Способ получения рекомбинантного противоопухолевого модифицированного белка dr5-b человека



Способ получения рекомбинантного противоопухолевого модифицированного белка dr5-b человека
Способ получения рекомбинантного противоопухолевого модифицированного белка dr5-b человека
Способ получения рекомбинантного противоопухолевого модифицированного белка dr5-b человека
Способ получения рекомбинантного противоопухолевого модифицированного белка dr5-b человека
Способ получения рекомбинантного противоопухолевого модифицированного белка dr5-b человека
Способ получения рекомбинантного противоопухолевого модифицированного белка dr5-b человека
Способ получения рекомбинантного противоопухолевого модифицированного белка dr5-b человека
Способ получения рекомбинантного противоопухолевого модифицированного белка dr5-b человека
Способ получения рекомбинантного противоопухолевого модифицированного белка dr5-b человека
Способ получения рекомбинантного противоопухолевого модифицированного белка dr5-b человека
C12N2800/101 - Микроорганизмы или ферменты; их композиции (биоциды, репелленты или аттрактанты или регуляторы роста растений, содержащие микроорганизмы, вирусы, микробные грибки, ферменты, агенты брожения или вещества, получаемые или экстрагируемые из микроорганизмов или из материала животного происхождения A01N 63/00; пищевые составы A21,A23; лекарственные препараты A61K; химические аспекты или использование материалов для бандажей, перевязочных средств, впитывающих подкладок или хирургических приспособлений A61L; удобрения C05); размножение, консервирование или сохранение микроорганизмов (консервирование живых тканей или органов людей или животных A01N 1/02); мутации или генная инженерия; питательные среды (среды для микробиологических испытаний C12Q)

Владельцы патента RU 2687435:

Общество с ограниченной ответственностью "Манебио" (RU)
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению терапевтических белков, и может быть использовано для получения рекомбинантного противоопухолевого белка DR5-B в Е. coli. Способ предусматривает трансформацию клеток штамма Е. coli SHuffle В полученной рекомбинантной плазмидной ДНК рЕТ-32а без Trx-, His- и S-тагов, кодирующей DR5-B с последующей экспрессией, выделением и очисткой целевого белка. Изобретение позволяет получить модифицированный противоопухолевый белок Манселан на основе мутантного варианта цитокина TRAIL DR5-B с высоким выходом и степенью очистки от низкомолекулярных белковых примесей и бактериальных эндотоксинов. 2 табл., 6 ил., 4 пр.

 

Изобретение относится к области клеточной биологии, молекулярной биологии и биотехнологии, конкретно, к получению белкового препарата модифицированного варианта цитокина TRAIL DR5-B - Манселана, который может быть использован в качестве терапевтического средства для лечения злокачественных опухолей.

Природный цитокин человека TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand) рассматривается как потенциальное средство для терапии опухолевых заболеваний, поскольку он способен селективно индуцировать апоптоз в опухолевых клетках, не затрагивая нормальные клетки. Однако клинические испытания показали его низкую эффективность в связи с тем, что многие типы опухолей резистентны к TRAIL. Один из механизмов резистентности связан с наличием пяти рецепторов TRAIL, из которых лишь два, DR4 и DR5 (рецепторы смерти), проводят сигнал апоптоза, a DcR1, DcR2 и OPG являются рецепторами - «ловушками», которые не проводят сигнал апоптоза и ингибируют TRAIL опосредованный гибель опухолевых клеток. Ранее был получен уникальный рецептор-специфичный вариант TRAIL DR5-B с заменами аминокислотных остатков Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266L/D269H в белке TRAIL, который селективно связывается лишь с одним из пяти рецепторов TRAIL, рецептором смерти DR5 (Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV et al. Apoptosis, 2009, 14:778-787). Исследования на линиях опухолевых клеток показали, что мутантный вариант DR5-B значительно эффективнее индуцирует апоптоз по сравнению с TRAIL дикого типа. В связи с этим рецептор-специфичный цитокин DR5-В является перспективным средством для лечения различных типов опухолей. Ранее авторами данного патента была описана методика получения рецептор-селективных мутантных вариантов TRAIL DR5-B, путем экспрессии в штамме Е. coli BL21(DE3) в виде гибридного белка с тиоредоксином и последующей очистки после расщепления слитного белка энтеропептидазой (Гаспарян М.Э., Яголович А.В., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Способ получения мутантного белка TRAIL человека. Роспатент №2405038 от 27.11.2010). Этот способ позволяет получить препаративные количества белка, однако он не подходит для использования препарата в клинических исследованиях, и, потенциально, для терапии опухолей по ряду причин. Несмотря на то, что энтеропептидаза расщепляет белок по специфическому сайту, расположенному между несущим белком тиоредоксином и целевым белком DR5-B, при расщеплении образуются следовые количества низкомолекулярных пептидов - продуктов неспецифического расщепления, способных оказывать побочные эффекты при введении в организм. Процесс очистки целевого белка включает дополнительный этап удаления энтеропептидазы методом аффинной хроматографии, при этом полностью избавится от следов фермента энтеропептидазы невозможно. Следовые количества энтеропептидазы приводят к постепенному накоплению низкомолекулярных белковых фрагментов неспецифического расщепления и снижению содержания активного белка при длительном хранении препарата. Кроме того, использование коммерческого препарата энтеропептидазы значительно повышает стоимость итогового продукта в связи с высокой стоимостью фермента, поскольку к использованию фермента в ходе очистки лекарственных препаратов предъявляются высокие требования к качеству: во-первых, фермент должен быть высокоочищенным и высокоактивным, во-вторых, в целевом белковом препарате должны отсутствовать даже следовые количества неспецифически расщепленных пептидов. Кроме того, трудозатратные и дорогостоящие этапы получение белка путем гибридной экспрессии с доменом тиоредоксина в качестве «несущего» белка затрудняют задачу масштабирования производства препарата для клинических испытаний. Еще один недостаток существующей методики заключается в том, что при экспрессии рекомбинантных белков в бактериальных клетках в препаратах превышен допустимый уровень бактериальных эндотоксинов, которые вызывают иммунный ответ в организме животных и способны привести к эндотоксиновому шоку. Разработанная ранее методика очистки рекомбинантного цитокина DR5-B включала только стадии метал-аффинной хроматографии, что не позволяет полностью избавиться от бактериальных эндотоксинов, следовых количеств энтеропептидазы и низкомолекулярных пептидных фрагментов неспецифического расщепления в препарате.

Известен другой способ цитоплазматической экспрессии цитокина TRAIL в виде слитного белка с мальтоз связывающим белком (МВР), где слитный белок расщепляют протеиназой вируса гравировки табака с последующей очисткой целевого белка (Do ВН, Nguyen МТ, Song JA, Park S, Yoo J, Jang J et al. Soluble prokaryotic expression and purification of bioactive Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand// J Microbiol Biotechnol. 2017, 27:2156-2164). Выход белка по данным этой работы составил 36 мл с 1 литра культуры клеток.

Известен также способ цитоплазматической экспрессии цитокина TRAIL с новым тагом Fh8-ΔI-CM, где Fh8 является полипептидом 8-кДа, полученный из низкомолекулярного антигена печеночной двуустка (Fasciola hepatica), который улучшает растворимость белка, a ΔI-CM это кальмодулин-связывающий полипептид способный расщепляться при низкиз рН раствора. (Zhang М, Wang Z, Chi L, Sun J, Shen Y. Enhanced production of soluble tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in Escherichia coli using a novel self-cleavable tag system Fh8-ΔI-CM. Protein Expr Purif. 2018, 148:16-23). Выход белка в данной работе составил 77,5 мг белка с 1 литра культуры клеток с чистотой на 89%.

Препараты, полученные путем гибридной экспрессии, позволяют получить растворимый белок, однако для очистки целевого белка требуется дополнительный этап расщепления слитного белка с последующей очистки целевого белка. Это увеличивает трудоемкость очистки, а также влияет на себестоимость препарата, так как стоимость протеиназ достаточно высока. Кроме того, в ходе расщепления слитных белков часто происходит неспецифическое расщепление целевого белка в скрытых неспецифических сайтах, что приводит к образованию низкомолекулярных пептидных примесей от которых очень трудно избавиться. Поэтому препараты, полученные путем гибридной экспрессии, часто удовлетворяют требованиям, предъявляемым к качеству белка для биологических исследований (исследование структуры и функций белка, связывания с рецепторами, биологической активности на линиях раковых клеток и пр.), но не подходит для клинических исследований, а также для его применения в качестве лекарственного препарата.

Известны способы получение TRAIL в системах прямой экспрессии белка в штаммах Е. coli, где белок экспрессируется в нерастворимой форме в составе телец включения (Kang Н, Sun AY, Shen YL, Wei DZ. Refolding and structural characteristic of TRAIL/Apo2L inclusion bodies from different specific growth rates of recombinant Escherichia coli. Biotechnol Prog. 2007; 23:286-292), (Zhihua L, Huanzong Lei, Peng C. Expression, purification, and in vitro refolding of soluble tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL). Protein Expression and Purification, 2007; 51:276-282). При экспрессии белка в таких системах возникает необходимость проведения процедуры ренатурации, что сильно увеличивает на трудоемкость и стоимость работы и влияет на окончательные выходы препарата.

Изобретение решает задачу получения высокоочищенного рекомбинантного модифицированного белка DR5-B - Манселана - с высоким выходом без примесей и эндотоксинов с качеством, удовлетворяющим требованиям к лекарственным препаратам. Задача решается за счет модификации белка DR5-B аминокислотным остатком метионина на N-конце и разработки принципиально нового способа получения модифицированного белка DR5-B Манселана с высокой противоопухолевой активностью, включающего создание генетической конструкции (плазмидного вектора) для прямой экспрессии белка Манселана с последующей трансформацией высокопроизводительного относительно нового штамма Е. coli SHuffle В, экспрессию и очистку целевого белка с помощью методов аффинной и ионообменной хроматографии, а также удаление эндотоксинов из очищенного препарата для терапии злокачественных опухолей различного происхождения.

Плазмидный вектор pET-32a/DR5-B ранее был получен для гибридной экспрессии белка Trx/DR5-B с доменом тиоредоксина в качестве «несущего» белка (Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA и др. Generation of new TRAIL mutants DR5-A and DR5-B with improved selectivity to death receptor 5. 2009, Apoptosis, 14:778-787). Плазмидный вектор для прямой экспрессии модифицированного белка DR5-B - Манселана - получают, вырезая ген тиоредоксина Trx из вектора pET-32a/DR5-B. Для этого предварительно вводят сайт рестрикции NdeI между генами тиоредоксина и DR5-В методом сайт-специфического мутагенеза. Плазмиду pET32a/DR5-B с введенным сайтом рестрикции NdeI обрабатывают рестриктазами XhoI и NdeI, получившиеся фрагменты ДНК разделяют в 1% агарозном геле, после чего фрагмент ДНК линеаризованного плазмидного вектора и фрагмент гена DR5-B элюируют из геля и лигируют с помощью Т4 ДНК лигазы. Таким образом получают новый плазмидный вектор pET-32a/manselan для прямой экспрессии целевого белка Манселана. В результате введения сайта рестрикции NdeI (С ATATG) непосредственно перед геном TRAIL DR5-B появляется кодон метионина ATG для инициации экспрессии модифицированного цитокина Манселана.

Для эффективной экспрессии растворимого белка Манселана, плазмидный вектор рЕТ-32а/ manselan трансформируют в высокопроизводительный штамм Е. coli SHuffle В. Это относительно новый штамм Е. coli, позволяющий получить высокий уровень цитоплазматической экспрессии активных белков с правильно образованными дисульфидными связями благодаря сниженной активности редуктаз gor и trxB наряду с повышенной экспрессией изомеразы дисульфидных связей DsbC (Lobstein et al. Microbial Cell Factories 2012, 11:56). Экспрессию белка индуцируют 0.25 mM IPTG (изопропил_β-D-1-тиогалактопиранозид) (Рис. 1). На первом этапе целевой белок Манселан очищают из растворимой фракции клеточного лизата с помощью металл-аффинной хроматографии на сорбенте Ni-NTA агарозе. Благодаря наличию нескольких гистидиновых остатков в аминокислотной последовательности белка Манселан аффинно связывается с сорбентом Ni-NTA агарозой даже в отсутствие полигистидинового тага. Данный этап позволяет получить белок, очищенный примерно на 85% (Рис. 2). Для получения высокоочищенного белка Манселан проводят второй этап очистки с помощью катион-обменной хроматографии на сорбенте SP Sepharose в О - 500 тМ линейном градиенте NaCl на установке (GE Healthcare, Sweden). Для удаления остаточных примесей, дополнительно очищают белок на сорбенте Ni-NTA (Рис. 2,3). Описываемый в изобретении способ позволяет получить высокоочищенный белок Манселан в количестве более 0.2 г из 1 литра клеточной культуры (Таблица 1).

Гомогенность и тримеризацию полученного препарата Манселан исследуют с помощью аналитического ультрацентрифугирования (Рис. 4). Полученный препарат является высоко гомогенным и состоит на 98% из тримерных молекул.

Определяют уровень эндотоксинов в препарате Манселан, полученном описываемым в изобретении методом. Уровень эндотоксинов в препарате TRAIL DR5-В, полученным путем гибридной экспрессии (Гаспарян М.Э., Яголович А.В., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Способ получения мутантного белка TRAIL человека. Роспатент №2405038 от 27.11.2010), составляет 250 ед./мг. Уровень эндотоксинов в препарате Манселан, полученном описываемым методом прямой экспрессии, на порядок ниже (25 ед./мг) благодаря использованию стадии катион-обменной хроматографии. Исследуют влияние низких концентраций (0.05-0.2%) детергента Тритон Х-100 в ходе очистки на содержание эндотоксинов в препарате. Оптимизируя отмывку сорбента детергентом Triton Х-100 на разных этапах очистки, уровень эндотоксинов снижают с 25 ед./мг до 8 ед./мг. Такое содержание эндотоксинов позволяет применять препарат в биологических и доклинических исследованиях, однако превышает предельно допустимую дозу для использования в клинике (не более 5 ед./кг/час). Поэтому препарат Манселан дополнительно очищают на аффинном сорбенте Pierce High Capacity Endotoxin Removal Resin (Thermo Scientific) с ковалентно-связанным модифицированным ε-поли-L-лизином для удаления эндотоксинов (этот сорбент имеет преимущество перед обычно используемыми сорбентами на основе полимиксина Б благодаря отсутствию токсичности). Итоговое содержание эндотоксинов в очищенном препарате Манселан составляет не более 0.5 ед./мг (Таблица 2).

Для корректной оценки цитотоксической активности белка Манселан аналогичным способом получают высокоочищенный рекомбинантный белок TRAIL дикого типа (114-281), модифицированный аминокислотным остатком метионина на N-конце, используя в качестве основы плазмидный вектор pET-32a/TRAIL, ранее полученный для гибридной экспрессии белка Trx/TRAIL с доменом тиоредоксина в качестве «несущего» белка.

Противоопухолевую активность полученных препаратов Манселана и TRAIL исследуют на линиях опухолевых клеток (Рис. 5). Препараты Манселан и TRAIL, полученные описываемым в изобретении методом прямой экспрессии в штаммах-продуцентах Е. coli SHuffle B/pE-T32a/manselan и Е. coli SHuffle B/pET-32a/trail, индуцируют апоптоз в клетках колоректальной карциномы НСТ-116, аденокарциномы легких А549, Т-клеточной лейкемии Jurkat и карциномы молочной железы MCF-7. Показывают, что Манселан эффективнее вызывает гибель в клеточных линиях по сравнению с TRAIL (Рис. 5). Активность препарата Манселан, полученного путем прямой экспрессии, сравнивают с препаратом DR5-B, полученным ранее описанным методом гибридной экспрессии, в линии Т-клеточной лейкемии Jurkat. Препараты, полученные обоими способами, индуцируют апоптоз с одинаковой эффективностью (Рис. 6).

Техническим результатом заявленного изобретения является способ получения модифицированного противоопухолевого белка Манселана на основе мутантного варианта цитокина TRAIL DR5-B, который заключается в повышении выхода целевого белка и степени очистки от низкомолекулярных белковых примесей и бактериальных эндотоксинов, а также в сокращенном количестве стадий очистки и снижении стоимости получения препарата. Описываемый в изобретении способ позволяет использовать препарат Манселан не только в качестве инструмента для молекулярно-биологических исследований, но и в качестве лекарственного средства при терапии онкологических заболеваний.

Результаты изобретения отражаются в рисунках.

Рис. 1. Экспрессия белка Манселан в штамме E.coli SHuffle В при индукции с индуктором Т7-ого промотора IPTG в различных концентрациях. Пробы, содержащие по 20 мкл ночной культуры, центрифугируют при 5000 × g в течении 5 мин., растворяют в буфере для проб и анализируют на 15% ДСН-ПААГ.

Рис. 2. Прямая экспрессия в штамме E.coli SHuffle В и очистка белка Манселан. Образцы, содержащие по 15 мкг белка, анализируют в 15% трис-глициновом ДСН-полиакриламидном геле после окрашивания краской Кумасси бриллиантовым синий R-250. Линия 1: клеточный лизат, Линия 2: фракция растворимых цитоплазматических белков. Линия 3: фракция белка Манселан после очистки на сорбенте Ni-NTA агарозы. Линия 4: Белок после очистки с помощью ионообменной хроматографии на SP сефарозе. Линия 5: фракция белка после дополнительной очистки на сорбенте Ni-NTA агарозы.

Рис. 3. Анализ чистоты препаратов Манселана и TRAIL. Образцы, содержащие по 0.25 мкг очищенного белка, анализируют в 16.5% трис-глициновом ДСН-полиакриламидном геле после окрашивания нитратом серебра. Линии 1: TRAIL дикого типа. Линия 2: Манселан.

Рис. 4. Анализ аналитического ультрацентрифугирования препарата Манселан. Препарат центрифугируют при 60000 rpm в стандартных 0.4 мл ячейках. Профили белка зарегистрированы после 1, 10, 20, 45, 54, 60, 74 и 86 мин при поглощении 280 нм. Посчитанный коэффициент седиментации s20, w = 5.49±0.03 и средняя молекулярная масса Mw = 59511 кДа свидетельствуют о содержании исключительно глобулярных тримерных молекул в препарате.

Рис. 5. Цитотоксичность рекомбинантных белковых препаратов TRAIL и Манселана на различных опухолевых клеточных линиях. Клетки карциномы прямой кишки НСТ116, аденокарциномы молочной железы MCF-7, карциномы легких А549 и Т-лимфобластной лейкемии Jurkat инкубировали с указанными концентрациями TRAIL или Манселана в течении 24 часов и жизнеспособность определяли с помощью МТТ теста.

Рис. 6. Сравнительный анализ цитотоксичной активности препаратов DR5-B и Манселан. Клетки Т-лимфобластной лейкемии Jurkat инкубируют с указанными концентрациями DR5-B или Манселана в течении 24 часов и жизнеспособность определяли с помощью МТТ теста.

Изобретение иллюстрируется примерами.

Пример 1. Создание генетической конструкции для прямой экспрессии модифицированного белка DR5-B - Манселана.

На первом этапе в последовательности слитного белка Trx/DR5-B (SEQ ID NO 1) в составе плазмидного вектора pET32a/DR5-B (ранее полученного авторами Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV, et al. Apoptosis, 2009, 14:778-787) вводят 3 точечные мутации (G469C, C471T, A473T) методом сайт-специфического мутагенеза, основанного на полимеразной цепной реакции. Реакционная смесь для полимеразной цепной реакции содержит буфер с MgSO4 для ДНК-полимеразы Pfu (Fermentas, Литва), ДНК-полимеразу Pfu, смесь из 4-х дезоксинуклеотидтрифосфатов, плазмидную ДНК pET-32a/DR5-B, прямой (SEQ ID NO 2) и обратный (SEQ ID NO 3) олигонуклеотидные праймеры. Поверх реакционной смеси наслаивают минеральное масло. Проводят 30 циклов амплификации при следующих условиях: 10 секунд при 95°С, 30 секунд при 95°С, 30 секунд при 55°С, 14.5 минут при 72°С.Синтез ДНК проверяют с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. Для расщепления исходной метилированной плазмидной ДНК реакционную смесь обрабатывают рестриктазой Dpn I в течение 1 часа при 37°С. Для наработки мутантной ДНК проводят трансформацию бактериального штамма Escherichia coli XL-1 Blue реакционной смесью ПЦР. Выращивают клетки в среде LB с ампициллином (100 мкг/мл) при 37°С и перемешивании 250 об/мин в течение 18 часов, после чего выделяют плазмидную ДНК из клеточной биомассы. Наличие мутаций подтверждают определением нуклеотидной последовательности мутантной ДНК. Таким образом вводят сайт рестрикции NdeI перед началом гена DR5-B.

На втором этапе обрабатывают плазмиду pET32a/DR5-B с дополнительным сайтом рестрикции NdeI рестриктазами XhoI и NdeI. В результате образуются 4 фрагмента: ДНК линеаризованного плазмидного вектора (5445 п.н.), фрагмент гена DR5-B (504 п.н.), а также фрагмент с геном тиоредоксина (345 п.н.) и фрагмент тага (129 п.н.) (так как в нем находится еще один сайт рестрикции NdeI). Фрагменты разделяют в 1% агарозном геле, после чего фрагменты ДНК линеаризованного плазмидного вектора и гена DR5-B элюируют из геля с помощью набора QuiaQuick Gel Extraction kit (Quiagen) и лигируют с помощью Т4 ДНК лигазы при 10°С в течение 16 часов. Реакционную смесь трансформируют в штамм Escherichia coli XL-1 Blue и выделяют плазмидную ДНК. Правильную вставку гена в плазмиду подтверждают определением нуклеотидной последовательности встроенного гена. Результатом проделанной работы является получение плазмидного вектора pET32a/manselan, который не содержит Trx-, His- и S-тагов и служит для прямой экспрессии модифицированного белка DR5-B - Манселана - благодаря внесенному аминокислотному остатку метионина на N-конце аминокислотной последовательности белка (SEQ ID NO 4).

Для корректной оценки цитотоксической активности белка Манселан аналогичную процедуру проводят с плазмидным вектором pET-32a/TRAIL, экспрессирующим цитокин TRAIL дикого типа. Результатом проделанной работы является плазмидный вектор pET-32a/trail для прямой экспрессии белка TRAIL дикого типа, который не содержит Trx-, His- и S-тагов и служит для прямой экспрессии белка TRAIL без тагов благодаря внесенному аминокислотному остатку метионина на N-конце (SEQ ID NO 5).

Пример 2. Экспрессия и очистка рекомбинантного белка Манселана.

Экспрессия модифицированного белка Манселана проводится в бактериальном штамме Е. coli SHuffle В. Клетки трансформируют плазмидным вектором рЕТ-32a/manselan и получают экспрессирующий штамм продуцент Е. coli SHuffle В/рЕТ-32a/manselan. Трансформированные клетки выращивают в жидкой питательной среде LB с ампициллином (100 мкг/мл) при 37°С и интенсивном перемешивании (250 об/мин) в течение 17 часов. После этого клетки инокулируют в жидкую среду ТВ с ампициллином (100 мкг/мл) разбавляя 1:100, растят при 37°С до оптической плотности ОД600=0,6 и индуцируют экспрессию целевого белка добавлением индуктора Т7-ого промотора IPTG (изопропил_β-D-1-тиогалактопиранозид). Культуру клеток выращивают при 28°С в течение 20 часов. Уровень экспрессии целевого белка анализируют в 15% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (Рис. 1). После этого клетки осаждают центрифугированием при 5000 × g при 4°С в течение 10 минут, ресуспендируют в буфере, содержащем 300 mM NaCl, 50 мМ Tris-HCl (рН 8.0) и разрушают под давлением 2000 psi на установке «French press» (Spectronic Instruments, Inc., США). Разрушенную клеточную массу осаждают центрифугированием при 25000 об/мин в течение 25 мин.

На первом этапе очистки растворимую клеточную фракцию наносят на хроматографическую колонку с сорбентом Ni-NTA агарозой (Qiagen) предварительно уравновешенную в буфере для разрушения клеток. Колонку промывают буфером, содержащим 300 мМ NaCl, 50 мМ NaH2PO4 20 mM имидазола, 0.1% Triton Х-100. Целевой белок Манселан элюируют в буфере, содержащем 300 мМ NaCl, 50 мМ NaH2PO4, 250 мМ имидазола (рН 8.0). Очищенный препарат диализуют против буфера, содержащего 45 мМ NaCl, 50 мМ Tris-HCl, 5 мМ β-МЕ (β-меркаптоэтанол), 0.02% NaN3 (рН 7.5) при комнатной температуре в течение 18 часов. На втором этапе белок очищают с помощью катион-обменной хроматографии на сорбенте SP Sepharose (GE Healthcare) в 0-500 mM линейном градиенте NaCl на установке (GE Healthcare, Sweden). Перед нанесением белка на колонку к раствору белка добавляют 0.05% Triton Х-100. На третьем этапе белок дополнительно очищают на сорбенте Ni-NTA агароза. Целевой белок Манселан элюируют с помощью буфера, содержащего 300 мМ NaCl, 50 мМ NaH2PO4, 250 мМ имидазола (рН 8.0). Очищенный белок диализуют против буфера, содержащего 150 мМ NaCl (рН 7.5) в течении 18-20 часов при 4°°С. Полученный высокоочищенный препарат Манселан стерилизуют фильтрацией через стерильный шприцевой фильтр (Millipore, США) с порами 0,2 мкм с мембраной поливинил-дифторид (PVDF) и хранят при 4°С. Пробы после каждой стадии очистки анализируют в полиакриламидном геле при окрашивании краской Кумасси бриллиантовой синий R250 (Рис. 2) или нитратом серебра (Рис. 3). Аналогичную процедуру проводят для цитокина TRAIL дикого типа.

Выходы белковых препаратов Манселан и TRAIL приведены в Таблице 1.

Гомогенность и тримеризацию полученного препарата Манселан исследуют с помощью аналитического ультрацентрифугирования. Показывают, что очищенный препарат Манселан является высоко гомогенным и состоит на 98% из тримерных молекул (Рис. 4).

Пример 3. Очистка препарата Манселан от эндотоксинов.

После аффинной и ионообменной хроматографии препараты Манселан и TRAIL дополнительно очищают на аффинном сорбенте Pierce High Capacity Endotoxin Removal Resin (Thermo Scientific). Каждые 50 мл образца инкубируют с 10 мл сорбента в течение 2 часов при комнатной температуре при медленном помешивании. Затем смесь белков с сорбентом наносят на колонку и собирают белковую фракцию без сорбента.

Для количественной оценки содержания эндотоксинов используют набор ToxinSensor™ Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit (USA). Содержание эндотоксинов в препарате оценивают спектрофотометрически по поглощению при 545 нм. Серийные разведения белков Манселан и TRAIL проводят в воде для ЛАЛ-теста. В качестве отрицательного контроля используют воду для ЛАЛ-теста, в качестве положительного контроля используют стандартные количества эндотоксинов, входящих в набор реактивов. Содержание эндотоксинов в препарате определяют графически по калибровочной кривой (Табл. 2).

Пример 4. Исследование биологической активности препарата на линиях опухолевых клеток.

Линии клеток колоректальной карциномы НСТ116 и карциномы легких А549 карциномы культивируют в жидкой питательной среде DMEM, содержащей 10% (по объему) бычьей эмбриональной сыворотки. Линию клеток аденокарциномы молочной железы MCF7 культивируют в жидкой питательной среде ЕМЕМ, содержащей 10 мкг/мл рекомбинантного человеческого инсулина (Sigma) и 10% бычьей эмбриональной сыворотки. Линию Т-клеточной лейкемии Jurkat культивируют в жидкой питательной среде RPMI 1640, содержащей 5% бычьей эмбриональной сыворотки. Все линии клеток культивируют при 37°С и 5% СО2. Разведения белков TRAIL, DR5-B и Манселан производят в культуральной среде. Для определения количества живых клеток клетки рассаживают на 96-луночные планшеты (1×105 клеток/лунку) и инкубируют с серийными разведениями препаратов TRAIL, DR5-B и Манселан в течение 24 часов при 37°С и 5% СО2. После этого добавляют реагент МТТ (3-[4,5-диметилтиазол-2]-2,5-дифенил тетразолия бромид) в окончательной концентрации 0.5 мг/мл и инкубируют в течении 3 часов при 37°С. Планшеты центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин, удаляют надосадок и в каждую лунку добавляют ДМСО для растворения кристаллов формазана. Количество живых клеток определяют путем измерения поглощения раствора формазана в ДМСО при 540 нм на установке BioRad 680 (USA). Показывают, что Манселан эффективнее вызывает гибель всех тестированных клеточных линиях по сравнению с TRAIL (Рис. 5). Активность препарата Манселан, полученного описываемым методом прямой экспрессии, сравнивают с препаратом DR5-B, полученным ранее описанным методом гибридной экспрессии в линии Т-клеточной лейкемии Jurkat. Показывают, что препараты, полученные обоими способами, индуцируют апоптоз с одинаковой эффективностью (Рис. 6).

Способ получения рекомбинантного противоопухолевого белка DR5-B, модифицированного аминокислотным остатком метионина на N-конце с SEQ ID NO 4, ген которого находится в составе плазмидной ДНК рЕТ-32а без Trx-, His- и S-тагов с последующей трансформацией штамма Е. coli SHuffle В полученной рекомбинантной плазмидной ДНК, прямой экспрессией, выделением и очисткой целевого белка.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к модуляции количества гепсидина, и может быть применено в медицине для лечения заболеваний, связанных с метаболизмом железа у субъекта.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению рекомбинантных аналогов лактаптина, и может быть использовано в медицине. Сконструирована плазмидная ДНК pEL1, обеспечивающая синтез рекомбинантного пептида EL1 в клетках млекопитающего, и получен рекомбинантный пептид EL1, имеющий молекулярную массу 14,1 кДа.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям, и может быть использовано для экспрессии представляющего интерес полипептида в клетках CHO.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения рекомбинантного альфа-2,3- и альфа-2,6-сиалированного фолликулостимулирующего гормона (ФСГ).

Изобретение относится к биотехнологии. Предложены клетка-хозяин E.coli для получения анти-VEGF антитела или антигенсвязывающего фрагмента анти-VEGF, свободных от ошибки включения норлейцина, клетка-хозяин E.coli для получения антитела против фактора D или антигенсвязывающего фрагмента против фактора D, свободных от ошибки включения норлейцина, и Клетка-хозяин E.coli для получения анти-МЕТ антитела или антигенсвязывающего фрагмента анти-МЕТ, свободных от ошибки включения норлейцина.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению иммуногенного полипептида, обеспечивающего формирование иммунного ответа против инфекции, вызываемой спирохетами комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato, и может быть использовано для серодиагностики клещевого боррелиоза.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к терапевтическим химерным белкам, которые можно применять в медицине для лечения мукополисахаридоза IIIB типа (Синдром Санфилиппо В).

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению терапевтических белков, и может быть использовано для получения слитого белка MBP84-106-Fc, состоящего из лидерного пептида тяжелой цепи моноклонального антитела FI0, слитого с фрагментом основного белка миелина 84-106 (МВР84-106) и затем с Fc-фрагментом антитела IgG 1 (домены СН2-СН3) человека, в клетках яичника китайского хомячка (СНО).

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ лечения расстройства, связанного или ассоциированного с действием желчных кислот, включающий введение пептида.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению человеческих белков в клетках СНО, и может быть использовано для получения человеческого антитела к гемагглютинину вируса гриппа А (ВГА) изотипа IgA2m1.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к дифференцировке клеточного кластера плюрипотентных стволовых клеток в клетки дефинитивной энтодермы. Способ включает получение клеточного кластера плюрипотентных стволовых клеток из плюрипотентных стволовых клеток, выращенных на плоской прикрепленной культуре, сформированного из скопления клеток или не выделенного из суспензий отдельных клеток, причем плюрипотентные стволовые клетки представляют собой плюрипотентные стволовые клетки неэмбрионального происхождения, индуцибельные плюрипотентные клетки, репрограмированные плюрипотентные клетки, клетки, выделенные из соматических клеток взрослого человека, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, клетки, полученные из амниотической жидкости человека, человеческие партеноты или клетки из линий эмбриональных стволовых клеток человека H1, H7, H9 или SA002.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к получению популяции клеток, экспрессирующих MAFA. Способ включает дифференцировку клеток человека, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, которые представляют собой плюрипотентные стволовые клетки человека не эмбрионального происхождения, клетки из линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, клетки из линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H7, клетки из линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H9, или клетки из линии человеческих эмбриональных стволовых клеток SA002, в клетки человека, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы.

Изобретение относится к биотехнологии. Описана двунитевая рибонуклеиновая кислота (днРНК) для ингибирования экспрессии ALAS1.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описано получение рекомбинантного антигена вирусного капсида цирковируса свиней 2 (PCV-2) и его модификации путем экспрессии в прокариотической системе, очистки в мономерной форме, выделения вирусоподобных частиц (ВПЧ) и его применение в композициях вакцин, диагностических наборах и системе для количественной оценки антигена PCV-2 в партиях вакцин путем анализа с помощью (антиген)захватывающего ELISA.

Настоящее изобретение относится к генной инженерии. Предложен способ in vitro модификации генома в представляющем интерес геномном локусе в нечеловеческой плюрипотентной клетке млекопитающего, включающий внесение в клетку компонентов системы CRISPR/Cas9 в комбинации с крупным направляющим вектором (LTVEC), который составляет по меньшей мере 10 т.п.о.

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к получению рекомбинантных полипептидов аденовируса, и может быть использовано в медицине для увеличения эффективности терапевтического лечения солидной опухоли, экспрессирующей десмоглеин 2 (DSG2).

Настоящее изобретение относится к иммунологии. Предложен химерный антигенный рецептор (CAR), который содержит дисиалоганглиозид (GD2)-связывающий домен.

Изобретение относится к биотехнологии. Описано применение для лечения пациента с раком, экспрессирующим опухолеассоциированный антигенный белок MAGEA3, выделенной вирусной частицы Maraba MG1 и первого вируса.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложена система для экспрессии Fab-фрагментов антител, состоящая из рекомбинантных плазмидных ДНК Ab-HCh-HIS/pPICZ_α_A и Ab-LCh-LAMBDA/pPICZα_A.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложен иммортализованный альвеолярный макрофаг свиней (PAM) для репликации вируса PRRS.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложены клетка-хозяин E.coli для получения анти-VEGF антитела или антигенсвязывающего фрагмента анти-VEGF, свободных от ошибки включения норлейцина, клетка-хозяин E.coli для получения антитела против фактора D или антигенсвязывающего фрагмента против фактора D, свободных от ошибки включения норлейцина, и Клетка-хозяин E.coli для получения анти-МЕТ антитела или антигенсвязывающего фрагмента анти-МЕТ, свободных от ошибки включения норлейцина.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению терапевтических белков, и может быть использовано для получения рекомбинантного противоопухолевого белка DR5-B в Е. coli. Способ предусматривает трансформацию клеток штамма Е. coli SHuffle В полученной рекомбинантной плазмидной ДНК рЕТ-32а без Trx-, His- и S-тагов, кодирующей DR5-B с последующей экспрессией, выделением и очисткой целевого белка. Изобретение позволяет получить модифицированный противоопухолевый белок Манселан на основе мутантного варианта цитокина TRAIL DR5-B с высоким выходом и степенью очистки от низкомолекулярных белковых примесей и бактериальных эндотоксинов. 2 табл., 6 ил., 4 пр.

Наверх