНК, которая выбрана из группы, состоящей из смысловых последовательностей, указанных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 и 15, и вторую последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из соответствующих антисмысловых последовательностей, указанных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 и 15.

В одном варианте и-РНК (например, днРНК), охарактеризованная в настоящем описании, содержит первую последовательность днРНК, которая выбрана из группы, состоящей из смысловых последовательностей, указанных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20, и вторую последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из соответствующих антисмысловых последовательностей, указанных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20. В одном варианте и-РНК (например, днРНК), охарактеризованная в настоящем описании, имеет смысловые и/или антисмысловые последовательности, выбранные из последовательностей AD-58882, AD-58878, AD-58886, AD-58877, AD-59115, AD-58856, AD-59129, AD-59124, AD-58874, AD-59125, AD-59105, AD-59120, AD-59122, AD-59106, AD-59126 и AD-59107, которые раскрыты в настоящем описании в примерах. В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) имеет смысловые и/или антисмысловые последовательности, выбранные из последовательностей AD-58882, AD-58878, AD-58886, AD-58877, AD-59115, AD-58856 и AD-59129.

Молекулы и-РНК, охарактеризованные в настоящем описании, могут содержать встречающиеся в природе нуклеотиды или могут содержать, по меньшей мере, один модифицированный нуклеотид, включая без ограничения модифицированный 2'-O-метилом нуклеотид, нуклеотид, имеющий 5'-фосфоротиоатную группу, и концевой нуклеотид, связанный с холестериловым производным. Альтернативно модифицированный нуклеотид может быть выбран из группы, состоящей из: 2'-дезокси-2'-фтор-модифицированного нуклеотида, 2'-дезокси-модифицированного нуклеотида, закрытого нуклеотида, лишенного основания нуклеотида, 2'-амино-модифицированного нуклеотида, 2'-алкил-модифицированного нуклеотида, морфолинонуклеотида, содержащего фосфорамидат и неприродное основание нуклеотида. Такая модифицированная последовательность может быть основана, например, на первой последовательности указанной и-РНК, выбранной из группы, состоящей из смысловых последовательностей, указанных в таблице 2, и второй последовательности, выбранной из группы, состоящей из соответствующих антисмысловых последовательностей, указанных в таблице 2.

В одном варианте и-РНК (например, днРНК), охарактеризованная в настоящем описании, содержит смысловую нить, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 330, SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 342, SEQ ID NO: 344, SEQ ID NO: 346, SEQ ID NO: 356, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 362, SEQ ID NO: 366, SEQ ID NO: 376 и SEQ ID NO: 380.

В одном варианте и-РНК (например, днРНК), охарактеризованная в настоящем описании, содержит антисмысловую нить, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 345, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 363, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 377 и SEQ ID NO: 381.

В одном варианте и-РНК (например, днРНК), охарактеризованная в настоящем описании, содержит смысловую нить, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 186 и SEQ ID NO: 190. В одном варианте и-РНК (например, днРНК), охарактеризованная в настоящем описании, содержит антисмысловую нить, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187 и SEQ ID NO: 191.

В одном варианте мишенью и-РНК, которая описана в настоящей публикации, является вариант РНК-транскрипта ALAS1 дикого типа, и в другом варианте мишенью и-РНК является мутантный транскрипт (например, РНК ALAS1, несущая аллельный вариант). Например, мишенью и-РНК, охарактеризованной в изобретении, может быть полиморфный вариант, такой как вариант, возникший вследствие однонуклеотидного полиморфизма (SNP) ALAS1. В другом варианте мишенью и-РНК является как транскрипт дикого типа, так мутантный транскрипт ALAS1. В следующем варианте мишенью и-РНК является конкретный вариант транскрипта ALAS1 (например, вариант 1 ALAS1 человека). В следующем варианте мишенью и-РНК-средства являются множественные варианты транскриптов (например, как вариант 1, так и вариант 2 ALAS1 человека).

В одном варианте мишенью и-РНК, охарактеризованной в изобретении, является некодирующая область РНК-транскрипта ALAS1, такая как 5'- или 3'-нетранслируемая область транскрипта.

В некоторых вариантах и-РНК, которая описана в настоящей публикации, имеет форму конъюгата, например, конъюгата с углеводом, который может служить в качестве направляющего к мишени остатка и/или лиганда, который описан в настоящей публикации. В одном варианте конъюгат связан с 3'-концом смысловой нити днРНК. В некоторых вариантах конъюгат связан через линкер, например, через бивалентный или трехвалентный разветвленный линкер.

В некоторых вариантах конъюгат содержит одно или несколько производных N-ацетилгалактозамина (GalNAc). Такой конъюгат также называют в настоящем описании GalNAc-конъюгатом. В некоторых вариантах конъюгат направляет РНК-и-средство к конкретной клетке, например, клетке печени, например, к гепатоциту. GalNAc-производные могут быть связаны через линкер, например, бивалентный или трехвалентный разветвленный линкер. В конкретных вариантах конъюгат представляет собой

В некоторых вариантах РНК-и-средство связано с углеводным конъюгатом через линкер, например, линкер, который показан на следующей схеме, где X означает O или S

В некоторых вариантах X означает O. В некоторых вариантах X означает S.

В некоторых вариантах РНК-и-средство конъюгировано с L96, который определен в таблице 1 и показан ниже

В одном аспекте в изобретении предлагается фармацевтическая композиция для ингибирования экспрессии гена ALAS1 в организме, обычно у человека. Композиция обычно содержит одну или несколько и-РНК, описанных в настоящей публикации, и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель для доставки. В одном варианте композицию применяют для лечения порфирии, например, AIP.

В одном аспекте и-РНК, предлагаемая в настоящем изобретении, является двунитевой рибонуклеиновой кислотой (днРНК) для ингибирования экспрессии ALAS1, при этом указанная днРНК содержит смысловую нить и антисмысловую нить длиной 15-30 пар оснований, и антисмысловая нить комплементарна, по меньшей мере, 15 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов последовательности SEQ ID NO: 1 или 382.

В следующем аспекте и-РНК, предлагаемая в настоящем изобретении, является двунитевой РНК-и (днРНК), содержащей смысловую нить, комплементарную антисмысловой нити, при этом указанная антисмысловая нить содержит область, комплементарную РНК-транскрипту ALAS1, при этом каждая нить имеет длину примерно от 14 до примерно 30 нуклеотидов, при этом указанное средство в виде двунитевой РНК-и представлено формулой (III):

смысловая: 5' n_p-N_a-(X X X)_i-N_b-Y Y Y - N_b-(Z Z Z)_j -N_a - n_q 3'

антисмысловая: 3' n_p'-N_a'-(X'X'X')_k-N_b'-Y'Y'Y'-N_b'-(Z'Z'Z')_l -N_a'- n_q' 5'

(III)

где:

i, j, k и l каждый независимо означают 0 или 1;

p, p', q и q' каждый независимо равен 0-6;

каждый N_a и N_a' независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 нуклеотидов, которые либо модифицированы, либо немодифицированы, либо представлены сочетанием модифицированных и немодифифированных нуклеотидов, при этом каждая последовательность содержит, по меньшей мере, два по-разному модифицированных нуклеотида;

каждый N_b и N_b' независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 нуклеотидов, которые либо модифицированы, либо немодифицированы, либо представлены сочетанием модифицированных и немодифифированных нуклеотидов;

каждый n_p, np', n_q и n_q' независимо означает выступающий нуклеотид;

XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' и Z'Z'Z' каждый независимо означает один мотив из трех идентичных модификаций трех непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов;

модификации на N_b отличаются от модификации на Y, и модификации на N_b' отличаются от модификации на Y'.

В некоторых вариантах смысловая нить конъюгирована, по меньшей мере, с одним лигандом.

В некоторых вариантах i равен 1; j равен 1; или оба i и j равны 1.

В некоторых вариантах k равен 1; l равен 1; или оба k и l равны 1.

В некоторых вариантах XXX комплементарен X'X'X', YYY комплементарен Y'Y'Y', и ZZZ комплементарен Z'Z'Z'.

В некоторых вариантах мотив Y'Y'Y' встречается в 11, 12 и 13 положениях антисмысловой нити от 5'-конца.

В некоторых вариантах Y' означает 2'-O-метил.

В некоторых вариантах область дуплекса имеет длину 15-30 пар нуклеотидов.

В некоторых вариантах область дуплекса имеет длину 17-23 пар нуклеотидов.

В некоторых вариантах область дуплекса имеет длину 19-21 пар нуклеотидов.

В некоторых вариантах область дуплекса имеет длину 21-23 пары нуклеотидов.

В некоторых вариантах модификации нуклеотидов выбраны из группы, состоящей из LNA, HNA, CeNA, 2'-метоксиэтил, 2'-O-алкил, 2'-O-аллил, 2'-C-аллил, 2'-фтор, 2'-дезоксигруппы, 2'-гидроксила и их сочетаний.

В некоторых вариантах модификациями нуклеотидов являются 2'-O-метил, 2'-фтор или оба.

В некоторых вариантах лиганд содержит углевод.

В некоторых вариантах лиганд связан через линкер.

В некоторых вариантах линкер представляет собой бивалентный или трехвалентный разветвленный линкер.

В некоторых вариантах лиганд представляет собой

В некоторых вариантах лиганд и линкер представляют собой лиганд и ликер, показанные в формуле XXIV:

В некоторых вариантах лиганд связан с 3'-концом смысловой нити.

В некоторых вариантах днРНК имеет (например, содержит) нуклеотидную последовательность, выбранную из группы последовательностей, представленных в таблицах 2 и 3. В некоторых вариантах днРНК имеет нуклеотидную последовательность, выбранную из группы последовательностей, представленных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8 и 9. В некоторых вариантах днРНК имеет нуклеотидную последовательность, выбранную из группы последовательностей, представленных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 и 15. В некоторых вариантах днРНК имеет нуклеотидную последовательность, выбранную из группы последовательностей, представленных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20. В некоторых вариантах днРНК имеет нуклеотидную последовательность, указанную в таблице 18. В некоторых вариантах днРНК имеет нуклеотидную последовательность, выбранную из группы последовательностей, представленных в таблицах 14 и 15.

В некоторых вариантах днРНК имеет нуклеотидную последовательность, выбранную из группы последовательностей, представленных в таблицах 3 и 8.

В следующем аспекте и-РНК, предлагаемая в настоящем изобретении, представляет собой двунитевую рибонуклеиновую кислоту (днРНК) для ингибирования экспрессии ALAS1, при этом указанная днРНК содержит смысловую нить и антисмысловую нить, при этом антисмысловая нить содержит область комплементарности РНК-транскрипту ALAS1, и такая антисмысловая нить содержит, по меньшей мере, 15 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от одной из антисмысловых последовательностей, перечисленных в любой из таблиц 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 или 20. В некоторых таких вариантах смысловые и антисмысловые последовательности выбраны из последовательностей дуплексов AD-58882, AD-58878, AD-58886, AD-58877, AD-59115, AD-58856, AD-59129, AD-59124, AD-58874, AD-59125, AD-59105, AD-59120, AD-59122, AD-59106, AD-59126 и AD-59107, которые раскрыты в настоящем описании в примерах. В некоторых вариантах смысловые и антисмысловые последовательности выбраны из последовательностей дуплексов AD-58882, AD-58878, AD-58886, AD-58877, AD-59115, AD-58856 и AD-59129. В некоторых вариантах смысловые и антисмысловые последовательности представляют собой последовательности дуплекса AD-58632. В некоторых вариантах смысловые и антисмысловые последовательности выбраны из последовательностей дуплексов AD-59453, AD-59395, AD-59477 и AD-59492. В некоторых вариантах смысловые и антисмысловые последовательности представляют собой последовательности дуплекса, раскрытого в настоящем описании, который подавляет экспрессию мРНК ALAS1, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85% или 90%, например, судя по оценке с использованием анализа, описанного в примерах, предлагаемых в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах днРНК содержит, по меньшей мере, один модифицированный нуклеотид.

В некоторых вариантах, по меньшей мере, один из модифицированных нуклеотидов выбран из группы, состоящей из: модифицированного 2'-O-метилом нуклеотида, нуклеотида, содержащего 5'-фосфоротиоатную группу, и концевого нуклеотида, связанного с группой холестерилового производного или бисдециламида додекановой кислоты.

В некоторых вариантах модифицированный нуклеотид выбран из группы, состоящей из: 2'-дезокси-2'-фтор-модифицированного нуклеотида, 2'-дезокси-модифицированного нуклеотида, закрытого нуклеотида, лишенного основания нуклеотида, 2'-амино-модифицированного нуклеотида, 2′-алкил-модифицированного нуклеотида, морфолинонуклеотида, содержащего фосфорамидат и нуклеотида, содержащего неприродное основание.

В некоторых вариантах область комплементарности имеет длину, по меньшей мере, 17 нуклеотидов.

В некоторых вариантах область комплементарности имеет длину от 19 до 21 нуклеотида.

В некоторых вариантах область комплементарности имеет длину 19 нуклеотидов.

В некоторых вариантах каждая нить имеет длину, составляющую не более чем 30 нуклеотидов.

В некоторых вариантах, по меньшей мере, одна нить содержит 3'-липкий конец, состоящий, по меньшей мере, из 1 нуклеотида.

В некоторых вариантах, по меньшей мере, одна нить содержит 3'-липкий конец, состоящий, по меньшей мере, из 2 нуклеотидов.

В некоторых вариантах днРНК, описанная в настоящей публикации, дополнительно содержит лиганд.

В некоторых вариантах лигандом является лиганд GalNAc.

В некоторых вариантах лиганд направляет днРНК в гепатоциты.

В некоторых вариантах лиганд конъюгирован с 3'-концом смысловой нити днРНК.

В некоторых вариантах область комплементарности состоит из антисмысловой последовательности, выбранной из последовательностей, указанных в таблице 2 или таблице 3. В некоторых вариантах область комплементарности состоит из антисмысловой последовательности, выбранной из последовательностей, указанных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 или 15. В некоторых вариантах область комплементарности состоит из антисмысловой последовательности, выбранной из последовательностей, указанных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 или 20. В некоторых вариантах область комплементарности состоит из антисмысловой последовательности, выбранной из последовательностей AD-58882, AD-58878, AD-58886, AD-58877, AD-59115, AD-58856, AD-59129, AD-59124, AD-58874, AD-59125, AD-59105, AD-59120, AD-59122, AD- 59106, AD-59126 или AD-59107, которые раскрыты в настоящем описании в примерах. В некоторых вариантах область комплементарности состоит из антисмысловой последовательности дуплекса AD-58632. В некоторых вариантах область комплементарности состоит из антисмысловой последовательности, выбранной из последовательностей AD-59453, AD-59395, AD-59477 и AD-59492. В некоторых вариантах область комплементарности состоит из антисмысловой последовательности, выбранной из дуплекса, раскрытого в настоящем описании, который подавляет экспрессию мРНК ALAS1, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85% или 90%, например, судя по оценке с использованием анализа, описанного в примерах, приведенных в настоящем описании.

В некоторых вариантах днРНК содержит смысловую нить, состоящую из последовательности смысловой нити, выбранной из последовательностей, указанных в таблице 2 или таблице 3, и антисмысловую нить, состоящую из антисмысловой последовательности, выбранной из последовательностей, указанных в таблице 2 или таблице 3.

В некоторых вариантах днРНК содержит смысловую нить, состоящую из последовательности смысловой нити, выбранной из последовательностей, указанных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 или 15, и антисмысловую нить, состоящую из антисмысловой последовательности, выбранной из последовательностей, указанных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 или 15. В некоторых вариантах днРНК содержит пару соответствующих смысловых и антисмысловых последовательностей, выбранных из последовательностей, указанных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 и 15.

В некоторых вариантах днРНК содержит смысловую нить, состоящую из последовательности смысловой нити, выбранной из последовательностей, указанных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 или 20, и антисмысловую нить, состоящую из антисмысловой последовательности, выбранной из последовательностей, указанных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 или 20. В некоторых вариантах днРНК содержит пару соответствующих смысловых и антисмысловых последовательностей, выбранных из последовательностей дуплексов, указанных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20.

В одном аспекте изобретение относится к клетке, содержащей, по меньшей мере, одну из и-РНК (например, днРНК), охарактеризованную в настоящем описании. Клетка обычно представляет собой клетку млекопитающего, такую как клетка человека. В некоторых вариантах клетка является эритроидной клеткой. В других вариантах клетка является клеткой печени (например, гепатоцитом).

В одном аспекте в настоящем изобретении предлагается фармацевтическая композиция для ингибирования экспрессии гена ALAS1, при этом композиция содержит и-РНК (например, днРНК), описанную в настоящей публикации.

В некоторых вариантах фармацевтических композиций, описанных в настоящей публикации, и-РНК (например, днРНК) вводят в небуферном растворе. В некоторых вариантах небуферным раствором является физиологический раствор или вода.

В некоторых вариантах фармацевтических композиций, описанных в настоящей публикации, и-РНК (например, днРНК вводят в небуферном растворе. В некоторых вариантах небуферный раствор содержит ацетат, цитрат, проламин, карбонат или фосфат или любое их сочетание. В некоторых вариантах буферный раствор представляет собой фосфатно-солевой буфер (PBS).

В некоторых вариантах фармацевтических композиций, описанных в настоящей публикации, и-РНК (например, днРНК) нацелена на гепатоциты.

В некоторых вариантах фармацевтических композиций, описанных в настоящей публикации, композицию вводят внутривенно.

В некоторых вариантах фармацевтических композиций, описанных в настоящей публикации, композицию вводят подкожно.

В некоторых вариантах фармацевтическая композиция содержит и-РНК (например, днРНК), описанную в настоящей публикации, которая содержит лиганд (например, лиганд GalNAc), который направляет и-РНК (например, днРНК) к гепатоцитам.

В некоторых вариантах фармацевтическая композиция содержит и-РНК (например, днРНК), описанную в настоящей публикации, которая содержит лиганд (например, лиганд GalNAc), и фармацевтическую композицию вводят подкожно. В некоторых вариантах лиганд направляет и-РНК (например, днРНК) к гепатоцитам.

В некоторых вариантах фармацевтическая композиция, например, композиция, описанная в настоящей публикации, включает липидный препарат. В некоторых вариантах РНК-и-средство находится в препарате LNP, например, препарате MC3. В некоторых вариантах препарат LNP направляет РНК-и-средство к конкретной клетке, например, клетке печени, например, к гепатоциту. В некоторых вариантах липидный препарат представляет собой препарат LNP11. В некоторых вариантах композицию вводят внутривенно.

В другом варианте фармацевтическую композицию готовят для введения согласно схеме дозирования, описанной в настоящей публикации, например, не более чем один раз каждые четыре недели, не более чем один раз каждые три недели, не более чем один раз каждые две недели или не более чем один раз в неделю. В другом варианте введение фармацевтической композиции можно осуществлять в течение месяца или дольше, например, один, два, три или шесть месяцев, или в течение одного года или дольше.

В другом варианте композицию, содержащую и-РНК, охарактеризованную в изобретении, например, днРНК, мишенью которой является ALAS1, вводят с терапевтическим средством, не являющимся и-РНК, таким как средство, которое, как известно, лечит порфирию (например, AIP) или симптом порфирии (например, боль). В другом варианте композицию, содержащую и-РНК, охарактеризованную в изобретении, например, днРНК, мишенью которой является AIP, вводят вместе с применением терапевтической схемы, в которой не используют и-РНК, такой как введение гемина или глюкозы (например, инфузия глюкозы (например, внутривенная глюкоза)). Например, и-РНК, охарактеризованную в изобретении, можно вводить до, после или одновременно с глюкозой, декстрозой или сходным средством лечения, которое служит для восстановления энергетического баланса (например, полное парентеральное питание). и-РНК, охарактеризованную в изобретении, также можно вводить до, после или одновременно с введением продукта гема (например, гемина, аргината гема или гемальбумина), и необязательно также с сочетании с глюкозой (например, внутривенной глюкозой) или тому подобным.

Обычно глюкозу, вводимую для лечения порфирии, вводят внутривенно (в/в). Введение глюкозы внутривенно в настоящем описании называют «в/в-глюкоза». Однако также предполагаются альтернативные варианты, в которых глюкозу вводят другими способами.

В одном варианте ALAS1-и-РНК вводят пациенту и затем пациенту вводят средство, не являющееся и-РНК, или терапевтическую схему без и-РНК (например, глюкозу и/или продукт гема) (или наоборот). В другом варианте ALAS1-и-РНК и терапевтическое средство, не являющееся и-РНК, или терапевтическую схему без и-РНК вводят одновременно.

В одном аспекте в настоящем изобретении предлагается способ ингибирования экспрессии ALAS1 в клетке, при этом способ включает в себя: (a) введение в клетку и-РНК (например, днРНК), описанной в настоящей публикации, и (b) поддержание клетки со стадии (a) в течение периода времени, достаточного для получения распада транскрипта мРНК гена ALAS1, с ингибированием, тем самым, экспрессии гена ALAS1 в клетке.

В одном аспекте в настоящем изобретении предлагается способ снижения или ингибирования экспрессии гена ALAS1 в клетке (например, эритроидной клетке или в клетке печени, такой как, например, гепатоцит). При этом способ включает в себя:

(a) введение в клетку двунитевой рибонуклеиновой кислоты (днРНК), при этом днРНК содержит, по меньшей мере, две последовательности, которые комплементарны друг другу. днРНК имеет смысловую нить, имеющую первую последовательность, и антисмысловую нить, имеющую вторую последовательность; при этом антисмысловая нить имеет область комплементарности, которая в значительной степени комплементарна, по меньшей мере, части мРНК, кодирующей ALAS1, и при этом область комплементарности имеет длину 30 нуклеотидов или меньше, т.е., 15-30 нуклеотидов и обычно имеет длину 19-24 нуклеотида, и при этом днРНК при контакте с клеткой, экспрессирующей ALAS1, ингибирует экспрессию гена ALAS1, по меньшей мере, на 10%, например, по меньшей мере, на 20%, по меньшей мере, на 30%, по меньшей мере, на 40% или больше; и

(b) поддержание клетки со стадии (a) в течение периода времени, достаточного для распада транскрипта мРНК гена ALAS1, тем самым, снижая или ингибируя экспрессию гена ALAS1 в клетке.

В некоторых вариантах описанных выше способов ингибирования экспрессии ALAS1 в клетку, клетку обрабатывают ex vivo, in vitro или in vivo. В некоторых вариантах клетка представляет собой гепатоцит.

В некоторых вариантах клетка присутствует в организме субъекта, нуждающегося в лечении, профилактике и/или контроле расстройства, связанного с экспрессией ALAS1.

В некоторых вариантах расстройством является порфирия. В некоторых вариантах порфирия представляет собой острую интермиттирующую порфирию или порфирию вследствие недостаточности ALA-дегидратазы.

В некоторых вариантах порфирия представляет собой печеночную порфирию, например, порфирию, выбранную из острой интермиттирующей порфирии (AIP), наследственной копропорфирии (HCP), смешанной порфирии (VP), порфирии вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP) и гепатоэритропоэтической порфирии. В некоторых вариантах порфирия является гомозиготной доминантной печеночной порфирией (например, гомозиготной доминантной AIP, HCP или VP) или гепатоэритропоэтической порфирией. В некоторых вариантах порфирия представляет собой двойную порфирию.

В некоторых вариантах экспрессию ALAS1 ингибируют, по меньшей мере, на 30%.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) имеет IC₅₀ в диапазоне 0,01-1 нМ.

В некоторых вариантах клетка (например, гепатоцит) является клеткой млекопитающего (например, клеткой человека, примата, отличного от человека, или грызуна).

В одном варианте клетку обрабатывают ex vivo, in vitro или in vivo (например, клетка присутствует в организме субъекта (например, пациента, нуждающегося в лечении, профилактике и/или контроле расстройства, связанного с экспрессией ALAS1).

В одном варианте субъектом является млекопитающее (например, человек) для которого существует риск или у которого диагностирована порфирия, например, X-сцепленная сидеробластная анемия (XLSA), порфирия вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP или ночная порфирия), острая интермиттирующая порфирия (AIP), врожденная эритропоэтическая порфирия (CEP), поздняя кожная порфирия (PCT), наследственная копропорфирия (копропорфирия или HCP), смешанная порфирия (VP), эритропоэтическая протопорфирия (EPP) или временная эритропорфирия новорожденных. В некоторых вариантах расстройством является острая печеночная порфирия, например, порфирия вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP), AIP, HCP или VP. В конкретных вариантах расстройством является порфирия вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP) или AIP.

В некоторых вариантах порфирия представляет собой печеночную порфирию, например, порфирию, выбранную из острой интермиттирующей порфирии (AIP) наследственной копропорфирии (HCP), смешанной порфирии (VP), порфирии вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP) и гепатоэритропоэтической порфирии. В некоторых вариантах порфирия представляет собой гомозиготную доминантную печеночную порфирию (например, гомозиготную доминантную AIP, HCP или VP) или гепатоэритропоэтическую порфирию. В некоторых вариантах порфирия представляет собой двойную порфирию.

В одном варианте введенная днРНК снижает или ингибирует экспрессию гена ALAS1 в клетке.

В одном варианте введенная днРНК снижает или ингибирует экспрессию гена ALAS1 или уровень одного или нескольких порфиринов или предшественников порфиринов (например, δ-аминолевулиновой кислоты (ALA), порфопилиногена (PBG), гидроксиметилбилана (HMB), уропорфириногена I или III, копропорфириногена I или III, протопорфириногена IX и протопорфирина IX) или продуктов или метаболитов порфирина, по меньшей мере, на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% или больше по сравнению с эталоном (например, необработанной клеткой или клеткой, обработанной не направленной к мишени контрольной днРНК). Без связи с какой-либо теорией полагают, что ALAS1 является первым ферментов порфиринового пути. Поэтому снижение экспрессии гена ALAS1 вероятно снижает уровень одного или нескольких предшественников порфиринов, порфиринов или продуктов или метаболитов порфиринов.

В других аспектах изобретение относится к способам лечения, профилактики или контроля патологических процессов, связанных с экспрессией ALAS1 (например, патологических процессов, в которые вовлечены порфирины, предшественники порфиринов или дефекты порфиринового пути, такие как, например, порфирии). В одном варианте способ включает в себя введение субъекту, например, пациенту, нуждающемуся в таком лечении, профилактике или контроле, эффективного (например, терапевтически или профилактически эффективного) количества одной или нескольких и-РНК, охарактеризованных в настоящем описании.

В одном аспекте в настоящем изобретении предлагается способ лечения и/или профилактики расстройства, связанного с экспрессией ALAS1, включающий в себя введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества и-РНК (например, днРНК), описанной в настоящей публикации, или композиции, содержащей и-РНК (например, днРНК), описанной в настоящей публикации.

В одном аспекте в настоящем изобретении предлагается способ лечения и/или профилактики порфирии, включающий в себя введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, двунитевой рибонуклеиновой кислоты (днРНК), при этом указанная днРНК содержит смысловую нить и антисмысловую нить длиной 15-30 пар оснований, и антисмысловая нить комплементарна, по меньшей мере, 15 непрерывно следующим друг за другом нуклеотидам последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 382.

В одном варианте субъект (например, пациент) имеет порфирию. В другом варианте для субъекта (например, пациента) существует риск развития порфирии. В некоторых вариантах введение и-РНК, нацеленной на ALAS1, облегчает или ослабляет тяжесть, по меньшей мере, одного симптома расстройства, связанного с ALAS1, у пациента.

В одном варианте субъектом является млекопитающее (например, человек), который подвержен риску или у которого было диагностировано расстройство, связанное с экспрессией ALAS1, например, порфирия, например, X-сцепленная сидеробластная анемия (XLSA), порфирия вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ночная порфирия), острая интермиттирующая порфирия (AIP), врожденная эритропоэтическая порфирия (CEP), поздняя кожная порфирия (PCT), наследственная копропорфирия (копропорфирия или HCP), смешанная порфирия (VP), эритропоэтическая протопорфирия (EPP) или временная эритропорфирия новорожденных. В следующем варианте порфирия представляет собой острую печеночную порфирию, например, порфирию вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP), AIP, HCP или VP. В некоторых таких вариантах расстройством является порфирия вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP) или AIP.

В некоторых вариантах субъект имеет или подвергается риску развития порфирии. В некоторых вариантах порфирия представляет собой печеночную порфирию, например, порфирию, выбранную из острой интермиттирующей порфирии (AIP), наследственной копропорфирии (HCP), смешанной порфирии (VP), порфирии вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP) и гепатоэритропоэтической порфирии. В некоторых вариантах порфирия представляет собой гомозиготную доминантную печеночную порфирию (например, гомозиготную доминантную AIP, HCP или VP) или гепатоэритропоэтическую порфирию. В некоторых вариантах порфирия представляет собой двойную порфирию.

В некоторых вариантах порфирия, симптом порфирии, продром или приступ порфирии индуцированы воздействием провоцирующего фактора, который описан в настоящей публикации. В некоторых вариантах провоцирующим фактором является химическое воздействие. В некоторых вариантах провоцирующим фактором является лекарственное средство, например, отпускаемое по рецепту лекарственное средство или безрецептурное лекарственное средство. В некоторых вариантах провоцирующим фактором является менструальный цикл, например, конкретная фаза менструального цикла, например, фаза лютеинизации.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) или композицию, содержащую и-РНК вводят после острого приступа порфирии.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) или композицию, содержащую и-РНК, вводят во время острого приступа порфирии.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) или композицию, содержащую и-РНК, вводят профилактически, чтобы предотвратить острый приступ порфирии.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) готовят в виде препарата LNP.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) находится в форме конъюгата с GalNAc.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) вводят в дозе 0,05-50 мг/кг.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) вводят в концентрации 0,01 мг/кг - 5 мг/кг массы тела субъекта.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) готовят в виде препарата LNP и вводят в дозе 0,05-5 мг/кг.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) находится в форме конъюгата с GalNAc, и его вводят в дозе 0,5-50 мг/кг.

В некоторых вариантах способ снижает уровень порфирина или предшественника порфирина у субъекта.

В некоторых вариантах уровень снижается, по меньшей мере, на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%. В одном варианте уровень снижается, по меньшей мере, на 30%.

В некоторых вариантах предшественником порфирина является δ-аминолевулиновая кислота (ALA) или порфопилиноген (PBG). В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) имеет IC₅₀ в диапазоне 0,01-1 нМ.

В некоторых вариантах способ, описанный в настоящей публикации

(i) ослабляет симптом, ассоциированный с расстройством, связанным с ALAS1 (например, порфирией);

(ii) ингибирует экспрессию ALAS1 у субъекта,

(iii) снижает уровень предшественника порфирина (например, ALA или PBG) или порфирина у субъекта,

(iv) снижает частоту острых приступов симптомов, ассоциированных с порфирией, у субъекта, или

(v) снижает частоту острых приступов симптомов, ассоциированных с порфирией, у субъекта, когда субъект подвергается воздействию провоцирующего фактора (например, предменструальной фазы или фазы лютеинизации).

В некоторых вариантах способ облегчает боль и/или прогрессирующую нейропатию.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) или композицию, содержащую и-РНК, вводят согласно схеме дозирования.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) или композицию, содержащую и-РНК, вводят до или во время острого приступа порфирии. В некоторых вариантах и-РНК вводят до острого приступа порфирии.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) или композицию, содержащую и-РНК, вводят во время продрома. В некоторых вариантах продром характеризуется болью в животе, тошнотой, психологическими симптомами (например, тревожностью), беспокойством и/или бессонницей.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) или композицию, содержащую и-РНК, вводят во время конкретно фазы менструального цикла, например, во время фазы лютеинизации. В некоторых вариантах способ ослабляет или предотвращает периодические приступы порфирии, например, благодаря снижению тяжести, продолжительности или частоты приступов. В некоторых вариантах периодические приступы ассоциированы с провоцирующим фактором. В некоторых вариантах провоцирующим фактором является менструальный цикл, например, конкретная фаза менструального цикла, например, фаза лютеинизации.

В некоторых вариантах субъект имеет повышенный уровень ALA и/или PBG. В некоторых вариантах субъект имеет или подвержен риску развития порфирии, например, печеночной порфирии. В некоторых вариантах у субъекта нет симптомов. В некоторых вариантах субъект несет генетическое изменение (например, генную мутацию), ассоциированное с порфирией, которое описано в настоящей публикации.

В некоторых вариантах субъект имеет или подвержен риску развития порфирии и страдает от боли (например, хронической боли, например, хронической нейропатической боли) и/или нейропатии (например, прогрессирующей нейропатии). В некоторых вариантах субъект не страдает от острых приступов, но страдает от боли (например, хронической боли, например, хронической нейропатической боли) и/или нейропатии (например, прогрессирующей нейропатии). В некоторых вариантах боль представляет собой боль в области живота.

В некоторых вариантах субъект (a) имеет повышенный уровень ALA и/или PBG и (b) страдает от боли (например, хронической боли, например, хронической нейропатической боли) и/или нейропатии (например, прогрессирующей нейропатии). В некоторых вариантах боль представляет собой боль в области живота.

В некоторых вариантах субъект имеет уровень в плазме и/или уровень в моче ALA и/или PBG, который повышен. В некоторых вариантах повышенный уровень ALA и/или PBG сопровождается другими симптомами, например, болью (например, хронической болью, например, хронической нейропатической болью) или нейропатией (например, прогрессирующей нейропатией). В некоторых вариантах боль представляет собой боль в области живота. В некоторых вариантах у субъекта нет симптомов. В некоторых вариантах субъект имеет генетическую мутацию, ассоциированную с порфирией, например, мутацию, которая описана в настоящей публикации.

В некоторых вариантах субъект имеет уровень (например, уровень в плазме или уровень в моче) предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG, который повышен, например, уровень выше или выше или равен эталонному значению. В некоторых вариантах уровень выше эталонного значения. В некоторых вариантах эталонное значение на два стандартных отклонения выше среднего уровня в образце от здоровых индивидуумов. В некоторых вариантах эталонное значение является верхним пределом для эталона.

В некоторых вариантах субъект имеет уровень в плазме и/или уровень в моче ALA и/или PBG, который выше или выше или равен 2-кратному, 3-кратному, 4-кратному или 5-кратному верхнему пределу эталона. В используемом в настоящем описании смысле «верхний предел эталона» относится к уровню, который является верхним пределом 95% доверительного интервала для эталонного образца, например, образца от нормальных (например, дикого типа) или здоровых индивидуумов, например, индивидуумов, которые не несут генетической мутации, ассоциированной с порфирией, и/или индивидуумов, которые не страдают от порфирии. В некоторых вариантах субъект имеет уровень ALA и/или PBG в моче, который в 2-4 раза превышает верхний предел эталона. В некоторых вариантах субъект имеет уровень ALA и/или PBG в моче, который в 4 раза превышает верхний предел эталона.

В некоторых вариантах эталонное значения PBG в плазме составляет 0,12 мкмоль/л. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень PBG в плазме, который превышает или выше или равен 0,12 мкмоль/л, 0,24 мкмоль/л, 0,36 мкмоль/л, 0,48 мкмоль/л или 0,60 мкмоль/л. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень PBG в плазме, который превышает или выше или равен 0,48 мкмоль/л.

В некоторых вариантах эталонное значение для PBG в моче составляет 1,2 ммоль/моль креатинина. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень PBG в моче, который превышает или выше или равен 1,2 ммоль/моль креатинина, 2,4 ммоль/моль креатинина, 3,6 ммоль/моль креатинина, 4,8 ммоль/моль креатинина или 6,0 ммоль/моль креатинина. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень PBG в моче, который превышает или выше или равен 4,8 ммоль/моль креатинина.

В некоторых вариантах эталонное значение для ALA в плазме составляет 0,12 мкмоль/л. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень ALA в плазме, который превышает или выше или равен 0,12 мкмоль/л, 0,24 мкмоль/л, 0,36 мкмоль/л, 0,48 мкмоль/л или 0,60 мкмоль/л. В некоторых вариантах субъектом является человек и он имеет уровень ALA в плазме, который превышает или выше или равен 0,48 мкмоль/л.

В некоторых вариантах эталонное значение для ALA в моче составляет 3,1 ммоль/моль креатинина. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень ALA в моче, который превышает или выше или равен 3,1 ммоль/моль креатинина, 6,2 ммоль/моль креатинина, 9,3 ммоль/моль креатинина, 12,4 ммоль/моль креатинина или 15,5 ммоль/моль креатинина.

В некоторых вариантах способ снижает повышенный уровень ALA и/или PBG. В некоторых вариантах способ уменьшает боль (например, хроническую боль, например хроническую нейропатическую боль) и/или нейропатию (например, прогрессирующую нейропатию). В некоторых вариантах боль представляет собой боль в области живота. В некоторых вариантах боль представляет собой нейропатическую боль (например, боль, ассоциированную с прогрессирующей нейропатией при острых порфириях). Уменьшение боли может включать, например, предотвращение боли, задержку появления боли, снижение частоты болей и/или снижение тяжести боли.

В некоторых вариантах способ ослабляет или предотвращает острые приступы порфирии, например, уменьшая тяжесть, продолжительность или частоту приступов.

В некоторых вариантах способ уменьшает или предотвращает повреждение нервов.

В некоторых вариантах способ предотвращает нарушения (например, предотвращает развитие аномалий) или приводит к улучшению клинических показателей, например, клинических показателей мышечной и/или нервной функции, например, ЭМГ и/или скорости проводимости нервов.

В некоторых вариантах способ является эффективным в отношении снижения уровня ALA и/или PBG (например, уровня ALA и/или PBG в плазме или моче). В некоторых вариантах способ является эффективным в отношении получения предварительно определяемого снижения повышенного уровня ALA и/или PBG.

В некоторых вариантах предварительно определяемым снижением является снижение до значения, которое меньше или равно эталонному значению. В некоторых вариантах эталонное значение является верхним пределом эталона. В некоторых вариантах эталонным значением является значение, которое на два стандартных отклонения выше среднего уровня в эталонном образце.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) или композицию, содержащую и-РНК, вводят многократно, например, согласно схеме дозирования.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) или композицию, содержащую и-РНК, вводят профилактически субъекту, который подвергается риску развития порфирии. В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) или композицию, содержащую и-РНК, вводят профилактически, начиная с пубертатного периода. В некоторых вариантах субъект несет генетическую мутацию, ассоциированную с порфирией, и/или имеет повышенный уровень ALA и/или PBG (например, повышенный уровень ALA и/или PBG в плазме или моче). В некоторых вариантах мутация делает индивидуума чувствительным к острому приступу (например, при воздействии провоцирующего фактора, например, лекарственного средства, питания или другого провоцирующего фактора, например, провоцирующего фактора, который раскрыт в настоящем описании). В некоторых вариантах мутация ассоциирована с повышенными уровнями порфирина или предшественника порфирина (например, ALA и/или PBG). В некоторых вариантах мутация ассоциирована с хронической болью (например, хронической нейропатической болью) и/или нейропатией (например, прогрессирующей нейропатией).

В некоторых вариантах мутация представляет собой мутацию гена ALAS1. В некоторых вариантах мутация представляет собой мутацию в промоторе гена ALAS1 или в областях выше или ниже гена ALAS1. В некоторых вариантах мутация представляет собой мутацию в факторах транскрипции или других генах, которые взаимодействуют с ALAS1. В некоторых вариантах мутация представляет собой мутацию в гене, который кодирует фермент пути биосинтеза гема.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) или композицию, содержащую и-РНК, вводят подкожно. В некоторых вариантах и-РНК находится в форме конъюгата с GalNAc. В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) вводят в дозе 0,5-50 мг/кг.

В одном аспекте в настоящем изобретении предлагается способ лечения субъекта с повышенным уровнем ALA и/или PBG, при этом способ включает в себя введение субъекту двунитевой рибонуклеиновой кислоты (днРНК), при этом указанная днРНК содержит смысловую нить и антисмысловую нить длиной 15-30 пар оснований, и антисмысловая нить комплементарна, по меньшей мере, 15 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидам последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 382.

В одном аспекте в настоящем изобретении предлагается способ лечения субъекта с повышенным уровнем ALA и/или PBG, при этом способ включает в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества днРНК или композиции, содержащей днРНК, которая описана в настоящей публикации.

В некоторых вариантах способы, описанные в настоящей публикации, являются эффективными в отношении снижения уровня ALA и/или PBG. В некоторых вариантах уровень ALA и/или PBG снижен так, что он ниже или ниже или равен эталонному значению, например, верхнему пределу эталона. В другом аспекте изобретение относится к способам снижения уровня порфирина или предшественника порфирина в клетке (например, эритроидной клетке или клетке печени, такой как, например, гепатоцит). В одном варианте клетку обрабатывают ex vivo, in vitro или in vivo (например, клетка присутствует в организме субъекта (например, пациента, нуждающегося в лечении, профилактике и/или контроле расстройства, связанного с экспрессией ALAS1). Способ включает в себя осуществление контакта клетки с эффективным количеством одной или нескольких и-РНК, мишенью которых является ALAS1, например, одной или нескольких и-РНК, раскрытых в настоящем описании, тем самым, снижая уровень порфирина или предшественника порфирина в клетке; или снижая уровень порфирина или предшественника порфирина в других клетках, тканях или жидкостях в организме субъекта, в котором клетка находится; относительно уровня до осуществления контакта. Такие способы можно применять для лечения (например, ослабления тяжести) расстройств, связанных с экспрессией ALAS1, таких как порфирии, например, AIP или порфирии вследствие недостаточности дегидратазы ALA.

В одном варианте стадию осуществления контакта осуществляют ex vivo, in vitro или in vivo. Например, клетка может присутствовать в организме субъекта, например, млекопитающего (например, человека), подверженного риску развития порфирии, или у которого диагностирована порфирия. В одном варианте порфирия представляет собой острую печеночную порфирию. В некоторых вариантах порфирия представляет собой печеночную порфирию, например, порфирию, выбранную из острой интермиттирующей порфирии (AIP), наследственной копропорфирии (HCP), смешанной порфирии (VP), порфирии вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP), и гепатоэритропоэтической порфирии. В некоторых вариантах порфирия представляет собой гомозиготную доминантную печеночную порфирию (например, гомозиготную доминантную AIP, HCP или VP) или гепатоэритропоэтическую порфирию. В некоторых вариантах порфирия представляет собой двойную порфирию.

В одном аспекте в настоящем изобретении предлагается способ снижения уровня порфирина или предшественника порфирина (например, ALA или PBG) в клетке, включающий в себя осуществление контакта клетки с и-РНК (например, днРНК), которая описана в настоящей публикации, в количестве, эффективном для снижения уровня порфирина или предшественника порфирина в клетке. В некоторых вариантах клеткой является гепатоцит. В некоторых вариантах порфирином или предшественником порфирина является δ-аминолевулиновая кислота (ALA), порфопилиноген (PBG), гидроксиметилбилан (HMB), уропорфириноген I или III, копропорфириноген I или III, протопорфириноген IX или протопорфирин IX. В некоторых вариантах предшественником порфирина является ALA или PBG.

В одном варианте клетка является эритроидной клеткой. В следующем варианте клетка является клеткой печени (например, гепатоцитом).

В одном аспекте в настоящем изобретении предлагается вектор, кодирующий, по меньшей мере, одну нить и-РНК (например, днРНК), которая описана в настоящей публикации.

В одном аспекте в настоящем изобретении предлагается вектор, кодирующий, по меньшей мере, одну нить днРНК, при этом указанная днРНК содержит область комплементарности, по меньшей мере, с частью мРНК, кодирующей ALAS1, при этом указанная днРНК имеет длину 30 пар оснований или меньше, и при этом указанная днРНК целенаправленно воздействует на указанную мРНК, приводит к ее расщеплению.

В некоторых вариантах область комплементарности имеет длину, по меньшей мере, 15 нуклеотидов.

В некоторых вариантах область комплементарности имеет длину от 19 до 21 нуклеотида. В одном аспекте изобретение относится к вектору для ингибирования экспрессии гена ALAS1 в клетке. В одном варианте вектор содержит и-РНК, которая описана в настоящей публикации. В одном варианте вектор содержит, по меньшей мере, одну регуляторную последовательность, оперативно связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует, по меньшей мере, одну нить и-РНК, которая описана в настоящей публикации. В одном варианте вектор содержит, по меньшей мере, одну нить и-РНК ALAS1.

В одном аспекте в настоящем изобретении предлагается клетка, содержащая вектор, который описан в настоящей публикации. В одном аспекте в настоящем изобретении предлагается клетка, содержащая вектор для ингибирования экспрессии гена ALAS1 в клетке. Вектор содержит регуляторную последовательность, оперативно связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует, по меньшей мере, одну нить одной из и-РНК, которые описаны в настоящей публикации. В одном варианте клетка представляет собой клетку печени (например, гепатоцит). В другом варианте клетка является эритроидной клеткой.

Все публикации, заявки на выдачу патентов, патенты и другие ссылки, упоминаемые в настоящем описании, включены в виде ссылки в полном объеме.

Подробности различных вариантов осуществления изобретения указаны в описании ниже. Другие признаки, цели и преимущества изобретения будут понятны из описания и чертежей и из формулы изобретения.

Описание чертежей

На фиг. 1 изображен путь биосинтеза гема.

На фиг. 2 суммированы некоторые порфирии, ассоциированные с генетическими ошибками в метаболизме гема.

На фиг. 3 изображен вариант 1 транскрипта последовательности мРНК ALAS1 человека (эталонная последовательность NM_000688.4 (GI:40316942, запись, датированная 19 ноября 2011), SEQ ID NO: 1).

На фиг. 4 изображен вариант 2 транскрипта последовательности мРНК ALAS1 человека (эталонная последовательность NM_000688.5 (GI: 362999011, запись, датированная 1 апреля 2012), SEQ ID NO: 382).

На фиг. 5 показана зависимость доза-ответ для ми-РНК AD-53558 в подавлении мРНК ALAS1 мыши (mALAS1) относительно PBS-контроля. Также показаны результаты для контроля с люциферазой (LUC) AD-1955.

На фиг. 6 показана зависимость доза-ответ для ми-РНК AD-53558 в подавлении мРНК ALAS1 у крыс относительно PBS-контроля. Также показаны результаты для контроля с люциферазой (LUC) AD-1955.

На фиг. 7 показана продолжительность подавления мРНК ALAS1 мыши (mALAS1) под действием ми-РНК AD-53558 относительно PBS-контроля.

На фиг. 8 показаны средние значения ± стандартные отклонения уровня ALA в плазме (в мкМ) исходного уровня и после обработки фенобарбиталом в экспериментальной (ми-РНК ALAS1) и контрольной (ми-РНК LUC) группах.

На фиг. 9 показаны уровни ALA в плазме (в мкМ) отдельных животных исходного уровня и после обработки фенобарбиталом у животных, которые получали обработку ми-РНК ALAS1 и контрольную обработку (ми-РНК LUC).

На фиг. 10 показаны средние значения ± стандартные отклонения уровней PBG в плазме (в мкМ) исходного уровня и после обработки фенобарбиталом у животных, которые получали обработку ми-РНК ALAS1 и контрольную обработку (ми-РНК LUC).

На фиг. 11 показаны уровни PBG в плазме (в мкМ) отдельных животных исходного уровня и после обработки фенобарбиталом у животных, которые получали обработку ми-РНК ALAS1 и контрольную обработку (ми-РНК LUC).

На фиг. 12 показан относительный уровень мРНК mALAS1 в печени на исходном уровне и после обработки фенобарбиталом у выбранных соответствующих экспериментальных (ми-РНК ALAS1) и контрольных (PBS) животных.

На фиг. 13 показано влияние трех GalNAc-конъюгированных ми-РНК mALAS1 на экспрессию mALAS1 (относительно PBS-контроля) в ткани печени мышей.

На фиг. 14 показаны уровни ALA и PBG в плазме с течением времени после введения фенобарбитала и обработки ми-РНК ALAS1 или контрольной ми-РНК LUC.

На фиг. 15 показано влияние GalNAc-конъюгированной ми-РНК ALAS1 на уровни ALA в плазме и уровни PBG в плазме в мышиной модели индуцированной фенобарбиталом AIP.

Подробное описание изобретения

и-РНК нацелена на специфичный для последовательности распад мРНК в результате процесса, известного как РНК-интерференция (РНК-и). В настоящей публикации описаны и-РНК и способы их применения для ингибирования экспрессии гена ALAS1 в клетке или в организме млекопитающего, при этом мишенью и-РНК является ген ALAS1. Также предлагаются композиции и способы лечения расстройств, связанных с экспрессией ALAS1, таких как порфирии (например, порфирия вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP или ночная порфирия), острая интермиттирующая порфирия, врожденная эритропоэтическая порфирия, поздняя кожная порфирия, наследственная копропорфирия (копропорфирия), смешанная порфирия, эритропоэтическая протопорфирия (EPP), X-сцепленная сидеробластная анемия (XLSA) и временная эритропорфирия новорожденных).

Порфирии являются врожденными или приобретенными расстройствами, которые могут быть вызваны сниженной или усиленной активностью конкретных ферментов в пути биосинтеза гема, также называемым в настоящем описании путем порфирина (См. фиг. 1). Порфирины являются основными предшественниками гема. Порфирины и предшественники порфиринов включают δ-аминолевулиновую кислоту (ALA), порфопилиноген (PBG), гидроксиметилбилан (HMB), уропорфириноген I или III, копропорфириноген I или III, протопорфириноген IX и протопорфирин IX. Гем является важной частью гемоглобина, миоглобина, каталаз, пероксидаз и цитохромов, при этом последние включают цитохромы дыхательной цепи и цитохромы P450 печени. Гем синтезируется в большинстве или во всех клетках человека. Примерно 85% гема образуется в эритроидных клетках, главным образом, для гемоглобина. Большая часть остального гема образуется в печени, 80% которого используется для синтеза цитохромов. Недостаточность специфичных ферментов в порфириновом пути приводит к недостаточной продукции гема, а также к накоплению предшественников порфиринов и/или порфиринов, которые в высоких концентрациях могут быть токсичными для функционирования клетки или органа.

Порфирии могут проявляться неврологическими осложнениями («острыми»), проблемами с кожей («кожными») или и тем и другим. Порфирии можно классифицировать по первичному месту сверхпродукции и накопления порфиринов или их предшественников. В случае печеночных порфирий порфирины и предшественники порфиринов преимущественно сверхпродуцируются в печени, тогда как в случае эритропоэтических порфирий порфирины сверхпродуцируются в эритроидных клетках в костях. Острые или печеночные порфирии приводят к нарушению функции нервной системы и неврологическим проявлениям, которые могут влиять как на центральную, так и на периферическую нервную систему, приводя к таким симптомам как, например, боль (например, боль в области живота и/или хроническая нейропатическая боль), рвоте, нейропатии (например, острой нейропатии, прогрессирующей нейропатии), мышечной слабости, судорогам, психическим нарушениям (например, галлюцинациям, депрессии и тревоге, паранойе), аритмиям сердца, тахикардии, запору и диарее. Кожные или эритропоэтические порфирии, главным образом, поражают кожу, вызывая такие симптомы, как повышенная чувствительность к свету, которая может быть болезненной, буллезным поражениям, некрозу, зуду, опуханию и усиленному росту волос в таких областях, как лоб. Последующая инфекция поражений кожи может приводить к потере костной и тканевой массы, а также рубцеванию, обезображиванию и утрате пальцев (например, пальцев рук и ног). Большинство порфирий вызваны мутациями, которые кодируют ферменты пути биосинтеза гема. Краткое описание порфирий, ассоциированных с генетическими ошибками метаболизма гема, представлено на фиг. 2.

Не все порфирии являются генетическими расстройствами. Например, у пациентов с заболеванием печени может развиваться порфирия в результате нарушения функции печени, и временная форма эритропорфирии (временная эритропорфирия новорожденных) была описана у новорожденных (См. публикацию Crawford, R.I. с соавторами, J. Am. Acad. Dermatol. 1995 Aug; 33(2 Pt 2): 333-6). Пациенты с PCT могут приобретать недостаточность активности уропорфириногендекарбоксилазы (URO-D), вследствие образования фермента ORO-D с более низкой по сравнению с нормальной ферментативной активностью (См. публикацию Phillips с соавторами Blood, 98: 3179-3185, 2001).

Острая интермиттирующая порфирия (AIP) (также называемая недостаточностью порфобилиноген (PBG)-дезаминазы или недостаточностью гидроксиметилбилансинтазы (HMBS)) является наиболее распространенным типом острой печеночной порфирии. Другие типы острых печеночных порфирий включают наследственную копропорфирию (HCP), смешанную порфирия (VP) и порфирию вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP). Острые печеночные порфирии описаны, например, в публикации Balwani M. and Desnick R.J., Blood, 120: 4496-4504, 2012.

AIP обычно является аутосомным доминантным заболеванием, которое характеризуется недостаточностью фермента порфобилиногендезаминазы (PBG-дезаминазы); указанный фермент также известен как гидроксиметилбилансинтаза (HMB-синтаза или HMBS). PBG-дезаминаза является третьим ферментом в пути биосинтеза гема (См. фиг. 1) и катализирует конденсацию «голова к хвосту» четырех молекул порфобилиногена в линейный тетрапиррол, гидроксиметилбилан (HMB). Были описаны альтернативно сплайсируемые варианты транскриптов, кодирующих разные изоформы PBG-дезаминазы. Мутации в гене PBG-дезаминазы ассоциированы с AIP. Такие мутации могут приводить к пониженным количествам PBG-дезаминазы и/или пониженной активности PBG-дезаминазы (у пораженных индивидуумов обычно имеет место ~50% снижение активности PBG-дезаминазы).

Существует, по меньшей мере, две разных модели патофизиологии AIP и других острых печеночных порфирий (См., например, Lin CS-Y с соавторами, Clinical Neurophysiology, 2011; 122:2336-44). Согласно одной модели пониженная продукция гема, возникающая, вследствие недостаточности PBG-дезаминазы, приводит к дефициту энергии и дегенерации аксонов. Согласно другой, более предпочтительной в настоящее время модели, накопление предшественников порфиринов (например, ALA и PBG) приводит к нейротоксичности.

Было обнаружено, что AIP распространена в некоторых популяциях с частотой 1 на 10000 (например, в Северной Швеции; См. Floderus Y. С соавторами, Clin Genet. 2002; 62: 288-97). Распространенность в общей популяции в Соединенных Штатах и Европе, за исключением Великобритании, оценивается примерно от 1 на 10000 до 1 на 20000. Клиническое заболевание проявляется само по себе только примерно у 10-15% индивидуумов, которые несут мутации, которые, как известно, ассоциированы с AIP. Однако пенетрантность у индивидуумов с некоторыми мутациями достигает 40% (например, в случае мутации W198X). AIP обычно не проявляется до пубертатного периода. Симптомы более распространены у женщин, чем у мужчин. Распространенность заболевания вероятно недооценена из-за неполной пенетрантности и длительных латентных периодов. В Соединенных Штатах, судя по оценкам, живет примерно 2000 пациентов, которые страдали, по меньшей мере, от одного приступа. Судя по оценкам, имеется примерно 150 активных повторных случаев во Франции, Великобритании и Польше; такими пациентами преимущественно являются молодые женщины среднего возраста 30 лет. См., например, публикацию Elder с соавторами, J. Inherit. Metab. Dis., опубликованную он-лайн 1 ноября, 2012.

AIP поражает, например, висцеральную, периферическую, автономную и центральную нервные системы. Симптомы AIP изменчивы и включают симптомы желудочно-кишечного тракта (например, тяжелую и плохо локализованную боль в области живота, тошноту/рвоту, запор, диарею, непроходимость кишечника), симптомы мочевой системы (дизурию, задержку мочеиспускания/недержание мочи или темную мочу), неврологические симптомы (например, сенсорную нейропатию, моторную нейропатию (например, поражение черепно-мозговых нервов и/или симптомы, приводящие к слабости рук и ног), судороги, нейропатическую боль (например, боль, ассоциированную с прогрессирующей нейропатией, например, хроническую нейропатическую боль), нейропсихиатрические симптомы (например, спутанность сознания, тревожность, возбуждение, галлюцинации, истерию, бред, апатию, депрессию, фобии, психоз, бессонницу, сонливость, кому), вовлечение автономной нервной системы (приводящее, например, к сердечно-сосудистым симптомам, таким как тахикардия, гипертония и/или аритмии, а также другие симптомы, такие как, например, повышенные уровни циркулирующего катехоламина, потливость, возбужденное состояние и/или тремор), обезвоживание и электролитные аномалии. Наиболее распространенными симптомами являются боль в области живота и тахикардия. Кроме того, пациенты часто имеют хроническую нейропатическую боль, и у них развивается прогрессирующая нейропатия. Пациенты с повторными приступами, часто имеют предвестники заболевания. Может возникать длительный паралич после тяжелого приступа. Восстановление после тяжелых приступов, которые своевременно не лечили, может занимать недели или месяцы. Острый приступ может быть смертельным, например, вследствие паралича дыхательных мышц или сердечно-сосудистой недостаточности из-за дисбаланса электролитов (См., например, Thunell S. Hydroxymethylbilane Synthase Deficiency. 2005 Sep. 27 [новая версия 11 сентября 2011]. В: Pagon RA, Bird TD, Dolan CR, et al., editors. GeneReviews(TM) [интернет]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993 (далее Thunell (1993)), которые включены в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме). До появления возможности лечения гемином до 20% пациентов с AIP умирали от заболевания.

У индивидуумов, которые несут гены для AIP, повышен риск возникновения гепатоклеточных видов рака. У пациентов с повторяющимися приступами риск гепатоклеточного рака особенно велик: после 50 лет риск примерно в 100 раз выше, чем в общей популяции.

Приступы острой порфирии могут быть спровоцированы эндогенными или экзогенными факторами. Механизмы, посредством которых такие факторы индуцируют приступы, могут включать например, повышенную потребность в печеночных ферментах P450 и/или индукцию активности ALAS1 в печени. Повышенная потребность в печеночных ферментах P450 приводит к уменьшению свободного гема в печени и, тем самым, к индукции синтеза печеночной ALAS1.

Провоцирующие факторы включают голодание (или другие формы пониженной или неполноценной калорийности потребляемой пищи, вследствие жестких диет, занятий бегом на длинные дистанции и т.д.), метаболические стрессы (например, инфекции, хирургическую операцию, международные авиационные перелеты и психологический стресс), эндогенные гормоны (например, прогестерон), курение сигарет, растворимые в липидах чужеродные химические вещества (включая, например, химические вещества, присутствующие в табачном дыму, некоторые лекарственные средства, отпускаемые по рецепту, органические растворители, биоциды, компоненты алкогольных напитков), эндокринные факторы (например, половые гормоны (женщины могут испытывать обострения во время предменструального периода), синтетические эстрогены, прогестероны, стимуляторы овуляции и гормонозаместительную терапию). См., например, Thunell (1993).

Более 1000 лекарственных средства противопоказано при острых печеночных порфириях (например, AIP, HCP, ADP и VP), включая, например, спирт, барбитураты, карбамазепин, карисопродол, клоназепам (высокие дозы), даназол, диклофенак и возможно другие НПВС, алкалоиды спорыньи, эстрогены, этхлорвинол, глутетимид, гризеофульвин, мефенитоин, мепробамат (также мебутамат и тибутамат), метиприлон, методопрамид, фенитоин, примидон, прогестерон и синтетические прогестины, пиразинамид, пиразолоны (аминопурин и антипирин), рифампин, сукцинимиды (этосуксимид и метсуксимид), сульфонамидные антибиотики и вальпроевую кислоту.

Объективные симптомы AIP включают изменение окраски мочи во время острого приступа (моча может казаться красной или красно-коричневой) и повышенные концентрации PBG и ALA в моче во время острого приступа. Молекулярно-генетическое тестирование выявляет мутации в гене PBG-дезаминазы (также известной как HMBS) у более чем 98% пораженных заболеванием людей. Thunell (1993).

Дифференциальная диагностика порфирий может включать в себя определение типа порфирии путем измерения индивидуальных уровней порфиринов или предшественников порфиринов (например, ALA, PBG) в моче, кале и/или плазме (например, с использованием хроматографии и флуорометрии) во время приступа. Диагноз AIP может быть подтвержден, благодаря установлению того, что активность PBG-дезаминазы эритроцитов составляет 50% или меньше от нормального уровня. ДНК-тестирование в отношении мутаций может быть осуществлено у пациентов и подверженных риску членов семьи. Диагноз AIP обычно подтверждают, используя тестирование ДНК, чтобы идентифицировать специфичную вызывающую заболевание генную мутацию (например, мутацию HMBS).

Лечение острых приступов обычно требует госпитализации, чтобы контролировать и лечить острые симптомы, включая, например, боль в области живота, судороги, обезвоживание/гипонатриемию, тошноту/рвоту, тахикардию/гипертонию, задержку мочеиспускания/непроходимость кишечника. Например, боль в области живота можно лечить, например, наркотическими анальгетиками, судороги можно лечить, принимая превентивные меры против судорог и возможно лекарственные средства (хотя многие противосудорожные лекарственные средства противопоказаны), тошноту/рвоту можно лечить, например, фенотиазинами, и тахикардию/гипертонию можно лечить, например, бета-блокаторами. Лечение может включать в себя отмену опасных лекарственных средств, мониторинг дыхательной функции, а также мышечной силы и неврологического статуса. Слабые приступы (например, приступы без пареза или гипонатриемии) можно лечить, используя, по меньшей мере, 300 г внутривенной 10% глюкозы в сутки, хотя в последнее время все чаще немедленно дают гемин. Тяжелые приступы следует лечить как можно скорее, используя внутривенный гемин (3-4 мг/кг сутки в течение 4-14 дней) и внутривенную глюкозу, пока ожидают эффекта от внутривенного введения гемина. Обычно приступы лечат, используя внутривенный гемин в течение 4 дней и внутривенную глюкозу в период ожидания эффекта от введения внутривенного гемина.

Гемин (пангематин® или гемин для инъекций, ранее известный как гематин) является единственным продуктом гема, разрешенным к применению в Соединенных Штатах, и был первым лекарственным средством, разрешенным законом о лекарственных средствах для лечения редких заболеваний. Пангематин® представляет собой гемин, полученный из обработанных эритроцитов (PRBC), и является протопорфирином IX, содержащим ион трехвалентного железа (гем B) с хлоридным лигандом. Гем действует, ограничивая синтез порфирина в печени и/или костном мозге. Точный механизм, посредством которого гемин вызывает симптоматическое улучшение у пациентов с острыми эпизодами печеночных порфирий, не установлен; однако его действие вероятно является следствием (обратного) ингибирования синтазы δ-аминолевулиновой кислоты (ALA), фермента, который ограничивает скорость пути биосинтеза порфирина/гема. См. этикетку к продукту пангемину®, Lundbeck, Inc., October 2010. Ингибирование ALA-синтазы должно приводить к пониженной продукции ALA и PBG, а также порфиринов и промежуточных продуктов синтеза порфиринов.

Недостатки гемина включают его замедленное влияние на клинические симптомы и его неспособность предотвращать рецидивы приступов. Неблагоприятные реакции, ассоциированные с введением гемина, могут включать тромбофлебит, антикоагулирующее действие, тромбоцитопению, остановку работы почек или перенасыщение железом, которое особенно вероятно у пациентов, которым требуются многократные курсы лечения гемином в связи с повторными приступами. Чтобы предотвратить флебит, необходим постоянный венозный катетер для доступа у пациентов с повторяющимися приступами. Необычные побочные эффекты включают лихорадку, болевые ощущения, недомогание, гемолиз, анафилаксию и циркуляционный коллапс. См. Anderson, K.E., Approaches to Treatment and Prevention of Human Porphyrias, in The Porphyrin Handbook: Medical Aspects of Porphyrins, Edited by Karl M. Kadish, Kevin M. Smith, Roger Guilard (2003)(далее Anderson).

Гем трудно получить в стабильной форме для внутривенного введения. Он нерастворим при нейтральном значении pH, но может быть получен в виде гидроксида гема при pH 8 или выше (Anderson). Пангематин представляет собой лиофилизированный препарат гемина. Когда лиофилизированный гемин растворяют для внутривенного введения, быстро образуются продукты распада; такие продукты распада ответственны за временное антикоагулянтное действие и флебит в месте инфузии (Anderson). Гемальбумин и аргинат гема (нормосанг, европейский вариант гемина) являются более стабильными и потенциально могут в меньшей степени вызывать тромбофлебит. Однако аргинат гема не разрешен для применения в Соединенных Штатах. Пангемин может быть стабилизирован при его солюбилизации для инфузии в 30% альбумине человека, а не в стерильной воде; однако, альбумин усиливает эффекты увеличения внутрисосудистого объема и повышает стоимость лечения, а также риск попадания патогенов, так как его выделяют из крови человека. См., например, публикацию Anderson.

Успешное лечение острого приступа не предотвращает или не задерживает появления рецидива. Возникает вопрос, может ли сам гемин запускать повторяющиеся приступы, вследствие индукции гемоксигеназы. При этом в некоторых регионах (особенно во Франции) молодых женщин с многократными повторяющимися приступами лечат еженедельным введением гемина в профилактических целях.

Ограниченный опыт по трансплантации печени свидетельствует о том, что в случае успеха это приводит к эффективному лечению AIP. Проведено примерно 12 трансплантаций пациентам в Европе с излечением или различными эффектами. Трансплантация печения может восстанавливать нормальную экскрецию ALA и PBG и предотвращать острые приступы. См., например, публикацию Dar F.S. с соавторами (Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int., 9(1): 93-96 (2010)). Кроме того, если печень пациента с AIP трансплантировать другому пациенту («трансплантация по принципу домино»), у пациента, получающего трансплантат, может развиваться AIP.

Среди длительных клинических эффектов острых порфирий имеет место хроническая нейропатическая боль, которая может возникать в результате прогрессирующей нейропатии, вследствие нейротоксических эффектов, например, повышенных уровней предшественников порфиринов (например, ALA и/или PBG). Пациенты могут страдать от нейропатической боли до или во время острого приступа. Пациенты пожилого возраста с возрастом могут испытывать усиленную нейропатическую боль, по поводу которой обычно назначают различные наркотические лекарственные средства. Нарушения на электромиограммах и уменьшенное время проведения возбуждения было документально подтверждено у пациентов с острыми печеночными порфириями. Следует отметить, что у необработанных, не подвергаемых индукции мышей с AIP (недостаточность PBG-дезаминазы) развивается прогрессирующая моторная нейропатия, которая, как было показано, вызывает прогрессирующую дегенерацию и утрату аксонов четырехглавой мышцы и, предположительно, вследствие конститутивно повышенных уровней предшественников порфирина (ALA и PBG), недостаточности порфиринов и/или гема (Lindberg с соавторами, J. Clin. Invest., 103(8): 1127-1134, 1999). У пациентов с острой порфирией (например, ADP, AIP, HCP или VP) уровни предшественников порфиринов (ALA и PBG) часто повышены у пациентов, не имеющих симптомов, и у пациентов с симптомами между приступами. Таким образом, предполагается, что снижение уровней предшественников порфиринов и восстановление нормального процесса биосинтеза гема за счет снижения уровня экспрессии и/или активности ALAS1, предотвращает и/или минимизирует развитие хронической и прогрессирующей нейропатии. Лечение, например, хроническое лечение (например, периодическое лечение с использованием и-РНК, которая описана в настоящей публикации, например, лечение в соответствии со схемой дозирования, которая описана в настоящей публикации, например, лечение еженедельно или раз в две недели) может непрерывно снижать экспрессию ALAS1 у пациентов с острой порфирией, которые имеют повышенные уровни предшественников порфиринов, порфиринов, продуктов порфиринов или их метаболитов. Такое лечение может быть осуществлено при необходимости, чтобы предотвратить или уменьшить частоту или тяжесть симптомов у отдельных пациентов (например, боль и/или нейропатию) и/или снизить уровень предшественника порфирина, порфирина, продукта или метаболита порфирина.

Существует необходимость в идентификации новых терапевтических средств, которые можно применять для лечения порфирий. Как обсуждалось выше, существующие средства лечения, такие гемин, имеют многочисленные недостатки. Например, влияние гемина на клинические симптомы замедлено, он дорого стоит, и он может иметь побочные эффекты (например, тромбофлебит, антикоагулирующее действие, тромбоцитопению, перенасыщение железом, остановку работы почек). Новые терапевтические средства, такие как средства, описанные в настоящей публикации, могут устранить такие недостатки и обеспечить неудовлетворенную потребность пациентов, например, действуя быстрее, не индуцируя флебит, обеспечивая возможность подкожного введения, успешно предотвращая повторные приступы, предотвращая или ослабляя боль (например, хроническую нейропатическую боль) и/или прогрессирующую нейропатию, и/или не вызывая некоторых неблагоприятных эффектов, ассоциированных с гемином (например, перенасыщение железом, повышенный риск возникновения гепатоклеточного рака).

Настоящее изобретение относится к способам и композициям и-РНК для модулирования экспрессии гена ALAS1. В некоторых вариантах экспрессию ALAS1 снижают или ингибируют, используя ALAS1-специфичную и-РНК, что приводит к пониженной экспрессии гена ALAS1. Пониженная экспрессия гена ALAS1 может снижать уровень одного или нескольких предшественников порфиринов, порфиринов или продуктов или метаболитов порфиринов. Пониженная экспрессия гена ALAS1, а также связанные снижения уровня одного или нескольких предшественников порфиринов и/или порфиринов могут быть полезны при лечении расстройств, связанных с экспрессией ALAS1, например, порфирий.

и-РНК в композициях, охарактеризованных в настоящем описании, включают РНК-нить (антисмысловую нить), имеющую область, которая имеет длину 30 нуклеотидов или меньше, т.е., длиной 15-30 нуклеотидов, обычно длиной 19-24 нуклеотида, и такая область в значительной степени комплементарна, по меньшей мере, части транскрипта мРНК гена ALAS1 (также называемую в настоящем описании «ALAS1-специфичной и-РНК»). Применение такой и-РНК делает возможным целенаправленный распад мРНК генов, которые вовлечены в патологии, ассоциированные с экспрессией ALAS1 у млекопитающих, например, порфирии, такие как порфирия с недостаточностью ALA-дегидрогеназы (ночная порфирия) или острая интермиттирующая порфирия. Очень низкие дозы ALAS1-специфичных и-РНК могут специфично и эффективно опосредовать РНК-и, приводящую к значительному ингибированию экспрессии гена ALAS1. и-РНК, мишенью которой является ALAS1, может специфично и эффективно опосредовать РНК-и, приводящую к значительному ингибированию экспрессии гена ALAS1, например, в основанных на клетках анализах. Таким образом, способы и композиции, содержащие такие и-РНК, применимы для лечения патологических процессов, связанных с экспрессией ALAS1, таких как порфирии (например, X-сцепленная сидеробластная анемия (XLSA), порфирия вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ночная порфирия), острая интермиттирующая порфирия (AIP), врожденная эритропоэтическая порфирия, поздняя кожная порфирия, наследственная копропорфирия (копропорфирия), смешанная порфирия, эритропоэтическая протопорфирия (EPP) и временная эритропорфирия новорожденных).

В следующем далее описании раскрыто, как получать и применять композиции, содержащие и-РНК, чтобы ингибировать экспрессию гена ALAS1, а также композиции и способы лечения заболеваний и расстройств, вызванных или модулированных экспрессией такого гена. Варианты фармацевтических композиций, охарактеризованных в изобретении, включают и-РНК, имеющую антисмысловую нить, содержащую область, которая имеет длину 30 нуклеотидов или меньше, обычно длиной 19-24 нуклеотида, и такая область в значительной степени комплементарна, по меньшей мере, части транскрипта мРНК гена ALAS1, наряду с фармацевтически приемлемым носителем. Варианты композиций, охарактеризованных в изобретении, также включают в себя и-РНК, имеющую антисмысловую нить, содержащую область комплементарности, которая имеет длину 30 нуклеотидов или меньше, обычно длиной 19-24 нуклеотида, и в значительной степени комплементарна, по меньшей мере, части транскрипта РНК гена ALAS1.

Соответственно, в некоторых аспектах в изобретении охарактеризованы фармацевтические композиции, содержащие и-РНК ALAS1 и фармацевтически приемлемый носитель, способы применения композиций для ингибирования экспрессии гена ALAS1 и способы применения фармацевтических композиций для лечения расстройств, связанных с экспрессией ALAS1.

I. Определения

Для удобства ниже приведены значения некоторых терминов и фраз, используемых в описании, примерах и прилагаемой формуле изобретения. Если есть явное расхождение между использованием термина в других частях настоящего описания и его определением, приведенным в настоящем разделе, определение в данном разделе имеет преимущественную силу.

Каждый из «G», «C», «A», «T» и «U» означает нуклеотид, который содержит гуанин, цитозин, аденин, тимидин и урацил в качестве основания, соответственно. Однако, будет понятно, что термин «рибонуклеотид» или «нуклеотид» также может относиться к модифицированному нуклеотиду, который подробно описан ниже, или к заменяющему остатку. Специалисту хорошо известно, что гуанин, цитозин, аденин и урацил могут быть заменены другими остатками без существенного изменения, относящихся к спариванию оснований свойств олигонуклеотида, содержащего нуклеотид, несущий такой заменяющий остаток. Например, и без ограничения нуклеотид, содержащий инозин в качестве основания, может образовывать пары оснований с нуклеотидами, содержащими аденин, цитозин или урацил. Следовательно, нуклеотиды, содержащие урацил, гуанин или аденин, могут быть заменены в нуклеотидных последовательностях днРНК, охарактеризованной в изобретении, нуклеотидом, содержащим, например, инозин. В другом примере, аденин и цитозин в любом месте олигонуклеотида могут быть заменены гуанином и урацилом, соответственно, с образованием неоднозначных пар оснований G-U с мРНК-мишенью. Последовательности, содержащие такие заменяющие остатки, являются подходящими для композиций и способов, охарактеризованных в изобретении.

В используемом в настоящем описании смысле «ALAS1» (также известный как ALAS-1; δ-аминолевулинатсинтаза 1; δ-ALA-синтаза 1; синтаза 1 5'-аминолевулиновой кислоты 1; ALAS-H; ALASH; ALAS-N; ALAS3; EC2.3.1.37; 5-аминолевулинатсинтаза, неспецифичная митохондриальная; ALAS; MIG4; OTTHUMP00000212619; OTTHUMP00000212620; OTTHUMP00000212621; OTTHUMP00000212622; индуцирующий миграцию белок 4; EC 2.3.1) относится к кодируемому в ядре митохондриальному ферменту, который является первым и обычно ограничивающим скорость ферментом в пути биосинтеза гема млекопитающих. ALAS1 катализирует конденсацию глицина с сукцинил-CoA с образованием δ-аминолевулиновой кислоты (ALA). Ген ALAS1 человека экспрессируется повсеместно, находится в хромосоме 3p21.1 и обычно кодирует последовательность из 640 аминокислот. Напротив, ген ALAS-2, который кодирует изозим, экспрессируется только в эритроцитах, находится в хромосоме Xp11.21 и обычно кодирует последовательность длиной 550 аминокислот. В используемом в настоящем описании смысле «белок ALAS1» означает любой вариант белка ALAS1 из любого вида (например, человека, мыши, примата, отличного от человека), а также любые его мутанты и фрагменты, которые сохраняют активность ALAS1. Подобным образом «транскрипт ALAS» относится к любому варианту транскрипта ALAS1 из любого вида (например, человека, мыши, примата, отличного от человека). Последовательность транскрипта мРНК варианта 1 ALAS1 человека можно найти под номером NM_000688.4 (фиг. 3; SEQ ID NO: 1). Другой вариант, транскрипт мРНК варианта 2 ALAS1 человека можно найти под номером NM_000688.5 (фиг. 4; SEQ ID NO: 382). Уровень зрелого кодируемого ALAS1 белка регулируется гемом: высокие уровни гема понижающим образом регулируют зрелый фермент в митохондриях, тогда как низкие уровни гема приводят к повышающей регуляции. Идентифицированы множественные альтернативно сплайсируемые варианты, кодирующие один и тот же белок.

В используемом в настоящем описании смысле термин «и-РНК», «РНК-и», «и-РНК-средство» или «РНК-и-средство» относится к средству, которое содержит РНК в соответствии с термином, который определен в настоящем описании, и которое опосредует целенаправленное расщепление РНК-транскрипта, например, посредством путем РНК-индуцируемого комплекса сайленсинга (RISC). В одном варианте и-РНК, которая описана в настоящей публикации, осуществляет ингибирование экспрессии ALAS1. Ингибирование экспрессии ALAS1 можно оценить на основе снижения уровня мРНК ALAS1 или снижения уровня белка ALAS1. В используемом в настоящем описании смысле «последовательность-мишень» относится к непрерывной части нуклеотидной последовательности молекулы мРНК, образованной в ходе транскрипции гена ALAS1, включая мРНК, которая является продуктом РНК-процессинга первичного продукта транскрипции. Часть-мишень последовательности будет, по меньшей мере, такой длины, которая достаточна для того, чтобы она служила субстратом для и-РНК-направленного расщепления в такой части или вблизи такой части. Например, последовательность-мишень в общем может быть длиной 9-36 нуклеотидов, например, длиной 15-30 нуклеотидов, включая все поддиапазоны между указанными значениями. В качестве не ограничивающих примеров последовательность-мишень может быть длиной 15-30 нуклеотидов, 15-26 нуклеотидов, 15-23 нуклеотида, 15-22 нуклеотида, 15-21 нуклеотид, 15-20 нуклеотидов, 15-19 нуклеотидов, 15-18 нуклеотидов, 15-17 нуклеотидов, 18-30 нуклеотидов, 18-26 нуклеотидов, 18-23 нуклеотида, 18-22 нуклеотида, 18-21 нуклеотид, 18-20 нуклеотидов, 19-30 нуклеотидов, 19-26 нуклеотидов, 19-23 нуклеотида, 19-22 нуклеотида, 19-21 нуклеотид, 19-20 нуклеотидов, 20-30 нуклеотидов, 20-26 нуклеотидов, 20-25 нуклеотидов, 20-24 нуклеотида, 20-23 нуклеотида, 20-22 нуклеотида, 20-21 нуклеотид, 21-30 нуклеотидов, 21-26 нуклеотидов, 21-25 нуклеотидов, 21-24 нуклеотида, 21-23 нуклеотида или 21-22 нуклеотида.

В используемом в настоящем описании смысле термин «нить, содержащая последовательность» относится к олигонуклеотиду, содержащему цепь нуклеотидов, которая описана последовательностью, обозначаемой с использованием стандартной номенклатуры нуклеотидов.

В используемом в настоящем описании смысле, и если не указано иное, термин «комплементарная» при использовании для описании первой нуклеотидной последовательности в сравнении со второй нуклеотидной последовательностью относится к способности олигонуклеотида или полинуклеотида, содержащего первую нуклеотидную последовательность, гибридизоваться и образовывать структуру дуплекса в некоторых условиях с олигонуклеотидом или полинуклеотидом, содержащим вторую нуклеотидную последовательность, что будет понятно специалисту. Такие условия могут представлять собой, например, жесткие условия, при этом жесткие условия могут включать: 400 мМ NaCl, 40 мМ PIPES pH 6,4, 1 мМ EDTA, 50°C или 70°C в течение 12-16 часов с последующей промывкой. Могут быть применимы другие условия, такие как физиологически подходящие условия, которые могут иметь место в нутрии организма. Специалист сможет определить набор условий, наиболее подходящих для проверки комплементарности двух последовательностей в соответствии с конечным применением гибридизуемых нуклеотидов.

Комплементарные последовательности в и-РНК, например, в днРНК, которая описана в настоящей публикации, включают спаривание оснований олигонуклеотида или полинуклеотида, содержащего первую нуклеотидную последовательность, с олигонуклеотидом или полинуклеотидом, содержащим вторую нуклеотидную последовательность, по всей длине одной или обеих нуклеотидных последовательностей. Такие последовательности могут быть названы в настоящем описании «полностью комплементарными» друг другу. Однако когда первую последовательность называют в настоящем описании «в значительной степени комплементарной» второй последовательности, две последовательности могут быть полностью комплементарными или они могут образовывать одну или несколько, но обычно не более 5, 4, 3 или 2 несовпадающих пар оснований при гибридизации в случае дуплекса длиной до 30 пар оснований, хотя при этом сохраняют способность гибридизоваться в условиях, наиболее подходящих для конечного применения, например, ингибирования экспрессии генов посредством пути RISC. Однако, когда два олигонуклеотида сконструированы для образования при гибридизации одного или нескольких однонитевых выступающих концов, такие выступающие концы не следует считать несовпадениями оснований при определении комплементарности. Например, днРНК, содержащая один олигонуклеотид длиной 21 нуклеотид и другой олигонуклеотид длиной 23 нуклеотида, в которой более длинный олигонуклеотид содержит последовательность из 21 нуклеотида, которые полностью комплементарны более короткому олигонуклеотиду, все еще можно называть «полностью комплементарной в целях, описанных в настоящей публикации.

«Комплементарные» последовательности в используемом в настоящем описании смысле также могут включать в себя или могут быть полностью образованы парами оснований, не соответствующими модели Уотосона-Крика, и/или парами оснований, образованными из неприродных и модифицированных нуклеотидов, в такой мере, чтобы были удовлетворены указанные выше требования в отношении их способности к гибридизации. Такие не соответствующие модели Уотсона-Крика пары оснований включают без ограничения неоднозначное спаривание оснований G:U или Хустиновские пары оснований.

Термины «комплементарные», «полностью комплементарные» и «в значительной степени комплементарные» в настоящем описании могут быть использованы по отношению к спариванию основания между смысловой нитью и антисмысловой нитью днРНК или между антисмысловой нитью и-РНК-средства и последовательностью-мишенью, что будет понятно в контексте их применения.

В используемом в настоящем описании смысле полинуклеотид, который «в значительной степени комплементарен», по меньшей мере, части матричной РНК (мРНК), относится к полинуклеотиду, который в значительной степени комплементарен непрерывной части, представляющей интерес мРНК (например, мРНК, кодирующей белок ALAS1). Например, полинуклеотид комплементарен, по меньшей мере, части мРНК ALAS1, если последовательность в значительной степени комплементарная непрерывной части мРНК, кодирующей ALAS1. В качестве другого примера полинуклеотид комплементарен, по меньшей мере, части мРНК ALAS1, если последовательность в значительной степени комплементарна непрерывной части мРНК, кодирующей ALAS1.

Термин «двунитевая РНК» или «днРНК» в используемом в настоящем описании смысле относится к и-РНК, которая включает молекулу РНК или комплекс молекул, имеющих гибридизуемую область дуплекса, которая содержит две антипараллельных и в значительной степени комплементарных нитей нуклеиновой кислоты, которые могут быть обозначены, как имеющие «смысловую» и «антисмысловую» ориентации по отношению к РНК-мишени. Область дуплекса может быть любой длины, которая обеспечивает возможность специфичного распада требуемой РНК-мишени, например, посредством пути RISC, но обычно будет иметь длину в диапазоне от 9 до 36 пар оснований, например, длину 15-30 пар оснований. При рассмотрении дуплекса длиной от 9 до 36 пар оснований дуплекс может быть любой длины в данном диапазоне, например, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 или 36, и любом поддиапазоне в данном диапазоне, включая без ограничения 15-30 пар оснований, 15-26 пар оснований, 15-23 пары оснований, 15-22 пары оснований, 15-21 пару оснований, 15-20 пар оснований, 15-19 пар оснований, 15-18 пар оснований, 15-17 пар оснований, 18-30 пар оснований, 18-26 пар оснований, 18-23 пары оснований, 18-22 пары оснований, 18-21 пару оснований, 18-20 пар оснований, 19-30 пар оснований, 19-26 пар оснований, 19-23 пары оснований, 19-22 пары оснований, 19-21 пару оснований, 19-20 пар оснований, 20-30 пар оснований, 20-26 пар оснований, 20-25 пар оснований, 20-24 пары оснований, 20-23 пары оснований, 20-22 пары оснований, 20-21 пару оснований, 21-30 пар оснований, 21-26 пар оснований, 21-25 пар оснований, 21-24 пары оснований, 21-23 пары оснований или 21-22 пары оснований. днРНК, образованные в клетке в результате процессинга с участием дайсер-фермента и сходных ферментов обычно имеют длину в диапазоне 19-22 пары оснований. Одна нить области дуплекса днДНК содержит последовательность, которая в значительной степени комплементарна области РНК-мишени. Две нити, образующие структуру дуплекса, могут быть из одной молекулы РНК, имеющей, по меньшей мере, одну самокомплементарную область, или могут быть образованы из двух или более отдельных молекул РНК. В том случае, когда область дуплекса образована из двух нитей одной молекулы, молекула может иметь область дуплекса, разделенную однонитевой цепью нуклеотидов (называемой в настоящем описании «петлей типа шпильки»), находящейся между 3'-концом одной нити и 5'-концом соответствующей другой нити, образующих структуру дуплекса. Петля типа шпильки может содержать, по меньшей мере, одни неспаренный нуклеотид; в некоторых вариантах петля типа шпильки может содержать, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 23 или больше неспаренных нуклеотидов. В том случае, когда две в значительной степени комплементарные нити днРНК состоят из отдельных молекул РНК, такие молекулы не обязательно, но могут быть ковалентно связаны. В том случае, когда две нити ковалентно связаны другим образом, отличным от петли типа шпильки, соединяющую структуру называют «линкером». Термин «ми-РНК» также используют в настоящем описании по отношению к днРНК, которая описана выше.

В другом варианте и-РНК-средство может представлять собой «однонитевую ми-РНК», которую вводят в клетку или организм для ингибирования мРНК-мишени. Средства в виде однонитевых РНК-и связываются с RISC-эндонуклеазой Argonaute 2, которая затем расщепляет мРНК-мишень. Однонитевые ми-РНК обычно имеют длину 15-30 нуклеотидов и химически модифицированы. Конструирование и тестирование однонитевых ми-РНК описано в патенте США № 8101348 и в публикации Lima с соавторами (2012), Cell 150: 883-894, при этом полное содержание каждой из публикаций включено в настоящее описание в виде ссылки. Любую из антисмысловых нуклеотидных последовательностей, описанных в настоящей публикации, (например, последовательности, представленные в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20) можно применять в качестве однонитевой ми-РНК, которая описана в настоящей публикации, или в после химической модификации способами, описанными Lima с соавторами, (2012) Cell 150: 883-894.

В другом аспекте РНК-средство представляет собой «однонитевую антисмысловую молекулу РНК». Однонитевая антисмысловая молекула РНК комплементарная последовательности в мРНК-мишени. Однонитевые антисмысловые молекулы РНК могут ингибировать трансляцию стехиометрическим образом за счет спаривания оснований с мРНК и создания физического препятствия для аппарата трансляции, См. публикацию Dias N. С соавторами (2002) Mol. Cancer. Ther. 1: 347-355. Альтернативно однонитевые антисмысловые молекулы ингибируют мРНК-мишень за счет гибридизации с мишенью и расщепления мишени в результате события расщепления РНК-азой H. Однонитевая антисмысловая молекула РНК может иметь длину примерно от 10 до примерно 30 нуклеотидов и иметь последовательность, которая комплементарна последовательности-мишени. Например, однонитевая антисмысловая молекула РНК может содержать последовательность, которая представляет собой, по меньшей мере, примерно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или больше непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов из любой из антисмысловых нуклеотидных последовательностей, описанных в настоящей публикации, например, последовательностей, представленных в любой из таблиц 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20.

Специалисту в данной области будет понятно, что термины «молекула РНК» или «молекула рибонуклеиновой кислоты» охватывают не только молекулы РНК, которые экспрессируются и встречаются в природе, но также аналоги и производные РНК, содержащие один или несколько аналогов или производных рибонуклеотидов/рибонуклеозидов, которые описаны в настоящей публикации или которые известны в данной области. Строго говоря, «рибонуклеозид» включает нуклеозидное основание и сахар рибозу, а «рибонуклеотид» представляет собой рибонуклеозид с одним, двумя или тремя остатками фосфата. Однако термины «рибонуклеозид» и «рибонуклеотид» можно считать эквивалентными в используемом в настоящем описании смысле. РНК может быть модифицирована в структуре оснований нуклеотидов или в структуре рибозо-фосфатного остова, например, как описано в настоящей публикации ниже. Однако молекулы, содержащие аналоги или производные рибонуклеозидов, должны сохранять способность образовывать дуплекс. В качестве не ограничивающих примеров молекула РНК также включает в себя, по меньшей мере, один модифицированный рибонуклеозид, включая без ограничения модифицированный 2'-O-метилом нуклеозид, нуклеозид, содержащий 5'-фосфоротиоатную группу, концевой нуклеозид, связанный с производным холестерина или группой бисдециламида додекановой кислоты, закрытый нуклеозид, лишенный основания нуклеозид, модифицированный 2'-дезокси-2'-фтором нуклеозид, 2'-амино-модифицированный нуклеозид, 2'-алкил-модифицированный нуклеозид, морфолинонуклеозид, содержащий фосфорамидат или неприродное основание нуклеозид или любое их сочетание. Альтернативно молекула РНК может содержать, по меньшей мере, два модифицированных рибонуклеозида, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20 или больше до полной длины молекулы днРНК. Модификации не должны быть обязательно одинаковыми в случае каждого из множества модифицированных рибонуклеозидов в молекуле РНК. В одном варианте модифицированные РНК, которые предполагают применять в способах и композициях, описанных в настоящей публикации, представляют собой пептидонуклеиновые кислоты (ПНК), которые обладают способностью образовывать требуемую структуру дуплекса и которые обеспечивают возможность или опосредуют специфичный распад РНК-мишени, например, посредством пути RISC.

В одном аспекте модифицированный рибонуклеозид включает дезоксирибонуклеозид. В таком случае средство в виде и-РНК может содержать один или несколько дезоксинуклеозидов, включая, например, дезоксинуклеозидный липкий конец(цы) или один или несколько дезоксинуклеозидов в двунитевой части днРНК. Однако, само собой разумеется, что ни при каких обстоятельствах термин «и-РНК» не охватывает молекулу двунитевой ДНК.

В одном аспекте средство для РНК-интерференции включает однонитевую РНК, которая взаимодействует с последовательностью РНК-мишени, запуская расщепление РНК-мишени. Не имея намерения быть связанными с какой-либо теорией, полагают, что длинная двунитевая РНК, вводимая в клетки, разрушается с образованием ми-РНК эндонуклеазой типа III, известной как эндонуклеаза Дайсер (Sharp с соавторами, Genes Dev. 2001, 15: 485). Дайсер, фермент рибонуклеаза типа III, процессирует днРНК на короткие интерферирующие РНК длиной 19-23 пары оснований с характерными 3'-линейными концами длиной в два основания (Bernstein с соавторами, (2001) Nature 409: 363). Затем ми-РНК включаются в РНК-индуцируемый комплекс сайленсинга (RISC), где одна или несколько геликаз расплетают дуплекс ми-РНК, позволяя комплементарной антисмысловой нити осуществлять узнавание мишени (Nykanen с соавторами, (2001) Cell 107: 309). После связывания с соответствующей мРНК-мишенью, одна или несколько эндонуклеаз в RISC расщепляют мишень, индуцируя сайленсинг (Elbashir с соавторами (2001) Genes Dev. 15: 188). Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к однонитевой РНК, которая стимулирует образование комплекса RISC, чтобы вызвать сайленсинг гена-мишени.

В используемом в настоящем описании смысле термин «нуклеотидный липкий конец» относится, по меньшей мере, к одному неспаренному нуклеотиду, который выдается из структуры дуплекса и-РНК, например, днРНК. Например, когда 3'-конец одной нити днРНК выступает за пределы 5'-конца другой нити или наоборот, имеет место нуклеотидный липкий конец. днРНК может содержать липкий конец длиной, по меньшей мере, в один нуклеотид; альтернативно липкий конец может содержать, по меньшей мере, два нуклеотида, по меньшей мере, три нуклеотида, по меньшей мере, четыре нуклеотида, по меньшей мере, пять нуклеотидов или больше. Нуклеотидный липкий конец может содержать или состоять из аналога нуклеотида/нуклеозида, включая дезоксинуклеотид/нуклеозид. липкий конец(цы) может быть на смысловой нити, антисмысловой нити или их сочетании. Кроме того, нуклеотид(ды) липкого конца может присутствовать на 5'-конце, 3'-конце или обоих концах либо антисмысловой, либо смысловой нити днРНК.

В одном варианте антисмысловая нить днРНК имеет липкий конец из 1-10 нуклеотидов на 3'-конце и/или 5'-конце. В одном варианте смысловая нить днРНК имеет липкий конец из 1-10 нуклеотидов на 3'-конце и/или 5'-конце. В другом варианте один или несколько нуклеотидов липкого конца заменяют тиофосфатом нуклеозида.

Термины «тупой» или «имеющий тупые концы» в используемом в настоящем описании смысле в отношении днРНК означает, что нет неспаренных нуклеотидов или аналогов нуклеотидов на данном конце днРНК, т.е., не нуклеотидного липкого конца. Один или оба конца днРНК могут быть тупыми. В том случае, когда оба конца днРНК являются тупыми, говорят, что днРНК имеет тупые концы. Для ясности «имеющая тупые концы» днРНК представляет собой днРНК, которая является тупой на обоих концах, т.е., нет нуклеотидного липкого конца ни одном конце молекулы. Чаще всего такая молекула будет двунитевой на протяжении всей ее длины.

Термин «антисмысловая нить» или «направляющая нить» относится к нити и-РНК, например, днРНК, которая содержит область, которая в значительной степени комплементарна последовательности-мишени. В используемом в настоящем описании смысле термин «область комплементарности» относится к области на антисмысловой нити, которая в значительной степени комплементарна последовательности, например, последовательности-мишени, которая определена в настоящем описании. В том случае, когда область комплементарности не полностью комплементарна последовательности-мишени, несоответствующие спаривания могут быть во внутренних или концевых областях молекулы. Обычно наиболее допустимые несоответствующие спаривания находятся в концевых областях, например, в пределах 5, 4, 3 или 2 нуклеотидов 5'- и/или 3'-конца.

Термин «смысловая нить» или «сопровождающая нить» в используемом в настоящем описании смысле относится к нити и-РНК, которая содержит область, которая в значительной степени комплементарна области антисмысловой нити в соответствии с термином, который определен в настоящем описании.

В используемом в настоящем описании смысле термин «SNALP» относится к стабильной частице нуклеиновой кислоты-липида. SNALP означает везикулу из липидов, покрывающих уменьшенное водное внутреннее пространство, содержащее нуклеиновую кислоту, такую как и-РНК или плазмида, с которой и-РНК транскрибируется. SNALP описаны, например, в публикациях заявок на выдачу патента США № 20060240093, 20070135372 и в международной заявке № WO 2009082817. Указанные заявки включены в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме.

«Введение в клетку» в отношении и-РНК означает облегчение или осуществление захвата или абсорбции в клетку, как понятно специалистам в данной области. Абсорбция или захват и-РНК могут быть осуществлены посредством самостоятельных диффузионных или активных клеточных процессов или посредством вспомогательных средств или устройств. Значение такого термина не ограничено клетками in vitro; и-РНК также может быть «введена в клетку» в том случае, когда клетка является частью живого организма. В таком случае введение в клетку будет включать доставку в организм. Например, в случае доставки in vivo и-РНК может быть инъецирована в участок ткани или введена системно. Доставка in vivo также может быть осуществлена с использованием системы доставки β-глюкана, такой как системы, описанные в патентах США №5032401 и 5607677 и в публикации США №2005/0281781, которые включены в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме. Введение in vitro в клетку включает способы, известные в данной области, такие как электропорация и липофекция. Дополнительные способы описаны в настоящей публикации ниже или известны в данной области.

В используемом в настоящем описании смысле термин «модулировать экспрессию» относится, по меньшей мере, к частичному «ингибированию» или частичной «активации» экспрессии гена ALAS1 в клетке, обработанной композицией и-РНК, которая описана в настоящей публикации, по сравнению с экспрессией ALAS1 в контрольной клетке. Контрольная клетка включает необработанную клетку или клетку, обработанную не направленной к мишени контрольной и-РНК.

Термины «активировать», «усиливать», «осуществлять повышающую регуляцию экспрессии», «увеличивать экспрессию», и тому подобные в той части, в которой они относятся к гену ALAS1, в настоящем описании относятся, по меньшей мере, к частичной активации экспрессии гена ALAS1, которая проявляется в увеличении количества мРНК ALAS1, которая может быть выделена или может быть выявлена в первой клетке или группе клеток, в которых ген ALAS1 транскрибируется, и которая была или которые были обработаны так, чтобы повысить экспрессию гена ALAS1, по сравнению со второй клеткой или группой клеток, по существу идентичных первой клетке или группе клеток, но которая не была или которые не были обработаны таким образом (контрольные клетки).

В одном варианте экспрессию гена ALAS1 активируют, по меньшей мере, примерно на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% или 50% введением и-РНК, которая описана в настоящей публикации. В некоторых вариантах ген ALAS1 активируют, по меньшей мере, примерно на 60%, 70% или 80% введением и-РНК, охарактеризованной в изобретении. В некоторых вариантах экспрессию гена ALAS1 активируют, по меньшей мере, примерно на 85%, 90% или 95% или больше введением и-РНК, которая описана в настоящей публикации. В некоторых вариантах экспрессию гена ALAS1 увеличивают, по меньшей мере, в 1 раз, по меньшей мере, в 2 раза, по меньшей мере, в 5 раз, по меньшей мере, в 10 раз, по меньшей мере, в 50 раз, по меньшей мере, в 100 раз, по меньшей мере, в 500 раз, по меньшей мере, в 1000 раз или больше в клетках, обработанных и-РНК, которая описана в настоящей публикации, по сравнению с экспрессией в необработанных клетках. Активация экспрессии малыми днРНК описана, например, в публикации Li с соавторами, 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103: 17337-42, и в US 20070111963 и US 2005226848, каждая из которых включена в настоящее описание в виде ссылки.

Термины «вызывать сайленсинг», «ингибировать экспрессию», «осуществлять понижающую регуляцию экспрессии», «подавлять экспрессию» и тому подобные в той части, в которой они относятся к гену ALAS1, в настоящем описании относятся, по меньшей мере, к частичному подавлению экспрессии гена ALAS1, которое оценивают, например, на основании экспрессии мРНК ALAS1, экспрессии белка ALAS1 или на основании другого параметра, функционально связанного с экспрессией гена ALAS1 (например, на основании концентраций ALA или PBG в плазме или моче). Например, ингибирование экспрессии ALAS1 может проявляться в виде снижения количества мРНК ALAS1, которая может быть выделена или может быть выявлена в первой клетке или группе клеток, в которых ген ALAS1 транскрибируется, и которая была или которые были обработаны так, чтобы ингибировать экспрессию гена ALAS1, по сравнению с контролем. Контролем может быть вторая клетка или группа клеток, по существу идентичных первой клетке или группе клеток, за исключением того, что вторая клетка или группа клеток не были обработаны таким образом (контрольные клетки). Степень ингибирования обычно выражают в виде процента от контрольного уровня, например,

Альтернативно степень ингибирования может быть приведена в виде уменьшения параметра, который функционально связан с экспрессией гена ALAS1, например, количества белка, кодируемого геном ALAS1, или уровня одного или нескольких порфиринов. Уменьшение параметра, функционально связанного с экспрессией гена ALAS1, можно подобным образом выразить в виде процента от контрольного уровня. В принципе, сайленсинг гена ALAS1 можно определить в любой клетке, экспрессирующей ALAS1 либо конститутивно, либо в результате конструирования генома и в любом подходящем анализе. Однако в том случае, когда необходим эталон для того, чтобы определить ингибирует ли данная и-РНК экспрессию гена ALAS1 в определенной степени и поэтому входит в объем настоящего изобретения, анализы, представленные в примерах ниже должны служить в качестве такого эталона.

Например, в некоторых случаях экспрессию гена ALAS1 подавляют, по меньшей мере, примерно на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% или 50% введением и-РНК, охарактеризованной в изобретении. В некоторых вариантах ген ALAS1 подавляют, по меньшей мере, примерно на 60%, 65%, 70%, 75% или 80% введением и-РНК, охарактеризованной в изобретении. В некоторых вариантах ген ALAS1 подавляют, по меньшей мере, примерно на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или больше введением и-РНК, которая описана в настоящей публикации.

В используемом в настоящем описании смысле в контексте экспрессии ALAS1 термины «лечить», «процесс лечения», «лечение» и тому подобные относятся к облегчению или ослаблению патологических процессов, связанных с экспрессией ALAS1 (например, патологических процессов, в которые вовлечены порфирины или дефекты порфиринового пути, такие как, например, порфирии). В контексте настоящего изобретения в той части, которая относится к любому из других состояний, перечисленных в настоящем описании ниже (отличных от патологических процессов, связанных с экспрессией ALAS1), термины «лечить», «лечение» и тому подобные означают предотвращать, облегчать или ослаблять, по меньшей мере, один симптом, ассоциированный с таким состоянием, или замедлять или реверсировать прогрессирование такого состояния. Например, способы, охарактеризованные в настоящем описании, в случае применения для лечения порфирии, могут служить для уменьшения или предотвращения одного или нескольких симптомов ассоциированных с порфирией (например, боли), снижения тяжести или частоты приступов, ассоциированных с порфирией, уменьшения вероятности того, что приступ одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, будет происходить после воздействия провоцирующего условия, укорочения приступа, ассоциированного с порфирией, и/или уменьшения риска развития состояний, ассоциированных с порфирией (например, гепатоклеточного рака или нейропатии (например, прогрессирующей нейропатии)). Таким образом, если контекст ясно не указывает иное, подразумевается, что термины «лечить», «лечение» и тому подобные охватывают профилактику, например, предотвращение расстройств и/или симптомов расстройств, связанных с экспрессией ALAS1.

«Более низкий» в контексте заболевания показатель или симптом означает статистически или клинически значимое снижение такого уровня. Снижение может составлять, например, по меньшей мере, 10%, по меньшей мере, 20%, по меньшей мере, 30%, по меньшей мере, 40% или больше, и обычно снижается до уровня в приятом диапазоне нормы для индивидуума без такого расстройства.

В используемом в настоящем описании смысле фразы «терапевтически эффективное количество» и «профилактически эффективное количество» относится к количеству, которое дает терапевтическую пользу при лечении, профилактике или контролировании патологических процессов, связанных с экспрессией ALAS1. Конкретное количество, которое является терапевтически эффективным, легко может определить опытный лечащий врач, и количество может варьировать, в зависимости от факторов, известных в данной области, таких как, например, тип патологического процесса, история болезни и возраст пациента, стадия патологического процесса и введение других средств.

В используемом в настоящем описании смысле «фармацевтическая композиция» содержит фармакологически эффективное количество и-РНК и фармацевтически приемлемый носитель. В используемом в настоящем описании смысле «фармакологически эффективное количество», «терапевтически эффективное количество» или просто «эффективное количество» относится к такому количеству и-РНК, которое эффективно в отношении получения предполагаемого фармакологического, терапевтического или профилактического результата. Например, в способе лечения расстройства, связанного с экспрессией ALAS1 (например, в способе лечения порфирии), эффективное количество включает количество эффективное в отношении уменьшения одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, количество, эффективное в отношении снижения частоты приступов, количество, эффективное в отношении снижения вероятности того, что приступ одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, будет происходить при воздействии провоцирующего фактора, или количество, эффективное в отношении снижения риска развития состояний, ассоциированных с порфирией (например, нейропатии (например, прогрессирующей нейропатии), гепатоклеточного рака). Например, если данное клиническое лечение считают эффективным, когда имеет место снижение, по меньшей мере, на 10% измеряемого параметра, ассоциированного с заболеванием или расстройством, терапевтически эффективное количество лекарственного средства для лечения такого заболевания или расстройства представляет собой количество, которое необходимо для получения уменьшения такого параметра, по меньшей мере, на 10%. Например, терапевтически эффективное количество и-РНК, мишенью которой является ALAS1, может снижать уровни белка ALAS1 на любое измеряемое количество, например, по меньшей мере, на 10%, 20%, 30%, 40% или 50%.

Термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к носителю для введения терапевтического средства. Такие носители включают без ограничения физиологический раствор, буферный физиологический раствор, декстрозу, воду, глицерин, этанол и их сочетания. Из термина специально исключена среда для культивирования клеток. В случае лекарственных средств, вводимых перорально, фармацевтически приемлемые носители включают без ограничения фармацевтически приемлемые эксципиенты, такие как инертные разбавители, дезинтегрирующие средства, связывающие средства, скользящие вещества, подсластители, корригенты, красители и консерванты. Подходящие инертные разбавители включают карбонат натрия и кальция, фосфат натрия и кальция и лактозу, тогда как кукурузный крахмал и альгиновая кислота являются подходящими дезинтегрирующими средствами. Связывающие средства могут включать крахмал и желатин, тогда как скользящим веществом, в случае его наличия, обычно будет стеарат магния, стериновая кислота или тальк. При необходимости таблетки могут быть покрыты таким материалом, как моностеарат глицерина или дистеарат глицерина, чтобы замедлить всасывание в желудочно-кишечном тракте. Средства, включаемые в препараты лекарственных средств, дополнительно описаны в настоящей публикации ниже.

Термин «примерно» в отношении количества или числового диапазона означает, что указанное количество или числовой диапазон является приблизительным в пределах вариабельности эксперимента (или в пределах статистической погрешности эксперимента) и, таким образом, количество или числовой диапазон может варьировать, например, от 1% до 15% от указанного числа или числового диапазона.

II. Двунитевая рибонуклеиновая кислота (днРНК)

В настоящей публикации описаны и-РНК-средства, которые ингибируют экспрессию гена ALAS1. В одном варианте и-РНК-средство включает молекулы двунитевой рибонуклеиновой кислоты (днРНК) для ингибирования экспрессии гена ALAS1 в клетке или у субъекта (например, у млекопитающего, например, у человека, имеющего порфирию), при этом днРНК содержит антисмысловую нить, имеющую область комплементарности, которая комплементарна, по меньшей мере, части мРНК, образованной при экспрессии гена ALAS1, и при этом область комплементарности имеет длину 30 нуклеотидов или меньше, обычно длину 19-24 нуклеотида, и при этом днРНК при контакте с клеткой, экспрессирующей ген ALAS1, ингибирует экспрессию гена ALAS1, по меньшей мере, на 10%, что анализируют, например, с использованием ПЦР или основанного на разветвленной ДНК (bDNA) способа или основанного на белках способа, такого как Вестерн-блоттинг. В одном варианте и-РНК-средство активирует экспрессию гена ALAS1 в клетке или в организме млекопитающего. Экспрессию гена ALAS1 в культуре клеток, такой как клетки COS, клетки HeLa, первичные гепатоциты, клетки HepG2, первичные культивируемые клетки, или в биологическом образце, полученном от субъекта, можно анализировать, измеряя уровни мРНК ALAS1, например, с использованием анализа bDNA или TaqMan, или измеряя уровни белка, например в анализе иммунофлуоресценции, используя, например, Вестерн-блоттинг или проточно-цитометрический способ.

днРНК содержит две нити РНК, которые комплементарны в достаточной степени, чтобы гибридизоваться с образованием структуры дуплекса в условиях, в которых днРНК будет использована. Одна нить днРНК (антисмысловая нить) содержит область комплементарности, которая в значительной степени комплементарна и обычно полностью комплементарна последовательности-мишени, полученной из последовательности мРНК, образованной во время экспрессии гена ALAS1. Другая нить (смысловая нить) содержит область, которая комплементарна антисмысловой нити, так что две нити гибридизуются и образуют структуру дуплекса при объединении в подходящих условиях. Обычно структура дуплекса имеет длину от 15 до 30 включительно, чаще от 18 до 25 включительно, еще более часто от 19 до 24 включительно и наиболее часто от 19 до 21 пары оснований включительно. Подобным образом область комплементарности с последовательностью-мишенью имеет длину от 15 до 30 включительно, чаще от 18 до 25 включительно, еще более часто от 19 до 24 включительно и наиболее часто от 19 до 21 нуклеотида включительно. В некоторых вариантах днРНК имеет длину от 15 до 20 нуклеотидов включительно, и в других вариантах днРНК имеет длину от 25 до 30 нуклеотидов включительно. Как будет понятно специалисту область-мишень в РНК, являющейся мишенью расщепления, чаще всего является частью более крупной молекулы РНК, часто молекулы мРНК. В соответствующем случае «часть» мРНК-мишени представляет собой непрерывную последовательность мРНК-мишени достаточной длины, чтобы быть субстратом РНК-и-направленного расщепления (т.е., расщепления посредством пути RISC). днРНК, имеющие короткие дуплексы даже длиной 9 пар оснований в некоторых случаях могут опосредовать РНК-и-направленное расщепление РНК. Чаще всего мишень будет иметь длину, по меньшей мере, 15 нуклеотидов, например, длину 15-30 нуклеотидов.

Специалисту в данной области также будет понятно, что область дуплекса является основной функциональной частью днРНК, например, область дуплекса длиной от 9 до 36, например, 15-30 пар оснований. Таким образом, в одном варианте в случае, если молекула РНК или комплекс молекул РНК оказывается процессированным до функционального дуплекса, например, длиной 15-30 пар оснований, который целенаправленно приводит к расщеплению требуемой РНК, молекула РНК или комплекс молекул РНК, имеющих область дуплекса больше 30 пар оснований, является днРНК. Таким образом, специалисту в данной области будет понятно, что в одном варианте ми-РНК является днРНК. В другом варианте днРНК не является встречающейся в природе ми-РНК. В другом варианте и-РНК-средство, применимое для целенаправленного действия на экспрессию ALAS1, не образуется в клетке-мишени в результате расщепления более крупной днРНК.

днРНК, которая описана в настоящей публикации, может дополнительно содержать один или несколько однонитевых нуклеотидных липких концов. днРНК может быть синтезирована стандартными способами, известными в данной области, которые дополнительно обсуждаются ниже, например, с использованием автоматического синтезатора ДНК, такого как коммерчески доступный синтезатор, например, из Biosearch, Applied Biosystems, Inc. В одном варианте ген ALAS1 представляет собой ген ALAS1 человека. В другом варианте ген ALAS1 представляет собой ген ALAS1 мыши или крысы. В конкретных вариантах первая последовательность является смысловой нитью днРНК, которая содержит смысловую последовательность, указанную в таблице 2 или таблице 3, и вторая последовательность является антисмысловой нитью днРНК, которая содержит антисмысловую последовательность, указанную в таблице 2 или таблице 3. В некоторых вариантах первая последовательность является смысловой нитью днРНК, которая содержит смысловую последовательность из таблицы 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 или 15, и вторая последовательность является антисмысловой нитью днРНК, которая содержит антисмысловую последовательность из таблицы 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 или 15. В некоторых вариантах первая последовательность является смысловой нитью днРНК, которая содержит смысловую последовательность из таблицы 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 или 20, и вторая последовательность является антисмысловой нитью днРНК, которая содержит антисмысловую последовательность из таблицы 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 или 20. Альтернативные днРНК-средства, мишенью которых являются другие последовательности, отличные от последовательностей днРНК, раскрытых в настоящем описании (например, в таблице 2 или таблице 3), легко могут быть определены с использованием последовательности-мишени и фланкирующей последовательности ALAS1.

В одном аспекте днРНК может содержать, по меньшей мере, смысловую и антисмысловую нуклеотидные последовательности, при этом смысловая нить выбрана из групп последовательностей, представленных в таблицах 2 и 3, и антисмысловая нить, соответствующая смысловой нити, выбрана из последовательностей, представленных в таблицах 2 и 3. В следующем аспекте днРНК может содержать, по меньшей мере, смысловую и антисмысловую нуклеотидные последовательности, при этом смысловая нить выбрана из групп последовательностей, представленных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 и 15, и антисмысловая нить, соответствующая смысловой нити, выбрана из таблиц 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 и 15. В следующем аспекте днРНК может содержать, по меньшей мере, смысловую и антисмысловую нуклеотидные последовательности, при этом смысловая нить выбрана из групп последовательностей, представленных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20, и антисмысловая нить, соответствующая смысловой нити, выбрана из таблиц 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20. В таких аспектах одна из двух последовательностей комплементарна другой из двух последовательностей, при этом одна из последовательностей по существу комплементарна последовательности мРНК, образуемой при экспрессии гена ALAS1. Как таковая, днРНК может содержать два олигонуклеотида, при этом один олигонуклеотид описан как смысловая нить в таблице 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 или 20, а второй олигонуклеотид описан как антисмысловая нить, соответствующая смысловой нити из таблиц 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 или 20. Как описано в настоящей публикации и как известно в данной области, комплементарные последовательности днРНК также могут быть представлены в виде самокомплементарных областей одной молекулы нуклеиновой кислоты, а не в виде отдельных олигонуклеотидов.

Специалисту хорошо известно, что днРНК, имеющая структуру дуплекса длиной от 20 до 23, но в частности 21 пару оснований, считается особенно эффективной в индукции РНК-интерференции (Elbashir с соавторами, EMBO 2001, 20: 6877-6888). Однако другими авторами было обнаружено, что также эффективными могут быть более короткие или более длинные структуры РНК-дуплексов. В описанных выше вариантах в силу природы олигонуклеотидных последовательностей, представленных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20, днРНК, описанные в настоящей публикации, могут содержать, по меньшей мере, одну нить с минимальной длиной 21 нуклеотид. Обоснованно можно ожидать, что более короткие дуплексы, имеющие одну из последовательностей, указанных в таблице 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 или 20, в которых отсутствуют только несколько нуклеотидов на одном или обоих концах, могут быть также эффективными при сравнении с днРНК, описанными выше. Следовательно, согласно настоящему изобретению предусмотрены днРНК, имеющие неполную последовательность, по меньшей мере, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или больше непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов из одной из последовательностей, указанных в таблице 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 или 20, и отличающиеся по своей способности ингибировать экспрессию гена ALAS1 не более чем на 5, 10, 15, 20, 25 или 30% ингибирования от днРНК, содержащей полную последовательность.

Кроме того, РНК, представленные в таблицах 2 и 3, а также РНК, представленные в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20, имеют участок транскрипта ALAS1, который чувствителен к RISC-опосредованному расщеплению. В связи с этим дополнительным характерным признаком настоящего изобретения являются и-РНК, мишень которых находится в пределах одной из таких последовательностей. В используемом в настоящем описании смысле говорят, что мишень и-РНК находится в пределах конкретного участка РНК-транскрипта, если и-РНК стимулирует расщепление транскрипта в любом месте в пределах конкретного участка. Такая и-РНК обычно будет содержать, по меньшей мере, 15 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов из одной из последовательностей, представленных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20, связанных с дополнительными нуклеотидными последовательностями, взятыми из области, являющейся соседней с выбранной последовательностью в гене ALAS1.

Хотя последовательность-мишень обычно имеет длину 15-30 нуклеотидов, имеет место широкая изменчивость в отношении применимости конкретных последовательностей в таком диапазоне для направленного расщепления любой данной РНК-мишени. В различных пакетах компьютерных программ и руководствах, указанных в настоящем описании, представлены инструкции по идентификации оптимальных последовательностей-мишеней для любого данного генной мишени, но также может быть использован эмпирический подход, в случае которого «окно» или «рамка» заданного размера (в качестве не ограничивающего примера, 21 нуклеотид) буквально или фигурально (включая, например, in silico) помещают на последовательность РНК-мишени, чтобы идентифицировать последовательности в данном размерном диапазоне, которые могут служить в качестве последовательностей-мишеней. Постепенно перемещая «окно» последовательности по одному нуклеотиду выше или ниже начального положения последовательности-мишени, можно идентифицировать следующую потенциальную последовательность-мишень, пока не будет идентифицирован полный набор возможных последовательностей для любого заданного выбранного размера мишени. Указанным способом вместе с последовательным синтезом и тестированием идентифицированных последовательностей (с использованием анализов, которые описаны в настоящей публикации или которые известны в данной области) для идентификации таких последовательностей, которые функционируют оптимально, можно идентифицировать такие последовательности РНК, которые в случае целенаправленного действия и-РНК-средства опосредуют наилучшее ингибирование экспрессии гена-мишени. Таким образом, хотя последовательности, указанные, например, в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20, представляют собой эффективные последовательности-мишени, предполагается, что дополнительная оптимизация эффективности ингибирования может быть осуществлена последовательным «прохождением окна» по одному нуклеотиду вверх или вниз заданных последовательностей, чтобы идентифицировать последовательности с равными или лучшими характеристиками ингибирования.

Кроме того, предусмотрено, что в случае любой идентифицированной последовательности, например, указанной в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 14, 15, 18 и 20, дополнительная оптимизация может быть осуществлена последовательными добавлением или удалением нуклеотидов, чтобы создать более длинные или более короткие последовательности, и тестированием таких образованных последовательностей путем прохождения окна более длинного или более короткого размера вверх или вниз РНК-мишени от данной точки. И в этом случае сочетание такого способа создания новых кандидатов в мишени с тестированием в отношении эффективностей и-РНК, основанных на таких последовательностях-мишенях, в анализе ингибирования, который известен в данной области или который описан в настоящей публикации, может приводить к дополнительному повышению эффективности ингибирования. Более того, такие оптимизированные последовательности могут быть скорректированы, например, введением модифицированных нуклеотидов, которые описаны в настоящей публикации или которые известны в данной области, добавлением или изменениями липких концов или другими модификациями, которые известны в данной области и/или обсуждаются в настоящем описании, чтобы дополнительно оптимизировать молекулу (например, повышение стабильности в сыворотке или увеличение времени полужизни в циркуляции, повышение термостабильности, усиление трансмембранной доставки, направление в конкретное место или тип клеток, усиление взаимодействия с ферментами в пути сайленсинга, усиление высвобождения из эндосом и т.д.) в качестве ингибитора экспрессии.

Описанная в настоящей публикации и-РНК может содержать одно или несколько ошибочных спариваний с последовательностью-мишенью. В одном варианте и-РНК, которая описана в настоящей публикации, содержит не более 3 ошибочных спариваний. Если антисмысловая нить и-РНК имеет ошибочные спаривания с последовательностью-мишенью, предпочтительно, чтобы область ошибочного спаривания не была расположена в центре области комплементарности. Если антисмысловая нить и-РНК содержит ошибочные спаривания с последовательностью-мишенью, предпочтительно, чтобы ошибочное спаривание было ограничено в пределах последних 5 нуклеотидов либо от 5'-, либо от 3'-конца области комплементарности. Например, в случае нити РНК 23-нуклеотидного и-РНК-средства нить РНК, которая комплементарна области гена ALAS1, нить РНК обычно не содержит никакого ошибочного спаривания в пределах центральных 13 нуклеотидов. Способы, описанные в настоящей публикации, или способы, известные в данной области, можно использовать для определения того является ли и-РНК, содержащая ошибочное спаривание с последовательностью-мишенью, эффективной в ингибировании экспрессии гена ALAS1. Важно учитывать эффективность и-РНК с ошибочными спариваниями в ингибировании экспрессии гена ALAS1, особенно если известно, что для конкретной области комплементарности в гене ALAS1 в популяции существует обусловленная полиморфизмом изменчивость последовательности.

В одном варианте, по меньшей мере, один конец днРНК имеет однонитевой нуклеотидный липкий конец длиной от 1 до 4 нуклеотидов, обычно 1 или 2 нуклеотида. днРНК, имеющие, состоящий, по меньшей мере, из одного нуклеотида липкий конец, обладают неожиданно превосходными ингибирующими свойствами по сравнению с их аналогами с тупыми концами. В еще одном варианте РНК в и-РНК, например, днРНК, химически модифицирована для того, чтобы повысить стабильность или другие полезные характеристики. Нуклеиновые кислоты, охарактеризованные в изобретении, могут быть синтезированы и/или модифицированы способами, хорошо разработанными в данной области, такими как способы, описанные в публикации «Current protocols in nucleic acid chemistry», Beaucage, S.L. et al. (Edr.), John Wiley and Sons, Inc., New York, NY, USA, которая включена в настоящее описание в виде ссылки. Модификации включают, например, (a) концевые модификации, например, 5'-концевые модификации (фосфорилирование, конъюгацию, связывание инвертированных повторов и т.д.), 3'-концевые модификации (конъюгации, ДНК-нуклеотиды, связывание инвертированных повторов и т.д.), (b) модификации оснований, например, замену стабилизирующими основаниями, дестабилизирующими основаниями или основаниями, которые, которые образуют пары оснований с более широким репертуаром партнеров, удаление оснований (нуклеотиды, лишенные оснований) или конъюгированные основания, (c) модификации сахаров (например, в 2'-положении или 4'-положении) или замену сахара, а также (d) модификации остова, включая модификацию или замену фосфодиэфирных связей. Конкретные примеры РНК-соединений, применимых в настоящем изобретении, включают без ограничения РНК, содержащие модифицированные остовы или не содержащие природных межнуклеозидных связей. РНК, имеющие модифицированные остовы, включают наряду с прочими остовы, которые не имеют атома фосфора в остове. В целях настоящего описания и как иногда указывают в данной области, модифицированные РНК, которые не имеют атома фосфора в своем межнуклеозидном остове, также можно считать олигонуклеозидами. В конкретных вариантах модифицированная РНК может иметь атом фосфора в своем межнуклеозидном остове.

Модифицированные остовы РНК включают, например, фосфоротиоаты, хиральные фосфоротиоаты, фосфородитиоаты, фосфотриэфиры, аминоалкилфосфотриэфиры, метил- и другие алкилфосфонаты, включая 3'-алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, включая 3'-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры и боранофосфаты, имеющие нормальные 3'-5'-связи, 2'-5'-связанные аналоги и тех и других), имеющие обратную ориентацию, в которых соседние пары нуклеозидных единиц связаны 3'-5' с 5'-3' или 2'-5' с 5'-2'. Также включены различные соли, смешанные соли и формы свободных кислот.

Соответствующие патенты США, в которых содержатся инструкции по получению указанных выше фосфорсодержащих связей, включают без ограничения патенты США №3687808, 4469863, 4476301, 5023243, 5177195, 5188897, 5264423, 5276019, 5278302, 5286717, 5321131, 5399676, 5405939, 5453496, 5455233, 5466677, 5476925, 5519126, 5536821, 5541316, 5550111, 5563253, 5571799, 5587361, 5625050, 6028188, 6124445, 6160109, 6169170, 6172209, 6239265, 6277603, 6326199, 6346614, 6444423, 6531590, 6534639, 6608035, 6683167, 6858715, 6867294, 6878805, 7015315, 7041816, 7273933, 7321029 и патент США RE39464, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки.

Модифицированные РНК-остовы, которые не содержат атома фосфора, имеют остовы, которые образованы короткоцепочечными алкил- или циклоалкильными межнуклеозидными связями, смешанными гетероатомами и алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями или одной или несколькими короткоцепочечными гетероматомными или гетероциклическими межнуклеозидными связями. Такие остовы включают остовы, имеющие морфолиносвязи (образованные частично из представленной сахаром части нуклеозида); силоксановые остовы; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые остовы; формацетильные и тиоформацетильные остовы; метиленформацетильные и тиоформацетильные остовы; содержащие алкен остовы; сульфаматные остовы; метиленимино- и метиленгидразино-остовы; сульфонатные и сульфонамидные остовы; амидные остовы; и другие, имеющие смешанные компоненты N, O, S и CH₂.

Соответствующие патенты США, в которых имеются инструкции по получению указанных выше олигонуклеозидов, включают без ограничения патенты США №5034506, 5166315, 5185444, 5214134, 5216141, 5235033, 564562, 5264564, 5405938, 5434257, 5466677, 5470967, 5489677, 5541307, 5561225, 5596086, 5602240, 5608046, 5610289, 5618704, 5623070, 5663312, 5633360, 5677437 и 5677439, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки.

В других миметиках РНК, подходящих или предполагаемых для применения в и-РНК, и сахар и межнуклеозидные связи, т.е. остов из нуклеотидных единиц, заменяют новыми группами. Единицы, представленные основаниями, сохраняют для гибридизации с соответствующим соединением-мишенью в виде нуклеиновой кислоты. Одно такое олигомерное соединение, миметик РНК, которое, как было показано, обладает превосходными свойствами в отношении гибридизации, называют пептидо-нуклеиновой кислотой (ПНК). В РНК-соединениях сахарный остов РНК заменяют остовом, содержащим амиды, в частности аминоэтилглициновым остовом. Основания нуклеотидов сохраняют, и они связаны прямо или опосредованно с атомами азота аза-группы в амидной части остова. Соответствующие патенты США, в которых содержатся руководства по получению соединений ПНК, включают без ограничения, патенты США №5539082, 5714331 и 5719262, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки. Дополнительные инструкции, касающиеся соединений ПНК, можно найти, например, в публикации Nielsen с соавторами, Science, 1991, 254, 1497-1500.

Некоторые варианты, охарактеризованные в изобретении, включают РНК с фосфоротиоатными остовами и олигонуклеозиды с остовами, содержащими гетероатомы, и в частности --CH₂--NH--CH₂--, --CH₂--N(CH₃)--O--CH₂-- [известный как метилен(метилимино)- или MMI-остов], --CH₂-O--N(CH₃)--CH₂--, --CH₂-N(CH₃)--N(CH₃)--CH₂-- и --N(CH₃)--CH₂--CH₂-- [где нативный фосфодиэфирный остов представлен в виде -O-P-O--CH₂--], описанные в указанном выше патенте США №5489677, и амидные остовы, описанные в указанном выше патенте США №5602240. В некоторых вариантах РНК, охарактеризованные в настоящем описании, имеют структуры морфолино-остова, описанные в указанном выше патенте США №5034506.

Модифицированные РНК также могут содержать один или несколько замещенных остатков сахаров. и-РНК, например, днРНК, охарактеризованные в настоящем описании, могут содержать одну из следующих групп в 2'-положении: OH; F; O-, S- или N-алкил; O-, S- или N-алкенил; O-, S- или N-алкинил; или O-алкил-O-алкил, где алкил, алкенил и алкинил могут представлять собой замещенный или незамещенный C₁-C₁₀-алкил или C₂-C₁₀-алкенил и -алкинил. Примеры подходящих модификаций включают O[(CH₂)_nO]_mCH₃, O(CH₂)_nOCH₃, O(CH₂)_nNH₂, O(CH₂)_nCH₃, O(CH₂)_nONH₂ и O(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃)]₂, где n и m составляют от 1 до примерно 10. В других вариантах днРНК содержат одну из следующих групп в 2'-положении: низший C₁-C₁₀-алкил, замещенный низший алкил, алкиларил, аралкил, O-алкиларил или O-аралкил, SH, SCH₃, OCN, Cl, Br, CN, CF₃, OCF₃, SOCH₃, SO₂CH₃, ONO₂, NO₂, N₃, NH₂, гетероциклоалкил, гетероциклоалкиларил, аминоалкиламиногруппу, полиалкиламиногруппу, замещенный силил, РНК-расщепляющую группу, репортерную группу, интеркалятор, группу для улучшения фармакокинетических свойств и-РНК или группу для улучшения фармакодинамических свойств и-РНК и другие заместители, обладающие сходными свойствами. В некоторых вариантах модификация включает 2'-метоксиэтоксигруппу (2'-O--CH₂CH₂OCH₃, также известную как 2'-О-(2-метоксиэтил) или 2'-MOE) (Martin с соавторами, Helv. Chim. Acta, 1995, 78: 486-504) т.е., алкокси-алкоксигруппу. Другим примером модификации является 2'-диметиламинооксиэтоксигруппа, т.е., группа O(CH₂)₂ON(CH₃)₂, также известная как 2'-DMAOE, которая описана в настоящей публикации в примерах ниже, и 2'-диметиламиноэтоксиэтоксигруппа (также известная в данной области как 2'-O-диметиламиноэтоксиэтил или 2'-DMAEOE), т.е., 2'-O--CH₂--O--CH₂--N(CH₂)₂, также описанная в настоящей публикации в примерах ниже.

Другие модификации включают 2'-метоксигруппу (2'-OCH), 2'-аминопропоксигруппу (2'-OCH₂CH₂CH₂NH₂) и 2'-фтор (2'-F). Сходные модификации также могут быть получены в других положениях РНК в и-РНК, в частности в 3'-положении сахара 3'-концевого нуклеотида или в 2'-5'-связанных днРНК и в 5'-положении 5'-концевого нуклеотида. и-РНК также могут содержать миметики сахара, такие как остатки циклобутила, вместо сахара пентофуранозила. Соответствующие патенты США, в которых описано получение таких структур модифицированных сахаров, включают без ограничения патенты США №4981957, 5118800, 5319080, 5359044, 5393878, 5446137, 5466786, 5514785, 5519134, 5567811, 5576427, 5591722, 5597909, 5610300, 5627053, 5639873, 5646265, 5658873, 5670633 и 5700920, авторы некоторых из которых также являются авторами настоящей заявки, и каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки.

и-РНК также может содержать модификации или замещения оснований нуклеотидов (часто называемых в данной области просто «основаниями»). В используемом в настоящем описании смысле «немодифицированные» или «природные» основания нуклеотидов включают пуриновые основания аденин (A) и гуанин (G) и пиримидиновые основания тимин (T), цитозин (C) и урацил (U). Модифицированные основания нуклеотидов включают другие синтетические и природные основания нуклеотидов, такие как 5-метилцитозин (5-me-C), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил- и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил- и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил и -цитозин, 5-пропинилурацил и -цитозин, 6-азоурацил, -цитозин и -тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген-, 8-амино-, 8-тиол-, 8-тиоалкил-, 8-гидроксил- и другие 8- замещенные аденины и гуцанины, 5-галоген-, в частности 5-бром-, 5-трифторметил- и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин и 3-деазагуанин и 3-деазааденин. Дополнительные основания нуклеотидов включают основания, описанные в патенте США №3687808, основания, раскрытые в публикации «Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine», Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008; основания, раскрытые в публикации «The Concise Encyclopedia Of Polymer Science and Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley and Sons, 1990, основания, раскрытые в публикации Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, и основания, раскрытые в публикации Sanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993. Некоторые из таких оснований нуклеотидов особенно применимы для повышения аффинности связывания олигомерных соединений, охарактеризованных в изобретении. Такие основания включают 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2-, N-6- и 0-6-замещенные пурины, включая 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин. Было показано, что замены 5-метилцитозином повышают стабильность дуплексов нуклеиновых кислот на 0,6-1,2°C (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) и являются примером замен оснований, еще более предпочтительно в сочетании с 2'-O-метоксиэтильными модификациями сахара.

Соответствующие патенты США, в которых описано получение некоторых указанных выше модифицированных оснований нуклеотидов, а также другие модифицированных оснований нуклеотидов, включают без ограничения упомянутый выше патент США №3687808, а также патенты США №4845205, 513030, 5134066, 5175273, 5367066, 5432272, 5457187, 5459255, 5484908, 5502177, 5525711, 5552540, 5587469, 5594121, 5596091, 5614617, 5681941, 6015886, 6147200, 6166197, 6222025, 6235887, 6380368, 6528640, 6639062, 6617438, 7045610, 7427672 и 7495088, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки, и патент США №5750692, также включенный в настоящее описание в виде ссылки.

РНК в и-РНК также может быть модифицирована так, чтобы она содержала одну или несколько закрытых нуклеиновых кислот (LNA). Закрытая нуклеиновая кислота представляет собой нуклеотид, имеющий модифицированный остаток рибозы, при этом остаток рибозы содержит дополнительный мостик, связывающий 2'- и 4'-атомы углерода. Такая структура эффективно «запирает» рибозу в структурной 3'-эндо-конформации. Было показано, что добавление закрытых нуклеиновых кислот к ми-РНК повышает стабильность ми-РНК в сыворотке и снижает нецелевые эффекты (Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193).

Соответствующие патенты США, в которых описано получение закрытых нуклеотидов нуклеиновой кислоты, включают без ограничения следующие патенты: патенты США №6268490, 6670461, 6794499, 6998484, 7053207, 7084125 и 7399845, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме.

Потенциально стабилизирующие модификации на концах молекул РНК могут включать N-(ацетиламинокапроил)-4-гидроксипролинол (Hyp-C6-NHAc), N-(капроил-4-гидроксипролинол (Hyp-C6), N-(ацетил-4-гидроксипролинол (Hyp-NHAc), тимидин-2'-O-дезокситимидин (простой эфир), N-(аминокапроил)-4-гидроксипролинол (Hyp-C6-амино), 2-докозаноилуридин-3”-фосфат, инвертированное основание dT(idT) и другие. Описание такой модификации можно найти в публикации PCT № WO 2011/005861.

МОТИВЫ И-РНК

В одном варианте последовательность смысловой нити может быть представлена формулой (I):

5' n_p-N_a-(X X X)_i-N_b-Y Y Y-N_b-(Z Z Z)_j-N_a-n_q 3' (I)

где:

i и j каждый независимо означают 0 или 1;

p и q каждый независимо означают 0-6;

каждый N_a независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, при этом каждая последовательность содержит, по меньшей мере, два по-разному модифицированных нуклеотида;

каждый N_b независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 модифицированных нуклеотидов;

каждый n_p и n_q независимо означает выступающий нуклеотид;

где N_b и Y не имеют одной и той же модификации; и

XXX, YYY и ZZZ каждый независимо означают один мотив из трех идентичных модификаций трех следующих друг за другом нуклеотидов. Предпочтительно все YYY являются 2'-F-модифицированными нуклеотидами.

В одном варианте N_a и/или N_b содержат модификации с изменяющегося характера.

В одном варианте мотив YYY находится в сайте расщепления или вблизи сайта расщепления смысловой нити. Например, когда РНК-и-средство имеет область дуплекса длиной 17-23 нуклеотида, мотив YYY может находиться в сайте расщепления или вблизи сайта расщепления (например: может находиться в положениях 6, 7, 8; 7, 8, 9; 8, 9, 10; 9, 10, 11; 10, 11, 12 или 11, 12, 13) смысловой нити, при этом нумерация начинается с 1-го нуклеотида от 5'-конца; или необязательно нумерация начинается с 1-ого спаренного нуклеотида в области дуплекса от 5'-конца.

В одном варианте i равен 1 и j равен 0, или i равен 0 и j равен 1, или оба i и j равны 1. Поэтому, смысловую нить может быть представлена следующими формулами:

5' n_p-N_a-YYY-N_b-ZZZ-N_a-n_q 3' (Ib);

5' n_p-N_a-XXX-N_b-YYY-N_a-n_q 3' (Ic); или

5' n_p-N_a-XXX-N_b-YYY-N_b-ZZZ-N_a-n_q 3' (Id).

В том случае, когда смысловая нить представлена формулой (Ib), N_b означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый N_a независимо может означать олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

В том случае, когда смысловая нить представлена формулой (Ic), N_b означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый N_a независимо может означать олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

В том случае, когда смысловая нить представлена формулой (Id), каждый N_b независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Предпочтительно N_b означает 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Каждый N_a независимо может означать олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

Каждый X, Y и Z могут быть одинаковыми или могут отличаться друг от друга.

В других вариантах i равен 0 и j равен 0, и смысловая нить может быть представлена формулой:

5' n_p-N_a-YYY-N_a-n_q 3' (Ia).

В том случае, когда смысловая нить представлена формулой (Ia), каждый N_a независимо может означать олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

В одном варианте последовательность антисмысловой нити РНК-и может быть представлена формулой (II):

5' n_q'-N_a'-(Z'Z'Z')_k-N_b'-Y'Y'Y'-N_b'-(X'X'X')_l-N_a'-n_p' 3' (II)

где:

k и l каждый независимо означают 0 или 1;

p' и q' каждый независимо означают 0-6;

каждый N_a' независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, при этом каждая последовательность содержит, по меньшей мере, два по-разному модифицированных нуклеотида;

каждый N_b' независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 модифицированных нуклеотидов;

каждый n_p' и n_q' независимо означают выступающий нуклеотид;

при этом N_b' и Y' не имеют одной и той же модификации;

и

X'X'X', Y'Y'Y' и Z'Z'Z' каждый независимо означают один мотив из трех идентичных модификаций трех следующих друг за другом нуклеотидов.

В одном варианте N_a' и/или N_b' содержат модификации изменяющегося характера.

Мотив Y'Y'Y' находится в сайте расщепления или вблизи сайта расщепления антисмысловой нити. Например, в том случае, когда РНК-и-средство имеет область дуплекса длиной 17-23 нуклеотида, мотив Y'Y'Y' может находиться в положениях 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14; или 13, 14, 15 антисмысловой нити, при этом нумерация начинается с 1-ого нуклеотида от 5'-конца; или необязательно нумерация начинается с 1-ого спаренного нуклеотида в области дуплекса от 5'-конца. Предпочтительно мотив Y'Y'Y' находится в положениях 11, 12, 13.

В одном варианте все нуклеотиды мотива Y'Y'Y' 2'-OMe-модифицированы.

В одном варианте k равен 1, и l равен 0, или k равен 0 и l равен 1, или оба k и l равны 1.

Таким образом, антисмысловая нить может быть представлена следующими формулами:

5' n_q'-Na'-Z'Z'Z'-N_b'-Y'Y'Y'-N_a'-n_p' 3' (IIb);

5' n_q'-N_a'-Y'Y'Y'-N_b'-X'X'X'-n_p' 3' (IIc); или

5' n_q'-N_a'-Z'Z'Z'-N_b'-Y'Y'Y'-N_b'-X'X'X'-N_a'-n_p' 3′ (IId).

В том случае, когда антисмысловая нить представлена формулой (IIb), N_b' означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый N_a' независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

В том случае, когда антисмысловая нить представлена формулой (IIc), N_b' означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый N_a' независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

В том случае, когда антисмысловая нить представлена формулой (IId), каждый N_b' независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый N_a' независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов. Предпочтительно, N_b означает 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

В других вариантах k равен 0, и l равен 0, и антисмысловая нить может быть представлена формулой:

5' n_p'-N_a'-Y'Y'Y'-N_a'-n_q' 3' (Ia).

В том случае, когда антисмысловая нить представлена формулой (IIa), каждый Na' независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

Каждый из X', Y' и Z' могут быть одинаковыми или могут отличаться друг от друга.

Каждый нуклеотид смысловой нити и антисмысловой нити могут быть независимо модифицированы LNA, HNA, CeNA, 2'-метоксиэтилом, 2'-O-метилом, 2'-O-аллилом, 2'-C-аллилом, 2'-гидроксилом или 2'-фтором. Например, каждый нуклеотид смысловой нити и антисмысловой нити независимо модифицирован 2'-O-метилом или 2'-фтором. В частности, каждый X, Y, Z, X', Y' и Z' может означать модификацию 2'-O-метилом или модификацию 2'-фтором.

В одном варианте смысловая нить РНК-и-средства может содержать мотив YYY, находящийся в положениях 9, 10 и 11 нити, когда область дуплекса имеет длину 21 нуклеотид, при этом нумерация начинается с 1-ого нуклеотида от 5'-конца или необязательно нумерация начинается с 1-ого спаренного нуклеотида в области дуплекса от 5'-конца; и Y означает 2'-F-модификацию. Смысловая нить может дополнительно содержать мотив XXX или мотивы ZZZ, в качестве боковых модификаций на противоположных концах области дуплекса; и XXX и ZZZ каждый независимо означают 2'-Ome-модификацию или 2'-F-модификацию.

В одном варианте антисмысловая нить может содержать мотив Y'Y'Y', находящийся в положениях 11, 12, 13 нити, при этом нумерация начинается с 1-ого нуклеотида от 5'-конца или необязательно нумерация начинается с 1-ого нуклеотида в пределах области дуплекса от 5'-конца; и Y' означает модификацию 2'-O-метилом. Антисмысловая нить может дополнительно содержать мотив X'X'X' или мотивы Z'Z'Z' в качестве боковых модификаций на противоположных концах области дуплекса; и X'X'X' и Z'Z'Z' каждый независимо означают 2'-Ome-модификацию или 2'-F-модификацию.

Смысловая нить, представленная любой из указанных выше формул (Ia), (Ib), (Ic) и (Id), образует дуплекс с антисмысловой нитью, представленной любой из формул (IIa), (IIb), (IIc) и (IId), соответственно.

Соответственно, РНК-и-средства для применения в способах согласно изобретению могут содержать смысловую нить и антисмысловую нить, при этом каждая нить имеет длину от 14 до 30 нуклеотидов, и при этом дуплекс РНК-и представлен формулой (III):

смысловая: 5' n_p-N_a-(X X X)_i-N_b-Y Y Y-N_b-(Z Z Z)_j-N_a-n_q 3'

антисмысловая: 3' n_p'-Na'-(X'X'X')_k-N_b'-Y'Y'Y'-N_b'-(Z'Z'Z')_l-N_a'-n_q' 5'

(III)

где:

i, j, k и l каждый независимо означают 0 или 1;

p, p', q и q' каждый независимо означают 0-6;

каждый N_a и N_a' независимо означают олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, при этом каждая последовательность содержит, по меньшей мере, два по-разному модифицированных нуклеотида;

каждый N_b и N_b' независимо означают олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 модифицированных нуклеотидов;

где

каждый n_p', n_p, n_q' и n_q, каждый из которых может присутствовать или может не присутствовать, независимо означает выступающий нуклеотид; и

XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' и Z'Z'Z' каждый независимо означают один мотив из трех идентичных модификаций трех следующих друг за другом нуклеотидов.

В одном варианте i равен 0 и j равен 0; или i равен 1 и j равен 0; или i равен 0 и j равен 1; или оба i и j равны 0; или оба i и j равны 1. В другом варианте k равен 0 и l равен 0; или k равен 1 и l равен 0; k равен 0 и l равен 1; или оба k и l равны 0; или оба k и l равны 1.

Примеры сочетаний смысловой нити и антисмысловой нити, образующих дуплекс РНК-и, включают приведенные ниже формулы:

5′ np - Na -Y Y Y -Na-nq 3′ 3′ np'-Na'-Y′Y′Y′ -Na'nq' 5′

(IIIa)

5′ np -Na -Y Y Y -Nb -Z Z Z -Na-nq 3′ 3′ np'-Na'-Y′Y′Y′-Nb'-Z′Z′Z′-Na'nq' 5′

(IIIb)

5′ np-Na- X X X -Nb -Y Y Y - Na-nq 3′ 3′ np'-Na'-X′X′X′-Nb'-Y′Y′Y′-Na'-nq' 5′

(IIIc)

5′ np -Na -X X X -Nb-Y Y Y -Nb- Z Z Z -Na-nq 3′ 3′ np'-Na'-X′X′X′-Nb'-Y′Y′Y′-Nb'-Z′Z′Z′-Na-nq' 5′

(IIId)

В том случае, когда РНК-и-средство представлено формулой (IIIa), каждый N_a независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

В том случае, когда РНК-и-средство представлено формулой (IIIb), каждый N_b независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 1-10, 1-7, 1-5 или 1-4 модифицированных нуклеотида. Каждый N_a независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

В том случае, когда РНК-и-средство представлено в виде формулы (IIIc), каждый N_b, N_b' независимо означают олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый N_a независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

В том случае, когда РНК-и-средство представлено в виде формулы (IIId), каждый N_b, N_b' независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый N_a, N_a' независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов. Каждый N_a, N_a', N_b и N_b' независимо содержит модификации изменяющегося характера.

Каждый X, Y и Z в формулах (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId) могут быть одинаковыми или могут отличаться друг от друга.

В том случае, когда РНК-и-средство представлено формулой (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId), по меньшей мере, один из нуклеотидов Y может образовывать пару оснований с одним из нуклеотидов Y'. Альтернативно, по меньшей мере, два из нуклеотидов Y образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Y'; или все три нуклеотида Y образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Y'.

В том случае, когда РНК-и-средство представлено формулой (IIIb) или (IIId), по меньшей мере, один из нуклеотидов Z может образовывать пару оснований с одним из нуклеотидов Z'. Альтернативно, по меньшей мере, два нуклеотида Z образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Z'; или все три нуклеотида Z образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Z'.

В том случае, когда РНК-и-средство представлено в виде формулы (IIIc) или (IIId), по меньшей мере, один из нуклеотидов X может образовывать пару оснований с одним из нуклеотидов X'. Альтернативно, по меньшей мере, два из нуклеотидов X образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами X'; или все три нуклеотида X образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами X'.

В одном варианте модификация нуклеотида Y отличается от модификации нуклеотида Y', модификация нуклеотида Z отличается от модификации нуклеотида Z' и/или модификация нуклеотида X отличается от модификации нуклеотида X'.

В одном варианте в том случае, когда РНК-и-средство представлено формулой (IIId), модификации N_a представляют собой модификации 2'-O-метилом или 2'-фтором. В другом варианте в том случае, когда РНК-и-средство представлено формулой (IIId), модификации N_a представляют собой модификации 2'-O-метилом или 2'-фтором и n_p' > 0 и, по меньшей мере, один n_p' связан с соседним нуклеотидом фосфоротиоатной связью. В еще одном варианте в том случае, когда РНК-и-средство представлено формулой (IIId), модификации N_a представляют собой модификации 2'-O-метилом или 2'-фтором, n_p' > 0 и, по меньшей мере, один n_p' связан с соседним нуклеотидом фосфоротиоатной связью, и смысловая нить конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, связанными бивалентным или трехвалентным разветвленным линкером. В другом варианте в том случае, когда РНК-и-средство представлено формулой (IIId), модификации N_a представляют собой модификации 2'-O-метилом или 2'-фтором, n_p' > 0 и, по меньшей мере, один n_p' связан с соседним нуклеотидом фосфоротиоатной связью, смысловая нить содержит, по меньшей мере, одну фосфоротиоатную связь, и смысловая нить конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, связанными бивалентным или трехвалентным разветвленным линкером.

В одном варианте в том случае, когда РНК-и-средство представлено формулой (IIIa), модификации N_a представляют собой представляют собой модификации 2'-O-метилом или 2'-фтором, n_p' > 0 и, по меньшей мере, один n_p' связан с соседним нуклеотидом фосфоротиоатной связью, смысловая нить содержит, по меньшей мере, одну фосфоротиоатную связь, и смысловая нить конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, связанными бивалентным или трехвалентным разветвленным линкером.

В одном варианте РНК-и-средство является мультимером, содержащим, по меньшей мере, два дуплекса, представленных формулами (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId), при этом дуплексы связаны линкером. Линкер может быть расщепляемым или нерасщепляемым. Необязательно мультимер дополнительно содержит лиганд. Дуплексы могут иметь в качестве мишени один и тот же ген или два разных гена; или каждый из дуплексов может иметь в качестве мишени один и тот же ген, но два разных сайта-мишени.

В одном варианте РНК-и-средство является мультимером, содержащим три, четыре, пять, шесть или больше дуплексов, представленных формулами (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId), при этом дуплексы связаны линкером. Линкер может быть расщепляемым или нерасщепляемым. Необязательно мультимер дополнительно содержит лиганд. Дуплексы могут иметь в качестве мишени один и тот же ген или два разных гена; или дуплексы могут иметь в качестве мишени один и тот же ген, но два разных сайта-мишени.

В одном варианте два РНК-и-средства, представленные формулами (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId) связаны друг с другом на 5'-конце и одном или обоих 3'-концах и необязательно конъюгированы с лигандом. Средства могут иметь в качестве мишени один и тот же ген или два разных гена; или средства могут иметь в качестве мишени один и тот же ген, но два разных сайта-мишени.

Конъюгаты и-РНК

и-РНК-средства, раскрытые в настоящем описании, могут быть в форме конъюгатов. Конъюгат может быть связан в любом подходящем положении в молекуле и-РНК, например, на 3'-конце или 5'-конце смысловой или антисмысловой нити. Конъюгаты необязательно связаны через линкер.

В некоторых вариантах и-РНК-средство, описанное в настоящей публикации, химически связано с одним или несколькими лигандами, остатками или конъюгатами, которые могут придавать функциональность, например, влияя (например, усиливая) на активность, распределение в клетке или захват и-РНК клеткой. Такие остатки включают без ограничения липидные остатки, такие как остаток холестерина (Letsinger с соавторами, Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556), холевой кислоты (Manoharan с соавторами, Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4: 1053-1060), тиоэфира, например, берил-S-тритилтиола (Manoharan с соавторами, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan с соавторами, Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3: 2765-2770), тиохолестерина (Oberhauser с соавторами, Nucl. Acids Res., 1992, 20: 533-538), алифатической цепи, например, остатки додекандиола или ундецила (Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54), фосфолипида, например, дигексадецил-рац-глицерина или 1,2-ди-O-гексадецил-рац-глицеро-3-фосфоната триэтиламмония (Manoharan с соавторами, Tetrahedron Lett., 1995, 36: 3651-3654; Shea с соавторами, Nucl. Acids Res., 1990, 18: 3777-3783), полиамина или цепи полиэтиленгликоля (Manoharan с соавторами, Nucleosides and Nucleotides, 1995, 14: 969-973) или адамантануксусной кислоты (Manoharan с соавторами, Tetrahedron Lett., 1995, 36: 3651-3654), остатка пальмитила (Mishra с соавторами, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264: 229-237) или остатка окстадециламина или остатка гексиламинокарбонилоксихолестерина (Crooke с соавторами, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277: 923-937).

В одном варианте лиганд изменяет распределение, целенаправленное действие или время жизни и-РНК-средства, в которое он включен. В некоторых вариантах лиганд обеспечивает повышенную аффинность по отношению к выбранной мишени, например, молекуле, клетке или типу клеток, компартменту, например, клеточному или органному компартменту, ткани, органу или области тела, например, по сравнению с видами, в которых такой лиганд отсутствует. Типичные лиганды не будут принимать участия в спаривании дуплекса в образующей дуплекс нуклеиновой кислоте.

Лиганды могут включать встречающиеся в природе вещество, такое как белок (например, сывороточный альбумин человека (HSA), липопротеид низкой плотности (ЛПНП) или глобулин); углевод (например, декстран, пуллулан, хитин, хитозан, инулин, циклодекстрин или гиалуроновая кислота); или липид. Лиганд также может представлять собой рекомбинантную или синтетическую молекулу, такую как синтетический полимер, например, синтетическая полиаминокислота. Примеры полиаминокислот включают полиаминокислоту полилизин (PLL), поли-L-аспарагиновую кислоту, поли-L-глутаминовую кислоту, сополимер стирола-ангидрида малеиновой кислоты, сополимер поли(L-лактид-гликолид), сополимер дивиниловый эфир-малеиновый ангидрид, сополимер N-(2- гидроксипропил)метакриламид (HMPA), полиэтиленгликоль (ПЭГ), поливиниловый спирт (PVA), полиуретан, поли(2-этилакриловую кислоту), полимеры N-изопропилакриламида или полифосфазин. Примеры полиаминов включают: полиэтиленимин, полилизин (PLL), спермин, спермидин, полиамин, полиаминовый псевдопептид, полиаминовый пептидомиметик, дендримерный полиамин, аргинин, амидин, протамин, катионный липид, катионный порфирин, четвертичную соль полиамина или α-спиральный пептид.

Лиганды также могут содержать направляющие к мишени группы, например, средство, направляющее к клетке или ткани в качестве мишени, например, лектин, гликопротеид, липид или белок, например, антитело, которое связывается с конкретным типом клеток, таким как клетка почки. Направляющая к мишени группа может представлять собой тиротропин, меланотропин, лектин, гликопротеид, поверхностно-активный белок A, углевод муцин, поливалентную лактозу, поливалентную галактозу, N-ацетилгалактозамин, N-ацетилглюкозамин, поливалентную маннозу, поливалентную фукозу, гликозилированные полиаминокислоты, поливалентную галактозу, трансферрин, бисфосфонат, полиглютамат, полиаспартат, липид, холестерин, стероид, желчную кислоту, фолат, витамин B12, биотин или пептид RGD или миметик пептида RGD.

В некоторых вариантах лигандом является лиганд GalNAc, который содержит одно или несколько производных N-ацетилгалактозамина (GalNAc). Дополнительное описание лигандов GalNAc представлено в разделе, озаглавленном «Конъюгаты с углеводами».

Другие примеры лигандов включают красители, интеркаляторы (например акридины), поперечные линкеры (например, псорален, митомицин C), порфирины (TPPC4, тексафирин, сапфирин), полициклические ароматические углеводороды (например, феназин, дигидрофеназин), искусственные эндонуклеазы (например EDTA), липофильные молекулы, например, холестерин, холевую кислоту, адамантануксусную кислоту, 1-пиренмасляную кислоту, дигидротестостерон, 1,3-бис-O(гексадецил)глицерин, жеранилоксигексильную группу, гексадецилглицерин, борнеол, ментол, 1,3-пропандиол, гептадецильную группу, пальмитиновую кислоту, миристиновую кислоту, O3-(олеоил)литохолевую кислоту, O3-(олеоил)холеновую кислоту, диметокситритил или феноксазин) и конъюгаты пептидов (например, пептида antennapedia, пептида Tat), алкилирующие агенты, фосфат, амино-, меркапто-, ПЭГ (например, ПЭГ-40K), MPEG, [MPEG]₂, полиамино-, алкил, замещенный алкил, радиоактивно меченые маркеры, ферменты, гаптены (например, биотин), средства, облегчающие транспорт/всасывание (например, аспирин, витамин E, фолиевую кислоту), синтетические рибонуклеазы (например, имидазол, бисимидазол, гистамин, кластеры имидазола, конъюгаты акридина-имидазола, комплексы Eu3+ тетраазамакроциклов), динитрофенил, HRP или AP.

Лиганды могут представлять собой белки, например, гликопротеиды, или пептиды, например, молекулы, обладающие специфичной аффинностью по отношению к колиганду, или антитела, например, антитело, которое связывается с конкретным типом клеток, таким как раковая клетка, эндотелиальная клетка или костная клетка. Лиганды также могут включать гормоны и рецепторы гормонов. Лиганды также могут включать непептидные формы, такие как липиды, лектины, углеводы, витамины, кофакторы, поливалентная лактоза, поливалентная галактоза, N-ацетилгалактозамин, N-ацетилглукозамин, поливалентная манноза или поливалентная фукоза. Лигандом может быть, например, липополисахарид, активатор MAP-киназы p38 или активатор NF-κB.

Лигандом может быть вещество, например, лекарственное средство, которое может увеличивать захват и-РНК-средства в клетку, например, за счет разрушения клеточного цитоскелета, например, за счет разрушения клеточных микротрубочек, микрофиламентов и/или промежуточных филаментов. Лекарственным средством может быть, например, таксол, винкристин, винбластин, цитохалазин, нокодазол, джаплакинолид, латрункулин A, фаллоидин, свинхолид A, инданоцин или миосервин.

В некоторых вариантах лиганд, связанный с и-РНК, которая описана в настоящей публикации, действует в качестве фармакокинетического модулятора (ФК-модулятора). ФК-модуляторы включают липофильные вещества, желчные кислоты, стероиды, аналоги фосфолипидов, пептиды, связывающие белки средства, ПЭГ, витамины и т.д.. Примеры ФК-модуляторов включают без ограничения холестерин, жирные кислоты, холевую кислоту, литохолевую кислоту, диалкилглицериды, диацилглицерид, фосфолипиды, сфингодипиды, напроксен, ибупрофен, витамин E, биотин и т.д.. Также известно, что олигонуклеотиды, которые содержат множество фосфоротиоатных связей, связываются с сывороточным белком, таким образом, короткие олигонуклеотиды, например, олигонуклеотиды длиной примерно 5 оснований, 10 оснований, 15 оснований или 20 оснований, содержащие множество фосфоротиоатных связей в остове, также приемлемы для настоящего изобретения в качестве лигандов (например, в качестве ФК-модулирующих лигандов). Кроме того, аптамеры, которые связывают компоненты сыворотки (например, сывороточные белки) также подходят для применения в качестве ФК-модулирующих лигандов в вариантах, описанных в настоящей публикации.

Конъюгированные с лигандом олигонуклеотиды согласно изобретению могут быть синтезированы с использованием олигонуклеотида, который несет боковую реакционно-способную функциональную группу, такую как функциональная группа, полученная в результате связывания линкерной молекулы с олигонуклеотидом (описанным ниже). Такой реакционно-способный олигонуклеотид может непосредственно взаимодействовать с коммерчески доступными лигандами, лигандами, которые синтезируют, несущими любую из множества защитных групп, или лигандами, которые имеют связанный с ними линкерный остаток.

Олигонуклеотиды, используемые в конъюгатах согласно настоящему изобретению, могут быть получены удобным и обычным образом с применением хорошо известных способов твердофазного синтеза. Оборудование для такого синтеза продается несколькими поставщиками, включая, например, Applied Biosystems (Foster City, Calif.). Дополнительно или альтернативно можно применять любые другие способы такого синтеза, известные в данной области. Также известно применение сходных способов для получения других олигонуклеотидов, таких как фосфоротиоаты и алкилированные производные.

В случае конъюгированных с лигандами олигонуклеотидов и несущих молекулу лиганда связанных в специфичную последовательность нуклеозидов согласно настоящему изобретению, олигонуклеотиды и олигонуклеозиды могут быть собраны на подходящем ДНК-синтезаторе с использованием стандартных предшественников нуклеотидов или нуклеозидов или предшественников конъюгатов нуклеотидов или нуклеозидов, которые уже несут связывающий остаток, предшественников лиганд-нуклеотидов или нуклеозидных конъюгатов, которые уже несут молекулу лиганда, или строительных блоков, несущих ненуклеозидные лиганды.

В случае использования предшественников нуклеотидных конъюгатов, которые уже несут линкерный остаток, обычно осуществляют синтез связанных в специфичную последовательность нуклеозидов и затем молекулу лиганда подвергают взаимодействию с линкерным остатком с образованием конъюгированного с лигандом олигонуклеотида. В некоторых вариантах олигонуклеотиды или связанные нуклеозиды согласно настоящему изобретению синтезируют с помощью автоматического синтезатора, используя фосфорамидиты, полученные из конъюгатов лиганд-нуклеозид, в дополнение в стандартным фосфорамидитам и нестандартным фосфорамидитам, которые коммерчески доступны и которые обычно используют для синтеза олигонуклеотидов.

Конъюгаты с липидами

В одном варианте лиганд является липидом или основанной на липиде молекулой. Такой липид или основанная на липиде молекула обычно может связываться с сывороточным белком, таким как сывороточный альбумин человека (HAS). Лиганд, связывающий HSA, обеспечивает возможность распределения конъюгата в ткань-мишень, например, непочечную ткань-мишень организма. Например, тканью-мишенью может быть печень, включая паренхиматозные клетки печени. В качестве лигандов также можно использовать другие молекулы, которые могут связываться с HSA. Например, можно использовать непроксин или аспирин. Липид или лиганд на основе липида могут (a) повышать устойчивость конъюгата к разложению, (b) улучшать направление к мишени или транспорт в клетку-мишень или клеточную мембрану, и/или (c) можно использовать для регуляции связывания с белком сыворотки, например, HSA.

Лиганд на основе липидов можно использовать для того, чтобы модулировать, например, контролировать (например, ингибировать) связывание конъюгата с тканью-мишенью. Например, липид или лиганд на основе липидов, который связывает с HSA более прочно, будет с меньшей вероятностью прицельно направлен в почки и, следовательно, с меньшей вероятностью будет выводиться из организма. Липид или лиганд на основе липидов, который связывается с HSA менее прочно, можно использовать для того, чтобы прицельно направить конъюгат в почки.

В одном варианте лиганд, основанный на липиде, связывается с HSA. Например, лиганд может связывать HSA с аффинностью, достаточной для того, чтобы усилить распределение конъюгата в непочечную ткань. Однако обычно аффинность не настолько высокая, чтобы связывание HAS с лигандом не могло быть обратимым.

В другом варианте лиганд, основанный на липиде, связывает HSA слабо или совсем не связывает, так что распределение конъюгата в почки усиливается. Другие остатки, которые нацеливают в почечные клетки, также можно использовать вместо или дополнительно к лиганду, основанному на липиде.

В другом аспекте лиганд представляет собой остаток, например витамин, который захватывается клеткой-мишенью, например пролиферирующей клеткой. Такие лиганды особенно применимы для лечения расстройств, характеризующихся нежелательной клеточной пролиферацией, например, злокачественного или доброкачественного типа, например раковых клеток. Примеры витаминов включают витамин A, E и K. Другие примеры витаминов включают витамин B, например фолиевую кислоту, B₁₂, рибофлавин, биотин, пиридоксаль или другие витамины или питательные вещества, захватываемые раковыми клетками. Также включены HSA и липопротеид низкой плотности (ЛПНП).

Средства для проникновения в клетку

В другом аспекте лиганд представляет собой средство для проникновения в клетку, предпочтительно спиральное средство для проникновения в клетку. В одном варианте средство является амфипатическим. Примером средства является пептид, такой как tat или antennopedia. Если средство представляет собой пептид, то оно может быть модифицировано, включая пептидилмиметики, инвертомеры, непептидные или псевдопептидные связи и применение D-аминокислот. Спиральное средство предпочтительно представляет собой средство в форме α-спирали и оно может иметь липофильную и липофобную фазу.

Лигандом может быть пептид или пептидомиметик. Пептидомиметик (также называемый в настоящем описании олигопептидомиметиком) представляет собой молекулу, способную укладываться в определенную трехмерную структуру, сходную со структурой природного пептида. Связывание пептида пептидомиметиков с и-РНК-средствами может влиять на фармакокинетическое распределение и-РНК, например за счет усиления клеточного распознавания и всасывания. Остаток пептида или пептидомиметика может иметь длину примерно 5-50 аминокислот, например, длиной примерно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 аминокислот.

Пептидом или пептидомиметиком может быть, например, пептид для проникновения в клетку, катионный пептид, амфипатический пептид или гидрофобный пептид (например, состоящий, главным образом, из Tyr, Trp или Phe). Пептидный остаток может представлять собой дендримерный пептид, конформационно ограниченный пептид или поперечно сшитый пептид. В другом альтернативном варианте пептидный остаток может содержать гидрофобную последовательность транслокации через мембрану (MTS). Примером пептида, содержащего гидрофобную MTS, является RFGF, имеющий аминокислотную последовательность AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 3367). Аналог RFGF (например, аминокислотная последовательность AALLPVLLAAP (SEQ ID NO: 3368)), содержащий гидрофобную MTS, также может быть направляющим к мишени остатком. Пептидный остаток может представлять собой пептид «для доставки», который может нести крупные полярные молекулы, включая пептиды, олигонуклеотиды и белок, через клеточные мембраны. Например, было обнаружено, что последовательности из белка Tat ВИЧ (GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 3369)) и белка Antennapedia Drosophila (RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 3370)) способны функционировать в качестве пептидов для доставки. Пептид или пептидомиметик могут кодироваться случайной последовательностью ДНК, например, как пептид, идентифицированный из библиотеки в фаговом дисплее или комбинаторной библиотеки «один шарик-одно соединение» (OBOC) (Lam с соавторами, Nature, 354: 82-84, 1991). Обычно пептид или пептидомиметик, связанный с днРНК-средством через включенную мономерную единицу, является направляющим в клетку-мишень пептидом, таким как пептид аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (RGD) или миметик RGD. Пептидный остаток может иметь длину в диапазоне примерно от 5 аминокислот до примерно 40 аминокислот. Пептидные остатки могут иметь структурную модификацию, в частности для повышения стабильности или прямых конформационных свойств. Можно использовать любую из структурных модификаций, описанных ниже.

Пептид RGD для применения в композициях и способах согласно изобретению может быть линейным или циклическим и может быть модифицированным, например, гликозилированным или метилированным, чтобы облегчить нацеливание на конкретную ткань (ткани). RGD-содержащие пептиды и пептидомиметики могут содержать D-аминокислоты, а также синтетические миметики RGD. Кроме RGD можно использовать другие остатки, мишенью которых является лиганд интегрин. Мишенью предпочтительных конъюгатов такого лиганда является PECAM-1 или VEGF.

Пептидный остаток RGD можно использовать для целенаправленного действия на конкретный тип клеток, например, опухолевую клетку, такую как эндотелиальная опухолевая клетка или клетка рака молочной железы (Zitzmann с соавторами, Cancer Res., 62: 5139-43, 2002). Пептид RGD может облегчать целенаправленное действие днРНК-средства на опухоли множества других тканей, включая легкое, почки, селезенку или печень (Aoki с соавторами, Cancer Gene Therapy 8: 783-787, 2001). Обычно пептид RGD может способствовать целенаправленному действию и-РНК-средства на почки. Пептид RGD может быть линейным или циклическим, и может быть модифицирован, например, гликозилирован или метилирован для облегчения целенаправленного действия на конкретные ткани. Например, гликозилированный пептид RGD может доставлять и-РНК-средство к опухолевой клетке, экспрессирующей α_vβ₃ (Haubner с соавторами, Jour. Nucl. Med., 42: 326-336, 2001).

«Пептид для проникновения в клетку» способен обеспечивать проницаемость клетки, например, клетки микроорганизма, такой как бактериальная клетка или клетка гриба, или клетки млекопитающего, такой как клетка человека. Пептид для проницаемости клеток микроорганизмов может представлять собой, например, α-спиральный линейный пептид (например, LL-37 или церопорин PI), пептид, содержащий дисульфидную связь (например, α-дефензин, β-дефензин или бактенецин), или пептид, содержащий только одну или две преобладающие аминокислоты (например, PR-39 или индолицидин). Пептид для проникновения в клетку также может содержать сигнал ядерной локализации (NLS). Например, пептид для проникновения в клетку может представлять собой состоящий из двух частей амфипатический пептид, такой как MPG, который получен из слитого пептидного домена gp41 ВИЧ-1 и NLS большого T-антигена SV40 (Simeoni с соавторами, Nucl. Acids Res. 31: 2717-2724, 2003).

Конъюгаты с углеводами

В некоторых вариантах композиций и способов согласно изобретению олигонуклеотид и-РНК дополнительно содержит углевод. Конъюгированные с углеводами и-РНК являются предпочтительными для доставки in vivo нуклеиновых кислот, а также композиций, подходящих для терапевтического применения in vivo, которые описаны в настоящей публикации. В используемом в настоящем описании смысле «углевод» относится к соединению, которое является либо углеводом как таковым, состоящим из одной или нескольких моносахаридных единиц, имеющих, по меньшей мере, 6 атомов углерода (который может быть линейным, разветвленным или циклическим), при этом с каждым атомом углерода связан атом кислорода, азота или серы; либо соединением, имеющим в качестве его части остаток углевода, состоящий из одной или нескольких моносахаридных единиц, каждая из которых имеет, по меньшей мере, шесть атомов углерода (который может быть линейным, разветвленным или циклическим), при этом с каждым атомом углерода связан атом кислорода, азота или серы. Соответствующие углеводы включают сахара (моно-, ди-, три- и олигосахариды, содержащие примерно 4, 5, 6, 7, 8 или 9 моносахаридных единиц), и полисахариды, такие как крахмалы, гликоген, целлюлоза и полисахаридные камеди. Конкретные моносахариды включают C5-сахара и выше (например, C5, C6, C7 или C8); ди- и трисахариды включают сахара, имеющие две или три моносахаридных единицы (например, C5, C6, C7 или C8).

В одном варианте конъюгат с углеводом содержит моносахарид. В одном варианте моносахаридом является N-ацетилгалактозамин (GalNAc). GalNAc-конъюгаты описаны, например, в патенте США № 8106022, полное содержание которого включено в настоящее описание в виде ссылки. В некоторых вариантах GalNAc-конъюгат служит в качестве лиганда, который направляет и-РНК к конкретным клеткам. В некоторых вариантах GalNAc-конъюгат направляет и-РНК в клетки печени, например, за счет того, что он служит в качестве лиганда рецептора асиалогликопротеида клеток печени (например, гепатоцитов).

В некоторых вариантах углеводный конъюгат содержит одно или несколько производных GalNAc. Производные GalNAc могут быть связаны через линкер, например, бивалентный или трехвалентный разветвленный линкер. В некоторых вариантах GalNAc-конъюгат конъюгирован с 3'-концом смысловой нити. В некоторых вариантах GalNac-конъюгат конъюгирован с и-РНК-средством (например, с 3'-концом смысловой нити) через линкер, например, линкер, который описан в настоящей публикации.

В некоторых вариантах GalNAc-конъюгат представляет собой

В некоторых вариантах РНК-и-средство связано в конъюгате с углеводом через линкер, который показан на следующей схеме, где X означает O или S.

В некоторых вариантах РНК-и-средство конъюгировано с L96, который определен в таблице 1 и показан ниже

В некоторых вариантах углеводный конъюгат для применения в композициях и способах согласно изобретению выбран из группы, состоящей из:

Другой типичный углеводный конъюгат для применения в вариантах, описанных в настоящей публикации, включает без ограничения

(формула XXIII), где один из X или Y означает олигонуклеотид, а другой означает водород.

В некоторых вариантах углеводный конъюгат дополнительно содержит один или несколько дополнительных лигандов, которые описаны выше, например, но без ограничения ФК-модулятор и/или пептид для проникновения в клетку.

В одном варианте и-РНК согласно изобретению конъюгирована с углеводом через линкер. Не ограничивающие примеры и-РНК-углеводных конъюгатов с линкерами в композициях и способы согласно изобретению включают без ограничения

(формула XXX), где один из X или Y означает олигонуклеотид, а другой означает водород.

Линкеры

В некоторых вариантах конъюгат или лиганд, описанный в настоящей публикации, может быть связан с олигонуклеотидом и-РНК с использованием различных линкеров, которые могут быть расщепляемыми или нерасщепляемыми.

Термин «линкер» или «линкерная группа» означает органический остаток, который связывает две части соединения, например, ковалентно связывает две части соединения. Линкеры обычно содержат непосредственную связь или такой атом как атом кислорода или серы, такую единицу как NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO₂, SO₂NH или цепь из атомов, такую как без ограничения замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный алкенил, замещенный или незамещенный алкинил, арилалкил, арилалкенил, арилалкинил, гетероарилалкил, гетероарилалкенил, гетероарилалкинил, гетероциклилалкил, гетероциклилалкенил, гетероциклилалкинил, арил, гетероарил, гетероциклил, циклоалкил, циклоалкенил, алкиларилалкил, алкиларилалкенил, алкиларилалкинил, алкениларилалкил, алкениларилалкенил, алкениларилалкинил, алкиниларилалкил, алкиниларилалкенил, алкиниларилалкинил, алкилгетероарилалкил, алкилгетероарилалкенил, алкилгетероарилалкинил, алкенилгетероарилалкил, алкенилгетероарилалкенил, алкенилгетероарилалкинил, алкинилгетероарилалкил, алкинилгетероарилалкенил, алкинилгетероарилалкинил, алкилгетероциклилалкил, алкилгетероциклилалкенил, алкилгетероциклилалкинил, алкенилгетероциклилалкил, алкенилгетероциклилалкенил, алкенилгетероциклилалкинил, алкинилгетероциклилалкил, алкинилгетероциклилалкенил, алкинилгетероциклилалкинил, алкиларил, алкениларил, алкиниларил, алкилгетероарил, алкенилгетероарил, алкинилгетероарил, при этом один или несколько метиленов могут быть прерваны или иметь на конце O, S, S(O), SO₂, N(R8), C(O), замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенный или незамещенный гетероцикл; где R8 означает водород, ацил, алифатическую или замещенную алифатическую группу. В одном варианте линкер содержит примерно 1-24 атома, 2-24, 3-24, 4-24, 5-24, 6-24, 6-18, 7-18, 8-18 атомов, 7-17, 8-17, 6-16, 7-16 или 8-16 атомов.

В одном варианте днРНК согласно изобретению конъюгирована с бивалентным или трехвалентным разветвленным линкером, выбранным из группы структур, показанных в любой из формул (XXXI) - (XXXIV):

где:

q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B и q5C независимо в каждом случае означают 0-20, и где повторяющиеся единицы могут быть одинаковыми или разными;

P^2A, P^2B, P^3A, P^3B, P^4A, P^4B, P^5A, P^5B, P^5C, T^2A, T^2B, T^3A, T^3B, T^4A, T^4B, T^5A, T^5B, T^5C независимо в каждом случае отсутствуют, означают CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH₂, CH₂NH или CH₂O;

Q^2A, Q^2B, Q^3A, Q^3B, Q^4A, Q^4B, Q^5A, Q^5B, Q^5C независимо в каждом случае отсутствуют, означают алкилен, замещенный алкилен, где один или несколько метиленов могут быть прерваны или иметь на конце один или несколько из O, S, S(O), SO₂, N(R^N), C(R')=C(R”), C≡С или C(O);

R^2A, R^2B, R^3A, R^3B, R^4A, R^4B, R^5A, R^5B, R^5C каждый независимо в каждом случае отсутствует, означает NH, O, S, CH₂, C(O)0, C(O)NH, NHCH(R^a)C(O), -C(O)-CH(R^a)-NH-, CO, CH=N-0,

или гетероциклил;

L^2A, L^2B, L^3A, L^3B, L^4A, L^4B, L^5A, L^5B и L^5C означают лиганд; т.е. каждый независимо в каждом случае означает моносахарид (такой как GalNAc), дисахарид, трисахарид, тетрасахарид, олигосахарид или полисахарид; и R^a означает H или боковую цепь аминокислоты. Трехвалентный конъюгируемые производные GalNAc особенно полезны в случае применения с РНК-и-средствами для ингибирования экспрессии гена-мишени, такие как соединения формулы (XXXV):

Формула XXXV

где L^5A, L^5B и L^5C означают моносахарид, такой как производное GalNAc.

Примеры подходящих бивалентных и трехвалентных разветвленных линкерных групп конъюгируемых производных GalNAc включают без ограничения структуры, перечисленные выше, представленные формулами II, VII, XI, X и XIII.

Расщепляемой линкерной группой является группа, которая в достаточной мере стабильна вне клетки, но которая при проникновении в клетку-мишень расщепляется, высвобождая две части, удерживаемые вместе в линкере. В предпочтительном варианте расщепляемая линкерная группа расщепляется, по меньшей мере, примерно в 10 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз или больше или, по меньшей мере, примерно в 100 раз быстрее в клетке-мишени или в определенных эталонных условиях (которые могут быть, например, выбраны для того, чтобы имитировать или представить условия внутри клетки), чем в крови субъекта или в случае других эталонных условий (которые могут быть, например, выбраны для того, чтобы имитировать или представить условия, встречающиеся в крови или сыворотке).

Расщепляемые линкерные группы чувствительны к расщепляющим агентам, например, pH, окислительно-восстановительному потенциалу или присутствию вызывающих распад молекул. Обычно расщепляющие агенты преобладают или встречаются на более высоких уровнях или с более высокими активностями внутри клеток, чем в сыворотке или крови. Примеры таких агентов, вызывающих распад, включают: окислительно-восстановительные агенты, которые выбраны для конкретных субстратов или которые не обладают субстратной специфичностью, включая, например, окислительные или восстановительные ферменты или такие восстановители, как меркаптаны, которые присутствуют в клетках, которые могут вызывать распад расщепляемых в реакции окисления-восстановления линкерных групп в результате восстановления; эстеразы; эндосомы или средства, которые могут создавать кислую среду, например, средства, которые приводят к значению pH пять или ниже; ферменты, которые могут гидролизовать или приводить к распаду расщепляемой кислотами линкерной группы, действуя как обычная кислота, пептидазы (которые могут обладать субстратной специфичностью) и фосфатазы.

Расщепляемая линкерная группа, такая как дисульфидная связь, может быть чувствительной к pH. Значение pH сыворотки человека равно 7,4, тогда как среднее значение внутриклеточного pH немного ниже в диапазоне примерно от 7,1 до 7,3. Эндосомы имеют более кислое значение pH, в диапазоне 5,5-6,0, и лизосомы имеют еще более кислый pH около 5,0. Некоторые линкеры будут иметь расщепляемую линкерную группу, которая расщепляется при предпочтительном значении pH, высвобождая при этом катионный липид из лиганда в клетку или в требуемый компартмент клетки.

Линкер может содержать расщепляемую линкерную группу, которая расщепляется конкретным ферментом. Тип расщепляемой линкерной группы, включенной в линкер, может зависеть от клетки, которая является мишенью. Например, направляющий в печень лиганд может быть связан с катионным липидом через линкер, который содержит сложноэфирную группу. Клетки печени богаты эстеразами, и поэтому линкер будет расщепляться более эффективно в клетках печени, чем в типах клеток, которые не богаты эстеразами. Другие типы клеток, богатых эстеразами, включают клетки легкого, коркового вещества почки и семенников.

Линкеры, которые содержат пептидные связи, можно использовать в том случае, когда типы клеток-мишеней богаты пептидазами, такие как клетки печени и синовиоциты.

В общем, чувствительность расщепляемых линкерных групп-кандидатов можно оценить, тестируя способность вызывающего распад агента (или условия) расщеплять выбранную для исследования линкерную группу. Также может требоваться тестирование выбранной для исследования линкерной группы в отношении способности быть резистентной к расщеплению в крови или в случае контакта с другой тканью, не являющейся мишенью. Таким образом, можно определить относительную чувствительность к расщеплению в случае первого и второго условия, при этом первое выбирают так, чтобы оно указывало на расщепление в клетке-мишени, а второе выбирают так, чтобы оно указывало на расщепление в других тканях или биологических жидкостях, например, в крови или сыворотке. Оценки можно осуществлять в бесклеточных системах, в клетках, в культуре клеток, в культуре органа или ткани или в целом организме животного. Могут быть полезными начальные оценки в бесклеточных условиях или в условиях культуры и для подтверждения дальнейшие оценки в целом организме животного. В предпочтительных вариантах применимые выбранные для исследования соединения расщепляются, по меньшей мере, примерно в 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или примерно 100 раз быстрее в клетке (или в условиях in vitro, выбранных с целью имитации внутриклеточных условий) по сравнению с кровью или сывороткой (или в условиях in vitro, выбранных с целью имитации внеклеточных условий).

Расщепляемые при окислении-восстановлении линкерные группы

В одном варианте расщепляемая линкерная группа представляет собой расщепляемую при окислении-восстановлении линкерную группу, которая расщепляется при восстановлении или окислении. Примером расщепляемой при восстановлении линкерной группы является дисульфидная линкерная группа (-S-S-). Чтобы определить, является ли выбранная для исследования расщепляемая линкерная группа подходящей «расщепляемой при восстановлении линкерной группой» или, например, подходящей для применения с конкретным остатком и-РНК и конкретным направляющим к мишени агентом, можно обратиться к способам, описанным в настоящей публикации. Например, кандидата можно оценивать посредством инкубации с дитиотреитолом (DTT) или другим восстановителем, используя реагенты, известные в данной области, которые имитируют скорость расщепления, которую можно наблюдать в клетке, например, в клетке-мишени. Выбранных для исследования кандидатов также можно оценивать в условиях, которые выбирают так, чтобы имитировать условия в крови или сыворотке. В одном варианте выбранные для исследования соединения расщепляются не больше чем примерно на 10% в крови. В других вариантах полезные выбранные для исследования соединения распадаются, по меньшей мере, примерно в 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или примерно в 100 раз быстрее в клетке (или в условиях in vitro, выбранных так, чтобы они имитировали внутриклеточные условия) по сравнению с кровью (или в условиях in vitro, выбранных так, чтобы они имитировали внутриклеточные условия). Скорость расщепления выбранных для исследования соединений также можно определить, используя стандартные ферментативные кинетические анализы в условиях, выбранных так, чтобы они имитировали внутриклеточную среду, и сравнивая с условиями, выбранными так, чтобы они имитировали внеклеточную среду.

Основанные на фосфате расщепляемые линкерные группы

В другом варианте расщепляемый линкер содержит основанную на фосфате расщепляемую линкерную группу. Основанная на фосфате расщепляемая линкерная группа расщепляется агентами, которые или вызывают распад или гидролизируют фосфатную группу. Примерами средства, которое расщепляет фосфатные группы в клетках, являются ферменты, такие как фосфатаза в клетках. Примерами основанных на фосфате линкерных групп являются -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)(Rk)-S-. Предпочтительными вариантами являются -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -0-P(S)(H)-0-, -S-P(O)(H)-0, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-. Предпочтительным вариантом является -O-P(O)(OH)-O-. Указанные выбранные для исследования кандидаты можно оценить, используя способы, аналогичные описанным выше способам.

Расщепляемая кислотой линкерная группа

В другом варианте расщепляемый линкер содержит расщепляемую кислотой линкерную группу. Расщепляемая кислотой линкерная группа представляет собой группу, которая расщепляется в кислых условиях. В предпочтительных вариантах расщепляемые кислотой линкерные группы расщепляются в кислой среде с pH примерно 6,5 или ниже (например, примерно 6,0, 5,75, 5,5, 5,25, 5,0 или ниже) или такими агентами, как ферменты, которые могут действовать как обычная кислота. В клетке специальные органеллы с низким pH, такие как эндосомы и лизосомы, могут обеспечивать среду для расщепления расщепляемых кислотой линкерных групп. Примеры расщепляемых кислотой линкерных групп включают без ограничения гидразоны, сложные эфиры и сложные эфиры аминокислот. Расщепляемые кислотой группы могут иметь общую формулу -C=NN-, C(O)O или -OC(O). Предпочтительным вариантом в том случае, когда атом углерода связан с атомом кислорода сложного эфира (алкоксигруппа) является арильная группа, замещенная алкильная группа или третичная алкильная группа, такая как диметилпентил или трет-бутил. Такие кандидаты можно оценить, используя способы, аналогичные описанным выше способам.

Основанные на сложных эфирах расщепляемые линкерные группы

В другом варианте расщепляемый линкер содержит основанную на сложном эфире расщепляемую линкерную группу. Основанная на сложном эфире расщепляемая линкерная группа расщепляется в клетке такими ферментами как эстеразы и амидазы. Примеры основанных на сложных эфирах расщепляемых линкерных групп включают без ограничения сложные эфиры групп алкилена, алкенилена и алкинилена. Сложноэфирные расщепляемые линкерные группы имеют общую формулу -C(O)O- или -OC(O)-. Такие кандидаты можно оценить, используя способы, аналогичные описанным выше способам.

Основанные на пептидах расщепляемые линкерные группы

В еще одном варианте расщепляемый линкер содержит основанную на пептиде расщепляемую линкерную группу. Основанная на пептиде расщепляемая линкерная группа расщепляется в клетке такими ферментами, как пептидазы и протеазы. Основанные на пептидах расщепляемые линкерные группы представляют собой пептидные связи, образованные между аминокислотами, которые приводят к образованию олигопептидов (например, дипептидов, трипептидов и т.д.) и полипептидов. Основанные на пептидах расщепляемые группы не включают амидную группу (-C(O)NH-). Амидная группа может быть образована между любыми алкиленами, алкениленами или алкиниленами. Пептидная связь представляет собой специальный тип амидной связи, образованной между аминокислотами и приводящей к образованию пептидов и белков. Основанная на пептиде расщепляемая группа обычно ограничена пептидной связью (т.е. амидной связью), образованной между аминокислотами с получением пептидов и белков и не включает полную амидную функциональную группу. Основанные на пептидах расщепляемые линкерные группы имеют общую формулу - NHCHRAC(O)NHCHRBC(O) - (SEQ ID NO: 13), где RA и RB представляют собой R-группы двух соседних аминокислот. Такие кандидаты можно оценивать с использованием способов, аналогичных описанным выше способам.

Соответствующие патенты США, в которых описано получение конъюгатов РНК, включают без ограничения патенты США №4828979, 4948882, 5218105, 5525465, 5541313, 5545730, 5552538, 5578717, 5580731, 5591584, 5109124, 5118802, 5138045, 5414077, 5486603, 5512439, 5578718, 5608046, 4587044, 4605735, 4667025, 4762779, 4789737, 4824941, 4835263, 4876335, 4904582, 4958013, 5082830, 5112963, 5214136, 5082830, 5112963, 5214136, 5245022, 5254469, 5258506, 5262536, 5272250, 5292873, 5317098, 5371241, 5391723, 5416203, 5451463, 5510475, 5512667, 5514785, 5565552, 5567810, 5574142, 5585481, 5587371, 5595726, 5597696, 5599923, 5599928 и 5688941, 6294664, 6320017, 6576752, 6783931, 6900297, 7037646, 8106022, полное содержание каждого из которых включено в настоящее описание в виде ссылки.

Необязательно, чтобы данное соединение было единообразно модифицировано во всех положениях, и в действительности в одно соединение или даже в один нуклеозид в и-РНК может быть включено более одной из вышеуказанных модификаций. Настоящее изобретение также относится к соединениям и-РНК, которые являются химерными соединениями.

«Химерные» соединения и-РНК или «химеры» в контексте настоящего изобретения представляют собой соединения и-РНК, например, днРНК, которые содержат две или больше химически отличающихся областей, каждая из которых состоит, по меньшей мере, из одной мономерной единицы, т.е. нуклеотида в случае соединения днРНК. Такие и-РНК обычно содержат, по меньшей мере, одну область, в которой РНК модифицирована так, чтобы придать и-РНК повышенную устойчивость к расщеплению нуклеазами, увеличенный захват в клетки и/или повышенную аффинность связывания нуклеиновой кислоты-мишени. Дополнительная область и-РНК может служить в качестве субстрата для ферментов, способных расщеплять гибриды РНК:ДНК или РНК:РНК. В качестве примера РНК-аза H является клеточной эндонуклеазой, которая расщепляет нить РНК дуплекса РНК:ДНК. Поэтому активация РНК-азы H приводит к расщеплению РНК-мишени, тем самым значительно повышая эффективность ингибирования экспрессии генов под действием и-РНК. Следовательно, при использовании химерных днРНК часто можно получить сравнимые результаты в случае более коротких и-РНК по сравнению с фосфоротиоатными дезокси-днРНК, гибридизующимися с той же областью-мишенью. Расщепление РНК-мишени можно выявить обычным образом, используя гель-электрофорез, и при необходимости ассоциированные способы гибридизации нуклеиновых кислот, известные в данной области.

В некоторых случаях РНК в и-РНК может быть модифицирована нелигандной группой. Множество нелигандных молекул было конъюгировано с и-РНК, чтобы повысить активность, распределение в клетках или клеточный захват и-РНК, и способы получения таких конъюгатов доступны в научной литературе. Такие нелигандные остатки включали липидные остатки, такие как холестерин (Kubo, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1): 54-61; Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86: 6553), холевую кислоту (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4: 1053), тиоэфир, например, гексил-S-тритилтиол (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660: 306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3: 2765), тиохолестерин (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20: 533), алифатическую цепь, например, остатки додекандиола или ундецила (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), фосфолипид, например, дигексадецил-рац-глицерин или 1,2-ди-O-гексадецил-рац-глицеро-3-H-фосфонат триэтиламмония (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36: 3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18: 3777), полиамин или цепь полиэтиленгликоля (Manoharan et al., Nucleosides and Nucleotides, 1995, 14: 969), или адамантануксусную кислоту (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36: 3651), остаток пальмитоила (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264: 229), или остаток октадециламина или гексиламинокарбонилоксихолестерина (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277: 923). Соответствующие патенты США, в которых описано получение таких конъюгатов РНК, было описано выше. Типичные протоколы конъюгации включают синтез РНК, несущих аминолинкер в одном или нескольких положениях последовательности. Затем аминогруппу подвергают взаимодействию с конъюгируемой молекулой, используя соответствующие реагенты для связывания или активации. Реакция конъюгации может быть осуществлена либо с РНК, все еще связанной с твердой подложкой, либо после отщепления РНК в фазе раствора. Очистку РНК-конъюгата с использованием ВЭЖХ обычно дает чистый конъюгат.

Доставка и-РНК

Доставка и-РНК в организм субъекта, нуждающегося в такой доставке, может быть осуществлена несколькими различными путями. Доставка in vivo может быть осуществлена непосредственно введением композиции, содержащей и-РНК, например, днРНК, субъекту. Альтернативно, доставка может быть осуществлена опосредованно введением одного или нескольких векторов, которые кодируют и направляют экспрессию и-РНК. Такие альтернативные варианты дополнительно обсуждаются ниже.

Прямая доставка

В общем, любой способ доставки молекулы нуклеиновой кислоты может быть адаптирован для применения с и-РНК (См., например, публикации Akhtar S. and Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5): 139-144 и WO94/02595, которые включены в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме). Однако существует три фактора, которые важно учитывать, чтобы успешно доставить молекулу и-РНК in vivo: (a) биологическая стабильность доставляемой молекулы, (2) предотвращение неспецифичных эффектов и (3) накопление доставляемой молекулы в ткани-мишени. Неспецифичные эффекты и-РНК могут быть минимизированы при локальном введении, например, посредством прямой инъекции или имплантации в ткань (в качестве не ограничивающего примера, в опухоль) или местом введении препарата. Локальное введение в место лечения максимизирует местную концентрацию средства, ограничивает воздействие средства на ткани всего организма, которые могут в ином случае могут пострадать при действии средства или которые могут вызвать распад средства, и позволяет вводить более низкую общую дозу молекулы и-РНК. В нескольких исследованиях показан успешный нокдаун генных продуктов при локальном введении и-РНК. Например, было показано, что внутриглазная доставка днРНК VEGF посредством инъекции в стекловидное тело макакам-крабоедам (Tolentino, ML, et al. (2004) Retina 24: 132-138) и субретинальные инъекции у мышей (Reich, SL, et al. (2003) Mol. Vis. 9: 210-216) предотвращают неоваскуляризацию в экспериментальной модели возрастной макулярной дегенерации. Кроме того, прямая внутриопухолевая инъекция днРНК мышам уменьшает объем опухоли (Pille, L, et al. (2005) Mol. Ther. 11: 267-274) и может увеличивать продолжительность жизни мышей, несущих опухоли (Kim, WL, et al. (2006) Mol. Ther. 14: 343-350; Li, S., et al. (2007) Mol. Ther. 15: 515-523). Также была показана успешная интерференция РНК в случае локальной доставки в ЦНС посредством прямой инъекции (Dorn, G., et al. (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH., et al (2005) Gene Ther. 12:59-66; Makimura, H., et al (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., et al (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER., et al (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-17275; Akaneya,Y., et al (2005) J. Neurophysiol. 93:594-602) и в легкие посредством интраназального введения (Howard, KA., et al (2006) Mol. Ther. 14:476-484; Zhang, X., et al (2004) J. Biol. Chem. 279:10677-10684; Bitko, V., et al (2005) Nat. Med. 11:50-55). В случае системного введения и-РНК для лечения заболевания РНК может быть модифицирована или альтернативно доставлена с использованием системы доставки лекарственного средства; при этом оба способа действуют, предотвращая быстрый распад днРНК под действием эндо- и экзонуклеаз in vivo.

Модификация РНК или фармацевтического носителя также может позволять направлять композицию и-РНК в ткань-мишень и избегать нежелательных нецелевых эффектов. Молекулы и-РНК могут быть модифицированы в результате химической конъюгации с другими группами, например, липидной или углеводной группой, которые описаны в настоящей публикации. Такие конъюгаты можно применять для того, чтобы направить и-РНК в конкретные клетки, например, клетки печени, например, гепатоциты. Например, препараты GalNAc-конъюгатов или липидные (например, LNP) можно использовать для того, чтобы направить и-РНК в конкретные клетки, например, клетки печени, например, гепатоциты.

Липофильные группы, такие как холестерин, усиливают захват клетками и предотвращают распад. Например, и-РНК, направленную против ApoB, конъюгированного с липофильным остатком холестерина, инъецировали системно мышам, что приводило к нокдауну мРНК apoB как в печени, так и в тонкой кишке (Soutschek, J., et al. (2004) Nature 432: 173-178). Было показано, что конъюгация и-РНК с аптамером ингибирует рост опухолей и опосредует регрессию опухоли в мышиной модели рака простаты (McNamara, JO., et al. (2006) Nat. Biotechnol. 24: 1005-1015). В альтернативном варианте и-РНК может быть доставлена с использованием систем доставки лекарственных средств, таких как наночастица, дендример, полимер, липосомы или катионные системы доставки. Положительно заряженные катионные системы доставки способствуют связыванию молекулы и-РНК (отрицательно заряженной), а также усиливают взаимодействия в отрицательно заряженной клеточной мембране, обеспечивая возможность эффективного захвата и-РНК клеткой. Катионные липиды, дендримеры или полимеры могут либо быть связаны с и-РНК, либо индуцированы с целью образования везикулы или мицеллы (См., например, Kim SH., et al. (2008) Journal of Controlled Release 129(2): 107-116), которая заключает в себе и-РНК. Образование везикул или мицелл дополнительно предотвращает распад и-РНК при системном введении. Способы получения и введения катионных и-РНК-комплексов может осуществить специалист в данной области (См., например, публикации Sorensen, DR., et al (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN., et al (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS et al (2007) J. Hypertens. 25:197-205, которые включены в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме). Некоторые не ограничивающие примеры систем доставки лекарственных средств, применимых для системной доставки и-РНК, включают DOTAP (Sorensen, DR., et al. (2003), выше; Verma, UN., et al. (2003), выше), олигофектамин, «твердые частицы нуклеиновой кислоты-липида» (Zimmermann, TS., et al. (2006) Nature 441: 111-114), кардиолипин (Chien, PY., et al. (2005) Cancer Gene Ther. 12: 321-328; Pal, A., et al. (2005) Int. J. Oncol. 26: 1087-1091), полиэтиленимин (Bonnet ME., et al. (2008) Pharm. Res. Aug. 16 Epub. ahead of print; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), пептиды Arg-Gly-Asp (RGD) (Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3: 472-487) и полиамидоамины (Tomalia, DA., et al. (2007) Biochem. Soc. Trans. 35: 61-67; Yoo, H., et al. (1999) Pharm. Res. 16: 1799-1804). В некоторых вариантах и-РНК образует комплекс с циклодекстрином для системного введения. Способы введения и фармацевтические композиции и-РНК и циклодекстринов можно найти в патенте США №7427605, который включен в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме.

Кодируемые вектором и-РНК

В другом аспекте и-РНК, мишенью которой является ген ALAS1, может быть экспрессирована с транскрипционных единиц, встроенных в ДНК- или РНК-векторы (См., например, Couture, A с соавторами, TIG. (1996), 12: 5-10; Skillern, A. с соавторами, международная публикация PCT № WO 00/22113, Conrad, международная публикация PCT № WO 00/22114 и Conrad, патент США №6054299). Экспрессия может быть временной (порядка от нескольких часов до недель) или продолжительной (от недель до месяцев и дольше), в зависимости от конкретной используемой конструкции и ткани-мишени или типа клеток-мишеней. Такие трансгены могут быть введены в виде линейной конструкции, кольцевой плазмиды или вирусного вектора, который может представлять собой интегрируемый или неинтегрируемый вектор. Трансген также может быть сконструирован так, чтобы обеспечить его наследование в виде внехромосомной плазмиды (Gassmann с соавторами, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 1292).

Отдельная нить или нити и-РНК могут быть транскрибированы с промотора, имеющегося в экспрессирующем векторе. В том случае, когда необходимо экспрессировать две отдельных нити, чтобы создать, например, днРНК, в клетку-мишень могут быть совместно введены два отдельных экспрессирующих вектора (например, посредством трансфекции или инфекции). Альтернативно каждая отдельная нить днРНК может быть транскрибирована с промоторов, которые оба находятся в одной и той же экспрессирующей плазмиде. В одном варианте днРНК экспрессируется в виде инвертированного повтора, соединенного линкерной полинуклеотидной последовательностью, так что днРНК имеет структуру «стебель-петля».

Вектор, экспрессирующий и-РНК, обычно представляет собой ДНК-плазмиду или вирусный вектор. Экспрессирующий вектор, совместимый с эукариотическими клетками, например, с клетками позвоночных, можно использовать для получения рекомбинантных конструкций для экспрессии и-РНК, которая описана в настоящей публикации. Векторы экспрессии в эукариотических клетках хорошо известны в данной области и доступны из множества коммерческих источников. Обычно такие векторы содержат подходящие сайты рестрикции для инсерции требуемого участка нуклеиновой кислоты. Доставка векторов, экспрессирующих и-РНК, может быть системной, такой как внутривенное или внутримышечное введение, путем введения в клетки-мишени, эксплантированных из организма пациента с последующим повторным введением в организм пациента или любыми другими способами, которые позволяют осуществлять введение в требуемую клетку-мишень.

Плазмида, экспрессирующая и-РНК, может быть трансфицирована в клетку-мишень в виде комплекса с катионным липидным носителем (например, олигофектамином) или не основанном на катионном липиде носителем (например, Transit-TKO™). Многократные трансфекции с использованием липидов для и-РНК-опосредованных нокдаунов, нацеленных на разные области РНК-мишени, в течение периода времени, составляющего неделю или больше, также предусмотрены в изобретении. Успешное введение векторов в клетки-хозяева можно наблюдать, используя различные известные способы. Например, сигналы, свидетельствующие о временной трансфекции, можно получать, благодаря репортеру, такому как флуоресцирующий маркер, такой как зеленый флуоресцирующий белок (GFP). В стабильной трансфекции клеток ex vivo можно удостовериться, используя маркеры, которые придают трансфицированной клетке резистентность к конкретным факторам окружающей среды (например, антибиотикам и лекарственным средствам), такую как резистентность к гигромицину B.

Системы вирусных векторов, которые можно использовать в способах и композициях, описанных в настоящей публикации, включают без ограничения (a) аденовирусные векторы; (b) ретровирусные векторы, включая без ограничения лентивирусные векторы, вирус лейкоза мышей Молони и т.д.; (c) векторы на основе аденоассоциированных вирусов; (d) векторы на основе вируса простого герпеса; (e) векторы SV40; (f) векторы на основе вируса полиомы; (g) векторы на основе вируса папилломы; (h) пикорнавирусные векторы; (i) векторы на основе поксвирусов, таких как ортопоксвирус, например, векторы на основе вируса вакцинии или авипоксвируса, например, поксвируса канареек или вируса оспы птиц; и (j) зависимый от хелперов или имеющий усеченный геном аденовирус. Дефектные по репликации вирусы также могут быть предпочтительными. Разные векторы будут включаться или не будут включаться в геном клеток. Конструкции при необходимости могут содержать вирусные последовательности для трансфекции. Альтернативно, конструкция может быть включена в векторы, способные к эписомной репликации, например, векторы EPV и EBV. Конструкции для рекомбинантной экспрессии и-РНК обычно могут требовать регуляторных элементов, например, промоторов, энхансеров и т.д., чтобы обеспечить экспрессию и-РНК в клетках-мишенях. Другие аспекты, которые следует учитывать в случае векторов и конструкций, дополнительно описаны ниже.

Векторы, применимые для доставки и-РНК, будут содержать регуляторные элементы (промотор, энхансер и т.д.), достаточные для экспрессии и-РНК в требуемой клетке-мишени или ткани-мишени. Регуляторные элементы могут быть выбраны так, чтобы они обеспечивали либо конститутивную, либо регулируемую/индуцируемую экспрессию.

Экспрессия и-РНК можно точно регулировать, например, используя индуцируемую регуляторную последовательность, которая чувствительна к некоторым физиологическим регуляторам, например, уровням глюкозы в циркуляции или гормонам (Docherty с соавторами, 1994, FASEB J. 8:20-24). Такие индуцируемые системы экспрессии, подходящие для регуляции экспрессии днРНК в клетках или в организмах млекопитающих, включают, например, регуляцию экдизоном, прогестероном, тетрациклином, химическими индукторами димеризации и изопропил-β-D1-тиогалактопиранозидом (IPTG). Специалист в данной области сможет выбрать подходящую регуляторную/промоторную последовательность на основе предполагаемого применения трансгена и-РНК.

В конкретном варианте можно использовать вирусные векторы, которые содержат последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие и-РНК. Например, можно использовать ретровирусный вектор (См. публикацию Miller с соавторами, Meth. Enzymol. 217: 581-599 (1993)). Такие ретровирусные векторы содержат компоненты, необходимые для правильной упаковки вирусного генома и интеграции в ДНК клетки-хозяина. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие и-РНК, клонируют в одном или нескольких векторах, которые обеспечивают доставку нуклеиновой кислоты в организм пациента. Более подробную информацию о ретровирусных векторах можно найти, например, в публикации Boesen с соавторами (Biotherapy 6: 291-302 (1994)), в которой описано применение ретровирусного вектора для доставки гена mdr1 в гематопоэтические стволовые клетки, чтобы получить стволовые клетки, более устойчивые к химиотерапии. Другими публикациями, иллюстрирующими применение ретровирусных векторов в генной терапии, являются: Clowes et al., J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); and Grossman and Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993). Лентивирусные векторы, предполагаемые для применения, включают, например, векторы на основе ВИЧ, описанные в патентах США №6143520, 5665557 и 5981276, которые включены в настоящее описание в виде ссылки.

Аденовирусы также предполагаются для применения для доставки и-РНК. Аденовирусы являются особенно привлекательными носителями, например, для доставки генов в эпителий дыхательных путей. Аденовирусы в природе инфицируют эпителий дыхательных путей, при этом они вызывают легкое заболевание. Другими мишенями основанных на вирусах систем доставки являются печень, центральная нервная система, эндотелиальные клетки и мышцы. Аденовирусы имеют преимущество, так как способны инфицировать неделящиеся клетки. Kozarsky и Wilson (Current Opinion in Genetics and Development 3: 499-503 (1993)) представили обзор генной терапии на основе аденовирусов. Bout с соавторами (Human Gene Therapy 5: 3-10 (1994)) продемонстрировали применение аденовирусных векторов для переноса генов в эпителий дыхательных путей макак-резус. Другие случаи применения аденовирусов для генной терапии можно найти в публикациях Rosenfeld с соавторами, (Science 252: 431-434 (1991)), Rosenfeld с соавторами (Cell 68: 143-155 (1992)), Mastrangeli с соавторами (J. Clin. Invest. 91: 225-234 (1993)), в публикации PCT WO94/12649; и в публикации Wang с соавторами (Gene Therapy 2: 775-783 (1995)). Подходящий AV-вектор для экспрессии и-РНК, охарактеризованной в изобретении, способ конструирования рекомбинантного AV-вектора и способ доставки вектора в клетки-мишени описаны Xia H. с соавторами ((2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010).

Также предполагается применение векторов на основе аденоассоциированных вирусов (AAV) (Walsh с соавторами, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 289-300 (1993); патент США №5436146). В одном варианте и-РНК может быть экспрессирована в виде двух отдельных комплементарных однонитевых молекул РНК с рекомбинантного AAV-вектора, имеющего, например, промоторы либо U6-, либо H1-РНК, или промотор цитомегаловируса (CMV). Подходящие AAV-векторы для экспрессии днРНК, охарактеризованной в изобретении, способы конструирования рекомбинантного AV-вектора и способы доставки векторов в клетки-мишени описаны в Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826;

в патенте США №5252479, патенте США №5139941, международной заявке на выдачу патента № WO 94/13788 и международной заявке на выдачу патента № WO 93/24641, полное содержание которых включено в настоящее описание в виде ссылки.

Другим типичным вирусным вектором является поксвирус, такой как вирус вакцинии, например, ослабленный вирус вакцинии, такой как модифицированный вирус Ankara (MVA) или NYVAC, авипоксвирус, такой как вирус оспы птиц или поксвирус канареек.

Тропизм вирусных векторов можно модифицировать, псевдотипируя векторы с использованием белков оболочки или других поверхностных антигенов из других вирусов, или при необходимости заменяя другими вирусными капсидными белками. Например, лентивирусные векторы могут быть псевдотипированы с использованием поверхностных белков из вируса везикулярного стоматита (VSV), бешенства, Эбола, Мокола и тому подобного. Могут быть получены AAV-векторы для целенаправленного действия на разные клетки путем конструирования векторов, экспрессирующих разные серотипа капсидных белков; См., например, публикацию Rabinowitz J. E. с соавторами ((2002), J. Virol. 76: 791-801), полное содержание которой включено в настоящее описание в виде ссылки.

Фармацевтический препарат вектора может содержать вектор в приемлемом разбавителе или может содержать матрикс для медленного высвобождения, в который помещен носитель для доставки генов. Альтернативно, в том случае, когда полный вектор для доставки генов может быть получен интактным из рекомбинантных клеток, например, ретровирусные векторы, фармацевтический препарат может содержать одну или несколько клеток, которые продуцируют систему доставки генов.

III. Фармацевтические композиции, содержащие и-РНК

В одном варианте изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим и-РНК, которые описаны в настоящей публикации, и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция, содержащая и-РНК, применима для лечения заболевания или расстройства, связанного с экспрессией или активностью гена ALAS1 (например, расстройства, в которое вовлечен путь порфирина). Такие фармацевтические композиции готовят на основе способа доставки. Например, композиции могут быть приготовлены для системного введения посредством парентеральной доставки, например, с использованием внутривенной (в/в) доставки. В некоторых вариантах композицию, предлагаемую в настоящем изобретении (например, препарат LNP), готовят для внутривенной доставки. В некоторых вариантах композицию, предлагаемую в настоящем изобретении (например, композицию, содержащую GalNAc-конъюгат) готовят для подкожной доставки.

Фармацевтические композиции, охарактеризованные в настоящем описании, вводят в дозе, достаточной для ингибирования экспрессии гена ALAS1. В общем, подходящая доза и-РНК будет в диапазоне от 0,01 до 200,0 миллиграмм на килограмм массы тела реципиента в сутки, обычно в диапазоне от 1 до 50 мг на килограмм массы тела в сутки. Например, днРНК можно вводить в количестве 0,05 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 1,5 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 10 мг/кг, 20 мг/кг, 30 мг/кг, 40 мг/кг или 50 мг/кг на одну дозу. Фармацевтическую композицию можно вводить один раз в сутки или и-РНК можно вводить в виде двух, трех или большего количества поддоз с соответствующими интервалами на протяжении суток или даже с использованием непрерывной инфузии или доставки посредством препарата с контролируемым высвобождением. В таком случае количество и-РНК в каждой поддозе должно быть соответственно меньше, чтобы достичь суммарную суточную дозу. Единичная доза также может быть составлена для доставки в течение нескольких суток, например, с использованием подходящего препарата замедленного высвобождения, который обеспечивает длительное высвобождение и-РНК в течение периода времени, составляющего несколько суток. Препараты длительного высвобождения хорошо известны в данной области и особенно применимы для доставки средств в конкретное место, и в частности, могут быть использованы в случае средств согласно настоящему изобретению. В указанном варианте единичная доза содержит соответствующее количество суточных доз.

Влияние однократной дозы на уровни ALAS1 может быть длительным, так что последующие дозы вводят с интервалами, составляющими не более чем 3, 4 или 5 дней или с интервалами, составляющими не более чем 1, 2, 3 или 4 недели.

Специалисту в данной области будет понятно, что некоторые факторы могут влиять на дозу и время введения, необходимые для того, чтобы эффективно лечить субъекта, включая без ограничения тяжесть заболевания или расстройства, предварительное лечение, общее состояние здоровья и/или возраст субъекта и другие присутствующие заболевания. Кроме того, лечение субъекта терапевтически эффективным количеством композиции может включать одно введение или серию введений. Оценки эффективных доз и времени полужизни in vivo для отдельных и-РНК, входящих в объем изобретения, можно осуществлять, используя обычные способы, или на основе тестирования in vivo с использованием подходящей животной модели, как описано в настоящей публикации.

Успехи в генетике мышей позволили создать ряд мышиных моделей для исследования различных заболеваний человека, таких как патологические процессы, связанные с экспрессией ALAS1 (например, патологические процессы, в которые вовлечены порфирины или дефекты пути порфиринов, такие как, например, порфирии). Такие модели можно использовать для тестирования и-РНК in vivo, а также для определения терапевтически эффективной дозы и/или эффективной схемы дозирования.

Подходящей мышиной моделью является, например, мышь, содержащая трансген, экспрессирующий ALAS1 человека. Мыши, которые имеют нокин-мутации (например, мутации, которые ассоциированы с острыми печеночными порфириями у человека), можно использовать для определения терапевтически эффективной дозы и/или продолжительности введения ми-РНК ALAS1. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям и препаратам, которые содержат соединения и-РНК, охарактеризованные в изобретении. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно вводить несколькими путями, в зависимости от того, требуется ли локальное или системное лечение, и от области, которую необходимо лечить. Введение может быть местным (например, посредством трансдермального пластыря), легочным, например, посредством ингаляции или инсуффляции порошков или аэрозолей, включая использование ингалятора; внутритрахеальным, интраназальным, эпидермальным и трансдермальным, пероральным или парентеральным. Парентеральное введение включает внутривенную, внутриартериальную, подкожную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию или инфузию; субдермальное, например, посредством имплантируемого устройства; или внутричерепное, например, интрапаренхимное, интратекальное или внутрижелудочковое введение.

и-РНК может быть доставлена таким образом, чтобы целенаправленно воздействовать на конкретную ткань, такую как ткань, которая продуцирует эритроциты. Например, и-РНК может быть доставлена в костный мозг, печень (например, гепатоциты печени), лимфатические узлы, селезенку, легкие (например, плевру легких) или спинной мозг. В одном варианте и-РНК доставляют в костный мозг.

Фармацевтические композиции и препараты для местного введения могут включать трансдермальные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкости и порошки. Могут быть необходимы или желательны обычные фармацевтические носители, водные, порошкообразные или масляные основы, загустители и тому подобное. Также могут быть применимы покрытые слоем презервативы, перчатки и тому подобное. Подходящие местные препараты включают препараты, в которых и-РНК, охарактеризованные в изобретении, находятся в смеси со средством для местной доставки, таким как липиды, липосомы, жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот, стероиды, хелатирующие средства и поверхностно-активные вещества. Подходящие липиды и липосомы включают нейтральные (например, диолеоилфосфатидилэтаноламин DOPE, димиристоилфосфатидилхолин DMPC, дистеароилфосфатидилхолин), отрицательные (например, димеристоилфосфатидилглицерин DMPG) и катионные (например, диолеоилтетраметиламинопропил DOTAP и диолеоилфосфатидилэтаноламин DOTMA). и-РНК, охарактеризованные в изобретении, могут быть инкапсулированы в липосомы или могут образовывать с ними комплексы, в частности с катионными липосомами. Альтернативно, и-РНК могут быть в комплексе с липидами, в частности, с катионными липидами. Подходящие жирные кислоты и сложные эфиры включают без ограничения арахидоновую кислоту, олеиновую кислоту, эйкозановую кислоту, лауриновую кислоту, каприловую кислоту, каприновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин, дилаурин, глицерил-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитин, ацилхолин или сложный C_1-20-алкиловый эфир (например, изопропилмиристат IPM), моноглицерид, диглицерид или их фармацевтически приемлемая соль. Местные препараты подробно описаны в патенте США №6747014, который включен в настоящее описание в виде ссылки.

Липосомные препараты

Существует множество организованных поверхностно-активных структур кроме микроэмульсий, которые были исследованы и использованы для приготовления препаратов лекарственных средств. Такие структуры включают монослои, мицеллы, бислои и везикулы. Везикулы, такие как липосомы, привлекли большой интерес, вследствие их специфичности и продолжительности действия, которые они обеспечивают с точки зрения доставки лекарственных средств. В используемом в настоящем описании смысле термин «липосома» означает везикулу, состоящую из амфипатических липидов в сферическом бислое или бислоях.

Липосомы представляют собой однослойные или многослойные везикулы, которые имеют мембрану, образованную из липофильного материала и водной внутренней части. Водная часть содержит композицию, которую необходимо доставить. Катионные липосомы обладают преимуществом, которое заключается в их способности сливаться с клеточной стенкой. Некатионные липосомы, хотя и не способны сливаться так эффективно с клеточной стенкой, захватываются макрофагами in vivo.

Чтобы пройти через интактную кожу млекопитающего, липидные везикулы должны пройти через серию мелких пор, каждая из которых имеет диаметр менее 50 нм, под действием подходящего трансдермального градиента. Поэтому желательно использовать липосому, которая легко деформируется и способна проходить через такие тонкие поры.

Дополнительные преимущества липосом включают: липосомы, полученные из природных фосфолипидов, являются биологически совместимыми и поддаются биологическому разрушению; липосомы могут включать в себя широкое множество растворимых в воде и растворимых в липидах лекарственных средств; липосомы могут защищать инкапсулированные лекарственные средства в своих внутренних отсеках от метаболизма и разрушения (Rosoff, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., v. 1, p. 245). Важными факторами, которые необходимо учитывать при получении липосомных препаратов, являются поверхностный заряд липидов, размер везикул и объем водной части липосом.

Липосомы применимы для переноса и доставки активных ингредиентов к месту действия. Поскольку мембрана липосом структурно сходна с биологическими мембранами, в том случае, когда липосомы наносят на ткань, липосомы начинают сливаться с клеточными мембранами и по мере слияния липосомы и клетки содержимое липосомы перетекает в клетку, в которой может действовать активное средство.

На липосомных препаратах было сфокусировано всестороннее исследование, в котором их использовали в качестве средств доставки множества лекарственных средств. Появляется все больше доказательств того, что для местного введения липосомы обладают несколькими преимуществами по сравнению с другими препаратами. Такие преимущества включают сниженные побочные эффекты, связанные с высоким системным поглощением вводимого лекарственного средства, повышенным накоплением вводимого лекарственного средства в требуемой мишени и возможностью вводить широкое множество лекарственных средств, как гидрофильных, так и гидрофобных, в кожу.

В нескольких сообщениях подробно описана способность липосом доставлять средства, включая высокомолекулярную ДНК, в кожу. В кожу вводили разные соединения, включая анальгетики, антибиотики, гормоны и высокомолекулярные ДНК. Большинство применений приводило к целенаправленному воздействию на верхний эпидермис.

Липосомы делятся на два больших класса. Катионные липосомы представляют собой положительно заряженные липосомы, которые взаимодействуют с отрицательно заряженными молекулами ДНК с образованием стабильного комплекса. Положительно заряженный комплекс ДНК/липосома связывается с отрицательно заряженной поверхностью клетки и интернализуется в эндосому. Благодаря кислому pH в эндосоме липосомы разрываются, высвобождая свое содержимое в цитоплазму клеток (Wang с соавторами, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).

Липосомы, которые являются pH-чувствительными или отрицательно заряженными, улавливают ДНК, а не комплекс с ДНК. Так как и ДНК и липид заряжены сходным образом, то происходит отталкивание, а не образование комплекса. Тем не менее, некоторое количество ДНК захватывается в водную внутреннюю часть таких липосом. pH-чувствительные липосомы использовали для доставки ДНК, кодирующей ген тимидинкиназы, в клеточный монослой в культуре. В клетках-мишенях выявляли экспрессию экзогенного гена (Zhou с соавторами, Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).

Один из основных типов липосомной композиции содержит другие фосфолипиды, отличные от природно получаемого фосфатидилхолина. Нейтральные липосомные композиции могут быть образованы, например, из димиристоилфосфатидилхолина (DMPC) или дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC). Анионные липосомные композиции обычно образованы из димиристоилфосфатидилглицерина, тогда как анионные способные к слиянию липосомы в основном образованы из диолеоилфосфатидилэтаноламина (DOPE). Липосомная композиция другого типа образована из фосфатидилхолина (PC), такого как, например, PC сои и PC яиц. Другой тип образован из смеси фосфолипида и/или фосфатидилхолина и/или холестерина.

В нескольких исследованиях оценивали местную доставку липосомных препаратов лекарственных средств в кожу. Нанесение липосом, содержащих интерферон, на кожу морских свинок приводило к снижению количества герпесных язв, тогда как доставка интерферона другими способами (например, в виде раствора или в виде эмульсии) была неэффективной (Weiner с соавторами, Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410). Кроме того, в дополнительном исследовании тестировали эффективность интерферона, вводимого в виде части липосомного препарата по сравнению с введением интерферона с использованием водной системы и пришли к выводу, что липосомный препарат превосходил введение в водной системе (du Plessis с соавторами, Antiviral Research, 1992, 18, 259-265).

Также исследовали неионогенные липосомные системы, чтобы определить их применимость для доставки лекарственных средств в кожу, в частности, системы, содержащие неионогенное поверхностно-активное вещество и холестерин. Неионогенные липосомные препараты, содержащие новасом™ I (глицерилдилаурат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир) и новасом™ II (глицерилдистеарат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир), использовали для доставки циклоспорина-A в дерму кожи мышей. Результаты показали, что такие неионогенные липосомные системы эффективны в обеспечении отложения циклоспорина-A в разных слоях кожи (Hu с соавторами, S.T.P. Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466).

Липосомы также включают «стерически стабилизированные» липосомы, термин, который в используемом в настоящем описании смысле относится к липосомам, содержащим один или несколько специализированных липидов, которые при включении в липосомы приводят к повышению времени жизни в циркуляции по сравнению с липосомами, в которых отсутствуют такие специализированные липиды. Примерами стерически стабилизированных липосом являются липосомы, в которых часть образующих везикулы липидов липосомы (A) содержит один или несколько гликолипидов, таких как моносиалоганглиозид G_M1, или (B) дериватизована одним или несколькими гидрофильными полимерами, такими как остаток полиэтиленгликоля (ПЭГ). Не имея намерения быть связанными с какой-либо конкретной теорией, в данной области полагают, что, по меньшей мере, в случае стерически стабилизированных липосом, содержащих ганглиозиды, сфингомиелин или ПЭГ-дериватизованные липиды, увеличенное время жизни таких стерически стабилизированных липосом в циркуляции происходит, вследствие пониженного захвата в клетки ретикулоэндотелиальной системы (RES) (Allen с соавторами, FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu с соавторами, Cancer Research, 1993, 53, 3765).

Различные липосомы, содержащие один или несколько гликолипидов, известны в данной области. Papahadjopoulos с соавторами (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) сообщили о способности моносиалоганглиозида G_M1, галактоцереброзидсульфата и фосфатидилинозитола увеличивать время полужизни липосом в крови. Такие данные были уточнены Gabizon с соавторами (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949). В патенте США №4837028 и в публикации WO 88/04924 Allen с соавторами раскрыли липосомы, содержащие (1) сфингомиелин и (2) ганглиозид G_M1 или сложный эфир галактоцереброзидсульфата. В патенте США №5543152 (Webb с соавторами) раскрыты липосомы, содержащие сфингомиелин. Липосомы, содержащие 1,2-sn-димиристоилфосфатидилхолин, раскрыты в WO 97/13499 (Lim с соавторами).

Многие липосомы, содержащие липиды, дериватизованные одним или несколькими гидрофильными полимерами, и способы их получения известны в данной области. В публикации Sunamoto с соавторами (Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778) описаны липосомы, содержащие неионогенный детергент, 2C_1215G, которые содержат молекулу ПЭГ. В публикации Illum с соавторами (FEBS Lett., 1984, 167, 79) отмечено, что гидрофильное покрытие полистироловых частиц полимерными гликолями приводит к значительному увеличению времени полужизни в крови. Синтетические фосфолипиды, модифицированные путем присоединения карбоксильных групп полиалкиленгликолей (например, ПЭГ), описаны Sears (патенты США №№4426330 и 4534899). В публикации Klibanov с соавторами (FEBS Lett., 1990, 268, 235) описаны эксперименты, демонстрирующие, что липосомы, содержащие фосфатидилэтаноламин (PE), дериватизованный ПЭГ или стеаратом ПЭГ, имеют значительно более длительное время полужизни в кровотоке. В публикации Blume с соавторами (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91) такие наблюдения были продолжены с использованием других ПЭГ-дериватизованных фосфолипидов, например, DSPE-ПЭГ, образованных в результате сочетания дистеароилфосфатидилэтаноламина (DSPE) и ПЭГ. Липосомы, имеющие ковалентно связанные остатки ПЭГ на своей наружной поверхности, описаны в европейском патенте № EP 0445131 B1 и в WO 90/04384, Fisher. Липосомные композиции, содержащие 1-20 моль % ПЭГ-дериватизованного PE, и способы их применения описаны Woodle с соавторами (патенты США №№5013556 и 5356633) и Martin с соавторами (патент США №5213804 и европейский патент № EP 0496813 B1). Липосомы, содержащие ряд других конъюгатов “липид-полимер”, описаны в WO 91/05545 и в патенте США №5225212 (обе публикации Martin с соавторами), и в WO 94/20073 (Zalipsky с соавторами). Липосомы, содержащие ПЭГ-модифицированные церамидные липиды, описаны в WO 96/10391 (Choi с соавторами). В патенте США №5540935 (Miyazaki с соавторами) и в патенте США №5556948 (Tagawa с соавторами) описаны ПЭГ-содержащие липосомы, которые на своих поверхностях могут быть дополнительно дериватизованы функциональными остатками.

Ряд липосом, содержащих нуклеиновые кислоты, известны в данной области. В WO 96/4062 Thierry с соавторами описали способы инкапсулирования высокомолекулярных нуклеиновых кислот в липосомы. В патенте США №5264221 Tagawa с соавторами описали связанные с белком липосомы и утверждают, что содержимое таких липосом может включать днРНК. В патенте США №5665710 Rahman с соавторами описали некоторые способы инкапсулирования олигодезоксинуклеотидов в липосомы. В WO 97/04787 Love с соавторами описали липосомы, содержащие днРНК, нацеленные на ген raf.

Трансферсомы представляют собой еще один тип липосом, являющихся в высокой степени деформируемыми липидными агрегатами, которые могут быть привлекательными кандидатами на использование их в качестве везикул для доставки лекарственных средств. Трансферсомы могут быть описаны как липидные капельки, степень деформируемости которых настолько высока, что они могут легко проникать через поры, размеры которых меньше, чем сами капли. Трансферсомы могут быть адаптированы к условиям окружающей среды, в которых они используются, например, они подвергаются самооптимизации (адаптируются к форме пор в коже), саморепарации, часто достигают своих мишеней без фрагментации и подвергаются самозагрузке. Для получения трансферсом в стандартную липосомную композицию могут быть добавлены активаторы поверхности раздела фаз, обычно поверхностно-активные вещества. Трансферсомы были использованы для доставки сывороточного альбумина в кожу. Было показано, что опосредуемая трансферсомами доставка сывороточного альбумина является эффективной при подкожной инъекции раствора, содержащего сывороточный альбумин.

Поверхностно-активные вещества находят широкое применение в таких препаратах, как эмульсии (включая микроэмульсии) и липосомы. Наиболее распространенным путем классификации и ранжирования свойств многих поверхностно-активных веществ различных типов, как природных, так и синтетических, заключается в использовании гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ). Природа гидрофильной группы (также известной как «головка») является наиболее часто применяемым критерием для определения категории различных поверхностно-активных веществ, используемых в препаратах (Rieger, в Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).

Если молекула поверхностно-активного вещества не ионизована, то такая молекула принадлежит к классу неионогенных поверхностно-активных веществ. Неионогенные поверхностно-активные вещества широко применяются в фармацевтических и косметических продуктах и используются в широком интервале значений рН. Обычно значения их ГЛБ находятся в диапазоне от 2 до примерно 18, в зависимости от их структуры. Неионогенные поверхностно-активные вещества включают неионогенные сложные эфиры, такие как сложные эфиры этиленгликоля, сложные эфиры пропиленгликоля, глицериловые сложные эфиры, полиглицериловые сложные эфиры, сложные эфиры сорбитана, сложные эфиры сахарозы и этоксилированные сложные эфиры. В класс таких соединений также включены неионогенные алканоламиды и простые эфиры, такие как этоксилаты жирного спирта, пропоксилированные спирты и этоксилированные/пропоксилированные блоксополимеры. Наиболее известными представителями класса неионогенных поверхностно-активных веществ являются полиоксиэтиленовые поверхностно-активные вещества.

Если молекула поверхностно-активного вещества несет отрицательный заряд, в том случае, когда она растворена или диспергирована в воде, то такое поверхностно-активное вещество классифицируют как анионогенное. Анионогенными поверхностно-активными веществами являются карбоксилаты, такие как мыла, ациллактилаты, ациламиды аминокислот, сложные эфиры серной кислоты, такие как алкилсульфаты и этоксилированные алкилсульфаты, сульфонаты, такие как алкилбензолсульфонаты, ацилизетионаты, ацилтаураты и сульфосукцинаты, и фосфаты. Наиболее важными представителями класса анионогенных поверхностно-активных веществ являются алкилсульфаты и мыла.

Если молекула поверхностно-активного вещества несет положительный заряд, в том случае, когда она растворена или диспергирована в воде, то такое поверхностно-активное вещество классифицируют как катионогенное. Катионогенными поверхностно-активными веществами являются четвертичные аммониевые соли и этоксилированные амины. Наиболее часто используемыми представителями такого класса являются четвертичные аммониевые соли.

Если молекула поверхностно-активного вещества способна нести либо положительный, либо отрицательный заряд, то такое поверхностно-активное вещество классифицируют как амфотерное. Амфотерные поверхностно-активные вещества включают производные акриловой кислоты, замещенные алкиламиды, N-алкилбетаины и фосфатиды.

Был опубликован обзор применения поверхностно-активных веществ в лекарственных продуктах, препаратах и в эмульсиях (Rieger, в Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).

Частица нуклеиновая кислота-липид

В одном варианте днРНК ALAS1, охарактеризованная в изобретении, полностью инкапсулирована в липидный препарат, например, с образованием SPLP, pSPLP, SNALP или другой частицы нуклеиновой кислоты-липида. В используемом в настоящем описании смысле термин «SNALP» относится к стабильной частице нуклеиновая кислота-липид, включая SPLP. В используемом в настоящем описании смысле термин «SPLP» относится к частице нуклеиновая кислота-липид, содержащей плазмидную ДНК, инкапсулированную в липидную везикулу. SNALP и SPLP обычно содержат катионный липид, некатионный липид и липид, который предотвращает агрегацию частицы (например, конъюгат ПЭГ-липид). SNALP и SPLP особенно полезны для системного применения, так как они имеют увеличенное время полужизни в циркуляции после внутривенной (в/в) инъекции и накапливаются в дистальных участках (например, участках, физически отделенных от места введения). SPLP включают «pSPLP», которые содержат инкапсулированный комплекс конденсирующее средство-нуклеиновая кислота, который описан в публикации PCT № WO 00/03683. Частицы согласно настоящему изобретению обычно имеют средний диаметр примерно от 50 нм до примерно 150 нм, чаще примерно от 60 нм до примерно 130 нм, чаще примерно от 70 нм до примерно 110 нм, чаще всего примерно от 70 нм до примерно 90 нм и по существу являются нетоксичными. Кроме того, нуклеиновые кислоты в том случае, когда они присутствуют в частицах нуклеиновая кислота-липид согласно настоящему изобретению, устойчивы в водном растворе к разрушению нуклеазой. Частицы нуклеиновая кислота-липид и способ их получения описаны, например, в патентах США №5976567, 5981501, 6534484, 6586410, 6815432 и в публикации PCT № WO 96/40964.

В одном варианте отношение липида к лекарственному средству (масс./масс.-отношение) (например, отношение липида к днРНК) будет в диапазоне примерно от 1:1 до примерно 50:1, примерно от 1:1 до примерно 25:1, примерно от 3:1 до примерно 15:1, примерно от 4:1 до примерно 10:1, примерно от 5:1 до примерно 9:1 или примерно от 6:1 до примерно 9:1.

Катионным липидом может быть, например, хлорид N,N-диолеил-N,N-диметиламмония (DODAC), бромид N,N-дистеарил-N,N-диметиламмония (DDAB), хлорид N-(I-(2,3-диолеоилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмония (DOTAP), хлорид N-(I-(2,3-диолеилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмония (DOTMA), N,N-диметил-2,3-диолеилокси)пропиламин (DODMA), 1,2-дилинолеилокси-N,N-диметиламинопропан (DLinDMA), 1,2-дилиноленилокси-N,N-диметиламинопропан (DLenDMA), 1,2-дилинолеилкарбамоилокси-3-диметиламинопропан (DLin-C-DAP), 1,2-дилинолеилокси-3- (диметиламино)ацетоксипропан (DLin-DAC), 1,2-дилинолеилокси-3-морфолинопропан (DLin-MA), 1,2-дилинолеоил-3-диметиламинопропан (DLinDAP), 1,2-дилинолеилтио-3-диметиламинопропан (DLin-S-DMA), 1-линолеоил-2-линолеилокси-3-диметиламинопропан (DLin-2-DMAP), хлоридная соль 1,2-дилинолеилокси-3-триметиламинопропана (DLin-TMA.Cl), хлоридная соль 1,2-дилинолеоил-3-триметиламинопропана (DLin-TAP.Cl), 1,2-дилинолеилокси-3-(N-метилпиперазино)пропан (DLin-MPZ) или 3-(N,N-дилинолеиламино)-1,2-пропандиол (DLinAP), 3-(N,N-диолеиламино)-1,2-пропандио (DOAP), 1,2-дилинолеилоксо-3-(2-N,N-диметиламино)этоксипропан (DLin-EG-DMA), 1,2-дилиноленилокси-N,N-диметиламинопропан (DLinDMA), 2,2-дилинолеил-4-диметиламинометил-[1,3]-диоксолан (DLin-K-DMA) или их аналоги, (3aR,5s,6aS)-N,N-диметил-2,2-ди((9Z,12Z)-октадека-9,12-диенил)тетрагидро-3aH-циклопента[d][1,3]диоксол-5-амин (ALN100), (6Z,9Z,28Z,31Z)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил-4-(диметиламино)бутаноат (MC3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(бис(2-гидроксидодецил)амино)этил)(2-гидроксидодецил)амино)этил)пиперазин-1-ил)этилазанедиил)дидодекан-2-ол (Tech G1) или их смесь. Катионный липид может составлять примерно от 20 моль % до примерно 50 моль % или примерно от 40 моль % от общего содержания липидов в частице.

В другом варианте можно использовать соединение 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан для получения наночастиц липид-ми-РНК. Синтез 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолана описан в предварительной заявке на выдачу патента США номер 61/107998, поданной 23 октября 2008, который включен в настоящее описание в виде ссылки.

В одном варианте частица липид-ми-РНК содержит 40% 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан: 10% DSPC: 40% холестерина: 10% ПЭГ-C-DOMG (молярных процентов) с размером частиц 63,0±20 нм и соотношением ми-РНК/липид 0,027.

Некатионным липидом может быть анионный липид или нейтральный липид, включая без ограничения дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), диолеоилфосфатидилхолин (DOPC), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), диолеоилфосфатидилглицерин (DOPG), дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG), диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE), пальмитоилолеоилфосфатидилхолин (POPC), пальмитоилолеоилфосфатидилэтаноламин (POPE), диолеоилфосфатидилэтаноламин-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (DOPE-mal), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), димиристоилфосфоэтаноламин (DMPE), дистеароилфосфатидилэтаноламин (DSPE), 16-O-монометил-PE, 16-O-диметил-PE, 18-1-транс-PE, 1-стеароил-2-олеоилфосфатидилэтаноламин (SOPE), холестерин или их смесь. Некатионный липид может составлять примерно от 5 моль % до примерно 90 моль %, примерно 10 моль % или примерно 58 моль %, если включен холестерин, от общего содержания липидов в частице.

Конъюгированным липидом, который ингибирует агрегацию частиц, может быть, например, полиэтиленгликоль (ПЭГ)-липид, включая без ограничения ПЭГ-диацилглицерин (DAG), ПЭГ-диалкилоксипропил (DAA), ПЭГ-фосфолипид, ПЭГ-церамид (Cer) или их смесь. Конъюгат ПЭГ-DAA может представлять собой, например, ПЭГ-дилаурилоксипропил (Ci₂), ПЭГ-димиристилоксипропил (Ci₄), ПЭГ-дипальмитилоксипропил (Ci₆) или ПЭГ-дистеарилоксипропил (Ci₈). Конъюгированный липид, который предотвращает агрегацию частиц, может составлять от 0 моль % до примерно 20 моль % или примерно 2 моль % от общего содержания липидов в частице.

В некоторых вариантах частица нуклеиновая кислота-липид дополнительно содержит холестерин, например, примерно от 10 моль % до примерно 60 моль % или примерно 48 моль % от общего содержания липидов в частице.

В некоторых вариантах и-РНК готовят в липидной наночастице (LNP).

LNP01

В одном варианте липидоид ND98-4HC1 (М.м. 1487) (См. заявку на выдачу патента США №12/056230, поданную 3/26/2008, которая включена в настоящее описание в виде ссылки), холестерин (Sigma-Aldrich) и ПЭГ-церамид C16 (Avanti Polar Lipids) можно использовать для получения наночастиц липид-днРНК (например, частиц LNP01). Маточные растворы каждого из них в этаноле можно получить следующим образом: ND98, 133 мг/мл; холестерин, 25 мг/мл, ПЭГ-церамид C16, 100 мг/мл. Затем маточные растворы ND98, холестерина и ПЭГ-церамида C16 могут быть объединены, например, в молярном соотношении 42:48:10. Раствор объединенных липидов можно смешать с водным раствором днРНК (например, в ацетате натрия, pH 5) так, чтобы конечная концентрация этанола составляла примерно 35-45% и конечная концентрация ацетата натрия составляла примерно 100-300 мМ. Наночастицы липид-днРНК обычно образуются спонтанно при смешивании. В зависимости от требуемого распределения по размеру частиц полученная смесь наночастиц может быть подвергнута экструзии через поликарбонатную мембрану (например, с пределом отсечения 100 нм), с использованием, например, экструдера Thermobarrel, такого как экструдер Lipex (Northern Lipids, Inc). В некоторых случаях стадия экструзии может быть исключена. Удаление этанола и одновременная замена буфера могут быть осуществлены, например, посредством диализа или тангенциальной проточной фильтрацией. Буфер может быть заменен, например, фосфатно-солевым буфером (PBS) с pH примерно 7, например, pH примерно 6,9, pH примерно 7,0, pH примерно 7,1, pH примерно 7,2, pH примерно 7,3 или pH примерно 7,4.

Препараты LNP01 описаны, например, в международной публикации заявки № WO 2008/042973, которая включена в настоящее описание в виде ссылки.

Дополнительные примеры препаратов липид-днРНК представлены в следующей таблице.

Таблица 10 Примеры липидных препаратов
	Катионный липид	Катионный липид/некатионный липид/холестерин/конъюгат ПЭГ-липид Соотношение липид:ми-РНК
SNALP	1,2-дилиноленилокси-N,N-диметиламинопропан (DLinDMA)	DLinDMA/DPPC/Холестерин/ПЭГ-cDMA (57.1/7.1/34.4/1.4) липид:ми-РНК ~ 7:1

S-XTC	2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан (XTC)	XTC/DPPC/Холестерин/ПЭГ-cDMA 57.1/7.1/34.4/1.4 липид:ми-РНК ~ 7:1
LNP05	2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан (XTC)	XTC/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DMG 57.5/7.5/31.5/3.5 липид:ми-РНК ~ 6:1
LNP06	2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан (XTC)	XTC/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DMG 57.5/7.5/31.5/3.5 липид:ми-РНК ~ 11:1
LNP07	2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан (XTC)	XTC/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DMG 60/7.5/31/1.5, липид:ми-РНК ~ 6:1
LNP08	2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан (XTC)	XTC/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DMG 60/7.5/31/1.5, липид:ми-РНК ~ 11:1
LNP09	2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан (XTC)	XTC/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DMG 50/10/38.5/1.5 Липид:ми-РНК 10:1
LNP10	3aR,5s,6aS)-N,N-диметил-2,2-ди((9Z,12Z)-октадека-9,12-диенил)тетрагидро-3aH-циклопента[d][1,3]диоксол-5-амин (ALN 100)	ALN100/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DMG 50/10/38.5/1.5 Липид:ми-РНК 10:1
LNP11	(6Z,9Z,28Z,31Z)гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил-4-(диметиламино)бутаноат (MC3)	MC-3/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DMG 50/10/38.5/1.5 Липид:ми-РНК 10:1
LNP12	1,1'-(2-(4-(2-((2-(бис(2-гидроксидодецил)амино)этил)(2-гидроксидодецил)амино)этил)пиперазин-1-ил)этилазанедиил)дидодекан-2-ол (C12-200)	C12-200/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DMG 50/10/38.5/1.5 Липид:ми-РНК 10:1
LNP13	XTC	XTC/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DMG 50/10/38.5/1.5

		Липид:ми-РНК: 33:1
LNP14	MC3	MC3/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DMG 40/15/40/5 Липид:ми-РНК: 11:1
LNP15	MC3	MC3/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DSG/GalNAc-PEG-DSG 50/10/35/4.5/0.5 Липид:ми-РНК: 11:1
LNP16	MC3	MC3/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DMG 50/10/38.5/1.5 Липид:ми-РНК: 7:1
LNP17	MC3	MC3/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DSG 50/10/38.5/1.5 Липид:ми-РНК: 10:1
LNP18	MC3	MC3/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DMG 50/10/38.5/1.5 Липид:ми-РНК: 12:1
LNP19	MC3	MC3/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DMG 50/10/35/5 Липид:ми-РНК: 8:1
LNP20	MC3	MC3/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DPG 50/10/38.5/1.5 Липид:ми-РНК: 10:1
LNP21	C12-200	C12-200/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DSG 50/10/38.5/1.5 Липид:ми-РНК: 7:1
LNP22	XTC	XTC/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DSG 50/10/38.5/1.5 Липид:ми-РНК: 10:1

DSPC: дистерароилфосфатидилхолин

DPPC: дипальмитоилфосфатидилхолин

ПЭГ-DMG: ПЭГ-дидимиристоилглицерин (C14-ПЭГ или ПЭГ-C14) (ПЭГ со средней молекулярной массой 2000)

ПЭГ-DSG: ПЭГ-дистирилглицерин (C18-ПЭГ или ПЭГ-C18) (ПЭГ со средней молекулярной массой 2000)

ПЭГ-cDMA: ПЭГ-карбамоил-1,2-димиристилоксипропиламин (ПЭГ со средней молекулярной массой 2000)

Препараты, содержащие SNALP (1,2-дилиноленилокси-N,N-диметиламинопропан (DLinDMA)), описаны в международной публикации № WO 2009/127060, поданной 15 апреля 2009, которая включена в настоящее описание в виде ссылки.

Препараты, содержащие XTC, описаны, например, в предварительной заявке на выдачу патента США с регистрационным № 61/148366, поданной 29 января 2009; предварительной заявке на выдачу патента США с регистрационным №61/156851, поданной 2 марта 2009; предварительной заявке на выдачу патента США с регистрационным №, поданной 10 июня 2009; предварительной заявке на выдачу патента США с регистрационным №61/228373, поданной 24 июля 2009; предварительной заявке на выдачу патента США с регистрационным №61/239686, поданной 3 сентября 2009, и в международной заявке № PCT/US 2010/022614, поданной 29 января 2010, которые включены в настоящее описание в виде ссылки.

Препараты, содержащие MC, описаны, например, в предварительной заявке на выдачу патента США с регистрационным №61/244834, поданной 22 сентября 2009, предварительной заявке на выдачу патента США с регистрационным №61/185800, поданной 10 июня 2009, и международной заявке No. PCT/US 10/28224, поданной 10 июня 2010, которые включены в настоящее описание в виде ссылки.

Препараты, содержащие ALNY-100, описаны, например, в международной заявке на выдачу патента номер PCT/US 09/63933, поданной 10 ноября 2009, которая включена в настоящее описание в виде ссылки.

Препараты, содержащие C12-200, описаны в предварительной заявке на выдачу патента США с регистрационным №61/175770, поданной 5 мая 2009, и международной заявке № PCT/US 10/33777, поданной 5 мая 2010, которые включены в настоящее описание в виде ссылки.

Синтез катионных липидов

Любое из соединений, например, катионные липиды и тому подобные, используемые в частицах нуклеиновая кислота-липид, охарактеризованных в изобретении, могут быть получены известными способами органического синтеза, включая способы, описанные более подробно в примерах. Все заместители имеют значение, которое определено ниже, если не указано иное.

«Алкил» означает имеющий прямую цепь или разветвленный, нециклический или циклический, насыщенный алифатический углеводород, содержащий от 1 до 24 атомов углерода. Типичные насыщенные алкилы с прямой цепью включают метил, этил, н-пропил, н-бутил, н-пентил, н-гексил и тому подобные; тогда как насыщенные разветвленные алкилы включают изопропил, втор-бутил, изобутил, трет-бутил, изопентил и тому подобные. Типичные насыщенные циклические алкилы включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и тому подобные; в то время как ненасыщенные циклические алкилы включают циклопентенил и циклогексенил и тому подобные.

«Алкенил» означает алкил, который описан выше, содержащий, по меньшей мере, одну двойную связь между соседними атомами углерода. Алкенилы включают как цис-, так и транс-изомеры. Типичные, имеющие прямую цепь и разветвленные алкенилы, включают этиленил, пропиленил, 1-бутенил, 2-бутенил, изобутиленил, 1-пентенил, 2-пентенил, 3-метил-1-бутенил, 2-метил-2-бутенил, 2,3-диметил-2-бутенил и тому подобные.

«Алкинил» означает любой алкил или алкенил, который определен выше, который дополнительно содержит, по меньшей мере, одну тройную связь между соседними атомами углерода. Типичные, имеющие прямую цепь и разветвленные алкинилы, включают ацетиленил, пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил, 1-пентинил, 2-пентинил, 3-метил-1-бутенил и тому подобные.

«Ацил» означает любой алкил, алкенил или алкинил, в котором атом углерода в точке связывания замещен оксогруппой, которая определена ниже. Например, -C(=O)алкил, -C(=O)алкенил и -C(=O)алкинил являются ацильными группами.

«Гетероцикл» означает 5-7-членное моноциклическое или 7-10-членное бицилическое гетероциклическое кольцо, которое является насыщенным, ненасыщенным или ароматическим и которое содержит 1 или 2 гетероатома, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, и в котором гетероатомы азота и серы необязательно могут быть окислены, и гетероатом азота необязательно может быть кватернизован, включая бициклические кольца, в которых указанные выше гетероциклы слиты с бензольным циклом. Гетероцикл может быть связан через любой гетероатом или атом углерода. Гетероциклы включают гетероарилы, которые определены ниже. Гетероциклы включают морфолинил, пирролидинонил, пирролидинил, пиперидинил, пиперизинил, гидантоинил, валеролактамил, оксиранил, оксетанил, тетрагидрофуранил, тетрагидропиранил, тетрагидропиридинил, тетрагидропиримидинил, тетрагидротиофенил, тетрагидротиопиранил, тетрагидропиримидинил, тетрагидротиофенил, тетрагидротиопиранил и тому подобные.

Термины «необязательно замещенный алкил», «необязательно замещенный алкенил», «необязательно замещенный алкинил», «необязательно замещенный ацил» и «необязательно замещенный гетероцикл» означает, что в том случае, когда он замещен, по меньшей мере, один атом водорода заменен заместителем. В случае оксо-заместителя (=O) заменены два атома водорода. В этом отношении заместители включают оксогруппу, галоген, гетероцикл, -CN, -OR^x, -NR^xR^y, -NR^xC(=O)R^y, -NR^xSO₂R^y, -C(=O)R^x, -C(=O)OR^x, -C(=O)NR^xR^y, -SO_nR^x и -SO_nNR^xR^y, где n равен 0, 1 или 2, R^x и R^y являются одинаковыми или разными и независимо означают водород, алкил или гетероцикл, и каждый из указанных заместителей алкила и гетероцикла может быть дополнительно замещен одним или несколькими заместителями: оксогруппой, галогеном, -OH, -CN, алкилом, -OR^x, гетероциклом, -NR^xR^y, -NR^xC(=O)R^y, -NR^xSO₂R^y, -C(=O)R^x, -C(=O)OR^x, -C(=O)NR^xR^y, -SO_nR^x и -SO_nNR^xR^y.

«Галоген» означает фтор, хлор, бром и йод.

В некоторых вариантах в способах, охарактеризованных в изобретении, может требоваться применение защитных групп. Методика использования защитных групп хорошо известна в данной области (См., например, Protective groups in organic synthesis, Green, T.W. et al, Wiley-Interscience, New York City, 1999). Коротко, защитные группы в контексте настоящего изобретения представляют собой любую группу, которая снижает или исключает нежелательную реактивность функциональной группы. Защитная группа может быть добавлена к функциональной группе, чтобы маскировать ее реактивность во время некоторых реакций, и затем удалена, чтобы демаскировать исходную функциональную группу. В некоторых вариантах используют «защитную группу спирта». «Защитная группа спирта» представляет собой любую группу, которая уменьшает или исключает нежелательную реактивность спиртовой функциональной группы. Защитные группы могут быть добавлены и удалены с использованием способов, хорошо известных в данной области.

Синтез соединений формулы A

В одном варианте частицы нуклеиновая кислота-липид, охарактеризованные в изобретении, готовят, используя катионный липид формулы A:

где R1 и R2 независимо означают алкил, алкенил или алкинил, каждый из которых необязательно может быть замещен, и R3 и R4, каждый независимо, означают низший алкил, или R3 и R4, вместе взятые, могут образовывать необязательно замещенное гетероциклическое кольцо. В некоторых вариантах катионный липид представляет собой XTC (2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан). В общем, липид формулы A, указанной выше, может быть получен с использованием следующих схем реакций 1 или 2, где все заместители имеют значение, которое определено выше, если не указано иное.

Схема 1

Липид A, в котором R₁ и R₂ независимо означают алкил, алкенил или алкинил, каждый из которых необязательно может быть замещен, и R₃ и R₄ независимо означают низший алкил, или R₃ и R₄, вместе взятые могут образовывать необязательно замещенное гетероциклическое кольцо, может быть получен согласно схеме 1. Кетон 1 и бромид 2 могут быть приобретены или получены согласно способам, известным в данной области. Взаимодействие 1 и 2 дает кеталь 3. Обработка кеталя 3 амином 4 дает липиды формулы A. Липиды формулы A могут быть превращены в соответствующую соль аммония с использованием органической соли формулы 5, где X означает анионный противоион, выбранный из галогена, гидроксида, фосфата, сульфата или тому подобного.

Схема 2

Альтернативно, исходное вещество кетон 1 может быть получен согласно схеме 2. Реактив Гриньяра 6 и цианид 7 могут быть приобретены или получены согласно способам, известным специалистам в данной области. Взаимодействие 6 и 7 дает кетон 1. Превращение кетона 1 в соответствующие липиды формулы A осуществляют, как описано на схеме 1.

Синтез MC3

Получение DLin-M-C3-DMA (т.е., (6Z,9Z,28Z,31Z)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил-4-(диметиламино)бутаноата) осуществляли следующим образом. Раствор (6Z,9Z,28Z,31Z)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ола (0,53 г), гидрохлорида 4-N,N-диметиламиномасляной кислоты (0,51 г), 4-N,N-диметиламинопиридина (0,61 г) и гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (0,53 г) в дихлорметане (5 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Раствор промывали разбавленной хлористоводородной кислотой, затем разбавленным водным раствором бикарбоната натрия. Органические фракции сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и растворитель удаляли на роторном вакуумной испарителе. Остаток пропускали через колонку с силикагелем (20 г), используя градиентное элюирование 1-5% метанолом/дихлорметаном. Фракции, содержащие очищенный продукт, объединяли и растворитель удаляли, получая бесцветное масло (0,54 г).

Синтез ALNY-100

Синтез кеталя 519 [ALNY-100] осуществляли, используя следующую схему 3:

Синтез 515:

К перемешиваемой суспензии LiA1H4 (3,74 г, 0,09852 моль) в 200 мл безводного ТГФ в двугорлой круглодонной колбе (1 л) медленно добавляли раствор 514 (10 г, 0,04926 моль) в 70 мл ТГФ при 0°C в атмосфере азота. После завершения добавления реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и затем кипятили с обратным холодильником в течение 4 часов. Протекание реакции контролировали, используя ТСХ. После завершения реакции (по данным ТСХ) смесь охлаждали до 0°C и гасили, осторожно добавляя насыщенный раствор Na₂SO₄. Реакционную смесь перемешивали в течение 4 часов при комнатной температуре и фильтровали. Остаток тщательно промывали ТГФ. Фильтрат и промывки смешивали и разбавляли, используя 400 мл диоксана и 26 мл концентрированной HCl, и перемешивали в течение 20 минут при комнатной температуре. Летучие вещества удаляли в вакууме, получая гидрохлоридную соль 515 в виде белого твердого вещества. Выход: 7,12 г. 1H-ЯМР (ДМСО, 400 МГц): δ = 9,34 (уширенный, 2H), 5,68 (с, 2H), 3,74 (м, 1H), 2,66-2,60 (м, 2H), 2,50-2,45 (м, 5H).

Синтез 516:

К перемешиваемому раствору соединения 515 в 100 мл безводного ДХМ в двугорлой круглодонной колбе объемом 250 мл добавляли NEt3 (37,2 мл, 0,2669 моль) и охлаждали до 0°C в атмосфере азота. После медленного добавления N-(бензилоксикарбонилокси)сукцинимида (20 г, 0,08007 моль) в 50 мл безводного ДХМ реакционной смеси давали возможность нагреться до комнатной температуры. После завершения реакции (2-3 часа по данным ТСХ) смесь последовательно промывали 1N раствором HCl (1×100 мл) и насыщенным раствором NaHCO₃ (1×50 мл). Затем органический слой сушили над безводным Na₂SO₄ и растворитель выпаривали, получая неочищенное вещество, которое очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая 516 в виде липкой массы. Выход: 11 г (89%). 1H-ЯМР (CDCl3, 400 МГц): δ = 7,36-7,27(м, 5H), 5,69 (с, 2H), 5,12 (с, 2H), 4,96 (уш., 1H), 2,74 (с, 3H), 2,60(м, 2H), 2,30-2,25(м, 2H). ЖХ-МС [M+H]-232,3 (96,94%).

Синтез 517A и 517B:

Циклопентен 516 (5 г, 0,02164 моль) растворяли в растворе 220 мл ацетона и воды (10:1) в одногорлой круглодонной колбе объемом 500 мл и к ней добавляли N-метилморфолин-N-оксид (7,6 г, 0,06492 моль), затем 4,2 мл 7,6% раствора OsO₄ (0,275 г, 0,00108 моль) в трет-бутаноле при комнатной температуре. После завершения реакции (~ 3 часа) смесь гасили добавлением твердого Na₂SO₃ и полученную смесь перемешивали в течение 1,5 часов при комнатной температуре. Реакционную смесь разбавляли ДХМ (300 мл) и промывали водой (2×100 мл), затем насыщенным раствором NaHCO₃ (1×50 мл), водой (1×30 мл) и, наконец, насыщенным раствором соли (1×50 мл). Органическую фазу сушили над безводным Na₂SO₄ и растворитель удаляли в вакууме. Хроматографическая очистка на колонке с силикагелем сырого вещества давала смесь диастереомеров, которые разделяли препаративной ВЭЖХ. Выход: - грубый 6 г.

517A - пик-1 (белок твердого вещества), 5,13 г (96%). 1H-ЯМР (ДМСО, 400 МГц): δ = 7,39-7,31(м, 5H), 5,04(с, 2H), 4,78-4,73 (м, 1H), 4,48-4,47(d, 2H), 3,94-3,93(м, 2H), 2,71(с, 3H), 1,72- 1,67(м, 4H). ЖХ-МС - [M+H]-266,3, [M+NH4 +]-283,5 фактический, ВЭЖХ-97,86%.

Стереохимию подтверждали рентгенографией.

Синтез 518:

Применяя способ, аналогичный способу, описанному для синтеза соединения 505, получали соединение 518 (1,2 г, 41%) в виде бесцветного масла. ¹H-ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ= 7,35-7,33 (м, 4H), 7,30-7,27 (м, 1H), 5,37-5,27 (м, 8H), 5,12 (с, 2H), 4,75 (м,1H), 4,58-4,57 (м, 2H), 2,78-2,74 (м, 7H), 2,06-2,00 (м, 8H), 1,96-1,91 (м, 2H), 1,62 (м, 4H), 1,48 (м, 2H), 1,37-1,25 (уш.м, 36H), 0,87 (м, 6H). ВЭЖХ-98,65%.

Общий способ синтеза соединения 519:

Раствор соединения 518 (1 экв.) в гексане (15 мл) добавляли по каплям в ледяной раствор LAH в ТГФ (1 М, 2 экв.). После завершения добавления смесь нагревали при 40°C в течение 0,5 часа, затем снова охлаждали на бане со льдом. Смесь осторожно гидролизовали насыщенным водным раствором Na₂SO₄, затем фильтровали через целит, и восстанавливали до масла. Хроматография на колонке давала чистый 519 (1,3 г, 68%), который получали в виде бесцветного масла. ¹³C ЯМР = 130,2, 130,1 (x2), 127,9 (x3), 112,3, 79,3, 64,4, 44,7, 38,3, 35,4, 31,5, 29,9 (x2), 29,7, 29,6 (x2), 29,5 (x3), 29,3 (x2), 27,2 (x3), 25,6, 24,5, 23,3, 226, 14,1; электроспрей МС (+ve): молекулярная масса для C44H80NO2 (M+H)+ вычисленная 654,6, найденная 654,6.

Препараты, полученные либо стандартным способом, либо способом без экструзии, могут быть охарактеризованы сходным образом. Например, препараты обычно характеризуют, используя визуальный просмотр. Они должны представлять собой беловатые прозрачные растворы, не содержащие агрегатов или осадка. Размер частиц и распределение частиц по размеру в случае липидных наночастиц можно измерить на основании светорассеяния, используя, например, Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, USA). Частицы должны иметь размер примерно 20-300 нм, например, размер 40-100 нм. Распределение по размеру частиц должно быть унимодальным. Концентрацию суммарной днРНК в препарате, а также улавливаемой фракции оценивают в основанном на исключении анализе с использованием красителя. Образец приготовленной днРНК можно подвергнуть инкубации с РНК-связывающим красителем, таким как Ribogreen (Molecular Probes), в присутствии или в отсутствие разрушающего препарат поверхностно-активного вещества, например, 0,5% тритона-X100. Суммарную днРНК в препарате можно определить по сигналу от образца, содержащего поверхностно-активное вещество, по сравнению со стандартной кривой. Улавливаемую фракцию можно определить, вычитая содержание «свободной» днРНК (которое измеряют по сигналу в отсутствие поверхностно-активного вещества) из содержания суммарной днРНК. Процентное содержание улавливаемой днРНК обычно >85%. В случае препарата SNALP размер частиц составляет, по меньшей мере 30 нм, по меньшей мере 40 нм, по меньшей мере 50 нм, по меньшей мере 60 нм, по меньшей мере 70 нм, по меньшей мере 80 нм, по меньшей мере 90 нм, по меньшей мере 100 нм, по меньшей мере 110 нм и по меньшей мере 120 нм. Подходящий диапазон обычно составляет от примерно, по меньшей мере, 50 нм до примерно, по меньшей мере, 110 нм, примерно, по меньшей мере, от 60 нм до примерно, по меньшей мере, 100 нм или примерно, по меньшей мере, от 80 нм до примерно, по меньшей мере, 90 нм.

Композиции и препараты для перорального введения включают порошки или гранулы, микрочастицы, наночастицы, суспензии или растворы в воде или в безводных средах, капсулы, гелевые капсулы, саше, таблетки или мини-таблетки. Для их получения может оказаться желательным использование загустителей, ароматизаторов, разбавителей, эмульгаторов, диспергирующих добавок или связующих агентов. В некоторых вариантах пероральными препаратами являются препараты, в случае которых днРНК, охарактеризованную в изобретении, вводят в сочетании с одним или несколькими усилителями проницаемости, поверхностно-активными веществами и хелатообразующими агентами. Подходящие поверхностно-активные вещества включают жирные кислоты и/или их сложные эфиры или соли, желчные кислоты и/или их соли. Подходящими желчными кислотами/солями являются хенодезоксихолевая кислота (CDCA) и урзодезоксихенодезоксихолевая кислота (UDCA), холевая кислота, дегидрохолевая кислота, дезоксихолевая кислота, глюкохолевая кислота, гликохолевая кислота, гликодезоксихолевая кислота, таурохолевая кислота, тауродезоксихолевая кислота, тауро-24,25-дигидрофузидат натрия и гликодигидрофузидат натрия. Подходящими жирными кислотами являются арахидоновая кислота, ундекановая кислота, олеиновая кислота, лауриновая кислота, каприловая кислота, каприновая кислота, миристиновая кислота, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота, линолевая кислота, линоленовая кислота, дикапрат, трикапрат, моноолеин, дилаурин, глицерил-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитин, ацилхолин или моноглицерид, диглицерид или их фармацевтически приемлемые соли (например, соли натрия). В некоторых вариантах используют комбинации усилителей проницаемости, например жирных кислот/солей в сочетании с желчными кислотами/солями. Одним примером комбинации является натриевая соль лауриновой кислоты, каприновой кислоты и UDCA. Другими усилителями проницаемости являются полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир, полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир. днРНК, охарактеризованные в изобретении, могут быть доставлены перорально, в гранулярной форме, включая распыляемые сухие частицы, или в комплексе с образованием микро- или наночастиц. Агенты, образующие комплексы с днРНК, включают полиаминокислоты; полимимины; полиакрилаты; полиалкилакрилаты, полиоксэтаны, полиалкилцианоакрилаты; катионизированные желатины, альбумины, крахмалы, акрилаты, полиэтиленгликоли (ПЭГ) и крахмалы; полиалкилцианоакрилаты; DEAE-дериватизированные полиимины, пуллуланы, целлюлозы и крахмалы. Подходящими комплексообразующими агентами являются хитозан, N-триметилхитозан, поли-L-лизин, полигистидин, полиорнитин, полиспермины, протамин, поливинилпиридин, политиодиэтиламинометилэтилен P(TDAE), полиаминостирол (например, п-амино), поли(метилцианоакрилат), поли(этилцианоакрилат), поли(бутилцианоакрилат), поли(изобутилцианоакрилат), поли(изогексилцианоакрилат), DEAE-метакрилат, DEAE-гексилакрилат, DEAE-акриламид, DEAE-альбумин и DEAE-декстран, полиметилакрилат, полигексилакрилат, поли(D,L-молочная кислота), сополимер DL-молочной и гликолевой кислоты (PLGA), альгинат и полиэтиленгликоль (ПЭГ). Пероральные препараты днРНК и их получение подробно описаны в патенте США 6887906, публикации патента США №20030027780 и в патенте США №6747014, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки.

Композиции и препараты для парентерального, интрапаренхимного (в головной мозг), интратекального, внутрижелудочкового введения или введения в печень могут включать стерильные водные растворы, которые могут также содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки, такие как без ограничения усилители проницаемости, соединения-носители и другие фармацевтически приемлемые носители или эксципиенты.

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут включать без ограничения растворы, эмульсии и препараты, содержащие липосомы. Такие композиции могут быть созданы из различных компонентов, которые включают без ограничения предварительно приготовленные жидкости, самоэмульгирующиеся твердые вещества и самоэмульгирующиеся полутвердые вещества.

Фармацевтические препараты, охарактеризованные в настоящем изобретении, которые обычно могут представлять собой стандартную лекарственную форму, могут быть получены обычными способами, хорошо известными в фармацевтической промышленности. Такие способы включают в себя стадию смешивания активных ингредиентов с фармацевтически приемлемым(и) носителем(ями) и эксципиентом(ами). В общем, препараты получают путем равномерного и тщательного смешивания активных ингредиентов с жидкими носителями и с тонко измельченными твердыми носителями или с теми и другими, с последующим, если это необходимо, формованием продукта.

Композиции, охарактеризованные в настоящем изобретении, могут быть приготовлены в любой из многих возможных дозированных форм, таких как без ограничения таблетки, капсулы, гелевые капсулы, жидкие сиропы, мягкие гели, суппозитории и клизмы. Композиции также могут быть приготовлены в виде суспензий в водной, безводной или смешанной среде. Водные суспензии могут дополнительно содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, включая, например, натрий-карбоксиметилцеллюлозу, сорбит и/или декстран. Такая суспензия может также содержать стабилизаторы.

Дополнительные препараты

Эмульсии

Композиции согласно настоящему изобретению могут быть получены и приготовлены в виде эмульсий. Эмульсии обычно представляют собой гетерогенные системы, состоящие из одной жидкости, диспергированной в другой жидкости в виде капелек, диаметр которых обычно превышает 0,1 мкм (См., например, Ansel′s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et al., in Remington′s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301). Эмульсии часто представляют собой двухфазные системы, содержащие две несмешивающиеся жидкие фазы, однородно смешанные и диспергированные одна в другой. В общем, эмульсии могут представлять собой либо эмульсии типа «вода в масле» (в/м), либо «масло в воде» (м/в). Если водная фаза является тонкодисперсной и диспергирована в виде небольших капелек в объемной масляной фазе, то получаемую в результате композицию называют эмульсией типа «вода в масле» (в/м). Альтернативно, если масляная фаза является тонкодисперсной и диспергирована в виде небольших капелек в объемной водной фазе, то получаемую в результате композицию называют эмульсией типа «масло в воде» (м/в). Помимо диспергированных фаз, эмульсии могут содержать дополнительные компоненты и активное лекарственное средство, которое может присутствовать в виде раствора в водной фазе, масляной фазе или в виде отдельной фазы. При необходимости, в эмульсии могут быть также добавлены фармацевтические эксципиенты, такие как эмульгаторы, стабилизаторы, красители и антиоксиданты. Фармацевтические эмульсии могут также представлять собой многосоставные эмульсии, состоящие более чем из двух фаз, например, в случае эмульсий типа «масло - в воде - в масле» (м/в/м) и типа «вода - в масле - в воде» (в/м/в). Такие сложные препараты часто имеют определенные преимущества, которыми не обладают простые бинарные эмульсии. Многосоставные эмульсии, в которых отдельные масляные капельки эмульсии типа м/в заключены в небольшие водные капельки, составляют эмульсию типа в/м/в. Подобным образом, система масляных капелек, включенных в глобулы воды, стабилизированные в масляной непрерывной фазе, составляют эмульсию типа м/в/м.

Эмульсии характеризуются невысокой термодинамической стабильностью или ее отсутствием. Часто дисперсная или прерывистая фаза эмульсии хорошо диспергируется во внешней или в непрерывной фазе и поддерживается в этой форме, благодаря эмульгаторам или вязкости данного препарата. Любая из фаз эмульсии может быть полутвердой или твердой, как в случае основ для мазей типа эмульсии и кремов. Другой способ стабилизации эмульсий заключается в использовании эмульгаторов, которые могут быть включены в любую фазу эмульсии. В общих чертах, эмульгаторы могут быть подразделены на четыре категории: синтетические поверхностно-активные вещества, встречающиеся в природе эмульгаторы, абсорбционные основы и тонкодисперсные твердые вещества (См., например, Ansel′s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).

Синтетические поверхностно-активные вещества, также известные как поверхностно-активные агенты, находят широкое применение в изготовлении эмульсионных препаратов и описаны в литературе (См., например, Ansel′s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199). Поверхностно-активные вещества обычно являются амфифильными и содержат гидрофильную и гидрофобную часть. Отношение гидрофильности к гидрофобности поверхностно-активного вещества называется гидрофильно-липофильным балансом (ГЛБ) и является ценным инструментом при определении категорий и при отборе поверхностно-активных веществ для приготовления препаратов. Поверхностно-активные вещества могут быть разделены на разные классы на основе природы их гидрофильной группы: неионогенные, анионогенные, катионогенные и амфотерные (См., например, Ansel′s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285).

Природными эмульгаторами, используемыми в эмульсионных препаратах, являются ланолин, пчелиный воск, фосфатиды, лецитин и аравийская камедь. Абсорбционные основы обладают гидрофильными свойствами, и поэтому они могут впитывать воду и образовывать эмульсии типа в/м, которые еще сохраняют свою полутвердую консистенцию, и такими основами являются безводный ланолин и гидрофильный вазелин. Тонко измельченные твердые вещества также применяли в качестве хороших эмульгаторов, особенно в сочетании с поверхностно-активными веществами и в вязких препаратах. Указанные вещества включают полярные неорганические твердые вещества, такие как гидроксиды тяжелых металлов, ненабухающие глины, такие как бентонит, аттапульгит, гекторит, каолин, монтмориллонит, коллоидный силикат алюминия и коллоидный силикат магния-алюминия, пигменты и неполярные твердые вещества, такие как уголь или глицерилтристеарат.

Большое разнообразие эмульгирующих веществ также включают в эмульсионные препараты, и такие вещества вносят вклад в определенные свойства эмульсий. Такими веществами являются жиры, масла, воски, жирные кислоты, жирные спирты, сложные эфиры жирных кислот, увлажнители, гидрофильные коллоиды, консерванты и антиоксиданты (Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).

Гидрофильными коллоидами или гидроколлоидами являются встречающиеся в природе смолы и синтетические полимеры, такие как полисахариды (например, аравийская камедь, агар, альгиновая кислота, каррагенан, гуаровая камедь, камедь карайи и трагакантовая камедь), производные целлюлозы (например, карбоксиметилцеллюлоза и карбоксипропилцеллюлоза) и синтетические полимеры (например, карбомеры, эфиры целлюлозы и карбоксивиниловые полимеры). Такие вещества диспергируются или набухают в воде с образованием коллоидных растворов, которые стабилизируют эмульсию за счет образования прочных межфазных пленок вокруг капелек дисперсионной фазы и посредством повышения вязкости внешней фазы.

Так как эмульсии часто содержат ряд ингредиентов, таких как углеводы, белки, стиролы и фосфатиды, которые могут хорошо поддерживать рост микробов, то часто в такие препараты включают консерванты. Широко используемыми консервантами, включаемыми в эмульсионные препараты, являются метилпарабен, пропилпарабен, четвертичные аммониевые соли, хлорид бензалкония, сложные эфиры п-гидроксибензойной кислоты и борная кислота. В эмульсионные препараты также обычно добавляют антиоксиданты для предотвращения разложения препарата. Используемыми антиоксидантами могут быть акцепторы свободных радикалов, такие как токоферолы, алкилгаллаты, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, или восстановители, такие как аскорбиновая кислота и метабисульфит натрия, и антиоксиданты-синергисты, такие как лимонная кислота, винная кислота и лецитин.

Применение эмульсионных препаратов чрескожным, пероральным и парентеральным путями и способы их производства описаны в литературе (См., например, Ansel′s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). Эмульсионные препараты для пероральной доставки очень широко применяли, вследствие простоты их приготовления, а также их эффективности с точки зрения всасывания и биологической доступности (См., например, Ansel′s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). Слабительные на основе минерального масла, растворимые в масле витамины и питательные препараты с высоким содержание жира относятся к веществам, которые обычно вводят перорально в виде эмульсий «м/в».

В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиции и-РНК и нуклеиновых кислот готовят в виде микроэмульсий. Микроэмульсия может быть определена как система, состоящая из воды, масла и амфифильного вещества, которая представляет собой оптически изотропный и термодинамически стабильный жидкий раствор (См., например, Ansel′s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). Обычно микроэмульсии представляют собой системы, которые получают сначала путем диспергирования масла в водном растворе поверхностно-активного вещества с последующим добавлением достаточного количества четвертого компонента, обычно спирта со средней длиной цепи, с образованием прозрачной системы. Поэтому микроэмульсии были также описаны как термодинамически стабильные изотропно чистые дисперсии двух несмешивающихся жидкостей, которые стабилизируются межфазными пленками, состоящими из поверхностно-активных молекул (Leung and Shah, в: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, p. 185-215). Микроэмульсии обычно получают путем объединения от трех до пяти компонентов, которые включают масло, воду, поверхностно-активное вещество, вторичное поверхностно-активное вещество и электролит. Является ли микроэмульсия микроэмульсией типа «вода в масле» (в/м) или «масло в воде» (м/в), зависит от свойств масла и используемого поверхностно-активного вещества и от структуры и геометрической упаковки полярных головок и углеводородных хвостов поверхностно-активных молекул (Schott, in Remington′s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271).

Были проведены всесторонние исследования фазовых диаграмм с использованием феноменологического подхода и были получены исчерпывающие сведения о том, как специалист в данной области может приготовить микроэмульсии (См., например, Ansel′s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335). По сравнению со стандартными эмульсиями микроэмульсии обеспечивают преимущество, которое заключается в солюбилизации не растворимых в воде лекарственных средств в препарате, состоящем из термодинамически стабильных капелек, которые образуются спонтанно.

Поверхностно-активные вещества, используемые для получения микроэмульсий, включают без ограничения ионогенные поверхностно-активные вещества, неионогенные поверхностно-активные вещества, Brij 96, простые олеиловые эфиры полиоксиэтилена, сложные эфиры полиглицерина и жирных кислот, монолаурат тетраглицерина (ML310), моноолеат тетраглицерина (MO310), моноолеат гексаглицерина (PO310), пентаолеат гексаглицерина (PO500), монокапрат декаглицерина (MCA750), моноолеат декаглицерина (MO750), секвиолеат декаглицерина (SO750), декаолеат декаглицерина (DAO750), отдельно или в сочетании со вторичными поверхностно-активными веществами. Вторичное поверхностно-активное вещество, обычно спирт с короткой цепью, такой как этанол, 1-пропанол и 1-бутанол, служит для повышения текучести за счет проникновения в пленку поверхностно-активного вещества с последующим образованием неупорядоченной пленки в результате образования пустого пространства между молекулами поверхностно-активного вещества. Однако микроэмульсии могут быть получены и без использования вторичных поверхностно-активных веществ, и в данной области известны самоэмульгирующиеся микроэмульсионные системы, не содержащие спирта. Водной фазой обычно могут служить без ограничения вода, водный раствор лекарственного средства, глицерин, ПЭГ300, ПЭГ400, полиглицерины, пропиленгликоли и производные этиленгликоля. Масляной фаза может содержать без ограничения такие вещества, как Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, сложные эфиры жирных кислот, моно-, ди- и триглицериды со средней длиной цепи (C8-C12), полиоксиэтилированные эфиры глицерина и жирных кислот, жирные спирты, полигликолевые глицериды, насыщенные полигликолизированные С8-С10-глицериды, растительные масла и силиконовое масло.

Микроэмульсии представляют особый интерес с точки зрения солюбилизации и усиления всасывания лекарственных средств. Было высказано предположение, что микроэмульсии на основе липидов (как м/в, так и в/м) повышают пероральную биологическую доступность лекарственных средств, включая пептиды (См., например, патенты США №6191105, 7063860, 7070802, 7157099; публикацию Constantinides с соавторами, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Преимущества микроэмульсий заключаются в улучшенной солюбилизации лекарственных средств, защите лекарственного средства от ферментативного гидролиза, возможном усилении всасывания лекарственного средства, обусловленном индуцированным поверхностно-активным веществом изменением текучести и проницаемости мембраны, легкости приготовления, легкости перорального введения в виде твердых лекарственных форм, улучшенной клинической эффективности и пониженной токсичности (См., например, патенты США №6191105, 7063860, 7070802, 7157099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). Часто микроэмульсии могут образовываться спонтанно при взаимодействии их компонентов при температуре окружающей среды. Это может быть особенно предпочтительным в случае приготовления термолабильных лекарственных средств, пептидов или и-РНК. Микроэмульсии также являются эффективными при трансдермальной доставке активных компонентов в случае как косметических, так и фармацевтических применений. Предполагается, что имеющие форму микроэмульсий композиции и препараты согласно настоящему изобретению будут способствовать повышению уровня системного всасывания и-РНК и нуклеиновых кислот из желудочно-кишечного тракта, а также повышению локального поглощения и-РНК и нуклеиновых кислот клетками.

Микроэмульсии согласно настоящему изобретению могут также содержать дополнительные компоненты и добавки, такие как моностеарат сорбитана (Grill 3), лабразол и усилители проницаемости, улучшающие свойства препарата и усиливающие всасывание и-РНК и нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению. Усилители проницаемости, используемые в микроэмульсиях согласно настоящему изобретению, могут быть классифицированы как вещества, принадлежащие к одной из пяти широких категорий, а именно поверхностно-активным веществам, жирным кислотам, солям желчных кислот, хелатообразующим агентам и веществам, не являющимся ни хелатообразующими, ни поверхностно-активными веществами (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Каждый из таких классов обсуждался выше.

Усилители проницаемости

В одном варианте осуществления настоящего изобретения используют различные усилители проницаемости в целях обеспечения эффективной доставки нуклеиновых кислот, в частности и-РНК, в кожу животных. Большинство лекарственных средств присутствует в растворе как в ионизованной, так и в неионизованной формах. Однако обычно через клеточные мембраны легко проходят только растворимые в липидах или липофильные лекарственные средства. Было обнаружено, что через клеточные мембраны могут проходить даже нелипофильные лекарственные средства, если такая пересекаемая мембрана обработана усилителем проницаемости. Усилители проницаемости, помимо стимуляции диффузии нелипофильных лекарственных средств через клеточные мембраны, также повышают проницаемость для липофильных лекарственных средств.

Усилители проницаемости могут быть классифицированы как соединения, принадлежащие к одной из пяти широких категорий, то есть поверхностно-активные вещества, жирные кислоты, соли желчных кислот, хелатообразующие агенты и соединения, не образующие хелатные комплексы и не являющиеся поверхностно-активными веществами (См., например, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). Каждый из вышеупомянутых классов усилителей проницаемости более подробно описан ниже.

Поверхностно-активные вещества: В соответствии с настоящим изобретением, поверхностно-активные вещества (или «поверхностно-активные агенты) представляют собой химические молекулы, которые при их растворении в водном растворе снижают поверхностное натяжение раствора или межфазное поверхностное натяжение между водным раствором и другой жидкостью, в результате чего повышается уровень всасывания и-РНК через слизистую оболочку. Помимо солей желчных кислот и жирных кислот, такими усилителями проницаемости являются, например, лаурилсульфат натрия, полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир и полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир (См., например, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92); и перфторированные эмульсии, такие как FC-43 (Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).

Жирные кислоты: Различные жирные кислоты и их производные, которые действуют как усилители проницаемости, включают, например, олеиновую кислоту, лауриловую кислоту, каприновую кислоту (н-декановую кислоту), миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин (1-моноолеоил-рац-глицерин), дилаурин, каприловую кислоту, арахидоновую кислоту, 1-монокапрат глицерина, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитины, ацилхолины или их сложные С_1-20 алкиловые эфиры (например, метиловый, изопропиловый и трет-бутиловый) и моно- и диглицериды (т.е., олеат, лаурат, капрат, миристат, пальмитат, стеарат, линолеат и т.п.) (См., например, Touitou, E., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).

Соли желчных кислот: Физиологическая роль желчи состоит в облегчении диспергирования и всасывания липидов и жирорастворимых витаминов (См., например, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935). Различные природные соли желчных кислот и их синтетические производные действуют как усилители проницаемости. Таким образом, термин «соли желчных кислот» включает любой из встречающихся в природе компонентов желчи, а также любое из их синтетических производных. Подходящие соли желчных кислот включают, например, холевую кислоту (или ее фармацевтически приемлемую натриевую соль, холат натрия), дегидрохолевую кислоту (дегидрохолат натрия), дезоксихолевую кислоту (дезоксихолат натрия), глюкохолевую кислоту (глюкохолат натрия), гликохолевую кислоту (гликохолат натрия), гликодезоксихолевую кислоту (гликодезоксихолат натрия), таурохолевую кислоту (таурохолат натрия), тауродезоксихолевую кислоту (тауродезоксихолат натрия), хенодезоксихолевую кислоту (хенодезоксихолат натрия), урсодезоксихолевую кислоту (UDCA), тауро-24,25-дигидрофузидат натрия (STDHF), гликодигидрофузидат натрия и полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир (POE) (См., например, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 In: Remington′s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).

Хелатообразующие агенты: Хелатообразующие агенты, используемые в настоящем изобретении, могут быть определены как соединения, которые удаляют ионы металлов из раствора посредством образования комплексов с такими ионами, что приводит к усилению всасывания и-РНК через слизистую оболочку. Что касается использования таких агентов в качестве усилителей проницаемости в настоящем изобретении, то такие хелатообразующие агенты имеют дополнительное преимущество, которое состоит в том, что они также служат в качестве ингибиторов ДНКазы, поскольку наиболее известным ДНК-нуклеазам для осуществления катализа необходим ион двухвалентного металла, и поэтому они ингибируются хелатообразующими агентами (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Подходящие хелатообразующие агенты включают без ограничения этилендиаминотетраацетат динатрия (EDTA), лимонную кислоту, салицилаты (например, салицилат натрия, 5-метоксисалицилат и гомованилат), N-ацильные производные коллагена, лаурет-9 и N-аминоацильные производные β-дикетонов (енаминов) (См., например, Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).

Соединения, не образующие хелатные комплексы и не являющиеся поверхностно-активными веществами: В используемом в настоящем описании смысле усилители проницаемости, не образующие хелатные комплексы и не являющиеся поверхностно-активными веществами, могут быть определены как соединения, которые проявляют незначительную активность в качестве хелатообразующих агентов или в качестве поверхностно-активных веществ, но, тем не менее, усиливают всасывание и-РНК через слизистую оболочку пищеварительного тракта (См., например, Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Такой класс усилителей проницаемости включает, например, ненасыщенные циклические мочевины, производные 1-алкил- и 1-алкенилазациклоалканонов (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92); и нестероидные противовоспалительные средства, такие как диклофенак-натрий, индометацин и фенилбутазон (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).

Средства для усиления захвата и-РНК на клеточном уровне также могут быть добавлены в фармацевтические и другие композиции согласно настоящему изобретению. Например, известно, что катионные липиды, такие как липофектин (Junichi с соавторами, патент США №5705188), катионные производные глицерина и поликатионные молекулы, такие как полилизин (Lollo с соавторами, заявка PCT WO 97/30731), усиливают захват днРНК клетками. Примеры коммерчески доступных реагентов для трансфекции наряду с другими включают, например, липофектамин™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), липофектамин 2000™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), 293-фектин™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), селлфектин™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), DMRIE-C™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), FreeStyle™ MAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), липофектамин™ 2000 CD (Invitrogen; Carlsbad, CA), липофектамин™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), RNAiMAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), олигофектамин™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), оптифект™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), реагент для трансфекции X-tremeGENE Q2 (Roche; Grenzacherstrasse, Switzerland), реагент для липосомной трансфекции DOTAP (Grenzacherstrasse, Switzerland), реагент для липосомной трансфекции DOSPER (Grenzacherstrasse, Switzerland) или Fugene (Grenzacherstrasse, Switzerland), реагент трансфектам® (Promega; Madison, WI), реагент для трансфекции TransFast™ (Promega; Madison, WI), реагент Tfx™-20 (Promega; Madison, WI), реагент Tfx™-50 (Promega; Madison, WI), DreamFect™ (OZ Biosciences; Marseille, France), EcoTransfect (OZ Biosciences; Marseille, France), реагент для трансфекции TransPass^a D1 (New England Biolabs; Ipswich, MA, USA), LyoVec™/LipoGen™ (Invivogen; San Diego, CA, USA), реагент для трансфекции PerFectin (Genlantis; San Diego, CA, USA), реагент для трансфекции NeuroPORTER (Genlantis; San Diego, CA, USA), реагент для трансфекции GenePORTER (Genlantis; San Diego, CA, USA), реагент для трансфекции GenePORTER 2 (Genlantis; San Diego, CA, USA), реагент для трансфекции цитофектин (Genlantis; San Diego, CA, USA), реагент для трансфекции BaculoPORTER (Genlantis; San Diego, CA, USA), реагент для трансфекции TroganPORTER™ (Genlants; San Diego, CA, USA), RiboFect (Bioline; Taunton, MA, USA), PlasFect (Bioline; Taunton, MA, USA), UniFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, USA), SureFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, USA), или HiFect™ (B-Bridge International, Mountain View, CA, USA).

Другие средства, которые могут быть использованы для усиления проницаемости для вводимых нуклеиновых кислот, включают гликоли, такие как этиленгликоль и пропиленгликоль, пирролы, такие как 2-пиррол, азоны и терпены, такие как лимонен и ментон.

Носители

Некоторые композиции согласно настоящему изобретению в препарате также содержат соединения-носители. В используемом в настоящем описании смысле термины «соединение-носитель» или «носитель» могут относиться к нуклеиновой кислоте или ее аналогу, которые являются инертными (т.е. не обладают биологической активностью как таковые), но распознаются как нуклеиновая кислота в процессах in vivo, которые снижают биологическую доступность нуклеиновой кислоты, обладающей биологической активностью, посредством, например, расщепления биологически активной нуклеиновой кислоты или стимуляции ее удаления из кровотока. Совместное введение нуклеиновой кислоты и соединения-носителя, обычно с избытком последнего вещества, может приводить к значительному снижению количества нуклеиновой кислоты, извлекаемой в печени, почках или в других не относящихся к циркуляции резервуарах, вероятно вследствие конкуренции между соединением-носителем и нуклеиновой кислотой за их общий рецептор. Например, извлечение частично фосфортиоатной днРНК в ткани печени может быть уменьшено при совместном введении с полиинозиновой кислотой, сульфатом декстрана, полицитидиновой кислотой или 4-ацетамидо-4'-изотиоцианостильбен-2,2'-дисульфоновой кислотой (Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183).

Эксципиенты

В отличие от соединения-носителя «фармацевтический носитель» или «эксципиент» представляет собой фармацевтически приемлемый растворитель, суспендирующий агент или любой другой фармакологически инертный носитель для доставки одной или нескольких нуклеиновых кислот в организм животного. Эксципиент может быть жидким или твердым, и он может быть выбран в соответствии с планируемым способом введения, так чтобы при объединении с нуклеиновой кислотой и с другими компонентами данной фармацевтической композиции он обеспечивал желаемый объем, консистенцию и т.д.. Типичные фармацевтические носители включают без ограничения связывающие вещества (например, предварительно желатинизированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлозу и т.д.); наполнители (например, лактозу и другие сахара, микрокристаллическую целлюлозу, пектин, желатин, сульфат кальция, этилцеллюлозу, полиакрилаты или бифосфат кальция и т.д.); скользящие вещества (например, стеарат магния, тальк, диоксид кремния, коллоидный диоксид кремния, стеариновую кислоту, стеараты металлов, гидрогенизированные растительные масла, кукурузный крахмал, полиэтиленгликоли, бензоат натрия, ацетат натрия и т.д.); дезинтегрирующие средства (например, крахмал, гликолят натрия-крахмала и т.д.); и увлажнители (например, лаурилсульфат натрия и т.д.).

Фармацевтически приемлемые органические или неорганические эксципиенты, подходящие для непарентерального введения, которые не вступают во взаимодействия с нуклеиновыми кислотами, вызывающими их разрушение, также могут быть использованы для приготовления композиций согласно настоящему изобретению. Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают без ограничения воду, солевые растворы, спирты, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, кремниевую кислоту, вязкий парафин, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и тому подобное.

Препараты для местного введения нуклеиновых кислот могут включать стерильные и нестерильные водные растворы, неводные растворы в стандартных растворителях, таких как спирты, или растворы нуклеиновых кислот в жидких или твердых масляных основах. Такие растворы также могут содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки. Могут быть также использованы фармацевтически приемлемые органические или неорганические эксципиенты, подходящие для непарентерального введения, которые не вступают во взаимодействия с нуклеиновыми кислотами, которые приводят к их разрушению.

Подходящие фармацевтически приемлемые эксципиенты включают без ограничения воду, солевые растворы, спирты, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, кремниевую кислоту, вязкий парафин, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и тому подобное.

Другие компоненты

Композиции согласно изобретению могут дополнительно содержать другие вспомогательные компоненты, обычно присутствующие в фармацевтических композициях на уровнях применения, установленных в данной области. Таким образом, композиции могут содержать, например, дополнительные совместимые фармацевтически активные вещества, такие как, например, противозудные средства, вяжущие средства, местные анестетики или противовоспалительные средства, либо они могут содержать дополнительные вещества, применимые при физическом приготовлении различных дозированных форм композиций согласно настоящему изобретению, такие как красители, корригенты, консерванты, антиоксиданты, вещества для придания светопоглощающих свойств, загустители и стабилизаторы. Однако такие вещества при их добавлении не должны оказывать чрезмерного влияния на биологическую активность компонентов композиций согласно настоящему изобретению. Препараты можно стерилизовать и при необходимости смешивать с вспомогательными средствами, например, скользящими веществами, консервантами, стабилизаторами, увлажнителями, эмульгаторами, солями, влияющими на осмотическое давление, буферами, красителями, корригентами и/или ароматизириюущими веществами и тому подобными, которые не вступают во взаимодействие с нуклеиновой кислотой (кислотами) в препарате, вызывающими из разрушение.

Водные суспензии могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, включая, например, натрий-карбоксиметилцеллюлозу, сорбит и/или декстран. Суспензия также может содержать стабилизаторы.

В некоторых вариантах фармацевтические композиции, охарактеризованные в изобретении, содержат (a) одно или несколько и-РНК-соединение и (b) одно или несколько биологических средств, которые действуют по механизму, отличному от механизма РНК-и. Примерами таких биологических средств включают средства, которые мешают взаимодействию ALAS1 и, по меньшей мере, одного партнера, связывающегося с ALAS1.

Токсичность и терапевтическую эффективность таких соединений можно определять стандартными фармацевтическими способами с использованием клеточных культур или экспериментальных животных, например, для определения LD50 (дозы, летальной для 50% популяции) и ED50 (дозы, терапевтически эффективной для 50% популяции). Отношение дозы, оказывающей токсическое действие, к дозе, оказывающей терапевтическое действие, является терапевтическим индексом и может быть выражено в виде отношения LD50/ED50. Обычными являются соединения, которые имеют высокие терапевтические индексы.

Данные, полученные в результате анализов клеточной культуры или в исследованиях на животных, могут быть использованы в целях приготовления доз в определенном диапазоне для применения на человеке. Дозы композиций, охарактеризованных в изобретении, обычно лежат в диапазоне концентрации в кровотоке, который включает ED50, с небольшой токсичностью или в отсутствие токсичности. Доза может варьировать в таком диапазоне, в зависимости от используемой лекарственной формы и от применяемого способа введения. Для любого соединения, используемого в способах, охарактеризованных в изобретении, терапевтически эффективную дозу сначала можно оценить в анализах на культуре клеток. В случае моделей на животных доза может быть приготовлена так, чтобы достичь циркулирующего в плазме диапазона концентраций соединения или, в соответствующем случае, полипептидного продукта последовательности-мишени (например, достижение пониженной концентрации полипептида), который включает IC50 (т.е., концентрацию тестируемого соединения, которая приводит к полумаксимальному подавлению симптомов), которую определяют в культуре клеток. Такая информация может быть использована для более точного определения доз для человека. Уровни в плазме могут быть измерены, например, с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Помимо обсуждаемого выше введения и-РНК, охарактеризованные в изобретении, можно вводить в сочетании с другими известными средствами, эффективными при лечении заболеваний или расстройств, связанных с экспрессией ALAS1. В любом случае, лечащий врач может скорректировать количество и время введения и-РНК на основе результатов, получаемых с использованием стандартных критериев эффективности, известных в данной области или описанных в настоящей публикации.

Способы лечения заболеваний, связанных с экспрессией гена ALAS1

Изобретение, в частности, относится к применению и-РНК, мишенью которой является ALAS1, для ингибирования экспрессии ALAS1 и/или лечения заболевания, расстройства или патологического процесса, который связан с экспрессией ALAS1.

В используемом в настоящем описании смысле термины «расстройство, связанное с экспрессией ALAS1», «заболевание, связанное с экспрессией ALAS1», «патологический процесс, связанный с экспрессией ALAS1»" или тому подобные включают любое состояние, расстройство или заболевание, при котором экспрессия ALAS1 изменена (например, повышена), уровень одного или нескольких порфиринов изменен (например, повышен), уровень или активность одного или нескольких ферментов в пути биосинтеза гема (пути порфирина) изменены, или действуют другие механизмы, которые приводят к патологическим изменениям пути биосинтеза гема. Например, и-РНК, мишенью которой является ген ALAS1, или ее сочетания можно использовать для лечения состояний, при которых уровни порфирина или предшественника порфирина (например, ALA или PBG) повышены (например, некоторых порфирий), или состояний, при которых существуют дефекты ферментов в пути биосинтеза гема (например, некоторых порфирий). Расстройства, связанные с экспрессией ALAS1, включают, например, X-сцепленную сидеробластную анемию (XLSA), порфирию вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ночную порфирию), острую интермиттирующую порфирию (AIP), врожденную эритропоэтическую порфирию, позднюю кожную порфирию, наследственную копропорфирию (копропорфирию), смешанную порфирию, эритропоэтическую протопорфирию (EPP), и временную эритропорфирию новорожденных.

В используемом в настоящем описании смысле «субъектом», подвергаемым лечению согласно способам, описанным в настоящей публикации, является человек или животное, отличное от человека, например, млекопитающее. Млекопитающим может быть, например, грызун (например, крыса или мышь) или примат (например, обезьяна). В некоторых вариантах субъектом является человек.

В некоторых вариантах субъект страдает от расстройства, связанного с экспрессией ALAS1 (например, у него диагностирована порфирия или он страдает от одного или нескольких симптомов порфирии и является носителем мутации, ассоциированной с порфирией), или для него существует риск развития расстройства, связанного с экспрессией ALAS1 (например, субъект с порфирией в семейном анамнезе или субъект, который является носителем генетической мутации, ассоциированной с порфирией).

Классификация порфирий, включая острые печеночные порфирии, описана, например, в работе Balwani, M. и Desnick, R.J., Blood, 120(23), опубликованной он-лайн: Blood First Edition paper, 12 июля, 102; DOI 10.1182/blood-2012-05-423186. Как описано в публикации Balwain и Desnick, острая интермиттирующая порфирия (AIP), наследственная копропорфирия (HCP), смешанная порфирия (VP) являются аутосомно-доминантными порфириями, а порфирия вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP) является аутосомно-рецессивной. В редких случаях AIP, HCP, и VP встречаются в виде гомозиготных доминантных форм. Кроме того, существует редкая гомозиготная рецессивная форма поздней кожной порфирии (PCT), которая является единственной кожной формой печеночной порфирии и также известна как гепатоэритропоэтическая порфирия. Клинические и лабораторные признаки таких порфирий описаны в таблице 11 ниже.

Таблица 11 Печеночные порфирии человека: клинические и лабораторные признаки
Порфирия	Недостаточность фермента	Наследование	Основные симптомы, NV или CP	Ферментативная активность, в % от нормальной	Повышенный уровень предшественников порфиринов и/или порфиринов
Эритроциты	Моча	Кал
Острые печеночные порфирии
ADP	ALA-дегидратаза	AR	NV	~5	Zn-протопорфирин	ALA, копропорфирин III	_
AIP	HMB-синтаза	AD	NV	~50	_	ALA, PBG, уропорфирин	_
HCP	копро-оксидаза	AD	NV и CP	~50	_	ALA, PBG, копропорфирин III	копропорфирин III
VP	прото-оксидаза	AD	NV и CP	~50	_	ALA, PBG копропорфирин III	копропорфирин III, протопорфирин
Кожная форма печеночной порфирии
PCT	URO-декарбоксилаза	спорадическая или AD	CP	<20	_	уропорфирин, 7-карбоксилатпорфирин	уропорфирин, 7-карбоксилатпорфирин
AR означает аутосомно-рецессивное; AD, аутосомно-доминантное; NV, нейровисцеральное; CP, кожная фоточувствительность; и -, не применимо. * Повышение, которое может быть важным для диагностики.

В некоторых вариантах субъект имеет порфирию или для него существует риск развития порфирии, например, печеночной порфирии например, AIP, HCP, VP, ADP или гепатоэритропоэтической порфирии.

В некоторых вариантах порфирия представляет собой острую печеночную порфирию, например, острую печеночную порфирию, выбранную из острой интермиттирующей порфирии (AIP), наследственной копропорфирии (HCP), смешанной порфирии (VP), и порфирии вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP).

В некоторых вариантах порфирия представляет собой двойную порфирию, например, по меньшей мере, две порфирии. В некоторых вариантах двойная порфирия включает две или более порфирий, выбранных из острой интермиттирующей порфирии (AIP) наследственной копропорфирии (HCP), смешанной порфирии (VP) и порфирии вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP).

В некоторых вариантах порфирия представляет собой гомозиготную доминантную печеночную порфирию (например, гомозиготную доминантную AIP, HCP, или VP) или гепатоэритропоэтическую порфирию. В некоторых вариантах порфирия представляет собой AIP, HCP, VP или гепатоэритропоэтическую порфирию или их сочетание (например, двойную порфирию). В некоторых вариантах AIP, HCP или VP являются либо гетерозиготными доминантными, либо гомозиготными доминантными.

В некоторых вариантах субъект подвергается риску развития порфирии, например, ADP, и у него наблюдают повышенный уровень (например, повышенный уровень в моче) ALA и/или копропорфирина III. В некоторых вариантах субъект имеет порфирию или подвергается риску развития порфирии, например, ADP, и у него наблюдают повышенный уровень Zn-протопорфирина в эритроцитах.

В некоторых вариантах субъект имеет порфирию или подвергается риску развития порфирии, например, AIP, и у него наблюдают повышенный уровень (например, повышенный уровень в моче) ALA, PBG и/или уропорфирина.

В некоторых вариантах субъект имеет порфирию или подвергается риску развития порфирии, например, HCP, и у него наблюдают повышенный уровень (например, повышенный уровень в моче) ALA, PBG и/или копропорфирина III. В некоторых вариантах субъект имеет порфирию или подвергается риску развития порфирии, например, HCP, и у него наблюдают повышенный уровень (например, повышенный уровень в кале) копропорфирина III.

В некоторых вариантах субъект имеет порфирию или подвергается риску развития порфирии, например, VP, и у него наблюдают повышенный уровень (например, повышенный уровень в моче) ALA, PBG, и/или копропорфирина III.

В некоторых вариантах субъект имеет порфирию или подвергается риску развития порфирии, например, HCP, и у него наблюдают повышенный уровень (например, повышенный уровень в кале) копропорфирина III и/или протопорфирина.

В некоторых вариантах субъект имеет порфирию или подвергается риску развития порфирии, например, PCT, (например, гепатоэритропоэтической порфирии), и у него наблюдают повышенный уровень (например, повышенный уровень в моче) уропорфирина и/или 7-карбоксилатпорфирина. В некоторых вариантах субъект имеет порфирию или подвергается риску развития порфирии, например, PCT, (например, гепатоэритропоэтической порфирии), и у него наблюдают повышенный уровень (например, повышенный уровень в кале) уропорфирина и/или 7-карбоксилатпорфирина.

Мутация, ассоциированная с порфирией, включает любую мутацию в гене, кодирующую фермент в пути биосинтеза гема (пути порфирина), или в гене, который изменяет экспрессию гена в пути биосинтеза гема. Во многих вариантах субъект несет одну или несколько мутаций в ферменте пути порфирина (например, мутацию ALA-дегидратазы или PBG-дезаминазы). В некоторых вариантах субъект страдает от острой порфирии (например, AIP, порфирии вследствие недостаточности ALA-дегидратазы).

В некоторых случаях пациенты с острой печеночной порфирией (например, AIP), или пациенты, которые несут мутации, ассоциированные с острой печеночной порфирией (например, AIP), но у которых нет симптомов, имеют повышенные уровни ALA и/или PBG по сравнению со здоровыми людьми. См., например, Floderus, Y. et al, Clinical Chemistry, 52(4): 701-707, 2006; Sardh et al., Clinical Pharmacokinetics, 46(4): 335-349, 2007. В таких случаях уровень ALA и/или PBG может быть повышен даже в том случае, когда у пациента нет или никогда не было приступа. В некоторых подобных случаях у пациента совсем нет симптомов. В некоторых подобных случаях пациент страдает от боли, например, нейропатической боли, которая может представлять собой хроническую боль (например, хроническую нейропатическую боль). В некоторых случаях пациент имеет нейропатию. В некоторых случаях пациент имеет прогрессирующую нейропатию.

В некоторых вариантах субъект, подвергаемый лечению согласно способам, описанным в настоящей публикации, имеет повышенный уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG. Уровни порфирина или предшественника порфирина можно оценить, используя способы, известные в данной области, или способы, описанные в настоящей публикации. Например, способы оценки уровней ALA и PBG в моче и плазме, а также уровней порфирина в моче и плазме описаны в публикациях Floderus, Y. et al, Clinical Chemistry, 52(4): 701-707, 2006; and Sardh et al., Clinical Pharmacokinetics, 46(4): 335-349, 2007, полное содержание которых включено в настоящее описание в полном объеме.

В некоторых вариантах субъектом является животное, которое является моделью порфирии, например, мышиной моделью порфирии (например, мутантная мышь, которая описана в публикации Lindberg с соавторами Nature Genetics, 12: 195-199, 1996). В некоторых вариантах субъектом является человек, например, человек, который имеет порфирию или подвергается риску развития порфирии, которая описана в настоящей публикации. В некоторых вариантах у субъекта в данный момент нет острого приступа порфирии. В некоторых вариантах у субъекта никогда не было приступа. В некоторых вариантах пациент страдает от хронической боли. В некоторых вариантах у пациента имеется повреждение нерва. В некоторых вариантах субъект имеет изменение на ЭМГ и/или изменения в скорости проводимости нерва. В некоторых вариантах у субъекта нет симптомов. В некоторых вариантах субъект подвергается риску развития порфирии (например, несет генную мутацию, ассоциированную с порфирией) и не имеет симптомов. В некоторых вариантах субъект ранее имел острый приступ, но во время лечения не имеет симптомов.

В некоторых вариантах субъект подвергается риску развития порфирии и подвергается профилактическому лечению, чтобы предотвратить развитие порфирии. В некоторых вариантах субъект имеет повышенный уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG. В некоторых вариантах профилактическое лечение начинается в пубертатный период. В некоторых вариантах лечение снижает уровень (например, уровень в плазме или уровень в моче) порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG. В некоторых вариантах лечение предотвращает развитие повышенного уровня порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG. В некоторых вариантах лечение предотвращает развитие или уменьшает частоту или тяжесть симптома, ассоциированного с порфирией, например, боли или повреждения нерва.

В некоторых вариантах уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, повышен, например, в образце плазмы или моче субъекта. В некоторых вариантах уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, у субъекта оценивают на основе абсолютного уровня порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG в образце, полученном от субъекта. В некоторых вариантах уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, у субъекта оценивают на основе относительного уровня порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, в образце, полученном от субъекта. В некоторых вариантах относительный уровень определяют по отношению к уровню другого белка или соединения, например, к уровню креатинина в образце, полученном от субъекта. В некоторых вариантах образец представляет собой образец мочи. В некоторых вариантах образец представляет собой образец плазмы. В некоторых вариантах образец представляет собой образец кала.

Повышенный уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG, может быть установлен, например, в том случае, когда показано, что субъект имеет уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG (например, уровень ALA и/или PBG в плазме или моче), который превышает или выше или равен эталонному значению. Лечащий врач, компетентный в отношении лечения порфирий может определить, является ли уровень порфирина или предшественника порфирина (например, ALA и/или PBG) повышенным, например, в целях диагностики порфирии или для определения того, подвергается ли субъект риску развития порфирии, например, субъект может быть предрасположен к острому приступу или к патологии, ассоциированной с порфирией, такой как, например, хроническая боль (например, нейропатическая боль) и нейропатия (например, прогрессирующая нейропатия).

В используемом в настоящем описании смысле «эталонное значение» относится к значению, полученному для субъекта в том случае, когда у субъекта нет патологического заболевания, или значению, полученному для нормального или здорового субъекта, или значению для эталонного образца или популяции, например, группы нормальных или здоровых субъектов (например, группы субъектов, которые не несут мутации, ассоциированной с порфирией, и/или группы субъектов, которые не страдают от симптомов, ассоциированных с порфирией).

В некоторых вариантах эталонным значением является значение, полученное до заболевания для того же самого индивидуума. В некоторых вариантах эталонным значением является уровень в эталонном образце или популяции. В некоторых вариантах эталонным значением является среднее или медианное значение в эталонном образце или популяции. В некоторых вариантах эталонным значением является значение, которое на два стандартных отклонения выше среднего значения в эталонном образце или популяции. В некоторых вариантах эталонным значением является значение, которое на 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 или 5 стандартных отклонений выше среднего в эталоннм образце или популяции.

В некоторых вариантах, когда субъект имеет повышенный уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG, субъект имеет уровень ALA и/или PBG, который, по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% выше, чем эталонное значение. В некоторых вариантах субъект имеет уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG, который, по меньшей мере, в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз выше, чем эталонное значение.

В некоторых вариантах эталонное значение является верхним пределом эталона. В используемом в настоящем описании смысле «верхний предел эталона» относится к уровню, который является верхним пределом 95% доверительного интервала для эталонного образца или популяции, например, группы нормальных (например, дикого типа) или здоровых индивидуумов, например, индивидуумов, которые не несут генетической мутации, ассоциированной с порфирией, и/или индивидуумов, которые не страдают от порфирии. Соответственно, нижний предел эталона относится к уровню, который является нижним пределом того же 95% доверительного интервала.

В некоторых вариантах, когда субъект имеет повышенный уровень, например, уровень в плазме или уровень в моче, порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, уровень выше или равен 2-кратному, 3-кратному, 4-кратному или 5-кратному эталонному значению, например, верхнему пределу эталона. В некоторых вариантах субъект имеет уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, в моче, которые более чем в 4 раза превышают верхний предел эталона.

В некоторых вариантах эталонным значением является значение, приведенное в публикации Floderus, Y. с соавторами (Clinical Chemistry, 52(4): 701-707, 2006) или Sardh с соавторами (Clinical Pharmacokinetics, 46(4): 335-349, 2007). В некоторых вариантах эталонным значением является значение, приведенное в таблице 1 в публикации Sardh с соавторами.

В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень PBG в моче, который выше или равен 4,8 ммоль/моль креатинина. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень PBG в моче, который превышает или выше или равен примерно 3, 4, 5, 6, 7 или 8 ммоль/моль креатинина.

В некоторых вариантах эталонное значение PBG в плазме равно 0,12 мкмоль/л. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень PBG в плазме, который превышает или выше или равен 0,10 мкмоль/л, 0,12 мкмоль/л, 0,24 мкмоль/л, 0,36 мкмоль/л, 0,48 мкмоль/л или 0,60 мкмоль/л. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень PBG в плазме, который превышает или выше или равен 0,48 мкмоль/л.

В некоторых вариантах эталонное значение PBG в моче равно 1,2 ммоль/моль креатинина. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень PBG в моче, который превышает или выше или равен 1,0 ммоль/моль креатинина, 1,2 ммоль/моль креатинина, 2,4 ммоль/моль креатинина, 3,6 ммоль/моль креатинина, 4,8 ммоль/моль креатинина или 6,0 ммоль/моль креатинина. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень PBG в моче, который превышает или выше или равен 4,8 ммоль/моль креатинина.

В некоторых вариантах эталонное значение ALA в плазме равно 0,12 мкмоль/л. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень ALA в плазме, который превышает или выше или равен 0,10 мкмоль/л, 0,12 мкмоль/л, 0,24 мкмоль/л, 0,36 мкмоль/л, 0,48 мкмоль/л или 0,60 мкмоль/л. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень ALA в плазме, который превышает или выше или равен 0,48 мкмоль/л.

В некоторых вариантах эталонное значение ALA в моче составляет 3,1 ммоль/моль креатинина. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень ALA в моче, который превышает или выше или равен 2,5 ммоль/моль креатинина, 3,1 ммоль/моль креатинина, 6,2 ммоль/моль креатинина, 9,3 ммоль/моль креатинина, 12,4 ммоль/моль креатинина или 15,5 ммоль/моль креатинина.

В некоторых вариантах эталонное значение порфирина в плазме равно 10 нмоль/л. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень порфирина в плазме, который превышает или выше или равен 10 нмоль/л. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень порфирина в плазме, который превышает или выше или равен 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 нмоль/л, субъектом является человек, и он имеет уровень порфирина в плазме, который превышает или выше или равен 40 нмоль/л. В некоторых вариантах эталонное значение порфирина в моче составляет 25 мкмоль/моль креатинина. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень порфирина в моче, который превышает или выше или равен 25 мкмоль/моль креатинина. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень порфирина в моче, который выше или равен 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, или 80 мкмоль/моль креатинина.

В некоторых вариантах субъект имеет уровень, например, уровень в плазме или уровень в моче порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, который выше чем уровень у 99% индивидуумов в образце от здоровых индивидуумов.

В некоторых вариантах субъект имеет уровень, например, уровень в плазме или уровень в моче ALA или PBG, который на два стандартных отклонения превышает средний уровень в образце от здоровых индивидуумов.

В некоторых вариантах субъект имеет уровень ALA в моче, который в 1,6 или большее число раз превышает средний уровень у нормального субъекта (например, субъекта, который не несет мутацию, ассоциированную с порфирией). В некоторых вариантах субъект имеет уровень ALA в плазме, который в 2 или 3 раза выше среднего уровня у нормального субъекта. В некоторых вариантах субъект имеет уровень PBG в моче, который в четыре или большее число раз превышает средний уровень у нормального субъекта. В некоторых вариантах субъект имеет уровень PBG в плазме, который в четыре или большее число раз превышает средний уровень у нормального субъекта.

В некоторых вариантах способ эффективно снижает уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG. В некоторых вариантах способ является эффективным в отношении получения предварительно определяемого снижения повышенного уровня порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG. В некоторых вариантах предварительно определяемым снижением является уменьшение, по меньшей мере, на 10%, 20%, 30%, 40% или 50%. В некоторых вариантах предварительно определяемым снижением является снижение, которое эффективно предотвращает или ослабляет симптомы, например, боль или рецидивы приступов.

В некоторых вариантах предварительно определяемым снижением является снижение, которое составляет, по меньшей мере, 1, 2, 3 или больше стандартных отклонений, при этом стандартное отклонение определяют на основе значений для эталонного образца, например, эталонного образца, который описан в настоящей публикации.

В некоторых вариантах предварительно определяемым снижением является снижение, которое приводит уровень порфирина или предшественника порфирина к уровню, который меньше эталонного значения, или к уровню, который меньше или равен эталонному значению (например, эталонному значению, которое описано в настоящей публикации).

В некоторых вариантах субъект, подвергаемый лечению согласно описанным способам, страдает от боли, например, хронической боли. В некоторых вариантах субъект имеет порфирию или подвергается риску развития порфирии, например острой печеночной порфирии, например, AIP. В некоторых вариантах способ эффективен в лечении боли, например, благодаря снижению тяжести боли или излечению от боли. В некоторых вариантах способ эффективен в снижении или предотвращении повреждения нервов.

В некоторых вариантах субъект, подвергаемый лечению согласно способам, описанным в настоящей публикации, (a) имеет повышенный уровень ALA и/или PBG, и (b) страдает от боли, например, хронической боли. В некоторых вариантах способ эффективен в снижении повышенного уровня ALA и/или PBG и/или в лечении боли, например, благодаря снижению тяжести боли или излечению от боли.

В некоторых вариантах субъектом является животное, которое служит в качестве модели расстройства, связанного с экспрессией ALAS1.

В некоторых вариантах субъектом является животное, которое служит в качестве модели порфирии (например, генетически модифицированное животное с одной или несколькими мутациями). В некоторых вариантах порфирия представляет собой AIP, и субъектом является животное, представляющее собой модель AIP. В одном таком варианте субъектом является генетически модифицированная мышь, имеющая недостаточность порфобилиногендезаминазы, такая как, например, мышь, описанная в публикации Lindberg с соавторами (Nature Genetics, 12: 195-199, 1996), или гомозиготная R167Q-мышь, описанная в публикации Yasuda, M., Yu, C. Zhang, J., Clavero, S., Edelmann, W., Gan, L., Phillips, J.D., & Desnick, R.J. Acute intermittent porphyria: A severely affected knock-in mouse that mimics the human homozygous dominant phenotype. (Abstract of Presentation on October 14, 2011 at the American Society of Human Genetics; Program No. 1308F; опубликованной он-лайн 4 апреля 2012 на сайте ichg2011.org/cgi-bin/showdetail.pl?absno=21167); обе указанных публикации включены в настоящее описание в полном объеме. Было создано несколько нокин-моделей с мутациями, вызывающими гомозиготную доминантную AIP у человека. Используемые мутации включают, например, R167Q, R173Q и R173W в PBG-дезаминазе. Жизнеспособные гомозиготы содержали R167Q/R176Q и R167Q/R173Q, и в обоих случаях у них наблюдали конститутивно повышенные уровни ALA и PBG, аналогичные фенотипу при гомозиготной доминантной AIP человека; в некоторых вариантах такая жизнеспособная гомозиготная мышиная модель AIP является субъектом.

В одном варианте субъект, которого необходимо лечить согласно способам, описанным в настоящей публикации (например, человек (субъект или пациент)), подвергается риску развития или у которого было диагностировано расстройство, связанное с экспрессией ALAS1, например, порфирии. В некоторых вариантах субъектом является субъект, который страдал от одного или нескольких острых приступов одного или нескольких симптомов порфирии. В других вариантах субъектом является субъект, который хронически страдал от одного или нескольких симптомов порфирии (например, боли, например, нейропатической боли и или нейропатии, например, прогрессирующей нейропатии). В некоторых вариантах субъект несет генетическое изменение (например, мутацию), которая описана в настоящей публикации, но не имеет никаких иных симптомов. В некоторых вариантах субъект ранее подвергался лечению продуктом гема (например, гемином, аргинатом гема или гемальбумином), который описан в настоящей публикации.

В некоторых вариантах субъект (например, субъект с порфирией, такой как, например, AIP), подвергаемый лечению согласно способам, описанным в настоящей публикации, недавно перенес или в настоящее время переживает состояние продрома. В некоторых таких вариантах субъекту проводят комбинированное лечение, например, используя и-РНК, которая описана в настоящей публикации, и одно или несколько дополнительных средств лечения, которые, как известно, эффективны против порфирии (например, глюкозу и/или продукт гема, такой как гемин, который описан в настоящей публикации) или ассоциированных с ней симптомов.

В одном варианте и-РНК, которая описана в настоящей публикации, вводят в сочетании с глюкозой или декстрозой. Например, может быть введено 10-20% декстрозы в физиологическом растворе внутривенно. Обычно, когда вводят глюкозу, ежедневно вводят, по меньшей мере, 300 г 10% глюкозы внутривенно. и-РНК (например, и-РНК в LNP-препарате) также может быть введена внутривенно, в виде части той же процедуры инфузии, которую используют для введения глюкозы или декстрозы, или в виде отдельной инфузии, которую проводят до, одновременно или после введения глюкозы или декстрозы. В некоторых вариантах и-РНК вводят другим путем введения (например, подкожно). В еще одном варианте и-РНК вводят в сочетании с полным парентеральным питанием. и-РНК можно вводить до, одновременно или после введения полного парентерального питания.

В одном варианте и-РНК вводят в сочетании с продуктом гема (например, гемином, аргинатом гема или гемальбумином). В следующем варианте и-РНК вводят в сочетании с продуктом гема и глюкозой, продуктом гема и декстрозой или продуктом гема и полным парентеральным питанием.

«Продром» в используемом в настоящем описании смысле включает любой симптом, который отдельный субъект перенес ранее, непосредственно перед развитием острого приступа. Типичные симптомы продрома включают, например, боль в области живота, тошноту, головные боли, психологические симптомы (например, тревожность), беспокойное состояние и/или бессонницу. В некоторых вариантах субъект претерпевает боль (например, боль в области живота и/или головную боль) во время продрома. В некоторых вариантах субъект чувствует тошноту во время продрома. В некоторых вариантах у субъекта проявляются психологические симптомы (например, тревожность) во время продрома. В некоторых вариантах субъект испытывает беспокойство и/или страдает от бессонницы во время продрома.

Острый «приступ» порфирии заключается в появлении одного или нескольких симптомов порфирии, обычно у пациента, который несет мутацию, ассоциированную с порфирией (например, мутацию в гене, который кодирует фермент в пути порфирина).

В некоторых вариантах введение и-РНК ALAS1 приводит к снижению уровня одного или нескольких порфиринов или предшественников порфиринов, которые описаны в настоящей публикации (например, ALA и/или PBG). Снижение может быть измерено относительно любого подходящего контрольного или эталонного значения. Например, снижение уровня одного или нескольких порфиринов или предшественников порфиринов может быть установлено у отдельного субъекта, например, в виде снижения, по меньшей мере, на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% или больше по сравнению с уровнем до лечения (например, непосредственно перед лечением). Снижение уровня предшественника порфирина, порфирина или метаболита порфирина можно измерить, используя любой способ, известный в данной области. Например, уровень PBG и/или ALA в моче или плазме можно оценить, используя тест Уотсона-Шварца, ионообменную хроматографию или высокоэффективную жидкостную хроматографию - масс-спектрометрию. См., например, Thunell (1993).

В некоторых вариантах введение ми-РНК ALAS1 эффективно снижает уровень ALA и/или PBG у субъекта. Уровень ALA или PBG у субъекта можно оценить, например, на основе абсолютного уровня ALA или PBG или на основе относительного уровня ALA или PBG (например, относительно уровня другого белка или соединения, например, уровня креатинина) в образце от субъекта. В некоторых вариантах образец представляет собой образец мочи. В некоторых вариантах образец представляет собой образец плазмы.

В некоторых вариантах и-РНК, мишенью которой является ALAS1, вводят в сочетании с одним или несколькими дополнительными средствами лечения, например, с другим средством лечения, которое, как известно, является эффективным в лечении порфирии или симптомов порфирии. Например, другим средством лечения может быть глюкоза (например, глюкоза в/в) или продукт гема (например, гемин, аргинат гема или гемальбумин). Дополнительное средство (средства) лечения можно вводить до, после или одновременно с введением и-РНК.

и-РНК и дополнительное терапевтическое средство можно вводить в сочетании в одной и той же композиции, например, внутривенно, или дополнительное терапевтическое средство можно вводить в виде части отдельной композиции или другим способом, описанным в настоящей публикации.

В некоторых вариантах введение и-РНК или введение и-РНК в сочетании с одним или несколькими дополнительными средствами лечения (например, глюкозой, декстрозой или тому подобным) уменьшает частоту острых приступов (например, за счет предотвращения острых приступов, так чтобы они больше не происходили, или за счет снижения количества приступов, которые происходят в определенный период времени, например, происходит меньшее количество приступов в год). В некоторых таких вариантах и-РНК вводят согласно схеме регулярного введения доз, например, ежедневно, еженедельно, раз в две недели или ежемесячно.

В некоторых вариантах и-РНК вводят после острого приступа порфирии. В некоторых таких вариантах и-РНК находится в композиции, например, в композиции, содержащей липидный препарат, например, LNP-препарат.

В некоторых вариантах и-РНК вводят во время острого приступа порфирии. В некоторых таких вариантах и-РНК находится в композиции, например, в композиции, содержащей липидный препарат (например, LNP-препарат), или в композиции, содержащей GalNAc-конъюгат.

В некоторых вариантах введение ми-РНК ALAS1 является эффективным в снижении тяжести приступа (например, благодаря ослаблению одного или нескольких признаков или симптомов, ассоциированных с приступом). В некоторых вариантах введение ми-РНК ALAS1 является эффективным в уменьшении продолжительности приступа. В некоторых вариантах введение ми-РНК ALAS1 является эффективным в отношении остановки приступа. В некоторых вариантах и-РНК вводят профилактически, чтобы предотвратить острый приступ порфирии. В некоторых таких вариантах и-РНК находится в форме GalNAc-конъюгата, например, в композиции, содержащей GalNAc-конъюгат. В некоторых вариантах профилактическое введение осуществляют до, во время или после воздействия или появления провоцирующего фактора. В некоторых вариантах субъект подвергается риску развития порфирии.

В некоторых вариантах ми-РНК вводят во время продрома. В некоторых вариантах продром характеризуется болью (например, головной болью и/или болью в области живота), тошнотой, психологическими симптомами (например, тревожностью), беспокойным состоянием и/или бессонницей.

В некоторых вариантах ми-РНК вводят во время конкретной фазы менструального цикла, например, во время фазы лютеинизации.

В некоторых вариантах введение ми-РНК ALAS1 эффективно предотвращает приступы (например, рецидивы приступов, которые ассоциированы с продромом и/или с провоцирующим фактором, например, с конкретной фазой менструального цикла, например, фазой лютеинизации). В некоторых вариантах введение ми-РНК ALAS1 эффективно снижает частоту приступов. В некоторых вариантах введение ми-РНК ALAS1 эффективно уменьшает тяжесть приступа (например, благодаря ослаблению одного или нескольких признаков или симптомов, ассоциированных с приступом). В некоторых вариантах введение ми-РНК ALAS1 эффективно уменьшает продолжительность приступа. В некоторых вариантах введение ми-РНК ALAS1 эффективно в отношении остановки приступа.

В некоторых вариантах введение ми-РНК ALAS1 эффективно предотвращает или снижает частоту или тяжесть боли, например, нейропатической боли.

В некоторых вариантах введение ми-РНК ALAS1 эффективно предотвращает или снижает частоту или тяжесть нейропатии.

Эффекты введения ми-РНК ALAS1 могут быть установлены, например, при сравнении с соответствующим контролем. Например, снижение частоты острых приступов, а также снижение уровня одного или нескольких порфиринов или предшественников порфиринов могут быть установлены, например, в группе пациентов с AIP в виде пониженной частоты по сравнению с соответствующей контрольной группой. Контрольная группа (например, группа сходных индивидуумов или такая же группа индивидуумов в перекрестном исследовании) может включать, например, не подвергаемую лечению популяцию, популяцию, которая получала лечение с использованием обычного средства лечения порфирии (например, обычное средство лечения AIP может включать глюкозу, гемин или оба средства); популяцию, которую лечили с использованием плацебо или не направленной к мишени и-РНК, необязательно в сочетании с одним или несколькими обычными средствами лечения порфирии (например, глюкозы, например, в/в-глюкозы) и тому подобными.

Субъектом, подвергаемым «риску» развития порфирии, в используемом в настоящем описании смысле является субъект с порфирией в семейном анамнезе и/или с одним или несколькими рецидивами или хроническими симптомами порфирии и/или субъект, который несет генетическое изменение (например, мутацию) в гене, кодирующем фермент пути биосинтеза гема, и субъект, который несет генетическое изменение, например, мутацию, которая, как известно, ассоциирована с порфирией.

В некоторых вариантах изменение, например, мутация, делает индивидуумов чувствительными к острому приступу (например, при воздействии провоцирующего фактора, например, лекарственного средства, питания или другого провоцирующего фактора, например, провоцирующего фактора, который раскрыт в настоящем описании). В некоторых вариантах изменение, например, мутация, ассоциировано с повышенными уровнями порфирина или предшественника порфирина (например, ALA и/или PBG). В некоторых вариантах изменение, например, мутация, ассоциирована с хронической болью (например, хронической нейропатической болью) и/или нейропатией (например, прогрессирующей нейропатией). В некоторых вариантах изменение, например, мутация, ассоциировано с изменениями в ЭМГ и/или скорости проводимости нерва.

В некоторых вариантах изменением является мутация в гене ALAS1. В некоторых вариантах изменением является мутация в промоторе гена ALAS1 или в областях выше или ниже гена ALAS1. В некоторых вариантах изменением является мутация в факторах транскрипции или других генах, которые взаимодействуют с ALAS1. В некоторых вариантах изменение представляет собой изменение, например, мутацию, в гене, который кодирует фермент пути биосинтеза гема.

В некоторых вариантах субъект имеет генетическое изменение, которое описано в настоящей публикации (например, генетическую мутацию, которая, как известно, ассоциирована с порфирией). В некоторых таких вариантах субъект имеет повышенный уровень (например, уровень в моче или в плазме) ALA и/или PBG. В некоторых таких вариантах субъект не имеет повышенного уровня ALA и/или PBG. В некоторых вариантах субъект имеет генетическое изменение, которое описано в настоящей публикации, и имеет другие симптомы, например, хроническую боль, изменения ЭМГ, изменения скорости проводимости нерва и/или другие симптомы, ассоциированные с порфирией. В некоторых вариантах субъект имеет генетическое изменение, но не страдает от острых приступов.

В некоторых вариантах субъект имеет мутацию, ассоциированную с AIP, HCP, VP или ADP.

В некоторых вариантах порфирия представляет собой AIP. В некоторых таких вариантах субъект имеет изменение, например, по меньшей мере, одну мутацию, в гене PBG-дезаминазы. В данной области известно множество мутаций PBG-дезаминазы, например, мутации, описанные в публикации Hrdinka, M. с соавторами (Physiological Research, 55 (Suppl. 2): S119-136 (2006)). В некоторых вариантах субъект является гетерозиготным по мутации PBG-дезаминазы. В других вариантах субъект является гомозиготным по мутации PBG-дезаминазы. Гомозиготный субъект может нести две идентичные мутации или две разные мутации в гене PBG-дезаминазы.

В некоторых вариантах порфирия представляет собой HCP. В некоторых таких вариантах субъект имеет изменение, например, по меньшей мере, одну мутацию в гене, который кодирует фермент копропорфириноген III-оксидазы.

В некоторых вариантах порфирия представляет собой VP. В некоторых таких вариантах субъект имеет изменение, например, по меньшей мере, одну мутацию в гене, который кодирует протопорфириногеноксидазу.

В некоторых вариантах порфирия представляет собой ADP, например, аутосомно-рецессивную ADP. В некоторых таких вариантах субъект имеет изменение, например, по меньшей мере, одну мутацию, в гене, который кодирует ALA-дегидратазу.

Способы лечения, предлагаемые в настоящем изобретении, могут служить для облегчения одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, снижения частоты приступов, ассоциированных с порфирией, снижения вероятности того, что приступ с проявлением одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, будет возникать при воздействии провоцирующего фактора, или снижения риска развития состояний, ассоциированных с порфирией {например, нейропатии (например, прогрессирующей нейропатии), гепатоклеточного рака). Кроме того, способы, предлагаемые в настоящем изобретении, могут служить для снижения уровня одного или нескольких предшественников порфиринов, порфиринов и/или родственных продуктов или метаболитов порфиринов. Уровень предшественника порфирина или порфирина можно измерить в любом биологическом образце, таком как, например, образец мочи, крови, кали, спинномозговой жидкости или ткани. Образец может находиться в организме субъекта или может быть получен или выделен из организма субъекта. В некоторых вариантах порфирия представляет собой AIP, и уровень PBG и/или ALA снижен. В некоторых вариантах продуктом или метаболитом порфирина является порфобилин, порфобилиноген или уропорфирин. Снижение уровня продукта или метаболита порфирина можно измерить любым способом, известным в данной области. Например, уровень PBG и/или ALA в моче или плазме можно оценить, используя тест Уотсона-Шварца, ионообменную хроматографию или высокоэффективную жидкостную хроматографию - масс-спектрометрию. См., например, Thunell (1993).

Способы, описанные в настоящей публикации, также могут служить для снижения хронически повышенных уровней предшественников порфирина (например, ALA и/или PBG) у субъектов, страдающих от порфирии (например, острой печеночной порфирии, например, AIP), или подвергающихся риску развития порфирии. Способы оценки уровней в плазме и в моче (например, хронически повышенных уровней) предшественников порфиринов включают, например, ВЭЖХ-масс-спектрометрию и ионообменную хроматографию. Уровни предшественников порфиринов могут быть выражены в виде уровня относительно другого белка или соединения, например, креатинина. См., например, Floderus, Y. et al, Clinical Chemistry, 52(4): 701-707, 2006; Sardh et al., Clinical Pharmacokinetics, 46(4): 335-349, 2007.

Термин «провоцирующий фактор» в используемом в настоящем описании смысле относится к эндогенному или экзогенному фактору, который может индуцировать острый приступ в виде одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией. Провоцирующие факторы включают голодание (или другие формы пониженной или неадекватной калорийности потребляемой пищи, вследствие жестких диет, занятий бегом на длинные дистанции и т.д.), метаболические стрессы (например, инфекции, хирургическую операцию, международные авиационные перелеты и психологический стресс), эндогенные гормоны (например, прогестерон), курение сигарет, растворимые в липидах чужеродные химические вещества (включая, например, химические вещества, присутствующие в табачном дыму, некоторые лекарственные средства, отпускаемые по рецепту, органические растворители, биоциды, компоненты алкогольных напитков), эндокринные факторы (например, половые гормоны (женщины могут испытывать обострения во время предменструального периода), синтетические эстрогены, прогестероны, стимуляторы овуляции и гормонозаместительную терапию). См., например, Thunell (1993). Обычно провоцирующими факторами являются индуцирующие цитохром P450 лекарственные средства и фенобарбитал.

Симптомы, ассоциированные с порфирией, могут включать боль или спазмы в области живота, головные боли, эффекты, вызванные аномалиями нервной системы и светочувствительность, вызывающая сыпи, нарывы и рубцевание кожи (световой дерматоз). В некоторых вариантах порфирия представляет собой AIP. Симптомы AIP включают симптомы, проявляющиеся в желудочно-кишечном тракте (например, тяжелую и плохо локализуемую боль в области живота, тошноту/рвоту, запор, диарею, непроходимость кишечника), симптомы мочевой системы (дизурию, задержку мочеиспускания/недержание мочи или темную мочу), неврологические симптомы (например, сенсорную нейропатию, моторную нейропатию (например, поражение черепно-мозговых нервов и/или симптомы, приводящие к слабости рук и ног), судороги, нейропатическую боль, прогрессирующую нейропатию, головные боли, нейропсихиатрические симптомы (например, спутанность сознания, тревожность, возбуждение, галлюцинации, истерию, бред, апатию, депрессию, фобии, психоз, бессонницу, сонливость, кому), вовлечение автономной нервной системы (приводящее, например, к сердечно-сосудистым симптомам, таким как тахикардия, гипертония и/или аритмии, а также другим симптомам, таким как, например, повышенные уровни циркулирующего катехоламина, потливость, возбужденное состояние и/или тремор), обезвоживание и электролитные аномалии.

В некоторых вариантах и-РНК, мишенью которой является ALAS1, вводят вместе (например, до, после или одновременно с другим средством лечения, которое может служить для облегчения одного или нескольких указанных выше симптомов. Например, боль в области живота можно лечить, например, наркотическим анальгетиком, судороги можно лечить, например, противосудорожными лекарственными средствами, тошноту/рвоту можно лечить, например, фенотриазинами, и тахикардию/гипертонию можно лечить, например, бета-блокаторами.

Подразумевается, что термин «снижение» (или «повышение») относится к измеряемому изменению, например, статистически значимому изменению. Изменение может составлять, например, изменение, по меньшей мере, на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% или больше (например, снижение (или повышение) относительно эталонного значения, например, эталона, получаемого в том случае когда и-РНК не вводят).

Изобретение, кроме того, относится к применению и-РНК или ее фармацевтической композиции, например, для лечения расстройства, связанного с экспрессией ALAS1, в сочетании с другими фармацевтическими средствами и/или другими способами терапии, например, с известными фармацевтическими средствами и/или известными терапевтическими способами, такими как, например, средства и способы, используемые в настоящее время для лечения расстройства. В одном варианте и-РНК или его фармацевтическую композицию можно вводить вместе с продуктом гема (например, гемином, аргинатом гема или гемальбумином, которые описаны в настоящей публикации,) и/или вместе с внутривенными инфузиями глюкозы. В некоторых вариантах и-РНК или ее фармацевтическую композицию применяют профилактически, например, чтобы предотвратить или ослабить симптомы ожидаемых приступов острой порфирии. Профилактическое применение может быть приурочено к воздействию или ожидаемому воздействию на субъекта провоцирующего фактора. Как описано в настоящей публикации, провоцирующим фактором может быть любой эндогенный или экзогенный фактор, который, как известно, провоцирует острый приступ. Например, предменструальная фаза является эндогенным провоцирующим фактором, а индуцирующее цитохром P450 лекарственное средство является экзогенным провоцирующим фактором.

Эффективное количество лекарственного средства для лечения расстройства, связанного с экспрессией ALAS1 (например, порфирии, такой как AIP) зависит от типа расстройства, подвергаемого лечению, тяжести симптомов, субъекта, подвергаемого лечению, пола, возраста и общего состояния субъекта, способа введения и так далее. В любом конкретном случае соответствующее «эффективное количество» может определить специалист в данной области, используя обычное экспериментирование. Специалист в данной области может контролировать эффективность лечения или профилактики, измеряя любой из таких параметров или любое сочетание параметров. В связи с введением и-РНК, нацеленной на ALAS1, или ее фармацевтической композиции фраза «эффективна против» расстройства, связанного с экспрессией ALAS1, указывает, что введение клинически подходящим способом приводит к полезному эффекту, например, у отдельного пациента или, по меньшей мере, у части пациентов, например, статистически значимой части пациентов. Полезные эффекты включают, например, предотвращение или снижение симптомов или другие эффекты. Например, полезные эффекты включают, например, улучшение (например, снижение тяжести или частоты) симптомов, уменьшение тяжести или частоты приступов, пониженный риск развития ассоциированного заболевания (например, нейропатии (например, прогрессирующей нейропатии), гепатоклеоточного рака), повышенной способности переносить действие провоцирующего фактора, улучшенное качество жизни, снижение экспрессии ALAS1, снижение уровня (например, уровня в плазме или моче) порфирина или предшественника порфирина (например, ALA и/или PBG) или другой эффект, обычно расцениваемый как позитивный лечащими врачами, которым известно лечение конкретного типа расстройства.

Лечебный или профилактический эффект очевиден, когда имеет место улучшение, например, статистически значимое улучшение одного или нескольких параметров патологического состояния, или когда нет ухудшения или развития симптомов, тогда как в ином случае они ожидаются. В качестве примера, благоприятное изменение измеряемого параметра заболевания, по меньшей мере, на 10%, например, по меньшей мере, на 20%, 30%, 40%, 50% или больше может быть показателем эффективного лечения. Об эффективности данного основанного на и-РНК лекарственного средства или препарата данного лекарственного средства также можно судить, используя экспериментальную животную модель такого заболевания, которая известна в данной области. При использовании экспериментальной животной модели эффективность лечения доказана в том случае, когда наблюдают статистически значимое снижение маркера (например, уровня ALA или PBG в плазме или моче) или симптома.

Пациентам можно вводить терапевтическое количество и-РНК. Терапевтическое количество может составлять, например, 0,05-50 мг/кг. Например, терапевтическое количество может составлять 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0 или 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, или 50 мг/кг днРНК.

В некоторых вариантах и-РНК готовят в виде липидного препарата, например, LNP-препарата, который описан в настоящей публикации. В некоторых таких вариантах терапевтическое количество составляет 0,05-5 мг/кг, например, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 или 5,0 мг/кг днРНК. В некоторых вариантах липидный препарат, например, LNP-препарат, вводят внутривенно.

В некоторых вариантах и-РНК вводят посредством внутривенной инфузии в течение такого периода времени как более чем 5-минутный, 10-минутный, 15-минутный, 20-минутный или 25-минутный период.

В некоторых вариантах и-РНК находится в форме GalNAc-конъюгата, который описан в настоящей публикации. В некоторых таких вариантах терапевтическое количество составляет 0,5-50 мг, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мг/кг днРНК. В некоторых вариантах GalNAc-конъюгат вводят подкожно.

В некоторых вариантах введение повторяют, например, на регулярной основе, например, ежедневно, раз в две недели (т.е. каждые две недели) в течение одного месяца, двух месяцев, трех месяцев, четырех месяцев или дольше. После осуществления начальной схемы лечения средства лечения можно вводить менее часто. Например, после введения раз в две недели в течение трех месяцев введение можно повторять один раз в месяц в течение шести месяцев или года или дольше.

В некоторых вариантах и-РНК-средство вводят в виде двух или большего количества доз. В некоторых вариантах число или количество последующих доз зависит от достижения требуемого эффекта, например, подавления гена ALAS, снижения уровня порфирина или предшественника порфирина (например, ALA и/или PBG) или достижения терапевтического или профилактического эффекта, например, снижения или предотвращения одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией (например, боли, например, нейропатической боли), и/или предотвращения приступов или уменьшения частоты и/или тяжести приступов, ассоциированных с порфирией.

В некоторых вариантах и-РНК-средство вводят согласно схеме. Например, и-РНК-средство можно вводить один раз в неделю, два раза в неделю, три раза в неделю, четыре раза в неделю или пять раз в неделю. В некоторых вариантах схема включает в себя введения, разделенные регулярными интервалами, например, ежечасно, каждые четыре часа, каждые шесть часов, каждые восемь часов, каждые двенадцать часов, ежедневно, каждые 2 дня, каждые 3 дня, каждые 4 дня, каждые 5 дней, еженедельно, раз в две недели или ежемесячно. В некоторых вариантах и-РНК-средство вводят еженедельно или раз в две недели, чтобы добиться требуемого эффекта, например, снижения уровня ALA и/или PBG, снижения боли и/или предотвращения острых приступов.

В некоторых вариантах схема включает введения, разделенные короткими интервалами с последующим более длительным периодом времени, в течение которого средство не вводят. Например, схема может включать начальный набор доз, которые вводят в относительно короткий период времени (например, примерно каждые 6 часов, примерно каждые 12 часов, примерно каждые 24 часа, примерно каждые 48 часов или примерно каждые 72 часа) с последующим более длительным периодом времени (например, примерно 1 неделю, примерно 2 недели, примерно 3 недели, примерно 4 недели, примерно 5 недель, примерно 6 недель, примерно 7 недель или примерно 8 недель), в течении которого и-РНК-средство не вводят. В одном варианте и-РНК-средство сначала вводят ежечасно, а позже вводят с более длительным интервалом (например, ежедневно, еженедельно, раз в две недели или ежемесячно). В другом варианте и-РНК-средство сначала вводят ежедневно, а затем вводят с более длительным интервалом (например, еженедельно, раз в две недели или ежемесячно). В некоторых вариантах более длительный интервал увеличивается с течением времени, или его определяют на основе достижения требуемого эффекта. В конкретном варианте и-РНК-средство вводят один раз в день во время острого приступа с последующим еженедельным введением дозы, начиная с восьмого дня введения. В другом конкретном варианте и-РНК-средство вводят через день в течение первой недели с последующим еженедельным введением дозы, начиная с восьмого дня введения.

В одном варианте и-РНК-средство вводят для предотвращения или снижения тяжести или частоты рецидивов приступов, например, циклических приступов, ассоциированных с провоцирующим фактором. В некоторых вариантах провоцирующим фактором является менструальный цикл. В некоторых вариантах и-РНК вводят многократно, например, с регулярными интервалами, чтобы предотвратить или уменьшить тяжесть или частоту рецидивов приступов, например, циклических приступов, ассоциированных с провоцирующим фактором, например, менструальным циклом, например, с конкретной фазой менструального цикла, например, фазой лютеинизации. В некоторых вариантах и-РНК вводят во время конкретной фазы менструального цикла или на основе уровней гормонов у пациента, подвергаемого лечению (например, на основе уровней гормонов, которые ассоциированы с конкретной фазой менструального цикла). В некоторых вариантах и-РНК вводят в один или несколько конкретных дней менструального цикла, например, в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 день (или позже в случае субъектов, которые имеют более длительный менструальный цикл). В некоторых вариантах и-РНК вводят во время фазы лютеинизации, например, в один или несколько дней в период от 14 до 28 дня менструального цикла (или позже в случае субъектов, которые имеют менструальный цикл длиннее, чем 28 дней). В некоторых вариантах оценивают овуляцию у субъекта (например, используя тестирование крови или мочи, при котором выявляют гормон, ассоциированный с овуляцией, например, LH), и и-РНК вводят в предварительно определенный интервал времени после овуляции. В некоторых вариантах и-РНК вводят сразу после овуляции. В некоторых вариантах и-РНК вводят через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 дней после овуляции. Любую из указанных схем необязательно можно повторять один или несколько раз. Количество повторений может зависеть от достижения требуемого эффекта, например, подавления гена ALAS1 и/или достижения терапевтического или профилактического эффекта, например, снижения или подавления одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, снижения частоты приступов, ассоциированных с порфирией.

В некоторых вариантах вводят начальную дозу и-РНК-средства и тестируют уровень ALA или PBG, например, через 1-48 часов, например, через 2, 4, 8, 12 или 24 часа после введения начальной дозы. В некоторых вариантах в том случае, если уровень ALA и/или PBG снизился (например, достигнуто предварительно определяемое снижение, например, нормализация) и/или если симптомы, ассоциированные с порфирией (например, боль), улучшились (например, так что у пациента не проявляются симптомы), больше дозу не вводят, тогда как в случае, когда уровень ALA и/или PBG не снизился (например, не было достигнуто предварительно определяемое снижение, например, не произошла нормализация), вводят дополнительную дозу ALA или PBG. В некоторых вариантах дополнительную дозу вводят через 12, 24, 36, 48, 60 или 72 часа после начальной дозы. В некоторых вариантах в том случае, когда начальная доза является неэффективной в снижении уровня ALA и/или PBG, дополнительную дозу модифицируют, например, увеличивают, чтобы добиться требуемого снижения (например, предварительно определяемого снижения, например, нормализации) уровней ALA или PBG.

В некоторых вариантах предварительно определяемое снижение представляет собой снижение, по меньшей мере, на 10%, 20%, 30%, 40% или 50%. В некоторых вариантах предварительно определяемое снижение представляет собой снижение, которое эффективно предотвращает или ослабляет симптомы, например, боль, симптомы продрома или рецидивы приступов.

В некоторых вариантах предварительно определяемое снижение представляет собой снижение, по меньшей мере, на 1, 2, 3 или больше стандартных отклонений, при этом стандартное отклонение определяют на основе значений, полученных для эталонного образца, например, эталонного образца, который описан в настоящей публикации.

В некоторых вариантах предварительно определяемое снижение представляет собой снижение, которое приводит уровень порфирина или предшественника порфирина к уровню, который ниже, или к уровню, который ниже или равен эталонному значению (например, эталонному значению, которое описано в настоящей публикации).

В используемом в настоящем описании смысле термин «нормализация» уровней ALA или PBG (или «нормальный» или «нормализованный» уровень) относится к уровню (например, уровню в моче и/или в плазме) либо ALA, либо PBG, либо обоих, который находится в ожидаемом диапазоне для здорового индивидуума, для индивидуума, у которого нет симптомов (например, индивидуума, который не испытывает боли и/или не страдает от нейропатии), или для индивидуума, который не имеет мутации, ассоциированной с порфирией. Например, в некоторых вариантах нормализованный уровень находится в пределах двух стандартных отклонений от нормального среднего значения. В некоторых вариантах нормализованный уровень находится в пределах нормального эталона, например, в 95% доверительном интервале для соответствующего контрольного образца, например, образца от здоровых индивидуумов или индивидуумов, которые не несут генной мутации, ассоциированной с порфирией. В некоторых вариантах уровень ALA и/или PBG у субъекта (например, уровень ALA и/или PBG в моче и/или плазме) контролируют с определенными интервалами, и дополнительную дозу и-РНК-средства вводят в том случае, когда уровень возрастает выше эталонного значения.

Введение и-РНК может снижать уровни мРНК или белка ALAS1, например, в клетке, ткани, крови, моче или другом отделе организма пациента, по меньшей мере, на 10%, по меньшей мере, на 15%, по меньшей мере, на 20%, по меньшей мере, на 25%, по меньшей мере, на 30%, по меньшей мере, на 40%, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 80% или, по меньшей мере, на 90% или больше. Введение и-РНК может снижать уровни продуктов, ассоциированных с экспрессией гена ALAS1, например, уровни одного или нескольких порфиринов или предшественников порфиринов (например, уровень of ALA и/или PBG). Введение и-РНК-средства также может ингибировать или предотвращать повышающую регуляцию уровней мРНК или белка ALAS1 во время острого приступа AIP.

Перед введением полной дозы и-РНК пациентам можно вводить меньшую дозу, такую как 5% инфузионной дозы, и контролировать неблагоприятные эффекты, такие как аллергическая реакция или повышенные уровни липидов или давления крови. В другом примере можно контролировать нежелательные эффекты у пациента.

Способы модулирования экспрессии гена ALAS1

В еще одном аспекте изобретение относится к способу модулирования (например, ингибирования или активации) экспрессии гена ALAS1, например, в клетке или в организме субъекта. В некоторых вариантах клетка находится ex vivo, in vitro или in vivo. В некоторых вариантах клеткой является эритроидная клетка или гепатоцит. В некоторых вариантах клетка находится в организме субъекта (например, млекопитающего, такого как, например, человек). В некоторых вариантах субъект (например, человек) подвергается риску или у него диагностировано заболевание, связанное с экспрессией ALAS1, которое описано выше.

В одном варианте способ включает в себя осуществление контакта клетки с и-РНК, которая описана в настоящей публикации, в количестве, эффективном для снижения экспрессии гена ALAS1 в клетке. «Осуществление контакта» в используемом в настоящем описании смысле включает непосредственный контакт клетки, а также опосредованный контакт клетки. Например, клетка в организме субъекта (например, эритроидная клетка или клетка печени, такая как гепатоцит) может быть подвергнута контакту в том случае, когда субъекту вводят (например, внутривенно или подкожно) композицию, содержащую и-РНК.

Экспрессию гена ALAS1 можно оценить на основе уровня экспрессии мРНК ALAS1, белка ALAS1 или уровня параметра, функционально связанного с уровнем экспрессии гена ALAS1 (например, уровня порфирина или частоты или тяжести симптома, связанного с порфирией). В некоторых вариантах экспрессию ALAS1 ингибируют, по меньшей мере, на 5%, по меньшей мере, на 10%, по меньшей мере, на 15%, по меньшей мере, на 20%, по меньшей мере, на 25%, по меньшей мере, на 30%, по меньшей мере, на 35%, по меньшей мере, на 40%, по меньшей мере, на 45%, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 55%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 65%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90% или, по меньшей мере, на 95%. В некоторых вариантах и-РНК имеет IC₅₀ в диапазоне 0,001-0,01 нМ, 0,001-0,10 нМ, 0,001-1,0 нМ, 0,001-10 нМ, 0,01-0,05 нМ, 0,01-0,50 нМ, 0,02-0,60 нМ, 0,01-1,0 нМ, 0,01-1,5 нМ, 0,01-10 нМ. Значение IC₅₀ может быть нормализовано по сравнению с соответствующим контрольным значением, например, IC₅₀ и-РНК, не нацеленной на данную мишень.

В некоторых вариантах способ включает в себя введение в клетку и-РНК, которая описана в настоящей публикации, и поддерживание клетки в течение периода времени, достаточного для получения распада транскрипта мРНК гена ALAS1, и тем самым, ингибирования экспрессии гена ALAS1 в клетке.

В одном варианте способ включает в себя введение композиции, описанной в настоящей публикации, например, композиции, содержащей и-РНК, мишенью которой является ALAS1, млекопитающему так, чтобы экспрессия гена-мишени ALAS1 снизилась, например, на длительный период времени, например, по меньшей мере, на два, три, четыре дня или больше, например, одну неделю, две недели, три недели или четыре недели или дольше. В некоторых вариантах снижение экспрессии ALAS1 выявляют в пределах 1 часа, 2 часов, 4 часов, 8 часов, 12 часов или 24 часов после первого введения.

В другом варианте способ включает в себя введение композиции, которая описана в настоящей публикации, млекопитающему, так что экспрессия гена-мишени ALAS1 увеличивается, например, по меньшей мере, на 10% по сравнению с животным, не подвергаемым лечению. В некоторых вариантах активация ALAS1 происходит в течение длительного периода, например, по меньшей мере, два, три, четыре дня или больше, например, одну неделю, две недели, три недели, четыре недели или больше. Не имея намерения быть связанными с какой-либо теорией, полагают, что и-РНК может активировать экспрессию ALAS1 за счет стабилизации транскрипта мРНК ALAS1, взаимодействия с промотором в геноме и/или ингибирования ингибитора экспрессии ALAS1.

и-РНК, применимые в способах и композициях, охарактеризованных в изобретении, специфично целенаправленно действуют на РНК (первичную или процессированную) гена ALAS1. Композиции и способы ингибирования экспрессии гена ALAS1 с использованием и-РНК могут быть получены и осуществлены в соответствии с описанием, приведенным в настоящей публикации.

В одном варианте способ включает в себя введение композиции, содержащей и-РНК, при этом и-РНК содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна, по меньшей мере, части РНК-транскрипта гена ALAS1 млекопитающего, подвергаемого лечению. В том случае, когда организмом, подвергаемым лечению, является млекопитающее, такое как человек, композицию можно вводить любыми способами, известными в данной области, включая без ограничения пероральный, внутрибрюшинный или парентеральный пути, включая внутричерепное (например, внутрижелудочковое, интрапаренхимальное и интратекальное), внутривенное, внутримышечное, подкожное, трансдермальное введение, введение через дыхательные пути (аэрозольное), назальное, ректальное и местное (включая буккальное и подъязычное) введение.

В некоторых вариантах композиции вводят путем внутривенной инфузии или инъекции. В некоторых таких вариантах композиции содержат приготовленную в липидном препарате ми-РНК (например, LNP-препарат, такой как LNP11-препарат) для внутривенной инфузии. В конкретных вариантах такие композиции можно использовать для лечения острых приступов порфирии и/или для профилактики (например, для снижения тяжести или частоты приступов).

В других вариантах композиции вводят подкожно. В некоторых таких вариантах композиции содержат и-РНК, конъюгированную с GalNAc-лигандом. В конкретных вариантах такие композиции можно использовать для лечения острых приступов порфирии или для профилактики (например, для снижения тяжести или частоты приступов).

Способы снижения уровня порфирина или предшественника порфирина

В другом аспекте изобретение относится к способу снижения уровня порфирина или предшественника порфирина, например, в клетке или в организме субъекта.

В некоторых вариантах клетка находится ex vivo, in vitro или in vivo. В некоторых вариантах клеткой является эритроидная клетка или гепатоцит. В некоторых вариантах клетка представляет собой гепатоцит. В некоторых вариантах клетка находится в организме субъекта (например, млекопитающего, такого как, например, человек).

В некоторых вариантах субъект (например, человек) подвергается риску или у него диагностирована порфирия, которая описана в настоящей публикации. В некоторых вариантах способ является эффективным для лечения порфирии, которая описана в настоящей публикации (например, благодаря ослаблению одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, снижению частоты приступов, ассоциированных с порфирией, уменьшению вероятности того, что приступ одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, будет происходить после воздействия провоцирующего условия или снижению риска развития состояний ассоциированных с порфирией (например, нейропатии (например, прогрессирующей нейропатии), гепатоклеточного рака). В одном варианте способ включает в себя осуществление контакта клетки с РНК-и, которая описана в настоящей публикации, в количестве, достаточном для снижения уровня порфирина или предшественника порфирина (например, ALA или PBG) в данной клетке или в другой связанной клетке или группе клеток или в организме субъекта. «Осуществление контакта» в используемом в настоящем описании смысле относится к непосредственному контакту клетки, а также опосредованному контакту клетки. Например, клетка в организме субъекта (например, эритроидная клетка или клетка печени, такая как гепатоцит) может быть подвергнута контакту в том случае, когда субъекту вводят (например, внутривенно или подкожно) композицию, содержащую и-РНК. «Другая связанная клетка или группа клеток» в используемом в настоящем описании смысле включает любую клетку или группу клеток, в которых уровень порфирина или предшественника порфирина снижается в результате контакта. Например, клетка может быть частью ткани, присутствующей в организме субъекта (например, клетка печени, присутствующая в организме субъекта), и контактирование клетки в организме субъекта (например, контактирование одной или нескольких клеток печени, присутствующих в организме субъекта) с РНК-и может приводить к снижению уровня порфирина или предшественник порфирина в другой связанной клетке или группе клеток (например, в нервных клетках субъекта) или в ткани или жидкости в организме субъекта (например, в моче, крови, плазме или спинномозговой жидкости субъекта).

В некоторых вариантах порфирин или предшественник порфирина выбран из группы, состоящей из δ-аминолевулиновой кислоты (ALA), порфопилиногена (PBG), гидроксиметилбилана (HMB), уропорфириногена III, копропорфириногена III, протопорфириногена IX и протопорфирина IX. В некоторых вариантах предшественником порфирина является ALA. В некоторых вариантах предшественником порфирина является PBG. В некоторых вариантах способ снижает уровень ALA и PBG. Уровень порфирина или предшественника порфирина можно измерить как описано в настоящей публикации и как известно в данной области.

Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, которое обычно подразумевает специалист в той области, к которой относится изобретение. Хотя при практическом осуществлении или тестировании и-РНК и способов, охарактеризованных в изобретении, могут быть использованы способы и материалы, сходные или эквивалентные способам и материалам, описанным в настоящей публикации, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, заявки на выдачу патентов, патенты и другие ссылки, приведенные в настоящем описании, включены в виде ссылки в полном объеме. В случае конфликта настоящее описание, включая определение, будет проверено. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения объема изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Синтез ми-РНК

Источник реагентов

В том случае, когда источник реагента специально не указан в настоящем описании, такой реагент может быть получен от любого поставщика реагентов для молекулярной биологии в соответствии со стандартом качества/чистоты для применения в молекулярной биологии.

Синтез олигонуклеотидов.

Все олигонуклеотиды синтезировали на синтезаторе AKTAoligopilot. Для синтеза олигонуклеотидов использовали твердую подложку из стекла с контролируемым размером пор (dT-CPG, 500A, Prime Synthesis) и РНК-фосфорамидиты со стандартными защитными группами, 5'-O-диметокситритил-N6-бензоил-2'-трет- бутилдиметилсилиладенозин-3'-O-N,N'-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит, 5'-O-диметокситритил-N4-ацетил-2'-трет-бутилдиметилсилилцитидин-3'-O-N,N'-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит, 5'-O-диметокситритил-N2-изобутирил-2'-трет-бутилдиметилсилилгуанозин-3'-O-N,N'-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит и 5'-O-диметокситритил-2'-трет- бутилдиметилсилилуридин-3'-O-N,N'-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит (Pierce Nucleic Acids Technologies). 2'-F-фосфорамидиты, 5'-O-диметокситритил-N4-ацетил-2'-фторцитидин-3'-O-N,N'-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит и 5'-O-диметокситритил-2'-фторуридин-3'-O-N,N'-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит приобретали из (Promega). Все фосфорамидиты использовали в концентрации 0,2 М в ацетонитриле (CH₃CN), за исключением гуанозина, который использовали в концентрации 0,2 М в 10% ТГФ/ANC (об./об.). Использовали время связывания/рециклинга, равное 16 минутам. Активатором был 5-этилтиотетразол (0,75 М, American International Chemicals); для PO-окисления использовали йод/воду/пиридин, и для PS-окисления использовали PADS (2%) в 2,6-лутидине/ACN (1:1 об./об.).

3'-конъюгированные с лигандом нити синтезировали, используя твердую подложку, содержащую соответствующий лиганд. Например, введение холестериновой единицы в последовательность осуществляли из гидроксипролинолхолестеринфосфорамидита. Холестерин связывали с транс-4-гидроксипролинолом 6-аминогексаноатной связью, получая остаток гидроксипролинолхолестерина. и-РНК, меченые на 5'-конце с использованием Cy-3 и Cy-5.5 (флуорофор), которые были синтезированы из соответствующего фосфорамидита Quasar-570 (Cy-3), приобретали из Biosearch Technologies. Конъюгацию лигандов с 5'-концом и/или внутренним положением осуществляли, используя соответствующим образом защищенный строительный блок лиганд-фосфорамидит. Осуществляли длительное 15-минутное связывание 0,1 М раствора фосфорамидита в безводном CH₃CN в присутствии активатора 5-(этилтио)-1H-тетразола со связанным с твердой подложкой олигонуклеотидом. Окисление межнуклеотидного фосфита до фосфата осуществляли, используя стандартный раствор йод-вода, как сообщается в публикации (1), или путем обработки смесью трет-бутилгидропероксид/ацетонитрил/вода (10:87:3) c 10-минутным периодом ожидания окисления конъюгированного олигонуклеотида. Фосфоротиоат вводили посредством окисления фосфита в фосфоротиоат с использованием реагента для переноса атома серы, такого как DDTT (приобретенного из AM Chemicals), PADS и/или реагента Бокажа. Холестеринфосфорамидит синтезировали самостоятельно и использовали в концентрации 0,1 М в дихлорметане. Время связывания холестеринфосфорамидита составляло 16 минут.

Удаление защиты I (удаление защиты нуклеотидного основания)

После завершения синтеза подложку переносили в стеклянный флакон объемом 100 мл (VWR). Олигонуклеотид отщепляли от подложки с одновременным удалением защиты основания и фосфатных групп с использованием 80 мл смеси этанольного раствора аммиака [аммиак:этанол (3:1)] в течение 6,5 часов при 55°C. Флакон недолго охлаждали на льду и затем этанольный раствор аммиака фильтровали в новый флакон объемом 250 мл. CPG промывали 2 частями по 40 мл смеси этанол/вода (1:1 об./об.). Затем объем смеси уменьшали до ~ 30 мл в роторном испарителе. Затем смесь замораживали, используя сухой лед, и сушили в вакууме на Speed vac.

Удаление защиты II (удаление группы 2'-TBDMS)

Высушенный остаток ресуспендировали в 26 мл триэтиламина, тригидрофторида триэтиламина (TEA⋅3HF) или пиридина-HF и ДМСО (3:4:6) и нагревали при 60°C в течение 90 минут, чтобы удалить группы трет-бутилдиметилсилила (TBDMS) в 2'-положении. Затем реакцию гасили, используя 50 мл 20 мМ ацетата натрия, и pH доводили до 6,5. Олигонуклеотид хранили в морозильной камере вплоть до очистки.

Анализ

Олигонуклеотиды анализировали высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) перед очисткой, и выбор буфера и колонки при этом зависит от природы последовательности и/или конъюгируемого лиганда.

Очистка с использованием ВЭЖХ

Конъюгированные с лигандом олигонуклеотиды очищали обращено-фазовой препаративной ВЭЖХ. Неконъюгированные олигонуклеотиды очищали анионообменной ВЭЖХ на колонке с гелем TSK, упакованной своими силами. Буферы представляли собой 20 мМ фосфат натрия (pH 8,5) в 10% CH₃CN (буфер A) и 20 мМ фосфат натрия (pH 8,5) в 10% CH₃CN, 1 М NaBr (буфер B). Фракции, содержащие полноразмерные олигонуклеотиды, объединяли, обессоливали и лиофилизировали. Примерно 0,15 OD обессоленных олигонуклеотидов разбавляли в воде до 150 мкл и затем пипеткой переносили в специальные флаконы для КГЭ и ЖХ-МС-анализа. Затем соединения анализировали, используя ЖХ-ESMS и КГЭ.

Получение ми-РНК

Для обычного получения ми-РНК эквимолярные количества смысловой и антисмысловой нитей нагревали в 1 x PBS при 95°C в течение 5 минут и медленно охлаждали до комнатной температуры. Целостность дуплекса подтверждали в ВЭЖХ-анализе.

Последовательности нуклеиновых кислот представлены ниже с использованием стандартной номенклатуры и специальных сокращений, указанных в таблице 1.

Таблица 1

Сокращенные обозначения нуклеотидных мономеров, используемые для представления последовательностей нуклеиновых кислот. Будет понятно, что такие мономеры, в том случае, когда они присутствуют в олигонуклеотиде, связаны друг с другом 5'-3'-фосфодиэфирными связями.

Сокращение	Нуклеотид(ды)
A	аденозин-3'-фосфат
Ab	бета-L-аденозин- 3'-фосфат
Abs	бета-L-аденозин- 3'-фосфоротиоат
Af	2'-фтораденозин-3'-фосфат
Afs	2'-фтораденозин-3'-фосфоротиоат
As	аденозин-3'-фосфоротиоат
C	цитидин-3'-фосфат
Cb	бета-L-цитидин-3'-фосфат
Cbs	бета-L-цитидин-3'-фосфоротиоат
Cf	2'-фторцитидин-3'-фосфат
Cfs	2'-фторцитидин-3'-фосфоротиоат
(Chd)	2'-O-гексадецилцитидин-3'-фосфат
(Chds)	2'-O-гексадецилцитидин-3'-фосфоротиоат
Cs	цитидин-3'-фосфоротиоат
G	гуанозин-3'-фосфат
Gb	бета-L-гуанозин-3'-фосфат
Gbs	бета-L-гуанозин-3'-фосфоротиоат
Gf	2'-фторгуанозин-3'-фосфат
Gfs	2'-фторгуанозин-3'-фосфоротиоат
Gs	гуанозин-3'-фософротиоат
T	5'-метилуридин-3'-фосфат
Tb	бета-L-тимидин-3'-фосфат
Tbs	бета-L-тимидин-3'-фосфоротиоат

Tf	2'-фтор-5-метилуридин-3'-фосфат
Tbs	2'-фтор-5-метилуридин-3'-фосфоротиоат
Ts	5-метилуридин-3'-фосфоротиоат
U	уридин-3'-фосфат
Ub	бета-L-уридин-3'-фосфат
Ubs	бета-L-уридин-3'-фосфоротиоат
Uf	2'-фторуридин-3'-фосфат
Ufs	2'-фторуридин-3'-фосфоротиоат
(Uhd)	2'-O-гексадецилуридин-3'-фосфат
(Uhds)	2′-O-гексадецилуридин-3'-фосфоротиоат
Us	уридин-3'-фосфоротиоат
N	любой нуклеотид ( G, A, C, T или U)
a	2'-O-метиладенозин-3'-фосфат
as	2'-O-метиладенозин-3'-фосфоротиоат
c	2'-O-метилцитидин-3'-фосфат
cs	2'-O-метилцитидин-3'-фосфоротиоат
g	2'-O-метилгуанозин-3'-фосфат
gs	2'-O-метилгуанозин-3'-фосфоротиоат
t	2'-O-метил-5-метилуридин-3'-фосфат
ts	2'-O-метил-5-метилуридин-3'-фосфоротиоат
u	2'-O-метилуридин-3'-фосфат
us	2'-O-метилуридин-3'-фосфоротиоат
dA	2'-дезоксиаденозин-3'-фосфат
dAs	2'-дезоксиаденозин-3'-фосфоротиоат
dC	2'-дезоксицитидин-3'-фосфат
dCs	2'-дезоксицитидин-3'-фосфоротиоат
dG	2'-дезоксигуанозин-3'-фосфат
dGs	2'-дезоксигуанозин-3'-фосфоротиоат
dT	2'-дезокситимидин
dTs	2'-дезокситимидин-3'-фосфоротиоат
dU	2'-дезоксиуридин
s	фосфоротиоатная связь
L961	N-[трис(GalNAc-алкил)амидодеканоил)]-4-гидроксипролинол Hyp-(GalNAc-алкил)3
(Aeo)	2'-O-метоксиэтиладенозин-3'-фосфат
(Aeos)	2'-O-метоксиэтиладенозин-3'-фосфоротиоат

(Geo)	2'-O-метоксиэтилгуанозин-3'-фосфат
(Geos)	2'-O-метоксиэтилгуанозин-3'-фосфоротиоат
(Teo)	2'-O-метоксиэтил-5-метилуридин-3'-фосфат
(Teos)	2'-O-метоксиэтил-5-метилуридин-3'-фосфоротиоат
(m5Ceo)	2'-O-метоксиэтил-5-метилцитидин-3'-фосфат
(m5Ceos)	2'-O-метоксиэтил-5-метилцитидин-3'-фосфоротиоат
1 L96 имеет следующую химическую структуру:

Пример 2. Конструирование и синтез ми-РНК ALAS1

Экспериментальные способы

Биоинформатика

Транскрипты

Осуществляли конструирование ми-РНК, чтобы идентифицировать ми-РНК, мишенью которых являются транскрипты ALAS1 человека, макака-резус (Macaca mulatto), мыши и крысы, описанные в базе данных о генах NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/). Для конструирования использовали следующие транскрипты из коллекции NCBI RefSeq: человек - NM_000688.4 (См. фиг. 3), NM_199166,1; резус - XM_001090440.2, XM_001090675.2; мышь - NM_020559.2; крыса - NM_024484.2. Вследствие высокой дивергенции последовательностей высших приматов/грызунов дуплексы ми-РНК конструировали несколькими отдельными партиями, включая без ограничения партии, содержащие дуплексы, соответствующие только транскриптам человека и макака-резус; только транскриптам человека, макака-резус, мыши и крысы; и только транскриптам мыши и крысы. Было сконструировано большинство дуплексов ми-РНК, которые имели 100% идентичность с указанным транскриптом человека и транскриптами других видов, предполагаемыми в каждой конструируемой партии (выше). В некоторых случаях (См. таблицу 8) были допустимы ошибочные спаривания между дуплексом и мРНК-мишенью в первом антисмысловом (последнем смысловом) положении, когда комплементарной парой оснований антисмысловая нить:мРНК-мишень была пара GC или CG. В указанных случаях конструировали дуплексы с парами UA или AU в паре первого антисмыслового:последнего смыслового положения. Таким образом, дуплексы сохраняли комплементарность, но имели несовпадения по отношению к мишени (U:C, U:G, A:C или A:G). Сконструировали восемнадцать таких дуплексов «с подстановкой UA» в виде части набора дуплексов человек/макак-резус/мышь/крыса (См. дуплексы в таблице 8 с пометкой «C19U», «G19U», «C19A» или «G19A» в колонке «Положение»).

Конструирование, прогноз специфичности и эффективности ми-РНК

Предположительную специфичность всех возможных 19-меров прогнозировали на основании каждой последовательности. Затем отбирали такие 19-мерные последовательности-кандидаты, в которых не было повторов длиннее 7 нуклеотидов. Такие выбранные для исследования 1510 ми-РНК человека/макака-резус, 114 ми-РНК человека/макака-резус/мыши/крысы и 717 ми-РНК мыши/крысы использовали в широких поисках против соответствующих транскриптомов (определяемых как набор данных NM_ и XM_ в наборах последовательностей NCBI Refseq человека, макака-резус, собаки, мыши или крысы) с помощью алгоритма полного «грубого перебора» вариантов, воплощенного в «BruteForce.py» с использованием скрипта Ppython. Скрипт подробно анализирует выравнивания олигомерных транскриптов, чтобы получить оценку на основании положения и количества несовпадений между ми-РНК и любым возможным транскриптом «вне мишени». Оценка вне мишени взвешивается, чтобы подчеркнуть отличия в области «затравки» ми-РНК, в положениях 2-9 от 5'-конца молекулы. Для каждой пары олиго-транскриптов, полученной в результате поиска с помощью «грубого перебора» вариантов, была дана оценка несовпадений посредством суммирования оценок отдельных несовпадений; несовпадения в положении 2-9 оценивали как 2,8, несовпадения положениях сайта расщепления 10-11 оценивали как 1,2, и несовпадения в области 12-19 оценивали как 1,0. Дополнительный прогноз вне мишени осуществляли путем сравнения частоты гептамеров и октомеров, полученных из 3 отдельных происходящих из затравки гексамеров каждого олигонуклеотида. Гексамеры из положений 2-7 относительно 5'-старта использовали для создания 2 гептамеров и одного октомера. Авторы создали «гептамер1», добавляя 3'-A к гексамеру; авторы создали гептамер2, добавляя 5'-A к гексамеру; авторы создали октомер, добавляя A как к 5'-, так и к 3'-концу гексамера. Предварительно вычисляли частоту октомеров и гептамеров в 3'UTRome человека, макака-резус, мыши или крысы (определяемым, как подпоследовательность транскриптома из базы данных NCBI Refseq, где конец кодирующей области «CDS» ясно определен). Частоту октомера нормализовали по отношению к частоте гептамеров, используя медианное значение из диапазоне частот октомера. Затем вычисляли «mirSeedScore», определяя сумму ((3 X нормализованная оценка октомера) + (2 X оценка гептамера2) + (1 X оценка гептамера1)).

Обе нити ми-РНК относили к определенной категории специфичности в соответствии с рассчитанными оценками в баллах: оценка выше 3 расценивается как высоко специфичная, равная 3 как специфичная и от 2,2 до 2,8 как умеренно специфичная. Авторы осуществляли сортировку по специфичности антисмысловой нити. Затем авторы отбирали дуплексы, в антисмысловых олигонуклеотидах, в которых отсутствовали GC в первом положении, отсутствовал G в обоих положениях 13 и 14, и которые имели 3 или больше Us или As в области затравки (характеристики дуплексов с высокой прогнозируемой эффективностью).

GalNac-конъюгированные дуплексы-кандидаты длиной 21 и 23 нуклеотида в смысловой и антисмысловой нитях, соответственно, конструировали, удлиняя антисмысловые 19-меры на 4 дополнительных нуклеотида в 3'-направлении (сохраняя точную комплементарность с транскриптом-мишенью). Смысловую нить определяли как обратный комплемент первых 21 нуклеотидов антисмыслового 23-мера. Отбирали дуплексы, которые сохраняли превосходные совпадения со всеми транскриптами выбранных видов на протяжении всех 23 нуклеотидов.

Отбор последовательностей ми-РНК

В общей сложности 90 смысловых и 90 антисмысловых, полученных для человека/макака-резус, 40 смысловых и 40 антисмысловых, полученных для человека/макака-резус/мыши/мыши/крысы, и 40 смысловых и 40 антисмысловых, полученных для мыши/крысы, 19-мерных олигомеров ми-РНК были синтезированы и сформированы в виде дуплексов. Всего синтезировали 45 смысловых и 45 антисмысловых полученных для человека/макака-резус 21/23-мерных олигонуклеотидов для получения 45 GalNac-конъюгированных дуплексов. Последовательности смысловых и антисмысловых нитей модифицированных дуплексов показаны в таблице 2, и последовательности смысловых и антисмысловых нитей немодифицированных дуплексов показаны в таблице 3.

Синтез последовательностей ALAS1

Последовательности ALAS1 синтезировали на синтезаторе MerMade 192 в масштабе либо 1, либо 0,2 мкмоль. Отдельные нити получали с 2'-O-метил-модификациями для скрининга in vitro с использованием реагентов для трансфекции. 3'-GalNAc-конъюгаты получали с использованием последовательностей, содержащих 2'-F- и 2'-O-метил-модификации в смысловой нити в 21-23-мерных конструкциях для свободного захвата клетками. В случае всех 21-мерных последовательностей в списке, применяли химию «endolight» («с ограниченной модификацией»), которая подробно описана ниже.

- Все пиримидины (цитозин и уридин) в смысловой нити содержали 2'-O-метил-основания (2'-O-метил-C и 2'-O-метил-U).

- В антисмысловой нити пиримидины, лежащие рядом (по направлению к 5'-положению) с рибо-A-нуклеозидом заменяли соответствующими им 2-O-метил-нуклеозидами.

- Вводили удлинение на два основания dTsdT на 3'-конце обеих смысловой и антисмысловой последовательностей.

- Файл с последовательностями преобразовывали в текстовый файл, чтобы сделать его совместимым в случае загрузки в программное обеспечение для синтеза MerMade 192.

В случае GalNAc-конъюгированных смысловых нитей и комплементарных антисмысловых последовательностей 2'F- и другие модифицированные нуклеозиды вводили в сочетании с 2'O-метил-рибонуклеозидами. Синтез осуществляли на GalNAc-модифицированной подложке на CPG в случае смысловой нити и на CPG, модифицированном универсальным носителем, в случае антисмысловой последовательности.

Синтез, отщепление и удаление защиты:

Для синтеза последовательностей ALAS1 использовали синтез олигонуклеотидов на твердой подложке с применением химии фосфорамидитов. Для 21-мерных последовательностей с ограниченной модификацией использовали дезокситимидин-CPG в качестве твердой подложки, тогда как в случае GalNAc-конъюгатов использовали GalNAc-твердую подложку для смысловой нити и универсальную CPG-подложку для антисмысловой нити.

Синтез указанных выше последовательностей осуществляли в масштабе либо 1, либо 0,2 мкмоль в 96-луночных планшетах. Растворы амидитов готовили в концентрации 0,1 М и использовали этилтиотетразол (0,6 М в ацетонитриле) в качестве активатора.

Синтезированные последовательности отщепляли и осуществляли удаление защиты в 96-луночных планшетах, используя метиламин на первой стадии и фторидный реагент на второй стадии. В случае последовательностей, содержащих GalNAc и 2'F-нуклеозиды, условия удаления защиты модифицировали. Последовательности после отщепления и удаления защиты преципитировали, используя смесь ацетон:этанол (80:20) и осадок ресуспендировали в 0,2 М натрий-ацетатном буфере. Образцы каждой последовательности анализировали, используя ЖХ-МС, чтобы подтвердить идентичность, используя УФ для количественной оценки, отобранный набор образцов анализировали, используя IEX-хроматографию, чтобы определить чистоту.

Очистка и обессоливание:

Последовательности ALAS1 преципитировали и очищали с помощью системы AKTA Purifier, используя колонку с сефадексом. Последовательности ALAS1 прогоняли при комнатной температуре. Инъекцию и сбор образцом осуществляли в 96-луночных планшетах (с глубиной лунок 1,8 мл). В элюенте собирали один пик, соответствующий полноразмерной последовательности. Обессоленные последовательности ALAS1 анализировали в отношении концентрации (используя УФ-измерения при A260) и чистоты (используя ионообменную ВЭЖХ). Затем отдельные комплементарные нити объединяли в стехиометрическом соотношении 1:1 с образованием дуплексов ми-РНК.

Таблица 2 Отдельные модифицированные нити ALAS1 человека и последовательности дуплексов
SEQ ID NO: (смысловая)	SEQ ID NO: (антисмысловая)	Положение в транскрипте NM_ 000688.4	Название дуплекса	Смысловая последовательность (5'-3')	Антисмысловая последовательность (5'-3')
2	3	522-540	AD-55078.2	cuccGGccAGuGAGAAAGAdTsdT	UCUUUCUcACUGGCCGGAGdTsdT
4	5	669-687	AD-55084.2	uGGcAGcAcAGAuGAAucAdTsdT	UGAUUcAUCUGUGCUGCcAdTsdT
6	7	790-808	AD-55090.2	cAGuGuGGuuAGuGuGAAAdTsdT	UUUcAcACuAACcAcACUGdTsdT
8	9	853-871	AD-55096.2	cAucAuGcAAAAGcAAAGAdTsdT	UCUUUGCUUUUGcAUGAUGdTsdT
10	11	876-894	AD-55102.2	AAAGAGuGucucAucuucudTsdT	AGAAGAUGAGAcACUCUUUdTsdT
12	13	877-895	AD-55106.2	AAGAGuGucucAucuucuudTsdT	AAGAAGAUGAGAcACUCUUdTsdT
14	15	914-932	AD-55111.2	ucuGuuuccAcuuuucAGudTsdT	ACUGAAAAGUGGAAAcAGAdTsdT
16	17	923-941	AD-55073.2	AcuuuucAGuAuGAucGuudTsdT	AACGAUcAuACUGAAAAGUdTsdT
18	19	926-944	AD-55079.2	uuucAGuAuGAucGuuucudTsdT	AGAAACGAUcAuACUGAAAdTsdT
20	21	927-945	AD-55085.2	uucAGuAuGAucGuuucuudTsdT	AAGAAACGAUcAuACUGAAdTsdT
22	23	928-946	AD-55091.2	ucAGuAuGAucGuuucuuudTsdT	AAAGAAACGAUcAuACUGAdTsdT
24	25	932-950	AD-55097.2	uAuGAucGuuucuuuGAGAdTsdT	UCUcAAAGAAACGAUcAuAdTsdT
26	27	973-991	AD-55103.2	uGAccAcAccuAucGAGuudTsdT	AACUCGAuAGGUGUGGUcAdTsdT
28	29	975-993	AD-55107.2	AccAcAccuAucGAGuuuudTsdT	AAAACUCGAuAGGUGUGGUdTsdT
30	31	1029-1047	AD-55112.2	uGGcAGAuGAcuAuucAGAdTsdT	UCUGAAuAGUcAUCUGCcAdTsdT
32	33	1077-1095	AD-55074.2	ucuGGuGcAGuAAuGAcuAdTsdT	uAGUcAUuACUGcACcAGAdTsdT
34	35	1124-1142	AD-55080.2	uGuGGGGcAGuuAuGGAcAdTsdT	UGUCcAuAACUGCCCcAcAdTsdT
36	37	1137-1155	AD-55086.2	uGGAcAcuuuGAAAcAAcAdTsdT	UGUUGUUUcAAAGUGUCcAdTsdT
38	39	1182-1200	AD-55098.2	AuAuuucuGGAAcuAGuAAdTsdT	UuACuAGUUCcAGAAAuAUdTsdT
40	41	1184-1202	AD-55104.2	AuuucuGGAAcuAGuAAAudTsdT	AUUuACuAGUUCcAGAAAUdTsdT
42	43	1185-1203	AD-55108.2	uuucuGGAAcuAGuAAAuudTsdT	AAUUuACuAGUUCcAGAAAdTsdT
44	45	1188-1206	AD-55113.2	cuGGAAcuAGuAAAuuccAdTsdT	UGGAAUUuACuAGUUCcAGdTsdT
46	47	1325-1343	AD-55075.2	uGuGAGAuuuAcucuGAuudTsdT	AAUcAGAGuAAAUCUcAcAdTsdT
48	49	1364-1382	AD-55081.2	AuccAAGGGAuucGAAAcAdTsdT	UGUUUCGAAUCCCUUGGAUdTsdT
50	51	1382-1400	AD-55087.2	AGccGAGuGccAAAGuAcAdTsdT	UGuACUUUGGcACUCGGCUdTsdT
52	53	1478-1496	AD-55093.2	uuuGAAAcuGuccAuucAAdTsdT	UUGAAUGGAcAGUUUcAAAdTsdT
54	55	1531-1549	AD-55099.2	uGAuGuGGcccAuGAGuuudTsdT	AAACUcAUGGGCcAcAUcAdTsdT
56	57	1631-1649	AD-53573.3	GucAuGccAAAAAuGGAcAdTsdT	UGUCcAUUUUUGGcAUGACdTsdT
58	59	1637-1655	AD-55109.2	ccAAAAAuGGAcAucAuuudTsdT	AAAUGAUGUCcAUUUUUGGdTsdT
60	61	1706-1724	AD-55114.2	AcGAGuucucuGAuuGAcAdTsdT	UGUcAAUcAGAGAACUCGUdTsdT
62	63	1962-1980	AD-55076.2	AAGucuGuGAuGAAcuAAudTsdT	AUuAGUUcAUcAcAGACUUdTsdT
64	65	1967-1985	AD-55082.2	uGuGAuGAAcuAAuGAGcAdTsdT	UGCUcAUuAGUUcAUcAcAdTsdT
66	67	1977-1995	AD-55088.2	uAAuGAGcAGAcAuAAcAudTsdT	AUGUuAUGUCUGCUcAUuAdTsdT
68	69	2189-2207	AD-55094.2	uuuGAAGuGAuGAGuGAAAdTsdT	UUUcACUcAUcACUUcAAAdTsdT
70	71	2227-2245	AD-55100.2	AGGcuuGAGcAAGuuGGuAdTsdT	uACcAACUUGCUcAAGCCUdTsdT

72	73	2313-2331	AD-55105.2	ucuucAGAGuuGucuuuAudTsdT	AuAAAGAcAACUCUGAAGAdTsdT
74	75	2317-2335	AD-55110.2	cAGAGuuGucuuuAuAuGudTsdT	AcAuAuAAAGAcAACUCUGdTsdT
76	77	2319-2337	AD-55115.2	GAGuuGucuuuAuAuGuGAdTsdT	UcAcAuAuAAAGAcAACUCdTsdT
78	79	2320-2338	AD-55077.2	AGuuGucuuuAuAuGuGAAdTsdT	UUcAcAuAuAAAGAcAACUdTsdT
80	81	2344-2362	AD-55083.2	uuAuAuuAAAuuuuAAucudTsdT	AGAUuAAAAUUuAAuAuAAdTsdT
82	83	2352-2370	AD-55089.2	AAuuuuAAucuAuAGuAAAdTsdT	UUuACuAuAGAUuAAAAUUdTsdT
84	85	2353-2371	AD-55095.2	AuuuuAAucuAuAGuAAAAdTsdT	UUUuACuAuAGAUuAAAAUdTsdT
86	87	2376-2394	AD-55101.2	AGuccuGGAAAuAAAuucudTsdT	AGAAUUuAUUUCcAGGACUdTsdT
88	89	358-376	AD-53511.1	cuGcccAuucuuAucccGAdTsdT	UCGGGAuAAGAAUGGGcAGdTsdT
90	91	789-807	AD-53512.1	ccAGuGuGGuuAGuGuGAAdTsdT	UUcAcACuAACcAcACUGGdTsdT
92	93	1076-1094	AD-53513.1	GucuGGuGcAGuAAuGAcudTsdT	AGUcAUuACUGcACcAGACdTsdT
94	95	1253-1271	AD-53514.1	GcAcucuuGuuuuccucGudTsdT	ACGAGGAAAAcAAGAGUGCdTsdT
96	97	1544-1562	AD-53515.1	GAGuuuGGAGcAAucAccudTsdT	AGGUGAUUGCUCcAAACUCdTsdT
98	99	2228-2246	AD-53516.1	GGcuuGAGcAAGuuGGuAudTsdT	AuACcAACUUGCUcAAGCCdTsdT
100	101	404-422	AD-53517.1	GGcAAAucucuGuuGuucudTsdT	AGAAcAAcAGAGAUUUGCCdTsdT
102	103	404-422	AD-53517.1	GGcAAAucucuGuuGuucudTsdT	AGAAcAAcAGAGAUUUGCCdTsdT
104	105	866-884	AD-53518.1	cAAAGAccAGAAAGAGuGudTsdT	AcACUCUUUCUGGUCUUUGdTsdT
106	107	1080-1098	AD-53519.1	GGuGcAGuAAuGAcuAccudTsdT	AGGuAGUcAUuACUGcACCdTsdT
108	109	1258-1276	AD-53520.1	cuuGuuuuccucGuGcuuudTsdT	AAAGcACGAGGAAAAcAAGdTsdT
110	111	1616-1634	AD-53521.1	GGGGAucGGGAuGGAGucAdTsdT	UGACUCcAUCCCGAUCCCCdTsdT
112	113	2230-2248	AD-53522.1	cuuGAGcAAGuuGGuAucudTsdT	AGAuACcAACUUGCUcAAGdTsdT
114	115	436-454	AD-53523.1	ccccAAGAuGAuGGAAGuudTsdT	AACUUCcAUcAUCUUGGGGdTsdT
116	117	436-454	AD-53523.1	ccccAAGAuGAuGGAAGuudTsdT	AACUUCcAUcAUCUUGGGGdTsdT
118	119	885-903	AD-53524.1	cucAucuucuucAAGAuAAdTsdT	UuAUCUUGAAGAAGAUGAGdTsdT
120	121	1127-1145	AD-53525.1	GGGGcAGuuAuGGAcAcuudTsdT	AAGUGUCcAuAACUGCCCCdTsdT
122	123	1315-1333	AD-53526.1	GAuGccAGGcuGuGAGAuudTsdT	AAUCUcAcAGCCUGGcAUCdTsdT
124	125	1870-1888	AD-53527.1	GAGAcAGAuGcuAAuGGAudTsdT	AUCcAUuAGcAUCUGUCUCdTsdT
126	127	2286-2304	AD-53528.1	ccccAGGccAuuAucAuAudTsdT	AuAUGAuAAUGGCCUGGGGdTsdT
128	129	489-507	AD-53529.1	cAGcAGuAcAcuAccAAcAdTsdT	UGUUGGuAGUGuACUGCUGdTsdT
130	131	489-507	AD-53529.1	cAGcAGuAcAcuAccAAcAdTsdT	UGUUGGuAGUGuACUGCUGdTsdT
132	133	915-933	AD-53530.1	cuGuuuccAcuuuucAGuAdTsdT	uACUGAAAAGUGGAAAcAGdTsdT
134	135	1138-1156	AD-53531.1	GGAcAcuuuGAAAcAAcAudTsdT	AUGUUGUUUcAAAGUGUCCdTsdT
136	137	1324-1342	AD-53532.1	cuGuGAGAuuuAcucuGAudTsdT	AUcAGAGuAAAUCUcAcAGdTsdT
138	139	1927-1945	AD-53533.1	cccuGuGcGGGuuGcAGAudTsdT	AUCUGcAACCCGcAcAGGGdTsdT
140	141	2312-2330	AD-53534.1	GucuucAGAGuuGucuuuAdTsdT	uAAAGAcAACUCUGAAGACdTsdT
142	143	646-664	AD-53535.1	cAcuGcAAGcAAAuGcccudTsdT	AGGGcAUUUGCUUGcAGUGdTsdT
144	145	922-940	AD-53536.1	cAcuuuucAGuAuGAucGudTsdT	ACGAUcAuACUGAAAAGUGdTsdT
146	147	1163-1181	AD-53537.1	GGGGcAGGuGGuAcuAGAAdTsdT	UUCuAGuACcACCUGCCCCdTsdT
148	149	1347-1365	AD-53538.1	GGAAccAuGccuccAuGAudTsdT	AUcAUGGAGGcAUGGUUCCdTsdT
150	151	1964-1982	AD-53539.1	GucuGuGAuGAAcuAAuGAdTsdT	UcAUuAGUUcAUcAcAGACdTsdT
152	153	2321-2339	AD-53540.1	GuuGucuuuAuAuGuGAAudTsdT	AUUcAcAuAuAAAGAcAACdTsdT
154	155	671-689	AD-53541.1	GcAGcAcAGAuGAAucAGAdTsdT	UCUGAUUcAUCUGUGCUGCdTsdT
156	157	924-942	AD-53542.1	cuuuucAGuAuGAucGuuudTsdT	AAACGAUcAuACUGAAAAGdTsdT
158	159	1164-1182	AD-53543.1	GGGcAGGuGGuAcuAGAAAdTsdT	UUUCuAGuACcACCUGCCCdTsdT
160	161	1460-1478	AD-53544.1	GuccccAAGAuuGuGGcAudTsdT	AUGCcAcAAUCUUGGGGACdTsdT
162	163	1976-1994	AD-53545.1	cuAAuGAGcAGAcAuAAcAdTsdT	UGUuAUGUCUGCUcAUuAGdTsdT
164	165	786-804	AD-53546.1	GccccAGuGuGGuuAGuGudTsdT	AcACuAACcAcACUGGGGCdTsdT
166	167	935-953	AD-53547.1	GAucGuuucuuuGAGAAAAdTsdT	UUUUCUcAAAGAAACGAUCdTsdT
168	169	1165-1183	AD-53548.1	GGcAGGuGGuAcuAGAAAudTsdT	AUUUCuAGuACcACCUGCCdTsdT
170	171	1530-1548	AD-53549.1	GuGAuGuGGcccAuGAGuudTsdT	AACUcAUGGGCcAcAUcACdTsdT

172	173	2003-2021	AD-53550.1	cAAGcAAucAAuuAcccuAdTsdT	uAGGGuAAUUGAUUGCUUGdTsdT
174	175	788-806	AD-53551.1	cccAGuGuGGuuAGuGuGAdTsdT	UcAcACuAACcAcACUGGGdTsdT
176	177	974-992	AD-53552.1	GAccAcAccuAucGAGuuudTsdT	AAACUCGAuAGGUGUGGUCdTsdT
178	179	1191-1209	AD-53553.1	GAAcuAGuAAAuuccAuGudTsdT	AcAUGGAAUUuACuAGUUCdTsdT
180	181	1541-1559	AD-53554.1	cAuGAGuuuGGAGcAAucAdTsdT	UGAUUGCUCcAAACUcAUGdTsdT
182	183	2075-2093	AD-53555.1	ccccAGAuGAuGAAcuAcudTsdT	AGuAGUUcAUcAUCUGGGGdTsdT
184	185	360-378	AD-53561.1	GcccAuucuuAucccGAGudTsdT	ACUCGGGAuAAGAAUGGGCdTsdT
186	187	1356-1374	AD-53567.1	ccuccAuGAuccAAGGGAudTsdT	AUCCCUUGGAUcAUGGAGGdTsdT
188	189	1631-1649	AD-53573.1	GucAuGccAAAAAuGGAcAdTsdT	UGUCcAUUUUUGGcAUGACdTsdT
190	191	1634-1652	AD-53579.1	AuGccAAAAAuGGAcAucAdTsdT	UGAUGUCcAUUUUUGGcAUdTsdT

Таблица 3 Отдельные немодифицированные нити ALAS1 человека и последовательности дуплексов
SEQ ID NO: (смысловая)	SEQ ID NO: (антисмысловая)	Положение в транскрипте NM_ 000688.4	Название дуплекса	Смысловая последовательность (5'-3')	Антисмысловая последовательность (5'-3')
192	193	522-540	AD-55078.2	CUCCGGCCAGUGAGAAAGA	UCUUUCUCACUGGCCGGAG
194	195	669-687	AD-55084.2	UGGCAGCACAGAUGAAUCA	UGAUUCAUCUGUGCUGCCA
196	197	790-808	AD-55090.2	CAGUGUGGUUAGUGUGAAA	UUUCACACUAACCACACUG
198	199	853-871	AD-55096.2	CAUCAUGCAAAAGCAAAGA	UCUUUGCUUUUGCAUGAUG
200	201	876-894	AD-55102.2	AAAGAGUGUCUCAUCUUCU	AGAAGAUGAGACACUCUUU
202	203	877-895	AD-55106.2	AAGAGUGUCUCAUCUUCUU	AAGAAGAUGAGACACUCUU
204	205	914-932	AD-55111.2	UCUGUUUCCACUUUUCAGU	ACUGAAAAGUGGAAACAGA
206	207	923-941	AD-55073.2	ACUUUUCAGUAUGAUCGUU	AACGAUCAUACUGAAAAGU
208	209	926-944	AD-55079.2	UUUCAGUAUGAUCGUUUCU	AGAAACGAUCAUACUGAAA
210	211	927-945	AD-55085.2	UUCAGUAUGAUCGUUUCUU	AAGAAACGAUCAUACUGAA
212	213	928-946	AD-55091.2	UCAGUAUGAUCGUUUCUUU	AAAGAAACGAUCAUACUGA
214	215	932-950	AD-55097.2	UAUGAUCGUUUCUUUGAGA	UCUCAAAGAAACGAUCAUA
216	217	973-991	AD-55103.2	UGACCACACCUAUCGAGUU	AACUCGAUAGGUGUGGUCA
218	219	975-993	AD-55107.2	ACCACACCUAUCGAGUUUU	AAAACUCGAUAGGUGUGGU
220	221	1029-1047	AD-55112.2	UGGCAGAUGACUAUUCAGA	UCUGAAUAGUCAUCUGCCA
222	223	1077-1095	AD-55074.2	UCUGGUGCAGUAAUGACUA	UAGUCAUUACUGCACCAGA
224	225	1124-1142	AD-55080.2	UGUGGGGCAGUUAUGGACA	UGUCCAUAACUGCCCCACA
226	227	1137-1155	AD-55086.2	UGGACACUUUGAAACAACA	UGUUGUUUCAAAGUGUCCA
228	229	1182-1200	AD-55098.2	AUAUUUCUGGAACUAGUAA	UUACUAGUUCCAGAAAUAU
230	231	1184-1202	AD-55104.2	AUUUCUGGAACUAGUAAAU	AUUUACUAGUUCCAGAAAU
232	233	1185-1203	AD-55108.2	UUUCUGGAACUAGUAAAUU	AAUUUACUAGUUCCAGAAA
234	235	1188-1206	AD-55113.2	CUGGAACUAGUAAAUUCCA	UGGAAUUUACUAGUUCCAG
236	237	1325-1343	AD-55075.2	UGUGAGAUUUACUCUGAUU	AAUCAGAGUAAAUCUCACA
238	239	1364-1382	AD-55081.2	AUCCAAGGGAUUCGAAACA	UGUUUCGAAUCCCUUGGAU
240	241	1382-1400	AD-55087.2	AGCCGAGUGCCAAAGUACA	UGUACUUUGGCACUCGGCU
242	243	1478-1496	AD-55093.2	UUUGAAACUGUCCAUUCAA	UUGAAUGGACAGUUUCAAA
244	245	1531-1549	AD-55099.2	UGAUGUGGCCCAUGAGUUU	AAACUCAUGGGCCACAUCA
246	247	1631-1649	AD-53573.3	GUCAUGCCAAAAAUGGACA	UGUCCAUUUUUGGCAUGAC
248	249	1637-1655	AD-55109.2	CCAAAAAUGGACAUCAUUU	AAAUGAUGUCCAUUUUUGG
250	251	1706-1724	AD-55114.2	ACGAGUUCUCUGAUUGACA	UGUCAAUCAGAGAACUCGU
252	253	1962-1980	AD-55076.2	AAGUCUGUGAUGAACUAAU	AUUAGUUCAUCACAGACUU
254	255	1967-1985	AD-55082.2	UGUGAUGAACUAAUGAGCA	UGCUCAUUAGUUCAUCACA

256	257	1977-1995	AD-55088.2	UAAUGAGCAGACAUAACAU	AUGUUAUGUCUGCUCAUUA
258	259	2189-2207	AD-55094.2	UUUGAAGUGAUGAGUGAAA	UUUCACUCAUCACUUCAAA
260	261	2227-2245	AD-55100.2	AGGCUUGAGCAAGUUGGUA	UACCAACUUGCUCAAGCCU
262	263	2313-2331	AD-55105.2	UCUUCAGAGUUGUCUUUAU	AUAAAGACAACUCUGAAGA
264	265	2317-2335	AD-55110.2	CAGAGUUGUCUUUAUAUGU	ACAUAUAAAGACAACUCUG
266	267	2319-2337	AD-55115.2	GAGUUGUCUUUAUAUGUGA	UCACAUAUAAAGACAACUC
268	269	2320-2338	AD-55077.2	AGUUGUCUUUAUAUGUGAA	UUCACAUAUAAAGACAACU
270	271	2344-2362	AD-55083.2	UUAUAUUAAAUUUUAAUCU	AGAUUAAAAUUUAAUAUAA
272	273	2352-2370	AD-55089.2	AAUUUUAAUCUAUAGUAAA	UUUACUAUAGAUUAAAAUU
274	275	2353-2371	AD-55095.2	AUUUUAAUCUAUAGUAAAA	UUUUACUAUAGAUUAAAAU
276	277	2376-2394	AD-55101.2	AGUCCUGGAAAUAAAUUCU	AGAAUUUAUUUCCAGGACU
278	279	358-376	AD-53511.1	CUGCCCAUUCUUAUCCCGA	UCGGGAUAAGAAUGGGCAG
280	281	789-807	AD-53512.1	CCAGUGUGGUUAGUGUGAA	UUCACACUAACCACACUGG
282	283	1076-1094	AD-53513.1	GUCUGGUGCAGUAAUGACU	AGUCAUUACUGCACCAGAC
284	285	1253-1271	AD-53514.1	GCACUCUUGUUUUCCUCGU	ACGAGGAAAACAAGAGUGC
286	287	1544-1562	AD-53515.1	GAGUUUGGAGCAAUCACCU	AGGUGAUUGCUCCAAACUC
288	289	2228-2246	AD-53516.1	GGCUUGAGCAAGUUGGUAU	AUACCAACUUGCUCAAGCC
290	291	404-422	AD-53517.1	GGCAAAUCUCUGUUGUUCU	AGAACAACAGAGAUUUGCC
292	293	404-422	AD-53517.1	GGCAAAUCUCUGUUGUUCU	AGAACAACAGAGAUUUGCC
294	295	866-884	AD-53518.1	CAAAGACCAGAAAGAGUGU	ACACUCUUUCUGGUCUUUG
296	297	1080-1098	AD-53519.1	GGUGCAGUAAUGACUACCU	AGGUAGUCAUUACUGCACC
298	299	1258-1276	AD-53520.1	CUUGUUUUCCUCGUGCUUU	AAAGCACGAGGAAAACAAG
300	301	1616-1634	AD-53521.1	GGGGAUCGGGAUGGAGUCA	UGACUCCAUCCCGAUCCCC
302	303	2230-2248	AD-53522.1	CUUGAGCAAGUUGGUAUCU	AGAUACCAACUUGCUCAAG
304	305	436-454	AD-53523.1	CCCCAAGAUGAUGGAAGUU	AACUUCCAUCAUCUUGGGG
306	307	436-454	AD-53523.1	CCCCAAGAUGAUGGAAGUU	AACUUCCAUCAUCUUGGGG
308	309	885-903	AD-53524.1	CUCAUCUUCUUCAAGAUAA	UUAUCUUGAAGAAGAUGAG
310	311	1127-1145	AD-53525.1	GGGGCAGUUAUGGACACUU	AAGUGUCCAUAACUGCCCC
312	313	1315-1333	AD-53526.1	GAUGCCAGGCUGUGAGAUU	AAUCUCACAGCCUGGCAUC
314	315	1870-1888	AD-53527.1	GAGACAGAUGCUAAUGGAU	AUCCAUUAGCAUCUGUCUC
316	317	2286-2304	AD-53528.1	CCCCAGGCCAUUAUCAUAU	AUAUGAUAAUGGCCUGGGG
318	319	489-507	AD-53529.1	CAGCAGUACACUACCAACA	UGUUGGUAGUGUACUGCUG
320	321	489-507	AD-53529.1	CAGCAGUACACUACCAACA	UGUUGGUAGUGUACUGCUG
322	323	915-933	AD-53530.1	CUGUUUCCACUUUUCAGUA	UACUGAAAAGUGGAAACAG
324	325	1138-1156	AD-53531.1	GGACACUUUGAAACAACAU	AUGUUGUUUCAAAGUGUCC
326	327	1324-1342	AD-53532.1	CUGUGAGAUUUACUCUGAU	AUCAGAGUAAAUCUCACAG
328	329	1927-1945	AD-53533.1	CCCUGUGCGGGUUGCAGAU	AUCUGCAACCCGCACAGGG
330	331	2312-2330	AD-53534.1	GUCUUCAGAGUUGUCUUUA	UAAAGACAACUCUGAAGAC
332	333	646-664	AD-53535.1	CACUGCAAGCAAAUGCCCU	AGGGCAUUUGCUUGCAGUG
334	335	922-940	AD-53536.1	CACUUUUCAGUAUGAUCGU	ACGAUCAUACUGAAAAGUG
336	337	1163-1181	AD-53537.1	GGGGCAGGUGGUACUAGAA	UUCUAGUACCACCUGCCCC
338	339	1347-1365	AD-53538.1	GGAACCAUGCCUCCAUGAU	AUCAUGGAGGCAUGGUUCC
340	341	1964-1982	AD-53539.1	GUCUGUGAUGAACUAAUGA	UCAUUAGUUCAUCACAGAC
342	343	2321-2339	AD-53540.1	GUUGUCUUUAUAUGUGAAU	AUUCACAUAUAAAGACAAC
344	345	671-689	AD-53541.1	GCAGCACAGAUGAAUCAGA	UCUGAUUCAUCUGUGCUGC
346	347	924-942	AD-53542.1	CUUUUCAGUAUGAUCGUUU	AAACGAUCAUACUGAAAAG
348	349	1164-1182	AD-53543.1	GGGCAGGUGGUACUAGAAA	UUUCUAGUACCACCUGCCC
350	351	1460-1478	AD-53544.1	GUCCCCAAGAUUGUGGCAU	AUGCCACAAUCUUGGGGAC
352	353	1976-1994	AD-53545.1	CUAAUGAGCAGACAUAACA	UGUUAUGUCUGCUCAUUAG
354	355	786-804	AD-53546.1	GCCCCAGUGUGGUUAGUGU	ACACUAACCACACUGGGGC

356	357	935-953	AD-53547.1	GAUCGUUUCUUUGAGAAAA	UUUUCUCAAAGAAACGAUC
358	359	1165-1183	AD-53548.1	GGCAGGUGGUACUAGAAAU	AUUUCUAGUACCACCUGCC
360	361	1530-1548	AD-53549.1	GUGAUGUGGCCCAUGAGUU	AACUCAUGGGCCACAUCAC
362	363	2003-2021	AD-53550.1	CAAGCAAUCAAUUACCCUA	UAGGGUAAUUGAUUGCUUG
364	365	788-806	AD-53551.1	CCCAGUGUGGUUAGUGUGA	UCACACUAACCACACUGGG
366	367	974-992	AD-53552.1	GACCACACCUAUCGAGUUU	AAACUCGAUAGGUGUGGUC
368	369	1191-1209	AD-53553.1	GAACUAGUAAAUUCCAUGU	ACAUGGAAUUUACUAGUUC
370	371	1541-1559	AD-53554.1	CAUGAGUUUGGAGCAAUCA	UGAUUGCUCCAAACUCAUG
372	373	2075-2093	AD-53555.1	CCCCAGAUGAUGAACUACU	AGUAGUUCAUCAUCUGGGG
374	375	360-378	AD-53561.1	GCCCAUUCUUAUCCCGAGU	ACUCGGGAUAAGAAUGGGC
376	377	1356-1374	AD-53567.1	CCUCCAUGAUCCAAGGGAU	AUCCCUUGGAUCAUGGAGG
378	379	1631-1649	AD-53573.1	GUCAUGCCAAAAAUGGACA	UGUCCAUUUUUGGCAUGAC
380	381	1634-1652	AD-53579.1	AUGCCAAAAAUGGACAUCA	UGAUGUCCAUUUUUGGCAU

Пример 3. Скрининг дуплексов ми-РНК ALAS1 in vitro в отношении активности в нокдауне ALAS1.

Дуплексы ми-РНК ALAS1 подвергали скринингу в отношении их способности вызывать нокдаун экспрессии ALAS1 in vitro.

Скрининг in vitro

Культура клеток и трансфекции

Клетки Hep3B (ATCC, Manassas, VA) выращивали почти до слияния при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в MEM (ATCC) с добавлением 10% FBS, затем снимали с планшета обработкой трипсином. Трансфекцию осуществляли, добавляя 14,8 мкл Opti-MEM плюс 0,2 мкл липофектамина RNAiMax на лунку (Invitrogen, Carlsbad CA, № в каталоге 13778-150) к 5 мкл дуплексов ми-РНК на лунку в 96-луночный планшет и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем к смеси ми-РНК добавляли 80 мкл полной ростовой среды, содержащей ~2×10⁴ клеток Hep3B. Клетки инкубировали либо в течение 24 часов, либо в течение 120 часов до очистки РНК. Эксперименты с одной дозой осуществляли с использованием конечной концентрации дуплекса 10 нМ и 0,1 нМ, а эксперименты по определению зависимости доза-ответ осуществляли, используя конечную концентрацию дуплекса 10, 1,67, 0,27, 0,046, 0,0077, 0,0013, 0,00021, 0,00004 нМ.

Выделение суммарной РНК с использованием набора для выделения мРНК DYNABEADS (Invitrogen, серия №: 610-12)

Клетки собирали и лизировали в 150 мкл буфера для лизиса/связывания, затем перемешивали в течение 5 минут при 850 об./мин, используя термомиксер Eppendorf (скорость перемешивания была одинаковой на протяжении всего процесса). Добавляли десять микролитров магнитных шариков и 80 мкл буфера для лизиса/связывания в лунки планшета с круглым дном и перемешивали в течение 1 минуты. Магнитные шарики улавливали, используя магнитную подставку, и надосадок удаляли, не нарушая шарики. После удаления надосадка к оставшимся шарикам добавляли лизированные клетки и перемешивали в течение 5 минут. После удаления надосадка магнитные шарики промывали 2 раза, используя 150 мкл буфера для промывки A, и перемешивали в течение 1 минуты. Шарики снова улавливали и надосадок удаляли. Затем шарики промывали, используя 150 мкл буфера для промывки B, улавливали и надосадок удаляли. Шарики снова промывали 150 мкл буфера для элюирования, улавливали и надосадок удаляли. Шарикам давали возможность высохнуть в течение 2 минут. После сушки добавляли 50 мкл буфера для элюирования и перемешивали в течение 5 минут при 70°C. Шарики улавливали на магните в течение 5 минут. 40 мкл надосадка извлекали и добавляли в другой 96-луночный планшет.

Синтез кДНК с использованием набора для высокопроизводительной обратной транскрипции кДНК ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, № в каталоге 4368813)

Маточную смесь, состоящую из 2 мкл 10X буфера, 0,8 мкл 25X dNTP, 2 мкл случайных праймеров, 1 мкл обратной транскриптазы, 1 мкл ингибитора РНКаз и 3,2 мкл H₂O на реакцию, добавляли к 10 мкл суммарной РНК. кДНК получали, используя термоциклер Bio-Rad C-1000 или S-1000 (Hercules, CA), выполняя следующие стадии: 25°C 10 минут, 37°C 120 минут, 85°C 5 секунд, 4°C - хранение.

ПЦР в реальном времени

2 мкл кДНК добавляли к маточной смеси, содержащей 0,5 мкл зонда GAPDH TaqMan (Applied Biosystems, № в каталоге 4326317E), 0,5 мкл зонда ALAS1 TaqMan (Applied Biosystems, № в каталоге Hs00167441_m1) и 5 мкл маточной смеси зонда Lightcycler 480 (Roche, № в каталоге 04887301001), на лунку в 384-луночный планшет (Roche, № в каталоге 04887301001). ПЦР в реальном времени осуществляли в системе для ПЦР в реальном времени Roche LC480 (Roche), используя анализ ΔΔCt(RQ). Каждый дуплекс тестировали, используя две независимых трансфекции с двумя биологическими повторами в каждом случае, и каждую трансфекцию анализировали в двух повторах, если не указано иное в сводных таблицах.

Чтобы вычислить относительное кратное изменение, данные, полученные в реальном времени, анализировали, используя способ ΔΔCt, и нормализовали по отношению к данным анализов, осуществляемых с использованием клеток, трансфицированных 10 нм AD-1955, или ложно трансфицированных клеток. IC50 вычисляли с помощью модели подгонки по 4 параметрам, используя XLFit, и нормализовали по отношению к клеткам, трансфицированным AD-1955, или наивным клеткам в том же диапазоне доз или по отношению к собственной наименьшей дозе.

Нокдаун in vitro эндогенной экспрессии ALAS1 дуплексами ми-РНК ALAS1

Таблица 4 иллюстрирует нокдаун ALAS1 в клетках Hep3B под действием дуплексов модифицированных ми-РНК ALAS1 (См. таблицу 2). Сайленсинг выражали в виде доли оставшейся матричной РНК относительно негативной (люцифераза) контрольной ми-РНК AD- 1955. Данные получали, как описано выше, после трансфекции 10 нМ или 0,1 нМ каждой ми-РНК. кПЦР осуществляли, используя зонд ALAS1 TaqMan Hs00167441_m1.

Таблица 4 Экспрессия ALAS1 в клетках Hep3B после трансфекции ми-РНК ALAS1
Идентификационный номер дуплекса	10 нМ Среднее	0,1 нМ Среднее	10 нМ Стандартное отклонение	0,1 нМ Стандартное отклонение
AD-55078.2	0,7	0,87	0,001	0,089
AD-55084.2	0,08	0,3	0	0,04
AD-55090.2	0,06	0,08	0,002	0,003
AD-55096.2	0,61	0,92	0,171	0,34
AD-55102.2	0,63	0,62	0,005	0,069
AD-55106.2	0,07	0,08	0,004	0,027
AD-55111.2	0,06	0,23	0,013	0,062

AD-55073.2	0,21	0,4	0,018	0,061
AD-55079.2	0,17	0,43	0,033	0,089
AD-55085.2	0,13	0,21	0,011	0,019
AD-55091.2	0,27	0,55	0,033	0,009
AD-55097.2	0,31	0,38	0,051	0,059
AD-55103.2	0,05	0,11	0,017	0,006
AD-55107.2	0,12	0,24	0,007	0,008
AD-55112.2	0,15	0,2	0,036	0,025
AD-55074.2	0,16	0,45	0,008	0,002
AD-55080.2	0,79	0,99	0,095	0,304
AD-55086.2	0,09	0,22	0,005	0,035
AD-55098.2	0,25	0,51	0,03	0,07
AD-55104.2	0,06	0,1	0,017	0,001
AD-55108.2	0,47	0,65	0,03	0,015
AD-55113.2	0,38	0,62	0,068	0,039
AD-55075.2	0,12	0,28	0,007	0,051
AD-55081.2	0,21	0,51	0,036	0,066
AD-55087.2	0,1	0,19	0,017	0,02
AD-55093.2	0,24	0,56	0,029	0,053
AD-55099.2	0,05	0,18	0,001	0,038
AD-53573.3	0,67	1,07	0,16	0,153
AD-55109.2	0,07	0,23	0,006	0,052
AD-55114.2	0,08	0,16	0,004	0,017
AD-55076.2	0,05	0,14	0,007	0,035
AD-55082.2	0,08	0,3	0,019	0,016
AD-55088.2	0,06	0,12	0,008	0,02
AD-55094.2	0,06	0,18	0,005	0,023
AD-55100.2	0,45	0,83	0,02	0,05
AD-55105.2	0,02	0,05	0,005	0,004
AD-55110.2	0,15	0,19	0,031	0,016
AD-55115.2	0,35	0,58	0,045	0,052
AD-55077.2	0,14	0,14	0,006	0,019
AD-55083.2	0,56	0,98	0,24	0,188
AD-55089.2	0,62	0,79	0,036	0,094

AD-55095.2	0,59	0,92	0,12	0,079
AD-55101.2	0,71	0,97	0,074	0,097
AD-1955	1,00	1,01	0,03	0,04
AD-53511.1	0,84	1,08	0,028	0,0515
AD-53512.1	0,15	0,65	0,062	0,023
AD-53513.1	0,34	0,86	0,055	0,011
AD-53514.1	0,12	0,61	0,003	0,008
AD-53515.1	0,25	0,66	0,005	0,004
AD-53516.1	1,05	1,02	0,032	0,011
AD-53517.1	0,145	0,725	0,025	0,0155
AD-53518.1	0,72	0,85	0,045	0,028
AD-53519.1	0,18	0,66	0,061	0,004
AD-53520.1	0,18	0,9	0,041	0,001
AD-53521.1	0,97	1,07	0,01	0,003
AD-53522.1	0,87	1,1	0,065	0,112
AD-53523.1	0,48	0,96	0,0305	0,0255
AD-53524.1	0,11	0,66	0,02	0,006
AD-53525.1	0,71	1,03	0,016	0,01
AD-53526.1	0,23	0,85	0,075	0,01
AD-53527.1	0,25	0,83	0,015	0,017
AD-53528.1	0,44	0,93	0,037	0,006
AD-53529.1	0,185	0,73	0,015	0,014
AD-53530.1	0,1	0,62	0,02	0,003
AD-53531.1	0,48	0,93	0,019	0,045
AD-53532.1	0,06	0,17	0	0,003
AD-53533.1	0,36	0,93	0,025	0,034
AD-53534.1	0,1	0,36	0,014	0,012
AD-53535.1	0,58	1,05	0,036	0,071
AD-53536.1	0,12	0,45	0,009	0,026
AD-53537.1	0,73	0,96	0,101	0,015
AD-53538.1	0,74	1,07	0	0,046
AD-53539.1	0,52	0,97	0,057	0,032
AD-53540.1	0,1	0,47	0,017	0,012
AD-53541.1	0,11	0,29	0,026	0,015

AD-53542.1	0,08	0,23	0,008	0,006
AD-53543.1	0,62	1,01	0,027	0,014
AD-53544.1	0,8	1,04	0,002	0,001
AD-53545.1	0,17	0,73	0,007	0,007
AD-53546.1	0,27	0,93	0,058	0,019
AD-53547.1	0,12	0,28	0,008	0,01
AD-53548.1	0,1	0,34	0,022	0,002
AD-53549.1	0,8	1,04	0,011	0,026
AD-53550.1	0,05	0,54	0,02	0,003
AD-53551.1	0,96	1,16	0,029	0,044
AD-53552.1	0,13	0,5	0,002	0,009
AD-53553.1	0,92	1,1	0,027	0,02
AD-53554.1	0,76	0,67	0,005	0,004
AD-53555.1	0,11	0,53	0,009	0,007
AD-53561.1	0,72	0,94	0,014	0,001
AD-53567.1	0,16	0,66	0,019	0,003
AD-53573.1	1,06	1,10	0,019	0,037
AD-53579.1	0,19	0,76	0,036	0,019

IC₅₀ выбранных дуплексов ми-РНК ALAS1 в скрининге in vitro

Таблица 5 иллюстрирует значения IC₅₀ выбранных дуплексов ми-РНК ALAS1, определенные на основании нокдауна эндогенно экспрессируемого ALAS1 в линии клеток Hep3B дуплексами модифицированной ми-РНК ALAS1 (См. таблицу 2). Данные получали, как описано выше, через 24 или 120 часов после трансфекции каждым дуплексом ми-РНК. Сайленсинг ALAS1 выражали в виде доли оставшейся мРНК относительно ми-РНК AD-1955, т.е. ми-РНК, не неправленой к мишени, которую использовали в качестве негативного контроля. Данные из экспериментов по трансфекции с повторами использовали для подгонки к одной линии, чтобы определить IC₅₀. Несколько дуплексов (например, AD-53541.1, AD-53542.1 и AD-53547.1) имели низкие IC₅₀ примерно до 0,03 нМ во временной точке 24 часа. Множество дуплексов имели IC₅₀ меньше 0,1 нМ (например, AD-53534.1, AD-53536.1, AD-53540.1, AD-53541.1, AD-53542.1, AD-53547.1, AD-53548.1, AD-53550.1, AD-53552.1) во временной точке 24 часа, и некоторые из них также имели IC₅₀ меньше 0,1 нМ (например, AD-53534.1, AD-53540.1, AD-53541.1, AD-53542.1, AD-53547.1, AD-53552.1) во временной точке 120 часа.

Таблица 5 IC50 выбранных дуплексов ми-РНК ALAS1, нормализованные по отношению к AD-1955
	IC50 (нМ)
Идентификационный номер дуплекса	24 часа	120 часов
AD-53534.1	0,045	0,076
AD-53536.1	0,049	0,105
AD-53540.1	0,054	0,077
AD-53541.1	0,032	0,062
AD-53542.1	0,028	0,093
AD-53547.1	0,03	0,062
AD-53548.1	0,044	0,101
AD-53550.1	0,085	0,152
AD-53552.1	0,077	0,063
AD-53567.1	0,219	0,357
AD-53579.1	0,217	0,566

Пример 4. Сайленсинг in vivo с использованием ми-РНК ALAS1 мыши/крысы, приготовленной в виде LNP

Последовательности модифицированного дуплекса AD-53558 показаны в таблице 6 ниже.

Таблица 6 Последовательности дуплекса ми-РНК ALAS1 AD-53558.4
SEQ ID NO: (смысловая)	SEQ ID NO: (антисмысловая)	Положение старта в транскрипте NM_020559.2	Название дуплекса	Смысловая последовательность (5'-3')	Антисмысловая последовательность (5'-3')
383	384	1184	AD-53558	cuGuGAAAuuuAcucuGAudTsdT	AUcAGAGuAAAUUUcAcAGdTsdT

Такой дуплекс готовили в виде препарата LNP11 (См. таблицу 10 выше). Приготовленную в виде LNP-препарата ми-РНК AD-53558 тестировали in vivo у мышей (N=25 животных; 5 животных на группу) и крыс (N=20 животных; 4 животных на группу) и был подтвержден сайленсинг мРНК ALAS1 in vivo. Результаты показаны на фиг. 5 и фиг. 6.

На фиг. 5 показано, что ми-РНК оказывала зависимый от дозы эффект у мышей. Экспрессия мышиной мРНК ALAS1 (mALAS1) снижалась примерно на 78% при введении ми-РНК в дозе 1 мг/кг; количество мышиной мРНК ALAS1 снижалось примерно на 60% при введении ми-РНК в дозе 0,3 мг/кг; и количество мышиной мРНК ALAS1 снижалось примерно на 49% при введении ми-РНК в дозе 0,1 мг/кг. Указанные снижения выражали относительно контроля с PBS. Также использовали контроль AD-1955 LUC, как показано на фиг. 5.

Подобным образом, на фиг. 6 показано, что ми-РНК проявляет зависимый от дозы эффект у крыс. Экспрессия РНК ALAS1 была снижена примерно на 70% при введении ми-РНК в дозе 1 мг/кг; количество мРНК ALAS1 было снижено примерно на 62% при введении ми-РНК в дозе 0,3 мг/кг; и количество ALAS1 было снижено примерно на 34% при введении ми-РНК в дозе 0,1 мг/кг.

Также тестировали продолжительность сайленсинга у мышей (N=15; 3 животных на временную точку. Результаты показаны на фиг. 7, на которой показано, что AD-53558 подавляла мРНК mALAS1 примерно на 80% в течение, по меньшей мере, 9 суток. Подавление, по меньшей мере, примерно на 50% длилось, по меньшей мере, 14 суток.

Пример 5. Эффективность ми-РНК ALAS1 в животной модели AIP

Влияние LNP11-препарата AD-53558 (ми-РНК ALAS1 мыши/крысы, описанная в предыдущем примере) исследовали в мышиной модели AIP. При нокауте PBGD животные нежизнеспособны (-/-, 0% активность). Доступны гетерозиготные нокаутированные по PBGD мыши (+/-, ~ 50% активность), но они не имеют полного биохимического фенотипа и поэтому не могут повторять фенотип заболевания человека. Таким образом, была разработана мышиная модель AIP, которая является сложной гетерозиготой с аллелями T1/T2, содержащей нарушение промотора T1 (+/-) и изменение сайта сплайсинга T2 (-/-). Было показано, что такие мыши имеют остаточную активность PBGD в печени, которая составляет примерно ~30% от уровня дикого типа, и нормальные или слегка повышенные исходные уровни ALA и PBG в плазме. Было обнаружено, что мыши выглядят нормальными в раннем возрасте и становятся немного медлительными и атаксическими с возрастом. При функциональном исследовании было документально показано, что к шестимесячному возрасту у мышей развивается нарушенная координация движений и работа мышц, и дегенерация аксонов. Исследование патологии в мышиной модели показывает дегенерацию аксонов, нарушенную координацию движений и работу мышц у старых мышей. Обнаружено, что уровни ALA и PBG в моче и плазме заметно возрастают при периодическом внутрибрюшинном введении фенобарбитала (См. Lindberg et al., (1996), Nature Genetics, 12:195-219 and Lindberg et al., (1999), Journal of Clinical Investigation, 103:1127-34). Мышей спасали посредством AAV-опосредованной экспрессии PBGD в печени Yasuda et al., (2010), Molecular Medicine, 1:17-22 and Unsu et al., (2011), Molecular Medicine, 2:243-50).

В 1 день мышам вводили 1 мг/кг ми-РНК ALAS1 (n=5) или контрольной LUC AD-1955 (n=3) путем внутривенной инъекции. Вводили три инъекции фенобарбитала (1 инъекция в сутки в 2, 3 и 4 день), чтобы индуцировать печеночную ALAS1 и предшественники порфирина, ALA и PBG. Образцы плазмы и утренней мочи собирали на 5 день и измеряли уровни метаболитов, используя ЖХ-МС. Уровни метаболитов измеряли в плазме, используя ЖХ-МС, а также измеряли в моче. Исходные уровни метаболитов измеряли перед первой обработкой в 1 день. Результаты показаны на фиг. 8-12 и в таблицах 12 и 13.

На фиг. 8 и фиг. 9 показаны уровни ALA в плазме в мкМ. Исходные уровни ALA были низкими (n=4), и обработка фенобарбиталом индуцировала значимое повышение уровней ALA в плазме у контрольных обработанных ми-РНК LUC животных (n=3). Обработка ми-РНК ALAS1 ингибировала индукцию ALA в плазме (n=5), как показано на фиг. 8. ми-РНК ALAS1 в равной мере эффективно блокировала индукцию ALA в плазме у каждого отдельного исследуемого животного (См. фиг. 9). Полученные результаты показывают, что обработка ми-РНК ALAS1 эффективно предотвращала повышения уровней ALA в плазме, ассоциированные с индуцированными фенобарбиталом острыми приступами в данной животной модели AIP.

На фиг. 10 и фиг. 11 показаны уровни PBG в плазме в мкМ. Исходные уровни PBG были низкими (n=4), и обработка фенобарбиталом индуцировала значимое повышение уровней PBG в плазме у контрольных обработанных ми-РНК LUC животных (n=3). Обработка ми-РНК ALAS1 ингибировала индукцию PBG в плазме (n=5), как показано на фиг. 10. ми-РНК ALAS1 в равной мере эффективно блокировала индукцию PBG в плазме у каждого отдельного исследуемого животного (См. фиг. 11). Полученные результаты показывают, что обработка ми-РНК ALAS1 эффективно предотвращала повышения уровней PBG в плазме, ассоциированные с индуцированными фенобарбиталом острыми приступами в данной животной модели AIP.

В таблицах 12 и 13 показаны уровни ALA и PBG в моче на исходном уровне и после обработки фенобарбиталом в случае животных, обработанных ми-РНК LUC (n=2), в контроле (CTR, который относится к животному, обработанному буфером PBS, n=1), и у животных, обработанных ми-РНК ALAS1 (n=5).

Таблица 12 Данные, полученные для образцов мочи от отдельных животных, показывающие предотвращение индуцированного острого приступа
Номер мыши	ALA (микроМ/л)	PBG (микроМ/л)	Креатин (мг/дл)	ALA (микроМ/мг креатинина)	PBG (микроМ/мг креатинина)	ми-РНК	PB
Ha-17-4-6				29,7	7,9	Исходный уровень	-
Ha-19-5-4/2				15,7	5,1	Исходный уровень	-
Ha-20-39-4/3				28,6	6,7	Исходный уровень	-
Ha-20-38-4				21,4	4,7	Исходный уровень	-
Ha-21-33-4	934,92	483,71	0,4205	222,33	115,03	Luc	+
Ha-21-36-9	944,08	563,53	0,5055	186,76	111,48	Luc	+
Ha-21-18-8	32,88	8,69	0,133	24,72	6,53	ALAS1; 1 мг/кг	+
Ha-21-33-7	83,07	23,28	0,426	19,50	5,46	ALAS1; 1 мг/кг	+
Ha-21-34-5	59,15	18,41	0,263	22,49	7,00	ALAS1; 1 мг/кг	+

PB означает фенобарбитал. «+» означает, что вводили фенобарбитал.
Таблица 13 Средние данные для образцов мочи
Среднее значение ALA (микроМ/мг креатинина)	Среднее значение PBG (микроМ/мг креатинина)
23,8	6.1 AIP Исходный уровень
204,55	113.26 Luc-ми-РНК
22,24	6.33 ALAS1-ми-РНК

Обработка фенобарбиталом индуцировала сильное повышение уровня (повышение ~25-30 раз) ALA в моче (~9-кратное по сравнению с исходными уровнями) и PBG (~ 19-кратное по сравнению с исходными уровнями) у мышей, обработанных ми-РНК LUC, в контроле, тогда как такое увеличение не наблюдали у животных, обработанных ми-РНК ALAS1. Таким образом, ми-РНК ALAS1 блокировала индуцированное фенобарбиталом повышение ALA и PBG в моче. Полученные результаты согласуются с измерениями в плазме и показывают, что обработка ми-РНК ALAS1 эффективно предотвращала повышение уровней метаболитов в моче (ALA и PBG), ассоциированное с индуцированными фенобарбиталом острыми приступами в модели AIP на животных.

В следующих экспериментах (фиг. 12) было обнаружено, что обработка фенобарбиталом индуцировала значительное повышение (~25 раз) экспрессии мРНК ALAS1 в печени модельной мыши. Введение ми-РНК ALAS1 полностью блокировало индукцию такой мРНК ALAS1. Полученные результаты являются дополнительным доказательством того, что ми-РНК ALAS1 эффективна в животной модели AIP.

Результаты, представленные в данном примере, вместе взятые, показывают, что ми-РНК ALAS1 является эффективной в лечении острых приступов в животной модели острой печеночной порфирии AIP. Многочисленные измерения результатов подтверждают такое заключение, включая уровни ALA в плазме, уровни PBG в плазме, уровни ALA в моче, уровни PBG в моче и уровни экспрессии мРНК ALAS1 в печени.

Пример 6. Сайленсинг in vivo с использованием GalNAc-конъюгированной ми-РНК ALAS1 мыши

В экспериментах, описанных в данном примере, исследовали эффективность in vivo трех GalNAc-конъюгированных ми-РНК (См. таблицу 7). Такие ми-РНК конструировали и получали такими способами, как способы, описанные в примере 2.

Таблица 7 Последовательности AD-57929
SEQ ID NO: (смысловая)	SEQ ID NO: (антисмысловая)	Положение смысловой последовательности в транскрипте	Название дуплекса	Смысловая последовательность (5'-3')	Антисмысловая последовательность (5'-3')	Положение антисмысловой последовательности в транскрипте NM_020559.2
385	386	775-795	AD-56211	AfaGfuCfuGfuUfUfCfcAfcUfuUfuCfaAfL96	uUfgAfaAfaGfuGfgaaAfcAfgAfcUfusUfsg	773-795
387	388	2168-2188	AD-56173	AfcAfuAfgUfaGfCfCfaGfaAfuUfgUfcUfL96	aGfaCfaAfuUfcUfggcUfaCfuAfuGfusGfsg	2166-2188
389	390	775-795	AD-57929	AfsasGfuCfuGfuUfUfCfcAfcUfuUfuCfaAfL96	usUfsgAfaAfaGfuGfgaaAfcAfgAfcUfususg	773-795

Мышей (n=40; n=4 на экспериментальное условие) делили на группы, которые получали PBS или дозы 3 мг/кг, 10 мг/кг или 30 мг/кг ми-РНК, вводимые подкожно. Уровень мРНК mALAS1/mGAPDH относительно PBS-контроля определяли в клетках печени через 72 часа после введения. Результаты показаны на фиг. 13. Имела место неясная зависимость эффекта от дозы в случае ми-РНК AD-56211 и AD-56173. Напротив, в случае ми-РНК ALAS1 AD-57929 наблюдали зависимый от дозы эффект в отношении ингибирования экспрессии mALAS1. Полученные результаты показывают, что конъюгат GalNAc-конъюгат ALAS1 эффективно ингибировал экспрессию мРНК ALAS1 мРНК in vivo и оказывал зависимый от дозы эффект.

Пример 7. ми-РНК человека

Дополнительные ми-РНК человека конструировали и получали, как описано в примере 2. 45 наилучших ми-РНК отбирали на основе их прогнозируемой эффективности. Последовательности таких 45 ми-РНК представлены в таблице 8.

Таблица 8 Смысловые и антисмысловые последовательности ми-РНК ALAS1 человека
SEQ ID NO: (смысловая)	SEQ ID NO: (антисмысловая)	Положение в транскрипте NM_ 000688.4	Смысловая последовательность (5'-3')	Антисмысловая последовательность (5'-3')
391	392	1635-1657	CAUGCCAAAAAUGGACAUCAU	AUGAUGUCCAUUUUUGGCAUGAC
393	394	2352-2374	UAAAUUUUAAUCUAUAGUAAA	UUUACUAUAGAUUAAAAUUUAAU
395	396	1324-1346	GGCUGUGAGAUUUACUCUGAU	AUCAGAGUAAAUCUCACAGCCUG
397	398	1637-1659	UGCCAAAAAUGGACAUCAUUU	AAAUGAUGUCCAUUUUUGGCAUG
399	400	1363-1385	AUGAUCCAAGGGAUUCGAAAC	GUUUCGAAUCCCUUGGAUCAUGG
401	402	925-947	ACUUUUCAGUAUGAUCGUUUC	GAAACGAUCAUACUGAAAAGUGG
403	404	790-812	CCCAGUGUGGUUAGUGUGAAA	UUUCACACUAACCACACUGGGGC
405	406	1531-1553	UGUGAUGUGGCCCAUGAGUUU	AAACUCAUGGGCCACAUCACACA
407	408	2189-2211	AUUUUGAAGUGAUGAGUGAAA	UUUCACUCAUCACUUCAAAAUGC
409	410	929-951	UUCAGUAUGAUCGUUUCUUUG	CAAAGAAACGAUCAUACUGAAAA
411	412	872-894	GACCAGAAAGAGUGUCUCAUC	GAUGAGACACUCUUUCUGGUCUU
413	414	706-728	UUCUGCAAAGCCAGUCUUGAG	CUCAAGACUGGCUUUGCAGAAGA
415	416	1362-1384	CAUGAUCCAAGGGAUUCGAAA	UUUCGAAUCCCUUGGAUCAUGGA
417	418	1634-1656	UCAUGCCAAAAAUGGACAUCA	UGAUGUCCAUUUUUGGCAUGACU
419	420	1325-1347	GCUGUGAGAUUUACUCUGAUU	AAUCAGAGUAAAUCUCACAGCCU
421	422	2208-2230	AAGAGAGAAGUCCUAUUUCUC	GAGAAAUAGGACUUCUCUCUUUC
423	424	2344-2366	AGUUAUAUUAAAUUUUAAUCU	AGAUUAAAAUUUAAUAUAACUUA
425	426	924-946	CACUUUUCAGUAUGAUCGUUU	AAACGAUCAUACUGAAAAGUGGA
427	428	873-895	ACCAGAAAGAGUGUCUCAUCU	AGAUGAGACACUCUUUCUGGUCU
429	430	759-781	GAGGAAAGAGGUUGCUGAAAC	GUUUCAGCAACCUCUUUCCUCAC
431	432	871-893	AGACCAGAAAGAGUGUCUCAU	AUGAGACACUCUUUCUGGUCUUU
433	434	1183-1205	AAUAUUUCUGGAACUAGUAAA	UUUACUAGUUCCAGAAAUAUUUC
435	436	2229-2251	AGGCUUGAGCAAGUUGGUAUC	GAUACCAACUUGCUCAAGCCUGA

437	438	671-693	UGGCAGCACAGAUGAAUCAGA	UCUGAUUCAUCUGUGCUGCCAGG
439	440	2187-2209	GCAUUUUGAAGUGAUGAGUGA	UCACUCAUCACUUCAAAAUGCAG
441	442	913-935	AAAUCUGUUUCCACUUUUCAG	CUGAAAAGUGGAAACAGAUUUUG
443	444	1977-1999	ACUAAUGAGCAGACAUAACAU	AUGUUAUGUCUGCUCAUUAGUUC
445	446	1174-1196	GGUACUAGAAAUAUUUCUGGA	UCCAGAAAUAUUUCUAGUACCAC
447	448	1810-1832	AUCCUGAAGAGCGCUGAGGGA	UCCCUCAGCGCUCUUCAGGAUCC
449	450	892-914	CUUCUUCAAGAUAACUUGCCA	UGGCAAGUUAUCUUGAAGAAGAU
451	452	877-899	GAAAGAGUGUCUCAUCUUCUU	AAGAAGAUGAGACACUCUUUCUG
453	454	935-957	AUGAUCGUUUCUUUGAGAAAA	UUUUCUCAAAGAAACGAUCAUAC
455	456	1975-1997	GAACUAAUGAGCAGACAUAAC	GUUAUGUCUGCUCAUUAGUUCAU
457	458	1478-1500	CAUUUGAAACUGUCCAUUCAA	UUGAAUGGACAGUUUCAAAUGCC
459	460	2366-2388	UAGUAAAAACAUAGUCCUGGA	UCCAGGACUAUGUUUUUACUAUA
461	462	853-875	GACAUCAUGCAAAAGCAAAGA	UCUUUGCUUUUGCAUGAUGUCCU
463	464	1966-1988	GUCUGUGAUGAACUAAUGAGC	GCUCAUUAGUUCAUCACAGACUU
465	466	928-950	UUUCAGUAUGAUCGUUUCUUU	AAAGAAACGAUCAUACUGAAAAG
467	468	1186-1208	AUUUCUGGAACUAGUAAAUUC	GAAUUUACUAGUUCCAGAAAUAU
469	470	1189-1211	UCUGGAACUAGUAAAUUCCAU	AUGGAAUUUACUAGUUCCAGAAA
471	472	973-995	AAUGACCACACCUAUCGAGUU	AACUCGAUAGGUGUGGUCAUUCU
473	474	983-1005	CCUAUCGAGUUUUUAAAACUG	CAGUUUUAAAAACUCGAUAGGUG
475	476	1185-1207	UAUUUCUGGAACUAGUAAAUU	AAUUUACUAGUUCCAGAAAUAUU
477	478	2353-2375	AAAUUUUAAUCUAUAGUAAAA	UUUUACUAUAGAUUAAAAUUUAA
479	480	875-897	CAGAAAGAGUGUCUCAUCUUC	GAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU
481	482	360-378	GCCCAUUCUUAUCCCGAGU	ACUCGGGAUAAGAAUGGGC
483	484	428-446	CAAAACUGCCCCAAGAUGA	UCAUCUUGGGGCAGUUUUG
485	486	873-891	CAGAAAGAGUGUCUCAUCU	AGAUGAGACACUCUUUCUG
487	488	874-892	AGAAAGAGUGUCUCAUCUU	AAGAUGAGACACUCUUUCU
489	490	877-895	AAGAGUGUCUCAUCUUCUU	AAGAAGAUGAGACACUCUU
491	492	1295-1313	CUCUUCACCCUGGCUAAGA	UCUUAGCCAGGGUGAAGAG
493	494	1296-1314	UCUUCACCCUGGCUAAGAU	AUCUUAGCCAGGGUGAAGA
495	496	1299-1317	UCACCCUGGCUAAGAUGAU	AUCAUCUUAGCCAGGGUGA
497	498	1347-1365	GGAACCAUGCCUCCAUGAU	AUCAUGGAGGCAUGGUUCC
499	500	1355-1373	GCCUCCAUGAUCCAAGGGA	UCCCUUGGAUCAUGGAGGC
501	502	1356-1374	CCUCCAUGAUCCAAGGGAU	AUCCCUUGGAUCAUGGAGG
503	504	1357-1375	CUCCAUGAUCCAAGGGAUU	AAUCCCUUGGAUCAUGGAG
505	506	1631-1649	GUCAUGCCAAAAAUGGACA	UGUCCAUUUUUGGCAUGAC
507	508	1634-1652	AUGCCAAAAAUGGACAUCA	UGAUGUCCAUUUUUGGCAU
509	510	1635-1653	UGCCAAAAAUGGACAUCAU	AUGAUGUCCAUUUUUGGCA
511	512	1791-1809	CCCUGGAGUCUGUGCGGAU	AUCCGCACAGACUCCAGGG
513	514	1794-1812	UGGAGUCUGUGCGGAUCCU	AGGAUCCGCACAGACUCCA
515	516	1921-1939	CAUCAUCCCUGUGCGGGUU	AACCCGCACAGGGAUGAUG
517	518	359-377	UGCCCAUUCUUAUCCCGAA	UUCGGGAUAAGAAUGGGCA
519	520	362-380	CCAUUCUUAUCCCGAGUCA	UGACUCGGGAUAAGAAUGG
521	522	363-381	CAUUCUUAUCCCGAGUCCA	UGGACUCGGGAUAAGAAUG
523	524	434-452	UGCCCCAAGAUGAUGGAAU	AUUCCAUCAUCUUGGGGCA
525	526	872-890	CCAGAAAGAGUGUCUCAUA	UAUGAGACACUCUUUCUGG
527	528	875-893	GAAAGAGUGUCUCAUCUUA	UAAGAUGAGACACUCUUUC
529	530	1112-1130	CACCCACGGGUGUGUGGGA	UCCCACACACCCGUGGGUG
531	532	1113-1131	ACCCACGGGUGUGUGGGGA	UCCCCACACACCCGUGGGU
533	534	1297-1315	CUUCACCCUGGCUAAGAUA	UAUCUUAGCCAGGGUGAAG
535	536	1300-1318	CACCCUGGCUAAGAUGAUA	UAUCAUCUUAGCCAGGGUG

537	538	1301-1319	ACCCUGGCUAAGAUGAUGA	UCAUCAUCUUAGCCAGGGU
539	540	1348-1366	GAACCAUGCCUCCAUGAUA	UAUCAUGGAGGCAUGGUUC
541	542	1481-1499	GAAACUGUCCAUUCAAUGA	UCAUUGAAUGGACAGUUUC
543	544	1786-1804	UGGAGCCCUGGAGUCUGUA	UACAGACUCCAGGGCUCCA
545	546	1795-1813	GGAGUCUGUGCGGAUCCUA	UAGGAUCCGCACAGACUCC
547	548	1919-1937	CACAUCAUCCCUGUGCGGA	UCCGCACAGGGAUGAUGUG
549	550	1922-1940	AUCAUCCCUGUGCGGGUUA	UAACCCGCACAGGGAUGAU
551	552	1923-1941	UCAUCCCUGUGCGGGUUGA	UCAACCCGCACAGGGAUGA

Пример 8. ми-РНК человека

Создавали дополнительные 19-мерные ми-РНК человека. Последовательности таких ми-РНК представлены в таблице 9. Такие ми-РНК могут быть протестированы в отношении эффективности с использованием способов, описанных в настоящей публикации, и/или способов, известных в данной области.

Таблица 9 Смысловые и антисмысловые последовательности ми-РНК ALAS1 человека
SEQ ID NO: (смысловая)	SEQ ID NO: (антисмысловая)	Положение в транскрипте NM_ 000688.4	Смысловая последовательность (5'-3')	Антисмысловая последовательность (5'-3')
553	554	4-22	UAUAUUAAGGCGCCGGCGA	UCGCCGGCGCCUUAAUAUA
555	556	5-23	AUAUUAAGGCGCCGGCGAU	AUCGCCGGCGCCUUAAUAU
557	558	6-24	UAUUAAGGCGCCGGCGAUC	GAUCGCCGGCGCCUUAAUA
559	560	7-25	AUUAAGGCGCCGGCGAUCG	CGAUCGCCGGCGCCUUAAU
561	562	8-26	UUAAGGCGCCGGCGAUCGC	GCGAUCGCCGGCGCCUUAA
563	564	9-27	UAAGGCGCCGGCGAUCGCG	CGCGAUCGCCGGCGCCUUA
565	566	10-28	AAGGCGCCGGCGAUCGCGG	CCGCGAUCGCCGGCGCCUU
567	568	11-29	AGGCGCCGGCGAUCGCGGC	GCCGCGAUCGCCGGCGCCU
569	570	12-30	GGCGCCGGCGAUCGCGGCC	GGCCGCGAUCGCCGGCGCC
571	572	13-31	GCGCCGGCGAUCGCGGCCU	AGGCCGCGAUCGCCGGCGC
573	574	14-32	CGCCGGCGAUCGCGGCCUG	CAGGCCGCGAUCGCCGGCG
575	576	81-99	CUUGAGUGCCCGCCUCCUU	AAGGAGGCGGGCACUCAAG
577	578	82-100	UUGAGUGCCCGCCUCCUUC	GAAGGAGGCGGGCACUCAA
579	580	83-101	UGAGUGCCCGCCUCCUUCG	CGAAGGAGGCGGGCACUCA
581	582	84-102	GAGUGCCCGCCUCCUUCGC	GCGAAGGAGGCGGGCACUC
583	584	85-103	AGUGCCCGCCUCCUUCGCC	GGCGAAGGAGGCGGGCACU
585	586	86-104	GUGCCCGCCUCCUUCGCCG	CGGCGAAGGAGGCGGGCAC
587	588	87-105	UGCCCGCCUCCUUCGCCGC	GCGGCGAAGGAGGCGGGCA
589	590	88-106	GCCCGCCUCCUUCGCCGCC	GGCGGCGAAGGAGGCGGGC
591	592	89-107	CCCGCCUCCUUCGCCGCCG	CGGCGGCGAAGGAGGCGGG
593	594	90-108	CCGCCUCCUUCGCCGCCGC	GCGGCGGCGAAGGAGGCGG
595	596	91-109	CGCCUCCUUCGCCGCCGCC	GGCGGCGGCGAAGGAGGCG
597	598	92-110	GCCUCCUUCGCCGCCGCCU	AGGCGGCGGCGAAGGAGGC
599	600	93-111	CCUCCUUCGCCGCCGCCUC	GAGGCGGCGGCGAAGGAGG
601	602	356-374	CGCUGCCCAUUCUUAUCCC	GGGAUAAGAAUGGGCAGCG
603	604	357-375	GCUGCCCAUUCUUAUCCCG	CGGGAUAAGAAUGGGCAGC
605	606	359-377	UGCCCAUUCUUAUCCCGAG	CUCGGGAUAAGAAUGGGCA
607	608	361-379	CCCAUUCUUAUCCCGAGUC	GACUCGGGAUAAGAAUGGG

609	610	362-380	CCAUUCUUAUCCCGAGUCC	GGACUCGGGAUAAGAAUGG
611	612	363-381	CAUUCUUAUCCCGAGUCCC	GGGACUCGGGAUAAGAAUG
613	614	364-382	AUUCUUAUCCCGAGUCCCC	GGGGACUCGGGAUAAGAAU
615	616	365-383	UUCUUAUCCCGAGUCCCCC	GGGGGACUCGGGAUAAGAA
617	618	366-384	UCUUAUCCCGAGUCCCCCA	UGGGGGACUCGGGAUAAGA
619	620	367-385	CUUAUCCCGAGUCCCCCAG	CUGGGGGACUCGGGAUAAG
621	622	368-386	UUAUCCCGAGUCCCCCAGG	CCUGGGGGACUCGGGAUAA
623	624	369-387	UAUCCCGAGUCCCCCAGGC	GCCUGGGGGACUCGGGAUA
625	626	370-388	AUCCCGAGUCCCCCAGGCC	GGCCUGGGGGACUCGGGAU
627	628	371-389	UCCCGAGUCCCCCAGGCCU	AGGCCUGGGGGACUCGGGA
629	630	372-390	CCCGAGUCCCCCAGGCCUU	AAGGCCUGGGGGACUCGGG
631	632	373-391	CCGAGUCCCCCAGGCCUUU	AAAGGCCUGGGGGACUCGG
633	634	374-392	CGAGUCCCCCAGGCCUUUC	GAAAGGCCUGGGGGACUCG
635	636	375-393	GAGUCCCCCAGGCCUUUCU	AGAAAGGCCUGGGGGACUC
637	638	376-394	AGUCCCCCAGGCCUUUCUG	CAGAAAGGCCUGGGGGACU
639	640	377-395	GUCCCCCAGGCCUUUCUGC	GCAGAAAGGCCUGGGGGAC
641	642	378-396	UCCCCCAGGCCUUUCUGCA	UGCAGAAAGGCCUGGGGGA
643	644	379-397	CCCCCAGGCCUUUCUGCAG	CUGCAGAAAGGCCUGGGGG
645	646	380-398	CCCCAGGCCUUUCUGCAGA	UCUGCAGAAAGGCCUGGGG
647	648	381-399	CCCAGGCCUUUCUGCAGAA	UUCUGCAGAAAGGCCUGGG
649	650	382-400	CCAGGCCUUUCUGCAGAAA	UUUCUGCAGAAAGGCCUGG
651	652	383-401	CAGGCCUUUCUGCAGAAAG	CUUUCUGCAGAAAGGCCUG
653	654	384-402	AGGCCUUUCUGCAGAAAGC	GCUUUCUGCAGAAAGGCCU
655	656	385-403	GGCCUUUCUGCAGAAAGCA	UGCUUUCUGCAGAAAGGCC
657	658	386-404	GCCUUUCUGCAGAAAGCAG	CUGCUUUCUGCAGAAAGGC
659	660	387-405	CCUUUCUGCAGAAAGCAGG	CCUGCUUUCUGCAGAAAGG
661	662	388-406	CUUUCUGCAGAAAGCAGGC	GCCUGCUUUCUGCAGAAAG
663	664	389-407	UUUCUGCAGAAAGCAGGCA	UGCCUGCUUUCUGCAGAAA
665	666	390-408	UUCUGCAGAAAGCAGGCAA	UUGCCUGCUUUCUGCAGAA
667	668	391-409	UCUGCAGAAAGCAGGCAAA	UUUGCCUGCUUUCUGCAGA
669	670	392-410	CUGCAGAAAGCAGGCAAAU	AUUUGCCUGCUUUCUGCAG
671	672	393-411	UGCAGAAAGCAGGCAAAUC	GAUUUGCCUGCUUUCUGCA
673	674	394-412	GCAGAAAGCAGGCAAAUCU	AGAUUUGCCUGCUUUCUGC
675	676	395-413	CAGAAAGCAGGCAAAUCUC	GAGAUUUGCCUGCUUUCUG
677	678	396-414	AGAAAGCAGGCAAAUCUCU	AGAGAUUUGCCUGCUUUCU
679	680	397-415	GAAAGCAGGCAAAUCUCUG	CAGAGAUUUGCCUGCUUUC
681	682	398-416	AAAGCAGGCAAAUCUCUGU	ACAGAGAUUUGCCUGCUUU
683	684	399-417	AAGCAGGCAAAUCUCUGUU	AACAGAGAUUUGCCUGCUU
685	686	400-418	AGCAGGCAAAUCUCUGUUG	CAACAGAGAUUUGCCUGCU
687	688	401-419	GCAGGCAAAUCUCUGUUGU	ACAACAGAGAUUUGCCUGC
689	690	402-420	CAGGCAAAUCUCUGUUGUU	AACAACAGAGAUUUGCCUG
691	692	403-421	AGGCAAAUCUCUGUUGUUC	GAACAACAGAGAUUUGCCU
693	694	405-423	GCAAAUCUCUGUUGUUCUA	UAGAACAACAGAGAUUUGC
695	696	406-424	CAAAUCUCUGUUGUUCUAU	AUAGAACAACAGAGAUUUG
697	698	407-425	AAAUCUCUGUUGUUCUAUG	CAUAGAACAACAGAGAUUU
699	700	408-426	AAUCUCUGUUGUUCUAUGC	GCAUAGAACAACAGAGAUU
701	702	409-427	AUCUCUGUUGUUCUAUGCC	GGCAUAGAACAACAGAGAU
703	704	410-428	UCUCUGUUGUUCUAUGCCC	GGGCAUAGAACAACAGAGA
705	706	411-429	CUCUGUUGUUCUAUGCCCA	UGGGCAUAGAACAACAGAG
707	708	412-430	UCUGUUGUUCUAUGCCCAA	UUGGGCAUAGAACAACAGA

709	710	413-431	CUGUUGUUCUAUGCCCAAA	UUUGGGCAUAGAACAACAG
711	712	414-432	UGUUGUUCUAUGCCCAAAA	UUUUGGGCAUAGAACAACA
713	714	415-433	GUUGUUCUAUGCCCAAAAC	GUUUUGGGCAUAGAACAAC
715	716	416-434	UUGUUCUAUGCCCAAAACU	AGUUUUGGGCAUAGAACAA
717	718	417-435	UGUUCUAUGCCCAAAACUG	CAGUUUUGGGCAUAGAACA
719	720	418-436	GUUCUAUGCCCAAAACUGC	GCAGUUUUGGGCAUAGAAC
721	722	419-437	UUCUAUGCCCAAAACUGCC	GGCAGUUUUGGGCAUAGAA
723	724	420-438	UCUAUGCCCAAAACUGCCC	GGGCAGUUUUGGGCAUAGA
725	726	421-439	CUAUGCCCAAAACUGCCCC	GGGGCAGUUUUGGGCAUAG
727	728	422-440	UAUGCCCAAAACUGCCCCA	UGGGGCAGUUUUGGGCAUA
729	730	423-441	AUGCCCAAAACUGCCCCAA	UUGGGGCAGUUUUGGGCAU
731	732	424-442	UGCCCAAAACUGCCCCAAG	CUUGGGGCAGUUUUGGGCA
733	734	425-443	GCCCAAAACUGCCCCAAGA	UCUUGGGGCAGUUUUGGGC
735	736	426-444	CCCAAAACUGCCCCAAGAU	AUCUUGGGGCAGUUUUGGG
737	738	427-445	CCAAAACUGCCCCAAGAUG	CAUCUUGGGGCAGUUUUGG
739	740	429-447	AAAACUGCCCCAAGAUGAU	AUCAUCUUGGGGCAGUUUU
741	742	430-448	AAACUGCCCCAAGAUGAUG	CAUCAUCUUGGGGCAGUUU
743	744	431-449	AACUGCCCCAAGAUGAUGG	CCAUCAUCUUGGGGCAGUU
745	746	432-450	ACUGCCCCAAGAUGAUGGA	UCCAUCAUCUUGGGGCAGU
747	748	433-451	CUGCCCCAAGAUGAUGGAA	UUCCAUCAUCUUGGGGCAG
749	750	434-452	UGCCCCAAGAUGAUGGAAG	CUUCCAUCAUCUUGGGGCA
751	752	435-453	GCCCCAAGAUGAUGGAAGU	ACUUCCAUCAUCUUGGGGC
753	754	437-455	CCCAAGAUGAUGGAAGUUG	CAACUUCCAUCAUCUUGGG
755	756	438-456	CCAAGAUGAUGGAAGUUGG	CCAACUUCCAUCAUCUUGG
757	758	439-457	CAAGAUGAUGGAAGUUGGG	CCCAACUUCCAUCAUCUUG
759	760	440-458	AAGAUGAUGGAAGUUGGGG	CCCCAACUUCCAUCAUCUU
761	762	441-459	AGAUGAUGGAAGUUGGGGC	GCCCCAACUUCCAUCAUCU
763	764	442-460	GAUGAUGGAAGUUGGGGCC	GGCCCCAACUUCCAUCAUC
765	766	443-461	AUGAUGGAAGUUGGGGCCA	UGGCCCCAACUUCCAUCAU
767	768	444-462	UGAUGGAAGUUGGGGCCAA	UUGGCCCCAACUUCCAUCA
769	770	445-463	GAUGGAAGUUGGGGCCAAG	CUUGGCCCCAACUUCCAUC
771	772	446-464	AUGGAAGUUGGGGCCAAGC	GCUUGGCCCCAACUUCCAU
773	774	447-465	UGGAAGUUGGGGCCAAGCC	GGCUUGGCCCCAACUUCCA
775	776	448-466	GGAAGUUGGGGCCAAGCCA	UGGCUUGGCCCCAACUUCC
777	778	449-467	GAAGUUGGGGCCAAGCCAG	CUGGCUUGGCCCCAACUUC
779	780	450-468	AAGUUGGGGCCAAGCCAGC	GCUGGCUUGGCCCCAACUU
781	782	451-469	AGUUGGGGCCAAGCCAGCC	GGCUGGCUUGGCCCCAACU
783	784	452-470	GUUGGGGCCAAGCCAGCCC	GGGCUGGCUUGGCCCCAAC
785	786	453-471	UUGGGGCCAAGCCAGCCCC	GGGGCUGGCUUGGCCCCAA
787	788	454-472	UGGGGCCAAGCCAGCCCCU	AGGGGCUGGCUUGGCCCCA
789	790	455-473	GGGGCCAAGCCAGCCCCUC	GAGGGGCUGGCUUGGCCCC
791	792	456-474	GGGCCAAGCCAGCCCCUCG	CGAGGGGCUGGCUUGGCCC
793	794	457-475	GGCCAAGCCAGCCCCUCGG	CCGAGGGGCUGGCUUGGCC
795	796	458-476	GCCAAGCCAGCCCCUCGGG	CCCGAGGGGCUGGCUUGGC
797	798	459-477	CCAAGCCAGCCCCUCGGGC	GCCCGAGGGGCUGGCUUGG
799	800	460-478	CAAGCCAGCCCCUCGGGCA	UGCCCGAGGGGCUGGCUUG
801	802	461-479	AAGCCAGCCCCUCGGGCAU	AUGCCCGAGGGGCUGGCUU
803	804	462-480	AGCCAGCCCCUCGGGCAUU	AAUGCCCGAGGGGCUGGCU
805	806	463-481	GCCAGCCCCUCGGGCAUUG	CAAUGCCCGAGGGGCUGGC
807	808	464-482	CCAGCCCCUCGGGCAUUGU	ACAAUGCCCGAGGGGCUGG

809	810	465-483	CAGCCCCUCGGGCAUUGUC	GACAAUGCCCGAGGGGCUG
811	812	466-484	AGCCCCUCGGGCAUUGUCC	GGACAAUGCCCGAGGGGCU
813	814	467-485	GCCCCUCGGGCAUUGUCCA	UGGACAAUGCCCGAGGGGC
815	816	468-486	CCCCUCGGGCAUUGUCCAC	GUGGACAAUGCCCGAGGGG
817	818	469-487	CCCUCGGGCAUUGUCCACU	AGUGGACAAUGCCCGAGGG
819	820	470-488	CCUCGGGCAUUGUCCACUG	CAGUGGACAAUGCCCGAGG
821	822	471-489	CUCGGGCAUUGUCCACUGC	GCAGUGGACAAUGCCCGAG
823	824	472-490	UCGGGCAUUGUCCACUGCA	UGCAGUGGACAAUGCCCGA
825	826	473-491	CGGGCAUUGUCCACUGCAG	CUGCAGUGGACAAUGCCCG
827	828	474-492	GGGCAUUGUCCACUGCAGC	GCUGCAGUGGACAAUGCCC
829	830	475-493	GGCAUUGUCCACUGCAGCA	UGCUGCAGUGGACAAUGCC
831	832	476-494	GCAUUGUCCACUGCAGCAG	CUGCUGCAGUGGACAAUGC
833	834	477-495	CAUUGUCCACUGCAGCAGU	ACUGCUGCAGUGGACAAUG
835	836	478-496	AUUGUCCACUGCAGCAGUA	UACUGCUGCAGUGGACAAU
837	838	479-497	UUGUCCACUGCAGCAGUAC	GUACUGCUGCAGUGGACAA
839	840	480-498	UGUCCACUGCAGCAGUACA	UGUACUGCUGCAGUGGACA
841	842	481-499	GUCCACUGCAGCAGUACAC	GUGUACUGCUGCAGUGGAC
843	844	482-500	UCCACUGCAGCAGUACACU	AGUGUACUGCUGCAGUGGA
845	846	483-501	CCACUGCAGCAGUACACUA	UAGUGUACUGCUGCAGUGG
847	848	484-502	CACUGCAGCAGUACACUAC	GUAGUGUACUGCUGCAGUG
849	850	485-503	ACUGCAGCAGUACACUACC	GGUAGUGUACUGCUGCAGU
851	852	486-504	CUGCAGCAGUACACUACCA	UGGUAGUGUACUGCUGCAG
853	854	487-505	UGCAGCAGUACACUACCAA	UUGGUAGUGUACUGCUGCA
855	856	488-506	GCAGCAGUACACUACCAAC	GUUGGUAGUGUACUGCUGC
857	858	490-508	AGCAGUACACUACCAACAG	CUGUUGGUAGUGUACUGCU
859	860	491-509	GCAGUACACUACCAACAGA	UCUGUUGGUAGUGUACUGC
861	862	492-510	CAGUACACUACCAACAGAU	AUCUGUUGGUAGUGUACUG
863	864	493-511	AGUACACUACCAACAGAUC	GAUCUGUUGGUAGUGUACU
865	866	494-512	GUACACUACCAACAGAUCA	UGAUCUGUUGGUAGUGUAC
867	868	495-513	UACACUACCAACAGAUCAA	UUGAUCUGUUGGUAGUGUA
869	870	496-514	ACACUACCAACAGAUCAAA	UUUGAUCUGUUGGUAGUGU
871	872	497-515	CACUACCAACAGAUCAAAG	CUUUGAUCUGUUGGUAGUG
873	874	498-516	ACUACCAACAGAUCAAAGA	UCUUUGAUCUGUUGGUAGU
875	876	499-517	CUACCAACAGAUCAAAGAA	UUCUUUGAUCUGUUGGUAG
877	878	500-518	UACCAACAGAUCAAAGAAA	UUUCUUUGAUCUGUUGGUA
879	880	501-519	ACCAACAGAUCAAAGAAAC	GUUUCUUUGAUCUGUUGGU
881	882	502-520	CCAACAGAUCAAAGAAACC	GGUUUCUUUGAUCUGUUGG
883	884	523-541	UCCGGCCAGUGAGAAAGAC	GUCUUUCUCACUGGCCGGA
885	886	524-542	CCGGCCAGUGAGAAAGACA	UGUCUUUCUCACUGGCCGG
887	888	525-543	CGGCCAGUGAGAAAGACAA	UUGUCUUUCUCACUGGCCG
889	890	526-544	GGCCAGUGAGAAAGACAAA	UUUGUCUUUCUCACUGGCC
891	892	527-545	GCCAGUGAGAAAGACAAAA	UUUUGUCUUUCUCACUGGC
893	894	528-546	CCAGUGAGAAAGACAAAAC	GUUUUGUCUUUCUCACUGG
895	896	529-547	CAGUGAGAAAGACAAAACU	AGUUUUGUCUUUCUCACUG
897	898	530-548	AGUGAGAAAGACAAAACUG	CAGUUUUGUCUUUCUCACU
899	900	531-549	GUGAGAAAGACAAAACUGC	GCAGUUUUGUCUUUCUCAC
901	902	570-588	CUCCUGAUGGAUCCCAGCA	UGCUGGGAUCCAUCAGGAG
903	904	571-589	UCCUGAUGGAUCCCAGCAG	CUGCUGGGAUCCAUCAGGA
905	906	572-590	CCUGAUGGAUCCCAGCAGA	UCUGCUGGGAUCCAUCAGG
907	908	573-591	CUGAUGGAUCCCAGCAGAG	CUCUGCUGGGAUCCAUCAG

909	910	574-592	UGAUGGAUCCCAGCAGAGU	ACUCUGCUGGGAUCCAUCA
911	912	575-593	GAUGGAUCCCAGCAGAGUC	GACUCUGCUGGGAUCCAUC
913	914	576-594	AUGGAUCCCAGCAGAGUCC	GGACUCUGCUGGGAUCCAU
915	916	577-595	UGGAUCCCAGCAGAGUCCA	UGGACUCUGCUGGGAUCCA
917	918	578-596	GGAUCCCAGCAGAGUCCAG	CUGGACUCUGCUGGGAUCC
919	920	579-597	GAUCCCAGCAGAGUCCAGA	UCUGGACUCUGCUGGGAUC
921	922	580-598	AUCCCAGCAGAGUCCAGAU	AUCUGGACUCUGCUGGGAU
923	924	581-599	UCCCAGCAGAGUCCAGAUG	CAUCUGGACUCUGCUGGGA
925	926	582-600	CCCAGCAGAGUCCAGAUGG	CCAUCUGGACUCUGCUGGG
927	928	583-601	CCAGCAGAGUCCAGAUGGC	GCCAUCUGGACUCUGCUGG
929	930	584-602	CAGCAGAGUCCAGAUGGCA	UGCCAUCUGGACUCUGCUG
931	932	585-603	AGCAGAGUCCAGAUGGCAC	GUGCCAUCUGGACUCUGCU
933	934	586-604	GCAGAGUCCAGAUGGCACA	UGUGCCAUCUGGACUCUGC
935	936	587-605	CAGAGUCCAGAUGGCACAC	GUGUGCCAUCUGGACUCUG
937	938	588-606	AGAGUCCAGAUGGCACACA	UGUGUGCCAUCUGGACUCU
939	940	589-607	GAGUCCAGAUGGCACACAG	CUGUGUGCCAUCUGGACUC
941	942	590-608	AGUCCAGAUGGCACACAGC	GCUGUGUGCCAUCUGGACU
943	944	591-609	GUCCAGAUGGCACACAGCU	AGCUGUGUGCCAUCUGGAC
945	946	592-610	UCCAGAUGGCACACAGCUU	AAGCUGUGUGCCAUCUGGA
947	948	593-611	CCAGAUGGCACACAGCUUC	GAAGCUGUGUGCCAUCUGG
949	950	594-612	CAGAUGGCACACAGCUUCC	GGAAGCUGUGUGCCAUCUG
951	952	595-613	AGAUGGCACACAGCUUCCG	CGGAAGCUGUGUGCCAUCU
953	954	596-614	GAUGGCACACAGCUUCCGU	ACGGAAGCUGUGUGCCAUC
955	956	597-615	AUGGCACACAGCUUCCGUC	GACGGAAGCUGUGUGCCAU
957	958	598-616	UGGCACACAGCUUCCGUCU	AGACGGAAGCUGUGUGCCA
959	960	599-617	GGCACACAGCUUCCGUCUG	CAGACGGAAGCUGUGUGCC
961	962	600-618	GCACACAGCUUCCGUCUGG	CCAGACGGAAGCUGUGUGC
963	964	601-619	CACACAGCUUCCGUCUGGA	UCCAGACGGAAGCUGUGUG
965	966	602-620	ACACAGCUUCCGUCUGGAC	GUCCAGACGGAAGCUGUGU
967	968	603-621	CACAGCUUCCGUCUGGACA	UGUCCAGACGGAAGCUGUG
969	970	604-622	ACAGCUUCCGUCUGGACAC	GUGUCCAGACGGAAGCUGU
971	972	605-623	CAGCUUCCGUCUGGACACC	GGUGUCCAGACGGAAGCUG
973	974	606-624	AGCUUCCGUCUGGACACCC	GGGUGUCCAGACGGAAGCU
975	976	607-625	GCUUCCGUCUGGACACCCC	GGGGUGUCCAGACGGAAGC
977	978	608-626	CUUCCGUCUGGACACCCCU	AGGGGUGUCCAGACGGAAG
979	980	609-627	UUCCGUCUGGACACCCCUU	AAGGGGUGUCCAGACGGAA
981	982	610-628	UCCGUCUGGACACCCCUUG	CAAGGGGUGUCCAGACGGA
983	984	611-629	CCGUCUGGACACCCCUUGC	GCAAGGGGUGUCCAGACGG
985	986	612-630	CGUCUGGACACCCCUUGCC	GGCAAGGGGUGUCCAGACG
987	988	613-631	GUCUGGACACCCCUUGCCU	AGGCAAGGGGUGUCCAGAC
989	990	614-632	UCUGGACACCCCUUGCCUG	CAGGCAAGGGGUGUCCAGA
991	992	615-633	CUGGACACCCCUUGCCUGC	GCAGGCAAGGGGUGUCCAG
993	994	616-634	UGGACACCCCUUGCCUGCC	GGCAGGCAAGGGGUGUCCA
995	996	617-635	GGACACCCCUUGCCUGCCA	UGGCAGGCAAGGGGUGUCC
997	998	618-636	GACACCCCUUGCCUGCCAC	GUGGCAGGCAAGGGGUGUC
999	1000	619-637	ACACCCCUUGCCUGCCACA	UGUGGCAGGCAAGGGGUGU
1001	1002	620-638	CACCCCUUGCCUGCCACAA	UUGUGGCAGGCAAGGGGUG
1003	1004	621-639	ACCCCUUGCCUGCCACAAG	CUUGUGGCAGGCAAGGGGU
1005	1006	622-640	CCCCUUGCCUGCCACAAGC	GCUUGUGGCAGGCAAGGGG
1007	1008	623-641	CCCUUGCCUGCCACAAGCC	GGCUUGUGGCAGGCAAGGG

1009	1010	624-642	CCUUGCCUGCCACAAGCCA	UGGCUUGUGGCAGGCAAGG
1011	1012	625-643	CUUGCCUGCCACAAGCCAG	CUGGCUUGUGGCAGGCAAG
1013	1014	626-644	UUGCCUGCCACAAGCCAGG	CCUGGCUUGUGGCAGGCAA
1015	1016	627-645	UGCCUGCCACAAGCCAGGG	CCCUGGCUUGUGGCAGGCA
1017	1018	628-646	GCCUGCCACAAGCCAGGGC	GCCCUGGCUUGUGGCAGGC
1019	1020	629-647	CCUGCCACAAGCCAGGGCA	UGCCCUGGCUUGUGGCAGG
1021	1022	630-648	CUGCCACAAGCCAGGGCAC	GUGCCCUGGCUUGUGGCAG
1023	1024	631-649	UGCCACAAGCCAGGGCACU	AGUGCCCUGGCUUGUGGCA
1025	1026	632-650	GCCACAAGCCAGGGCACUG	CAGUGCCCUGGCUUGUGGC
1027	1028	633-651	CCACAAGCCAGGGCACUGC	GCAGUGCCCUGGCUUGUGG
1029	1030	634-652	CACAAGCCAGGGCACUGCA	UGCAGUGCCCUGGCUUGUG
1031	1032	635-653	ACAAGCCAGGGCACUGCAA	UUGCAGUGCCCUGGCUUGU
1033	1034	636-654	CAAGCCAGGGCACUGCAAG	CUUGCAGUGCCCUGGCUUG
1035	1036	637-655	AAGCCAGGGCACUGCAAGC	GCUUGCAGUGCCCUGGCUU
1037	1038	638-656	AGCCAGGGCACUGCAAGCA	UGCUUGCAGUGCCCUGGCU
1039	1040	639-657	GCCAGGGCACUGCAAGCAA	UUGCUUGCAGUGCCCUGGC
1041	1042	640-658	CCAGGGCACUGCAAGCAAA	UUUGCUUGCAGUGCCCUGG
1043	1044	641-659	CAGGGCACUGCAAGCAAAU	AUUUGCUUGCAGUGCCCUG
1045	1046	642-660	AGGGCACUGCAAGCAAAUG	CAUUUGCUUGCAGUGCCCU
1047	1048	643-661	GGGCACUGCAAGCAAAUGC	GCAUUUGCUUGCAGUGCCC
1049	1050	644-662	GGCACUGCAAGCAAAUGCC	GGCAUUUGCUUGCAGUGCC
1051	1052	645-663	GCACUGCAAGCAAAUGCCC	GGGCAUUUGCUUGCAGUGC
1053	1054	647-665	ACUGCAAGCAAAUGCCCUU	AAGGGCAUUUGCUUGCAGU
1055	1056	648-666	CUGCAAGCAAAUGCCCUUU	AAAGGGCAUUUGCUUGCAG
1057	1058	649-667	UGCAAGCAAAUGCCCUUUC	GAAAGGGCAUUUGCUUGCA
1059	1060	650-668	GCAAGCAAAUGCCCUUUCC	GGAAAGGGCAUUUGCUUGC
1061	1062	651-669	CAAGCAAAUGCCCUUUCCU	AGGAAAGGGCAUUUGCUUG
1063	1064	652-670	AAGCAAAUGCCCUUUCCUG	CAGGAAAGGGCAUUUGCUU
1065	1066	653-671	AGCAAAUGCCCUUUCCUGG	CCAGGAAAGGGCAUUUGCU
1067	1068	654-672	GCAAAUGCCCUUUCCUGGC	GCCAGGAAAGGGCAUUUGC
1069	1070	655-673	CAAAUGCCCUUUCCUGGCA	UGCCAGGAAAGGGCAUUUG
1071	1072	656-674	AAAUGCCCUUUCCUGGCAG	CUGCCAGGAAAGGGCAUUU
1073	1074	657-675	AAUGCCCUUUCCUGGCAGC	GCUGCCAGGAAAGGGCAUU
1075	1076	658-676	AUGCCCUUUCCUGGCAGCA	UGCUGCCAGGAAAGGGCAU
1077	1078	659-677	UGCCCUUUCCUGGCAGCAC	GUGCUGCCAGGAAAGGGCA
1079	1080	660-678	GCCCUUUCCUGGCAGCACA	UGUGCUGCCAGGAAAGGGC
1081	1082	661-679	CCCUUUCCUGGCAGCACAG	CUGUGCUGCCAGGAAAGGG
1083	1084	662-680	CCUUUCCUGGCAGCACAGA	UCUGUGCUGCCAGGAAAGG
1085	1086	663-681	CUUUCCUGGCAGCACAGAU	AUCUGUGCUGCCAGGAAAG
1087	1088	664-682	UUUCCUGGCAGCACAGAUG	CAUCUGUGCUGCCAGGAAA
1089	1090	665-683	UUCCUGGCAGCACAGAUGA	UCAUCUGUGCUGCCAGGAA
1091	1092	666-684	UCCUGGCAGCACAGAUGAA	UUCAUCUGUGCUGCCAGGA
1093	1094	667-685	CCUGGCAGCACAGAUGAAU	AUUCAUCUGUGCUGCCAGG
1095	1096	668-686	CUGGCAGCACAGAUGAAUC	GAUUCAUCUGUGCUGCCAG
1097	1098	670-688	GGCAGCACAGAUGAAUCAG	CUGAUUCAUCUGUGCUGCC
1099	1100	672-690	CAGCACAGAUGAAUCAGAG	CUCUGAUUCAUCUGUGCUG
1101	1102	692-710	GGCAGCAGUGUCUUCUGCA	UGCAGAAGACACUGCUGCC
1103	1104	693-711	GCAGCAGUGUCUUCUGCAA	UUGCAGAAGACACUGCUGC
1105	1106	694-712	CAGCAGUGUCUUCUGCAAA	UUUGCAGAAGACACUGCUG
1107	1108	695-713	AGCAGUGUCUUCUGCAAAG	CUUUGCAGAAGACACUGCU

1109	1110	696-714	GCAGUGUCUUCUGCAAAGC	GCUUUGCAGAAGACACUGC
1111	1112	697-715	CAGUGUCUUCUGCAAAGCC	GGCUUUGCAGAAGACACUG
1113	1114	698-716	AGUGUCUUCUGCAAAGCCA	UGGCUUUGCAGAAGACACU
1115	1116	699-717	GUGUCUUCUGCAAAGCCAG	CUGGCUUUGCAGAAGACAC
1117	1118	700-718	UGUCUUCUGCAAAGCCAGU	ACUGGCUUUGCAGAAGACA
1119	1120	701-719	GUCUUCUGCAAAGCCAGUC	GACUGGCUUUGCAGAAGAC
1121	1122	702-720	UCUUCUGCAAAGCCAGUCU	AGACUGGCUUUGCAGAAGA
1123	1124	703-721	CUUCUGCAAAGCCAGUCUU	AAGACUGGCUUUGCAGAAG
1125	1126	704-722	UUCUGCAAAGCCAGUCUUG	CAAGACUGGCUUUGCAGAA
1127	1128	705-723	UCUGCAAAGCCAGUCUUGA	UCAAGACUGGCUUUGCAGA
1129	1130	706-724	CUGCAAAGCCAGUCUUGAG	CUCAAGACUGGCUUUGCAG
1131	1132	707-725	UGCAAAGCCAGUCUUGAGC	GCUCAAGACUGGCUUUGCA
1133	1134	708-726	GCAAAGCCAGUCUUGAGCU	AGCUCAAGACUGGCUUUGC
1135	1136	709-727	CAAAGCCAGUCUUGAGCUU	AAGCUCAAGACUGGCUUUG
1137	1138	710-728	AAAGCCAGUCUUGAGCUUC	GAAGCUCAAGACUGGCUUU
1139	1140	711-729	AAGCCAGUCUUGAGCUUCA	UGAAGCUCAAGACUGGCUU
1141	1142	712-730	AGCCAGUCUUGAGCUUCAG	CUGAAGCUCAAGACUGGCU
1143	1144	713-731	GCCAGUCUUGAGCUUCAGG	CCUGAAGCUCAAGACUGGC
1145	1146	714-732	CCAGUCUUGAGCUUCAGGA	UCCUGAAGCUCAAGACUGG
1147	1148	715-733	CAGUCUUGAGCUUCAGGAG	CUCCUGAAGCUCAAGACUG
1149	1150	716-734	AGUCUUGAGCUUCAGGAGG	CCUCCUGAAGCUCAAGACU
1151	1152	717-735	GUCUUGAGCUUCAGGAGGA	UCCUCCUGAAGCUCAAGAC
1153	1154	718-736	UCUUGAGCUUCAGGAGGAU	AUCCUCCUGAAGCUCAAGA
1155	1156	719-737	CUUGAGCUUCAGGAGGAUG	CAUCCUCCUGAAGCUCAAG
1157	1158	720-738	UUGAGCUUCAGGAGGAUGU	ACAUCCUCCUGAAGCUCAA
1159	1160	721-739	UGAGCUUCAGGAGGAUGUG	CACAUCCUCCUGAAGCUCA
1161	1162	722-740	GAGCUUCAGGAGGAUGUGC	GCACAUCCUCCUGAAGCUC
1163	1164	723-741	AGCUUCAGGAGGAUGUGCA	UGCACAUCCUCCUGAAGCU
1165	1166	724-742	GCUUCAGGAGGAUGUGCAG	CUGCACAUCCUCCUGAAGC
1167	1168	725-743	CUUCAGGAGGAUGUGCAGG	CCUGCACAUCCUCCUGAAG
1169	1170	726-744	UUCAGGAGGAUGUGCAGGA	UCCUGCACAUCCUCCUGAA
1171	1172	727-745	UCAGGAGGAUGUGCAGGAA	UUCCUGCACAUCCUCCUGA
1173	1174	728-746	CAGGAGGAUGUGCAGGAAA	UUUCCUGCACAUCCUCCUG
1175	1176	729-747	AGGAGGAUGUGCAGGAAAU	AUUUCCUGCACAUCCUCCU
1177	1178	730-748	GGAGGAUGUGCAGGAAAUG	CAUUUCCUGCACAUCCUCC
1179	1180	731-749	GAGGAUGUGCAGGAAAUGA	UCAUUUCCUGCACAUCCUC
1181	1182	732-750	AGGAUGUGCAGGAAAUGAA	UUCAUUUCCUGCACAUCCU
1183	1184	733-751	GGAUGUGCAGGAAAUGAAU	AUUCAUUUCCUGCACAUCC
1185	1186	734-752	GAUGUGCAGGAAAUGAAUG	CAUUCAUUUCCUGCACAUC
1187	1188	735-753	AUGUGCAGGAAAUGAAUGC	GCAUUCAUUUCCUGCACAU
1189	1190	755-773	GUGAGGAAAGAGGUUGCUG	CAGCAACCUCUUUCCUCAC
1191	1192	756-774	UGAGGAAAGAGGUUGCUGA	UCAGCAACCUCUUUCCUCA
1193	1194	757-775	GAGGAAAGAGGUUGCUGAA	UUCAGCAACCUCUUUCCUC
1195	1196	758-776	AGGAAAGAGGUUGCUGAAA	UUUCAGCAACCUCUUUCCU
1197	1198	759-777	GGAAAGAGGUUGCUGAAAC	GUUUCAGCAACCUCUUUCC
1199	1200	760-778	GAAAGAGGUUGCUGAAACC	GGUUUCAGCAACCUCUUUC
1201	1202	761-779	AAAGAGGUUGCUGAAACCU	AGGUUUCAGCAACCUCUUU
1203	1204	762-780	AAGAGGUUGCUGAAACCUC	GAGGUUUCAGCAACCUCUU
1205	1206	763-781	AGAGGUUGCUGAAACCUCA	UGAGGUUUCAGCAACCUCU
1207	1208	764-782	GAGGUUGCUGAAACCUCAG	CUGAGGUUUCAGCAACCUC

1209	1210	765-783	AGGUUGCUGAAACCUCAGC	GCUGAGGUUUCAGCAACCU
1211	1212	766-784	GGUUGCUGAAACCUCAGCA	UGCUGAGGUUUCAGCAACC
1213	1214	787-805	CCCCAGUGUGGUUAGUGUG	CACACUAACCACACUGGGG
1215	1216	791-809	AGUGUGGUUAGUGUGAAAA	UUUUCACACUAACCACACU
1217	1218	792-810	GUGUGGUUAGUGUGAAAAC	GUUUUCACACUAACCACAC
1219	1220	812-830	GAUGGAGGGGAUCCCAGUG	CACUGGGAUCCCCUCCAUC
1221	1222	813-831	AUGGAGGGGAUCCCAGUGG	CCACUGGGAUCCCCUCCAU
1223	1224	833-851	CUGCUGAAGAACUUCCAGG	CCUGGAAGUUCUUCAGCAG
1225	1226	834-852	UGCUGAAGAACUUCCAGGA	UCCUGGAAGUUCUUCAGCA
1227	1228	835-853	GCUGAAGAACUUCCAGGAC	GUCCUGGAAGUUCUUCAGC
1229	1230	836-854	CUGAAGAACUUCCAGGACA	UGUCCUGGAAGUUCUUCAG
1231	1232	837-855	UGAAGAACUUCCAGGACAU	AUGUCCUGGAAGUUCUUCA
1233	1234	838-856	GAAGAACUUCCAGGACAUC	GAUGUCCUGGAAGUUCUUC
1235	1236	839-857	AAGAACUUCCAGGACAUCA	UGAUGUCCUGGAAGUUCUU
1237	1238	840-858	AGAACUUCCAGGACAUCAU	AUGAUGUCCUGGAAGUUCU
1239	1240	841-859	GAACUUCCAGGACAUCAUG	CAUGAUGUCCUGGAAGUUC
1241	1242	842-860	AACUUCCAGGACAUCAUGC	GCAUGAUGUCCUGGAAGUU
1243	1244	843-861	ACUUCCAGGACAUCAUGCA	UGCAUGAUGUCCUGGAAGU
1245	1246	844-862	CUUCCAGGACAUCAUGCAA	UUGCAUGAUGUCCUGGAAG
1247	1248	845-863	UUCCAGGACAUCAUGCAAA	UUUGCAUGAUGUCCUGGAA
1249	1250	846-864	UCCAGGACAUCAUGCAAAA	UUUUGCAUGAUGUCCUGGA
1251	1252	847-865	CCAGGACAUCAUGCAAAAG	CUUUUGCAUGAUGUCCUGG
1253	1254	848-866	CAGGACAUCAUGCAAAAGC	GCUUUUGCAUGAUGUCCUG
1255	1256	849-867	AGGACAUCAUGCAAAAGCA	UGCUUUUGCAUGAUGUCCU
1257	1258	850-868	GGACAUCAUGCAAAAGCAA	UUGCUUUUGCAUGAUGUCC
1259	1260	851-869	GACAUCAUGCAAAAGCAAA	UUUGCUUUUGCAUGAUGUC
1261	1262	852-870	ACAUCAUGCAAAAGCAAAG	CUUUGCUUUUGCAUGAUGU
1263	1264	854-872	AUCAUGCAAAAGCAAAGAC	GUCUUUGCUUUUGCAUGAU
1265	1266	855-873	UCAUGCAAAAGCAAAGACC	GGUCUUUGCUUUUGCAUGA
1267	1268	856-874	CAUGCAAAAGCAAAGACCA	UGGUCUUUGCUUUUGCAUG
1269	1270	857-875	AUGCAAAAGCAAAGACCAG	CUGGUCUUUGCUUUUGCAU
1271	1272	858-876	UGCAAAAGCAAAGACCAGA	UCUGGUCUUUGCUUUUGCA
1273	1274	859-877	GCAAAAGCAAAGACCAGAA	UUCUGGUCUUUGCUUUUGC
1275	1276	860-878	CAAAAGCAAAGACCAGAAA	UUUCUGGUCUUUGCUUUUG
1277	1278	861-879	AAAAGCAAAGACCAGAAAG	CUUUCUGGUCUUUGCUUUU
1279	1280	862-880	AAAGCAAAGACCAGAAAGA	UCUUUCUGGUCUUUGCUUU
1281	1282	863-881	AAGCAAAGACCAGAAAGAG	CUCUUUCUGGUCUUUGCUU
1283	1284	864-882	AGCAAAGACCAGAAAGAGU	ACUCUUUCUGGUCUUUGCU
1285	1286	865-883	GCAAAGACCAGAAAGAGUG	CACUCUUUCUGGUCUUUGC
1287	1288	867-885	AAAGACCAGAAAGAGUGUC	GACACUCUUUCUGGUCUUU
1289	1290	868-886	AAGACCAGAAAGAGUGUCU	AGACACUCUUUCUGGUCUU
1291	1292	869-887	AGACCAGAAAGAGUGUCUC	GAGACACUCUUUCUGGUCU
1293	1294	870-888	GACCAGAAAGAGUGUCUCA	UGAGACACUCUUUCUGGUC
1295	1296	871-889	ACCAGAAAGAGUGUCUCAU	AUGAGACACUCUUUCUGGU
1297	1298	872-890	CCAGAAAGAGUGUCUCAUC	GAUGAGACACUCUUUCUGG
1299	1300	875-893	GAAAGAGUGUCUCAUCUUC	GAAGAUGAGACACUCUUUC
1301	1302	878-896	AGAGUGUCUCAUCUUCUUC	GAAGAAGAUGAGACACUCU
1303	1304	879-897	GAGUGUCUCAUCUUCUUCA	UGAAGAAGAUGAGACACUC
1305	1306	880-898	AGUGUCUCAUCUUCUUCAA	UUGAAGAAGAUGAGACACU
1307	1308	881-899	GUGUCUCAUCUUCUUCAAG	CUUGAAGAAGAUGAGACAC

1309	1310	882-900	UGUCUCAUCUUCUUCAAGA	UCUUGAAGAAGAUGAGACA
1311	1312	883-901	GUCUCAUCUUCUUCAAGAU	AUCUUGAAGAAGAUGAGAC
1313	1314	884-902	UCUCAUCUUCUUCAAGAUA	UAUCUUGAAGAAGAUGAGA
1315	1316	886-904	UCAUCUUCUUCAAGAUAAC	GUUAUCUUGAAGAAGAUGA
1317	1318	887-905	CAUCUUCUUCAAGAUAACU	AGUUAUCUUGAAGAAGAUG
1319	1320	888-906	AUCUUCUUCAAGAUAACUU	AAGUUAUCUUGAAGAAGAU
1321	1322	889-907	UCUUCUUCAAGAUAACUUG	CAAGUUAUCUUGAAGAAGA
1323	1324	890-908	CUUCUUCAAGAUAACUUGC	GCAAGUUAUCUUGAAGAAG
1325	1326	891-909	UUCUUCAAGAUAACUUGCC	GGCAAGUUAUCUUGAAGAA
1327	1328	892-910	UCUUCAAGAUAACUUGCCA	UGGCAAGUUAUCUUGAAGA
1329	1330	893-911	CUUCAAGAUAACUUGCCAA	UUGGCAAGUUAUCUUGAAG
1331	1332	894-912	UUCAAGAUAACUUGCCAAA	UUUGGCAAGUUAUCUUGAA
1333	1334	895-913	UCAAGAUAACUUGCCAAAA	UUUUGGCAAGUUAUCUUGA
1335	1336	896-914	CAAGAUAACUUGCCAAAAU	AUUUUGGCAAGUUAUCUUG
1337	1338	897-915	AAGAUAACUUGCCAAAAUC	GAUUUUGGCAAGUUAUCUU
1339	1340	898-916	AGAUAACUUGCCAAAAUCU	AGAUUUUGGCAAGUUAUCU
1341	1342	899-917	GAUAACUUGCCAAAAUCUG	CAGAUUUUGGCAAGUUAUC
1343	1344	900-918	AUAACUUGCCAAAAUCUGU	ACAGAUUUUGGCAAGUUAU
1345	1346	901-919	UAACUUGCCAAAAUCUGUU	AACAGAUUUUGGCAAGUUA
1347	1348	902-920	AACUUGCCAAAAUCUGUUU	AAACAGAUUUUGGCAAGUU
1349	1350	903-921	ACUUGCCAAAAUCUGUUUC	GAAACAGAUUUUGGCAAGU
1351	1352	904-922	CUUGCCAAAAUCUGUUUCC	GGAAACAGAUUUUGGCAAG
1353	1354	905-923	UUGCCAAAAUCUGUUUCCA	UGGAAACAGAUUUUGGCAA
1355	1356	906-924	UGCCAAAAUCUGUUUCCAC	GUGGAAACAGAUUUUGGCA
1357	1358	907-925	GCCAAAAUCUGUUUCCACU	AGUGGAAACAGAUUUUGGC
1359	1360	908-926	CCAAAAUCUGUUUCCACUU	AAGUGGAAACAGAUUUUGG
1361	1362	909-927	CAAAAUCUGUUUCCACUUU	AAAGUGGAAACAGAUUUUG
1363	1364	910-928	AAAAUCUGUUUCCACUUUU	AAAAGUGGAAACAGAUUUU
1365	1366	911-929	AAAUCUGUUUCCACUUUUC	GAAAAGUGGAAACAGAUUU
1367	1368	912-930	AAUCUGUUUCCACUUUUCA	UGAAAAGUGGAAACAGAUU
1369	1370	913-931	AUCUGUUUCCACUUUUCAG	CUGAAAAGUGGAAACAGAU
1371	1372	916-934	UGUUUCCACUUUUCAGUAU	AUACUGAAAAGUGGAAACA
1373	1374	917-935	GUUUCCACUUUUCAGUAUG	CAUACUGAAAAGUGGAAAC
1375	1376	918-936	UUUCCACUUUUCAGUAUGA	UCAUACUGAAAAGUGGAAA
1377	1378	919-937	UUCCACUUUUCAGUAUGAU	AUCAUACUGAAAAGUGGAA
1379	1380	920-938	UCCACUUUUCAGUAUGAUC	GAUCAUACUGAAAAGUGGA
1381	1382	921-939	CCACUUUUCAGUAUGAUCG	CGAUCAUACUGAAAAGUGG
1383	1384	925-943	UUUUCAGUAUGAUCGUUUC	GAAACGAUCAUACUGAAAA
1385	1386	929-947	CAGUAUGAUCGUUUCUUUG	CAAAGAAACGAUCAUACUG
1387	1388	930-948	AGUAUGAUCGUUUCUUUGA	UCAAAGAAACGAUCAUACU
1389	1390	931-949	GUAUGAUCGUUUCUUUGAG	CUCAAAGAAACGAUCAUAC
1391	1392	933-951	AUGAUCGUUUCUUUGAGAA	UUCUCAAAGAAACGAUCAU
1393	1394	934-952	UGAUCGUUUCUUUGAGAAA	UUUCUCAAAGAAACGAUCA
1395	1396	936-954	AUCGUUUCUUUGAGAAAAA	UUUUUCUCAAAGAAACGAU
1397	1398	937-955	UCGUUUCUUUGAGAAAAAA	UUUUUUCUCAAAGAAACGA
1399	1400	938-956	CGUUUCUUUGAGAAAAAAA	UUUUUUUCUCAAAGAAACG
1401	1402	939-957	GUUUCUUUGAGAAAAAAAU	AUUUUUUUCUCAAAGAAAC
1403	1404	940-958	UUUCUUUGAGAAAAAAAUU	AAUUUUUUUCUCAAAGAAA
1405	1406	941-959	UUCUUUGAGAAAAAAAUUG	CAAUUUUUUUCUCAAAGAA
1407	1408	942-960	UCUUUGAGAAAAAAAUUGA	UCAAUUUUUUUCUCAAAGA

1409	1410	943-961	CUUUGAGAAAAAAAUUGAU	AUCAAUUUUUUUCUCAAAG
1411	1412	944-962	UUUGAGAAAAAAAUUGAUG	CAUCAAUUUUUUUCUCAAA
1413	1414	945-963	UUGAGAAAAAAAUUGAUGA	UCAUCAAUUUUUUUCUCAA
1415	1416	946-964	UGAGAAAAAAAUUGAUGAG	CUCAUCAAUUUUUUUCUCA
1417	1418	947-965	GAGAAAAAAAUUGAUGAGA	UCUCAUCAAUUUUUUUCUC
1419	1420	948-966	AGAAAAAAAUUGAUGAGAA	UUCUCAUCAAUUUUUUUCU
1421	1422	949-967	GAAAAAAAUUGAUGAGAAA	UUUCUCAUCAAUUUUUUUC
1423	1424	950-968	AAAAAAAUUGAUGAGAAAA	UUUUCUCAUCAAUUUUUUU
1425	1426	951-969	AAAAAAUUGAUGAGAAAAA	UUUUUCUCAUCAAUUUUUU
1427	1428	952-970	AAAAAUUGAUGAGAAAAAG	CUUUUUCUCAUCAAUUUUU
1429	1430	953-971	AAAAUUGAUGAGAAAAAGA	UCUUUUUCUCAUCAAUUUU
1431	1432	954-972	AAAUUGAUGAGAAAAAGAA	UUCUUUUUCUCAUCAAUUU
1433	1434	955-973	AAUUGAUGAGAAAAAGAAU	AUUCUUUUUCUCAUCAAUU
1435	1436	956-974	AUUGAUGAGAAAAAGAAUG	CAUUCUUUUUCUCAUCAAU
1437	1438	957-975	UUGAUGAGAAAAAGAAUGA	UCAUUCUUUUUCUCAUCAA
1439	1440	958-976	UGAUGAGAAAAAGAAUGAC	GUCAUUCUUUUUCUCAUCA
1441	1442	959-977	GAUGAGAAAAAGAAUGACC	GGUCAUUCUUUUUCUCAUC
1443	1444	960-978	AUGAGAAAAAGAAUGACCA	UGGUCAUUCUUUUUCUCAU
1445	1446	961-979	UGAGAAAAAGAAUGACCAC	GUGGUCAUUCUUUUUCUCA
1447	1448	962-980	GAGAAAAAGAAUGACCACA	UGUGGUCAUUCUUUUUCUC
1449	1450	963-981	AGAAAAAGAAUGACCACAC	GUGUGGUCAUUCUUUUUCU
1451	1452	964-982	GAAAAAGAAUGACCACACC	GGUGUGGUCAUUCUUUUUC
1453	1454	965-983	AAAAAGAAUGACCACACCU	AGGUGUGGUCAUUCUUUUU
1455	1456	966-984	AAAAGAAUGACCACACCUA	UAGGUGUGGUCAUUCUUUU
1457	1458	967-985	AAAGAAUGACCACACCUAU	AUAGGUGUGGUCAUUCUUU
1459	1460	968-986	AAGAAUGACCACACCUAUC	GAUAGGUGUGGUCAUUCUU
1461	1462	969-987	AGAAUGACCACACCUAUCG	CGAUAGGUGUGGUCAUUCU
1463	1464	970-988	GAAUGACCACACCUAUCGA	UCGAUAGGUGUGGUCAUUC
1465	1466	971-989	AAUGACCACACCUAUCGAG	CUCGAUAGGUGUGGUCAUU
1467	1468	972-990	AUGACCACACCUAUCGAGU	ACUCGAUAGGUGUGGUCAU
1469	1470	976-994	CCACACCUAUCGAGUUUUU	AAAAACUCGAUAGGUGUGG
1471	1472	977-995	CACACCUAUCGAGUUUUUA	UAAAAACUCGAUAGGUGUG
1473	1474	978-996	ACACCUAUCGAGUUUUUAA	UUAAAAACUCGAUAGGUGU
1475	1476	979-997	CACCUAUCGAGUUUUUAAA	UUUAAAAACUCGAUAGGUG
1477	1478	980-998	ACCUAUCGAGUUUUUAAAA	UUUUAAAAACUCGAUAGGU
1479	1480	981-999	CCUAUCGAGUUUUUAAAAC	GUUUUAAAAACUCGAUAGG
1481	1482	982-1000	CUAUCGAGUUUUUAAAACU	AGUUUUAAAAACUCGAUAG
1483	1484	983-1001	UAUCGAGUUUUUAAAACUG	CAGUUUUAAAAACUCGAUA
1485	1486	984-1002	AUCGAGUUUUUAAAACUGU	ACAGUUUUAAAAACUCGAU
1487	1488	985-1003	UCGAGUUUUUAAAACUGUG	CACAGUUUUAAAAACUCGA
1489	1490	986-1004	CGAGUUUUUAAAACUGUGA	UCACAGUUUUAAAAACUCG
1491	1492	987-1005	GAGUUUUUAAAACUGUGAA	UUCACAGUUUUAAAAACUC
1493	1494	988-1006	AGUUUUUAAAACUGUGAAC	GUUCACAGUUUUAAAAACU
1495	1496	989-1007	GUUUUUAAAACUGUGAACC	GGUUCACAGUUUUAAAAAC
1497	1498	990-1008	UUUUUAAAACUGUGAACCG	CGGUUCACAGUUUUAAAAA
1499	1500	991-1009	UUUUAAAACUGUGAACCGG	CCGGUUCACAGUUUUAAAA
1501	1502	992-1010	UUUAAAACUGUGAACCGGC	GCCGGUUCACAGUUUUAAA
1503	1504	993-1011	UUAAAACUGUGAACCGGCG	CGCCGGUUCACAGUUUUAA
1505	1506	994-1012	UAAAACUGUGAACCGGCGA	UCGCCGGUUCACAGUUUUA
1507	1508	995-1013	AAAACUGUGAACCGGCGAG	CUCGCCGGUUCACAGUUUU

1509	1510	996-1014	AAACUGUGAACCGGCGAGC	GCUCGCCGGUUCACAGUUU
1511	1512	997-1015	AACUGUGAACCGGCGAGCA	UGCUCGCCGGUUCACAGUU
1513	1514	998-1016	ACUGUGAACCGGCGAGCAC	GUGCUCGCCGGUUCACAGU
1515	1516	999-1017	CUGUGAACCGGCGAGCACA	UGUGCUCGCCGGUUCACAG
1517	1518	1000-1018	UGUGAACCGGCGAGCACAC	GUGUGCUCGCCGGUUCACA
1519	1520	1001-1019	GUGAACCGGCGAGCACACA	UGUGUGCUCGCCGGUUCAC
1521	1522	1002-1020	UGAACCGGCGAGCACACAU	AUGUGUGCUCGCCGGUUCA
1523	1524	1003-1021	GAACCGGCGAGCACACAUC	GAUGUGUGCUCGCCGGUUC
1525	1526	1004-1022	AACCGGCGAGCACACAUCU	AGAUGUGUGCUCGCCGGUU
1527	1528	1005-1023	ACCGGCGAGCACACAUCUU	AAGAUGUGUGCUCGCCGGU
1529	1530	1006-1024	CCGGCGAGCACACAUCUUC	GAAGAUGUGUGCUCGCCGG
1531	1532	1007-1025	CGGCGAGCACACAUCUUCC	GGAAGAUGUGUGCUCGCCG
1533	1534	1008-1026	GGCGAGCACACAUCUUCCC	GGGAAGAUGUGUGCUCGCC
1535	1536	1028-1046	AUGGCAGAUGACUAUUCAG	CUGAAUAGUCAUCUGCCAU
1537	1538	1030-1048	GGCAGAUGACUAUUCAGAC	GUCUGAAUAGUCAUCUGCC
1539	1540	1031-1049	GCAGAUGACUAUUCAGACU	AGUCUGAAUAGUCAUCUGC
1541	1542	1032-1050	CAGAUGACUAUUCAGACUC	GAGUCUGAAUAGUCAUCUG
1543	1544	1033-1051	AGAUGACUAUUCAGACUCC	GGAGUCUGAAUAGUCAUCU
1545	1546	1034-1052	GAUGACUAUUCAGACUCCC	GGGAGUCUGAAUAGUCAUC
1547	1548	1035-1053	AUGACUAUUCAGACUCCCU	AGGGAGUCUGAAUAGUCAU
1549	1550	1036-1054	UGACUAUUCAGACUCCCUC	GAGGGAGUCUGAAUAGUCA
1551	1552	1037-1055	GACUAUUCAGACUCCCUCA	UGAGGGAGUCUGAAUAGUC
1553	1554	1038-1056	ACUAUUCAGACUCCCUCAU	AUGAGGGAGUCUGAAUAGU
1555	1556	1039-1057	CUAUUCAGACUCCCUCAUC	GAUGAGGGAGUCUGAAUAG
1557	1558	1040-1058	UAUUCAGACUCCCUCAUCA	UGAUGAGGGAGUCUGAAUA
1559	1560	1041-1059	AUUCAGACUCCCUCAUCAC	GUGAUGAGGGAGUCUGAAU
1561	1562	1042-1060	UUCAGACUCCCUCAUCACC	GGUGAUGAGGGAGUCUGAA
1563	1564	1043-1061	UCAGACUCCCUCAUCACCA	UGGUGAUGAGGGAGUCUGA
1565	1566	1044-1062	CAGACUCCCUCAUCACCAA	UUGGUGAUGAGGGAGUCUG
1567	1568	1045-1063	AGACUCCCUCAUCACCAAA	UUUGGUGAUGAGGGAGUCU
1569	1570	1046-1064	GACUCCCUCAUCACCAAAA	UUUUGGUGAUGAGGGAGUC
1571	1572	1047-1065	ACUCCCUCAUCACCAAAAA	UUUUUGGUGAUGAGGGAGU
1573	1574	1048-1066	CUCCCUCAUCACCAAAAAG	CUUUUUGGUGAUGAGGGAG
1575	1576	1049-1067	UCCCUCAUCACCAAAAAGC	GCUUUUUGGUGAUGAGGGA
1577	1578	1050-1068	CCCUCAUCACCAAAAAGCA	UGCUUUUUGGUGAUGAGGG
1579	1580	1070-1088	GUGUCAGUCUGGUGCAGUA	UACUGCACCAGACUGACAC
1581	1582	1071-1089	UGUCAGUCUGGUGCAGUAA	UUACUGCACCAGACUGACA
1583	1584	1072-1090	GUCAGUCUGGUGCAGUAAU	AUUACUGCACCAGACUGAC
1585	1586	1073-1091	UCAGUCUGGUGCAGUAAUG	CAUUACUGCACCAGACUGA
1587	1588	1074-1092	CAGUCUGGUGCAGUAAUGA	UCAUUACUGCACCAGACUG
1589	1590	1075-1093	AGUCUGGUGCAGUAAUGAC	GUCAUUACUGCACCAGACU
1591	1592	1078-1096	CUGGUGCAGUAAUGACUAC	GUAGUCAUUACUGCACCAG
1593	1594	1079-1097	UGGUGCAGUAAUGACUACC	GGUAGUCAUUACUGCACCA
1595	1596	1081-1099	GUGCAGUAAUGACUACCUA	UAGGUAGUCAUUACUGCAC
1597	1598	1082-1100	UGCAGUAAUGACUACCUAG	CUAGGUAGUCAUUACUGCA
1599	1600	1083-1101	GCAGUAAUGACUACCUAGG	CCUAGGUAGUCAUUACUGC
1601	1602	1084-1102	CAGUAAUGACUACCUAGGA	UCCUAGGUAGUCAUUACUG
1603	1604	1085-1103	AGUAAUGACUACCUAGGAA	UUCCUAGGUAGUCAUUACU
1605	1606	1086-1104	GUAAUGACUACCUAGGAAU	AUUCCUAGGUAGUCAUUAC
1607	1608	1087-1105	UAAUGACUACCUAGGAAUG	CAUUCCUAGGUAGUCAUUA

1609	1610	1088-1106	AAUGACUACCUAGGAAUGA	UCAUUCCUAGGUAGUCAUU
1611	1612	1089-1107	AUGACUACCUAGGAAUGAG	CUCAUUCCUAGGUAGUCAU
1613	1614	1090-1108	UGACUACCUAGGAAUGAGU	ACUCAUUCCUAGGUAGUCA
1615	1616	1091-1109	GACUACCUAGGAAUGAGUC	GACUCAUUCCUAGGUAGUC
1617	1618	1092-1110	ACUACCUAGGAAUGAGUCG	CGACUCAUUCCUAGGUAGU
1619	1620	1093-1111	CUACCUAGGAAUGAGUCGC	GCGACUCAUUCCUAGGUAG
1621	1622	1094-1112	UACCUAGGAAUGAGUCGCC	GGCGACUCAUUCCUAGGUA
1623	1624	1095-1113	ACCUAGGAAUGAGUCGCCA	UGGCGACUCAUUCCUAGGU
1625	1626	1096-1114	CCUAGGAAUGAGUCGCCAC	GUGGCGACUCAUUCCUAGG
1627	1628	1097-1115	CUAGGAAUGAGUCGCCACC	GGUGGCGACUCAUUCCUAG
1629	1630	1098-1116	UAGGAAUGAGUCGCCACCC	GGGUGGCGACUCAUUCCUA
1631	1632	1099-1117	AGGAAUGAGUCGCCACCCA	UGGGUGGCGACUCAUUCCU
1633	1634	1100-1118	GGAAUGAGUCGCCACCCAC	GUGGGUGGCGACUCAUUCC
1635	1636	1101-1119	GAAUGAGUCGCCACCCACG	CGUGGGUGGCGACUCAUUC
1637	1638	1102-1120	AAUGAGUCGCCACCCACGG	CCGUGGGUGGCGACUCAUU
1639	1640	1103-1121	AUGAGUCGCCACCCACGGG	CCCGUGGGUGGCGACUCAU
1641	1642	1104-1122	UGAGUCGCCACCCACGGGU	ACCCGUGGGUGGCGACUCA
1643	1644	1105-1123	GAGUCGCCACCCACGGGUG	CACCCGUGGGUGGCGACUC
1645	1646	1106-1124	AGUCGCCACCCACGGGUGU	ACACCCGUGGGUGGCGACU
1647	1648	1107-1125	GUCGCCACCCACGGGUGUG	CACACCCGUGGGUGGCGAC
1649	1650	1108-1126	UCGCCACCCACGGGUGUGU	ACACACCCGUGGGUGGCGA
1651	1652	1109-1127	CGCCACCCACGGGUGUGUG	CACACACCCGUGGGUGGCG
1653	1654	1110-1128	GCCACCCACGGGUGUGUGG	CCACACACCCGUGGGUGGC
1655	1656	1111-1129	CCACCCACGGGUGUGUGGG	CCCACACACCCGUGGGUGG
1657	1658	1112-1130	CACCCACGGGUGUGUGGGG	CCCCACACACCCGUGGGUG
1659	1660	1113-1131	ACCCACGGGUGUGUGGGGC	GCCCCACACACCCGUGGGU
1661	1662	1114-1132	CCCACGGGUGUGUGGGGCA	UGCCCCACACACCCGUGGG
1663	1664	1115-1133	CCACGGGUGUGUGGGGCAG	CUGCCCCACACACCCGUGG
1665	1666	1116-1134	CACGGGUGUGUGGGGCAGU	ACUGCCCCACACACCCGUG
1667	1668	1117-1135	ACGGGUGUGUGGGGCAGUU	AACUGCCCCACACACCCGU
1669	1670	1118-1136	CGGGUGUGUGGGGCAGUUA	UAACUGCCCCACACACCCG
1671	1672	1119-1137	GGGUGUGUGGGGCAGUUAU	AUAACUGCCCCACACACCC
1673	1674	1120-1138	GGUGUGUGGGGCAGUUAUG	CAUAACUGCCCCACACACC
1675	1676	1121-1139	GUGUGUGGGGCAGUUAUGG	CCAUAACUGCCCCACACAC
1677	1678	1122-1140	UGUGUGGGGCAGUUAUGGA	UCCAUAACUGCCCCACACA
1679	1680	1123-1141	GUGUGGGGCAGUUAUGGAC	GUCCAUAACUGCCCCACAC
1681	1682	1125-1143	GUGGGGCAGUUAUGGACAC	GUGUCCAUAACUGCCCCAC
1683	1684	1126-1144	UGGGGCAGUUAUGGACACU	AGUGUCCAUAACUGCCCCA
1685	1686	1128-1146	GGGCAGUUAUGGACACUUU	AAAGUGUCCAUAACUGCCC
1687	1688	1129-1147	GGCAGUUAUGGACACUUUG	CAAAGUGUCCAUAACUGCC
1689	1690	1130-1148	GCAGUUAUGGACACUUUGA	UCAAAGUGUCCAUAACUGC
1691	1692	1131-1149	CAGUUAUGGACACUUUGAA	UUCAAAGUGUCCAUAACUG
1693	1694	1132-1150	AGUUAUGGACACUUUGAAA	UUUCAAAGUGUCCAUAACU
1695	1696	1133-1151	GUUAUGGACACUUUGAAAC	GUUUCAAAGUGUCCAUAAC
1697	1698	1134-1152	UUAUGGACACUUUGAAACA	UGUUUCAAAGUGUCCAUAA
1699	1700	1135-1153	UAUGGACACUUUGAAACAA	UUGUUUCAAAGUGUCCAUA
1701	1702	1136-1154	AUGGACACUUUGAAACAAC	GUUGUUUCAAAGUGUCCAU
1703	1704	1139-1157	GACACUUUGAAACAACAUG	CAUGUUGUUUCAAAGUGUC
1705	1706	1140-1158	ACACUUUGAAACAACAUGG	CCAUGUUGUUUCAAAGUGU
1707	1708	1141-1159	CACUUUGAAACAACAUGGU	ACCAUGUUGUUUCAAAGUG

1709	1710	1142-1160	ACUUUGAAACAACAUGGUG	CACCAUGUUGUUUCAAAGU
1711	1712	1143-1161	CUUUGAAACAACAUGGUGC	GCACCAUGUUGUUUCAAAG
1713	1714	1144-1162	UUUGAAACAACAUGGUGCU	AGCACCAUGUUGUUUCAAA
1715	1716	1145-1163	UUGAAACAACAUGGUGCUG	CAGCACCAUGUUGUUUCAA
1717	1718	1146-1164	UGAAACAACAUGGUGCUGG	CCAGCACCAUGUUGUUUCA
1719	1720	1147-1165	GAAACAACAUGGUGCUGGG	CCCAGCACCAUGUUGUUUC
1721	1722	1148-1166	AAACAACAUGGUGCUGGGG	CCCCAGCACCAUGUUGUUU
1723	1724	1149-1167	AACAACAUGGUGCUGGGGC	GCCCCAGCACCAUGUUGUU
1725	1726	1150-1168	ACAACAUGGUGCUGGGGCA	UGCCCCAGCACCAUGUUGU
1727	1728	1151-1169	CAACAUGGUGCUGGGGCAG	CUGCCCCAGCACCAUGUUG
1729	1730	1152-1170	AACAUGGUGCUGGGGCAGG	CCUGCCCCAGCACCAUGUU
1731	1732	1153-1171	ACAUGGUGCUGGGGCAGGU	ACCUGCCCCAGCACCAUGU
1733	1734	1154-1172	CAUGGUGCUGGGGCAGGUG	CACCUGCCCCAGCACCAUG
1735	1736	1155-1173	AUGGUGCUGGGGCAGGUGG	CCACCUGCCCCAGCACCAU
1737	1738	1156-1174	UGGUGCUGGGGCAGGUGGU	ACCACCUGCCCCAGCACCA
1739	1740	1157-1175	GGUGCUGGGGCAGGUGGUA	UACCACCUGCCCCAGCACC
1741	1742	1158-1176	GUGCUGGGGCAGGUGGUAC	GUACCACCUGCCCCAGCAC
1743	1744	1159-1177	UGCUGGGGCAGGUGGUACU	AGUACCACCUGCCCCAGCA
1745	1746	1160-1178	GCUGGGGCAGGUGGUACUA	UAGUACCACCUGCCCCAGC
1747	1748	1161-1179	CUGGGGCAGGUGGUACUAG	CUAGUACCACCUGCCCCAG
1749	1750	1162-1180	UGGGGCAGGUGGUACUAGA	UCUAGUACCACCUGCCCCA
1751	1752	1166-1184	GCAGGUGGUACUAGAAAUA	UAUUUCUAGUACCACCUGC
1753	1754	1167-1185	CAGGUGGUACUAGAAAUAU	AUAUUUCUAGUACCACCUG
1755	1756	1168-1186	AGGUGGUACUAGAAAUAUU	AAUAUUUCUAGUACCACCU
1757	1758	1169-1187	GGUGGUACUAGAAAUAUUU	AAAUAUUUCUAGUACCACC
1759	1760	1170-1188	GUGGUACUAGAAAUAUUUC	GAAAUAUUUCUAGUACCAC
1761	1762	1171-1189	UGGUACUAGAAAUAUUUCU	AGAAAUAUUUCUAGUACCA
1763	1764	1172-1190	GGUACUAGAAAUAUUUCUG	CAGAAAUAUUUCUAGUACC
1765	1766	1173-1191	GUACUAGAAAUAUUUCUGG	CCAGAAAUAUUUCUAGUAC
1767	1768	1174-1192	UACUAGAAAUAUUUCUGGA	UCCAGAAAUAUUUCUAGUA
1769	1770	1175-1193	ACUAGAAAUAUUUCUGGAA	UUCCAGAAAUAUUUCUAGU
1771	1772	1176-1194	CUAGAAAUAUUUCUGGAAC	GUUCCAGAAAUAUUUCUAG
1773	1774	1177-1195	UAGAAAUAUUUCUGGAACU	AGUUCCAGAAAUAUUUCUA
1775	1776	1178-1196	AGAAAUAUUUCUGGAACUA	UAGUUCCAGAAAUAUUUCU
1777	1778	1179-1197	GAAAUAUUUCUGGAACUAG	CUAGUUCCAGAAAUAUUUC
1779	1780	1180-1198	AAAUAUUUCUGGAACUAGU	ACUAGUUCCAGAAAUAUUU
1781	1782	1181-1199	AAUAUUUCUGGAACUAGUA	UACUAGUUCCAGAAAUAUU
1783	1784	1183-1201	UAUUUCUGGAACUAGUAAA	UUUACUAGUUCCAGAAAUA
1785	1786	1186-1204	UUCUGGAACUAGUAAAUUC	GAAUUUACUAGUUCCAGAA
1787	1788	1187-1205	UCUGGAACUAGUAAAUUCC	GGAAUUUACUAGUUCCAGA
1789	1790	1189-1207	UGGAACUAGUAAAUUCCAU	AUGGAAUUUACUAGUUCCA
1791	1792	1190-1208	GGAACUAGUAAAUUCCAUG	CAUGGAAUUUACUAGUUCC
1793	1794	1192-1210	AACUAGUAAAUUCCAUGUG	CACAUGGAAUUUACUAGUU
1795	1796	1193-1211	ACUAGUAAAUUCCAUGUGG	CCACAUGGAAUUUACUAGU
1797	1798	1194-1212	CUAGUAAAUUCCAUGUGGA	UCCACAUGGAAUUUACUAG
1799	1800	1195-1213	UAGUAAAUUCCAUGUGGAC	GUCCACAUGGAAUUUACUA
1801	1802	1196-1214	AGUAAAUUCCAUGUGGACU	AGUCCACAUGGAAUUUACU
1803	1804	1197-1215	GUAAAUUCCAUGUGGACUU	AAGUCCACAUGGAAUUUAC
1805	1806	1198-1216	UAAAUUCCAUGUGGACUUA	UAAGUCCACAUGGAAUUUA
1807	1808	1199-1217	AAAUUCCAUGUGGACUUAG	CUAAGUCCACAUGGAAUUU

1809	1810	1200-1218	AAUUCCAUGUGGACUUAGA	UCUAAGUCCACAUGGAAUU
1811	1812	1201-1219	AUUCCAUGUGGACUUAGAG	CUCUAAGUCCACAUGGAAU
1813	1814	1202-1220	UUCCAUGUGGACUUAGAGC	GCUCUAAGUCCACAUGGAA
1815	1816	1222-1240	GGAGCUGGCAGACCUCCAU	AUGGAGGUCUGCCAGCUCC
1817	1818	1223-1241	GAGCUGGCAGACCUCCAUG	CAUGGAGGUCUGCCAGCUC
1819	1820	1224-1242	AGCUGGCAGACCUCCAUGG	CCAUGGAGGUCUGCCAGCU
1821	1822	1225-1243	GCUGGCAGACCUCCAUGGG	CCCAUGGAGGUCUGCCAGC
1823	1824	1226-1244	CUGGCAGACCUCCAUGGGA	UCCCAUGGAGGUCUGCCAG
1825	1826	1227-1245	UGGCAGACCUCCAUGGGAA	UUCCCAUGGAGGUCUGCCA
1827	1828	1228-1246	GGCAGACCUCCAUGGGAAA	UUUCCCAUGGAGGUCUGCC
1829	1830	1229-1247	GCAGACCUCCAUGGGAAAG	CUUUCCCAUGGAGGUCUGC
1831	1832	1230-1248	CAGACCUCCAUGGGAAAGA	UCUUUCCCAUGGAGGUCUG
1833	1834	1231-1249	AGACCUCCAUGGGAAAGAU	AUCUUUCCCAUGGAGGUCU
1835	1836	1232-1250	GACCUCCAUGGGAAAGAUG	CAUCUUUCCCAUGGAGGUC
1837	1838	1233-1251	ACCUCCAUGGGAAAGAUGC	GCAUCUUUCCCAUGGAGGU
1839	1840	1254-1272	CACUCUUGUUUUCCUCGUG	CACGAGGAAAACAAGAGUG
1841	1842	1255-1273	ACUCUUGUUUUCCUCGUGC	GCACGAGGAAAACAAGAGU
1843	1844	1256-1274	CUCUUGUUUUCCUCGUGCU	AGCACGAGGAAAACAAGAG
1845	1846	1257-1275	UCUUGUUUUCCUCGUGCUU	AAGCACGAGGAAAACAAGA
1847	1848	1259-1277	UUGUUUUCCUCGUGCUUUG	CAAAGCACGAGGAAAACAA
1849	1850	1260-1278	UGUUUUCCUCGUGCUUUGU	ACAAAGCACGAGGAAAACA
1851	1852	1261-1279	GUUUUCCUCGUGCUUUGUG	CACAAAGCACGAGGAAAAC
1853	1854	1262-1280	UUUUCCUCGUGCUUUGUGG	CCACAAAGCACGAGGAAAA
1855	1856	1263-1281	UUUCCUCGUGCUUUGUGGC	GCCACAAAGCACGAGGAAA
1857	1858	1264-1282	UUCCUCGUGCUUUGUGGCC	GGCCACAAAGCACGAGGAA
1859	1860	1265-1283	UCCUCGUGCUUUGUGGCCA	UGGCCACAAAGCACGAGGA
1861	1862	1266-1284	CCUCGUGCUUUGUGGCCAA	UUGGCCACAAAGCACGAGG
1863	1864	1267-1285	CUCGUGCUUUGUGGCCAAU	AUUGGCCACAAAGCACGAG
1865	1866	1268-1286	UCGUGCUUUGUGGCCAAUG	CAUUGGCCACAAAGCACGA
1867	1868	1269-1287	CGUGCUUUGUGGCCAAUGA	UCAUUGGCCACAAAGCACG
1869	1870	1270-1288	GUGCUUUGUGGCCAAUGAC	GUCAUUGGCCACAAAGCAC
1871	1872	1271-1289	UGCUUUGUGGCCAAUGACU	AGUCAUUGGCCACAAAGCA
1873	1874	1272-1290	GCUUUGUGGCCAAUGACUC	GAGUCAUUGGCCACAAAGC
1875	1876	1273-1291	CUUUGUGGCCAAUGACUCA	UGAGUCAUUGGCCACAAAG
1877	1878	1274-1292	UUUGUGGCCAAUGACUCAA	UUGAGUCAUUGGCCACAAA
1879	1880	1275-1293	UUGUGGCCAAUGACUCAAC	GUUGAGUCAUUGGCCACAA
1881	1882	1276-1294	UGUGGCCAAUGACUCAACC	GGUUGAGUCAUUGGCCACA
1883	1884	1277-1295	GUGGCCAAUGACUCAACCC	GGGUUGAGUCAUUGGCCAC
1885	1886	1278-1296	UGGCCAAUGACUCAACCCU	AGGGUUGAGUCAUUGGCCA
1887	1888	1279-1297	GGCCAAUGACUCAACCCUC	GAGGGUUGAGUCAUUGGCC
1889	1890	1280-1298	GCCAAUGACUCAACCCUCU	AGAGGGUUGAGUCAUUGGC
1891	1892	1281-1299	CCAAUGACUCAACCCUCUU	AAGAGGGUUGAGUCAUUGG
1893	1894	1282-1300	CAAUGACUCAACCCUCUUC	GAAGAGGGUUGAGUCAUUG
1895	1896	1283-1301	AAUGACUCAACCCUCUUCA	UGAAGAGGGUUGAGUCAUU
1897	1898	1284-1302	AUGACUCAACCCUCUUCAC	GUGAAGAGGGUUGAGUCAU
1899	1900	1285-1303	UGACUCAACCCUCUUCACC	GGUGAAGAGGGUUGAGUCA
1901	1902	1286-1304	GACUCAACCCUCUUCACCC	GGGUGAAGAGGGUUGAGUC
1903	1904	1287-1305	ACUCAACCCUCUUCACCCU	AGGGUGAAGAGGGUUGAGU
1905	1906	1288-1306	CUCAACCCUCUUCACCCUG	CAGGGUGAAGAGGGUUGAG
1907	1908	1289-1307	UCAACCCUCUUCACCCUGG	CCAGGGUGAAGAGGGUUGA

1909	1910	1290-1308	CAACCCUCUUCACCCUGGC	GCCAGGGUGAAGAGGGUUG
1911	1912	1291-1309	AACCCUCUUCACCCUGGCU	AGCCAGGGUGAAGAGGGUU
1913	1914	1292-1310	ACCCUCUUCACCCUGGCUA	UAGCCAGGGUGAAGAGGGU
1915	1916	1293-1311	CCCUCUUCACCCUGGCUAA	UUAGCCAGGGUGAAGAGGG
1917	1918	1294-1312	CCUCUUCACCCUGGCUAAG	CUUAGCCAGGGUGAAGAGG
1919	1920	1297-1315	CUUCACCCUGGCUAAGAUG	CAUCUUAGCCAGGGUGAAG
1921	1922	1298-1316	UUCACCCUGGCUAAGAUGA	UCAUCUUAGCCAGGGUGAA
1923	1924	1300-1318	CACCCUGGCUAAGAUGAUG	CAUCAUCUUAGCCAGGGUG
1925	1926	1301-1319	ACCCUGGCUAAGAUGAUGC	GCAUCAUCUUAGCCAGGGU
1927	1928	1302-1320	CCCUGGCUAAGAUGAUGCC	GGCAUCAUCUUAGCCAGGG
1929	1930	1303-1321	CCUGGCUAAGAUGAUGCCA	UGGCAUCAUCUUAGCCAGG
1931	1932	1304-1322	CUGGCUAAGAUGAUGCCAG	CUGGCAUCAUCUUAGCCAG
1933	1934	1305-1323	UGGCUAAGAUGAUGCCAGG	CCUGGCAUCAUCUUAGCCA
1935	1936	1306-1324	GGCUAAGAUGAUGCCAGGC	GCCUGGCAUCAUCUUAGCC
1937	1938	1307-1325	GCUAAGAUGAUGCCAGGCU	AGCCUGGCAUCAUCUUAGC
1939	1940	1308-1326	CUAAGAUGAUGCCAGGCUG	CAGCCUGGCAUCAUCUUAG
1941	1942	1309-1327	UAAGAUGAUGCCAGGCUGU	ACAGCCUGGCAUCAUCUUA
1943	1944	1310-1328	AAGAUGAUGCCAGGCUGUG	CACAGCCUGGCAUCAUCUU
1945	1946	1311-1329	AGAUGAUGCCAGGCUGUGA	UCACAGCCUGGCAUCAUCU
1947	1948	1312-1330	GAUGAUGCCAGGCUGUGAG	CUCACAGCCUGGCAUCAUC
1949	1950	1313-1331	AUGAUGCCAGGCUGUGAGA	UCUCACAGCCUGGCAUCAU
1951	1952	1314-1332	UGAUGCCAGGCUGUGAGAU	AUCUCACAGCCUGGCAUCA
1953	1954	1316-1334	AUGCCAGGCUGUGAGAUUU	AAAUCUCACAGCCUGGCAU
1955	1956	1317-1335	UGCCAGGCUGUGAGAUUUA	UAAAUCUCACAGCCUGGCA
1957	1958	1318-1336	GCCAGGCUGUGAGAUUUAC	GUAAAUCUCACAGCCUGGC
1959	1960	1319-1337	CCAGGCUGUGAGAUUUACU	AGUAAAUCUCACAGCCUGG
1961	1962	1320-1338	CAGGCUGUGAGAUUUACUC	GAGUAAAUCUCACAGCCUG
1963	1964	1321-1339	AGGCUGUGAGAUUUACUCU	AGAGUAAAUCUCACAGCCU
1965	1966	1322-1340	GGCUGUGAGAUUUACUCUG	CAGAGUAAAUCUCACAGCC
1967	1968	1323-1341	GCUGUGAGAUUUACUCUGA	UCAGAGUAAAUCUCACAGC
1969	1970	1326-1344	GUGAGAUUUACUCUGAUUC	GAAUCAGAGUAAAUCUCAC
1971	1972	1327-1345	UGAGAUUUACUCUGAUUCU	AGAAUCAGAGUAAAUCUCA
1973	1974	1328-1346	GAGAUUUACUCUGAUUCUG	CAGAAUCAGAGUAAAUCUC
1975	1976	1329-1347	AGAUUUACUCUGAUUCUGG	CCAGAAUCAGAGUAAAUCU
1977	1978	1330-1348	GAUUUACUCUGAUUCUGGG	CCCAGAAUCAGAGUAAAUC
1979	1980	1331-1349	AUUUACUCUGAUUCUGGGA	UCCCAGAAUCAGAGUAAAU
1981	1982	1332-1350	UUUACUCUGAUUCUGGGAA	UUCCCAGAAUCAGAGUAAA
1983	1984	1333-1351	UUACUCUGAUUCUGGGAAC	GUUCCCAGAAUCAGAGUAA
1985	1986	1334-1352	UACUCUGAUUCUGGGAACC	GGUUCCCAGAAUCAGAGUA
1987	1988	1335-1353	ACUCUGAUUCUGGGAACCA	UGGUUCCCAGAAUCAGAGU
1989	1990	1336-1354	CUCUGAUUCUGGGAACCAU	AUGGUUCCCAGAAUCAGAG
1991	1992	1337-1355	UCUGAUUCUGGGAACCAUG	CAUGGUUCCCAGAAUCAGA
1993	1994	1338-1356	CUGAUUCUGGGAACCAUGC	GCAUGGUUCCCAGAAUCAG
1995	1996	1339-1357	UGAUUCUGGGAACCAUGCC	GGCAUGGUUCCCAGAAUCA
1997	1998	1340-1358	GAUUCUGGGAACCAUGCCU	AGGCAUGGUUCCCAGAAUC
1999	2000	1341-1359	AUUCUGGGAACCAUGCCUC	GAGGCAUGGUUCCCAGAAU
2001	2002	1342-1360	UUCUGGGAACCAUGCCUCC	GGAGGCAUGGUUCCCAGAA
2003	2004	1343-1361	UCUGGGAACCAUGCCUCCA	UGGAGGCAUGGUUCCCAGA
2005	2006	1344-1362	CUGGGAACCAUGCCUCCAU	AUGGAGGCAUGGUUCCCAG
2007	2008	1345-1363	UGGGAACCAUGCCUCCAUG	CAUGGAGGCAUGGUUCCCA

2009	2010	1346-1364	GGGAACCAUGCCUCCAUGA	UCAUGGAGGCAUGGUUCCC
2011	2012	1348-1366	GAACCAUGCCUCCAUGAUC	GAUCAUGGAGGCAUGGUUC
2013	2014	1349-1367	AACCAUGCCUCCAUGAUCC	GGAUCAUGGAGGCAUGGUU
2015	2016	1350-1368	ACCAUGCCUCCAUGAUCCA	UGGAUCAUGGAGGCAUGGU
2017	2018	1351-1369	CCAUGCCUCCAUGAUCCAA	UUGGAUCAUGGAGGCAUGG
2019	2020	1352-1370	CAUGCCUCCAUGAUCCAAG	CUUGGAUCAUGGAGGCAUG
2021	2022	1353-1371	AUGCCUCCAUGAUCCAAGG	CCUUGGAUCAUGGAGGCAU
2023	2024	1354-1372	UGCCUCCAUGAUCCAAGGG	CCCUUGGAUCAUGGAGGCA
2025	2026	1358-1376	UCCAUGAUCCAAGGGAUUC	GAAUCCCUUGGAUCAUGGA
2027	2028	1359-1377	CCAUGAUCCAAGGGAUUCG	CGAAUCCCUUGGAUCAUGG
2029	2030	1360-1378	CAUGAUCCAAGGGAUUCGA	UCGAAUCCCUUGGAUCAUG
2031	2032	1361-1379	AUGAUCCAAGGGAUUCGAA	UUCGAAUCCCUUGGAUCAU
2033	2034	1362-1380	UGAUCCAAGGGAUUCGAAA	UUUCGAAUCCCUUGGAUCA
2035	2036	1363-1381	GAUCCAAGGGAUUCGAAAC	GUUUCGAAUCCCUUGGAUC
2037	2038	1365-1383	UCCAAGGGAUUCGAAACAG	CUGUUUCGAAUCCCUUGGA
2039	2040	1366-1384	CCAAGGGAUUCGAAACAGC	GCUGUUUCGAAUCCCUUGG
2041	2042	1367-1385	CAAGGGAUUCGAAACAGCC	GGCUGUUUCGAAUCCCUUG
2043	2044	1368-1386	AAGGGAUUCGAAACAGCCG	CGGCUGUUUCGAAUCCCUU
2045	2046	1369-1387	AGGGAUUCGAAACAGCCGA	UCGGCUGUUUCGAAUCCCU
2047	2048	1370-1388	GGGAUUCGAAACAGCCGAG	CUCGGCUGUUUCGAAUCCC
2049	2050	1371-1389	GGAUUCGAAACAGCCGAGU	ACUCGGCUGUUUCGAAUCC
2051	2052	1372-1390	GAUUCGAAACAGCCGAGUG	CACUCGGCUGUUUCGAAUC
2053	2054	1373-1391	AUUCGAAACAGCCGAGUGC	GCACUCGGCUGUUUCGAAU
2055	2056	1374-1392	UUCGAAACAGCCGAGUGCC	GGCACUCGGCUGUUUCGAA
2057	2058	1375-1393	UCGAAACAGCCGAGUGCCA	UGGCACUCGGCUGUUUCGA
2059	2060	1376-1394	CGAAACAGCCGAGUGCCAA	UUGGCACUCGGCUGUUUCG
2061	2062	1377-1395	GAAACAGCCGAGUGCCAAA	UUUGGCACUCGGCUGUUUC
2063	2064	1378-1396	AAACAGCCGAGUGCCAAAG	CUUUGGCACUCGGCUGUUU
2065	2066	1379-1397	AACAGCCGAGUGCCAAAGU	ACUUUGGCACUCGGCUGUU
2067	2068	1380-1398	ACAGCCGAGUGCCAAAGUA	UACUUUGGCACUCGGCUGU
2069	2070	1381-1399	CAGCCGAGUGCCAAAGUAC	GUACUUUGGCACUCGGCUG
2071	2072	1383-1401	GCCGAGUGCCAAAGUACAU	AUGUACUUUGGCACUCGGC
2073	2074	1384-1402	CCGAGUGCCAAAGUACAUC	GAUGUACUUUGGCACUCGG
2075	2076	1385-1403	CGAGUGCCAAAGUACAUCU	AGAUGUACUUUGGCACUCG
2077	2078	1386-1404	GAGUGCCAAAGUACAUCUU	AAGAUGUACUUUGGCACUC
2079	2080	1387-1405	AGUGCCAAAGUACAUCUUC	GAAGAUGUACUUUGGCACU
2081	2082	1388-1406	GUGCCAAAGUACAUCUUCC	GGAAGAUGUACUUUGGCAC
2083	2084	1389-1407	UGCCAAAGUACAUCUUCCG	CGGAAGAUGUACUUUGGCA
2085	2086	1390-1408	GCCAAAGUACAUCUUCCGC	GCGGAAGAUGUACUUUGGC
2087	2088	1391-1409	CCAAAGUACAUCUUCCGCC	GGCGGAAGAUGUACUUUGG
2089	2090	1392-1410	CAAAGUACAUCUUCCGCCA	UGGCGGAAGAUGUACUUUG
2091	2092	1393-1411	AAAGUACAUCUUCCGCCAC	GUGGCGGAAGAUGUACUUU
2093	2094	1394-1412	AAGUACAUCUUCCGCCACA	UGUGGCGGAAGAUGUACUU
2095	2096	1395-1413	AGUACAUCUUCCGCCACAA	UUGUGGCGGAAGAUGUACU
2097	2098	1396-1414	GUACAUCUUCCGCCACAAU	AUUGUGGCGGAAGAUGUAC
2099	2100	1397-1415	UACAUCUUCCGCCACAAUG	CAUUGUGGCGGAAGAUGUA
2101	2102	1398-1416	ACAUCUUCCGCCACAAUGA	UCAUUGUGGCGGAAGAUGU
2103	2104	1399-1417	CAUCUUCCGCCACAAUGAU	AUCAUUGUGGCGGAAGAUG
2105	2106	1400-1418	AUCUUCCGCCACAAUGAUG	CAUCAUUGUGGCGGAAGAU
2107	2108	1401-1419	UCUUCCGCCACAAUGAUGU	ACAUCAUUGUGGCGGAAGA

2109	2110	1402-1420	CUUCCGCCACAAUGAUGUC	GACAUCAUUGUGGCGGAAG
2111	2112	1403-1421	UUCCGCCACAAUGAUGUCA	UGACAUCAUUGUGGCGGAA
2113	2114	1404-1422	UCCGCCACAAUGAUGUCAG	CUGACAUCAUUGUGGCGGA
2115	2116	1405-1423	CCGCCACAAUGAUGUCAGC	GCUGACAUCAUUGUGGCGG
2117	2118	1406-1424	CGCCACAAUGAUGUCAGCC	GGCUGACAUCAUUGUGGCG
2119	2120	1407-1425	GCCACAAUGAUGUCAGCCA	UGGCUGACAUCAUUGUGGC
2121	2122	1427-1445	CUCAGAGAACUGCUGCAAA	UUUGCAGCAGUUCUCUGAG
2123	2124	1428-1446	UCAGAGAACUGCUGCAAAG	CUUUGCAGCAGUUCUCUGA
2125	2126	1429-1447	CAGAGAACUGCUGCAAAGA	UCUUUGCAGCAGUUCUCUG
2127	2128	1430-1448	AGAGAACUGCUGCAAAGAU	AUCUUUGCAGCAGUUCUCU
2129	2130	1431-1449	GAGAACUGCUGCAAAGAUC	GAUCUUUGCAGCAGUUCUC
2131	2132	1432-1450	AGAACUGCUGCAAAGAUCU	AGAUCUUUGCAGCAGUUCU
2133	2134	1433-1451	GAACUGCUGCAAAGAUCUG	CAGAUCUUUGCAGCAGUUC
2135	2136	1434-1452	AACUGCUGCAAAGAUCUGA	UCAGAUCUUUGCAGCAGUU
2137	2138	1435-1453	ACUGCUGCAAAGAUCUGAC	GUCAGAUCUUUGCAGCAGU
2139	2140	1436-1454	CUGCUGCAAAGAUCUGACC	GGUCAGAUCUUUGCAGCAG
2141	2142	1437-1455	UGCUGCAAAGAUCUGACCC	GGGUCAGAUCUUUGCAGCA
2143	2144	1457-1475	UCAGUCCCCAAGAUUGUGG	CCACAAUCUUGGGGACUGA
2145	2146	1458-1476	CAGUCCCCAAGAUUGUGGC	GCCACAAUCUUGGGGACUG
2147	2148	1459-1477	AGUCCCCAAGAUUGUGGCA	UGCCACAAUCUUGGGGACU
2149	2150	1461-1479	UCCCCAAGAUUGUGGCAUU	AAUGCCACAAUCUUGGGGA
2151	2152	1462-1480	CCCCAAGAUUGUGGCAUUU	AAAUGCCACAAUCUUGGGG
2153	2154	1463-1481	CCCAAGAUUGUGGCAUUUG	CAAAUGCCACAAUCUUGGG
2155	2156	1464-1482	CCAAGAUUGUGGCAUUUGA	UCAAAUGCCACAAUCUUGG
2157	2158	1465-1483	CAAGAUUGUGGCAUUUGAA	UUCAAAUGCCACAAUCUUG
2159	2160	1466-1484	AAGAUUGUGGCAUUUGAAA	UUUCAAAUGCCACAAUCUU
2161	2162	1467-1485	AGAUUGUGGCAUUUGAAAC	GUUUCAAAUGCCACAAUCU
2163	2164	1468-1486	GAUUGUGGCAUUUGAAACU	AGUUUCAAAUGCCACAAUC
2165	2166	1469-1487	AUUGUGGCAUUUGAAACUG	CAGUUUCAAAUGCCACAAU
2167	2168	1470-1488	UUGUGGCAUUUGAAACUGU	ACAGUUUCAAAUGCCACAA
2169	2170	1471-1489	UGUGGCAUUUGAAACUGUC	GACAGUUUCAAAUGCCACA
2171	2172	1472-1490	GUGGCAUUUGAAACUGUCC	GGACAGUUUCAAAUGCCAC
2173	2174	1473-1491	UGGCAUUUGAAACUGUCCA	UGGACAGUUUCAAAUGCCA
2175	2176	1474-1492	GGCAUUUGAAACUGUCCAU	AUGGACAGUUUCAAAUGCC
2177	2178	1475-1493	GCAUUUGAAACUGUCCAUU	AAUGGACAGUUUCAAAUGC
2179	2180	1476-1494	CAUUUGAAACUGUCCAUUC	GAAUGGACAGUUUCAAAUG
2181	2182	1477-1495	AUUUGAAACUGUCCAUUCA	UGAAUGGACAGUUUCAAAU
2183	2184	1479-1497	UUGAAACUGUCCAUUCAAU	AUUGAAUGGACAGUUUCAA
2185	2186	1480-1498	UGAAACUGUCCAUUCAAUG	CAUUGAAUGGACAGUUUCA
2187	2188	1481-1499	GAAACUGUCCAUUCAAUGG	CCAUUGAAUGGACAGUUUC
2189	2190	1482-1500	AAACUGUCCAUUCAAUGGA	UCCAUUGAAUGGACAGUUU
2191	2192	1483-1501	AACUGUCCAUUCAAUGGAU	AUCCAUUGAAUGGACAGUU
2193	2194	1484-1502	ACUGUCCAUUCAAUGGAUG	CAUCCAUUGAAUGGACAGU
2195	2196	1485-1503	CUGUCCAUUCAAUGGAUGG	CCAUCCAUUGAAUGGACAG
2197	2198	1486-1504	UGUCCAUUCAAUGGAUGGG	CCCAUCCAUUGAAUGGACA
2199	2200	1487-1505	GUCCAUUCAAUGGAUGGGG	CCCCAUCCAUUGAAUGGAC
2201	2202	1488-1506	UCCAUUCAAUGGAUGGGGC	GCCCCAUCCAUUGAAUGGA
2203	2204	1508-1526	GUGUGCCCACUGGAAGAGC	GCUCUUCCAGUGGGCACAC
2205	2206	1509-1527	UGUGCCCACUGGAAGAGCU	AGCUCUUCCAGUGGGCACA
2207	2208	1510-1528	GUGCCCACUGGAAGAGCUG	CAGCUCUUCCAGUGGGCAC

2209	2210	1511-1529	UGCCCACUGGAAGAGCUGU	ACAGCUCUUCCAGUGGGCA
2211	2212	1512-1530	GCCCACUGGAAGAGCUGUG	CACAGCUCUUCCAGUGGGC
2213	2214	1513-1531	CCCACUGGAAGAGCUGUGU	ACACAGCUCUUCCAGUGGG
2215	2216	1514-1532	CCACUGGAAGAGCUGUGUG	CACACAGCUCUUCCAGUGG
2217	2218	1515-1533	CACUGGAAGAGCUGUGUGA	UCACACAGCUCUUCCAGUG
2219	2220	1516-1534	ACUGGAAGAGCUGUGUGAU	AUCACACAGCUCUUCCAGU
2221	2222	1517-1535	CUGGAAGAGCUGUGUGAUG	CAUCACACAGCUCUUCCAG
2223	2224	1518-1536	UGGAAGAGCUGUGUGAUGU	ACAUCACACAGCUCUUCCA
2225	2226	1519-1537	GGAAGAGCUGUGUGAUGUG	CACAUCACACAGCUCUUCC
2227	2228	1520-1538	GAAGAGCUGUGUGAUGUGG	CCACAUCACACAGCUCUUC
2229	2230	1521-1539	AAGAGCUGUGUGAUGUGGC	GCCACAUCACACAGCUCUU
2231	2232	1522-1540	AGAGCUGUGUGAUGUGGCC	GGCCACAUCACACAGCUCU
2233	2234	1523-1541	GAGCUGUGUGAUGUGGCCC	GGGCCACAUCACACAGCUC
2235	2236	1524-1542	AGCUGUGUGAUGUGGCCCA	UGGGCCACAUCACACAGCU
2237	2238	1525-1543	GCUGUGUGAUGUGGCCCAU	AUGGGCCACAUCACACAGC
2239	2240	1526-1544	CUGUGUGAUGUGGCCCAUG	CAUGGGCCACAUCACACAG
2241	2242	1527-1545	UGUGUGAUGUGGCCCAUGA	UCAUGGGCCACAUCACACA
2243	2244	1528-1546	GUGUGAUGUGGCCCAUGAG	CUCAUGGGCCACAUCACAC
2245	2246	1529-1547	UGUGAUGUGGCCCAUGAGU	ACUCAUGGGCCACAUCACA
2247	2248	1532-1550	GAUGUGGCCCAUGAGUUUG	CAAACUCAUGGGCCACAUC
2249	2250	1533-1551	AUGUGGCCCAUGAGUUUGG	CCAAACUCAUGGGCCACAU
2251	2252	1534-1552	UGUGGCCCAUGAGUUUGGA	UCCAAACUCAUGGGCCACA
2253	2254	1535-1553	GUGGCCCAUGAGUUUGGAG	CUCCAAACUCAUGGGCCAC
2255	2256	1536-1554	UGGCCCAUGAGUUUGGAGC	GCUCCAAACUCAUGGGCCA
2257	2258	1537-1555	GGCCCAUGAGUUUGGAGCA	UGCUCCAAACUCAUGGGCC
2259	2260	1538-1556	GCCCAUGAGUUUGGAGCAA	UUGCUCCAAACUCAUGGGC
2261	2262	1539-1557	CCCAUGAGUUUGGAGCAAU	AUUGCUCCAAACUCAUGGG
2263	2264	1540-1558	CCAUGAGUUUGGAGCAAUC	GAUUGCUCCAAACUCAUGG
2265	2266	1542-1560	AUGAGUUUGGAGCAAUCAC	GUGAUUGCUCCAAACUCAU
2267	2268	1543-1561	UGAGUUUGGAGCAAUCACC	GGUGAUUGCUCCAAACUCA
2269	2270	1545-1563	AGUUUGGAGCAAUCACCUU	AAGGUGAUUGCUCCAAACU
2271	2272	1546-1564	GUUUGGAGCAAUCACCUUC	GAAGGUGAUUGCUCCAAAC
2273	2274	1547-1565	UUUGGAGCAAUCACCUUCG	CGAAGGUGAUUGCUCCAAA
2275	2276	1548-1566	UUGGAGCAAUCACCUUCGU	ACGAAGGUGAUUGCUCCAA
2277	2278	1549-1567	UGGAGCAAUCACCUUCGUG	CACGAAGGUGAUUGCUCCA
2279	2280	1550-1568	GGAGCAAUCACCUUCGUGG	CCACGAAGGUGAUUGCUCC
2281	2282	1551-1569	GAGCAAUCACCUUCGUGGA	UCCACGAAGGUGAUUGCUC
2283	2284	1552-1570	AGCAAUCACCUUCGUGGAU	AUCCACGAAGGUGAUUGCU
2285	2286	1553-1571	GCAAUCACCUUCGUGGAUG	CAUCCACGAAGGUGAUUGC
2287	2288	1554-1572	CAAUCACCUUCGUGGAUGA	UCAUCCACGAAGGUGAUUG
2289	2290	1555-1573	AAUCACCUUCGUGGAUGAG	CUCAUCCACGAAGGUGAUU
2291	2292	1556-1574	AUCACCUUCGUGGAUGAGG	CCUCAUCCACGAAGGUGAU
2293	2294	1557-1575	UCACCUUCGUGGAUGAGGU	ACCUCAUCCACGAAGGUGA
2295	2296	1558-1576	CACCUUCGUGGAUGAGGUC	GACCUCAUCCACGAAGGUG
2297	2298	1559-1577	ACCUUCGUGGAUGAGGUCC	GGACCUCAUCCACGAAGGU
2299	2300	1560-1578	CCUUCGUGGAUGAGGUCCA	UGGACCUCAUCCACGAAGG
2301	2302	1561-1579	CUUCGUGGAUGAGGUCCAC	GUGGACCUCAUCCACGAAG
2303	2304	1562-1580	UUCGUGGAUGAGGUCCACG	CGUGGACCUCAUCCACGAA
2305	2306	1563-1581	UCGUGGAUGAGGUCCACGC	GCGUGGACCUCAUCCACGA
2307	2308	1564-1582	CGUGGAUGAGGUCCACGCA	UGCGUGGACCUCAUCCACG

2309	2310	1565-1583	GUGGAUGAGGUCCACGCAG	CUGCGUGGACCUCAUCCAC
2311	2312	1566-1584	UGGAUGAGGUCCACGCAGU	ACUGCGUGGACCUCAUCCA
2313	2314	1567-1585	GGAUGAGGUCCACGCAGUG	CACUGCGUGGACCUCAUCC
2315	2316	1568-1586	GAUGAGGUCCACGCAGUGG	CCACUGCGUGGACCUCAUC
2317	2318	1569-1587	AUGAGGUCCACGCAGUGGG	CCCACUGCGUGGACCUCAU
2319	2320	1570-1588	UGAGGUCCACGCAGUGGGG	CCCCACUGCGUGGACCUCA
2321	2322	1571-1589	GAGGUCCACGCAGUGGGGC	GCCCCACUGCGUGGACCUC
2323	2324	1572-1590	AGGUCCACGCAGUGGGGCU	AGCCCCACUGCGUGGACCU
2325	2326	1595-1613	GGGGCUCGAGGCGGAGGGA	UCCCUCCGCCUCGAGCCCC
2327	2328	1596-1614	GGGCUCGAGGCGGAGGGAU	AUCCCUCCGCCUCGAGCCC
2329	2330	1597-1615	GGCUCGAGGCGGAGGGAUU	AAUCCCUCCGCCUCGAGCC
2331	2332	1598-1616	GCUCGAGGCGGAGGGAUUG	CAAUCCCUCCGCCUCGAGC
2333	2334	1599-1617	CUCGAGGCGGAGGGAUUGG	CCAAUCCCUCCGCCUCGAG
2335	2336	1600-1618	UCGAGGCGGAGGGAUUGGG	CCCAAUCCCUCCGCCUCGA
2337	2338	1601-1619	CGAGGCGGAGGGAUUGGGG	CCCCAAUCCCUCCGCCUCG
2339	2340	1602-1620	GAGGCGGAGGGAUUGGGGA	UCCCCAAUCCCUCCGCCUC
2341	2342	1603-1621	AGGCGGAGGGAUUGGGGAU	AUCCCCAAUCCCUCCGCCU
2343	2344	1604-1622	GGCGGAGGGAUUGGGGAUC	GAUCCCCAAUCCCUCCGCC
2345	2346	1605-1623	GCGGAGGGAUUGGGGAUCG	CGAUCCCCAAUCCCUCCGC
2347	2348	1606-1624	CGGAGGGAUUGGGGAUCGG	CCGAUCCCCAAUCCCUCCG
2349	2350	1607-1625	GGAGGGAUUGGGGAUCGGG	CCCGAUCCCCAAUCCCUCC
2351	2352	1608-1626	GAGGGAUUGGGGAUCGGGA	UCCCGAUCCCCAAUCCCUC
2353	2354	1609-1627	AGGGAUUGGGGAUCGGGAU	AUCCCGAUCCCCAAUCCCU
2355	2356	1610-1628	GGGAUUGGGGAUCGGGAUG	CAUCCCGAUCCCCAAUCCC
2357	2358	1611-1629	GGAUUGGGGAUCGGGAUGG	CCAUCCCGAUCCCCAAUCC
2359	2360	1612-1630	GAUUGGGGAUCGGGAUGGA	UCCAUCCCGAUCCCCAAUC
2361	2362	1613-1631	AUUGGGGAUCGGGAUGGAG	CUCCAUCCCGAUCCCCAAU
2363	2364	1614-1632	UUGGGGAUCGGGAUGGAGU	ACUCCAUCCCGAUCCCCAA
2365	2366	1615-1633	UGGGGAUCGGGAUGGAGUC	GACUCCAUCCCGAUCCCCA
2367	2368	1617-1635	GGGAUCGGGAUGGAGUCAU	AUGACUCCAUCCCGAUCCC
2369	2370	1618-1636	GGAUCGGGAUGGAGUCAUG	CAUGACUCCAUCCCGAUCC
2371	2372	1619-1637	GAUCGGGAUGGAGUCAUGC	GCAUGACUCCAUCCCGAUC
2373	2374	1620-1638	AUCGGGAUGGAGUCAUGCC	GGCAUGACUCCAUCCCGAU
2375	2376	1621-1639	UCGGGAUGGAGUCAUGCCA	UGGCAUGACUCCAUCCCGA
2377	2378	1622-1640	CGGGAUGGAGUCAUGCCAA	UUGGCAUGACUCCAUCCCG
2379	2380	1623-1641	GGGAUGGAGUCAUGCCAAA	UUUGGCAUGACUCCAUCCC
2381	2382	1624-1642	GGAUGGAGUCAUGCCAAAA	UUUUGGCAUGACUCCAUCC
2383	2384	1625-1643	GAUGGAGUCAUGCCAAAAA	UUUUUGGCAUGACUCCAUC
2385	2386	1626-1644	AUGGAGUCAUGCCAAAAAU	AUUUUUGGCAUGACUCCAU
2387	2388	1627-1645	UGGAGUCAUGCCAAAAAUG	CAUUUUUGGCAUGACUCCA
2389	2390	1628-1646	GGAGUCAUGCCAAAAAUGG	CCAUUUUUGGCAUGACUCC
2391	2392	1629-1647	GAGUCAUGCCAAAAAUGGA	UCCAUUUUUGGCAUGACUC
2393	2394	1630-1648	AGUCAUGCCAAAAAUGGAC	GUCCAUUUUUGGCAUGACU
2395	2396	1632-1650	UCAUGCCAAAAAUGGACAU	AUGUCCAUUUUUGGCAUGA
2397	2398	1633-1651	CAUGCCAAAAAUGGACAUC	GAUGUCCAUUUUUGGCAUG
2399	2400	1636-1654	GCCAAAAAUGGACAUCAUU	AAUGAUGUCCAUUUUUGGC
2401	2402	1638-1656	CAAAAAUGGACAUCAUUUC	GAAAUGAUGUCCAUUUUUG
2403	2404	1639-1657	AAAAAUGGACAUCAUUUCU	AGAAAUGAUGUCCAUUUUU
2405	2406	1640-1658	AAAAUGGACAUCAUUUCUG	CAGAAAUGAUGUCCAUUUU
2407	2408	1641-1659	AAAUGGACAUCAUUUCUGG	CCAGAAAUGAUGUCCAUUU

2409	2410	1642-1660	AAUGGACAUCAUUUCUGGA	UCCAGAAAUGAUGUCCAUU
2411	2412	1643-1661	AUGGACAUCAUUUCUGGAA	UUCCAGAAAUGAUGUCCAU
2413	2414	1644-1662	UGGACAUCAUUUCUGGAAC	GUUCCAGAAAUGAUGUCCA
2415	2416	1645-1663	GGACAUCAUUUCUGGAACA	UGUUCCAGAAAUGAUGUCC
2417	2418	1646-1664	GACAUCAUUUCUGGAACAC	GUGUUCCAGAAAUGAUGUC
2419	2420	1647-1665	ACAUCAUUUCUGGAACACU	AGUGUUCCAGAAAUGAUGU
2421	2422	1648-1666	CAUCAUUUCUGGAACACUU	AAGUGUUCCAGAAAUGAUG
2423	2424	1649-1667	AUCAUUUCUGGAACACUUG	CAAGUGUUCCAGAAAUGAU
2425	2426	1650-1668	UCAUUUCUGGAACACUUGG	CCAAGUGUUCCAGAAAUGA
2427	2428	1651-1669	CAUUUCUGGAACACUUGGC	GCCAAGUGUUCCAGAAAUG
2429	2430	1652-1670	AUUUCUGGAACACUUGGCA	UGCCAAGUGUUCCAGAAAU
2431	2432	1653-1671	UUUCUGGAACACUUGGCAA	UUGCCAAGUGUUCCAGAAA
2433	2434	1654-1672	UUCUGGAACACUUGGCAAA	UUUGCCAAGUGUUCCAGAA
2435	2436	1655-1673	UCUGGAACACUUGGCAAAG	CUUUGCCAAGUGUUCCAGA
2437	2438	1656-1674	CUGGAACACUUGGCAAAGC	GCUUUGCCAAGUGUUCCAG
2439	2440	1657-1675	UGGAACACUUGGCAAAGCC	GGCUUUGCCAAGUGUUCCA
2441	2442	1658-1676	GGAACACUUGGCAAAGCCU	AGGCUUUGCCAAGUGUUCC
2443	2444	1659-1677	GAACACUUGGCAAAGCCUU	AAGGCUUUGCCAAGUGUUC
2445	2446	1660-1678	AACACUUGGCAAAGCCUUU	AAAGGCUUUGCCAAGUGUU
2447	2448	1661-1679	ACACUUGGCAAAGCCUUUG	CAAAGGCUUUGCCAAGUGU
2449	2450	1662-1680	CACUUGGCAAAGCCUUUGG	CCAAAGGCUUUGCCAAGUG
2451	2452	1682-1700	UGUGUUGGAGGGUACAUCG	CGAUGUACCCUCCAACACA
2453	2454	1683-1701	GUGUUGGAGGGUACAUCGC	GCGAUGUACCCUCCAACAC
2455	2456	1684-1702	UGUUGGAGGGUACAUCGCC	GGCGAUGUACCCUCCAACA
2457	2458	1685-1703	GUUGGAGGGUACAUCGCCA	UGGCGAUGUACCCUCCAAC
2459	2460	1686-1704	UUGGAGGGUACAUCGCCAG	CUGGCGAUGUACCCUCCAA
2461	2462	1687-1705	UGGAGGGUACAUCGCCAGC	GCUGGCGAUGUACCCUCCA
2463	2464	1688-1706	GGAGGGUACAUCGCCAGCA	UGCUGGCGAUGUACCCUCC
2465	2466	1689-1707	GAGGGUACAUCGCCAGCAC	GUGCUGGCGAUGUACCCUC
2467	2468	1690-1708	AGGGUACAUCGCCAGCACG	CGUGCUGGCGAUGUACCCU
2469	2470	1691-1709	GGGUACAUCGCCAGCACGA	UCGUGCUGGCGAUGUACCC
2471	2472	1692-1710	GGUACAUCGCCAGCACGAG	CUCGUGCUGGCGAUGUACC
2473	2474	1693-1711	GUACAUCGCCAGCACGAGU	ACUCGUGCUGGCGAUGUAC
2475	2476	1694-1712	UACAUCGCCAGCACGAGUU	AACUCGUGCUGGCGAUGUA
2477	2478	1695-1713	ACAUCGCCAGCACGAGUUC	GAACUCGUGCUGGCGAUGU
2479	2480	1696-1714	CAUCGCCAGCACGAGUUCU	AGAACUCGUGCUGGCGAUG
2481	2482	1697-1715	AUCGCCAGCACGAGUUCUC	GAGAACUCGUGCUGGCGAU
2483	2484	1698-1716	UCGCCAGCACGAGUUCUCU	AGAGAACUCGUGCUGGCGA
2485	2486	1699-1717	CGCCAGCACGAGUUCUCUG	CAGAGAACUCGUGCUGGCG
2487	2488	1700-1718	GCCAGCACGAGUUCUCUGA	UCAGAGAACUCGUGCUGGC
2489	2490	1701-1719	CCAGCACGAGUUCUCUGAU	AUCAGAGAACUCGUGCUGG
2491	2492	1702-1720	CAGCACGAGUUCUCUGAUU	AAUCAGAGAACUCGUGCUG
2493	2494	1703-1721	AGCACGAGUUCUCUGAUUG	CAAUCAGAGAACUCGUGCU
2495	2496	1704-1722	GCACGAGUUCUCUGAUUGA	UCAAUCAGAGAACUCGUGC
2497	2498	1705-1723	CACGAGUUCUCUGAUUGAC	GUCAAUCAGAGAACUCGUG
2499	2500	1707-1725	CGAGUUCUCUGAUUGACAC	GUGUCAAUCAGAGAACUCG
2501	2502	1727-1745	GUACGGUCCUAUGCUGCUG	CAGCAGCAUAGGACCGUAC
2503	2504	1728-1746	UACGGUCCUAUGCUGCUGG	CCAGCAGCAUAGGACCGUA
2505	2506	1729-1747	ACGGUCCUAUGCUGCUGGC	GCCAGCAGCAUAGGACCGU
2507	2508	1730-1748	CGGUCCUAUGCUGCUGGCU	AGCCAGCAGCAUAGGACCG

2509	2510	1731-1749	GGUCCUAUGCUGCUGGCUU	AAGCCAGCAGCAUAGGACC
2511	2512	1732-1750	GUCCUAUGCUGCUGGCUUC	GAAGCCAGCAGCAUAGGAC
2513	2514	1733-1751	UCCUAUGCUGCUGGCUUCA	UGAAGCCAGCAGCAUAGGA
2515	2516	1734-1752	CCUAUGCUGCUGGCUUCAU	AUGAAGCCAGCAGCAUAGG
2517	2518	1735-1753	CUAUGCUGCUGGCUUCAUC	GAUGAAGCCAGCAGCAUAG
2519	2520	1736-1754	UAUGCUGCUGGCUUCAUCU	AGAUGAAGCCAGCAGCAUA
2521	2522	1737-1755	AUGCUGCUGGCUUCAUCUU	AAGAUGAAGCCAGCAGCAU
2523	2524	1738-1756	UGCUGCUGGCUUCAUCUUC	GAAGAUGAAGCCAGCAGCA
2525	2526	1739-1757	GCUGCUGGCUUCAUCUUCA	UGAAGAUGAAGCCAGCAGC
2527	2528	1740-1758	CUGCUGGCUUCAUCUUCAC	GUGAAGAUGAAGCCAGCAG
2529	2530	1741-1759	UGCUGGCUUCAUCUUCACC	GGUGAAGAUGAAGCCAGCA
2531	2532	1742-1760	GCUGGCUUCAUCUUCACCA	UGGUGAAGAUGAAGCCAGC
2533	2534	1743-1761	CUGGCUUCAUCUUCACCAC	GUGGUGAAGAUGAAGCCAG
2535	2536	1744-1762	UGGCUUCAUCUUCACCACC	GGUGGUGAAGAUGAAGCCA
2537	2538	1745-1763	GGCUUCAUCUUCACCACCU	AGGUGGUGAAGAUGAAGCC
2539	2540	1746-1764	GCUUCAUCUUCACCACCUC	GAGGUGGUGAAGAUGAAGC
2541	2542	1747-1765	CUUCAUCUUCACCACCUCU	AGAGGUGGUGAAGAUGAAG
2543	2544	1748-1766	UUCAUCUUCACCACCUCUC	GAGAGGUGGUGAAGAUGAA
2545	2546	1749-1767	UCAUCUUCACCACCUCUCU	AGAGAGGUGGUGAAGAUGA
2547	2548	1750-1768	CAUCUUCACCACCUCUCUG	CAGAGAGGUGGUGAAGAUG
2549	2550	1751-1769	AUCUUCACCACCUCUCUGC	GCAGAGAGGUGGUGAAGAU
2551	2552	1752-1770	UCUUCACCACCUCUCUGCC	GGCAGAGAGGUGGUGAAGA
2553	2554	1753-1771	CUUCACCACCUCUCUGCCA	UGGCAGAGAGGUGGUGAAG
2555	2556	1754-1772	UUCACCACCUCUCUGCCAC	GUGGCAGAGAGGUGGUGAA
2557	2558	1755-1773	UCACCACCUCUCUGCCACC	GGUGGCAGAGAGGUGGUGA
2559	2560	1756-1774	CACCACCUCUCUGCCACCC	GGGUGGCAGAGAGGUGGUG
2561	2562	1757-1775	ACCACCUCUCUGCCACCCA	UGGGUGGCAGAGAGGUGGU
2563	2564	1758-1776	CCACCUCUCUGCCACCCAU	AUGGGUGGCAGAGAGGUGG
2565	2566	1759-1777	CACCUCUCUGCCACCCAUG	CAUGGGUGGCAGAGAGGUG
2567	2568	1760-1778	ACCUCUCUGCCACCCAUGC	GCAUGGGUGGCAGAGAGGU
2569	2570	1761-1779	CCUCUCUGCCACCCAUGCU	AGCAUGGGUGGCAGAGAGG
2571	2572	1762-1780	CUCUCUGCCACCCAUGCUG	CAGCAUGGGUGGCAGAGAG
2573	2574	1763-1781	UCUCUGCCACCCAUGCUGC	GCAGCAUGGGUGGCAGAGA
2575	2576	1764-1782	CUCUGCCACCCAUGCUGCU	AGCAGCAUGGGUGGCAGAG
2577	2578	1765-1783	UCUGCCACCCAUGCUGCUG	CAGCAGCAUGGGUGGCAGA
2579	2580	1766-1784	CUGCCACCCAUGCUGCUGG	CCAGCAGCAUGGGUGGCAG
2581	2582	1767-1785	UGCCACCCAUGCUGCUGGC	GCCAGCAGCAUGGGUGGCA
2583	2584	1768-1786	GCCACCCAUGCUGCUGGCU	AGCCAGCAGCAUGGGUGGC
2585	2586	1769-1787	CCACCCAUGCUGCUGGCUG	CAGCCAGCAGCAUGGGUGG
2587	2588	1770-1788	CACCCAUGCUGCUGGCUGG	CCAGCCAGCAGCAUGGGUG
2589	2590	1771-1789	ACCCAUGCUGCUGGCUGGA	UCCAGCCAGCAGCAUGGGU
2591	2592	1772-1790	CCCAUGCUGCUGGCUGGAG	CUCCAGCCAGCAGCAUGGG
2593	2594	1773-1791	CCAUGCUGCUGGCUGGAGC	GCUCCAGCCAGCAGCAUGG
2595	2596	1774-1792	CAUGCUGCUGGCUGGAGCC	GGCUCCAGCCAGCAGCAUG
2597	2598	1775-1793	AUGCUGCUGGCUGGAGCCC	GGGCUCCAGCCAGCAGCAU
2599	2600	1776-1794	UGCUGCUGGCUGGAGCCCU	AGGGCUCCAGCCAGCAGCA
2601	2602	1777-1795	GCUGCUGGCUGGAGCCCUG	CAGGGCUCCAGCCAGCAGC
2603	2604	1778-1796	CUGCUGGCUGGAGCCCUGG	CCAGGGCUCCAGCCAGCAG
2605	2606	1779-1797	UGCUGGCUGGAGCCCUGGA	UCCAGGGCUCCAGCCAGCA
2607	2608	1780-1798	GCUGGCUGGAGCCCUGGAG	CUCCAGGGCUCCAGCCAGC

2609	2610	1781-1799	CUGGCUGGAGCCCUGGAGU	ACUCCAGGGCUCCAGCCAG
2611	2612	1782-1800	UGGCUGGAGCCCUGGAGUC	GACUCCAGGGCUCCAGCCA
2613	2614	1783-1801	GGCUGGAGCCCUGGAGUCU	AGACUCCAGGGCUCCAGCC
2615	2616	1784-1802	GCUGGAGCCCUGGAGUCUG	CAGACUCCAGGGCUCCAGC
2617	2618	1785-1803	CUGGAGCCCUGGAGUCUGU	ACAGACUCCAGGGCUCCAG
2619	2620	1786-1804	UGGAGCCCUGGAGUCUGUG	CACAGACUCCAGGGCUCCA
2621	2622	1787-1805	GGAGCCCUGGAGUCUGUGC	GCACAGACUCCAGGGCUCC
2623	2624	1788-1806	GAGCCCUGGAGUCUGUGCG	CGCACAGACUCCAGGGCUC
2625	2626	1789-1807	AGCCCUGGAGUCUGUGCGG	CCGCACAGACUCCAGGGCU
2627	2628	1790-1808	GCCCUGGAGUCUGUGCGGA	UCCGCACAGACUCCAGGGC
2629	2630	1792-1810	CCUGGAGUCUGUGCGGAUC	GAUCCGCACAGACUCCAGG
2631	2632	1793-1811	CUGGAGUCUGUGCGGAUCC	GGAUCCGCACAGACUCCAG
2633	2634	1795-1813	GGAGUCUGUGCGGAUCCUG	CAGGAUCCGCACAGACUCC
2635	2636	1796-1814	GAGUCUGUGCGGAUCCUGA	UCAGGAUCCGCACAGACUC
2637	2638	1797-1815	AGUCUGUGCGGAUCCUGAA	UUCAGGAUCCGCACAGACU
2639	2640	1798-1816	GUCUGUGCGGAUCCUGAAG	CUUCAGGAUCCGCACAGAC
2641	2642	1799-1817	UCUGUGCGGAUCCUGAAGA	UCUUCAGGAUCCGCACAGA
2643	2644	1800-1818	CUGUGCGGAUCCUGAAGAG	CUCUUCAGGAUCCGCACAG
2645	2646	1801-1819	UGUGCGGAUCCUGAAGAGC	GCUCUUCAGGAUCCGCACA
2647	2648	1802-1820	GUGCGGAUCCUGAAGAGCG	CGCUCUUCAGGAUCCGCAC
2649	2650	1803-1821	UGCGGAUCCUGAAGAGCGC	GCGCUCUUCAGGAUCCGCA
2651	2652	1804-1822	GCGGAUCCUGAAGAGCGCU	AGCGCUCUUCAGGAUCCGC
2653	2654	1805-1823	CGGAUCCUGAAGAGCGCUG	CAGCGCUCUUCAGGAUCCG
2655	2656	1806-1824	GGAUCCUGAAGAGCGCUGA	UCAGCGCUCUUCAGGAUCC
2657	2658	1807-1825	GAUCCUGAAGAGCGCUGAG	CUCAGCGCUCUUCAGGAUC
2659	2660	1808-1826	AUCCUGAAGAGCGCUGAGG	CCUCAGCGCUCUUCAGGAU
2661	2662	1809-1827	UCCUGAAGAGCGCUGAGGG	CCCUCAGCGCUCUUCAGGA
2663	2664	1810-1828	CCUGAAGAGCGCUGAGGGA	UCCCUCAGCGCUCUUCAGG
2665	2666	1811-1829	CUGAAGAGCGCUGAGGGAC	GUCCCUCAGCGCUCUUCAG
2667	2668	1812-1830	UGAAGAGCGCUGAGGGACG	CGUCCCUCAGCGCUCUUCA
2669	2670	1813-1831	GAAGAGCGCUGAGGGACGG	CCGUCCCUCAGCGCUCUUC
2671	2672	1814-1832	AAGAGCGCUGAGGGACGGG	CCCGUCCCUCAGCGCUCUU
2673	2674	1815-1833	AGAGCGCUGAGGGACGGGU	ACCCGUCCCUCAGCGCUCU
2675	2676	1816-1834	GAGCGCUGAGGGACGGGUG	CACCCGUCCCUCAGCGCUC
2677	2678	1817-1835	AGCGCUGAGGGACGGGUGC	GCACCCGUCCCUCAGCGCU
2679	2680	1818-1836	GCGCUGAGGGACGGGUGCU	AGCACCCGUCCCUCAGCGC
2681	2682	1819-1837	CGCUGAGGGACGGGUGCUU	AAGCACCCGUCCCUCAGCG
2683	2684	1820-1838	GCUGAGGGACGGGUGCUUC	GAAGCACCCGUCCCUCAGC
2685	2686	1821-1839	CUGAGGGACGGGUGCUUCG	CGAAGCACCCGUCCCUCAG
2687	2688	1822-1840	UGAGGGACGGGUGCUUCGC	GCGAAGCACCCGUCCCUCA
2689	2690	1823-1841	GAGGGACGGGUGCUUCGCC	GGCGAAGCACCCGUCCCUC
2691	2692	1824-1842	AGGGACGGGUGCUUCGCCG	CGGCGAAGCACCCGUCCCU
2693	2694	1825-1843	GGGACGGGUGCUUCGCCGC	GCGGCGAAGCACCCGUCCC
2695	2696	1826-1844	GGACGGGUGCUUCGCCGCC	GGCGGCGAAGCACCCGUCC
2697	2698	1827-1845	GACGGGUGCUUCGCCGCCA	UGGCGGCGAAGCACCCGUC
2699	2700	1828-1846	ACGGGUGCUUCGCCGCCAG	CUGGCGGCGAAGCACCCGU
2701	2702	1829-1847	CGGGUGCUUCGCCGCCAGC	GCUGGCGGCGAAGCACCCG
2703	2704	1830-1848	GGGUGCUUCGCCGCCAGCA	UGCUGGCGGCGAAGCACCC
2705	2706	1831-1849	GGUGCUUCGCCGCCAGCAC	GUGCUGGCGGCGAAGCACC
2707	2708	1832-1850	GUGCUUCGCCGCCAGCACC	GGUGCUGGCGGCGAAGCAC

2709	2710	1833-1851	UGCUUCGCCGCCAGCACCA	UGGUGCUGGCGGCGAAGCA
2711	2712	1834-1852	GCUUCGCCGCCAGCACCAG	CUGGUGCUGGCGGCGAAGC
2713	2714	1835-1853	CUUCGCCGCCAGCACCAGC	GCUGGUGCUGGCGGCGAAG
2715	2716	1836-1854	UUCGCCGCCAGCACCAGCG	CGCUGGUGCUGGCGGCGAA
2717	2718	1837-1855	UCGCCGCCAGCACCAGCGC	GCGCUGGUGCUGGCGGCGA
2719	2720	1838-1856	CGCCGCCAGCACCAGCGCA	UGCGCUGGUGCUGGCGGCG
2721	2722	1839-1857	GCCGCCAGCACCAGCGCAA	UUGCGCUGGUGCUGGCGGC
2723	2724	1840-1858	CCGCCAGCACCAGCGCAAC	GUUGCGCUGGUGCUGGCGG
2725	2726	1841-1859	CGCCAGCACCAGCGCAACG	CGUUGCGCUGGUGCUGGCG
2727	2728	1842-1860	GCCAGCACCAGCGCAACGU	ACGUUGCGCUGGUGCUGGC
2729	2730	1865-1883	CUCAUGAGACAGAUGCUAA	UUAGCAUCUGUCUCAUGAG
2731	2732	1866-1884	UCAUGAGACAGAUGCUAAU	AUUAGCAUCUGUCUCAUGA
2733	2734	1867-1885	CAUGAGACAGAUGCUAAUG	CAUUAGCAUCUGUCUCAUG
2735	2736	1868-1886	AUGAGACAGAUGCUAAUGG	CCAUUAGCAUCUGUCUCAU
2737	2738	1869-1887	UGAGACAGAUGCUAAUGGA	UCCAUUAGCAUCUGUCUCA
2739	2740	1871-1889	AGACAGAUGCUAAUGGAUG	CAUCCAUUAGCAUCUGUCU
2741	2742	1872-1890	GACAGAUGCUAAUGGAUGC	GCAUCCAUUAGCAUCUGUC
2743	2744	1873-1891	ACAGAUGCUAAUGGAUGCC	GGCAUCCAUUAGCAUCUGU
2745	2746	1874-1892	CAGAUGCUAAUGGAUGCCG	CGGCAUCCAUUAGCAUCUG
2747	2748	1875-1893	AGAUGCUAAUGGAUGCCGG	CCGGCAUCCAUUAGCAUCU
2749	2750	1876-1894	GAUGCUAAUGGAUGCCGGC	GCCGGCAUCCAUUAGCAUC
2751	2752	1877-1895	AUGCUAAUGGAUGCCGGCC	GGCCGGCAUCCAUUAGCAU
2753	2754	1878-1896	UGCUAAUGGAUGCCGGCCU	AGGCCGGCAUCCAUUAGCA
2755	2756	1879-1897	GCUAAUGGAUGCCGGCCUC	GAGGCCGGCAUCCAUUAGC
2757	2758	1880-1898	CUAAUGGAUGCCGGCCUCC	GGAGGCCGGCAUCCAUUAG
2759	2760	1881-1899	UAAUGGAUGCCGGCCUCCC	GGGAGGCCGGCAUCCAUUA
2761	2762	1882-1900	AAUGGAUGCCGGCCUCCCU	AGGGAGGCCGGCAUCCAUU
2763	2764	1883-1901	AUGGAUGCCGGCCUCCCUG	CAGGGAGGCCGGCAUCCAU
2765	2766	1884-1902	UGGAUGCCGGCCUCCCUGU	ACAGGGAGGCCGGCAUCCA
2767	2768	1885-1903	GGAUGCCGGCCUCCCUGUU	AACAGGGAGGCCGGCAUCC
2769	2770	1886-1904	GAUGCCGGCCUCCCUGUUG	CAACAGGGAGGCCGGCAUC
2771	2772	1887-1905	AUGCCGGCCUCCCUGUUGU	ACAACAGGGAGGCCGGCAU
2773	2774	1888-1906	UGCCGGCCUCCCUGUUGUC	GACAACAGGGAGGCCGGCA
2775	2776	1889-1907	GCCGGCCUCCCUGUUGUCC	GGACAACAGGGAGGCCGGC
2777	2778	1890-1908	CCGGCCUCCCUGUUGUCCA	UGGACAACAGGGAGGCCGG
2779	2780	1891-1909	CGGCCUCCCUGUUGUCCAC	GUGGACAACAGGGAGGCCG
2781	2782	1892-1910	GGCCUCCCUGUUGUCCACU	AGUGGACAACAGGGAGGCC
2783	2784	1893-1911	GCCUCCCUGUUGUCCACUG	CAGUGGACAACAGGGAGGC
2785	2786	1894-1912	CCUCCCUGUUGUCCACUGC	GCAGUGGACAACAGGGAGG
2787	2788	1895-1913	CUCCCUGUUGUCCACUGCC	GGCAGUGGACAACAGGGAG
2789	2790	1896-1914	UCCCUGUUGUCCACUGCCC	GGGCAGUGGACAACAGGGA
2791	2792	1897-1915	CCCUGUUGUCCACUGCCCC	GGGGCAGUGGACAACAGGG
2793	2794	1898-1916	CCUGUUGUCCACUGCCCCA	UGGGGCAGUGGACAACAGG
2795	2796	1899-1917	CUGUUGUCCACUGCCCCAG	CUGGGGCAGUGGACAACAG
2797	2798	1900-1918	UGUUGUCCACUGCCCCAGC	GCUGGGGCAGUGGACAACA
2799	2800	1901-1919	GUUGUCCACUGCCCCAGCC	GGCUGGGGCAGUGGACAAC
2801	2802	1902-1920	UUGUCCACUGCCCCAGCCA	UGGCUGGGGCAGUGGACAA
2803	2804	1903-1921	UGUCCACUGCCCCAGCCAC	GUGGCUGGGGCAGUGGACA
2805	2806	1904-1922	GUCCACUGCCCCAGCCACA	UGUGGCUGGGGCAGUGGAC
2807	2808	1905-1923	UCCACUGCCCCAGCCACAU	AUGUGGCUGGGGCAGUGGA

2809	2810	1906-1924	CCACUGCCCCAGCCACAUC	GAUGUGGCUGGGGCAGUGG
2811	2812	1907-1925	CACUGCCCCAGCCACAUCA	UGAUGUGGCUGGGGCAGUG
2813	2814	1908-1926	ACUGCCCCAGCCACAUCAU	AUGAUGUGGCUGGGGCAGU
2815	2816	1909-1927	CUGCCCCAGCCACAUCAUC	GAUGAUGUGGCUGGGGCAG
2817	2818	1910-1928	UGCCCCAGCCACAUCAUCC	GGAUGAUGUGGCUGGGGCA
2819	2820	1911-1929	GCCCCAGCCACAUCAUCCC	GGGAUGAUGUGGCUGGGGC
2821	2822	1912-1930	CCCCAGCCACAUCAUCCCU	AGGGAUGAUGUGGCUGGGG
2823	2824	1913-1931	CCCAGCCACAUCAUCCCUG	CAGGGAUGAUGUGGCUGGG
2825	2826	1914-1932	CCAGCCACAUCAUCCCUGU	ACAGGGAUGAUGUGGCUGG
2827	2828	1915-1933	CAGCCACAUCAUCCCUGUG	CACAGGGAUGAUGUGGCUG
2829	2830	1916-1934	AGCCACAUCAUCCCUGUGC	GCACAGGGAUGAUGUGGCU
2831	2832	1917-1935	GCCACAUCAUCCCUGUGCG	CGCACAGGGAUGAUGUGGC
2833	2834	1918-1936	CCACAUCAUCCCUGUGCGG	CCGCACAGGGAUGAUGUGG
2835	2836	1919-1937	CACAUCAUCCCUGUGCGGG	CCCGCACAGGGAUGAUGUG
2837	2838	1920-1938	ACAUCAUCCCUGUGCGGGU	ACCCGCACAGGGAUGAUGU
2839	2840	1922-1940	AUCAUCCCUGUGCGGGUUG	CAACCCGCACAGGGAUGAU
2841	2842	1923-1941	UCAUCCCUGUGCGGGUUGC	GCAACCCGCACAGGGAUGA
2843	2844	1924-1942	CAUCCCUGUGCGGGUUGCA	UGCAACCCGCACAGGGAUG
2845	2846	1925-1943	AUCCCUGUGCGGGUUGCAG	CUGCAACCCGCACAGGGAU
2847	2848	1926-1944	UCCCUGUGCGGGUUGCAGA	UCUGCAACCCGCACAGGGA
2849	2850	1928-1946	CCUGUGCGGGUUGCAGAUG	CAUCUGCAACCCGCACAGG
2851	2852	1929-1947	CUGUGCGGGUUGCAGAUGC	GCAUCUGCAACCCGCACAG
2853	2854	1930-1948	UGUGCGGGUUGCAGAUGCU	AGCAUCUGCAACCCGCACA
2855	2856	1931-1949	GUGCGGGUUGCAGAUGCUG	CAGCAUCUGCAACCCGCAC
2857	2858	1932-1950	UGCGGGUUGCAGAUGCUGC	GCAGCAUCUGCAACCCGCA
2859	2860	1933-1951	GCGGGUUGCAGAUGCUGCU	AGCAGCAUCUGCAACCCGC
2861	2862	1934-1952	CGGGUUGCAGAUGCUGCUA	UAGCAGCAUCUGCAACCCG
2863	2864	1935-1953	GGGUUGCAGAUGCUGCUAA	UUAGCAGCAUCUGCAACCC
2865	2866	1936-1954	GGUUGCAGAUGCUGCUAAA	UUUAGCAGCAUCUGCAACC
2867	2868	1937-1955	GUUGCAGAUGCUGCUAAAA	UUUUAGCAGCAUCUGCAAC
2869	2870	1938-1956	UUGCAGAUGCUGCUAAAAA	UUUUUAGCAGCAUCUGCAA
2871	2872	1939-1957	UGCAGAUGCUGCUAAAAAC	GUUUUUAGCAGCAUCUGCA
2873	2874	1940-1958	GCAGAUGCUGCUAAAAACA	UGUUUUUAGCAGCAUCUGC
2875	2876	1941-1959	CAGAUGCUGCUAAAAACAC	GUGUUUUUAGCAGCAUCUG
2877	2878	1961-1979	GAAGUCUGUGAUGAACUAA	UUAGUUCAUCACAGACUUC
2879	2880	1963-1981	AGUCUGUGAUGAACUAAUG	CAUUAGUUCAUCACAGACU
2881	2882	1965-1983	UCUGUGAUGAACUAAUGAG	CUCAUUAGUUCAUCACAGA
2883	2884	1966-1984	CUGUGAUGAACUAAUGAGC	GCUCAUUAGUUCAUCACAG
2885	2886	1968-1986	GUGAUGAACUAAUGAGCAG	CUGCUCAUUAGUUCAUCAC
2887	2888	1969-1987	UGAUGAACUAAUGAGCAGA	UCUGCUCAUUAGUUCAUCA
2889	2890	1970-1988	GAUGAACUAAUGAGCAGAC	GUCUGCUCAUUAGUUCAUC
2891	2892	1971-1989	AUGAACUAAUGAGCAGACA	UGUCUGCUCAUUAGUUCAU
2893	2894	1972-1990	UGAACUAAUGAGCAGACAU	AUGUCUGCUCAUUAGUUCA
2895	2896	1973-1991	GAACUAAUGAGCAGACAUA	UAUGUCUGCUCAUUAGUUC
2897	2898	1974-1992	AACUAAUGAGCAGACAUAA	UUAUGUCUGCUCAUUAGUU
2899	2900	1975-1993	ACUAAUGAGCAGACAUAAC	GUUAUGUCUGCUCAUUAGU
2901	2902	1978-1996	AAUGAGCAGACAUAACAUC	GAUGUUAUGUCUGCUCAUU
2903	2904	1979-1997	AUGAGCAGACAUAACAUCU	AGAUGUUAUGUCUGCUCAU
2905	2906	1980-1998	UGAGCAGACAUAACAUCUA	UAGAUGUUAUGUCUGCUCA
2907	2908	2000-2018	GUGCAAGCAAUCAAUUACC	GGUAAUUGAUUGCUUGCAC

2909	2910	2001-2019	UGCAAGCAAUCAAUUACCC	GGGUAAUUGAUUGCUUGCA
2911	2912	2002-2020	GCAAGCAAUCAAUUACCCU	AGGGUAAUUGAUUGCUUGC
2913	2914	2004-2022	AAGCAAUCAAUUACCCUAC	GUAGGGUAAUUGAUUGCUU
2915	2916	2024-2042	GUGCCCCGGGGAGAAGAGC	GCUCUUCUCCCCGGGGCAC
2917	2918	2025-2043	UGCCCCGGGGAGAAGAGCU	AGCUCUUCUCCCCGGGGCA
2919	2920	2026-2044	GCCCCGGGGAGAAGAGCUC	GAGCUCUUCUCCCCGGGGC
2921	2922	2027-2045	CCCCGGGGAGAAGAGCUCC	GGAGCUCUUCUCCCCGGGG
2923	2924	2028-2046	CCCGGGGAGAAGAGCUCCU	AGGAGCUCUUCUCCCCGGG
2925	2926	2029-2047	CCGGGGAGAAGAGCUCCUA	UAGGAGCUCUUCUCCCCGG
2927	2928	2030-2048	CGGGGAGAAGAGCUCCUAC	GUAGGAGCUCUUCUCCCCG
2929	2930	2031-2049	GGGGAGAAGAGCUCCUACG	CGUAGGAGCUCUUCUCCCC
2931	2932	2032-2050	GGGAGAAGAGCUCCUACGG	CCGUAGGAGCUCUUCUCCC
2933	2934	2033-2051	GGAGAAGAGCUCCUACGGA	UCCGUAGGAGCUCUUCUCC
2935	2936	2034-2052	GAGAAGAGCUCCUACGGAU	AUCCGUAGGAGCUCUUCUC
2937	2938	2060-2078	ACCCCUCACCACACACCCC	GGGGUGUGUGGUGAGGGGU
2939	2940	2061-2079	CCCCUCACCACACACCCCA	UGGGGUGUGUGGUGAGGGG
2941	2942	2062-2080	CCCUCACCACACACCCCAG	CUGGGGUGUGUGGUGAGGG
2943	2944	2063-2081	CCUCACCACACACCCCAGA	UCUGGGGUGUGUGGUGAGG
2945	2946	2064-2082	CUCACCACACACCCCAGAU	AUCUGGGGUGUGUGGUGAG
2947	2948	2065-2083	UCACCACACACCCCAGAUG	CAUCUGGGGUGUGUGGUGA
2949	2950	2066-2084	CACCACACACCCCAGAUGA	UCAUCUGGGGUGUGUGGUG
2951	2952	2067-2085	ACCACACACCCCAGAUGAU	AUCAUCUGGGGUGUGUGGU
2953	2954	2068-2086	CCACACACCCCAGAUGAUG	CAUCAUCUGGGGUGUGUGG
2955	2956	2069-2087	CACACACCCCAGAUGAUGA	UCAUCAUCUGGGGUGUGUG
2957	2958	2070-2088	ACACACCCCAGAUGAUGAA	UUCAUCAUCUGGGGUGUGU
2959	2960	2071-2089	CACACCCCAGAUGAUGAAC	GUUCAUCAUCUGGGGUGUG
2961	2962	2072-2090	ACACCCCAGAUGAUGAACU	AGUUCAUCAUCUGGGGUGU
2963	2964	2073-2091	CACCCCAGAUGAUGAACUA	UAGUUCAUCAUCUGGGGUG
2965	2966	2074-2092	ACCCCAGAUGAUGAACUAC	GUAGUUCAUCAUCUGGGGU
2967	2968	2076-2094	CCCAGAUGAUGAACUACUU	AAGUAGUUCAUCAUCUGGG
2969	2970	2077-2095	CCAGAUGAUGAACUACUUC	GAAGUAGUUCAUCAUCUGG
2971	2972	2078-2096	CAGAUGAUGAACUACUUCC	GGAAGUAGUUCAUCAUCUG
2973	2974	2079-2097	AGAUGAUGAACUACUUCCU	AGGAAGUAGUUCAUCAUCU
2975	2976	2080-2098	GAUGAUGAACUACUUCCUU	AAGGAAGUAGUUCAUCAUC
2977	2978	2081-2099	AUGAUGAACUACUUCCUUG	CAAGGAAGUAGUUCAUCAU
2979	2980	2082-2100	UGAUGAACUACUUCCUUGA	UCAAGGAAGUAGUUCAUCA
2981	2982	2083-2101	GAUGAACUACUUCCUUGAG	CUCAAGGAAGUAGUUCAUC
2983	2984	2084-2102	AUGAACUACUUCCUUGAGA	UCUCAAGGAAGUAGUUCAU
2985	2986	2085-2103	UGAACUACUUCCUUGAGAA	UUCUCAAGGAAGUAGUUCA
2987	2988	2086-2104	GAACUACUUCCUUGAGAAU	AUUCUCAAGGAAGUAGUUC
2989	2990	2087-2105	AACUACUUCCUUGAGAAUC	GAUUCUCAAGGAAGUAGUU
2991	2992	2088-2106	ACUACUUCCUUGAGAAUCU	AGAUUCUCAAGGAAGUAGU
2993	2994	2089-2107	CUACUUCCUUGAGAAUCUG	CAGAUUCUCAAGGAAGUAG
2995	2996	2090-2108	UACUUCCUUGAGAAUCUGC	GCAGAUUCUCAAGGAAGUA
2997	2998	2091-2109	ACUUCCUUGAGAAUCUGCU	AGCAGAUUCUCAAGGAAGU
2999	3000	2117-2135	UGGAAGCAAGUGGGGCUGG	CCAGCCCCACUUGCUUCCA
3001	3002	2118-2136	GGAAGCAAGUGGGGCUGGA	UCCAGCCCCACUUGCUUCC
3003	3004	2119-2137	GAAGCAAGUGGGGCUGGAA	UUCCAGCCCCACUUGCUUC
3005	3006	2120-2138	AAGCAAGUGGGGCUGGAAC	GUUCCAGCCCCACUUGCUU
3007	3008	2121-2139	AGCAAGUGGGGCUGGAACU	AGUUCCAGCCCCACUUGCU

3009	3010	2122-2140	GCAAGUGGGGCUGGAACUG	CAGUUCCAGCCCCACUUGC
3011	3012	2123-2141	CAAGUGGGGCUGGAACUGA	UCAGUUCCAGCCCCACUUG
3013	3014	2124-2142	AAGUGGGGCUGGAACUGAA	UUCAGUUCCAGCCCCACUU
3015	3016	2125-2143	AGUGGGGCUGGAACUGAAG	CUUCAGUUCCAGCCCCACU
3017	3018	2126-2144	GUGGGGCUGGAACUGAAGC	GCUUCAGUUCCAGCCCCAC
3019	3020	2127-2145	UGGGGCUGGAACUGAAGCC	GGCUUCAGUUCCAGCCCCA
3021	3022	2147-2165	CAUUCCUCAGCUGAGUGCA	UGCACUCAGCUGAGGAAUG
3023	3024	2148-2166	AUUCCUCAGCUGAGUGCAA	UUGCACUCAGCUGAGGAAU
3025	3026	2149-2167	UUCCUCAGCUGAGUGCAAC	GUUGCACUCAGCUGAGGAA
3027	3028	2150-2168	UCCUCAGCUGAGUGCAACU	AGUUGCACUCAGCUGAGGA
3029	3030	2151-2169	CCUCAGCUGAGUGCAACUU	AAGUUGCACUCAGCUGAGG
3031	3032	2152-2170	CUCAGCUGAGUGCAACUUC	GAAGUUGCACUCAGCUGAG
3033	3034	2153-2171	UCAGCUGAGUGCAACUUCU	AGAAGUUGCACUCAGCUGA
3035	3036	2154-2172	CAGCUGAGUGCAACUUCUG	CAGAAGUUGCACUCAGCUG
3037	3038	2155-2173	AGCUGAGUGCAACUUCUGC	GCAGAAGUUGCACUCAGCU
3039	3040	2156-2174	GCUGAGUGCAACUUCUGCA	UGCAGAAGUUGCACUCAGC
3041	3042	2157-2175	CUGAGUGCAACUUCUGCAG	CUGCAGAAGUUGCACUCAG
3043	3044	2158-2176	UGAGUGCAACUUCUGCAGG	CCUGCAGAAGUUGCACUCA
3045	3046	2159-2177	GAGUGCAACUUCUGCAGGA	UCCUGCAGAAGUUGCACUC
3047	3048	2160-2178	AGUGCAACUUCUGCAGGAG	CUCCUGCAGAAGUUGCACU
3049	3050	2161-2179	GUGCAACUUCUGCAGGAGG	CCUCCUGCAGAAGUUGCAC
3051	3052	2162-2180	UGCAACUUCUGCAGGAGGC	GCCUCCUGCAGAAGUUGCA
3053	3054	2163-2181	GCAACUUCUGCAGGAGGCC	GGCCUCCUGCAGAAGUUGC
3055	3056	2164-2182	CAACUUCUGCAGGAGGCCA	UGGCCUCCUGCAGAAGUUG
3057	3058	2165-2183	AACUUCUGCAGGAGGCCAC	GUGGCCUCCUGCAGAAGUU
3059	3060	2166-2184	ACUUCUGCAGGAGGCCACU	AGUGGCCUCCUGCAGAAGU
3061	3062	2167-2185	CUUCUGCAGGAGGCCACUG	CAGUGGCCUCCUGCAGAAG
3063	3064	2168-2186	UUCUGCAGGAGGCCACUGC	GCAGUGGCCUCCUGCAGAA
3065	3066	2169-2187	UCUGCAGGAGGCCACUGCA	UGCAGUGGCCUCCUGCAGA
3067	3068	2170-2188	CUGCAGGAGGCCACUGCAU	AUGCAGUGGCCUCCUGCAG
3069	3070	2171-2189	UGCAGGAGGCCACUGCAUU	AAUGCAGUGGCCUCCUGCA
3071	3072	2172-2190	GCAGGAGGCCACUGCAUUU	AAAUGCAGUGGCCUCCUGC
3073	3074	2173-2191	CAGGAGGCCACUGCAUUUU	AAAAUGCAGUGGCCUCCUG
3075	3076	2174-2192	AGGAGGCCACUGCAUUUUG	CAAAAUGCAGUGGCCUCCU
3077	3078	2175-2193	GGAGGCCACUGCAUUUUGA	UCAAAAUGCAGUGGCCUCC
3079	3080	2176-2194	GAGGCCACUGCAUUUUGAA	UUCAAAAUGCAGUGGCCUC
3081	3082	2177-2195	AGGCCACUGCAUUUUGAAG	CUUCAAAAUGCAGUGGCCU
3083	3084	2178-2196	GGCCACUGCAUUUUGAAGU	ACUUCAAAAUGCAGUGGCC
3085	3086	2179-2197	GCCACUGCAUUUUGAAGUG	CACUUCAAAAUGCAGUGGC
3087	3088	2180-2198	CCACUGCAUUUUGAAGUGA	UCACUUCAAAAUGCAGUGG
3089	3090	2181-2199	CACUGCAUUUUGAAGUGAU	AUCACUUCAAAAUGCAGUG
3091	3092	2182-2200	ACUGCAUUUUGAAGUGAUG	CAUCACUUCAAAAUGCAGU
3093	3094	2183-2201	CUGCAUUUUGAAGUGAUGA	UCAUCACUUCAAAAUGCAG
3095	3096	2184-2202	UGCAUUUUGAAGUGAUGAG	CUCAUCACUUCAAAAUGCA
3097	3098	2185-2203	GCAUUUUGAAGUGAUGAGU	ACUCAUCACUUCAAAAUGC
3099	3100	2186-2204	CAUUUUGAAGUGAUGAGUG	CACUCAUCACUUCAAAAUG
3101	3102	2187-2205	AUUUUGAAGUGAUGAGUGA	UCACUCAUCACUUCAAAAU
3103	3104	2188-2206	UUUUGAAGUGAUGAGUGAA	UUCACUCAUCACUUCAAAA
3105	3106	2190-2208	UUGAAGUGAUGAGUGAAAG	CUUUCACUCAUCACUUCAA
3107	3108	2191-2209	UGAAGUGAUGAGUGAAAGA	UCUUUCACUCAUCACUUCA

3109	3110	2192-2210	GAAGUGAUGAGUGAAAGAG	CUCUUUCACUCAUCACUUC
3111	3112	2193-2211	AAGUGAUGAGUGAAAGAGA	UCUCUUUCACUCAUCACUU
3113	3114	2194-2212	AGUGAUGAGUGAAAGAGAG	CUCUCUUUCACUCAUCACU
3115	3116	2195-2213	GUGAUGAGUGAAAGAGAGA	UCUCUCUUUCACUCAUCAC
3117	3118	2196-2214	UGAUGAGUGAAAGAGAGAA	UUCUCUCUUUCACUCAUCA
3119	3120	2197-2215	GAUGAGUGAAAGAGAGAAG	CUUCUCUCUUUCACUCAUC
3121	3122	2198-2216	AUGAGUGAAAGAGAGAAGU	ACUUCUCUCUUUCACUCAU
3123	3124	2199-2217	UGAGUGAAAGAGAGAAGUC	GACUUCUCUCUUUCACUCA
3125	3126	2200-2218	GAGUGAAAGAGAGAAGUCC	GGACUUCUCUCUUUCACUC
3127	3128	2201-2219	AGUGAAAGAGAGAAGUCCU	AGGACUUCUCUCUUUCACU
3129	3130	2202-2220	GUGAAAGAGAGAAGUCCUA	UAGGACUUCUCUCUUUCAC
3131	3132	2203-2221	UGAAAGAGAGAAGUCCUAU	AUAGGACUUCUCUCUUUCA
3133	3134	2204-2222	GAAAGAGAGAAGUCCUAUU	AAUAGGACUUCUCUCUUUC
3135	3136	2205-2223	AAAGAGAGAAGUCCUAUUU	AAAUAGGACUUCUCUCUUU
3137	3138	2206-2224	AAGAGAGAAGUCCUAUUUC	GAAAUAGGACUUCUCUCUU
3139	3140	2207-2225	AGAGAGAAGUCCUAUUUCU	AGAAAUAGGACUUCUCUCU
3141	3142	2208-2226	GAGAGAAGUCCUAUUUCUC	GAGAAAUAGGACUUCUCUC
3143	3144	2209-2227	AGAGAAGUCCUAUUUCUCA	UGAGAAAUAGGACUUCUCU
3145	3146	2210-2228	GAGAAGUCCUAUUUCUCAG	CUGAGAAAUAGGACUUCUC
3147	3148	2211-2229	AGAAGUCCUAUUUCUCAGG	CCUGAGAAAUAGGACUUCU
3149	3150	2212-2230	GAAGUCCUAUUUCUCAGGC	GCCUGAGAAAUAGGACUUC
3151	3152	2213-2231	AAGUCCUAUUUCUCAGGCU	AGCCUGAGAAAUAGGACUU
3153	3154	2214-2232	AGUCCUAUUUCUCAGGCUU	AAGCCUGAGAAAUAGGACU
3155	3156	2215-2233	GUCCUAUUUCUCAGGCUUG	CAAGCCUGAGAAAUAGGAC
3157	3158	2216-2234	UCCUAUUUCUCAGGCUUGA	UCAAGCCUGAGAAAUAGGA
3159	3160	2217-2235	CCUAUUUCUCAGGCUUGAG	CUCAAGCCUGAGAAAUAGG
3161	3162	2218-2236	CUAUUUCUCAGGCUUGAGC	GCUCAAGCCUGAGAAAUAG
3163	3164	2219-2237	UAUUUCUCAGGCUUGAGCA	UGCUCAAGCCUGAGAAAUA
3165	3166	2220-2238	AUUUCUCAGGCUUGAGCAA	UUGCUCAAGCCUGAGAAAU
3167	3168	2221-2239	UUUCUCAGGCUUGAGCAAG	CUUGCUCAAGCCUGAGAAA
3169	3170	2222-2240	UUCUCAGGCUUGAGCAAGU	ACUUGCUCAAGCCUGAGAA
3171	3172	2223-2241	UCUCAGGCUUGAGCAAGUU	AACUUGCUCAAGCCUGAGA
3173	3174	2224-2242	CUCAGGCUUGAGCAAGUUG	CAACUUGCUCAAGCCUGAG
3175	3176	2225-2243	UCAGGCUUGAGCAAGUUGG	CCAACUUGCUCAAGCCUGA
3177	3178	2226-2244	CAGGCUUGAGCAAGUUGGU	ACCAACUUGCUCAAGCCUG
3179	3180	2229-2247	GCUUGAGCAAGUUGGUAUC	GAUACCAACUUGCUCAAGC
3181	3182	2231-2249	UUGAGCAAGUUGGUAUCUG	CAGAUACCAACUUGCUCAA
3183	3184	2232-2250	UGAGCAAGUUGGUAUCUGC	GCAGAUACCAACUUGCUCA
3185	3186	2233-2251	GAGCAAGUUGGUAUCUGCU	AGCAGAUACCAACUUGCUC
3187	3188	2234-2252	AGCAAGUUGGUAUCUGCUC	GAGCAGAUACCAACUUGCU
3189	3190	2235-2253	GCAAGUUGGUAUCUGCUCA	UGAGCAGAUACCAACUUGC
3191	3192	2236-2254	CAAGUUGGUAUCUGCUCAG	CUGAGCAGAUACCAACUUG
3193	3194	2237-2255	AAGUUGGUAUCUGCUCAGG	CCUGAGCAGAUACCAACUU
3195	3196	2238-2256	AGUUGGUAUCUGCUCAGGC	GCCUGAGCAGAUACCAACU
3197	3198	2239-2257	GUUGGUAUCUGCUCAGGCC	GGCCUGAGCAGAUACCAAC
3199	3200	2240-2258	UUGGUAUCUGCUCAGGCCU	AGGCCUGAGCAGAUACCAA
3201	3202	2241-2259	UGGUAUCUGCUCAGGCCUG	CAGGCCUGAGCAGAUACCA
3203	3204	2242-2260	GGUAUCUGCUCAGGCCUGA	UCAGGCCUGAGCAGAUACC
3205	3206	2243-2261	GUAUCUGCUCAGGCCUGAG	CUCAGGCCUGAGCAGAUAC
3207	3208	2244-2262	UAUCUGCUCAGGCCUGAGC	GCUCAGGCCUGAGCAGAUA

3209	3210	2245-2263	AUCUGCUCAGGCCUGAGCA	UGCUCAGGCCUGAGCAGAU
3211	3212	2246-2264	UCUGCUCAGGCCUGAGCAU	AUGCUCAGGCCUGAGCAGA
3213	3214	2247-2265	CUGCUCAGGCCUGAGCAUG	CAUGCUCAGGCCUGAGCAG
3215	3216	2248-2266	UGCUCAGGCCUGAGCAUGA	UCAUGCUCAGGCCUGAGCA
3217	3218	2249-2267	GCUCAGGCCUGAGCAUGAC	GUCAUGCUCAGGCCUGAGC
3219	3220	2250-2268	CUCAGGCCUGAGCAUGACC	GGUCAUGCUCAGGCCUGAG
3221	3222	2251-2269	UCAGGCCUGAGCAUGACCU	AGGUCAUGCUCAGGCCUGA
3223	3224	2252-2270	CAGGCCUGAGCAUGACCUC	GAGGUCAUGCUCAGGCCUG
3225	3226	2253-2271	AGGCCUGAGCAUGACCUCA	UGAGGUCAUGCUCAGGCCU
3227	3228	2279-2297	CACUUAACCCCAGGCCAUU	AAUGGCCUGGGGUUAAGUG
3229	3230	2280-2298	ACUUAACCCCAGGCCAUUA	UAAUGGCCUGGGGUUAAGU
3231	3232	2281-2299	CUUAACCCCAGGCCAUUAU	AUAAUGGCCUGGGGUUAAG
3233	3234	2282-2300	UUAACCCCAGGCCAUUAUC	GAUAAUGGCCUGGGGUUAA
3235	3236	2283-2301	UAACCCCAGGCCAUUAUCA	UGAUAAUGGCCUGGGGUUA
3237	3238	2284-2302	AACCCCAGGCCAUUAUCAU	AUGAUAAUGGCCUGGGGUU
3239	3240	2285-2303	ACCCCAGGCCAUUAUCAUA	UAUGAUAAUGGCCUGGGGU
3241	3242	2287-2305	CCCAGGCCAUUAUCAUAUC	GAUAUGAUAAUGGCCUGGG
3243	3244	2288-2306	CCAGGCCAUUAUCAUAUCC	GGAUAUGAUAAUGGCCUGG
3245	3246	2289-2307	CAGGCCAUUAUCAUAUCCA	UGGAUAUGAUAAUGGCCUG
3247	3248	2290-2308	AGGCCAUUAUCAUAUCCAG	CUGGAUAUGAUAAUGGCCU
3249	3250	2291-2309	GGCCAUUAUCAUAUCCAGA	UCUGGAUAUGAUAAUGGCC
3251	3252	2292-2310	GCCAUUAUCAUAUCCAGAU	AUCUGGAUAUGAUAAUGGC
3253	3254	2314-2332	CUUCAGAGUUGUCUUUAUA	UAUAAAGACAACUCUGAAG
3255	3256	2315-2333	UUCAGAGUUGUCUUUAUAU	AUAUAAAGACAACUCUGAA
3257	3258	2316-2334	UCAGAGUUGUCUUUAUAUG	CAUAUAAAGACAACUCUGA
3259	3260	2318-2336	AGAGUUGUCUUUAUAUGUG	CACAUAUAAAGACAACUCU
3261	3262	2322-2340	UUGUCUUUAUAUGUGAAUU	AAUUCACAUAUAAAGACAA
3263	3264	2323-2341	UGUCUUUAUAUGUGAAUUA	UAAUUCACAUAUAAAGACA
3265	3266	2324-2342	GUCUUUAUAUGUGAAUUAA	UUAAUUCACAUAUAAAGAC
3267	3268	2325-2343	UCUUUAUAUGUGAAUUAAG	CUUAAUUCACAUAUAAAGA
3269	3270	2326-2344	CUUUAUAUGUGAAUUAAGU	ACUUAAUUCACAUAUAAAG
3271	3272	2327-2345	UUUAUAUGUGAAUUAAGUU	AACUUAAUUCACAUAUAAA
3273	3274	2328-2346	UUAUAUGUGAAUUAAGUUA	UAACUUAAUUCACAUAUAA
3275	3276	2329-2347	UAUAUGUGAAUUAAGUUAU	AUAACUUAAUUCACAUAUA
3277	3278	2330-2348	AUAUGUGAAUUAAGUUAUA	UAUAACUUAAUUCACAUAU
3279	3280	2331-2349	UAUGUGAAUUAAGUUAUAU	AUAUAACUUAAUUCACAUA
3281	3282	2332-2350	AUGUGAAUUAAGUUAUAUU	AAUAUAACUUAAUUCACAU
3283	3284	2333-2351	UGUGAAUUAAGUUAUAUUA	UAAUAUAACUUAAUUCACA
3285	3286	2334-2352	GUGAAUUAAGUUAUAUUAA	UUAAUAUAACUUAAUUCAC
3287	3288	2335-2353	UGAAUUAAGUUAUAUUAAA	UUUAAUAUAACUUAAUUCA
3289	3290	2336-2354	GAAUUAAGUUAUAUUAAAU	AUUUAAUAUAACUUAAUUC
3291	3292	2337-2355	AAUUAAGUUAUAUUAAAUU	AAUUUAAUAUAACUUAAUU
3293	3294	2338-2356	AUUAAGUUAUAUUAAAUUU	AAAUUUAAUAUAACUUAAU
3295	3296	2339-2357	UUAAGUUAUAUUAAAUUUU	AAAAUUUAAUAUAACUUAA
3297	3298	2340-2358	UAAGUUAUAUUAAAUUUUA	UAAAAUUUAAUAUAACUUA
3299	3300	2341-2359	AAGUUAUAUUAAAUUUUAA	UUAAAAUUUAAUAUAACUU
3301	3302	2342-2360	AGUUAUAUUAAAUUUUAAU	AUUAAAAUUUAAUAUAACU
3303	3304	2343-2361	GUUAUAUUAAAUUUUAAUC	GAUUAAAAUUUAAUAUAAC
3305	3306	2345-2363	UAUAUUAAAUUUUAAUCUA	UAGAUUAAAAUUUAAUAUA
3307	3308	2346-2364	AUAUUAAAUUUUAAUCUAU	AUAGAUUAAAAUUUAAUAU

3309	3310	2347-2365	UAUUAAAUUUUAAUCUAUA	UAUAGAUUAAAAUUUAAUA
3311	3312	2348-2366	AUUAAAUUUUAAUCUAUAG	CUAUAGAUUAAAAUUUAAU
3313	3314	2349-2367	UUAAAUUUUAAUCUAUAGU	ACUAUAGAUUAAAAUUUAA
3315	3316	2350-2368	UAAAUUUUAAUCUAUAGUA	UACUAUAGAUUAAAAUUUA
3317	3318	2351-2369	AAAUUUUAAUCUAUAGUAA	UUACUAUAGAUUAAAAUUU
3319	3320	2354-2372	UUUUAAUCUAUAGUAAAAA	UUUUUACUAUAGAUUAAAA
3321	3322	2355-2373	UUUAAUCUAUAGUAAAAAC	GUUUUUACUAUAGAUUAAA
3323	3324	2356-2374	UUAAUCUAUAGUAAAAACA	UGUUUUUACUAUAGAUUAA
3325	3326	2357-2375	UAAUCUAUAGUAAAAACAU	AUGUUUUUACUAUAGAUUA
3327	3328	2358-2376	AAUCUAUAGUAAAAACAUA	UAUGUUUUUACUAUAGAUU
3329	3330	2359-2377	AUCUAUAGUAAAAACAUAG	CUAUGUUUUUACUAUAGAU
3331	3332	2360-2378	UCUAUAGUAAAAACAUAGU	ACUAUGUUUUUACUAUAGA
3333	3334	2361-2379	CUAUAGUAAAAACAUAGUC	GACUAUGUUUUUACUAUAG
3335	3336	2362-2380	UAUAGUAAAAACAUAGUCC	GGACUAUGUUUUUACUAUA
3337	3338	2363-2381	AUAGUAAAAACAUAGUCCU	AGGACUAUGUUUUUACUAU
3339	3340	2364-2382	UAGUAAAAACAUAGUCCUG	CAGGACUAUGUUUUUACUA
3341	3342	2365-2383	AGUAAAAACAUAGUCCUGG	CCAGGACUAUGUUUUUACU
3343	3344	2366-2384	GUAAAAACAUAGUCCUGGA	UCCAGGACUAUGUUUUUAC
3345	3346	2367-2385	UAAAAACAUAGUCCUGGAA	UUCCAGGACUAUGUUUUUA
3347	3348	2368-2386	AAAAACAUAGUCCUGGAAA	UUUCCAGGACUAUGUUUUU
3349	3350	2369-2387	AAAACAUAGUCCUGGAAAU	AUUUCCAGGACUAUGUUUU
3351	3352	2370-2388	AAACAUAGUCCUGGAAAUA	UAUUUCCAGGACUAUGUUU
3353	3354	2371-2389	AACAUAGUCCUGGAAAUAA	UUAUUUCCAGGACUAUGUU
3355	3356	2372-2390	ACAUAGUCCUGGAAAUAAA	UUUAUUUCCAGGACUAUGU
3357	3358	2373-2391	CAUAGUCCUGGAAAUAAAU	AUUUAUUUCCAGGACUAUG
3359	3360	2374-2392	AUAGUCCUGGAAAUAAAUU	AAUUUAUUUCCAGGACUAU
3361	3362	2375-2393	UAGUCCUGGAAAUAAAUUC	GAAUUUAUUUCCAGGACUA
3363	3364	2377-2395	GUCCUGGAAAUAAAUUCUU	AAGAAUUUAUUUCCAGGAC
3365	3366	2378-2396	UCCUGGAAAUAAAUUCUUG	CAAGAAUUUAUUUCCAGGA

Пример 9. Подавление предшественников порфиринов с использованием ми-РНК ALAS1 в случае применения подхода острого лечения

Мышиную модель AIP (См. пример 5) использовали для исследования того, может ли ми-РНК ALAS1 работать в случае применения подхода острого лечения, снижая уже повышенные уровни ALA и PBG, что может иметь место, например, когда пациент с порфирией страдает от острого приступа. Введение LND11-препарат ми-РНК AD-53558 в дозе 1 мг/кг через 12 часов после последней дозы фенобарбитала быстро снижало уровни ALA и PBG в плазме мышей, тогда как у контрольных обработанных Luc животных уровни продолжали возрастать (фиг. 14). Полученные результаты показывают, что ми-РНК ALAS является эффективной при лечении острого приступа. ми-РНК ALAS1 эффективно снижала и предотвращала дальнейшее повышение уровней ALA и PBG.

Пример 10. ми-РНК, мишенью которых является ALAS1

Дополнительные немодифицированные и модифицированные последовательности ми-РНК, мишенью которых является ALAS1, конструировали и получали, как описано в примере 2. Активность in vitro модифицированных дуплексов тестировали, как описано ниже.

Способы

Опосредованная липидами трансфекция

В случае Hep3B, PMH и первичных гепатоцитов макак-крабоедов трансфекцию осуществляли, добавляя по 14,8 мкл Opti-MEM плюс 0,2 мкл липофектамина RNAiMax на лунку (Invitrogen, Carlsbad CA, номер в каталоге 13778-150) к 5 мкл каждого дуплекса ми-РНК в отдельной лунке в 96-луночном планшете. Затем смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем к смеси ми-РНК добавляли восемнадцать микролитров полной ростовой среды без антибиотика, содержащей соответствующее количество клеток. Клетки инкубировали в течение 24 часов перед очисткой РНК.

Эксперименты с введением однократной дозы осуществляли, используя конечную концентрацию дуплекса 1 мкМ, 500 нМ, 20 нМ, 10 нМ и 0,2 нМ в случае GalNAc-модифицированных последовательностей.

Трансфекция в результате свободного захвата

Криозамороженные первичные гепатоциты макака-крабоеда (Celsis In Vitro Technologies, M003055-P) размораживали на водяной бане при 37°C непосредственно перед использованием и ресуспендировали в концентрации 0,26×10⁶ клеток/мл в среде InVitroGRO CP (посев) (Celsis In Vitro Technologies, номер в каталоге Z99029). Во время трансфекции клетки высевали на 96-луночный планшет с коллагеном BD BioCoat (BD, 356407) по 25000 клеток на лунку и инкубировали при 37°C в атмосфере 5% CO₂. Эксперименты по свободному захвату осуществляли, добавляя по 10 мкл дуплексов ми-РНК в PBS на лунку в 96-луночный (96л) планшет. Затем к ми-РНК добавляли девяносто микролитров полной ростовой среды, содержащей соответствующее количество клеток для данного типа клеток. Клетки инкубировали в течение 24 часов перед очисткой РНК. Эксперименты с введением однократных доз осуществляли, используя конечную концентрацию дуплекса 1 мкМ, 500 нМ, 20 нМ и 10 нМ.

Выделение суммарной РНК с использованием набора для выделения мРНК DYNABEADS (Invitrogen, серия №: 610-12)

Клетки собирали и лизировали в 150 мкл буфера для лизиса/связывания, затем перемешивали в течение 5 минут при 850 об./мин, используя термомиксер Eppendorf (скорость перемешивания была одинаковой на протяжении всего процесса). Добавляли десять микролитров магнитных шариков и 80 мкл буфера для лизиса/связывания в лунки планшета с круглым дном и перемешивали в течение 1 минуты. Магнитные шарики улавливали, используя магнитную подставку, и надосадок удаляли, не нарушая шарики. После удаления надосадка к оставшимся шарикам добавляли лизированные клетки и перемешивали в течение 5 минут. После удаления надосадка магнитные шарики промывали 2 раза, используя 150 мкл буфера для промывки A, и перемешивали в течение 1 минуты. Шарики улавливали и надосадок удаляли. Затем шарики промывали, используя 150 мкл буфера для промывки B, улавливали и надосадок удаляли. Шарики снова промывали 150 мкл буфера для элюирования, улавливали и надосадок удаляли. Шарикам давали возможность высохнуть в течение 2 минут. После сушки добавляли 50 мкл буфера для элюирования и перемешивали в течение 5 минут при 70°C. Шарики улавливали на магните в течение 5 минут. Сорок пять мкл надосадка извлекали и добавляли в другой 96-луночный планшет.

Синтез кДНК с использованием набора для высокопроизводительной обратной транскрипции кДНК ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, № в каталоге 4368813)

Готовили маточную смесь, состоящую из 2 мкл 10X буфера, 0,8 мкл 25X dNTP, 2 мкл случайных праймеров, 1 мкл обратной транскриптазы, 1 мкл ингибитора РНКаз и 3,2 мкл H₂O на реакцию. Смешивали равные объемы маточной смеси и РНК до конечного объема 12 мкл в случае образцов, которые были подвергнуты скринингу in vitro, или 20 мкл в случае образцов, которые были подвергнуты скринингу in vivo. кДНК получали, используя термоциклер Bio-Rad C-1000 или S-1000 (Hercules, CA), выполняя следующие стадии: 25°C 10 минут, 37°C 120 минут, 85°C 5 секунд, 4°C - хранение.

ПЦР в реальном времени

Два мкл кДНК добавляли к маточной смеси, содержащей 2 мкл H₂O, 0,5 мкл зонда GAPDH TaqMan (Life Technologies, № в каталоге 4326317E в случае клеток Hep3B cells, номер в каталоге 352339E в случае первичных гепатоцитов мыши или специально приготовленного зонда в случае первичных гепатоцитов макака-крабоеда), 0,5 мкл зонда C5 TaqMan probe (Life Technologies, номер в каталоге Hs00167441_m1 в случае клеток Hep3B или Mm00457879_m1 в случае первичных гепатоцитов мыши или специально приготовленного зонда в случае первичных гепатоцитов макака-крабоеда) и 5 мкл маточной смеси зонда Lightcycler 480 (Roche, номер в каталоге 04887301001) на лунку в 384-луночные (384 w) планшеты (Roche, номер в каталоге 04887301001). ПЦР в реальном времени осуществляли в системе для ПЦР в реальном времени Roche LC480 (Roche), используя анализ ΔΔCt(RQ). В случае скрининга in vitro каждый дуплекс тестировали с двумя биологическими повторами, если не указано иное, и каждую ПЦР в реальном времени осуществляли в двух технических повторах. В случае скрининга in vivo каждый дуплекс тестировали в одном или нескольких экспериментах (3 мыши на группу), и каждую ПЦР в реальном времени осуществляли в двух технических повторах.

Чтобы вычислить относительное кратное изменение уровней мРНК ALAS1, данные, полученные в реальном времени, анализировали, используя способ ΔΔCt, и нормализовали по отношению к данным анализов, осуществляемых с использованием клеток, трансфицированных 10 нм AD-1955, или ложно трансфицированных клеток. IC₅₀ вычисляли с помощью модели подгонки по 4 параметрам, используя XLFit, и нормализовали по отношению к клеткам, трансфицированным AD-1955, в том же диапазоне доз или по отношению к собственной наименьшей дозе.

Смысловые и антисмысловые последовательности AD-1955:

Смысловая: cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT (SEQ ID NO: 3682)

Антисмысловая: UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT (SEQ ID NO: 3683).

Последовательности одиночных нитей и дуплексов модифицированных и немодифицированных ми-РНК представлены в таблице 14 и таблице 15, соответственно.

Таблица 14 Модифицированные последовательности одиночных нитей и дуплексов ALAS1 человека
SEQ ID NO: (смысловая)	SEQ ID NO: (антисмысловая)	Название дуплекса	Смысловая последовательность (5'-3')	Антисмысловая последовательность (5'-3')	Сайты-мишени антисмысловой последовательности на NM_ 000688.4
3371	3372	AD-58848	CfsasUfgCfcAfaAfAfAfuGfgAfcAfuCfaUfL96	asUfsgAfuGfuCfcAfuuuUfuGfgCfaUfgsAfsc	1635-1657
3373	3374	AD-58849	AfsusUfuUfgAfaGfUfGfaUfgAfgUfgAfaAfL96	usUfsuCfaCfuCfaUfcacUfuCfaAfaAfusGfsc	2189-2211
3375	3376	AD-58850	AfsgsUfuAfuAfuUfAfAfaUfuUfuAfaUfcUfL96	asGfsaUfuAfaAfaUfuuaAfuAfuAfaCfusUfsa	2344-2366
3377	3378	AD-58851	GfscsAfuUfuUfgAfAfGfuGfaUfgAfgUfgAfL96	usCfsaCfuCfaUfcAfcuuCfaAfaAfuGfcsAfsg	2187-2209
3379	3380	AD-58852	GfsasAfcUfaAfuGfAfGfcAfgAfcAfuAfaCfL96	gsUfsuAfuGfuCfuGfcucAfuUfaGfuUfcsAfsu	1975-1997
3381	3382	AD-58853	AfsasUfgAfcCfaCfAfCfcUfaUfcGfaGfuUfL96	asAfscUfcGfaUfaGfgugUfgGfuCfaUfusCfsu	973-995
3383	3384	AD-58854	UfsasAfaUfuUfuAfAfUfcUfaUfaGfuAfaAfL96	usUfsuAfcUfaUfaGfauuAfaAfaUfuUfasAfsu	2352-2374
3385	3386	AD-58855	UfsusCfaGfuAfuGfAfUfcGfuUfuCfuUfuGfL96	csAfsaAfgAfaAfcGfaucAfuAfcUfgAfasAfsa	929-951
3387	3388	AD-58856	CfsasCfuUfuUfcAfGfUfaUfgAfuCfgUfuUfL96	asAfsaCfgAfuCfaUfacuGfaAfaAfgUfgsGfsa	924-946
3389	3390	AD-58857	AfsasAfuCfuGfuUfUfCfcAfcUfuUfuCfaGfL96	csUfsgAfaAfaGfuGfgaaAfcAfgAfuUfusUfsg	913-935
3391	3392	AD-58858	CfsasUfuUfgAfaAfCfUfgUfcCfaUfuCfaAfL96	usUfsgAfaUfgGfaCfaguUfuCfaAfaUfgsCfsc	1478-1500
3393	3394	AD-58859	CfscsUfaUfcGfaGfUfUfuUfuAfaAfaCfuGfL96	csAfsgUfuUfuAfaAfaacUfcGfaUfaGfgsUfsg	983-1005
3395	3396	AD-58861	GfsasCfcAfgAfaAfGfAfgUfgUfcUfcAfuCfL96	gsAfsuGfaGfaCfaCfucuUfuCfuGfgUfcsUfsu	872-894
3397	3398	AD-58862	AfscsCfaGfaAfaGfAfGfuGfuCfuCfaUfcUfL96	asGfsaUfgAfgAfcAfcucUfuUfcUfgGfusCfsu	873-895
3399	3400	AD-58863	AfscsUfaAfuGfaGfCfAfgAfcAfuAfaCfaUfL96	asUfsgUfuAfuGfuCfugcUfcAfuUfaGfusUfsc	1977-1999
3401	3402	AD-58864	UfsasGfuAfaAfaAfCfAfuAfgUfcCfuGfgAfL96	usCfscAfgGfaCfuAfuguUfuUfuAfcUfasUfsa	2366-2388
3403	3404	AD-58865	UfsasUfuUfcUfgGfAfAfcUfaGfuAfaAfuUfL96	asAfsuUfuAfcUfaGfuucCfaGfaAfaUfasUfsu	1185-1207
3405	3406	AD-58867	UfsusCfuGfcAfaAfGfCfcAfgUfcUfuGfaGfL96	csUfscAfaGfaCfuGfgcuUfuGfcAfgAfasGfsa	706-728
3407	3408	AD-58868	GfsasGfgAfaAfgAfGfGfuUfgCfuGfaAfaCfL96	gsUfsuUfcAfgCfaAfccuCfuUfuCfcUfcsAfsc	759-781

3409	3410	AD-58869	GfsgsUfaCfuAfgAfAfAfuAfuUfuCfuGfgAfL96	usCfscAfgAfaAfuAfuuuCfuAfgUfaCfcsAfsc	1174-1196
3411	3412	AD-58870	GfsasCfaUfcAfuGfCfAfaAfaGfcAfaAfgAfL96	usCfsuUfuGfcUfuUfugcAfuGfaUfgUfcsCfsu	853-875
3413	3414	AD-58871	AfsasAfuUfuUfaAfUfCfuAfuAfgUfaAfaAfL96	usUfsuUfaCfuAfuAfgauUfaAfaAfuUfusAfsa	2353-2375
3415	3416	AD-58873	CfsasUfgAfuCfcAfAfGfgGfaUfuCfgAfaAfL96	usUfsuCfgAfaUfcCfcuuGfgAfuCfaUfgsGfsa	1362-1384
3417	3418	AD-58874	AfsgsAfcCfaGfaAfAfGfaGfuGfuCfuCfaUfL96	asUfsgAfgAfcAfcUfcuuUfcUfgGfuCfusUfsu	871-893
3419	3420	AD-58875	AfsusCfcUfgAfaGfAfGfcGfcUfgAfgGfgAfL96	usCfscCfuCfaGfcGfcucUfuCfaGfgAfusCfsc	1810-1832
3421	3422	AD-58876	GfsusCfuGfuGfaUfGfAfaCfuAfaUfgAfgCfL96	gsCfsuCfaUfuAfgUfucaUfcAfcAfgAfcsUfsu	1966-1988
3423	3424	AD-58877	CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUfcUfuCfL96	gsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsGfsu	875-897
3425	3426	AD-58878	AfscsUfuUfuCfaGfUfAfuGfaUfcGfuUfuCfL96	gsAfsaAfcGfaUfcAfuacUfgAfaAfaGfusGfsg	925-947
3427	3428	AD-58879	UfscsAfuGfcCfaAfAfAfaUfgGfaCfaUfcAfL96	usGfsaUfgUfcCfaUfuuuUfgGfcAfuGfasCfsu	1634-1656
3429	3430	AD-58880	AfsasUfaUfuUfcUfGfGfaAfcUfaGfuAfaAfL96	usUfsuAfcUfaGfuUfccaGfaAfaUfaUfusUfsc	1183-1205
3431	3432	AD-58881	CfsusUfcUfuCfaAfGfAfuAfaCfuUfgCfcAfL96	usGfsgCfaAfgUfuAfucuUfgAfaGfaAfgsAfsu	892-914
3433	3434	AD-58882	UfsusUfcAfgUfaUfGfAfuCfgUfuUfcUfuUfL96	asAfsaGfaAfaCfgAfucaUfaCfuGfaAfasAfsg	928-950
3435	3436	AD-58883	CfscsCfaGfuGfuGfGfUfuAfgUfgUfgAfaAfL96	usUfsuCfaCfaCfuAfaccAfcAfcUfgGfgsGfsc	790-812
3437	3438	AD-58884	GfscsUfgUfgAfgAfUfUfuAfcUfcUfgAfuUfL96	asAfsuCfaGfaGfuAfaauCfuCfaCfaGfcsCfsu	1325-1347
3439	3440	AD-58885	AfsgsGfcUfuGfaGfCfAfaGfuUfgGfuAfuCfL96	gsAfsuAfcCfaAfcUfugcUfcAfaGfcCfusGfsa	2229-2251
3441	3442	AD-58886	GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96	asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsUfsg	877-899
3443	3444	AD-58887	AfsusUfuCfuGfgAfAfCfuAfgUfaAfaUfuCfL96	gsAfsaUfuUfaCfuAfguuCfcAfgAfaAfusAfsu	1186-1208
3445	3446	AD-58888	UfsgsUfgAfuGfuGfGfCfcCfaUfgAfgUfuUfL96	asAfsaCfuCfaUfgGfgccAfcAfuCfaCfasCfsa	1531-1553
3447	3448	AD-58889	AfsasGfaGfaGfaAfGfUfcCfuAfuUfuCfuCfL96	gsAfsgAfaAfuAfgGfacuUfcUfcUfcUfusUfsc	2208-2230
3449	3450	AD-58890	UfsgsGfcAfgCfaCfAfGfaUfgAfaUfcAfgAfL96	usCfsuGfaUfuCfaUfcugUfgCfuGfcCfasGfsg	671-693
3451	3452	AD-58891	AfsusGfaUfcGfuUfUfCfuUfuGfaGfaAfaAfL96	usUfsuUfcUfcAfaAfgaaAfcGfaUfcAfusAfsc	935-957
3453	3454	AD-58892	UfscsUfgGfaAfcUfAfGfuAfaAfuUfcCfaUfL96	asUfsgGfaAfuUfuAfcuaGfuUfcCfaGfasAfsa	1189-1211
3455	3456	AD-59095	GfscsCfcAfuUfcUfUfAfuCfcCfgAfgUfL96	asCfsuCfgGfgAfuAfagaAfuGfgsgsc	360-382
3457	3458	AD-59096	GfsgsAfaCfcAfuGfCfCfuCfcAfuGfaUfL96	asUfscAfuGfgAfgGfcauGfgUfuscsc	1347-1369
3459	3460	AD-59097	UfsgsGfaGfuCfuGfUfGfcGfgAfuCf	asGfsgAfuCfcGfcAfcagAfcUfc	1794-1816

			cUfL96	scsa
3461	3462	AD-59098	CfsasCfcCfaCfgGfGfUfgUfgUfgGfgAfL96	usCfscCfaCfaCfaCfccgUfgGfgsusg	1112-1134
3463	3464	AD-59099	GfsgsAfgUfcUfgUfGfCfgGfaUfcCfuAfL96	usAfsgGfaUfcCfgCfacaGfaCfuscsc	1795-1817
3465	3466	AD-59100	CfsasAfaAfcUfgCfCfCfcAfaGfaUfgAfL96	usCfsaUfcUfuGfgGfgcaGfuUfususg	428-450
3467	3468	AD-59101	GfscsCfuCfcAfuGfAfUfcCfaAfgGfgAfL96	usCfscCfuUfgGfaUfcauGfgAfgsgsc	1355-1377
3469	3470	AD-59102	CfsasUfcAfuCfcCfUfGfuGfcGfgGfuUfL96	asAfscCfcGfcAfcAfgggAfuGfasusg	1921-1943
3471	3472	AD-59103	AfscsCfcAfcGfgGfUfGfuGfuGfgGfgAfL96	usCfscCfcAfcAfcAfcccGfuGfgsgsu	1113-1135
3473	3474	AD-59104	CfsasCfaUfcAfuCfCfCfuGfuGfcGfgAfL96	usCfscGfcAfcAfgGfgauGfaUfgsusg	1919-1941
3475	3476	AD-59105	CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUfcUfL96	asGfsaUfgAfgAfcAfcucUfuUfcsusg	873-895
3477	3478	AD-59106	CfscsUfcCfaUfgAfUfCfcAfaGfgGfaUfL96	asUfscCfcUfuGfgAfucaUfgGfasgsg	1356-1378
3479	3480	AD-59107	UfsgsCfcCfaUfuCfUfUfaUfcCfcGfaAfL96	usUfscGfgGfaUfaAfgaaUfgGfgscsa	359-381
3481	3482	AD-59108	CfsusUfcAfcCfcUfGfGfcUfaAfgAfuAfL96	usAfsuCfuUfaGfcCfaggGfuGfasasg	1297-1319
3483	3484	AD-59109	AfsusCfaUfcCfcUfGfUfgCfgGfgUfuAfL96	usAfsaCfcCfgCfaCfaggGfaUfgsasu	1922-1944
3485	3486	AD-59110	AfsgsAfaAfgAfgUfGfUfcUfcAfuCfuUfL96	asAfsgAfuGfaGfaCfacuCfuUfuscsu	874-896
3487	3488	AD-59111	CfsusCfcAfuGfaUfCfCfaAfgGfgAfuUfL96	asAfsuCfcCfuUfgGfaucAfuGfgsasg	1357-1379
3489	3490	AD-59112	CfscsAfuUfcUfuAfUfCfcCfgAfgUfcAfL96	usGfsaCfuCfgGfgAfuaaGfaAfusgsg	362-384
3491	3492	AD-59113	CfsasCfcCfuGfgCfUfAfaGfaUfgAfuAfL96	usAfsuCfaUfcUfuAfgccAfgGfgsusg	1300-1322
3493	3494	AD-59114	UfscsAfuCfcCfuGfUfGfcGfgGfuUfgAfL96	usCfsaAfcCfcGfcAfcagGfgAfusgsa	1923-1945
3495	3496	AD-59115	AfsasGfaGfuGfuCfUfCfaUfcUfuCfuUfL96	asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcsusu	877-899
3497	3498	AD-59116	GfsusCfaUfgCfcAfAfAfaAfuGfgAfcAfL96	usGfsuCfcAfuUfuUfuggCfaUfgsasc	1631-1653
3499	3500	AD-59117	CfsasUfuCfuUfaUfCfCfcGfaGfuCfcAfL96	usGfsgAfcUfcGfgGfauaAfgAfasusg	363-385
3501	3502	AD-59118	AfscsCfcUfgGfcUfAfAfgAfuGfaUfgAfL96	usCfsaUfcAfuCfuUfagcCfaGfgsgsu	1301-1323
3503	3504	AD-59119	CfsusCfuUfcAfcCfCfUfgGfcUfaAfgAfL96	usCfsuUfaGfcCfaGfgguGfaAfgsasg	1295-1317
3505	3506	AD-59120	AfsusGfcCfaAfaAfAfUfgGfaCfaUfcAfL96	usGfsaUfgUfcCfaUfuuuUfgGfcsasu	1634-1656
3507	3508	AD-59121	UfsgsCfcCfcAfaGfAfUfgAfuGfgAfaUfL96	asUfsuCfcAfuCfaUfcuuGfgGfgscsa	434-456
3509	3510	AD-59122	GfsasAfcCfaUfgCfCfUfcCfaUfgAfuAfL96	usAfsuCfaUfgGfaGfgcaUfgGfususc	1348-1370

3511	3512	AD-59123	UfscsUfuCfaCfcCfUfGfgCfuAfaGfaUfL96	asUfscUfuAfgCfcAfgggUfgAfasgsa	1296-1318
3513	3514	AD-59124	UfsgsCfcAfaAfaAfUfGfgAfcAfuCfaUfL96	asUfsgAfuGfuCfcAfuuuUfuGfgscsa	1635-1657
3515	3516	AD-59125	CfscsAfgAfaAfgAfGfUfgUfcUfcAfuAfL96	usAfsuGfaGfaCfaCfucuUfuCfusgsg	872-894
3517	3518	AD-59126	GfsasAfaCfuGfuCfCfAfuUfcAfaUfgAfL96	usCfsaUfuGfaAfuGfgacAfgUfususc	1481-1503
3519	3520	AD-59127	UfscsAfcCfcUfgGfCfUfaAfgAfuGfaUfL96	asUfscAfuCfuUfaGfccaGfgGfusgsa	1299-1321
3521	3522	AD-59128	CfscsCfuGfgAfgUfCfUfgUfgCfgGfaUfL96	asUfscCfgCfaCfaGfacuCfcAfgsgsg	1791-1813
3523	3524	AD-59129	GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuAfL96	usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfususc	875-897
3525	3526	AD-59130	UfsgsGfaGfcCfcUfGfGfaGfuCfuGfuAfL96	usAfscAfgAfcUfcCfaggGfcUfcscsa	1786-1808

Таблица 15 Немодифицированные последовательности одиночных нитей и дуплексов ALAS1 человека
SEQ ID NO: (смысловая)	SEQ ID NO: (антисмысловая)	Название дуплекса	Смысловая последовательность (5'-3')	Антисмысловая последовательность (5'-3')	Сайты-мишени антисмысловой последовательности на NM_ 000688.4
3684	3527	AD-58848	CAUGCCAAAAAUGGACAUCAU	AUGAUGUCCAUUUUUGGCAUGAC	1635-1657
3528	3529	AD-58849	AUUUUGAAGUGAUGAGUGAAA	UUUCACUCAUCACUUCAAAAUGC	2189-2211
3530	3531	AD-58850	AGUUAUAUUAAAUUUUAAUCU	AGAUUAAAAUUUAAUAUAACUUA	2344-2366
3532	3533	AD-58851	GCAUUUUGAAGUGAUGAGUGA	UCACUCAUCACUUCAAAAUGCAG	2187-2209
3534	3535	AD-58852	GAACUAAUGAGCAGACAUAAC	GUUAUGUCUGCUCAUUAGUUCAU	1975-1997
3536	3537	AD-58853	AAUGACCACACCUAUCGAGUU	AACUCGAUAGGUGUGGUCAUUCU	973-995
3538	3539	AD-58854	UAAAUUUUAAUCUAUAGUAAA	UUUACUAUAGAUUAAAAUUUAAU	2352-2374
3540	3541	AD-58855	UUCAGUAUGAUCGUUUCUUUG	CAAAGAAACGAUCAUACUGAAAA	929-951
3542	3543	AD-58856	CACUUUUCAGUAUGAUCGUUU	AAACGAUCAUACUGAAAAGUGGA	924-946
3544	3545	AD-58857	AAAUCUGUUUCCACUUUUCAG	CUGAAAAGUGGAAACAGAUUUUG	913-935
3546	3547	AD-58858	CAUUUGAAACUGUCCAUUCAA	UUGAAUGGACAGUUUCAAAUGCC	1478-1500
3548	3549	AD-58859	CCUAUCGAGUUUUUAAAACUG	CAGUUUUAAAAACUCGAUAGGUG	983-1005
3550	3551	AD-58861	GACCAGAAAGAGUGUCUCAUC	GAUGAGACACUCUUUCUGGUCUU	872-894
3552	3553	AD-58862	ACCAGAAAGAGUGUCUCAUCU	AGAUGAGACACUCUUUCUGGUCU	873-895

3554	3555	AD-58863	ACUAAUGAGCAGACAUAACAU	AUGUUAUGUCUGCUCAUUAGUUC	1977-1999
3556	3557	AD-58864	UAGUAAAAACAUAGUCCUGGA	UCCAGGACUAUGUUUUUACUAUA	2366-2388
3558	3559	AD-58865	UAUUUCUGGAACUAGUAAAUU	AAUUUACUAGUUCCAGAAAUAUU	1185-1207
3560	3561	AD-58867	UUCUGCAAAGCCAGUCUUGAG	CUCAAGACUGGCUUUGCAGAAGA	706-728
3562	3563	AD-58868	GAGGAAAGAGGUUGCUGAAAC	GUUUCAGCAACCUCUUUCCUCAC	759-781
3564	3565	AD-58869	GGUACUAGAAAUAUUUCUGGA	UCCAGAAAUAUUUCUAGUACCAC	1174-1196
3566	3567	AD-58870	GACAUCAUGCAAAAGCAAAGA	UCUUUGCUUUUGCAUGAUGUCCU	853-875
3568	3569	AD-58871	AAAUUUUAAUCUAUAGUAAAA	UUUUACUAUAGAUUAAAAUUUAA	2353-2375
3570	3571	AD-58873	CAUGAUCCAAGGGAUUCGAAA	UUUCGAAUCCCUUGGAUCAUGGA	1362-1384
3572	3573	AD-58874	AGACCAGAAAGAGUGUCUCAU	AUGAGACACUCUUUCUGGUCUUU	871-893
3574	3575	AD-58875	AUCCUGAAGAGCGCUGAGGGA	UCCCUCAGCGCUCUUCAGGAUCC	1810-1832
3576	3577	AD-58876	GUCUGUGAUGAACUAAUGAGC	GCUCAUUAGUUCAUCACAGACUU	1966-1988
3578	3579	AD-58877	CAGAAAGAGUGUCUCAUCUUC	GAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU	875-897
3580	3581	AD-58878	ACUUUUCAGUAUGAUCGUUUC	GAAACGAUCAUACUGAAAAGUGG	925-947
3582	3583	AD-58879	UCAUGCCAAAAAUGGACAUCA	UGAUGUCCAUUUUUGGCAUGACU	1634-1656
3584	3585	AD-58880	AAUAUUUCUGGAACUAGUAAA	UUUACUAGUUCCAGAAAUAUUUC	1183-1205
3586	3587	AD-58881	CUUCUUCAAGAUAACUUGCCA	UGGCAAGUUAUCUUGAAGAAGAU	892-914
3588	3589	AD-58882	UUUCAGUAUGAUCGUUUCUUU	AAAGAAACGAUCAUACUGAAAAG	928-950
3590	3591	AD-58883	CCCAGUGUGGUUAGUGUGAAA	UUUCACACUAACCACACUGGGGC	790-812
3592	3593	AD-58884	GCUGUGAGAUUUACUCUGAUU	AAUCAGAGUAAAUCUCACAGCCU	1325-1347
3594	3595	AD-58885	AGGCUUGAGCAAGUUGGUAUC	GAUACCAACUUGCUCAAGCCUGA	2229-2251
3596	3597	AD-58886	GAAAGAGUGUCUCAUCUUCUU	AAGAAGAUGAGACACUCUUUCUG	877-899
3598	3599	AD-58887	AUUUCUGGAACUAGUAAAUUC	GAAUUUACUAGUUCCAGAAAUAU	1186-1208
3600	3601	AD-58888	UGUGAUGUGGCCCAUGAGUUU	AAACUCAUGGGCCACAUCACACA	1531-1553
3602	3603	AD-58889	AAGAGAGAAGUCCUAUUUCUC	GAGAAAUAGGACUUCUCUCUUUC	2208-2230
3604	3605	AD-58890	UGGCAGCACAGAUGAAUCAGA	UCUGAUUCAUCUGUGCUGC	671-693

				CAGG
3606	3607	AD-58891	AUGAUCGUUUCUUUGAGAAAA	UUUUCUCAAAGAAACGAUCAUAC	935-957
3608	3609	AD-58892	UCUGGAACUAGUAAAUUCCAU	AUGGAAUUUACUAGUUCCAGAAA	1189-1211
3610	3611	AD-59095	GCCCAUUCUUAUCCCGAGU	ACUCGGGAUAAGAAUGGGC	360-382
3612	3613	AD-59096	GGAACCAUGCCUCCAUGAU	AUCAUGGAGGCAUGGUUCC	1347-1369
3614	3615	AD-59097	UGGAGUCUGUGCGGAUCCU	AGGAUCCGCACAGACUCCA	1794-1816
3616	3617	AD-59098	CACCCACGGGUGUGUGGGA	UCCCACACACCCGUGGGUG	1112-1134
3618	3619	AD-59099	GGAGUCUGUGCGGAUCCUA	UAGGAUCCGCACAGACUCC	1795-1817
3620	3621	AD-59100	CAAAACUGCCCCAAGAUGA	UCAUCUUGGGGCAGUUUUG	428-450
3622	3623	AD-59101	GCCUCCAUGAUCCAAGGGA	UCCCUUGGAUCAUGGAGGC	1355-1377
3624	3625	AD-59102	CAUCAUCCCUGUGCGGGUU	AACCCGCACAGGGAUGAUG	1921-1943
3626	3627	AD-59103	ACCCACGGGUGUGUGGGGA	UCCCCACACACCCGUGGGU	1113-1135
3628	3629	AD-59104	CACAUCAUCCCUGUGCGGA	UCCGCACAGGGAUGAUGUG	1919-1941
3630	3631	AD-59105	CAGAAAGAGUGUCUCAUCU	AGAUGAGACACUCUUUCUG	873-895
3632	3633	AD-59106	CCUCCAUGAUCCAAGGGAU	AUCCCUUGGAUCAUGGAGG	1356-1378
3634	3635	AD-59107	UGCCCAUUCUUAUCCCGAA	UUCGGGAUAAGAAUGGGCA	359-381
3636	3637	AD-59108	CUUCACCCUGGCUAAGAUA	UAUCUUAGCCAGGGUGAAG	1297-1319
3638	3639	AD-59109	AUCAUCCCUGUGCGGGUUA	UAACCCGCACAGGGAUGAU	1922-1944
3640	3641	AD-59110	AGAAAGAGUGUCUCAUCUU	AAGAUGAGACACUCUUUCU	874-896
3642	3643	AD-59111	CUCCAUGAUCCAAGGGAUU	AAUCCCUUGGAUCAUGGAG	1357-1379
3644	3645	AD-59112	CCAUUCUUAUCCCGAGUCA	UGACUCGGGAUAAGAAUGG	362-384
3646	3647	AD-59113	CACCCUGGCUAAGAUGAUA	UAUCAUCUUAGCCAGGGUG	1300-1322
3648	3649	AD-59114	UCAUCCCUGUGCGGGUUGA	UCAACCCGCACAGGGAUGA	1923-1945
3650	3651	AD-59115	AAGAGUGUCUCAUCUUCUU	AAGAAGAUGAGACACUCUU	877-899
3652	3653	AD-59116	GUCAUGCCAAAAAUGGACA	UGUCCAUUUUUGGCAUGAC	1631-1653
3654	3655	AD-59117	CAUUCUUAUCCCGAGUCCA	UGGACUCGGGAUAAGAAUG	363-385
3656	3657	AD-59118	ACCCUGGCUAAGAUGAUGA	UCAUCAUCUUAGCCAGGGU	1301-1323
3658	3659	AD-59119	CUCUUCACCCUGGCUAAGA	UCUUAGCCAGGGUGAAGAG	1295-1317
3660	3661	AD-59120	AUGCCAAAAAUGGACAUCA	UGAUGUCCAUUUUUGGCAU	1634-1656
3662	3663	AD-59121	UGCCCCAAGAUGAUGGAAU	AUUCCAUCAUCUUGGGGCA	434-456
3664	3665	AD-59122	GAACCAUGCCUCCAUGAUA	UAUCAUGGAGGCAUGGUUC	1348-1370
3666	3667	AD-59123	UCUUCACCCUGGCUAAGAU	AUCUUAGCCAGGGUGAAGA	1296-1318
3668	3669	AD-59124	UGCCAAAAAUGGACAUCAU	AUGAUGUCCAUUUUUGGCA	1635-1657
3670	3671	AD-59125	CCAGAAAGAGUGUCUCAUA	UAUGAGACACUCUUUCUGG	872-894
3672	3673	AD-59126	GAAACUGUCCAUUCAAUGA	UCAUUGAAUGGACAGUUUC	1481-1503
3674	3675	AD-59127	UCACCCUGGCUAAGAUGAU	AUCAUCUUAGCCAGGGUGA	1299-1321
3676	3677	AD-59128	CCCUGGAGUCUGUGCGGAU	AUCCGCACAGACUCCAGGG	1791-1813
3678	3679	AD-59129	GAAAGAGUGUCUCAUCUUA	UAAGAUGAGACACUCUUUC	875-897
3680	3681	AD-59130	UGGAGCCCUGGAGUCUGUA	UACAGACUCCAGGGCUCCA	1786-1808

Результаты анализов in vitro представлены в таблице 16. В таблице 16 также указаны виды-мишени для каждой ми-РНК.

	Таблица 16 Результаты функциональных анализов
			Свободный захват Cyno	Трансфекция Cyno	Трансфекция Hep3b
Номер дуплекса	Виды-мишени	Тип	1 мкМ среднее	500 нМ	20 нМ среднее	10 нМ	20 нМ среднее	0,2 нМ среднее	10 нМ среднее	0,1нМ среднее
AD-58848	M/R/Rh/H	21/23	131,6	176,0	104,4	128,0	43,5	44,8	25,3	76,8
AD-58849	H/Rh	21/23	91,9	88,1	92,2	105,0	29,4	35,4	11,5	47,1
AD-58850	H/Rh	21/23	79,4	103,4	80,0	111,2	Нет данных	62,2	31,3	72,0
AD-58851	H/Rh	21/23	99,7	74,7	94,8	104,7	Нет данных	40,7	8,6	81,3
AD-58852	H/Rh	21/23	108,1	91,8	103,3	111,9	101,1	128,8	43,4	129,0
AD-58853	H/Rh	21/23	74,8	67,7	84,2	93,5	24,7	52,9	14,1	61,2
AD-58854	H/Rh	21/23	145,9	124,1	106,6	115,3	119,0	83,9	85,0	84,0
AD-58855	H/Rh	21/23	81,5	97,9	92,7	101,8	39,5	40,3	15,3	67,6
AD-58856	H/Rh	21/23	74,1	90,6	84,6	82,6	22,4	30,7	8,7	33,3
AD-58857	H/Rh	21/23	64,7	91,4	62,3	87,1	22,0	31,6	9,8	106,3
AD-58858	H/Rh	21/23	67,4	91,7	68,6	98,3	27,9	40,3	17,4	44,8
AD-58859	H/Rh	21/23	71,2	77,2	92,4	90,1	19,1	34,3	13,1	39,7
AD-58861	H/Rh	21/23	104,6	107,2	102,0	100,6	25,9	35,1	18,0	69,8
AD-58862	H/Rh	21/23	66,8	77,0	68,7	88,5	20,3	31,1	24,2	49,9
AD-58863	H/Rh	21/23	70,8	66,8	76,8	98,5	21,5	29,7	8,7	54,9
AD-58864	H/Rh	21/23	76,2	85,6	83,7	100,8	60,4	61,0	56,4	87,3
AD-58865	H/Rh	21/23	67,9	77,9	95,9	98,4	21,3	38,6	15,5	81,4
AD-58867	H/Rh	21/23	95,9	93,3	107,0	97,5	32,3	42,7	16,6	79,8
AD-58868	H/Rh	21/23	95,2	92,1	116,2	94,7	54,6	69,2	61,5	105,9
AD-58869	H/Rh	21/23	65,0	78,2	75,8	88,2	17,4	25,0	13,0	63,9
AD-58870	H/Rh	21/23	69,4	92,3	81,0	88,1	29,2	43,8	33,7	79,1
AD-58871	H/Rh	21/23	61,2	77,3	88,2	77,0	71,2	73,2	36,7	110,3
AD-58873	H/Rh	21/23	95,2	100,9	83,3	94,6	54,2	52,8	36,6	73,3

AD-58874	H/Rh	21/23	75,8	76,8	63,8	85,3	22,3	31,2	15,0	38,2
AD-58875	H/Rh	21/23	80,7	88,7	78,6	97,9	48,6	73,6	61,2	90,6
AD-58876	H/Rh	21/23	90,8	93,1	82,5	100,2	41,1	56,9	21,2	58,7
AD-58877	H/Rh	21/23	68,3	85,1	51,2	78,7	18,5	46,6	11,9	27,4
AD-58878	H/Rh	21/23	78,3	68,3	81,2	91,2	24,1	23,4	6,2	37,1
AD-58879	H/Rh	21/23	87,9	94,1	79,7	95,4	32,0	47,8	15,7	82,5
AD-58880	H/Rh	21/23	74,9	72,2	88,9	88,1	20,1	27,5	14,0	60,7
AD-58881	H/Rh	21/23	85,9	76,8	78,8	118,0	22,2	36,7	27,6	71,6
AD-58882	H/Rh	21/23	54,1	53,4	60,3	85,8	14,6	27,2	8,2	23,8
AD-58883	H/Rh	21/23	80,4	69,9	75,7	80,3	31,8	25,8	12,3	63,0
AD-58884	H/Rh	21/23	57,7	55,3	64,8	78,2	20,0	30,0	11,8	68,9
AD-58885	H/Rh	21/23	101,8	91,8	104,1	101,5	85,9	71,9	61,8	71,2
AD-58886	M/R/Rh/H	21/23	47,1	58,0	36,3	93,3	16,0	26,6	9,2	32,0
AD-58887	H/Rh	21/23	73,6	98,7	82,6	95,2	28,5	33,5	12,8	65,2
AD-58888	H/Rh	21/23	90,2	69,9	69,4	85,6	46,9	45,0	16,6	72,0
AD-58889	H/Rh	21/23	83,6	98,6	82,4	92,2	36,5	40,3	31,6	99,4
AD-58890	H/Rh	21/23	69,5	95,4	84,2	88,2	50,8	45,6	21,7	92,9
AD-58891	H/Rh	21/23	62,8	75,7	75,4	109,2	23,6	34,3	15,6	55,8
AD-58892	H/Rh	21/23	60,2	92,9	89,8	92,9	22,8	43,3	20,2	75,6
AD-59095	M/R/Rh/H	19мер.	88,9	Нет данных	132,8	Нет данных	48,3	97,4	54,3	99,0
AD-59096	M/R/Rh/H	19мер.	95,5	Нет данных	90,5	Нет данных	105,7	138,6	131,4	120,7
AD-59097	M/R/Rh/H	19мер.	92,5	Нет данных	84,2	Нет данных	75,0	NA	94,7	108,5
AD-59098	M/R/Rh/H	19мер.	84,0	Нет данных	87,7	Нет данных	109,3	NA	130,0	87,3
AD-59099	M/R/Rh/H	19мер.	89,7	Нет данных	90,0	Нет данных	77,8	85,4	46,8	74,9
AD-59100	M/R/Rh/H	19мер.	84,8	Нет данных	144,3	Нет данных	70,6	108,1	91,5	117,6
AD-	M/R/Rh/H	19мер.	79,0	Нет	103,8	Нет	89,8	102,9	124,2	107,0

59101				данных		данных
AD-59102	M/R/Rh/H	19мер.	85,9	Нет данных	100,6	Нет данных	72,2	68,5	87,9	95,1
AD-59103	M/R/Rh/H	19мер.	86,0	Нет данных	91,1	Нет данных	93,0	81,3	130,0	96,0
AD-59104	M/R/Rh/H	19мер.	92,6	Нет данных	96,9	Нет данных	94,9	91,4	124,4	83,1
AD-59105	M/R/Rh/H	19мер.	48,9	Нет данных	101,7	Нет данных	18,4	48,9	17,0	34,7
AD-59106	M/R/Rh/H	19мер.	63,2	Нет данных	76,7	Нет данных	28,5	40,7	28,6	46,4
AD-59107	M/R/Rh/H	19мер.	71,4	Нет данных	68,7	Нет данных	37,1	45,3	26,8	63,6
AD-59108	M/R/Rh/H	19мер.	70,7	Нет данных	85,1	Нет данных	89,9	84,8	139,2	101,7
AD-59109	M/R/Rh/H	19мер.	86,1	Нет данных	83,4	Нет данных	84,9	96,2	131,7	86,7
AD-59110	M/R/Rh/H	19мер.	70,8	Нет данных	119,7	Нет данных	38,5	60,4	67,4	80,3
AD-59111	M/R/Rh/H	19мер.	66,1	Нет данных	76,5	Нет данных	52,2	61,0	69,7	87,6
AD-59112	M/R/Rh/H	19мер.	71,2	Нет данных	80,2	Нет данных	91,2	83,4	127,4	89,0
AD-59113	M/R/Rh/H	19мер.	67,0	Нет данных	77,8	Нет данных	49,1	59,0	66,8	91,4
AD-59114	M/R/Rh/H	19мер.	81,7	Нет данных	79,3	Нет данных	96,3	88,0	129,6	72,4
AD-59115	M/R/Rh/H	19мер.	40,4	Нет данных	69,6	Нет данных	19,6	35,7	9,3	16,9
AD-59116	M/R/Rh/H	19мер.	72,2	Нет данных	78,3	Нет данных	53,5	77,8	70,1	107,8
AD-59117	M/R/Rh/H	19мер.	70,7	Нет данных	75,6	Нет данных	75,8	74,9	129,0	103,5
AD-59118	M/R/Rh/H	19мер.	68,8	Нет данных	75,9	Нет данных	81,4	82,1	114,1	89,7
AD-59119	M/R/Rh/H	19мер.	64,9	Нет данных	86,5	Нет данных	85,1	125,1	122,8	124,8
AD-59120	M/R/Rh/H	19мер.	63,5	Нет данных	75,1	Нет данных	29,9	52,0	16,1	54,1
AD-59121	M/R/Rh/H	19мер.	67,6	Нет данных	72,0	Нет данных	88,8	77,4	108,0	103,1
AD-59122	M/R/Rh/H	19мер.	60,2	Нет данных	62,3	Нет данных	25,1	45,3	16,2	54,8
AD-59123	M/R/Rh/H	19мер.	68,6	Нет данных	108,2	Нет данных	59,2	84,6	80,0	97,7
AD-59124	M/R/Rh/H	19мер.	47,5	Нет данных	56,5	Нет данных	23,9	40,0	9,8	18,9
AD-59125	M/R/Rh/H	19мер.	45,4	Нет данных	47,2	Нет данных	15,2	40,7	14,7	15,1
AD-59126	M/R/Rh/H	19мер.	64,3	Нет данных	74,6	Нет данных	51,6	57,1	35,5	54,4

AD-59127	M/R/Rh/H	19мер.	103,4	Нет данных	105,8	Нет данных	94,0	156,4	135,9	113,7
AD-59128	M/R/Rh/H	19мер.	102,4	Нет данных	81,4	Нет данных	66,3	89,3	60,2	74,9
AD-59129	M/R/Rh/H	19мер.	41,3	Нет данных	38,8	Нет данных	17,9	41,4	8,6	12,6
AD-59130	M/R/Rh/H	19мер.	58,3	Нет данных	80,8	Нет данных	94,9	78,3	106,7	88,0

Таблица 17 иллюстрирует IC₅₀ выбранных дуплексов ми-РНК ALAS1. IC₅₀ определяли на основании нокдауна эндогенно экспрессируемого ALAS1 в линии клеток Hep3B через 24 часа после трансфекции каждого модифицированного дуплекса ми-РНК ALAS1 (См. таблицу 14). По меньшей мере, семь дуплексов, включая AD-58882, AD-58878, AD-58886, AD-58877, AD-59115, AD-58856 и AD-59129, соответственно имели IC₅₀ меньше 0,1 нМ, что свидетельствует о том, что такие дуплексы особенно эффективны в подавлении экспрессии ALAS1.

Таблица 17 IC50 выбранных дуплексов ми-РНК ALAS1
	IC50 (нМ)
Номер дуплекса	384w IC50 (нМ)	96w IC50 (нМ)
AD-58882	0,008	0,014
AD-58878	0,040	0,031
AD-58886	0,037	0,033
AD-58877	0,031	0,034
AD-59115	0,093	0,052
AD-58856	0,061	0,066
AD-59129	0,085	0,071
AD-59124	0,572	0,078
AD-58874	0,140	0,102
AD-59125	0,118	0,115
AD-59105	0,511	0,144
AD-59120	180,592	0,498
AD-59122	36,646	0,646
AD-59106	7,906	0,847
AD-59126	нет данных	1,014
AD-59107	нет данных	1,971

Пример 11. Активность ALAS1-GalNAc в мышиной модели индуцированной фенобарбиталом AIP

Мышиную модель AIP использовали для исследования эффекта ми-РНК, которая представляла собой конъюгат ALAS1-GalNAc. ми-РНК имела последовательность дуплекса AD-58632 (См. таблицу 20).

Таблица 20 Последовательности дуплекса ми-РНК ALAS1 AD-58632
SEQ ID NO: (смысловая)	SEQ ID NO: (антисмысловая)	Сайты-мишени антисмысловой последовательности	Название дуплекса	Смысловая последовательность (5'-3')	Антисмысловая последовательность (5'-3')
4149	4150	877-899	AD-58632	GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96	asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg

Мышей AIP не обрабатывали (исходный уровень) или им подкожно инъецировали в 1 день физиологический раствор или конъюгат ALAS1-GalNAc в дозе 20 мг/кг. На 2, 3 и 4 день их оставляли необработанными (исходный уровень), или их обрабатывали с использованием внутрибрюшинных инъекций фенобарбитала. На 5 день собирали плазму и измеряли уровни ALA и PBG, используя анализ ЖХ-МС. Как показано на фиг. 15, конъюгат ALAS1-GalNAc ослаблял продукцию ALA и PBG в плазме примерно на 84 и 80%, соответственно. Полученные результаты свидетельствуют, что лечение конъюгатом ALAS1-GalNAc эффективно предотвращает повышение уровней ALA и PBG в плазме, ассоциированные с индуцированными фенобарбиталом острыми приступами, в такой животной модели AIP.

Пример 12. Дополнительные ми-РНК, которые нацелены на ALAS1 в качестве мишени и ингибируют экспрессию ALAS1

Модифицированные последовательности ми-РНК, мишенью которых является мРНК ALAS1, конструировали и получали, как описано в примере 2. Последовательности представлены в таблице 18. Активность in vitro модифицированных дуплексов тестировали, как описано ниже.

Таблица 18 Модифицированные последовательности одиночных нитей и дуплексов ALAS1 человека
SEQ ID NO: (смысловая)	SEQ ID NO: (антисмысловая)	Название дуплекса	Смысловая последовательность (5'-3')	Антисмысловая последовательность (5'-3')	Сайты-мишени антисмысловой последовательности на NM_ 000688.4
3685	3686	AD-59453	CAGGCAAAUCUCUGUUGUUdTdT	AACAACAGAGAUUUGCCUGdTdT	402-420

3687	3688	AD-59395	GAAAAAAAUUGAUGAGAAAdTdT	UUUCUCAUCAAUUUUUUUCdTdT	949-967
3689	3690	AD-59477	GGAAAGAUGCCGCACUCUUdTdT	AAGAGUGCGGCAUCUUUCCdTdT	1242-1260
3691	3692	AD-59492	UGUCUCAUCUUCUUCAAGAdTdT	UCUUGAAGAAGAUGAGACAdTdT	882-900
3693	3694	AD-59361	ACAUCUACGUGCAAGCAAUdTdT	AUUGCUUGCACGUAGAUGUdTdT	1992-2010
3695	3696	AD-59462	UUCUCUGAUUGACACCGUAdTdT	UACGGUGUCAAUCAGAGAAdTdT	1711-1729
3697	3698	AD-59433	GCUGCUGGCUUCAUCUUCAdTdT	UGAAGAUGAAGCCAGCAGCdTdT	1739-1757
3699	3700	AD-59424	AGCGCAACGUCAAACUCAUdTdT	AUGAGUUUGACGUUGCGCUdTdT	1851-1869
3701	3702	AD-59414	UAUUUCUGGAACUAGUAAAdTdT	UUUACUAGUUCCAGAAAUAdTdT	1183-1201
3703	3704	AD-59539	GGUUGUGUUGGAGGGUACAdTdT	UGUACCCUCCAACACAACCdTdT	1679-1697
3705	3706	AD-59400	GUGUCAGUCUGGUGCAGUAdTdT	UACUGCACCAGACUGACACdTdT	1070-1088
3707	3708	AD-59551	CUUUGUGGCCAAUGACUCAdTdT	UGAGUCAUUGGCCACAAAGdTdT	1273-1291
3709	3710	AD-59482	AGAUGCUGCUAAAAACACAdTdT	UGUGUUUUUAGCAGCAUCUdTdT	1942-1960
3711	3712	AD-59448	GAGUCAUGCCAAAAAUGGAdTdT	UCCAUUUUUGGCAUGACUCdTdT	1629-1647
3713	3714	AD-59392	CUGUGCGGAUCCUGAAGAGdTdT	CUCUUCAGGAUCCGCACAGdTdT	1800-1818
3715	3716	AD-59469	CACUUUGAAACAACAUGGUdTdT	ACCAUGUUGUUUCAAAGUGdTdT	1141-1159
3717	3718	AD-59431	AAGUGAUGAGUGAAAGAGAdTdT	UCUCUUUCACUCAUCACUUdTdT	2193-2211
3719	3720	AD-59423	AUCUGCUAGUCACAUGGAAdTdT	UUCCAUGUGACUAGCAGAUdTdT	2103-2121
3721	3722	AD-59517	UGGGGCAGGUGGUACUAGAdTdT	UCUAGUACCACCUGCCCCAdTdT	1162-1180
3723	3724	AD-59578	GCAGAUGACUAUUCAGACUdTdT	AGUCUGAAUAGUCAUCUGCdTdT	1031-1049
3725	3726	AD-59495	GCCUCAUUCCUCAGCUGAGdTdT	CUCAGCUGAGGAAUGAGGCdTdT	2143-2161
3727	3728	AD-59432	GUAUGAUCGUUUCUUUGAGdTdT	CUCAAAGAAACGAUCAUACdTdT	931-949
3729	3730	AD-59382	UAUCCAGAUGGUCUUCAGAdTdT	UCUGAAGACCAUCUGGAUAdTdT	2302-2320
3731	3732	AD-59472	UAGUGUGAAAACCGAUGGAdTdT	UCCAUCGGUUUUCACACUAdTdT	799-817
3733	3734	AD-59459	UCCCCAUGGCAGAUGACUAdTdT	UAGUCAUCUGCCAUGGGGAdTdT	1023-1041
3735	3736	AD-59413	CCACUGCAGCAGUACACUAdTdT	UAGUGUACUGCUGCAGUGGdTdT	483-501
3737	3738	AD-	CUGUGAACCGGCGAGCACAdTdT	UGUGCUCGCCGGUUCACAG	999-1017

		59478		dTdT
3739	3740	AD-59376	GGUCCUAUGCUGCUGGCUUdTdT	AAGCCAGCAGCAUAGGACCdTdT	1731-1749
3741	3742	AD-59556	AGCCUUUGGUUGUGUUGGAdTdT	UCCAACACAACCAAAGGCUdTdT	1672-1690
3743	3744	AD-59399	AAUUCCAUGUGGACUUAGAdTdT	UCUAAGUCCACAUGGAAUUdTdT	1200-1218
3745	3746	AD-59474	CCAGGGCACUGCAAGCAAAdTdT	UUUGCUUGCAGUGCCCUGGdTdT	640-658
3747	3748	AD-53542	cuuuucAGuAuGAucGuuudTsdT	AAACGAUcAuACUGAAAAGdTsdT	924-942
3749	3750	AD-59480	GAAUCAGAGAGGCAGCAGUdTdT	ACUGCUGCCUCUCUGAUUCdTdT	682-700
3751	3752	AD-59549	GCAAAGAUCUGACCCCUCAdTdT	UGAGGGGUCAGAUCUUUGCdTdT	1441-1459
3753	3754	AD-59515	GGAGAAGAGCUCCUACGGAdTdT	UCCGUAGGAGCUCUUCUCCdTdT	2033-2051
3755	3756	AD-59427	CCAUGAGUUUGGAGCAAUCdTdT	GAUUGCUCCAAACUCAUGGdTdT	1540-1558
3757	3758	AD-59390	CUUUGAGAAAAAAAUUGAUdTdT	AUCAAUUUUUUUCUCAAAGdTdT	943-961
3759	3760	AD-59511	UGAGCAGACAUAACAUCUAdTdT	UAGAUGUUAUGUCUGCUCAdTdT	1980-1998
3761	3762	AD-59532	CGUGCAAGCAAUCAAUUACdTdT	GUAAUUGAUUGCUUGCACGdTdT	1999-2017
3763	3764	AD-59562	AAAGCAAAGACCAGAAAGAdTdT	UCUUUCUGGUCUUUGCUUUdTdT	862-880
3765	3766	AD-59513	GGAUGUGCAGGAAAUGAAUdTdT	AUUCAUUUCCUGCACAUCCdTdT	733-751
3767	3768	AD-59362	CAGCAUACUUCCUGAACAUdTdT	AUGUUCAGGAAGUAUGCUGdTdT	321-339
3769	3770	AD-53541	GcAGcAcAGAuGAAucAGAdTsdT	UCUGAUUcAUCUGUGCUGCdTsdT	671-689
3771	3772	AD-59490	UCUGUUGUUCUAUGCCCAAdTdT	UUGGGCAUAGAACAACAGAdTdT	412-430
3773	3774	AD-59422	UGAGACAGAUGCUAAUGGAdTdT	UCCAUUAGCAUCUGUCUCAdTdT	1869-1887
3775	3776	AD-59467	GCCAAUGACUCAACCCUCUdTdT	AGAGGGUUGAGUCAUUGGCdTdT	1280-1298
3777	3778	AD-59579	GAGUGCAACUUCUGCAGGAdTdT	UCCUGCAGAAGUUGCACUCdTdT	2159-2177
3779	3780	AD-59426	GUGAAAGAGAGAAGUCCUAdTdT	UAGGACUUCUCUCUUUCACdTdT	2202-2220
3781	3782	AD-59363	UAACUUGCCAAAAUCUGUUdTdT	AACAGAUUUUGGCAAGUUAdTdT	901-919
3783	3784	AD-59436	AAGCCAGUCUUGAGCUUCAdTdT	UGAAGCUCAAGACUGGCUUdTdT	711-729
3785	3786	AD-53536	cAcuuuucAGuAuGAucGudTsdT	ACGAUcAuACUGAAAAGUGdTsdT	922-940
3787	3788	AD-59491	GCAGCAGUGUCUUCUGCAAdTdT	UUGCAGAAGACACUGCUGCdTdT	693-711

3789	3790	AD-59500	UCCUGAACAUGGAGAGUGUdTdT	ACACUCUCCAUGUUCAGGAdTdT	330-348
3791	3792	AD-59394	AUUUCUGGAACACUUGGCAdTdT	UGCCAAGUGUUCCAGAAAUdTdT	1652-1670
3793	3794	AD-59441	CAGUACACUACCAACAGAUdTdT	AUCUGUUGGUAGUGUACUGdTdT	492-510
3795	3796	AD-59365	GCAUGACCUCAAUUAUUUCdTdT	GAAAUAAUUGAGGUCAUGCdTdT	2261-2279
3797	3798	AD-59411	AGAACUGCUGCAAAGAUCUdTdT	AGAUCUUUGCAGCAGUUCUdTdT	1432-1450
3799	3800	AD-59544	CACCCCAGAUGAUGAACUAdTdT	UAGUUCAUCAUCUGGGGUGdTdT	2073-2091
3801	3802	AD-59428	GAUCCAAGGGAUUCGAAACdTdT	GUUUCGAAUCCCUUGGAUCdTdT	1363-1381
3803	3804	AD-59471	CUCAUCACCAAAAAGCAAGdTdT	CUUGCUUUUUGGUGAUGAGdTdT	1052-1070
3805	3806	AD-59518	ACAACAUGGUGCUGGGGCAdTdT	UGCCCCAGCACCAUGUUGUdTdT	1150-1168
3807	3808	AD-53547	GAucGuuucuuuGAGAAAAdTsdT	UUUUCUcAAAGAAACGAUCdTsdT	935-953
3809	3810	AD-59573	CAGCACGAGUUCUCUGAUUdTdT	AAUCAGAGAACUCGUGCUGdTdT	1702-1720
3811	3812	AD-59473	AAUGAUGUCAGCCACCUCAdTdT	UGAGGUGGCUGACAUCAUUdTdT	1412-1430
3813	3814	AD-59412	AGUUAUGGACACUUUGAAAdTdT	UUUCAAAGUGUCCAUAACUdTdT	1132-1150
3815	3816	AD-59522	GAUGAUGAACUACUUCCUUdTdT	AAGGAAGUAGUUCAUCAUCdTdT	2080-2098
3817	3818	AD-59502	GCAGGAAAUGAAUGCCGUGdTdT	CACGGCAUUCAUUUCCUGCdTdT	739-757
3819	3820	AD-59499	UCUUCAAGAUAACUUGCCAdTdT	UGGCAAGUUAUCUUGAAGAdTdT	892-910
3821	3822	AD-59520	CGAUGGAGGGGAUCCCAGUdTdT	ACUGGGAUCCCCUCCAUCGdTdT	811-829
3823	3824	AD-59581	CCAAAAAGCAAGUGUCAGUdTdT	ACUGACACUUGCUUUUUGGdTdT	1059-1077
3825	3826	AD-59461	GAUUGGGGAUCGGGAUGGAdTdT	UCCAUCCCGAUCCCCAAUCdTdT	1612-1630
3827	3828	AD-59370	CCCUGGAGUCUGUGCGGAUdTdT	AUCCGCACAGACUCCAGGGdTdT	1791-1809
3829	3830	AD-53540	GuuGucuuuAuAuGuGAAudTsdT	AUUcAcAuAuAAAGAcAACdTsdT	2321-2339
3831	3832	AD-59574	CGGGCAUUGUCCACUGCAGdTdT	CUGCAGUGGACAAUGCCCGdTdT	473-491
3833	3834	AD-59375	UAUUCAGACUCCCUCAUCAdTdT	UGAUGAGGGAGUCUGAAUAdTdT	1040-1058
3835	3836	AD-59387	CACUGCAUUUUGAAGUGAUdTdT	AUCACUUCAAAAUGCAGUGdTdT	2181-2199
3837	3838	AD-59397	CCAGAAAGAGUGUCUCAUCdTdT	GAUGAGACACUCUUUCUGGdTdT	872-890
3839	3840	AD-	AGGCGGAGGGAUUGGGGAUdTdT	AUCCCCAAUCCCUCCGCCU	1603-1621

		59396		dTdT
3841	3842	AD-59393	AGACCUCCAUGGGAAAGAUdTdT	AUCUUUCCCAUGGAGGUCUdTdT	1231-1249
3843	3844	AD-59483	GCAGGAGGCCACUGCAUUUdTdT	AAAUGCAGUGGCCUCCUGCdTdT	2172-2190
3845	3846	AD-59430	AUCUGUUUCCACUUUUCAGdTdT	CUGAAAAGUGGAAACAGAUdTdT	913-931
3847	3848	AD-59463	AGAGAAGUCCUAUUUCUCAdTdT	UGAGAAAUAGGACUUCUCUdTdT	2209-2227
3849	3850	AD-53534	GucuucAGAGuuGucuuuAdTsdT	uAAAGAcAACUCUGAAGACdTsdT	2312-2330
3851	3852	AD-59514	GGCUGGAACUGAAGCCUCAdTdT	UGAGGCUUCAGUUCCAGCCdTdT	2130-2148
3853	3854	AD-59575	GCCAUUAUCAUAUCCAGAUdTdT	AUCUGGAUAUGAUAAUGGCdTdT	2292-2310
3855	3856	AD-59364	AGCAGGCCCCAGUGUGGUUdTdT	AACCACACUGGGGCCUGCUdTdT	781-799
3857	3858	AD-59402	UCAGCUGAGUGCAACUUCUdTdT	AGAAGUUGCACUCAGCUGAdTdT	2153-2171
3859	3860	AD-59479	GAGCACACAUCUUCCCCAUdTdT	AUGGGGAAGAUGUGUGCUCdTdT	1011-1029
3861	3862	AD-59481	ACUUCCAGGACAUCAUGCAdTdT	UGCAUGAUGUCCUGGAAGUdTdT	843-861
3863	3864	AD-59530	CCUAUCGAGUUUUUAAAACdTdT	GUUUUAAAAACUCGAUAGGdTdT	981-999
3865	3866	AD-59582	CUUCCUUGAGAAUCUGCUAdTdT	UAGCAGAUUCUCAAGGAAGdTdT	2092-2110
3867	3868	AD-59506	ACCAACAGAUCAAAGAAACdTdT	GUUUCUUUGAUCUGUUGGUdTdT	501-519
3869	3870	AD-59567	UAACCCCAGGCCAUUAUCAdTdT	UGAUAAUGGCCUGGGGUUAdTdT	2283-2301
3871	3872	AD-59485	CCAUGCCUCCAUGAUCCAAdTdT	UUGGAUCAUGGAGGCAUGGdTdT	1351-1369
3873	3874	AD-59525	UGAUGAACUAAUGAGCAGAdTdT	UCUGCUCAUUAGUUCAUCAdTdT	1969-1987
3875	3876	AD-59566	CCUGAAGAGCGCUGAGGGAdTdT	UCCCUCAGCGCUCUUCAGGdTdT	1810-1828
3877	3878	AD-59580	AACACUUGGCAAAGCCUUUdTdT	AAAGGCUUUGCCAAGUGUUdTdT	1660-1678
3879	3880	AD-59512	UCUGCAGAAAGCAGGCAAAdTdT	UUUGCCUGCUUUCUGCAGAdTdT	391-409
3881	3882	AD-59475	CCGGCCUCCCUGUUGUCCAdTdT	UGGACAACAGGGAGGCCGGdTdT	1890-1908
3883	3884	AD-59438	CAUCAUCCCUGUGCGGGUUdTdT	AACCCGCACAGGGAUGAUGdTdT	1921-1939
3885	3886	AD-59442	UGUGCGGGUUGCAGAUGCUdTdT	AGCAUCUGCAACCCGCACAdTdT	1930-1948
3887	3888	AD-59516	GGAAAGAGGUUGCUGAAACdTdT	GUUUCAGCAACCUCUUUCCdTdT	759-777
3889	3890	AD-59429	AGGUCCACGCAGUGGGGCUdTdT	AGCCCCACUGCGUGGACCUdTdT	1572-1590

3891	3892	AD-59510	UGCCGUGAGGAAAGAGGUUdTdT	AACCUCUUUCCUCACGGCAdTdT	751-769
3893	3894	AD-59457	GCUAAUGGAUGCCGGCCUCdTdT	GAGGCCGGCAUCCAUUAGCdTdT	1879-1897
3895	3896	AD-59434	GAAGCAAGUGGGGCUGGAAdTdT	UUCCAGCCCCACUUGCUUCdTdT	2119-2137
3897	3898	AD-59454	CAUCUUCCGCCACAAUGAUdTdT	AUCAUUGUGGCGGAAGAUGdTdT	1399-1417
3899	3900	AD-59468	AUUUCUCAGGCUUGAGCAAdTdT	UUGCUCAAGCCUGAGAAAUdTdT	2220-2238
3901	3902	AD-59565	CCCGAGUCCCCCAGGCCUUdTdT	AAGGCCUGGGGGACUCGGGdTdT	372-390
3903	3904	AD-59416	CAAGCAAAUGCCCUUUCCUdTdT	AGGAAAGGGCAUUUGCUUGdTdT	651-669
3905	3906	AD-59420	CCCCUCAGUCCCCAAGAUUdTdT	AAUCUUGGGGACUGAGGGGdTdT	1453-1471
3907	3908	AD-59552	CUACGGUGCCCCGGGGAGAdTdT	UCUCCCCGGGGCACCGUAGdTdT	2019-2037
3909	3910	AD-59558	AAAACUGCCCCAAGAUGAUdTdT	AUCAUCUUGGGGCAGUUUUdTdT	429-447
3911	3912	AD-59404	ACAAAACUGCUAAGGCCAAdTdT	UUGGCCUUAGCAGUUUUGUdTdT	540-558
3913	3914	AD-59455	GAUUCUGGGAACCAUGCCUdTdT	AGGCAUGGUUCCCAGAAUCdTdT	1340-1358
3915	3916	AD-59496	CCAGAUGGCACACAGCUUCdTdT	GAAGCUGUGUGCCAUCUGGdTdT	593-611
3917	3918	AD-59446	AGGGAUUCGAAACAGCCGAdTdT	UCGGCUGUUUCGAAUCCCUdTdT	1369-1387
3919	3920	AD-59435	CUCUGCAGUCCUCAGCGCAdTdT	UGCGCUGAGGACUGCAGAGdTdT	109-127
3921	3922	AD-59419	CCGCCGCCUCUGCAGUCCUdTdT	AGGACUGCAGAGGCGGCGGdTdT	102-120
3923	3924	AD-59533	CUGGCUGGAGCCCUGGAGUdTdT	ACUCCAGGGCUCCAGCCAGdTdT	1781-1799
3925	3926	AD-59366	GACAUCAUGCAAAAGCAAAdTdT	UUUGCUUUUGCAUGAUGUCdTdT	851-869
3927	3928	AD-59521	GCUUGAGCAAGUUGGUAUCdTdT	GAUACCAACUUGCUCAAGCdTdT	2229-2247
3929	3930	AD-59563	CAGGCUGUGAGAUUUACUCdTdT	GAGUAAAUCUCACAGCCUGdTdT	1320-1338
3931	3932	AD-59534	AGAGCUGUGUGAUGUGGCCdTdT	GGCCACAUCACACAGCUCUdTdT	1522-1540
3933	3934	AD-59407	GGAGCUGGCAGACCUCCAUdTdT	AUGGAGGUCUGCCAGCUCCdTdT	1222-1240
3935	3936	AD-59445	AUCCCAGUGGACUGCUGAAdTdT	UUCAGCAGUCCACUGGGAUdTdT	822-840
3937	3938	AD-59546	GUCAAACUCAUGAGACAGAdTdT	UCUGUCUCAUGAGUUUGACdTdT	1859-1877
3939	3940	AD-59456	CUUUCCUGGCAGCACAGAUdTdT	AUCUGUGCUGCCAGGAAAGdTdT	663-681
3941	3942	AD-	CCCUCCGGCCAGUGAGAAAdTdT	UUUCUCACUGGCCGGAGGG	520-538

		59503		dTdT
3943	3944	AD-59536	CUACCUAGGAAUGAGUCGCdTdT	GCGACUCAUUCCUAGGUAGdTdT	1093-1111
3945	3946	AD-59385	CCCAAGAUUGUGGCAUUUGdTdT	CAAAUGCCACAAUCUUGGGdTdT	1463-1481
3947	3948	AD-59367	GAGCAAUCACCUUCGUGGAdTdT	UCCACGAAGGUGAUUGCUCdTdT	1551-1569
3949	3950	AD-59458	UGCCCAUUCUUAUCCCGAGdTdT	CUCGGGAUAAGAAUGGGCAdTdT	359-377
3951	3952	AD-59381	AAGGCCAAGGUCCAACAGAdTdT	UCUGUUGGACCUUGGCCUUdTdT	551-569
3953	3954	AD-59538	CACACAGCUUCCGUCUGGAdTdT	UCCAGACGGAAGCUGUGUGdTdT	601-619
3955	3956	AD-59421	UUAUGGGGCUCGAGGCGGAdTdT	UCCGCCUCGAGCCCCAUAAdTdT	1591-1609
3957	3958	AD-59388	UGUCUUCUGCAAAGCCAGUdTdT	ACUGGCUUUGCAGAAGACAdTdT	700-718
3959	3960	AD-59444	AGGCCUGAGCAUGACCUCAdTdT	UGAGGUCAUGCUCAGGCCUdTdT	2253-2271
3961	3962	AD-59528	AUGUGAAUUAAGUUAUAUUdTdT	AAUAUAACUUAAUUCACAUdTdT	2332-2350
3963	3964	AD-59498	ACUGCUGAAGAACUUCCAGdTdT	CUGGAAGUUCUUCAGCAGUdTdT	832-850
3965	3966	AD-59497	UGAGAAAGACAAAACUGCUdTdT	AGCAGUUUUGUCUUUCUCAdTdT	532-550
3967	3968	AD-59384	UCAGCCACCUCAGAGAACUdTdT	AGUUCUCUGAGGUGGCUGAdTdT	1419-1437
3969	3970	AD-59452	GGCAACGAGCGUUUCGUUUdTdT	AAACGAAACGCUCGUUGCCdTdT	51-69
3971	3972	AD-59379	CCUGAUGGAUCCCAGCAGAdTdT	UCUGCUGGGAUCCAUCAGGdTdT	572-590
3973	3974	AD-59529	UGUGCCCACUGGAAGAGCUdTdT	AGCUCUUCCAGUGGGCACAdTdT	1509-1527
3975	3976	AD-59389	CCACAGGAGCCAGCAUACUdTdT	AGUAUGCUGGCUCCUGUGGdTdT	311-329
3977	3978	AD-59585	GUGGUACUAGAAAUAUUUCdTdT	GAAAUAUUUCUAGUACCACdTdT	1170-1188
3979	3980	AD-59570	UUCGCCGCUGCCCAUUCUUdTdT	AAGAAUGGGCAGCGGCGAAdTdT	351-369
3981	3982	AD-59415	CCGCCAGCACCAGCGCAACdTdT	GUUGCGCUGGUGCUGGCGGdTdT	1840-1858
3983	3984	AD-59505	CGCUGAGGGACGGGUGCUUdTdT	AAGCACCCGUCCCUCAGCGdTdT	1819-1837
3985	3986	AD-59557	UGGACUUCUCGACUUGAGUdTdT	ACUCAAGUCGAGAAGUCCAdTdT	69-87
3987	3988	AD-59548	AAAGAAACCCCUCCGGCCAdTdT	UGGCCGGAGGGGUUUCUUUdTdT	512-530
3989	3990	AD-59487	UUGACACCGUACGGUCCUAdTdT	UAGGACCGUACGGUGUCAAdTdT	1719-1737
3991	3992	AD-59550	CCCUCUUCACCCUGGCUAAdTdT	UUAGCCAGGGUGAAGAGGGdTdT	1293-1311

3993	3994	AD-59572	CCCCCAGGCCUUUCUGCAGdTdT	CUGCAGAAAGGCCUGGGGGdTdT	379-397
3995	3996	AD-59554	AUGCCCAAAACUGCCCCAAdTdT	UUGGGGCAGUUUUGGGCAUdTdT	423-441
3997	3998	AD-59437	CUUGAGUGCCCGCCUCCUUdTdT	AAGGAGGCGGGCACUCAAGdTdT	81-99
3999	4000	AD-59584	GGGUACAUCGCCAGCACGAdTdT	UCGUGCUGGCGAUGUACCCdTdT	1691-1709
4001	4002	AD-59373	GUGUGGGGCAGUUAUGGACdTdT	GUCCAUAACUGCCCCACACdTdT	1123-1141
4003	4004	AD-59545	ACAUAGUCCUGGAAAUAAAdTdT	UUUAUUUCCAGGACUAUGUdTdT	2372-2390
4005	4006	AD-59547	AUCCCAGCAGAGUCCAGAUdTdT	AUCUGGACUCUGCUGGGAUdTdT	580-598
4007	4008	AD-59470	CUAGAUUCUUUCCACAGGAdTdT	UCCUGUGGAAAGAAUCUAGdTdT	300-318
4009	4010	AD-59417	UUGUUUUCCUCGUGCUUUGdTdT	CAAAGCACGAGGAAAACAAdTdT	1259-1277
4011	4012	AD-59535	CCUCCUUCGCCGCCGCCUCdTdT	GAGGCGGCGGCGAAGGAGGdTdT	93-111
4013	4014	AD-59507	UGAGGCUGCUCCCGGACAAdTdT	UUGUCCGGGAGCAGCCUCAdTdT	31-49
4015	4016	AD-59519	CCAACAGACUCCUGAUGGAdTdT	UCCAUCAGGAGUCUGUUGGdTdT	562-580
4017	4018	AD-59391	UCACAUGGAAGCAAGUGGGdTdT	CCCACUUGCUUCCAUGUGAdTdT	2112-2130
4019	4020	AD-59537	CAUUCAAUGGAUGGGGCGGdTdT	CCGCCCCAUCCAUUGAAUGdTdT	1490-1508
4021	4022	AD-59450	AGGAAUGAGUCGCCACCCAdTdT	UGGGUGGCGACUCAUUCCUdTdT	1099-1117
4023	4024	AD-59449	UGGACUUAGAGCGGGAGCUdTdT	AGCUCCCGCUCUAAGUCCAdTdT	1209-1227
4025	4026	AD-59418	CUAAAAACACAGAAGUCUGdTdT	CAGACUUCUGUGUUUUUAGdTdT	1950-1968
4027	4028	AD-59561	CCCUCACCACACACCCCAGdTdT	CUGGGGUGUGUGGUGAGGGdTdT	2062-2080
4029	4030	AD-59460	AAUCCUUGCUUCAGGGACUdTdT	AGUCCCUGAAGCAAGGAUUdTdT	171-189
4031	4032	AD-59409	UUGUGGCAUUUGAAACUGUdTdT	ACAGUUUCAAAUGCCACAAdTdT	1470-1488
4033	4034	AD-59476	UCAAUUACCCUACGGUGCCdTdT	GGCACCGUAGGGUAAUUGAdTdT	2010-2028
4035	4036	AD-59406	CAAGCCAGCCCCUCGGGCAdTdT	UGCCCGAGGGGCUGGCUUGdTdT	460-478
4037	4038	AD-59569	GAGUCUUCCCUGCCUGGAUdTdT	AUCCAGGCAGGGAAGACUCdTdT	259-277
4039	4040	AD-59451	UGGAGAGUGUUGUUCGCCGdTdT	CGGCGAACAACACUCUCCAdTdT	339-357
4041	4042	AD-59553	ACCCCUUGCCUGCCACAAGdTdT	CUUGUGGCAGGCAAGGGGUdTdT	621-639
4043	4044	AD-	CUGGAUGGAUGAGUGGCUUdTdT	AAGCCACUCAUCCAUCCAG	272-290

		59372		dTdT
4045	4046	AD-59377	CAAGAUGAUGGAAGUUGGGdTdT	CCCAACUUCCAUCAUCUUGdTdT	439-457
4047	4048	AD-59531	UUUCGUUUGGACUUCUCGAdTdT	UCGAGAAGUCCAAACGAAAdTdT	62-80
4049	4050	AD-59560	UCAUCUUCACCACCUCUCUdTdT	AGAGAGGUGGUGAAGAUGAdTdT	1749-1767
4051	4052	AD-59489	UGCCCAGUUCUUCCCGCUGdTdT	CAGCGGGAAGAACUGGGCAdTdT	132-150
4053	4054	AD-59540	AAAAAUGGACAUCAUUUCUdTdT	AGAAAUGAUGUCCAUUUUUdTdT	1639-1657
4055	4056	AD-59378	CUUGAGCUUCAGGAGGAUGdTdT	CAUCCUCCUGAAGCUCAAGdTdT	719-737
4057	4058	AD-59403	CCUCUCUGCCACCCAUGCUdTdT	AGCAUGGGUGGCAGAGAGGdTdT	1761-1779
4059	4060	AD-59493	AAAGUCAGGAUCCCUAAGAdTdT	UCUUAGGGAUCCUGACUUUdTdT	242-260
4061	4062	AD-59374	CGACCACGGAGGAAUCCUUdTdT	AAGGAUUCCUCCGUGGUCGdTdT	159-177
4063	4064	AD-59380	UUCCGUCUGGACACCCCUUdTdT	AAGGGGUGUCCAGACGGAAdTdT	609-627
4065	4066	AD-59576	CCACCCAUGCUGCUGGCUGdTdT	CAGCCAGCAGCAUGGGUGGdTdT	1769-1787
4067	4068	AD-59425	UGAGAAAAAGAAUGACCACdTdT	GUGGUCAUUCUUUUUCUCAdTdT	961-979
4069	4070	AD-59509	UAAGAUGAUGCCAGGCUGUdTdT	ACAGCCUGGCAUCAUCUUAdTdT	1309-1327
4071	4072	AD-59488	AGUUAUAUUAAAUUUUAAUdTdT	AUUAAAAUUUAAUAUAACUdTdT	2342-2360
4073	4074	AD-59486	UCUUCCCGCUGUGGGGACAdTdT	UGUCCCCACAGCGGGAAGAdTdT	140-158
4075	4076	AD-59465	UGCCACAAGCCAGGGCACUdTdT	AGUGCCCUGGCUUGUGGCAdTdT	631-649
4077	4078	AD-59484	AGCGCAGUUAUGCCCAGUUdTdT	AACUGGGCAUAACUGCGCUdTdT	122-140
4079	4080	AD-59368	GGACCAGGAGAAAGUCAGGdTdT	CCUGACUUUCUCCUGGUCCdTdT	232-250
4081	4082	AD-59464	UGUCCACUGCCCCAGCCACdTdT	GUGGCUGGGGCAGUGGACAdTdT	1903-1921
4083	4084	AD-59386	AUCGCGGCCUGAGGCUGCUdTdT	AGCAGCCUCAGGCCGCGAUdTdT	22-40
4085	4086	AD-59439	GGGGAUGUGGGGACCAGGAdTdT	UCCUGGUCCCCACAUCCCCdTdT	222-240
4087	4088	AD-59440	CUGGAAAUAAAUUCUUGCUdTdT	AGCAAGAAUUUAUUUCCAGdTdT	2380-2398
4089	4090	AD-59542	UUGAAACUGUCCAUUCAAUdTdT	AUUGAAUGGACAGUUUCAAdTdT	1479-1497
4091	4092	AD-59559	GUGGGGACACGACCACGGAdTdT	UCCGUGGUCGUGUCCCCACdTdT	150-168
4093	4094	AD-59586	CGCAGUGGGGCUUUAUGGGdTdT	CCCAUAAAGCCCCACUGCGdTdT	1579-1597

4095	4096	AD-59408	UUGUCUUUAUAUGUGAAUUdTdT	AAUUCACAUAUAAAGACAAdTdT	2322-2340
4097	4098	AD-59568	UCACCCUGGCUAAGAUGAUdTdT	AUCAUCUUAGCCAGGGUGAdTdT	1299-1317
4099	4100	AD-59398	GUAUCUGCUCAGGCCUGAGdTdT	CUCAGGCCUGAGCAGAUACdTdT	2243-2261
4101	4102	AD-59508	AUGAGUGGCUUCUUCUCCAdTdT	UGGAGAAGAAGCCACUCAUdTdT	280-298
4103	4104	AD-59523	GAAGUUGGGGCCAAGCCAGdTdT	CUGGCUUGGCCCCAACUUCdTdT	449-467
4105	4106	AD-59410	UCAGGGACUCGGGACCCUGdTdT	CAGGGUCCCGAGUCCCUGAdTdT	181-199
4107	4108	AD-59541	UCCUACGGAUUGCCCCCACdTdT	GUGGGGGCAAUCCGUAGGAdTdT	2043-2061
4109	4110	AD-59524	UUACUCUGAUUCUGGGAACdTdT	GUUCCCAGAAUCAGAGUAAdTdT	1333-1351
4111	4112	AD-59501	AUCCCUAAGAGUCUUCCCUdTdT	AGGGAAGACUCUUAGGGAUdTdT	251-269
4113	4114	AD-59383	UGCCAAAGUACAUCUUCCGdTdT	CGGAAGAUGUACUUUGGCAdTdT	1389-1407
4115	4116	AD-59577	UCCUCGGGUUUAGGGGAUGdTdT	CAUCCCCUAAACCCGAGGAdTdT	210-228
4117	4118	AD-59447	UGCUGAAACCUCAGCAGGCdTdT	GCCUGCUGAGGUUUCAGCAdTdT	769-787
4119	4120	AD-59555	CCACCCACGGGUGUGUGGGdTdT	CCCACACACCCGUGGGUGGdTdT	1111-1129
4121	4122	AD-59405	UGGUGCAGUAAUGACUACCdTdT	GGUAGUCAUUACUGCACCAdTdT	1079-1097
4123	4124	AD-59371	UUCUCCACCUAGAUUCUUUdTdT	AAAGAAUCUAGGUGGAGAAdTdT	292-310
4125	4126	AD-59443	UAAGGCGCCGGCGAUCGCGdTdT	CGCGAUCGCCGGCGCCUUAdTdT	9-27
4127	4128	AD-59401	UGGAACUAGUAAAUUCCAUdTdT	AUGGAAUUUACUAGUUCCAdTdT	1189-1207
4129	4130	AD-59494	GGACCCUGCUGGACCCCUUdTdT	AAGGGGUCCAGCAGGGUCCdTdT	192-210
4131	4132	AD-59504	UCAAUUAUUUCACUUAACCdTdT	GGUUAAGUGAAAUAAUUGAdTdT	2269-2287
4133	4134	AD-59369	CCCGGACAAGGGCAACGAGdTdT	CUCGUUGCCCUUGUCCGGGdTdT	41-59
4135	4136	AD-59571	UUUUAAAACUGUGAACCGGdTdT	CCGGUUCACAGUUUUAAAAdTdT	991-1009
4137	4138	AD-59527	GUGCUUCGCCGCCAGCACCdTdT	GGUGCUGGCGGCGAAGCACdTdT	1832-1850
4139	4140	AD-59466	UGGACCCCUUCCUCGGGUUdTdT	AACCCGAGGAAGGGGUCCAdTdT	201-219
4141	4142	AD-59526	CUGUAUAUUAAGGCGCCGGdTdT	CCGGCGCCUUAAUAUACAGdTdT	1-19
4143	4144	AD-59543	UUGCCCCCACCCCUCACCAdTdT	UGGUGAGGGGUGGGGGCAAdTdT	2052-2070
4145	4146	AD-	AUGGGGCGGUGUGCCCACUdTdT	AGUGGGCACACCGCCCCAU	1500-1518

		59564		dTdT
4147	4148	AD-59583	CUAUAGUAAAAACAUAGUCdTdT	GACUAUGUUUUUACUAUAGdTdT	2361-2379

Активность in vitro ми-РНК в подавлении мРНК ALAS1 тестировали в ходе скрининга по одной дозе на клетках Hep3B, которые были трансфицированы с использованием липофектамина 2000 в качестве реагента для трансфекции. Эксперименты с использованием одной дозы осуществляли при концентрации дуплекса 10 нМ и анализировали в анализе разветвленной ДНК (р-ДНК). Результаты показаны в таблице 19 и выражены в виде процента сохраняемой мРНК.

Таблица 19 Подавление мРНК ALAS1, которое оценивали в анализе р-ДНК
Дуплекс	% сохраняемой мРНК	SD
AD-59453	11,2	1,5
AD-59395	12,7	1,1
AD-59477	14,5	2,0
AD-59492	14,8	2,1
AD-59361	15,1	4,9
AD-59462	15,4	2,6
AD-59433	15,8	2,7
AD-59424	16,0	1,7
AD-59414	16,1	1,3
AD-59539	16,2	2,6
AD-59400	16,2	1,8
AD-59551	16,3	2,3
AD-59482	16,6	2,1
AD-59448	16,6	3,7
AD-59392	16,9	3,5
AD-59469	16,9	2,2
AD-59431	17,0	2,0
AD-59423	17,1	3,8
AD-59517	17,2	1,5
AD-59578	17,3	3,1
AD-59495	17,7	3,7

AD-59432	17,7	2,8
AD-59382	17,9	3,2
AD-59472	18,6	3,5
AD-59459	18,7	3,8
AD-59413	18,8	2,4
AD-59478	18,9	3,0
AD-59376	18,9	3,2
AD-59556	18,9	2,4
AD-59399	19,0	4,1
AD-59474	19,4	1,6
AD-53542	19,4	1,7
AD-59480	19,6	1,6
AD-59549	19,7	2,1
AD-59515	19,8	4,4
AD-59427	19,9	3,2
AD-59390	19,9	3,4
AD-59511	19,9	2,2
AD-59532	20,0	2,4
AD-59562	20,2	2,6
AD-59513	20,3	3,9
AD-59362	20,6	2,5
AD-53541	20,6	2,2
AD-59490	20,7	2,3
AD-59422	20,8	4,5
AD-59467	21,2	2,3
AD-59579	21,2	3,3
AD-59426	21,7	2,3
AD-59363	21,7	2,7
AD-59436	21,7	2,7
AD-53536	21,9	1,5
AD-59491	21,9	2,6
AD-59500	22,2	2,8
AD-59394	22,3	10,1
AD-59441	22,3	2,6

AD-59365	22,4	4,2
AD-59411	22,5	2,9
AD-59544	22,5	2,1
AD-59428	22,7	4,7
AD-59471	22,9	5,0
AD-59518	22,9	2,3
AD-53547	22,9	1,5
AD-59573	23,0	4,2
AD-59473	23,2	1,8
AD-59412	23,4	2,5
AD-59522	23,4	3,3
AD-59502	23,6	2,7
AD-59499	23,6	1,6
AD-59520	23,8	3,8
AD-59581	23,9	6,0
AD-59461	24,3	4,2
AD-59370	24,3	5,6
AD-53540	24,4	2,1
AD-59574	24,5	2,0
AD-59375	24,6	2,3
AD-59387	24,8	7,2
AD-59397	24,9	9,6
AD-59396	25,0	10,2
AD-59393	25,3	11,6
AD-59483	25,4	3,8
AD-59430	25,5	1,8
AD-59463	25,6	4,8
AD-53534	25,9	3,1
AD-59514	26,2	5,7
AD-59575	26,2	3,2
AD-59364	26,2	4,5
AD-59402	26,3	3,1
AD-59479	26,3	2,5
AD-59481	26,4	2,2

AD-59530	26,4	4,4
AD-59582	26,6	3,9
AD-59506	27,0	4,1
AD-59567	27,3	1,1
AD-59485	27,7	4,7
AD-59525	28,3	3,1
AD-59566	28,5	0,6
AD-59580	28,7	7,1
AD-59512	29,5	2,5
AD-59475	29,6	4,2
AD-59438	29,6	3,3
AD-59442	29,9	2,8
AD-59516	30,4	3,8
AD-59429	30,8	4,3
AD-59510	31,3	1,9
AD-59457	31,4	1,2
AD-59434	31,6	3,5
AD-59454	32,0	1,9
AD-59468	32,2	3,2
AD-59565	32,4	1,5
AD-59416	32,7	1,7
AD-59420	33,2	3,1
AD-59552	33,2	2,2
AD-59558	33,8	3,8
AD-59404	34,0	5,4
AD-59455	34,8	1,3
AD-59496	34,9	5,2
AD-59446	35,5	1,7
AD-59435	35,9	1,2
AD-59419	36,0	1,4
AD-59533	36,7	3,7
AD-59366	36,7	6,0
AD-59521	36,9	4,3
AD-59563	36,9	4,1

AD-59534	36,9	3,3
AD-59407	37,1	4,7
AD-59445	37,2	3,2
AD-59546	37,9	4,9
AD-59456	38,3	4,0
AD-59503	38,8	5,0
AD-59536	39,8	4,2
AD-59385	39,9	13,7
AD-59367	40,0	3,6
AD-59458	40,0	3,4
AD-59381	40,3	9,9
AD-59538	40,8	4,9
AD-59421	40,9	6,4
AD-59388	41,0	9,1
AD-59444	41,1	2,7
AD-59528	41,9	3,3
AD-59498	42,2	3,3
AD-59497	42,4	4,9
AD-59384	42,7	17,6
AD-59452	42,7	3,1
AD-59379	43,6	2,6
AD-59529	43,8	4,8
AD-59389	44,1	6,4
AD-59585	44,3	3,2
AD-59570	45,1	4,0
AD-59415	46,6	2,3
AD-59505	47,5	6,2
AD-59557	48,1	4,4
AD-59548	49,9	4,0
AD-59487	50,7	3,2
AD-59550	50,8	5,8
AD-59572	51,1	4,0
AD-59554	51,3	6,0
AD-59437	52,2	4,8

AD-59584	54,9	2,7
AD-59373	55,3	20,1
AD-59545	55,4	3,4
AD-59547	55,9	4,7
AD-59470	56,0	2,7
AD-59417	56,4	7,7
AD-59535	57,6	5,1
AD-59507	58,8	4,7
AD-59519	59,1	5,6
AD-59391	60,1	12,5
AD-59537	60,6	9,1
AD-59450	60,7	7,2
AD-59449	61,6	6,8
AD-59418	61,8	8,4
AD-59561	62,2	7,2
AD-59460	62,8	4,7
AD-59409	64,4	9,0
AD-59476	65,2	5,6
AD-59406	65,6	3,5
AD-59569	66,7	7,6
AD-59451	66,9	2,9
AD-59553	67,2	8,8
AD-59372	67,3	25,6
AD-59377	68,7	5,1
AD-59531	68,7	9,0
AD-59560	68,7	12,7
AD-59489	69,6	8,9
AD-59540	70,1	10,1
AD-59378	70,6	14,1
AD-59403	71,4	3,3
AD-59493	72,3	3,5
AD-59374	75,9	5,1
AD-59380	76,4	11,1
AD-59576	77,5	16,2

AD-59425	77,9	10,6
AD-59509	78,0	3,2
AD-59488	78,6	7,1
AD-59486	79,4	5,0
AD-59465	79,5	5,1
AD-59484	79,8	3,2
AD-59368	80,0	11,9
AD-59464	80,2	9,3
AD-59386	80,6	33,2
AD-59439	80,9	4,0
AD-59440	82,2	1,9
AD-59542	83,3	10,6
AD-59559	83,7	9,1
AD-59586	83,8	11,5
AD-59408	86,3	2,8
AD-59568	86,8	4,2
AD-59398	87,4	24,9
AD-59508	87,5	2,5
AD-59523	87,6	11,8
AD-59410	88,8	8,3
AD-59541	88,9	10,8
AD-59524	89,5	12,1
AD-59501	89,9	5,1
AD-59383	90,8	27,4
AD-59577	91,1	2,3
AD-59447	91,3	12,9
AD-59555	91,7	3,4
AD-59405	92,5	5,7
AD-59371	93,5	31,7
AD-59443	93,8	9,0
AD-59401	94,5	7,1
AD-59494	95,1	9,1
AD-59504	96,8	11,7
AD-59369	96,8	4,8

AD-59571	97,4	7,0
AD-59527	98,6	7,8
AD-59466	99,7	14,0
AD-59526	102,9	4,6
AD-59543	103,7	3,0
AD-59564	103,7	12,1
AD-59583	112,4	13,2

Двести тридцать два дуплекса, которые были тестированы, в различной степени подавляли мРНК ALAS1 в таком анализе по одной дозе. Согласно проведенному анализу, по меньшей мере, четыре дуплекса (AD-59453, AD-59395, AD-59477,и AD-59492) подавляли мРНК ALAS1 на 85% или больше, 39 дуплексов подавляли мРНК ALAS1 на 80% или больше, 101 дуплекс подавлял мРНК ALAS1 на 70% или больше, и 152 дуплекса подавляли мРНК ALAS1 на 50% или больше. Напротив, некоторые дуплексы не оказывали заметного подавления в данном анализе.

ЭКВИВАЛЕНТЫ

Специалистам в данной области будет понятно, или они смогут установить, используя ничего более, кроме обычных экспериментов, множество эквивалентов конкретных вариантов осуществления изобретения, описанных в настоящей публикации. Подразумевается, что такие эквиваленты входят в объем следующей формулы изобретения.

1. Двунитевая рибонуклеиновая кислота (днРНК) для ингибирования экспрессии ALAS1, при этом указанная днРНК содержит смысловую нить и антисмысловую нить, причем:

(i) антисмысловая нить комплементарна по меньшей мере нуклеотидам 871-889 последовательности SEQ ID NO: 1 и включает SEQ ID NO: 1296,

(ii) смысловая нить содержит по меньшей мере 15 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов последовательности SEQ ID NO: 1295,

(iii) каждая из смысловой и антисмысловой нитей имеет длину от 19 до 24 нуклеотидов,

(iv) лиганд и линкер со структурой, показанной ниже, присоединен к 3’-концу смысловой нити днРНК

и

(v) днРНК включает один или более нуклеотидов с модификацией, выбранной из 2’-O-метил-модифицированного нуклеотида, 2’-фтор-модифицированного нуклеотида или обоих.

2. Двунитевая рибонуклеиновая кислота (днРНК) для ингибирования экспрессии ALAS1, содержащая:

(i) антисмысловую нить, комплементарную по меньшей мере нуклеотидам 871-889 последовательности SEQ ID NO: 1;

(ii) смысловую нить, содержащую по меньшей мере 15 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов последовательности SEQ ID NO: 1295;

(iii) каждая из смысловой и антисмысловой нитей имеет длину от 19 до 24 нуклеотидов;

(iv) одно или более производных N-ацетилгалактозамина (GalNAc) и

(v) один или более нуклеотидов с модификацией, выбранной из 2’-O-метил-модифицированного нуклеотида, 2’-фтор-модифицированного нуклеотида или обоих.

3. ДнРНК по п. 2, в которой антисмысловая нить содержит последовательность SEQ ID NO: 1296.

4. ДнРНК по п. 3, содержащая по меньшей мере пять 2’-O-метил-модифицированных нуклеотидов и по меньшей мере пять 2’-фтор-модифицированных нуклеотидов.

5. ДнРНК по п. 4, содержащая одну или более фосфоротиоатных связей.

6. ДнРНК по п. 2, содержащая по меньшей мере 20 2’-O-метил-модифицированных нуклеотидов и/или 2’-фтор-модифицированных нуклеотидов.

7. ДнРНК по п. 5, содержащая 2’-O-метил-модифицированные нуклеотиды и/или 2’-фтор-модифицированные нуклеотиды по всей длине смысловой и антисмысловой нитей.

8. ДнРНК по п. 3, включающая по меньшей мере один тупой конец.

9. ДнРНК по п. 3, в которой оба конца днРНК являются тупыми концами.

10. ДнРНК по п. 3, в которой по меньшей мере одна нить включает 3’-липкий конец, состоящий из по меньшей мере 1 нуклеотида.

11. ДнРНК по п. 10, в которой 3’-липкий конец имеет длину 2 нуклеотида.

12. ДнРНК по п. 10, в которой 3’-липкий конец присутствует на 3’-конце либо антисмысловой нити, либо смысловой нити, либо на обоих 3’-концах антисмысловой нити и смысловой нити днРНК.

13. ДнРНК по п. 10, в которой 3’-липкий конец находится на антисмысловой нити.

14. ДнРНК по п. 13, в которой один или более нуклеотидов липкого конца представляют собой нуклеозид трифосфат.

15. ДнРНК по п. 1 или 2, в которой лиганд или производное GalNAc конъюгирован(о) с 3’-концом смысловой нити днРНК.

16. ДнРНК по п. 2, в которой одно или более производных GalNAc является двухантенным или трехантенным лигандом GalNAc.

17. ДнРНК по п. 16, в которой лиганд GalNAc представляет собой

18. ДнРНК по п. 16, в которой лиганд GalNAc присоединен к 3’-концу смысловой нити.

19. ДнРНК по п. 16, в которой лиганд GalNAc присоединен к 3’-концу смысловой нити посредством линкера.

20. ДнРНК по п. 16, в которой лиганд GalNAc и линкер имеют структуру

21. ДнРНК по п. 1 или 2, в которой антисмысловая нить полностью комплементарна по меньшей мере нуклеотидам 871-889 последовательности SEQ ID NO: 1.

22. Двунитевая рибонуклеиновая кислота (днРНК) для ингибирования экспрессии ALAS1, содержащая:

(i) антисмысловую нить, которая включает последовательность SEQ ID NO: 1296;

(ii) смысловую нить, содержащую по меньшей мере 15 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов последовательности SEQ ID NO: 1295;

(iii) область дуплекса длиной от 19 до 30 пар оснований;

(iv) двухантенный или трехантенный лиганд GalNAc;

(v) 20 или более модифицированных нуклеотидов, выбранных из 2’-O-метил-модифицированных нуклеотидов и 2’-фтор-модифицированных нуклеотидов, и

(vi) по меньшей мере одну нить, содержащую 3’-липкий конец, состоящий из по меньшей мере 1 нуклеотида.

23. ДнРНК по п. 22, в которой каждая из смысловой и антисмысловой нитей имеет длину от 19 до 24 нуклеотидов.

24. ДнРНК по п. 23, в которой антисмысловая нить включает 3’-липкий конец.

25. ДнРНК по п. 24, в которой 3’-липкий конец имеет длину 2 нуклеотида.

26. ДнРНК по п. 25, содержащая смысловую нить с тупым концом.

27. ДнРНК по п. 26, содержащая одну или более фосфоротиоатных связей.

28. ДнРНК по п. 27, содержащая 2’-O-метил-модифицированные нуклеотиды и/или 2’-фтор-модифицированные нуклеотиды по всей длине смысловой и антисмысловой нитей.

29. ДнРНК по п. 22, в которой лиганд GalNAc представляет собой

30. ДнРНК по п. 29, в которой лиганд GalNAc присоединен к 3’-концу смысловой нити.

31. ДнРНК по п. 30, в которой лиганд GalNAc присоединен к 3’-концу смысловой нити посредством линкера.

32. ДнРНК по п. 16, в которой лиганд GalNAc и линкер имеют структуру

33. Двунитевая рибонуклеиновая кислота (днРНК) для ингибирования экспрессии ALAS1, содержащая:

(i) антисмысловую нить, которая полностью комплементарна по меньшей мере нуклеотидам 871-889 последовательности SEQ ID NO: 1;

(ii) смысловую нить, содержащую по меньшей мере 15 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов последовательности SEQ ID NO: 1295, причем каждая из смысловой и антисмысловой нитей имеет длину от 19 до 24 нуклеотидов;

(iii) лиганд, присоединенный к 3’-концу смысловой нити и имеющий структуру

(iv) модифицированные нуклеотиды по всей длине смысловой нити и антисмысловой нити, состоящие из 2’-O-метил-модифицированных нуклеотидов, 2’-фтор-модифицированных нуклеотидов, и фосфоротиоатные связи;

(v) антисмысловую нить, включающую 3’-липкий конец длиной 2 нуклеотида, и

(vi) смысловую нить с тупым концом.

34. Фармацевтическая композиция для ингибирования экспрессии гена ALAS1, содержащая терапевтически эффективное количество днРНК по любому из пп. 1-33.

35. Фармацевтическая композиция по п. 34, причем указанную композицию вводят внутривенно или подкожно.

36. Способ ингибирования экспрессии ALAS1 в клетке, включающий:

(a) введение в клетку днРНК по любому из пп. 1-33 или фармацевтической композиции по п. 34 и

(b) поддержание клетки со стадии (a) в течение периода времени, достаточного для получения распада транскрипта мРНК гена ALAS1 с ингибированием тем самым экспрессии гена ALAS1 в клетке.

37. Способ лечения расстройства, связанного с экспрессией ALAS1, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества днРНК по любому из пп. 1-33 или фармацевтической композиции по п. 34.

38. Способ по п. 37, в котором субъект подвергается риску развития порфирии или у него диагностирована порфирия.

39. Способ снижения уровня порфирина или предшественника порфирина в клетке, включающий осуществление контакта клетки с днРНК по п. 1 в количестве, эффективном для снижения уровня порфирина или предшественника порфирина в клетке.

40. Способ по п. 38, в котором порфирия представляет собой печеночную порфирию.

41. Способ по п. 40, в котором печеночная порфирия выбрана из острой интермиттирующей порфирии (AIP), наследственной копропорфирии (HCP), смешанной порфирии (VP), порфирии вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP) и гепатоэритропоэтической порфирии.

42. Способ по п. 38, в котором днРНК или композицию, содержащую днРНК, вводят до, во время или после острого приступа порфирии.

43. Способ по п. 38, в котором днРНК или композицию, содержащую днРНК, вводят в продромальный период.

44. Способ по п. 43, в котором продромальный период характеризуется болью, тошнотой, психологическими симптомами, беспокойством или бессонницей.

45. Способ по п. 38, в котором пациент имеет повышенный уровень ALA и/или PBG.