Способ повышения термостойкости желатина при модификации его глутаровым альдегидом

Настоящее изобретение относится к способу повышения термостойкости желатина при модификации его глутаровым альдегидом и температурой. Способ включает смешивание 20% раствора желатина с 0,1% раствором глутарового альдегида, приготовленных на изотоническом растворе NaCl или дистиллированной воде, в объемном соотношение растворов 9:1 соответственно, с последующей инкубацией смеси в течение 30 минут при температуре 4°С и экспозиции смеси в чашке Петри в течение 30 минут при температуре 37°С и влажности воздуха 50-70%. Предлагаемый способ позволяет получить модифицированный желатин, обладающий повышенной температурной стойкостью продолжительное время.

 

Данное изобретение относится к биомедицине, а именно к повышению температурной стабильности желатина для изготовления биомедицинских клеточных продуктов.

На сегодняшний день желатин является одним из самых перспективных кандидатов на роль структурного компонента матрикса для биомедицинских клеточных продуктов, так как он обладает низкой стоимостью и хорошей совместимостью с биологическими объектами / 1, Ji S andGuvendiren М (2017) RecentAdvancesinBioinkDesignfor 3D BioprintingofTissuesandOrgans. Front. Bioeng. Biotechnol. 5:23. doi: 10.3389/fbioe.2017.00023/.

Основной минус использования желатина для этих целей заключается в том, что он обладает низкой термостабильностью, теряя свои структурные свойства даже при небольшом повышении температуры. Сегодня существуют различные способы повышениятермостабильности желатина, заключающиеся в использовании токсичных химических веществ, таких как формальдегид, метакриловая кислота / 2, Yue, K. etal. Synthesis, properties, and biomedical applications of gelatin methacryloyl (GelMA) hydrogels.Biomaterials (2015) 73, 254-271. doi: https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2015.08.045/. Данные способы модификации подразумевают повышение степени термостабильности желатина на срок от одного до двух дней.

В связи с этим, основной недостаток данных способов модификации заключается в коротком сроке повышения термостабильности - на 1-2 дня, а также в высокой цитотоксичности, поэтому для решения этой проблемы необходимо дополнительно модифицировать образцы, а также тщательно промывать от остатков используемых для модификации веществ.

В результате проведенного патентно-информационного поиска ближайший аналог выявлен не был.

Техническая проблема, решаемая данным изобретением, состоит в создании способа, позволяющего повысить температурную стойкость желатина на продолжительный срок.

Глутаровый альдегид представляет собой насыщенный альдегид, обладающий бактерицидной активностью / 3 Li В, Shan CL (2013) Synthesis, characterization, andantibacterialactivityofcross-linkedchitosan-glutaraldehyde. DOI: 10.3390/md11051534/. Имеющиеся научные данные свидетельствуют о способности глутарового альдегидаповышать термостойкость коллагена, а также повышать стойкость последнего к воздействию различных химических и физических факторов / 4, Tian Z. etal. Physicochemicalpropertiesofcollagensolutionscross-linkedbyglutaraldehyde. ConnectTissueRes (2014) Jun; 55(3):239-47. doi:10.3109/03008207.2014.898066;/ Данный эффект можно экстраполировать на желатин, так как он является продуктом гидролиза коллагена.

Сущность данного изобретения заключается в приготовлении раствора 20% желатина, смешивании его с 0.1% раствором глутарового альдегида в объемном соотношение растворов - 9: Соответственно, приготовленных на изотоническом растворе NaCl или дистиллированной воде, с дальнейшей инкубацией смеси на 30 минут при температуре 4°С и экспозиции смеси в чашке Петри на 30 минут при температуре 37°С и влажности воздуха 50-70%.

Способ получения модифицированного желатина осуществляют следующим образом. Приготавливают раствор №1 - 20% желатина на изотоническом растворе NaCl или дистиллированной воде, затем помещают его на 30 минут в термостат с температурой 37°С для ускоренного растворения вещества. Приготавливают раствор №2 - 0.1% раствор глутарового альдегида на изотоническом растворе NaCl или дистиллированной воде. После того, как желатин полностью растворится, его раствор охлаждают до комнатной температуры (22-23°С). Производят смешивание раствора №1 и раствора №2 в объемном соотношении 9:1 соответственно. Полученный после смешивания раствор помещают в чашку Петри на 30 минут при температуре 4°С, это позволяет добиться дополнительной полимеризации желатина, связанного с воздействием холодового фактора. Излишки раствора №2, не вступившие в химическую реакцию, удаляются путем двукратного промывания физиологическим раствором или дистиллированной водой образца после полимеризации желатина.

Изобретение было проверено в нескольких экспериментах, основанных на изучении потери стабильности раствора желатина и его модификаций при комнатной температуре (21-22°С) и при 37°С. Получены следующие данные: в исследованиях термостойкости желатина и его модификаций при 37°С, 20% раствор желатина начинал терять стабильность, проявляющуюся в виде растворения, на 60±5 секунде, полная потеря стабильности на 130±10,5 секунде; 20% раствор желатина с добавленным 0.1% раствором глутарового альдегида (объемное соотношение 9:1) - начало растворения на 3-4±0,5 часа, полное растворение - более 72 часов. 20% раствор желатина с добавлением 0.1% раствора глутарового альдегида (объемное соотношение 9:1) и инкубацией при 4°С - начало растворения на 5-6±0,5 часа, полное растворение - более 72 часов. Статистическая значимость полученных результатов оценивалась параметрическим методом с использованием t-критерия Стьюдента при p<0,01. Выявлены достоверные различия времени начала растворения и времени полного растворения образцов 20% желатина и образцов 20% желатина, модифицированных 0.1% раствором глутарового альдегида, что свидетельствует о повышении термостойкости желатина при его модификации глутаровым альдегидом. При этом отличия между образцами с использованием глутарового альдегида и глутарового альдегида с инкубацией при 4°С также статистически значимы. Следовательно, инкубация при 4°С статистически увеличивает температурную стабильность желатина. Также исследовалась температурная стабильность желатина и модифицированного желатина при комнатной температуре (22-23°С). Полученные результаты следующие: термостабильность 20% раствора желатина - 14±0,3 часа, термостабильность 20% раствора желатина, модифицированного 0.1% раствором глутарового альдегида (объемное соотношение 9:1) - более 72 часов, термостабильность 20% раствора желатина, модифицированного 0.1% раствором глутарового альдегида с инкубацией при 4°С - более 72 часов. Данные результаты статистически значимы при p<0,01 при использовании параметрического метода с применением t-критерия Стьюдента.

Технический результат от использования способа - длительное повышение температурной стабильности раствора желатина при модификации глутаровым альдегидом в соотношении 9:1 с инкубацией при 4°С для биомедицинских клеточных продуктов, что может быть

использовано для создания биомедицинского клеточного продукта, например, эквивалента кожи, для лечения термических и трофических повреждений кожи.

Литература:

1. Ji S and Guvendiren М (2017) Recent Advances in Bioink Design for 3D Bioprinting of Tissues and Organs. Front. Bioeng. Biotechnol. 5:23. doi: 10.3389/fbioe.2017.00023

2. Yue, K. et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of gelatin methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials (2015) 73, 254-271. doi: https://doi.Org/10.1016/i.biomaterials.2015.08.045

3. Li B, Shan CL (2013) Synthesis, characterization, and antibacterial activity of cross-linked chitosan-glutaraldehyde. DOI: 10.3390/mdl 1051534;

4. Tian Z. et al. Physicochemical properties of collagen solutions cross-linked by glutaraldehyde. Connect Tissue Res (2014) Jun; 55(3): 239-47. doi: 10.3109/03008207.2014.898066

Способ повышения термостойкости желатина при модификации его глутаровым альдегидом и температурой, включающий смешивание 20% раствора желатина с 0.1% раствором глутарового альдегида, приготовленных на изотоническом растворе NaCl или дистиллированной воде, в объемном соотношение растворов 9:1 соответственно, с последующей инкубацией смеси в течение 30 минут при температуре 4°С и экспозиции смеси в чашке Петри в течение 30 минут при температуре 37°С и влажности воздуха 50-70%.