Способ детекции нуклеосом, содержащих нуклеотиды

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены способы детекции присутствия в образце биологической жидкости основания ДНК, связанного с внеклеточной нуклеосомой, способ оценки животного субъекта или человека в отношении пригодности для терапевтического лечения, способ наблюдения лечения животного субъекта или человека и применение основания ДНК, связанного с внеклеточной нуклеосомой, в качестве биомаркера в образце биологической жидкости для диагностики рака, причем основание ДНК выбрано из 5-метилцитозина или 5-гидроксиметилцитозина. Предложенная группа изобретений обеспечивает более высокую клиническую чувствительность диагностики рака у животного субъекта или человека. 6 н. и 11 з.п. ф-лы, 21 ил., 7 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу детекции и измерения присутствия мононуклеосом и олигоуклеосом, а также нуклеосом, которые содержат определенные нуклеотиды, и к применению таких измерений для детекции и диагностики заболевания. Настоящее изобретение также относится к способу идентификации связанных с нуклеосомами нуклеотидных биомаркеров для детекции и диагностики заболевания и к биомаркерам, идентифицируемым указанным способом.

Уровень техники

Организм человека включает несколько сотен клеточных типов. Все эти клеточные типы содержат одинаковый геном, но имеют весьма разнообразные фенотипы и выполняют различные функции в организме. Их фенотипическое разнообразие обусловлено дифференциальной экспрессией генома в различных клеточных типах. Регулирование дифференциальной экспрессии генов не является полностью понятным, но основные механизмы включают регулирование генов рядом взаимосвязанных эпигенетических сигналов, связанных с генами, включая регуляцию укладки хроматина в форме эухроматина или гетерохроматина, регулирование расположение нуклеосом и доступных для нуклеазы центров, метилирование ДНК и видоизменение структуры нуклеосом, вокруг которых обертывается ДНК.

Нуклеосома представляет собой основную единицу структуры хроматина и состоит из белкового комплекса восьми высококонсервативных центральных гистонов (включая пару каждого из гистонов H2A, H2B, H3 и H4). Вокруг этого комплекса обертываются приблизительно 146 пар оснований ДНК. Другой гистон, H1 или H5, выступает в качестве линкера и принимает участие в уплотнении хроматина. Часто говорят, что ДНК, которая обертывается вокруг последовательных нуклеосом в структуре, напоминает «бусины на нити», образуя, таким образом, основную структуру открытого хроматина или эухроматина. В уплотненном хроматине или гетерохроматине эта нить свертывается в закрытую и сложную структуру (Herranz и Esteller, 2007).

Структуру нуклеосом может изменять посттранскрипционная модификация (ПТМ) гистоновых белков и включение вариантов гистоновых белков. ПТМ гистоновых белков, как правило, происходит на концах центральных гистонов, причем обычные модификации включают ацетилирование, метилирование или убиквитинирование лизиновых остатков, а также метилирование аргининовых остатков, фосфорилирование сериновых остатков и многие другие реакции. Как известно, гистоновые модификации принимают участие в эпигенетическом регулировании экспрессии генов (Herranz и Esteller, 2007). Структуру нуклеосомы может также изменять включение альтернативных гистоновых изоформ или вариантов, которые представляют собой различные гены или продукты сплайсинга и имеют различные аминокислотные последовательности. Гистоновые варианты можно классифицировать по ряду семейств, которые подразделяются на индивидуальные типы. Нуклеотидные последовательности большого числа гистоновых вариантов являются известными и общедоступными; их представляют, например, гистоновая база данных Национального института исследования генома человека (NHGRI) (см. поданную работу L. Marino-Ramirez, K.M. Levine, M. Morales, S. Zhang, R.T. Moreland, A.D. Baxevanis и D. Landsman, «Гистоновая база данных: интегрированный ресурс по гистонам и содержащим складки гистоновым белкам», база данных, т. 2011, и http://genome.nhgri.nih.gov/histione/complete.shtml), база данных генетических последовательностей GenBank® Национального института здравоохранения (NIH), база данных нуклеотидных последовательностей Европейской лаборатории молекулярной биологии (EMBL) и банк данных ДНК Японии (DDBJ).

Нормальный клеточный оборот у взрослого человека включает образование приблизительно 10¹¹ клеток в сутки посредством клеточного деления и смерть приблизительно такого же числа клеток, главным образом, посредством апоптоза. В течение процесса апоптоза хроматин разрушается, образуя мононуклеосомы и олигонуклеосомы, которые высвобождаются из клеток. При нормальных условиях, согласно сообщениям, у здоровых субъектов обнаруживается низкий уровень циркулирующих нуклеосом. Повышенные уровни обнаруживаются у субъектов, имеющих разнообразные состояния, включающие многочисленные типы рака, аутоиммунные заболевания, воспалительные состояния, инсульт и инфаркт миокарда (Holdenreider и Stieber, 2009).

Мононуклеосомы и олигонуклеосомы можно обнаруживать, используя иммуноферментный твердофазный анализ (ELISA), причем в сообщениях описан ряд методов (Salgame et al., 1997; Holdenrieder et al., 2001; van Nieuwenhuijze et al., 2003). В этих анализах, как правило, используют антигистоновое антитело (например, анти-H2B, анти-H3 или анти-H1, H2A, H2B, H3 и H4) в качестве иммобилизованного антитела и комплексное антитело анти-ДНК или анти-H2A-H2B-ДНК в качестве идентифицирующего антитела. Используя эти анализы, исследователи в данной области сообщают, что уровень нуклеосом в сыворотке выше (на целый порядок), чем в образцах плазмы, взятых у тех же самых пациентов. Это также действительно для измерений ДНК в сыворотке и плазмы, осуществленных методом ПЦР (Holdenrieder et al., 2005). Причина этого остается неизвестной, но авторы предполагают, что она может быть обусловлена дополнительным выделением ДНК в течение процесса свертывание. Однако авторы настоящего изобретения обнаружили, что результаты нуклеосомных анализов методом ELISA предшествующего уровня техники не согласуются друг с другом. Кроме того, хотя, согласно сообщениям, основная масса циркулирующей ДНК в сыворотке или плазме существует в форме мононуклеосом и олигоуклеосом (Holdenrieder et al., 2001), измеряемые уровни нуклеосом и ДНК в сыворотке или плазме не согласуются удовлетворительным образом. Коэффициент корреляции r между результатами ELISA в отношении уровней циркулирующих внеклеточных нуклеосом и уровней циркулирующей ДНК, который измеряются в реальном времени с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), согласно сообщениям, составляет 0,531 в сыворотке и 0,350 в плазме (Holdenrieder et al., 2005).

В настоящее время методы нуклеосомного ELISA используют в клеточной культуре, главным образом, в качестве метода детекции апоптоза (Salgame et al., 1997; Holdenrieder et al., 2001; van Nieuwenhuijze et al., 2003), и их также используют для измерения циркулирующих внеклеточных нуклеосом в сыворотке и плазме (Holdenrieder et al., 2001). Уровни внеклеточных нуклеосом в сыворотке и плазме, которые высвобождаются в систему кровообращение из умирающих клеток, измеряют методами ELISA в исследованиях ряда различных типов рака, чтобы оценить их использование в качестве потенциального биомаркера (Holdenrieder et al., 2001). Согласно сообщениям, средние уровни циркулирующих нуклеосом являются максимально высокими, но не для всех исследованных типов рака. Наиболее высокие уровни циркулирующих нуклеосом наблюдали у страдающих раком легкого субъектов. В случае рака предстательной железы наблюдали минимальные уровни, которые находились в пределах нормального интервала для здоровых субъектов. Однако пациенты, имеющие злокачественные опухоли, согласно сообщениям, имеют концентрации нуклеосом в сыворотке, которые значительно отличались, и у некоторых пациентов, имеющих прогрессирующее опухолевое заболевание, обнаружены низкие уровни циркулирующих нуклеосом, которые находились в пределах интервала, измеряемого для здоровых субъектов (Holdenrieder et al., 2001). Вследствие этого, а также разнообразных нераковых причин повышенных уровней нуклеосом уровни циркулирующих нуклеосом не используют в клинической практике в качестве биомаркера рака (Holdenrieder и Stieber, 2009). Неожиданно авторы обнаружили, что многие страдающие раком субъекты, у которых уровни циркулирующих нуклеосом являются низкими или не обнаруживаются при измерении методами нуклеосомного ELISA предшествующего уровня техники, на самом деле имеют повышенные уровни циркулирующих внеклеточных нуклеосом. Авторы разработали и продемонстрировали для нуклеосом новые методы ELISA, которыми обнаруживаются нуклеосомы, не обнаруживаемые методами ELISA предшествующего уровня техники.

В данной области также известны методы ELISA для детекции гистоновых ПТМ. Методы ELISA для детекции ПТМ в свободных гистоновых белках (не связанных с другими гистонами и ДНК в нуклеосомном комплексе) используют для детекции ПТМ в экстрагированных гистонах, получаемых обычно посредством кислотной экстракции из клеточных лизатов. Описан иммунологический анализ для детекции ПТМ в циркулирующих внеклеточных нуклеосомах (Bawden et al., 2005). Недавно было описано применение метода ELISA для детекции гистоновых ПТМ в очищенных нуклеосомах, нанесенных непосредственно на лунки микропланшета (Dai et al., 2011). Согласно данному методу, нуклеосомы, полученные путем гидролиза хроматиновых экстрактов из культивируемых клеток, нанесены непосредственно на лунки микропланшета и реагируют с антителами анти-ПТМ. Как очевидно специалистам в данной области, для данного метода требуются относительно чистые нуклеосомные образцы, и он не является подходящим для непосредственного измерения гистоновых ПТМ в сложных биологических средах, таких как кровь или сыворотка.

Описан метод модифицированной иммунопреципитации хроматина (ИПХ) для детекции в плазме гистоновых ПТМ (H3K9Me, гистон H3, монометилированный в лизиновом остатке K9) во внеклеточных нуклеосомах, связанных с определенной последовательностью ДНК. Согласно описанию, уровень метилирования последовательности определенных гистонов не зависит от концентрации циркулирующих нуклеосом (Deligezer et al., 2008).

Как известно, гистоновые варианты (также известные как гистоновые изоформы) представляют собой эпигенетические регуляторы экспрессии генов (Herranz и Esteller, 2007). Гистоновые варианты были исследованы in vitro и in vivo, с использованием разнообразных методов, таких как исследования нокдауна гена, кодирующего определенный вариант (например, использование нокдауна РНК-интерференции), иммунопреципитация хроматина, стабильные изотопные метки аминокислот и количественная масс-спектрометрическая протеомика, иммуногистохимия и вестерн-блоттинг (Whittle et al., 2008; Boulard et al., 2010; Sporn et al., 2009; Kapoor et al., 2010; Zee et al., 2010; Hua et al., 2008).

Описаны иммуногистохимические исследования экспрессии гистоновых вариантов в образцах тканей, удаленных в процессе хирургической операции или биопсии у субъектов, имеющих диагностированный рак легкого, рак молочной железы и меланому. Эти иммуногистохимические исследования показывают, что окрашивание гистоновых вариантов макроH2A (mH2A) и H2AZ в резецированных образцах раковых тканей может иметь прогностическое применение в отношении этих типов рака (Sporn et al., 2009; Hua et al., 2008; Kapoor et al., 2010). Один недостаток клинического применения иммуногистохимических методов заключается в том, что сбор образцов тканей является инвазивным и представляет собой хирургическую операцию или биопсию. Еще один недостаток иммуногистохимических методов заключается в том, что они не являются пригодными для ранней диагностики или для диагностики в массовом обследовании, поскольку обоснованное предположение заболевания обычно должно уже существовать перед тем, как осуществляется биопсия или резекция ткани. Минимально инвазивные анализы крови методом ELISA являются подходящими для широкого круга применений, преодолевают эти недостатки и являются предпочтительными для пациента, а также отличаются повышенной скоростью, меньшей стоимостью и увеличенной пропускной способностью для медицинских учреждений.

Однако внеклеточные гистоновые варианты во внеклеточных нуклеосомах не были измерены в крови или другой среде. Не описаны исследования присутствия или отсутствия гистоновых вариантов во внеклеточных нуклеосомах крови. В настоящее время не существуют методы детекции или измерения гистоновых вариантов в неизмененных внеклеточных нуклеосомах, и не предложены и не предусмотрены какие-либо подобные измерения.

Помимо эпигенетического сигнала, который передают положение нуклеосомы и структура нуклеосомы (в отношении составляющего гистонового белкового варианта и структур ПТМ), регуляция экспрессии генов в клетках также передается модификациями нуклеотидов ДНК, включая состояние метилирования цитозина ДНК. В течение некоторого времени в данной области известно, что ДНК можно метилировать в положении 5 цитозиновых нуклеотидов, образуя 5-метилцитозин. Согласно сообщениям, метилирование ДНК в форме 5-метилцитозина происходит в положениях последовательности ДНК, где цитозиновый нуклеотид присутствует после гуанинового нуклеотида. Эти положения обозначаются для краткости термином «CpG». Согласно сообщениям, у позвоночных более чем 70% положений CpG являются метилированными (Pennings et al., 2005). Области генома, которые содержат в высокой пропорции центры CpG, часто называются термином «островки CpG», и приблизительно 60% последовательностей промоторов генов человека связаны с такими островками CpG (Rodriguez-Paredes и Esteller, 2011). В активных генах эти островки CpG, как правило, являются гипометилированными. Метилирование последовательностей промоторов генов связано с инактивацией стабильного гена. Метилирование ДНК также обычно происходит в повторяющихся элементах, включающих повторяющиеся элементы Alu и длинные рассеянные нуклеотидные элементы (Herranz и Esteller, 2007; Allen et al., 2004).

Сообщение об изменении метилирования ДНК в случае рака было опубликовано еще в 1983 г. (Feinberg и Vogelstein, 1983). Уровни метилирования ДНК, наблюдаемые в раковых клетках, отличаются от уровней метилирования здоровых клеток. Согласно сообщениям, повторяющиеся элементы, в частности, вокруг перицентромерных областей, являются гипометилированными в случае рака по сравнению со здоровыми клетками, но промоторы специфических генов, согласно сообщениям, являются гиперметилированными в случае рака. Согласно сообщениям, баланс этих двух эффектов приводит к глобальному гипометилированию ДНК в раковых клетках (Rodriguez-Paredes и Esteller, 2007).

Гиперметилирование определенных специфических генов можно использовать в качестве диагностического биомаркера рака. Например, описанный метод детекции гиперметилирования гена септина 9 методом ПЦР-амплификации ДНК, экстрагированной из плазмы, согласно сообщениям, обнаруживал 72% случаев рака ободочной кишки, причем относительное число ложноположительных заключений составляло 10% (Grutzmann et al., 2008). Состояние метилирования ДНК специфических генов или локусов обычно обнаруживается посредством селективного бисульфитного деаминирования цитозина, но не 5-метилцитозина, до урацила, вызывая изменение первичной последовательности ДНК, которое можно детектировать, используя секвенирование или другие методы (Allen et al., 2004).

Глобальное гипометилирование ДНК представляет собой признак раковых клеток (Esteller, 2007; Hervouet et al., 2010). Глобальное метилирование ДНК можно исследовать в клетках с использованием методов иммуногистохимии (ИГХ). Альтернативно, ДНК экстрагируют из клеток для анализа. Описаны многочисленные способы детекции глобального метилирования ДНК, экстрагированной из клеток, такие как рестрикционное картирование и анализ ближайшего окружения, флуоресцентный анализ с использованием хлорацетальдегида, обратное определение путем метилирования всех островков CpG с использованием ДНК-метилтрансферазы в сочетании с меченным тритием S-аденозилметионином для вычисления количества неметилированного CpG и гидролиз ДНК на отдельные нуклеотиды для анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, тонкослойной хроматографии или жидкостной хроматографии с последующей масс-спектрометрией. Недостатки этих методов заключаются в том, что они являются трудоемкими, и/или для них требуются большие количества экстрагированной ДНК хорошего качества (Allen et al., 2004). Основанные на ПЦР методы, использующие бисульфитное деаминирование, устраняют необходимость больших количеств ДНК, но должны усиливать специфические геномные области, как правило, повторяющиеся последовательности, в качестве показателя суммарного геномного содержания 5-метилцитозина (Allen et al., 2004). Эти методы измерения глобального метилирования ДНК использовались для исследования ДНК, экстрагированной из разнообразных клеток и тканей. Некоторые авторы исследовали ДНК, экстрагированную из лейкоцитов цельной крови, потому что их легче получать минимально инвазивным способом (Moore et al., 2008; Ting Hsiung et al., 2007; Mansour et al., 2010). Жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией рассматривается в качестве золотого стандарта для измерения глобального метилирования ДНК, но она имеет высокую стоимость, и ДНК необходимо гидролизовать до уровня отдельных нуклеотидов перед анализом (Vasser et al., 2009).

Современные методы оценки глобального метилирования ДНК включают жидкостную хроматографию ультравысокого давления в сочетании с масс-спектрометрией гидролизованной ДНК, экстрагированной из ткани (Zhang et al., 2011) и метод специфического к метилированию цифрового секвенирования (MSDS) (Ogoshi et al. 2011). Описан классический конкурентный иммунологический анализ глобального метилирования ДНК (а также аналогичный анализ глобального метилирования 5-гидроксиметилцитозина). Согласно этому методу, экстрагированную из клеток или тканей ДНК, помещают в лунку микропланшета, которую покрывает 5-метилированный цитидинконъюгат, добавляют анти-5-метилцитидиновое антитело, и распределение связывания антитела между нанесенным 5-метилцитидинконъюгатом и метилированной ДНК в экстрагированном образце сравнивают с распределением известных стандартных образцов для оценки присутствующего в образце уровня глобального метилирования ДНК (Cell Biolabs, 2011). Согласно еще одному способу, подобному иммунологическому анализу, ДНК, экстрагированную из образцов тканей, плазмы или сыворотки, наносят на лунку микропланшета, и метилированную ДНК обнаруживают, используя анти-5-метилцитозиновое антитело (Vasser, et al., 2009; Epigentek, 2009). Недостаток этих методов заключается в том, что для них требуется экстракция ДНК, включающая денатурацию и удаление всей нуклеосомной и хроматиновой структуры из ДНК. Таким образом, эти методы не могут измерять связанные с нуклеосомами нуклеотиды и не являются пригодными, например, для непосредственного измерения глобального метилирования ДНК в биологических жидкостях, таких как лизат ткани, кровь, плазма или сыворотка, без стадии экстракции ДНК.

Кроме того, описана модификация путем 5-гидроксиметилирования цитозиновых оснований в ДНК. Роль 5-гидроксиметилирования еще не является вполне понятной, но считается, что она принимает участие в генном регулировании (Stroud et al., 2011).

Существующие в настоящее время методы детекции глобального метилирования ДНК включают экстракцию или очистку ДНК и не являются подходящими в качестве быстрых, высокопроизводительных, дешевых и минимально инвазивных методов диагностики. Аналогичным образом, исследование ДНК в отношении других модифицированных или необычных оснований (например, урацила, инозина, ксантина и гипоксантина) можно осуществлять только посредством анализа практически чисто или экстрагированной ДНК. Такой анализ невозможно осуществлять непосредственно в сложной биологической среде, такой как лизат ткани, кровь, плазма или сыворотка.

Внеклеточные нуклеосомы, содержащие 5-метилцитозин или какие-либо другие определенные нуклеотиды или модифицированные нуклеотиды, не были измерены в крови или какой-либо другой среде. Не описаны исследования присутствия или отсутствия в крови внеклеточных нуклеосом, содержащих определенные нуклеотиды. Не были предложены или предусмотрены анализы внеклеточных нуклеосом, содержащих определенные нуклеотиды. В настоящее время отсутствуют способы детекции или измерения внеклеточных связанных с нуклеосомами нуклеотидов.

Авторы настоящего изобретения сообщают о способах простого иммунологического анализа для непосредственной оценки связанных с нуклеосомами нуклеотидов, включая, например, 5-метилцитозин и 5-гидроксиметилцитозин, в биологических образцах без экстракции. Неожиданно авторы обнаружили, что связанные с нуклеосомами нуклеотиды можно определять в образцы крови, в которых нуклеосомы не обнаруживаются методами ELISA предшествующего уровня техники.

Сущность изобретения

Согласно первому аспекту, настоящее изобретение относится к внеклеточной нуклеосоме, включающей основание ДНК, нуклеотид или нуклеозид, для применения в качестве биомаркера в диагностике рака, кардиомиопатии, системной красной волчанки, колита, хронического обструктивного заболевания легких, болезни Крона (Crohn) и ревматоидного артрита.

Согласно второму аспекту, настоящее изобретение относится к способу детекции присутствия в образце нуклеосомы, содержащей основание ДНК, нуклеотид или нуклеозид, включающему следующие стадии:

(i) контакт образца со связующим веществом, которое связывается с основанием ДНК, нуклеотидом или нуклеозидом;

(ii) детекцию или количественное определение связывания указанного связующего вещества с основанием ДНК, нуклеотидом или нуклеозидом в образце; и

(iii) использование присутствия или степени такого связывания в качестве меры присутствия в образце нуклеосом, содержащих основание ДНК, нуклеотид или нуклеозид.

Согласно третьему аспекту, настоящее изобретение относится к способу детекции присутствия в образце нуклеосомы, содержащей основание ДНК, нуклеотид или нуклеозид, включающему следующие стадии:

(i) контакт образца с первым связующим веществом, которое связывается с нуклеосомами;

(ii) контакт нуклеосом или образца со вторым связующим веществом, которое связывается с основанием ДНК, нуклеотидом или нуклеозидом;

(iii) детекцию или количественное определение связывания указанного второго связующего вещества с основанием ДНК, нуклеотидом или нуклеозидом в образце; и

(iv) использование присутствия или степени такого связывания в качестве меры присутствия в образце нуклеосом, содержащих основание ДНК, нуклеотид или нуклеозид.

Согласно четвертому аспекту, настоящее изобретение относится к способу детекции присутствия в образце нуклеосомы, содержащей основание ДНК, нуклеотид или нуклеозид, включающему следующие стадии:

(i) контакт образца с первым связующим веществом, которое связывается с основанием ДНК, нуклеотидом или нуклеозидом;

(ii) контакт нуклеосом или образца со вторым связующим веществом, которое связывается с нуклеосомами;

(iii) детекцию или количественное определение связывания указанного второго связующего вещества с нуклеосомами в образце; и

(iv) использование присутствие или степень такого связывания в качестве меры присутствия в образце нуклеосом, содержащих основание ДНК, нуклеотид или нуклеозид.

Согласно следующему аспекту, настоящее изобретение относится к способу детекции присутствия в клетке нуклеосомы, содержащей основание ДНК, нуклеотид или нуклеозид, включающему следующие стадии:

(i) выделение хроматина из клетки;

(ii) гидролитическое, ультразвуковое или другое разрушение хроматина для образования мононуклеосом и/или олигоуклеосом; и

(iii) детекцию или измерение присутствия основания ДНК, нуклеотида или нуклеозида в указанных нуклеосомах согласно способу настоящего изобретения.

Согласно следующему аспекту, настоящее изобретение относится к способу детекции или диагностики состояния заболевания животного субъекта или человека, включающему следующие стадии:

(i) детекцию или измерение нуклеосом, содержащих основание ДНК, нуклеотид или нуклеозид, в биологической жидкости субъекта; и

(ii) использование уровня связанного с нуклеосомами основания ДНК, нуклеотида или нуклеозида, измеренного для определения состояния заболевания субъекта.

Согласно следующему аспекту, настоящее изобретение относится к способу оценки животного субъекта или человека в отношении пригодности для терапевтического лечения, включающему следующие стадии:

(i) детекцию или измерение нуклеосом, содержащих основание ДНК, нуклеотид или нуклеозид, в биологической жидкости субъекта; и

(ii) использование уровня связанного с нуклеосомами основания ДНК, нуклеотида или нуклеозида, определяемого в качестве параметра при выборе подходящего лечения для субъекта.

Согласно следующему аспекту, настоящее изобретение относится к способу наблюдения лечения животного субъекта или человека, включающему следующие стадии:

(i) детекцию или измерение нуклеосом, содержащих основание ДНК, нуклеотид или нуклеозид в биологической жидкости субъекта; повторную детекцию или измерение нуклеосом, содержащих основание ДНК, нуклеотид или нуклеозид в биологической жидкости субъекта в один или несколько моментов времени; и

(ii) использование любых изменений уровня связанного с нуклеосомами основания ДНК, нуклеотида или нуклеозида, определяемого в качестве параметра любых изменений состояния субъекта.

Согласно следующему аспекту, настоящее изобретение относится к способу идентификации биомаркера основания ДНК, нуклеотида или нуклеозида для детекции или диагностики состояния заболевания животного субъекта или человека, включающему следующие стадии:

(i) детекцию или измерение нуклеосом, содержащих основание ДНК, нуклеотид или нуклеозид в биологической жидкости субъекта;

(ii) детекцию или измерение нуклеосом, содержащих основание ДНК, нуклеотид или нуклеозид в биологической жидкости здорового субъекта или контрольного субъекта; и

(iii) использование разности между уровнями, обнаруженными у больных и контрольных субъектов, для определения возможного применения основания ДНК, нуклеотида или нуклеозида в качестве биомаркера для оценки состояния заболевания.

Согласно следующему аспекту, настоящее изобретение относится к биомаркеру, идентифицируемому описанным выше способом согласно настоящему изобретению.

Согласно следующему аспекту, настоящее изобретение относится к набору для детекции связанного с нуклеосомами основания ДНК, нуклеотида или нуклеозида, который включает специфический лиганд или связующее вещество для основания ДНК, нуклеотида или нуклеозида, или их составляющей части, или имитатор структуры/формы основания ДНК, нуклеотида или нуклеозида, или их составляющей части, вместе с инструкциями для применения набора.

Краткое описание фигур

Фиг.1. Кривая доза-ответ для детекции методом ELISA 5-метилцитозинметилированной ДНК во внеклеточных нуклеосомах перекрестно-сшитого гидролизованного хроматина, экстрагированного из клеток MCF7 и разведенного телячьей сывороткой.

Фиг.2. Кривая доза-ответ для детекции методом ELISA 5-гидроксиметилцитозинметилированной ДНК во внеклеточных нуклеосомах перекрестно-сшитого гидролизованного хроматина, экстрагированного из клеток A375 и разведенного телячьей сывороткой.

Фиг.3. Уровни нуклеосом, детектированные в образцах сыворотки и содержащей EDTA плазмы, взятых у 20 здоровых добровольцев, с использованием методов нуклеосомного ELISA известного уровня техники.

Фиг.4. Уровни связанного с внеклеточными нуклеосомами гистонового варианта mH2A1.1, детектированные в образцах сыворотки и содержащей EDTA плазмы, взятых к 20 здоровых добровольцев.

Фиг.5. Уровни связанного с внеклеточными нуклеосомами гистонового варианта mH2A2, детектированные в образцах сыворотки и содержащей EDTA плазмы, взятых у 20 здоровых добровольцев.

Фиг.6. Уровни связанного с внеклеточными нуклеосомами гистонового варианта H2AZ, детектированные в образцах сыворотки и содержащей EDTA плазмы, взятых у 20 здоровых добровольцев.

Фиг.7. Уровни связанной с внеклеточными нуклеосомами гистоновой модификации P-H2AX (Ser139), детектированные в образцах сыворотки и содержащей EDTA плазмы, взятых у 20 здоровых добровольцев.

Фиг.8. Уровни связанной с внеклеточными нуклеосомами 5-метилцитозинметилированной ДНК, детектированные в образцах сыворотки и содержащей EDTA плазмы, взятых у 20 здоровых добровольцев, с использованием методов ELISA согласно настоящему изобретению.

Фиг.9. Уровни связанной с внеклеточными нуклеосомами 5-гидроксиметилцитозинметилированной ДНК, детектированные в образцах сыворотки, взятых у 20 здоровых добровольцев, с использованием методов ELISA согласно настоящему изобретению.

Фиг.10. Уровни связанных с внеклеточными нуклеосомами нуклеотидов и типов гистонов, детектированные в содержащих EDTA образцах плазмы, взятых у трех страдающих раком ободочной кишки субъектов.

Фиг.11. Уровни связанных с внеклеточными нуклеосомами нуклеотидов и типов гистонов, детектированные в содержащих EDTA образцах плазмы, взятых у 13 страдающих раком легкого субъектов.

Фиг.12. Уровни связанных с внеклеточными нуклеосомами нуклеотидов и типов гистонов, детектированные в содержащих EDTA образцах плазмы, взятых у двух страдающих раком поджелудочной железы субъектов.

Фиг.13. Уровни связанных с внеклеточными нуклеосомами нуклеотидов и типов гистонов, детектированные в содержащих EDTA образцах плазмы, взятых у одного страдающего раком полости рта субъекта.

Фиг.14. Уровни связанных с внеклеточными нуклеосомами нуклеотидов и типов гистонов, детектированные в содержащих EDTA образцах плазмы, взятых у четырех страдающих различными раковыми заболеваниями субъектов, и нормированные по отношению к уровням связанной с нуклеосомами 5-метилцитозинметилированной ДНК, детектированным с использованием методов ELISA согласно настоящему изобретению. Нормированные уровни для образца, содержащего нуклеосомы, полученные от здоровых добровольцев и полученные известным способом (*Holdenrieder et al., 2001) представлены для сравнения (в данном образце не измеряли mH2A2 и 5-гидроксиметилцитозин).

Фиг.15. Уровни связанного с внеклеточными нуклеосомами 5-метилцитозина (5mc), mH2A1.1, H2AZ и P-H2AX (Ser139), детектированные в образцах содержащей EDTA плазмы, содержащей цитрат плазмы и содержащей гепарин плазмы, взятых у здоровых добровольцев, с использованием методов ELISA согласно настоящему изобретению.

Фиг.16. Уровни связанного с внеклеточными нуклеосомами 5-метилцитозина, детектированные в образцах сыворотки, взятых у трех здоровых добровольцев и 10 страдающих раком ободочной кишки субъектов, с использованием методов ELISA согласно настоящему изобретению.

Фиг.17. Уровни связанного с внеклеточными нуклеосомами 5-метилцитозина, детектированные в содержащих EDTA образцах плазмы, взятых у 13 здоровых добровольцев и 55 страдающих раком пациентов. Представленные уровни отсечки определены как среднее значение для здоровых образцов плюс одно или удвоенное среднеквадратическое отклонение от среднего значения.

Фиг.18. Уровни связанного с внеклеточными нуклеосомами 5-метилцитозина, детектированные в содержащих EDTA образцах плазмы, взятых у 10 здоровых добровольцев и 61 страдающего раком пациента. Представленный уровень определен как среднее значение для здоровых образцов плюс удвоенное среднеквадратическое отклонение от среднего значения.

Фиг.19. Уровни связанного с внеклеточными нуклеосомами 5-метилцитозина, детектированные в содержащих EDTA образцах плазмы, взятых у страдающих раком легкого и раком ободочной кишки пациентов с увеличивающимся размером опухоли, стадией и узловым развитием заболевания.

Фиг.20. Средние уровни связанных с внеклеточными нуклеосомами нуклеотидов и типов гистонов, детектированные с использованием методов ELISA согласно настоящему изобретению в содержащих EDTA образцах плазмы, взятых у 10 страдающих различными раковыми заболеваниями пациентов, нормированные по отношению у уровням связанной с нуклеосомами 5-метилцитозинметилированной (5mc) ДНК и выраженные по отношению к средним уровням, обнаруженным у 11 здоровых субъектов.

Фиг.21. Средние уровни связанных с внеклеточными нуклеосомами нуклеотидов и типов гистонов, детектированные с использованием методов ELISA согласно настоящему изобретению в содержащих EDTA образцах плазмы, взятых у двух страдающих кардиомиопатией пациентов, 10 страдающих системной красной волчанкой пациентов, 12 страдающих язвенным колитом пациентов, 10 страдающих хроническим обструктивным заболеванием легких (ХОЗЛ) пациентов, 8 страдающих болезнью Крона пациентов и 10 страдающих ревматоидным артритом (РА) пациентов, нормированные по отношению к уровням связанной с нуклеосомами 5-метилцитозинметилированной (5mc) ДНК и выраженные по отношению к средним уровням, обнаруженным у 11 здоровых субъектов.

Подробное описание изобретения

Согласно первому аспекту, настоящее изобретение относится к внеклеточной нуклеосоме, включающей основание ДНК, нуклеотид или нуклеозид, для применения в качестве биомаркера в диагностике рака, кардиомиопатии, системной красной волчанки, колита, хронического обструктивного заболевания легких, болезни Крона и ревматоидного артрита.

Согласно одному варианту осуществления, нуклеосома представляет собой мононуклеосому или олигонуклеосому.

Согласно одному частному аспекту настоящего изобретения, который можно привести, изобретение относится к применению основания ДНК, нуклеотида или нуклеозида в качестве биомаркера в диагностике рака.

Согласно одному варианту осуществления, рак представляет собой рак мочевого пузыря, молочной железы, ободочной кишки, шейки матки, пищевода, почки, толстой кишки, легкого, полости рта, яичника, поджелудочной железы, предстательной железы, прямой кишки, кожи или желудка. Согласно одному частному варианту осуществления, который можно привести, рак представляет собой рак ободочной кишки, легкого, полости рта или поджелудочной железы.

Авторы разработали исследования методом ELISA для детекции и измерения нуклеосом, содержащих основания ДНК (5-метилцитозин и 5-гидроксиметилцитозин). Авторы использовали антигистоновое антитело в качестве иммобилизованного антитела для этих исследований в комбинации с соответствующим антителом, специфическим для анти-нуклеотида. Авторы использовали анализы для демонстрации того, что нуклеосомы, содержащие специфические нуклеотиды, можно измерять в образцах крови, взятых у субъектов, страдающих раком, обладают достаточной разрешающей способностью для применения в качестве неинвазивных или минимально инвазивных биомаркеров. По сравнению с уровнями других нуклеосомных эпитопов, уровни связанного с нуклеосомами ДНК 5-метилцитозина детектированные в образцах сыворотки и плазмы, взятых у больных субъектов, отличались от уровней, обнаруженных в образцах, взятых у здоровых субъектов. Кроме того, картина уровней нуклеотидов, обнаруженных в нуклеосомах образцов, взятый у субъектов, имеющих различные заболевания, оказалась отличающейся, таким образом, что оказалась возможной дифференциальная диагностика заболевания, в частности, когда картины связанных с нуклеосомами нуклеотидов исследовали в сочетании с картинами, определенными для нуклеосом, содержащих различные гистоновые варианты и гистоновые модификации. Для специалистов в данной области будет очевидным, что включение в исследования нуклеосом, содержащих различные или дополнительные нуклеотиды, должно, вероятно, повышать разрешающую способность дифференциальной диагностики с использованием таких картин.

Для исследования уровней нуклеосом, которые обнаруживаются у здоровых субъектов, с использованием способов известного уровня техники авторы измеряли нуклеосомы в образцах сыворотки и плазмы, взятых у 20 здоровых субъектов. Оба способа известного уровня техники демонстрировали более высокие сигналы для образцов сыворотки, взятых у здоровых субъектов, чем для образцов плазмы. Результаты представлены на фиг.4. Это согласуется с опубликованными данными о том, что уровни нуклеосом являются более высокими в сыворотке, чем в плазме (*Holdenrieder et al., 2001).

Для исследования уровней нуклеосом, которые обнаруживаются у здоровых субъектов, с использованием способов согласно настоящему изобретению авторы измеряли нуклеосомы, содержащие модифицированный нуклеотид 5-метилцитозин в образцах сыворотки 20 здоровых субъектов и здоровой бычьей сыворотки. Результаты в случае сыворотки были низкими или недектируемыми для всех 20 здоровых субъектов. Авторы также измеряли нуклеосомы, содержащие модифицированный нуклеотид 5-метилцитозин, в содержащих EDTA образцах плазмы, взятых у 20 здоровых субъектов, и неожиданно наблюдали более высокие сигналы. Высокие уровни внеклеточных нуклеосом, содержащих модифицированный нуклеотид 5-метилцитозин, детектировали способами согласно настоящему изобретению в содержащей EDTA плазме здорового человека, но меньшие уровни детектировали в сыворотке здорового человека, как представлено на фиг.8. На фиг.4-9 показано, что аналогичные результаты были получены и для других нуклеосомных структур. Данный факт является неожиданным и одновременно отличается от опубликованных результатов (*Holdenrieder et al., 2001) и результатов, обнаруженных авторами с использованием нуклеосомных методов ELISA известного уровня техники. Таким образом, способы согласно настоящему изобретению неожиданно приводят к противоположным результатам по сравнению со способами известного уровня техники для относительных уровней нуклеосом, которые присутствуют в образцах сыворотки и содержащей EDTA плазмы.

Авторы исследовали возможность детекции нуклеосомных структур во всем разнообразии обычных типов плазмы, которые могут быть собраны. Авторы обнаружили, что высокие уровни связанного с внеклеточными нуклеосомами 5-метилцитозина можно детектировать способом согласно настоящему изобретению в содержащей EDTA плазме и, в меньшей степени, в содержащей цитрат плазме, взятой у здоровых субъектов, но что связанный с нуклеосомами 5-метилцитозин присутствовал на низком или не пригодном для детекции уровне на фоне сигналов буфера или лошадиной сыворотки в большинстве (3 из 5) образцов содержащей гепарин плазмы, взятых у здоровых субъектов. Результаты представлены на фиг.15. Таким образом, обнаружено, что внеклеточные нуклеосомы присутствуют в относительно высоких концентрациях в большинстве или всех образцах содержащей EDTA плазмы и содержащей цитрат плазмы, взятых у здоровых субъектов, с использованием способа согласно настоящему изобретению, но присутствуют в низких концентрациях или отсутствуют в большинстве образцов содержащей гепарин плазмы или сыворотки, взятых у здоровых субъектов. Таким образом, оказывается очевидным, что точный выбор типа образца будет иметь определяющее значение для различных применений.

Авторы показали, что выбор образца для детекции внеклеточных нуклеосом, содержащих определенные нуклеотидные структуры, включает несколько параметров. Эти параметры включают уровни внеклеточных нуклеосом, которые, как правило, присутствуют в образцах сыворотки и содержащей гепарин плазмы, взятых у здоровых субъектов, причем повышенные уровни, как правило, присутствуют в образцах содержащей EDTA и цитрат плазмы, взятых у здоровых субъектов, причем рекомендуется, что образцы сыворотки, содержащие внеклеточные нуклеосомы, должны быть стабилизированы посредством добавления EDTA после отделения сыворотки от свернувшейся крови (*Holdenreider et al., 2001), и протокол получения образцов сыворотки. Можно также использовать и другие стабилизирующие вещества (например, ингибиторы протеазы). Насколько это возможно, авторы использовали образцы сыворотки, которые центрифугировали в течение одного часа после венепункции, и затем добавляли раствор 10 мМ EDTA, и образцы замораживали.

Выбор типа образца крови для клинических исследований необходимо осуществлять на основании оптимальной клинической разрешающей способности для определенного исследования. После детекции авторами достаточно низких уровней нуклеосом способом согласно настоящему изобретению в сыворотке здоровых субъектов авторы измеряли нуклеосомы, содержащие нуклеотид 5-метилцитозин, в образцах сыворотки, взятых у субъектов, страдающих раком. Наблюдаемый уровень клинической чувствительности составлял вплоть до 100%, как представлено на фиг.16, для образцов рака ободочной кишки.

Авторы также измеряли относительные уровни внеклеточных нуклеосом, содержащих нуклеотиды (5-метилцитозин и 5-гидроксиметилцитозин) и другие нуклеосомные структуры в образцах содержащей EDTA плазмы, взятых у субъектов, страдающих разнообразными заболеваниями. Уровни внеклеточных нуклеосом являются высокими в образцах содержащей EDTA плазмы, взятых у здоровых субъектов и больных субъектов, и, таким образом, оказывается маловероятным, что выбор содержащих EDTA образцов представляет собой наилучший выбор образца для чувствительного различия больных и здоровых субъектов. Однако авторы показали, что уровни и состав циркулирующих внеклеточных нуклеосом, в отношении относительных уровни нуклеосом, содержащих различные нуклеотиды (а также другие нуклеосомные структуры), различаются между больными и здоровыми субъектами, а также между различными заболеваниями. Таким образом, авторы впервые сообщили, что (i) высокие уровни циркулирующих нуклеосом присутствуют во всех или большинстве содержащих EDTA образцов плазмы, взятых у здоровых и больных субъектов, но это не является верным для всех типов образцов крови; а также, неожиданно, что (ii) детекцию заболевания и идентификацию типа заболевания можно, тем не менее, осуществлять посредством анализа этих нуклеосом в содержащей EDTA плазме на основании уровней и структурного профиля одного или нескольких относительных типов нуклеосомных структур, которые присутствуют в плазме больных и здоровых субъектов.

Авторы измеряли внеклеточные нуклеосомы в содержащей EDTA плазме, взятой у здоровых субъектов и 117 субъектов, страдающих разнообразными типами рака в двух повторах с участием 55 и 62 страдающих раком субъектов, соответственно. В итоге, 78% (91 из 117) раковых образцов правильно идентифицировали как положительные в отношении рака с использованием способа согласно настоящему изобретению для связанного с нуклеосомами 5-метилцитозина, используя в качестве уровня отсечки средний результат для здоровых субъектов плюс удвоенное среднеквадратическое отклонение от среднего значения.

В первом из этих двух экспериментов авторы измеряли внеклеточные нуклеосомы в содержащей EDTA плазме, взятой у 13 здоровых субъектов и 55 субъектов, страдающих раком желудка, толстой кишки, прямой кишки, легкого (мелкоклеточная карцинома и разнообразные немелкоклеточные карциномы), молочной железы, яичника, поджелудочной железы, предстательной железы, почки и различных органов полости рта (полость рта, небо, глотка и гортань). Все из 13 образцов, взятых у здоровых субъектов и страдающих раком пациентов, оказались положительными в отношении нуклеосом. Однако уровни, детектированные в образцах, взятых у страдающих раком субъектов, оказались выше, чем было обнаружено в образцах, взятых у здоровых субъектов, и результаты продемонстрировали, что можно различать здоровых и страдающих раком субъектов. Например, нормальный интервал оптической плотности, вычисленный как среднее значение плюс/минус удвоенное среднеквадратическое отклонение от среднего значения, в отношении связанного с нуклеосомами 5-метилцитозина составлял 0-1,41. При использовании данного уровня отсечки все 13 здоровых образцов оказались отрицательными, и 30 из 55 раковых образцов оказались положительными (итоговая клиническая чувствительность составляла 55%), включая 38% (3 из 8) в отношении рака желудка, 60% (3 из 5) в отношении рака толстой кишки, 33% (1 из 3) в отношении рака прямой кишки, 33% (2 из 6) в отношении мелкоклеточного рака легкого, 64% (9 из 14) в отношении немелкоклеточного рака легкого, 33% (2 из 6) в отношении рака молочной железы, 100% (1 из 1) в отношении рака яичника, 100% (1 из 1) в отношении рака поджелудочной железы, 33% (2 из 6) в отношении рака предстательной железы, 100% (1 из 1) в отношении рака почки и 60% (3 из 5) в отношении рака полости рта. Результаты представлены на фиг.17.

Аналогичным образом, нормальный интервал в отношении анализа связанного с нуклеосомами H2AZ составлял 0-0,95. При использовании данного уровня отсечки, составляющего 0,95, все 13 здоровых субъектов оказались отрицательными в отношении повышенных уровней нуклеосом H2AZ. С другой стороны, положительный результат в отношении повышенных уровней нуклеосом H2AZ был обнаружен для 84% (46 из 55) раковых образцов (итоговая клиническая чувствительность составляла 84%), включая 100% (8 из 8) в отношении рака желудка, 100% (5 из 5) в отношении рака толстой кишки, 67% (2 из 3) в отношении рака прямой кишки, 83% (5 из 6) в отношении мелкоклеточного рака легкого, 79% (11 из 14) в отношении немелкоклеточного рака легкого, 50% (3 из 6) в отношении рака молочной железы, 100% (1 из 1) в отношении рака яичника, 100% (1 из 1) в отношении рака поджелудочной железы, 80% (4 из 5) в отношении рака предстательной железы, 100% (1 из 1) в отношении рака почки и 100% (5 из 5) в отношении рака полости рта.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, предложен контрольный образец, и определен уровень отсечки для анализа в целях различия между положительными и отрицательными результатами по отношению к результату для контрольного образца. Это может быть любая пропорция, которая равна или находится выше или ниже уровня результата для контрольного образца. Результаты у пациентов ниже данного уровня рассматриваются как отрицательные, и результаты у пациентов выше данного уровня рассматриваются как положительные. Может существовать также «область неопределенности», соответствующая интервалу результатов пациентов, которые являются очень близкими к уровню отсечки, и для которых решение рассматривается как неопределенное, и/или требуется повтор исследований.

Аналогичным образом, для анализа связанного с нуклеосомами mH2A1.1 нормальный интервал составлял 0-0,91. При использовании данного уровня отсечки все 13 здоровых образцов оказались отрицательными, и 64% (35 из 55) раковых образцов оказались положительными. Для анализа связанного с нуклеосомами P-H2AX (Ser139) нормальный интервал составлял 0-1,08. При использовании данного уровня отсечки все 13 здоровых образцов оказались отрицательными и 60% (33 из 55) раковых образцов оказались положительными. Таким образом, некоторые нуклеосомные анализы проявляют более высокую клиническую чувствительность, чем другие.

Кроме того, можно использовать картину нуклеосомных структур для повышения клинической применимости настоящего изобретения. Это можно осуществлять, например, посредством снижения уровня отсечки при анализе связанного с нуклеосомами 5-метилцитозина до среднего значения плюс среднеквадратическое отклонение от среднего значения, что дает интервал до 1,01. В данном случае, число ложноотрицательных результатов уменьшается до 4, обеспечивая повышенную клиническую чувствительность, составляющую 93% (51 из 55) за счет увеличения ложноположительных результатов для образцов, взятых у здоровых субъектов, 0%-23% (3 из 13). Результаты представлены на фиг.17.

Образцы, оказавшиеся положительными для связанных с 5-метилцитозином нуклеосомами или любыми нуклеосомами, можно исследовать в отношении нуклеосомного структурного профиля. Нуклеосомный профиль можно использовать для различия между здоровыми и больными субъектами, как проиллюстрировано на фиг.20 и 21, где относительные пропорции разнообразных нуклеосомных структур у больных пациентов представлены по сравнению с пропорциями, обнаруженными у здоровых субъектов и пациентов, страдающих другими нераковыми заболеваниями. Это показывает, что исследование многочисленных нуклеосомных структур в исследуемой группе может способствовать повышению клинической разрешающей способности.

Аналогичным образом, диагностическую специфичность и/или чувствительность настоящего изобретения можно увеличивать путем объединения данных от более чем одного исследования в форме соотношений. Например, использование соотношения связанных с нуклеосомами P-H2AX и 5-метилцитозина увеличивает детекцию действительно положительных случаев рака от 55% (30 из 55) при использовании только связанного с нуклеосомами 5-метилцитозина до 67% (37 из 55) при уровне отсечки, составляющем среднее значение плюс удвоенное среднеквадратическое отклонение от среднего значения, сохраняя при этом 100% (13 из 13) отрицательных результатов для образцов, взятых у здоровых субъектов.

Авторы измеряли уровни циркулирующих внеклеточных нуклеосом, содержащих два различных нуклеотида, в образцах содержащей EDTA плазмы, взятых у трех пациентов, страдающих раком ободочной кишки, 13 пациентов, страдающих раком легкого, двух пациентов, страдающих раком поджелудочной железы, и одного пациента, страдающего раком полости рта, и сравнивали их с уровнями, присутствующими в образцах крови, взятых у 20 здоровых субъектов, а также с искусственно полученным препаратом сыворотки нуклеосом от здоровых субъектов, согласно описанию в литературе (*Holdenreider et al., 2001). Авторы также представляли наблюдаемые уровни в нормированной форме как соотношения уровня нуклеосом, содержащих один определенный нуклеотид, и показали, что такие соотношения или картины соотношений можно использовать в общей диагностике рака и в дифференциальной диагностике специфических типов рака. Авторы также исследовали, изменяется ли уровень связанного с нуклеосомами 5-метилцитозина при прогрессировании заболевания. Авторы наблюдали, что средний уровень внеклеточных нуклеосом, содержащих 5-метилцитозин, увеличивается со степенью тяжести заболевания и возрастает при увеличении распространения заболевания в лимфатические узлы. Это обеспечивает доказательство того, что детектированные нуклеосомы связаны с опухолью.

Авторы также измеряли нуклеосомы, присутствующие в этих 19 раковых образцах, используя два нуклеосомных метода ELISA известного уровня техники. Среди 19 страдающих раком субъектов, которые принимали участие в исследовании, у большинства обнаружены низкие уровни нуклеосом в содержащей EDTA плазме, согласно определению методами нуклеосомного ELISA 1 и 2 известного уровня техники. Данный результат иллюстрирует одну причину, по которой анализы известного уровня техники не используются для обычных клинических целей.

Авторы использовали методы ELISA согласно настоящему изобретению для измерения нуклеосом, содержащих нуклеотиды 5-метилцитозина и 5-гидроксиметилцитозина в тех же 19 образцах. Высокие уровни нуклеосом, содержащих 5-метилцитозин, неожиданно были детектированы во всех 19 образцах. Таким образом, согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, предложен новый способ нуклеосомного ELISA, который дает возможность детекции нуклеосомы, не детектируемые нуклеосомными анализами известного уровня техники.

Авторы также измеряли уровни нуклеосом, содержащих три различных гистоновых варианта и гистоновую ПТМ в тех же 19 образцах, взятых у страдающих раком субъектов, а также образец нуклеосом, полученный у здоровых субъектов способом, описанным в литературе (*Holdenrieder et al., 2001). Авторы использовали эти измерения вместе с измерениями связанных с нуклеосомами нуклеотидов, которые описаны в настоящем описании, в качестве группы разнообразных внеклеточных нуклеосом, присутствующих в биологических жидкостях, взятых у субъектов, страдающих раком четырех различных типов, и с измерениями нуклеосом, взятых у здоровых субъектов. Неожиданно картина нуклеосом, обнаруженных в случаях рака четырех исследованных типов (рак легкого, ободочной кишки, поджелудочной железы и полости рта), полностью отличалась от картины нуклеосом, обнаруженных в образце, полученном у здоровых субъектов. Кроме того, различные типы рака также отличались друг от друга, как показывает картина внеклеточных нуклеосом, детектируемых в крови субъектов. Таким образом, согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, предложен способ детекции или диагностики присутствия, типа, рецидива или степени тяжести заболевания или оценки оптимального лекарственного средства или других способов лечения посредством исследования образца в отношении группы различных нуклеосомных эпитопов, которую составляют два или более измерений нуклеосом, содержащих различные основания ДНК или комбинацию одного или нескольких оснований ДНК и одного или нескольких гистоновых вариантов, и/или одной или нескольких гистоновых модификаций, и/или измерения нуклеосом в чистом виде, или любую комбинацию или соотношение любых из данных вариантов, в качестве показателя состояния здоровья или заболевания субъекта.

Аналогичным образом, авторы использовали методы ELISA согласно настоящему изобретению для детекции изменчивости нуклеотидных и гистоновых структур циркулирующих внеклеточных нуклеосом в случаях разнообразных раковых и нераковых заболеваний и сравнивали эти результаты со структурой нуклеосом, обнаруженных у здоровых субъектов. Обнаружено, что нуклеосомы присутствуют во всех исследованных случаях раковых и нераковых заболеваний, и обнаружено, что они имеют профили, которые отличались от профилей здоровых субъектов.

Авторы исследовали содержащие EDTA образцы плазмы, взятые у двух страдающих кардиомиопатией пациентов, 10 страдающих системной красной волчанкой пациентов, 12 страдающих язвенным колитом пациентов, 10 страдающих хроническим обструктивным заболеванием легких (ХОЗЛ) пациентов, 8 страдающих болезнью Крона пациентов и 10 страдающих ревматоидным артритом (РА) пациентов, нормировали обнаруженные уровни разнообразных нуклеосомных структур в пропорции к средним уровням связанного с нуклеосомами 5-метилцитозина и представляли данные результаты в сравнении с результатами, обнаруженными у 11 здоровых субъектов. Авторы обнаружили, что заболевания были связаны с нуклеосомными структурными профилями, которые отличались от профилей здоровых или страдающих раком субъектов. Таким образом, нуклеосомные структурные профили можно использовать в качестве диагностического средства для детекции, прогностического предсказания, наблюдения и предсказания терапевтической эффективности широкого разнообразия нераковых заболеваний. Результаты представлены на фиг.21.

Авторы также исследовали изменчивость структуры внеклеточных нуклеосом в отношении нуклеотидов и типов гистонов, детектированных с использованием методов ELISA согласно настоящему изобретению в содержащих EDTA образцах плазмы, взятых у 55 пациентов, страдающих десятью различными раковыми заболеваниями. Обнаруженные уровни разнообразных нуклеосомных структур нормировали в форме пропорции уровней связанной с нуклеосомами 5-метилцитозин метилированной (5mc) ДНК и представляли по отношению к средним пропорциям, обнаруженным у 11 здоровых субъектов. Авторы обнаружили нуклеосомы, присутствующие у всех субъектов, и нуклеосомные структурные профили, которые различались у пациентов, страдающих раковыми заболеваниями и нераковыми заболеваниями, и здоровых субъектов. Таким образом, нуклеосомные структурные профили можно использовать в качестве диагностического средства для детекции, прогностического предсказания, наблюдения и предсказания терапевтической эффективности в случае раковых и других заболеваний. Результаты представлены на фиг.20 и 21.

Поскольку, согласно сообщениям, основная масса циркулирующей ДНК в сыворотке или плазме существует в форме мононуклеосом и олигоуклеосом (Holdenrieder et al., 2001), для специалистов в данной области будет очевидным, что способы согласно настоящему изобретению можно также использовать для детекции или измерения внеклеточной метилированной ДНК в чистом виде (в форме связанной с нуклеосомами ДНК, содержащей, например, 5-метилцитозин или 5-гидроксиметилцитозин) непосредственно в биологических жидкостях, включая кровь, сыворотку и плазму. Таким образом, используемые способы согласно настоящему изобретению обладают преимуществами простоты и скорости по сравнению со способами измерения метилированной ДНК известного уровня техники, в частности, поскольку не осуществляется и не требуется экстракция ДНК.

Кроме того, понятно, что способ согласно настоящему изобретению можно использовать для детекции или измерения любой нуклеиновой кислоты или основания ДНК или аналога или производного нуклеиновой кислоты в нуклеосомах. Такие основания включают, но без ограничения, аденин, тимин, гуанин, цитозин, урацил, инозин, ксантин, гипоксантин, 7,8-дигидро-8-оксо-гуанин и любые соответствующие производные или аналоги. Для специалистов в данной области будет очевидным, что обычный нуклеотид (например, но без ограничения, гуанин, цитозин, тимин или аденин) присутствует во всех или большинстве из нуклеосом, и что способ согласно настоящему изобретению с использованием антитела к обычному нуклеотиду представляет собой способ связывания и детекции практически всех нуклеосом в образце. Таким образом, согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, предложен новый способ детекции нуклеосом в чистом виде, в котором нуклеосомы, содержащие обычный нуклеотид, измеряют таким путем, который обеспечивает детекцию всех или большинства нуклеосом.

Согласно следующему варианту осуществления, настоящее изобретение относится к новому способу детекции всех связанных с нуклеосомами ДНК, в котором измеряют нуклеосомы, содержащие обычный нуклеотид, в качестве способа, обеспечивающего детекцию всей или основной массы связанной с нуклеосомами ДНК. Кроме того, измерение двух или более оснований ДНК представляет собой основу для измерения соотношений относительного содержания в ДНК данных оснований ДНК. Авторы проиллюстрировали такие соотношения для относительных уровней 5-метилцитозина и 5-гидроксиметилцитозина в образцах на фиг.10-14. Данные авторов показывают, что детектируемые относительные уровни 5-метилцитозина и 5-гидроксиметилцитозина различаются для различных типов рака и могут быть использованы для различия таких типов рака. Другие аналогичные соотношения также можно использовать в данной области. Например, при использовании настоящего изобретения для определения соответствующего основания (или оснований) ДНК в качестве меры суммарного содержания связанной с нуклеосомами ДНК и определения относительного уровня еще одного основания (например, 5-метилцитозина) становится понятным, что способ согласно настоящему изобретению можно использовать для определения пропорции ДНК, которая включает любое определенное основание (например, процентную долю ДНК, которая является метилированной в образце). Таким образом, способы согласно настоящему изобретению представляют собой простой и быстрый путь измерения процентного содержания любого основания ДНК в образце. Данный способ можно использовать быстро и просто, чтобы исследовать многочисленные образцы, например, образцы крови. Способы согласно настоящему изобретению можно использовать для детекции и измерения оснований ДНК в нуклеосомах в любом образце, где присутствуют такие нуклеосомы, включая, например, образцы, полученные путем гидролиза хроматина, экстрагированного из клеток. Для специалистов в данной области будет очевидным, что используемый в настоящем описании термин «нуклеотид» означает, но без ограничения, пурины, пиримидины или любые другие основания, которые содержат нуклеиновые кислоты, а также аналогичные молекулы, в том числе имеющие или нет присоединенные сахара, фосфорилированные или нет, и включающие любые соответствующие аналоги, производные или имитаторы.

Авторы делают вывод, что способ согласно настоящему изобретению представляет собой успешный способ детекции и измерения связанной с нуклеосомами ДНК, содержащей определенные нуклеотиды, что данный способ можно также успешно применять в качестве способа детекции нуклеосом в чистом виде, и что он представляет собой превосходный способ детекции нуклеосом в чистом виде по сравнению со способами известного уровня техники, и что данный способ можно также успешно использовать как способ непосредственной детекции внеклеточного ДНК в чистом виде и определения нуклеотидного состава внеклеточной ДНК в чистом виде, и что он представляет собой превосходный способ детекции связанной с нуклеосомами ДНК и ее нуклеотидного состава по сравнению со способами известного уровня техники. Данный способ является быстрым, дешевым и подходящим для применения в сложных биологических средах и жидкостях. Авторы продемонстрировали, что способ согласно настоящему изобретению можно применять для детекции в крови нуклеосом, а также нуклеосом, содержащих метилированную ДНК, и что его можно использовать в качестве биомаркера для рака. Для специалистов в данной области будет очевидным, что биомаркер, который присутствует в образцах крови, взятых у страдающих раком пациентов, является полезным для широкого круга целей диагностики заболеваний и массового обследования для детекции рака и других заболеваний, которые связаны с повышенным уровнем циркулирующих нуклеосом (Holdenrieder et al., 2001).

Для подтверждения того, что повышенные уровни нуклеосом не обнаруживаются у здоровых субъектов при применении способов согласно настоящему изобретению, авторы измеряли нуклеосомы, содержащие нуклеотиды 5-метилцитозин и 5-гидроксиметилцитозин, в образцах сыворотки 20 здоровых субъектов и в здоровой бычьей сыворотке. Результаты детекции циркулирующих нуклеосом в сыворотка при исследованиях двумя методами ELISA согласно настоящему изобретению оказались низкими, или их невозможно было детектировать у всех 20 здоровых субъектов. Авторы также проводили аналогичные исследования в образцах плазмы, взятых у тех же 20 здоровых субъектов, и неожиданно наблюдали повышенные сигналы. Данный результат является неожиданным и значительно отличающимся от результатов, которые авторы обнаружили в отношении нуклеосом, используя методы ELISA известного уровня техники.

Настоящее изобретение было проверено в отношении многочисленных раковых и нераковых заболеваний, и оно оказалось эффективным для детекции всех исследованных заболеваний. Это включает детекцию случаев рака предстательной железы, который не обнаруживается посредством нуклеосомных исследований методом ELISA известного уровня техники (Holdenrieder, 2001). Очевидно, что настоящее изобретение является эффективным для детекции всех или большинства типов рака. Для специалистов в данной области будет очевидным, что клиническую эффективность согласно настоящему изобретению можно дополнительно повышать посредством включения дополнительных исследований нуклеосомных структур и посредством исследования соотношений различных присутствующих нуклеосомных структур.

Согласно одному аспекту настоящего изобретения, предложен способ двойных антител, иммунометрического или многослойного иммунологического анализа детекции и измерения внеклеточных нуклеосом, содержащих нуклеотиды в образце. Один вариант осуществления данного аспекта представляет собой иммунологический анализ, который включает следующие стадии:

(i) контакт образца, в котором могут содержаться нуклеосомы, с первым антителом или другим связующим веществом, которое связывается с нуклеосомами;

(ii) контакт нуклеосом или образца со вторым антителом или другим связующим веществом, которое связывается с нуклеотидом;

(iii) детекцию и/или количественное определение связывания указанного второго антитела или другого связующего вещества с нуклеотидом в образце; и

(iv) использование присутствия или степени такого связывания в качестве меры присутствия связанного с нуклеосомами нуклеотида в образце.

Согласно второму варианту осуществления, настоящее изобретение относится к способу детекции и измерения в образце внеклеточных нуклеосом, содержащих нуклеотиды, посредством иммунометрического иммунологического анализа, включающему следующие стадии:

(i) контакт образца, в котором могут содержаться нуклеосомы, с первым антителом или другим связующим веществом, которое связывается с нуклеотидом;

(ii) контакт нуклеосом или образца со вторым антителом или другим связующим веществом, которое связывается с нуклеосомами;

(iii) детекцию и/или количественное определение связывания указанного второго антитела или другого связующего вещества с нуклеосомами в образце; и

(iv) использование присутствия или степени такого связывания в качестве меры присутствия связанного с нуклеосомами нуклеотида в образце.

Согласно настоящему изобретению, разнообразные антитела или другие связующие вещества можно использовать в качестве связующего вещества, которое связывается с нуклеосомами. Эти вещества включают связующие вещества, предназначенные для связывания с эпитопами, которые присутствуют в неизмененных нуклеосомах и отсутствуют в свободных гистонах (например, эпитоп находится на соединении между двумя гистонами в нуклеосоме), а также связующие вещества, связывающиеся с каким-либо нуклеосомным компонентом, включая обычный нуклеосомный белок, гистон или эпитопы нуклеиновой кислоты.

Для специалистов в данной области будет очевидным, что описанные способы согласно настоящему изобретению включают разнообразные варианты осуществления, включающие анализы биосенсорного типа и безиндикаторные анализы таких типов, которые продает, например, компания ForteBio Incorporated (США). В иммунометрических иммунологических анализах используется антитело (или другое связующее вещество) для связывания с анализируемым веществом. Связанное таким способом анализируемое вещество детектируется в качестве непосредственной меры его уровня или концентрации в исходном исследуемом образце. Напротив, в «конкурентных» иммунологических анализах часто используется значительно меньшее количество антитела (или другого связующего вещества) для связывания доли препарата анализируемого вещества и меченого анализируемого вещества (или аналога анализируемого вещества), которое используют для распределения между фракциями связанного и свободного анализируемого вещества (с образцом анализируемого вещества). Количество связанного меченого анализируемого вещества измеряют в качестве косвенной меры концентрации анализируемого вещества в исходном образце. Согласно варианту схемы «конкурентного» иммунологического анализа, используют меченое антитело, вместе с препаратом твердофазного анализируемого вещества (или аналога анализируемого вещества). Связанное меченое антитело распределяется между образцом анализируемого вещества и твердофазным анализируемым веществом (или аналогом анализируемого вещества). Количество антитела, которое связывается с препаратом твердофазного анализируемого вещества (или аналога анализируемого вещества), используют в качестве косвенной меры концентрации анализируемого вещества в образце.

Согласно третьему варианту осуществления, настоящее изобретение относится к способу детекции и измерения в образце нуклеотида, включая связанный с нуклеосомами нуклеотид, посредством безиндикаторного иммунометрического иммунологического анализа, включающему следующие стадии:

(i) контакт образца с антителом или другим связующим веществом, которое связывается с нуклеотидом;

(ii) детекцию и/или количественное определение связывания указанного антитела или другого связующего вещества с нуклеотидом в образце; и

(iii) использование присутствия или степени такого связывания в качестве меры присутствия нуклеотида в образце.

Согласно четвертому варианту осуществления, настоящее изобретение относится к способу детекции и измерения в образце нуклеотида, включая связанный с нуклеосомами нуклеотид, посредством конкурентного иммунологического анализа, включающему следующие стадии:

(i) контакт образца с антителом или другим связующим веществом, которое связывается с нуклеотидом;

(ii) детекцию и/или количественное определение связывания указанного антитела или другого связующего вещества с нуклеотидом в образце; и

(iii) использование присутствия или степени такого связывания в качестве меры присутствия нуклеотида в образце.

Для специалистов в данной области будет очевидным, что этими способами иммунологического анализа согласно настоящему изобретению непосредственно измеряют нуклеотиды и связанные с нуклеосомами нуклеотиды без какой-либо необходимости экстракции ДНК. Напротив, способами иммунологического анализа нуклеотидов согласно известному уровню техники определяют (не связанные с нуклеосомами) нуклеотиды после экстракции ДНК из образца. Способы согласно настоящему изобретению обладают преимуществами скорости, простоты и пригодности для непосредственных измерений сложных биологических образцов, включая кровь или ее производные.

Согласно пятому варианту осуществления, настоящее изобретение относится к способу детекции в образце пропорции внеклеточной ДНК, в которой содержится определенный нуклеотид, включающему следующие стадии:

(i) детекцию или измерение уровня внеклеточной ДНК в образце;

(ii) детекцию или измерение уровня связанного с нуклеосомами нуклеотида способом согласно настоящему изобретению; и

(iii) использование двух измерений для определения пропорции ДНК, которая включает нуклеотид.

Согласно одному варианту осуществления данного аспекта настоящего изобретения, уровень внеклеточной ДНК в образце и исследуемого нуклеотида измеряют с использованием способа согласно настоящему изобретению. Согласно еще одному варианту осуществления, исследуемый нуклеотид представляет собой метилированный цитозиновый нуклеотид, и пропорция ДНК, которая включает нуклеотид, представляет собой меру глобального метилирования ДНК.

Авторы показали, что детекцию и измерение нуклеосом, содержащих нуклеотиды, в крови, взятой у субъектов, можно использовать в качестве диагностического способа для определения субъектов, страдающих раком и для отличия их от здоровых субъектов. Кроме того, авторы показали, что картины нуклеосом, содержащих группа различных нуклеотидов, гистоновых вариантов и гистоновых ПТМ, можно использовать для установления отличия между различными типами рака. Для специалистов в данной области будет очевидным, что это обеспечивает исследование крови в отношении рака, которое обнаруживает рак у субъектов, и которое можно использовать для различия между типами рака у имеющих положительный диагноз рака субъектов. Согласно следующему аспекту настоящего изобретения, предложен способ детекции или диагностики присутствия заболевания посредством измерения или детекции присутствия и/или уровня или концентрации внеклеточных нуклеосом, содержащих нуклеотид, в биологической жидкости, и использования детектированного уровня в качестве биомаркера состояния заболевания субъекта, включая, но без ограничения, клиническую диагностику заболевания, дифференциальную диагностику типа или подтипа заболевания, или прогноз заболевания, или рецидив заболевания, или диагностику чувствительности субъекта к схеме лечения. Специалистам в данной области будет понятно, что биологические жидкости, используемые для диагностических исследований, включают, но без ограничения, кровь, сыворотку, плазму, мочу, спинномозговую жидкость и другие жидкости. Согласно предпочтительному варианту осуществления, биологическая жидкость, выбранная в качестве образца, представляет собой кровь, сыворотку или плазму. Уровень аналитического сигнала, концентрации или количества связанного с нуклеосомами нуклеотида в биологической жидкости можно выражать в абсолютных значениях или в относительных значениях, например, но без ограничения, как долю суммарного присутствующего уровня нуклеосом, или как отношение к уровню нуклеосом, содержащих еще один нуклеотид или гистоновый вариант или гистоновую ПТМ, или к суммарному уровню ДНК.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, связанный с нуклеосомами нуклеотид измерение используют в качестве элемента диагностической группы исследований или измерений для детекции или диагностики состояния заболевания субъекта, включая, но без ограничения, клиническую диагностику заболевания, дифференциальную диагностику типа или подтипа заболевания, или прогноз заболевания, или рецидив заболевания, или диагностику чувствительности субъекта к схеме лечения

Поскольку, согласно сообщениям, вся или основная масса циркулирующей внеклеточной ДНК существует в форме связанной с нуклеосомами ДНК, для специалистов в данной области будет очевидным, что диагностику или детекцию состояния заболевания можно осуществлять посредством детекции или измерения нуклеотидов в чистом виде с использованием прямого иммунологического анализа нуклеотидов согласно настоящему изобретению, не осуществляя стадию экстракции ДНК из биологической жидкости, альтернативно или дополнительно к иммунологическому анализу в отношении связанных с нуклеосомами нуклеотидов. Согласно следующему аспекту настоящего изобретения, предложены неэкстракционный способ иммунологического анализа нуклеотидов для детекции или диагностики присутствия заболевания посредством измерения или детекции присутствия и/или уровня или концентрации нуклеотида в биологической жидкости, и использование детектированного уровня в качестве биомаркера (или индивидуально в качестве элемента исследуемой группы) состояния заболевания субъекта, включая, но без ограничения, клиническую диагностику заболевания, дифференциальную диагностику типа или подтипа заболевания, или прогноз заболевания, или рецидив заболевания, или диагностику чувствительности субъекта к схеме лечения. Специалистам в данной области будет понятно, что биологические жидкости, используемые для диагностических исследований, включают, но без ограничения, кровь, сыворотку, плазму, мочу, спинномозговую жидкость и другие жидкости. Согласно предпочтительному варианту осуществления, биологическая жидкость, выбранная в качестве образца, представляет собой кровь, сыворотку или плазму. Уровень аналитического сигнала, концентрации или количества нуклеотида в биологической жидкости можно выражать в абсолютных значениях или в относительных значениях, например, но без ограничения, как долю от присутствующего суммарного уровня нуклеосом или как отношение к уровню еще одного нуклеотида или гистонового варианта или гистоновой ПТМ, или к суммарному уровню ДНК.

Согласно следующему аспекту, настоящее изобретение относится к способу детекции или измерения в клетке присутствия и/или уровня нуклеосом, содержащих нуклеотид, включающему следующие стадии:

(i) выделение хроматина из клетки;

(ii) разрушение хроматина с образованием мононуклеосом и/или олигонуклеосом; и

(iii) детекцию или измерение присутствия нуклеотида в мононуклеосомах и/или олигоуклеосомах с использованием способа иммунологического анализа согласно настоящему изобретению.

Способы получения мононуклеосом и/или олигоуклеосом из хроматина хорошо известны в данной области и включают ферментативный гидролиз и ультразвуковую обработку (Dai et al., 2011). Согласно одному варианту осуществления, нуклеотид, выбранный для детекции данным способом, представляет собой обычный распространенный нуклеотид, который встречается во всех или большинстве неизмененных нуклеосом, обеспечивая, таким образом, способ детекции или измерения нуклеосом в чистом виде. Согласно еще одному варианту осуществления, нуклеотид, выбранный для детекции данным способом, представляет собой обычный распространенный нуклеотид, который встречается во всех или большинстве неизмененных нуклеосом, обеспечивая, таким образом, способ детекции или измерения связанной с нуклеосомами ДНК.

Специалистам в данной области будет понятно, что описанный способ детекции связанных с нуклеосомами нуклеотидов в клетках или тканях обладает преимуществами по сравнению с используемым до настоящего времени способами, включая иммуногистохимию (ИГХ) или детекцию нуклеотидов в ДНК, экстрагированной из клеток, рестрикционное картирование и анализ ближайшего окружения, флуоресцентный анализ с использованием хлорацетальдегида, обратное определение путем метилирования всех островков CpG с использованием ДНК-метилтрансферазы в сочетании с меченным тритием S-аденозилметионином для вычисления количества неметилированного CpG и гидролиз ДНК на отдельные нуклеотиды для анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, тонкослойной хроматографии или жидкостной хроматографии с последующей масс-спектрометрией. Уровень, концентрацию или количество определенного связанного с нуклеосомами нуклеотида можно выражать в абсолютных значениях или в относительных значениях, например, как долю от присутствующего суммарного уровня нуклеосом или как отношение к суммарному уровню нуклеосом или к уровню нуклеосом, содержащих еще один нуклеотид или гистоновый вариант или гистоновую ПТМ, или к суммарному уровню ДНК.

Для специалистов в данной области будет очевидным, что термины «антитело», «связующее вещество» или «лиганд» по отношению к любому аспекту настоящего изобретения не являются ограничивающими, но используются для обозначения любого связующего вещества, способного связываться со специфическими молекулами или частицами, и что любое подходящее связующее вещество можно использовать в способе согласно настоящему изобретению. Кроме того, является очевидным, что термин «нуклеосомы» используется для обозначения мононуклеосом и олигонуклеосом, а также любых таких хроматиновых фрагментов, которые можно анализировать в жидкой среде.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения, предложен набор для детекции или измерения нуклеосом, который включает специфический лиганд или связующее вещество для нуклеотида или его составляющей части, или имитатор структуры/формы нуклеосомы или ее составляющей части, вместе с инструкциями для применения набора в соответствии с любым из способов, определенных в настоящем описании.

Согласно следующему аспекту, настоящее изобретение относится к набору для детекции или измерения нуклеосом, содержащих нуклеотид, который включает специфический лиганд или связующее вещество для нуклеотида или его составляющей части, или имитатор структуры/формы нуклеотида или его составляющей части, вместе с инструкциями для применения набора в соответствии с любым из способов, определенных в настоящем описании.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения, предложен способ идентификации связанного с нуклеосомами нуклеотидного биомаркера или нуклеотидного биомаркера для детекции или диагностики состояния заболевания животного или человека, включающий следующие стадии:

(i) детекцию или измерение уровня внеклеточных нуклеосом, содержащих нуклеотид, в биологической жидкости больных субъектов;

(ii) детекцию или измерение уровня внеклеточных нуклеосом, содержащих нуклеотид, в биологической жидкости контрольных субъектов; и

(iii) использование разности между уровнями, детектированными у больных и контрольных субъектов, для установления возможности использования нуклеотида в качестве биомаркера в отношении данного заболевания.

Для специалистов в данной области будет очевидным, что контрольных субъектов можно выбирать на различной основе, которая может включать, например, субъектов с заведомым отсутствием заболевания, или можно выбирать субъектов, страдающих различными заболеваниями (например, для исследования дифференциальной диагностики).

Согласно следующему аспекту настоящего изобретения, предложен способ идентификации связанного с нуклеосомами нуклеотидного биомаркера или нуклеотидного биомаркера для оценки прогноза в отношении больного животного субъекта или человека, который включает следующие стадии:

(i) детекцию или измерение уровня внеклеточных нуклеосом, содержащих нуклеотид, в биологической жидкости больных субъектов; и

(ii) корреляцию уровня содержащих нуклеотид внеклеточных нуклеосом, детектированных в биологической жидкости больных субъектов, с исходом заболевания субъектов.

Согласно следующему аспекту настоящего изобретения, предложен способ идентификации нуклеотидного биомаркера для применения в выборе схемы лечения субъекта больного животного или человека, нуждающегося в лечении, включающий следующие стадии:

(i) детекцию или измерение уровня внеклеточных нуклеосом, содержащих нуклеотид, в биологической жидкости больных субъектов; и

(ii) корреляция уровня содержащих нуклеотид внеклеточных нуклеосом, детектированных в биологической жидкости больных субъектов, с наблюдаемой эффективностью схемы лечения данных субъектов.

Согласно следующему аспекту настоящего изобретения, предложен способ идентификации связанного с нуклеосомами нуклеотидного биомаркера или нуклеотидного биомаркера для применения в наблюдении лечения субъекта больного животного или человека, включающий следующие стадии:

(i) детекцию или измерение уровня внеклеточных нуклеосом, содержащих нуклеотид, в биологической жидкости больного субъекта;

(ii) повтор указанной выше детекции или измерения в один или несколько моментов времени в течение прогрессирующего заболевания субъекта; и

(iii) корреляцию уровня содержащих нуклеотид внеклеточных нуклеосом, детектированных в биологической жидкости больного субъекта, при прогрессировании заболевания субъекта.

Согласно следующему аспекту настоящего изобретения, предложен биомаркер, идентифицируемый способом, который определен в настоящем описании.

В данной области известно, что можно детектировать присутствие компонента, который составляет часть комплекса, содержащего другие частицы, с использованием способов иммунологического анализа. Для специалистов в данной области будет очевидным, что внеклеточные нуклеосомы, содержащие нуклеотид, можно детектировать в биологической жидкости, включая кровь, плазму, сыворотку и мочу, используя методику, включающую непосредственный иммунологический анализ самого нуклеотида в жидкости. Согласно данной методике, одностадийный иммунологический анализ с использованием одного антитела, соответствующего эпитопу, который присутствует на нуклеотиде, или двухстадийный иммунологический анализ с использованием двух антител, соответствующих двум эпитопам, которые присутствуют на нуклеотиде, используют для детекции присутствия нуклеотида в нуклеосоме. Таким образом, согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения, нуклеотид, содержащийся в нуклеосоме, детектируют непосредственно в биологической жидкости, включая кровь, плазму, сыворотку и мочу, путем использования способа иммунологического анализа в отношении нуклеотида.

Таким образом, согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, связанный с нуклеосомами нуклеотид детектируют непосредственно без предварительной экстракции из биологической жидкости, включая кровь, плазму, сыворотку и мочу, с использованием иммунологического анализа в отношении нуклеотида.

Согласно следующему аспекту настоящего изобретения, предложены лиганды или связующие вещества, такие как встречающиеся в природе или химически синтезируемые соединения, способные осуществлять специфическое связывание с биомаркером. Лиганд или связующее вещество согласно настоящему изобретению может включать пептид, антитело или его фрагмент, или синтетический лиганд, такой как пластичное антитело, или аптамер или олигонуклеотид, способный осуществлять специфическое связывание с биомаркером. Антитело может представлять собой моноклональное антитело или его фрагмент, способный осуществлять специфическое связывание с биомаркером. Лиганд согласно настоящему изобретению можно маркировать, используя детектируемый маркер, такой как люминесцентный, флуоресцентный, ферментативный или радиоактивный маркер; альтернативно или дополнительно, лиганд согласно настоящему изобретению можно маркировать, используя аффинный маркер, например, биотиновый, авидиновый, стрептавидиновый или гистидиновый (например, гексагистидиновый) маркер. Альтернативно, связывание лиганда можно определять с использованием безиндикаторной технологии, например, технологии компании ForteBio Inc.

Биосенсор согласно настоящему изобретению может включать биомаркер или соответствующий имитатор структуры/формы, способный осуществлять специфическое связывание с антителом, относящемся к биомаркеру. Кроме того, предложена матрица, включающая лиганд или имитатор, который описан в настоящем описании.

Кроме того, согласно настоящему изобретению, предложено применение одного или нескольких лигандов, как описано в настоящем описании, и которые могут представлять собой встречающиеся в природе или химически синтезируемые соединения, и они предпочтительно представляют собой пептид, антитело или его фрагмент, аптамер или олигонуклеотид, или использование биосенсора согласно настоящему изобретению, или матрицы согласно настоящему изобретению, или набора согласно настоящему изобретению для детекции и/или количественного определения биомаркера. Для этих целей детекцию и/или количественное определение можно осуществлять, используя биологический образец, как определено в настоящем описании.

Предложены наборы для диагностики или наблюдения, для осуществления способов согласно настоящему изобретению. Такие наборы предпочтительно включают лиганд согласно настоящему изобретению для детекции и/или количественного определения биомаркера, и/или биосенсора, и/или матрицы, как описано в настоящем описании, необязательно вместе с инструкциями для применения данного набора.

Следующий аспект настоящего изобретения представляет собой набор для детекции присутствия состояния заболевания, включающий биосенсор, способный осуществлять детекцию и/или количественное определение одного или нескольких биомаркеров, как определено в настоящем описании.

Биомаркеры для детекции присутствия заболевания представляют собой важные мишени для открытия новых мишеней и молекул лекарственных средств, которые замедляют или останавливают прогрессирующее заболевание. Поскольку уровень биомаркера представляет собой показатель заболевания и эффективности лекарственного средства, биомаркер можно использовать для идентификации новых применяемых в терапии соединений, осуществляя анализы in vitro и/или in vivo. Биомаркеры согласно настоящему изобретению можно использовать в способах обследования в отношении соединений, которые модулируют активность биомаркера.

Таким образом, согласно следующему аспекту настоящего изобретения, предложено применение связующих веществ или лигандов, описанных выше, которые могут представлять собой пептид, антитело или его фрагмент, или аптамер, или олигонуклеотид согласно настоящему изобретению; или применение биосенсора согласно настоящему изобретению, или матрицы согласно настоящему изобретению, или набора согласно настоящему изобретению, для определения вещества, способного усиливать и/или подавлять образование биомаркера.

Кроме того, предложен способ идентификации вещества, способного усиливать или подавлять образование биомаркера у субъекта, включая введение исследуемого вещества животному субъекту и детекцию и/или количественное определение уровня биомаркера, присутствующего в исследуемом образце, взятом у субъекта.

Термин «биомаркер» означает определенный биологический или биологически полученный маркер процесса, явления или состояния. Биомаркеры можно использовать в способах диагностики, например, для клинического массового обследования, для прогностической оценки и наблюдения результатов терапии, для выявления пациентов, реагирующих с наибольшей вероятностью на определенное терапевтическое лечение, а также для исследования и разработки лекарственных средств. Биомаркеры и их приложения представляют собой ценность для идентификации новых лекарственных средств и для детекции новых мишеней при использовании лекарственных средств.

Термины «детекция» и «диагностика» при использовании в настоящем описании означают определение, подтверждение и/или описание состояния заболевания. Способы детекции, наблюдения и диагностики согласно настоящему изобретению можно использовать, чтобы подтверждать существование заболевания, наблюдать развитие заболевания посредством определения его начала и прогрессирования, или оценивать ослабление или рецидив заболевания. Способы детекции, наблюдения и диагностики также можно использовать в способах оценки клинического обследования, прогноза, выбора терапии, оценки терапевтической пользы, т.е. для исследования лекарственных средств и разработки лекарственных средств.

Эффективные способы диагностики и наблюдения представляют собой очень мощные «решения для пациентов», которые имеют возможность улучшенного прогноза за счет установления правильной диагностики, обеспечивая быстрое определение основных соответствующих видов лечения (таким образом, снижая нежелательное воздействие лекарственных средств, приводящих к вредным побочным эффектам) и сокращая вероятность рецидива.

Согласно одному варианту осуществления, указанный выше биомаркер высвобождается из клеток опухоли. Таким образом, согласно следующему аспекту настоящего изобретения, предложен способ детекции роста опухоли, включающий следующие стадии:(i) измерение биомаркера в биологическом образце, который связан с опухолью или высвобождается из ее клеток, и (ii) демонстрацию того, что с уровнем указанного биомаркера связаны размер, стадия, агрессивность или распространение опухоли.

Известно, что увеличение клеточного оборота, смерти клеток и апоптоза приводит к увеличению уровней циркулирующих внеклеточных нуклеосом (Holdenrieder et al., 2001). Уровень циркулирующих внеклеточных нуклеосом представляет собой неспецифический индикатор, который используется в разнообразных состояниях, включая воспалительные заболевания, большое разнообразие доброкачественных и злокачественных состояний, аутоиммунные заболевания, а также последующую травму или ишемию (Holdenrieder et al. 2001). Для специалистов в данной области будет очевидным, что настоящее изобретение находит применение в лечении разнообразных состояний, в которых у субъектов обнаруживаются циркулирующие нуклеосомы. Они включают, но без ограничения, травмы (например, в результате серьезного повреждения или хирургической операции), чрезмерные физические нагрузки (например, марафонский бег), инсульт, сердечный приступ, сепсис или другие серьезные инфекции и эндометриоз. Авторы использовали способ иммунологического анализа согласно настоящему изобретению для измерения уровней нуклеосом и исследовали изменчивость их гистоновой и нуклеотидной структуры в случаях разнообразных заболеваний, в число которых входят кардиомиопатия, системная красная волчанка, язвенный колит, хроническое обструктивное заболевание легких, болезнь Крона и ревматоидный артрит, и сравнивали результаты с результатами для здоровых субъектов. Авторы смогли детектировать нуклеосомы и определить их относительные структуры (в отношении гистонового и нуклеотидного состава) для всех данных заболеваний. Поскольку способы согласно настоящему изобретению являются пригодными для детекции более широкого круга нуклеосом, чем существовавшие до настоящего времени методы ELISA для детекции нуклеосом, способы согласно настоящему изобретению находят применение в широкой области раковых и нераковых заболеваний.

Иммунологические анализы согласно настоящему изобретению включают иммунометрические анализы с использованием ферментативных способов детекции (например, ELISA), иммунометрические анализы с флуоресцентной маркировкой, иммунометрические анализы с флуоресцентной маркировкой и временным разрешением, хемилюминесцентные иммунометрические анализы, иммунотурбидиметрические анализы, иммунометрические анализы с крупнодисперсной маркировкой и иммунорадиометрические анализы, а также и конкурентные способы иммунологического анализа, включая конкурентные способы иммунологического анализа с меченым антигеном и меченым антителом, в которых используются разнообразные типы маркировки, включая радиоактивные, ферментативные, флуоресцентные, флуоресцентные с временным разрешением и крупнодисперсные метки. Все указанные способы иммунологического анализа хорошо известны в данной области, см., например, работы Salgame et al. (1997) и van Nieuwenhuijze et al. (2003).

Согласно одному варианту осуществления, указанный выше биологический образец представляет собой биологическую жидкость. Например, биологические образцы, которые можно исследовать способом согласно настоящему изобретению, включают спинномозговую жидкость (СМЖ), цельную кровь, сыворотку крови, плазму, менструальную кровь, эндометриальную жидкость, мочу, слюну или другие биологические жидкости (стул, слезная жидкость, синовиальную жидкость, мокроту), выделяемый при дыхании пар, например, в форме сконденсированного пара, или экстракт или продукт очистки, или соответствующий продукт разведения. Биологические образцы также включают образцы, взятые у живых субъектов, или образцы, взятые посмертно. Образцы можно готовить, насколько это необходимо, например, разводить или концентрировать, и хранить обычным способом.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, способ повторяют несколько раз. Данный вариант осуществления предоставляет преимущество возможности наблюдения результатов детекции в течение заданного периода времени. Такая возможность обеспечивает преимущество наблюдения или оценки эффективности лечения состояния заболевания. Такие способы наблюдения согласно настоящему изобретению можно использовать для наблюдения начала, развития, стабилизации, ослабления, рецидива и/или ремиссии.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу наблюдения эффективности терапии в отношении состояния заболевания субъекта, подозреваемого в присутствии такого заболевания, включающему детекцию и/или количественное определение биомаркера, который присутствует в биологическом образце, взятом у указанного субъекта. Согласно способам наблюдения, исследуемые образцы можно отбирать дважды или большее число раз. Способ может дополнительно включать сопоставление уровня биомаркера(ов), который(ые) присутствует(ют) в исследуемом образце с одним контрольным образцом или несколькими контрольными образцами, и/или с одним или несколькими предшествующими исследуемыми образцами, взятыми ранее у того же исследуемого субъекта, например, до начала терапии, и/или у того же исследуемого субъекта на предшествующей стадии терапии. Способ может включать детекцию изменения природы или количества биомаркера(ов) в исследуемых образцах, взятых в различные сроки.

Таким образом, согласно следующему аспекту, настоящее изобретение относится к способу наблюдения эффективности терапии в отношении состояния заболевания у человека или животного субъекта, включающему:

(i) количественное определение количество биомаркера, как описано в настоящем описании; и

(ii) сопоставление количества указанного биомаркера в исследуемом образце с количеством, которое присутствует в одном контрольном образце или в нескольких контрольных образцах, и/или в одном или нескольких предшествующих исследуемых образцах, взятых ранее у того же исследуемого субъекта.

Изменение уровня биомаркера исследуемом образце по сравнению с его уровнем в предшествующем исследуемом образце, взятом ранее у того же исследуемого субъекта, может представлять собой показатель полезного эффекта, например, стабилизации или улучшения при использовании указанной выше терапии в отношении заболевания или подозреваемого заболевания. Кроме того, после завершения лечения способ согласно настоящему изобретению можно периодически повторять для предотвращения рецидива заболевания.

Способы наблюдения эффективности терапии можно использовать для наблюдения терапевтической эффективности существующих типов терапии и новых типов терапии в отношении человека и животного субъекта другого вида (например, животного, служащего в качестве модели). Эти способы наблюдения можно внедрять в исследования новых лекарственных веществ и комбинаций веществ.

Согласно следующему варианту осуществления, наблюдение более быстрых изменений, обусловленных быстродействующими типами терапии, можно осуществлять с менее продолжительными интервалами, составляющими несколько часов или суток.

Согласно следующему аспекту настоящего изобретения, предложен способ идентификации биомаркера для детекции присутствия состояния заболевания. Термин «идентификация» при использовании в настоящем описании означает подтверждение присутствия биомаркера, который содержится в биологическом образце. Количественное определение количества биомаркера, присутствующего в образце, может включать определение концентрации биомаркера, присутствующего в образце. Идентификацию и/или количественное определение можно осуществлять непосредственно, используя образец, или косвенно, используя полученный из него экстракт или продукт его разведения.

Согласно альтернативным аспектам настоящего изобретения, присутствие биомаркера оценивают посредством детекции и/или количественного определения антитела или его фрагмента, способного осуществлять специфическое связывание с биомаркером, и производимого организмом субъекта при воздействии биомаркера и, таким образом, присутствующего в биологическом образце, взятом у субъекта, находящегося в состоянии заболевания.

Идентификацию и/или количественное определение можно осуществлять, применяя любой способ, подходящий для определения присутствия и/или количества специфического белка в биологическом образце, взятом у пациента, или в продукте очистки или экстракте биологического образца или продукта его разведения. Используя способы согласно настоящему изобретению, количественное определение можно осуществлять посредством измерения концентрации биомаркера в образце или образцах. Биологические образцы, которые можно исследовать способом согласно настоящему изобретению, включают образцы, которые описаны выше в настоящем описании. Данные образцы можно изготавливать, насколько это целесообразно, посредством разведения или концентрирования и хранить обычным образом.

Идентификацию и/или количественное определение биомаркеров можно осуществлять посредством детекции биомаркера или его фрагмента, например, фрагмента, содержащего разветвление у концевого атома C или разветвление у концевого атома N. Длина этих фрагментов предпочтительно составляет более чем 4 аминокислоты, например, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислот. Следует отметить, в частности, что пептиды, содержащие такую же последовательность, как гистоновые хвосты, представляют собой особенно полезные фрагменты гистоновых белков.

Биомаркеры могут быть детектированы непосредственно, например, используя методы усиленной поверхностью лазерной десорбции/ионизации (SELDI) или времяпролетной ионизации лазерной десорбцией с использованием матрицы (MALDI-TOF). Альтернативно, биомаркер можно детектировать непосредственно или косвенно путем взаимодействия с лигандом или лигандами, такими как антитело или его связывающий биомаркер фрагмент, или с другим пептидом, или лигандом, например, аптамером, или олигонуклеотидом, способным осуществлять специфическое связывание с биомаркером. Лиганд или связующее вещество может содержать детектируемый индикатор, такой как люминесцентный, флуоресцентный или радиоактивный индикатор, и/или аффинный маркер.

Например, детекцию и/или количественное определение можно осуществлять, применяя один способ или несколько способов, выбранных из группы, состоящей из: (времяпролетной) усиленной поверхностью лазерной десорбции/ионизации (SELDI(-TOF)), (времяпролетной) ионизации лазерной десорбции с использованием матрицы (MALDI(-TOF)), одномерного (1-D) анализа на основе геля, двумерного (2-D) анализа на основе геля, масс-спектрометрии (МС), жидкостной хроматографии (с обращенной фазой) ((ОФ)ЖХ), гель-хроматографии (гель-фильтрация), ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), жидкостной хроматографии ультравысокого давления (UPLC) и других методов, на основе жидкостной хроматографии (ЖХ) или сочетания ЖХ и МС. Соответствующие методы на основе ЖХ-МС включают кодированный изотопом аффинный индикатор (ICAT®) от компании Applied Biosystems (штат Калифорния, США) или изобарический индикатор для относительного и абсолютного количественного определения (iTRAQ®) от компании Applied Biosystems (штат Калифорния, США). Могут быть также использованы жидкостная хроматография (например, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) или жидкостная хроматография низкого давления (НДЖХ)), тонкослойная хроматография и спектрометрия ЯМР (ядерного магнитного резонанса).

Способы диагностики или наблюдения согласно настоящему изобретению могут включать анализ образца методами времяпролетной усиленной поверхностью лазерной десорбции/ионизации (SELDI TOF) или времяпролетной ионизации лазерной десорбцией с использованием матрицы (MALDI TOF) для детекции присутствия или уровня биомаркера. Эти способы являются также подходящими, для осуществления клинического обследования, прогноза, наблюдения результатов терапии, определения пациентов, реагирующих с наибольшей вероятностью на определенное терапевтическое лечение, исследования и разработки лекарственных средств и определения новых мишеней для применения лекарственных средств.

Идентификацию и/или количественное определение анализируемых биомаркеров можно осуществлять, применяя иммунологический способ с использованием антитела или его фрагмента, способного осуществлять специфическое связывание с биомаркером. Подходящие иммунологические способы включают многослойные иммунологические анализы, такие как многослойный ELISA, в котором детекцию анализируемых биомаркеров осуществляют с использованием двух антител, которые распознают различные эпитопы на анализируемом биомаркере; радиоиммунологические анализы (РИА), непосредственные, косвенные или конкурентные твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), иммунологические ферментативные анализы (ИФА), флуоресцентные иммунологические анализы (ФИА), вестерн-блоттинг, иммунопреципитация и любой иммунологический анализ на основе частиц (например, с использованием частиц золота, серебра или латекса, магнитных частиц или квантовых точек). Иммунологические способы можно осуществлять, например, в формате микропланшета или микрополоски.

Согласно одному варианту осуществления, один или несколько биомаркеров может заменять молекула или пригодный для измерения фрагмент молекулы, которая предшествует биомаркеру или следует за ним на пути биологического процесса.

Идентификация ключевых биомаркеров, специфических по отношению к заболеванию, представляет собой основную задачу для интеграции диагностических процедур и терапевтических схем. Используя прогностические биомаркеры, можно разрабатывать соответствующие диагностические средства, такие как биосенсоры; соответственно, в способах и применениях согласно настоящему изобретению для осуществления идентификации и количественного определения могут применяться биосенсоры, микроаналитические системы, микротехнологические системы, микроразделительные системы, иммунохроматографические системы или другие подходящие аналитические устройства. Биосенсор может включать иммунологический способ детекции биомаркера(ов), электрические, термические, магнитные, оптические (например, голографические) или акустические технологии. С использованием таких биосенсоров становится возможным детекция целевого биомаркера(ов) в предполагаемых концентрациях, которые присутствуют в биологических образцах.

При использовании в настоящем описании термин «биосенсор» означает любое средство, которое способно осуществлять детекцию присутствия биомаркера. Примеры биосенсоров описаны в настоящем описании.

Согласно настоящему изобретению, биосенсоры могут включать лигандные связующие вещества или лиганды, которые описаны в настоящем описании и способны осуществлять специфическое связывание с биомаркером. Такие биосенсоры можно использовать для детекции и/или количественного определения биомаркера согласно настоящему изобретению.

Согласно настоящему изобретению, биомаркер(ы) могут быть детектированы с использованием включающих биосенсоры технологий, основу которых составляют сканируемые голограммы или высокочастотные акустические системы, причем такие системы являются особенно приспособленными для конфигураций штриховых кодов или матриц.

В сенсорах на основе сканируемых голограмм от компании Smart Holograms Ltd. (Кембридж, Великобритания) голографическое изображение сохраняется на тонкой полимерной пленке, которая является сенсибилизированной для специфической реакции с биомаркером. При облучении биомаркер реагирует с полимером, вызывая изменение изображения, которое представляет голограмма. Считываемый результат исследования может представлять собой изменение оптической яркости, изображения, цвета и/или положения изображения. Для качественных и полуколичественных приложений сенсорную голограмму можно считывать невооруженным глазом, устраняя, таким образом, необходимость в аналитическом оборудовании. Можно использовать простой цветовой сенсор для считывания сигнала, когда требуются количественные измерения. Работе сенсора не мешают ни матовость, ни цвет образца. Формат сенсора допускает мультиплексирование для одновременной детекции нескольких веществ. Можно разрабатывать обратимые и необратимые сенсоры для выполнения различных требований, и становится возможным непрерывное наблюдение определенных исследуемых биомаркеров.

Предпочтительно биосенсоры для детекции одного или нескольких биомаркеры согласно настоящему изобретению сочетают биомолекулярное распознавание и соответствующее приспособление, которое преобразовывает в сигнал обнаруженное присутствие или количественное определение биомаркера в образце. Биосенсоры можно приспосабливать для диагностических исследований в различных точках, например, в больнице, амбулаторном отделении, в хирургическом отделении, на дому, в полевых условиях и по месту работы.

Согласно настоящему изобретению, биосенсоры для детекции одного или нескольких биомаркеров включают акустические, плазмонные резонансные, голографические, биослойные интерферометрические (БСИ) и микротехнологические сенсоры. Впечатанные распознавательные элементы, тонкопленочные транзисторные технологии, магнитоакустические резонансные устройства и другие новые акустоэлектрические системы можно использовать в биосенсорах для детекции одного или нескольких биомаркеров согласно настоящему изобретению.

Способы, включающие идентификацию и/или количественное определение одного или нескольких биомаркеров согласно настоящему изобретению, можно осуществлять, используя стационарные измерительные приборы, или их можно применять в мобильных диагностических или измерительных устройствах, которые можно устанавливать вне лабораторного помещения, например, в кабинете врача или у койки пациента. Подходящие биосенсоры для осуществления способов согласно настоящему изобретению включают пластиковые карты с оптическими или акустическими считывающими устройствами. Биосенсоры могут осуществлять функцию электронной передачи собранных данных врачу для интерпретации, и, таким образом, они могут представлять собой основу для электронного обмена медицинской информацией.

В настоящем описании описаны диагностические наборы для определения и наблюдения присутствующего состояния заболевания. Согласно одному варианту осуществления, эти наборы дополнительно содержат биосенсор, способный производить идентификацию и/или количественное определение биомаркера. Предпочтительно набор согласно настоящему изобретению может содержать один или несколько компонентов, выбранных из группы, включающей лигандные связующие вещества или лиганды, специфические для биомаркера, или имитаторы структуры/формы биомаркера, один или несколько контрольных стандартов, один или несколько реагентов и один или несколько расходных материалов; необязательно вместе с инструкциями для применения набора согласно любому из способов, описанных в настоящем описании.

Идентификация биомаркеров состояния заболевания позволяет интегрировать диагностические процедуры и терапевтические схемы. Детекцию биомаркера согласно настоящему изобретению можно использовать для обследования субъектов перед их участием в клинических исследованиях. Биомаркеры представляют собой средства, показывающие терапевтический эффект, отсутствие эффекта, профиль неблагоприятных побочных эффектов, степень соответствия лекарственного средства и достижение достаточных уровней лекарственных средств в сыворотке. Биомаркеры можно использовать в качестве средства предупреждения о неблагоприятной реакции на лекарственное средство. Биомаркеры можно использовать для разработки персонализированных типов терапии, поскольку оценку реакции можно использовать для тонкого регулирования дозировки, сведения к минимуму числа выписываемых лекарственных средств, сокращения задержки в достижении эффективности терапии и предотвращения неблагоприятных реакций на лекарственные средства. Таким образом, посредством наблюдения биомаркеров согласно настоящему изобретению можно точно регулировать лечение пациента в соответствии с требованиями, определяемыми заболеванием и фармакогеномным профилем пациента; таким образом, биомаркер можно использовать для установления оптимальной дозы, прогноза положительной терапевтической реакции и определения пациентов, подверженных высокому риску серьезных побочных эффектов.

Исследования на основе биомаркеров обеспечивают первоочередную оценку новых пациентов и представляют собой объективные средства для точной и быстрой диагностики, которая является недостижимой с использованием средств, существовавших до настоящего времени.

Кроме того, диагностические исследования на основе биомаркеров можно использовать для определения членов семьи или пациентов, которые имеют легкое или бессимптомное заболевание, или которые могут подвергаться высокому риску развития симптоматического заболевания. Это позволяет предпринимать соответствующие терапевтические или профилактические меры, например, снижающие факторы риска. Признано, что такие подходы улучшают результативность лечения и могут предотвращать явное возникновение заболевания.

Биомаркерные способы наблюдения, биосенсоры и наборы также являются актуальными в качестве средств для наблюдения пациентов, позволяющих врачу определять, обусловлен ли рецидив ухудшением заболевания. Если фармакологическое лечение оказывается недостаточным, то терапию можно возобновлять или усиливать; изменение терапии можно осуществлять, если это целесообразно. Поскольку биомаркеры обладают чувствительностью к состоянию заболевания, они представляют собой показатель эффективности лекарственной терапии.

Далее настоящее изобретение будет проиллюстрировано со ссылкой на следующие неограничивающие примеры.

Пример 1

Коммерчески доступный нуклеосомный препарат, полученный гидролизом хроматина, экстрагированного из клеток MCF7, в котором ДНК и белки в нуклеосоме являются перекрестно-сшитыми для стабильности (для гарантии того, что все гистоны, которые присутствуют в препарате, внедрены в неизмененные нуклеосомы), анализировали в отношении метилированного ДНК с использованием метода ELISA для связанного с нуклеосомами нуклеотида 5-метилцитозина, используя твердофазное анти-гистоновое иммобилизованное антитело, которое связывает неизмененные нуклеосомы, и идентифицирующее антитело биотинилированного моноклонального анти-5-метилцитозина. Нуклеосомный образец последовательно разводили фетальной телячьей сывороткой и исследовали в двух повторах методом ELISA. Чистую фетальную телячью сыворотку также исследовали методом ELISA в качестве контрольного образца, в котором не содержались внеклеточные нуклеосомы. Анализ осуществляли следующим образом: раствор антигистонового антитела в 0,1М фосфатном буфере, pH 7,4, добавляли в лунки микропланшета (100 мкл/лунка) и инкубировали в течение ночи при 4°C, чтобы покрыть лунки иммобилизованным антителом. Избыток антигистонового антитела декантировали. Раствор бычьего сывороточного альбумина (20 г/л) добавляли в лунки (200 мкл/лунка) и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы блокировать избыточные области связывания белка на лунках. Избыток раствора бычьего сывороточного альбумина декантировали, и лунки промывали три раза промывочным буфером (200 мкл/лунка, 0,05М буфер TRIS/HCl, pH 7,5, содержащий 1% Tween 20). Образец (10 мкл/лунка) и аналитический буфер (50 мкл/лунка, 0,05М TRIS/HCl, pH 7,5, содержащий 0,9% NaCl, 0,05% деоксихолат натрия и 1% заменитель Nonidet P40) добавляли в лунки и инкубировали в течение 90 минут при комнатной температуре при умеренном перемешивании. Смесь образца и аналитического буфера декантировали, и лунки промывали три раза промывочным буфером (200 мкл/лунка). Раствор идентифицирующего антитела биотинилированного анти-5-метилцитозина добавляли (50 мкл/лунка) и инкубировали в течение 90 минут при комнатной температуре при умеренном перемешивании. Избыток идентифицирующего антитела декантировали, и лунки снова промывали три раза промывочным буфером (200 мкл/лунка). Раствор, содержащий конъюгат стрептавидина и пероксидазы хрена, добавляли (50 мкл/лунка) и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре при умеренном перемешивании. Избыток конъюгата декантировали, и лунки снова промывали три раза промывочным буфером (200 мкл/лунка). Окрашенный раствор субстрата (100 мкл/лунка, диаммониевая соль 2,2’-азинобис-3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты) добавляли и инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре при умеренном перемешивании. Оптическую плотность (OD) лунок измеряли при длине волны 405 нм, используя стандартный микропланшет-ридер. Кривую доза-ответ с усилением цвета при увеличении концентрации связанного с нуклеосомами анти-5-метилцитозина наблюдали при низком фоновом сигнале, измеряемом при отсутствии 5-метилцитозина (фетальная телячья сыворотка). Положительный сигнал ELISA показывает, что 5-метилцитозин, детектированный методом ELISA, внедряется в неизмененную нуклеосому, содержащую одновременно гистоновый белок и ДНК, поскольку (i) иммобилизованное антитело связывается с гистонами в образце, и (ii) идентифицирующее антитело связывается с 5-метилцитозиновым компонентом ДНК. Результаты представлены на фиг.1.

Пример 2

Коммерчески доступный нуклеосомный препарат, полученный гидролизом хроматина, экстрагированного из клеток A375, в котором ДНК и белки в нуклеосоме являются перекрестно-сшитыми для стабильности (для гарантии того, что все гистоны, которые присутствуют в препарате, внедрены в неизмененные нуклеосомы), анализировали в отношении 5-гидроксиметилированного ДНК с использованием метода ELISA для связанного с нуклеосомами нуклеотида 5-гидроксиметилцитозина, используя твердофазное анти-гистоновое иммобилизованное антитело, которое связывает неизмененные нуклеосомы, и идентифицирующее антитело биотинилированного моноклонального анти-5-гидроксиметилцитозина. Нуклеосомный образец последовательно разводили фетальной телячьей сывороткой и исследовали в двух повторах методом ELISA. Чистую фетальную телячью сыворотку также исследовали методом ELISA в качестве контрольного образца, в котором не содержались внеклеточные нуклеосомы. Анализ осуществляли следующим образом: раствор антигистонового антитела в 0,1М фосфатном буфере, pH 7,4, добавляли в лунки микропланшета (100 мкл/лунка) и инкубировали в течение ночи при 4°C, чтобы покрыть лунки иммобилизованным антителом. Избыток антигистонового антитела декантировали. Раствор бычьего сывороточного альбумина (20 г/л) добавляли в лунки (200 мкл/лунка) и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы блокировать избыточные области связывания белка на лунках. Избыток раствора бычьего сывороточного альбумина декантировали, и лунки промывали три раза промывочным буфером (200 мкл/лунка, 0,05М буфер TRIS/HCl, pH 7,5, содержащий 1% Tween 20). Образец (10 мкл/лунка) и аналитический буфер (50 мкл/лунка, 0,05М TRIS/HCl, pH 7,5, содержащий 0,9% NaCl, 0,05% деоксихолат натрия и 1% заменитель Nonidet P40) добавляли в лунки и инкубировали в течение 90 минут при комнатной температуре при умеренном перемешивании. Смесь образца и аналитического буфера декантировали, и лунки промывали три раза промывочным буфером (200 мкл/лунка). Раствор идентифицирующего антитела биотинилированного анти-5-гидроксиметилцитозина добавляли (50 мкл/лунка) и инкубировали в течение 90 минут при комнатной температуре при умеренном перемешивании. Избыток идентифицирующего антитела декантировали, и лунки снова промывали три раза промывочным буфером (200 мкл/лунка). Раствор, содержащий конъюгат стрептавидина и пероксидазы хрена, добавляли (50 мкл/лунка) и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре при умеренном перемешивании. Избыток конъюгата декантировали, и лунки снова промывали три раза промывочным буфером (200 мкл/лунка). Окрашенный раствор субстрата (100 мкл/лунка, диаммониевой соли 2,2’-азинобис-3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты) добавляли и инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре при умеренном перемешивании. Оптическую плотность (OD) лунок измеряли при длине волны 405 нм, используя стандартный микропланшет-ридер. Кривую доза-ответ с усилением цвета при увеличении концентрации связанного с нуклеосомами 5-гидроксиметилцитозина наблюдали при низком фоновом сигнале, измеряемом при отсутствии 5-гидроксиметилцитозина (фетальная телячья сыворотка). Положительный сигнал ELISA показывает, что 5-гидроксиметилцитозин, детектированный методом ELISA, внедряется в неизмененную нуклеосому, одновременно включающую гистоновый белок и ДНК, поскольку (i) иммобилизованное антитело связывается с гистонами в образце, и (ii) идентифицирующее антитело связывается с 5-гидроксиметилцитозиновым компонентом ДНК. Результаты представлены на фиг.2.

Пример 3

Авторы использовали два нуклеосомных метода ELISA известного уровня техники для измерения содержания циркулирующих внеклеточных нуклеосом в образцах сыворотки и плазмы крови, взятых у 20 здоровых субъектов. Первый существующий метод ELISA (ELISA 1) представлял собой метод ELISA от компании Roche для определения клеточной смерти, и в другом методе ELISA (ELISA 2) использовали анти-гистоновое иммобилизованное антитело и идентифицирующее антитело комплекса анти-гистон-ДНК. Уровни нуклеосом, детектированные обоими существующими нуклеосомными методами ELISA, оказались ниже в нормальной плазме, чем в нормальной сыворотке. Нормальный интервал (выраженный в единицах оптической плотности) для уровня нуклеосом в сыворотке, который вычисляли как среднее значение плюс/минус удвоенное среднеквадратическое отклонение от среднего значения результатов исследования сыворотки, взятой у 20 здоровых субъектов, составлял 0-4,3 единиц оптической плотности для ELISA 1 и 0-1,4 для ELISA 2. Соответствующие интервалы для плазмы составляли 0-0,95 и 0-0,96. Результаты представлены на фиг.3.

Авторы также измеряли уровни нуклеосом, содержащих два связанных с нуклеосомами нуклеотида, а также три связанных с нуклеосомами гистоновых варианта и гистоновую ПТМ, в тех же 20 образцах, взятые у здоровых субъектов. Результаты показывают, что здоровые образцы сыворотки имеют одинаково низкие уровни нуклеосом, содержащих гистоновые варианты или ПТМ или нуклеотиды. Нормальные интервалы (выраженные в единицах оптической плотности) для уровня нуклеосом в сыворотке, содержащих гистоновые варианты, ПТМ или нуклеотиды составляли (a) 0-0,36 для mH2A1.1, (b) 0,05-0,78 для mH2A2, (c) 0,11-0,58 для H2AZ, (d) 0,06-0,61 для P-H2AX (Ser139), (e) 0,06-0,36 для 5-метилцитозина и (f) 0,03-0,36 для 5-гидроксиметилцитозина. Результаты измерений содержащей EDTA плазмы оказались выше для всех 20 здоровых субъектов. Результаты представлены на фиг.4, 5, 6, 7, 8 и 9.

Пример 4

Авторы измеряли внеклеточные нуклеосомы, содержащие 5-метилцитозин, в содержащей EDTA плазме, взятой у 13 здоровых субъектов и у 55 субъектов, страдающих раком желудка, толстой кишки, прямой кишки, легкого (мелкоклеточная карцинома и разнообразные немелкоклеточные карциномы), молочной железы, яичника, поджелудочной железы, предстательной железы, почки и разнообразными типами рака полости рта (полость рта, небо, глотка и гортань). Все из 13 образцов, взятых у здоровых субъектов, оказались положительными для одного или нескольких типов внеклеточных нуклеосом. Все из 55 образцов, взятых у страдающих раком пациентов, оказались положительными для всех анализируемых типов внеклеточных нуклеосом. Однако уровни, обнаруженные в образцах, взятых у страдающих раком субъектов, оказались выше, чем было обнаружено в образцах, взятых у здоровых субъектов, и эти результаты продемонстрировали, что можно различать здоровых и страдающих раком субъектов. Например, нормальный интервал оптической плотности, вычисленный как среднее значение плюс/минус удвоенное среднеквадратическое отклонение от среднего значения, для связанного с нуклеосомами 5-метилцитозина, составлял 0-1,41. При использовании данного уровня отсечки все 13 здоровых образцов оказались отрицательными, и 30 из 55 раковых образцов оказались положительными (итоговая клиническая чувствительность составляла 55%), включая 38% (3 из 8) в отношении рака желудка, 60% (3 из 5) в отношении рака толстой кишки, 33% (1 из 3) в отношении рака прямой кишки, 33% (2 из 6) в отношении мелкоклеточного рака легкого, 64% (9 из 14) в отношении немелкоклеточного рака легкого, 33% (2 из 6) в отношении рака молочной железы, 100% (1 из 1) в отношении рака яичника, 100% (1 из 1) в отношении рака поджелудочной железы, 33% (2 из 6) в отношении рака предстательной железы, 100% (1 из 1) в отношении рака почки и 60% (3 из 5) в отношении рака полости рта. Результаты представлены на фиг.17.

Авторы также использовали способы согласно настоящему изобретению для измерения других разнообразных связанных с нуклеосомами структур в тех же образцах. Результаты этих иммунологические анализов компилировали, чтобы получить профиль нуклеосомных структур в образцах, взятых у страдающих раком пациентов, нормированный по отношению к обнаруженным уровням нуклеосом, содержащих 5-метилцитозин. Авторы сравнивали полученные в результате профилей с нуклеосомной структурой образцов, взятых у здоровых субъектов. Профиль нуклеосомной структуры внеклеточных нуклеосом оказался отличающимся от профилей здоровых субъектов. Результаты представлены на фиг.20. Аналогичным образом, авторы компилировали нуклеосомные структурные профили для образцов, взятых у страдающих разнообразными нераковыми заболеваниями пациентов, и сравнивали их с профилями нуклеосом в образцах, взятых у страдающих раком пациентов и у здоровых субъектов. Результаты представлены на фиг.21.

Затем авторы осуществили еще один аналогичный эксперимент с исследованием образцов, взятых у 10 здоровых субъектов, а также у 62 пациентов, страдающих раком разнообразных типов. Результаты оказались аналогичными результатам первого эксперимента. Например, используя результаты для связанного с нуклеосомами 5-метилцитозина и уровень отсечки, составляющий среднее значение плюс удвоенное среднеквадратическое отклонение от среднего значения результатов для здоровых субъектов, отрицательные результаты были получены для всех 10 здоровых субъектов, и положительные результаты были получены для 95% (61 из 62) страдающих раком пациентов, включая 9 из 9 страдающих раком предстательной железы пациентов, 5 из 5 страдающих раком кожи пациентов, 8 из 8 страдающих раком пищевода пациентов, 12 из 13 страдающих раком мочевого пузыря пациентов, 2 из 2 страдающих раком шейки матки пациенток, 1 из 1 страдающего раком ободочной кишки пациента, 4 из 4 страдающих раком молочной железы пациенток, 7 из 7 яичник страдающих раком яичника пациенток, 7 из 7 страдающих раком гортани пациентов, 3 из 3 страдающих раком легкого пациентов и 3 из 3 страдающих раком почки пациентов. Результаты представлены на фиг.18. Этот результат показывает, что уровни нуклеотидов в сыворотке и уровни связанных с нуклеосомами нуклеотидов, включая, в частности, 5-метилцитозин, представляют собой клинически чувствительные биомаркеры для рака.

Пример 5

Авторы использовали два нуклеосомных метода ELISA известного уровня техники для измерения содержания циркулирующих внеклеточных нуклеосом в образцах, взятых у трех субъектов, страдающих раком ободочной кишки, 13 субъектов, страдающих раком легкого, двух субъектов, страдающих раком поджелудочной железы, одного субъекта, страдающего раком полости рта, и в нуклеосомных образцах, взятых у здоровых субъектов, согласно способу Holdenrieder (*Holdenrieder et al., 2001). Первый существующий метод ELISA (ELISA 1) представлял собой метод ELISA от компании Roche для определения клеточной смерти, и в другом методе ELISA (ELISA 2) использовали анти-гистоновое иммобилизованное антитело и идентифицирующее антитело комплекса анти-гистон-ДНК.

Авторы также измеряли уровни нуклеосом, содержащих нуклеотиды 5-метилцитозин и 5-гидроксиметилцитозин, а также три гистоновых варианта и гистон ПТМ в тех же 19 образцах, взятых у страдающих раком субъектов. Результаты показывают, что, несмотря на низкие количества нуклеосом, детектированных методами ELISA известного уровня техники для большинства субъектов, в частности, для страдающих раком поджелудочной железы и полости рта пациентов, большинство из этих образцов имеют повышенные детектируемые уровни нуклеосом, которые содержат один или несколько связанных с нуклеосомами нуклеотидов или гистоновых вариантов. Результаты для образцов, взятых у трех субъектов, страдающих раком ободочной кишки, 13 субъектов, страдающих раком легкого, двух субъектов, страдающих раком поджелудочной железы, и одного субъекта, страдающего раком полости рта, представлены на фиг.10, 11, 12 и 13, соответственно. Значительные уровни связанных с нуклеосомами гистоновых вариантов и уровни гистоновых ПТМ детектировали в 16 из 19 раковых образцов (всех, кроме трех образцов рака легкого). Кроме того, значительные уровни связанного с нуклеосомами 5-гидроксиметилцитозина детектировали в 12 из 19 раковых образцов. Кроме того, значительные уровни связанного с нуклеосомами 5-метилцитозина детектировали во всех 19 раковых образцах.

Кроме того, картина уровней нуклеосом, содержащий различные уровни нуклеотида, гистонового варианта и гистоновой ПТМ, не является одинаковой для всех субъектов, но различные картины выявляются для различных исследованных типов рака. Чтобы упростить сравнение между результатами для субъектов, страдающих раком одинаковых или различных типов, результаты для исследования нуклеосом (для нуклеосом, содержащих макроH2A1.1, макроH2A2, H2AZ, P-H2AX (Ser139), 5-метилцитозин, 5-гидроксиметилцитозин) нормировали в форме пропорции к сигналу оптической плотности, который наблюдали для нуклеосом, содержащих 5-метилцитозин. Нормированные результаты (с планками погрешностей, которые показывают среднеквадратическое отклонение от среднего значения результатов в тех случаях, где исследовали образцы от более чем одного субъекта) представлены для каждого типа рака на фиг.14 вместе с соответствующими результатами для нуклеосомных образцов, взятых у здоровых субъектов (mH2A2 и 5-гидроксиметилцитозин не измеряли для этого образца). На фиг.14 показано, что картина распределения нуклеосом, содержащих различные нормированный нуклеотиды, гистоновые варианты или ПТМ, для всех исследованных типов рака достаточно заметно отличается от картины распределения нуклеосом в образцах, взятых у здоровых субъектов. Например, относительный уровень нуклеосом, содержащих макроH2A1.1, в здоровом нуклеосомном образце отличается от уровня, который детектируется в образцах любого из типов рака. Таким образом, настоящее изобретение можно использовать в качестве способа детекции рака в массовом обследовании на основе анализа крови. Для специалистов в данной области будет очевидным, что настоящее изобретение включает исследование нуклеосом, содержащих другие дополнительные нуклеотиды и/или гистоновые варианты и/или гистоновые модификации, чтобы дополнительно или лучше устанавливать различие между циркулирующими внеклеточными нуклеосомами, возникающими в результате опухолевого или другого заболевания.

Кроме того, наблюдаемая картина типов нуклеосом отличается для различных типов рака. Например, образцы, взятые у субъектов, страдающих раком ободочной кишки, раком поджелудочной железы и раком полости рта, можно отличать по различным нормированным уровням связанного с нуклеосомами H2AZ и 5-гидроксиметилцитозина. Аналогичным образом, рак полости рта показывает нормированные уровни обеих нуклеосом, содержащих mH2A2 или P-H2AX (Ser139), которые отличаются от любого из трех других типов рака, и образцы, взятые у субъектов, страдающих раком поджелудочной железы, можно отличать от образцов, взятых у субъектов, страдающих раком ободочной кишки, на основании различных относительных уровней нуклеосом, содержащих вариант макроH2A1.1. Таким образом, настоящее изобретение можно использовать в качестве способа общей диагностики рака, а также для различия определенных типов рака. Для специалистов в данной области будет очевидным, что настоящее изобретение включает исследование нуклеосом, содержащих другие дополнительные гистоновые варианты и/или гистоновые модификации, и/или нуклеотиды, чтобы дополнительно или лучше устанавливать различие между циркулирующими внеклеточными нуклеосомами, возникающими в результате различных специфических опухолей или в результате других заболеваний.

Пример 6

Авторы исследовали способ согласно настоящему изобретению в образцах сыворотки, взятых у трех здоровых субъектов и у 10 страдающих раком ободочной кишки пациентов. Авторы измеряли нуклеосомы, содержащие 5-метилцитозин, в этих образцах, и результаты в случае рака оказались одинаково повышенными по сравнению с результатами, полученными для здоровых субъектов, как представлено на фиг.16.

Пример 7

Авторы измеряли уровни связанного с нуклеосомами человека 5-метилцитозина в содержащих EDTA образцах плазмы, взятых у страдающих раком легкого и ободочной кишки пациентов. Детектированные уровни показывали корреляцию с прогрессирующим заболеванием пациентов. Результаты, представленные на фиг.19, показывают, что уровни связанного с нуклеосомами 5-метилцитозина увеличиваются при повышении степени тяжести заболевания в отношении размера, стадии, распространения узлов, и уровни связанного с нуклеосомами 5-метилцитозина можно использовать, отдельно или как часть диагностической группы, в качестве маркеров прогрессирующего заболевания.

Список литературы

Allen et al, A simple method for estimating global DNA methylation using bisulfite PCR of repetitive DNA elements. Nucleic Acids Research: 32(3) e38DOI: 10.1093/nar/gnh032.

Bawden et al, Detection of histone modification in cell-free nucleosomes. WO 2005/019826, 2005.

Boulard et al, Histone variant macroH2A1 deletion in mice causes female-specific steatosis. Epigenetics & Chromatin: 3(8), 1-13, 2010.

Cell Biolabs, Inc. Product Manual for "Global DNA Methylation ELISA Kit (5'-methyl-2'-deoxycytidine Quantitation", 2011.

Dai et al, Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA. http://www.jove.com/details.php?id=2593 doi: 10.3791/2593. J Vis Exp. 50 (2011).

Deligezer et al, Sequence-Specific Histone Methylation Is Detectable on Circulating Nucleosomes in Plasma. Clinical Chemistry 54(7), 1125-1131, 2008.

Epigentek Group Inc, Methylamp™ Global DNA Methylation Quantification Kit, User Guide, Version 2.0802, 2009.

Esteller, Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps Nature Reviews Genetics: 8, 286-298, 2007.

Feinberg and Vogelstein, Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts. Nature: 301, 89-92, 1983.

Grutzmann et al, Sensitive Detection of Colorectal Cancer in Peripheral Blood by Septin 9 DNA Methylation Assay. PLoS ONE 3(11): e3759. doi:10.1371/journal.pone.0003759, 2008.

Hervouet et al, Disruption of Dnmt1/PCNA/UHRF1 Interactions Promotes Tumorigenesis from Human and Mice Glial Cells PLoS ONE 5(6): e11333. doi:10.1371/journal.pone.0011333, 2010.

Hua et al, Genomic analysis of estrogen cascade reveals histone variant H2A.Z associated with breast cancer progression. Molecular Systems Biology 4; Article number 188; doi:10.1038/msb.2008.25, 2008.

Herranz and Esteller, DNA methylation and histone modifications in patients with cancer: potential prognostic and therapeutic targets. Methods Mol Biol. 361:25-62, 2007.

Holdenrieder et al, Nucleosomes in serum of patients with benign and malignant diseases. Int. J. Cancer (Pred. Oncol.): 95, 114-120, 2001.

*Holdenrieder et al, Nucleosomes in Serum as a Marker for Cell Death. Clin Chem Lab Med; 39(7), 596-605, 2001.

Holdenrieder et al, Cell-Free DNA in Serum and Plasma: Comparison of ELISA and Quantitative PCR. Clinical Chemistry: 51(8), 1544-1546, 2005.

Holdenreider and Stieber, Clinical use of circulating nucleosomes. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences; 46(1): 1-24, 2009.

Kapoor et al, The histone variant macroH2A suppresses melanoma progression through regulation of CDK8. Nature: 468, 1105-1111, 2010.

Mansour et al, The Prognostic Significance of Whole Blood Global and Specific DNA Methylation Levels in Gastric Adenocarcinoma. PLoS ONE 5(12): e15585. doi:10.1371/journal.pone.0015585, 2010.

Moore et al, Genomic DNA hypomethylation as a biomarker for bladder cancer susceptibility in the Spanish Bladder Cancer Study: a case-control study. The Lancet Oncology: 9(4), 359-366, 2008.

Ogoshi et al, Genome-wide profiling of DNA methylation in human cancer cells. Genomics: In Press, 2011.

Pennings et al, DNA methylation, nucleosome formation and positioning. Briefings in functional genomics and proteomics: 3(4), 351-361, 2005.

Rodriguez-Paredes and Esteller, Cancer epigenetics reaches mainstream oncology. Nature Medicine: 17(3), 330-339, 2011.

Salgame et al, An ELISA for detection of apoptosis. Nucleic Acids Research, 25(3), 680-681, 1997.

Sporn et al, Histone macroH2A isoforms predict the risk of lung cancer recurrence. Oncogene: 28(38), 3423-8, 2009.

Stroud et al, 5-Hydroxymethylcytosine is associated with enhancers and gene bodies in human embryonic stem cells. Genome Biology: 12:R54, 2011.

Tachiwana et al, Structures of human nucleosomes containing major histone H3 variants. Acta Cryst: D67, 578-583, 2011.

Ting Hsiung et al, Global DNA Methylation Level in Whole Blood as a Biomarker in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention: 16(1), 108-114, 2007.

van Nieuwenhuijze et al, Time between onset of apoptosis and release of nucleosomes from apoptotic cells: putative implications for sysytemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis; 62: 10-14, 2003.

Vasser et al, Measurement of Global DNA Methylation. Genetic Engineering and Biotechnology News: 29(7), 2009.

Whittle et al, The Genomic Distribution and Function of Histone Variant HTZ-1 during C. elegans Embryogenesis. PLoS Genet 4(9): 1-17, 2008.

Zee et al, Global turnover of histone post-translational modifications and variants in human cells Epigenetics & Chromatin. 3(22): 1-11, 2010.

Zhang et al, Analysis of global DNA methylation by hydrophilic interaction ultra high-pressure liquid chromatography tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry: 413(2), 164-170, 2011.

1. Применение основания ДНК, связанного с внеклеточной нуклеосомой, в качестве биомаркера в образце биологической жидкости для диагностики рака, причем основание ДНК выбрано из 5-метилцитозина или 5-гидроксиметилцитозина.

2. Применение по п.1, где внеклеточная нуклеосома представляет собой мононуклеосому или олигонуклеосому.

3. Применение по п.1, где основание ДНК, связанное с внеклеточной нуклеосомой, измеряют в образце крови.

4. Применение по п.1, где рак представляет собой рак мочевого пузыря, молочной железы, ободочной кишки, шейки матки, пищевода, почки, толстой кишки, легкого, полости рта, яичника, поджелудочной железы, предстательной железы, прямой кишки, кожи или желудка.

5. Применение по п.4, где рак представляет собой рак ободочной кишки, легкого, полости рта или поджелудочной железы.

6. Способ детекции присутствия в образце биологической жидкости основания ДНК, связанного с внеклеточной нуклеосомой, в качестве биомаркера для диагностики рака, включающий следующие стадии:

(i) контакт образца биологической жидкости с первым связующим веществом, которое связывается с нуклеосомами;

(ii) контакт нуклеосом или образца биологической жидкости со вторым связующим веществом, которое связывается с основанием ДНК;

(iii) детекцию или количественное определение связывания указанного второго связующего вещества с основанием ДНК в образце биологической жидкости; и

(iv) использование присутствия или степени такого связывания в качестве меры присутствия в образце биологической жидкости основания ДНК, связанного с нуклеосомами,

причем основание ДНК выбрано из 5-метилцитозина или 5-гидроксиметилцитозина.

7. Способ по п.6, где связующее вещество представляет собой антитело.

8. Способ по п.6, где образец биологической жидкости представляет собой кровь, сыворотку или плазму.

9. Способ детекции присутствия в образце биологической жидкости основания ДНК, связанного с внеклеточной нуклеосомой, в качестве биомаркера для диагностики рака, включающий следующие стадии:

(i) контакт образца биологической жидкости с первым связующим веществом, которое связывается с основанием ДНК;

(ii) контакт нуклеосом или образца биологической жидкости со вторым связующим веществом, которое связывается с нуклеосомами;

(iii) детекцию или количественное определение связывания указанного второго связующего вещества с нуклеосомами в образце биологической жидкости; и

(iv) использование присутствия или степени такого связывания в качестве меры присутствия в образце биологической жидкости основания ДНК, связанного с нуклеосомами,

причем основание ДНК выбрано из 5-метилцитозина или 5-гидроксиметилцитозина.

10. Способ по п.9, где связующее вещество представляет собой антитело.

11. Способ по п.9, где образец представляет собой кровь, сыворотку или плазму.

12. Способ детекции состояния заболевания животного субъекта или человека, включающий следующие стадии:

(i) детекцию или измерение основания ДНК, связанного с внеклеточной нуклеосомой, в качестве биомаркера в биологической жидкости субъекта; и

(ii) использование уровня связанного с нуклеосомами основания ДНК, измеренного для определения состояния заболевания субъекта,

причем основание ДНК выбрано из 5-метилцитозина или 5-гидроксиметилцитозина, и

причем заболевание представляет собой рак.

13. Способ по п.12, где основание ДНК, связанное с внеклеточной нуклеосомой, определяют или измеряют как один из параметров измерений.

14. Способ оценки животного субъекта или человека в отношении пригодности для терапевтического лечения, включающий следующие стадии:

(i) детекцию или измерение основания ДНК, связанного с внеклеточной нуклеосомой, в качестве биомаркера в биологической жидкости субъекта; и

(ii) использование уровня связанного с нуклеосомами основания ДНК, определяемого в качестве параметра при выборе подходящего лечения для субъекта,

причем основание ДНК выбрано из 5-метилцитозина или 5-гидроксиметилцитозина, и

причем лечение проводят для лечения рака.

15. Способ по п.14, в котором основание ДНК, связанное с внеклеточной нуклеосомой, определяют или измеряют как один из параметров измерений.

16. Способ наблюдения лечения животного субъекта или человека, включающий следующие стадии:

(i) детекцию или измерение основания ДНК, связанного с внеклеточной нуклеосомой, в качестве биомаркера в биологической жидкости субъекта;

(ii) повторную детекцию или измерение основания ДНК, связанного с внеклеточной нуклеосомой, в биологической жидкости субъекта в один или несколько моментов времени; и

(iii) использование любых изменений уровня связанного с нуклеосомами основания ДНК, определяемого в качестве параметра любых изменений состояния субъекта,

причем основание ДНК выбрано из 5-метилцитозина или 5-гидроксиметилцитозина, и

причем лечение проводят для лечения рака.

17. Способ по п.16, где основание ДНК, связанное с внеклеточной нуклеосомой, определяют или измеряют как один из параметров измерений.