Иммуноферментная тест-система для определения специфических антител к бактериям moraxella bovoculi в сыворотке крови крупного рогатого скота

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и касается иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета. Раскрыта иммуноферментная тест-система для определения специфических антител к бактериям Moraxella bovoculi в сыворотке крови крупного рогатого скота, которая содержит специфический антиген запатентованного штамма «СХ-Ч6 № - ДЕП» Moraxella bovoculi, полученный путем 3-кратного отмыва их 0,01 М фосфатно-буферным физиологическим раствором и последующим разрушением бактериальных клеток ультразвуком на дезинтеграторе «Bandelin GM3100» при частоте 20 kНz ± 500 Гц в течение 10 мин при 4°С, дальнейшим осаждением антигена Moraxella bovoculi трихлоруксусной кислотой при 5%-ном насыщении и диализом против водопроводной воды, представляющего собой специфический белок в концентрации 9-12 мкг/см³, адсорбированный на поверхности полистироловых лунок в карбонатно-бикарбонатном буфере. Тест-система также включает контрольную положительную сыворотку, полученную к антигену Moraxella bovoculi с титрами антител 1:6400-1:12800 в ИФА, контрольную отрицательную сыворотку, пероксидазный конъюгат против IgG быка, буферные растворы: фосфатно-буферный раствор рН 7,2-7,4 с Твином-20 (детергентом) для разведения контрольных, исследуемых сывороток и промывки панелей; фосфатно-буферный раствор рН 7,2-7,4 для разведения конъюгата; хромоген-субстратный раствор, включающий ортофенилендиамин и перекись водорода, стоп-реагент и панели для постановки реакции иммуноферментного анализа. Тест-система позволяет проводить диагностику инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота и определить напряженность поствакцинального иммунитета с высокой чувствительностью и специфичностью. 2 табл., 5 пр.

 

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии и касается иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета.

Инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота - это острое контагиозное заболевание, характеризующееся слезотечением, гиперемией сосудов конъюнктивы, светобоязнью, серозно-гнойным истечением, помутнением и изъязвлением роговицы, деформацией глазного яблока в виде кератоглобуса или кератоконуса, частичной или полной потерей зрения [1].

Разноречивость взглядов среди исследователей в отношении этиологии болезни, отсутствие методов и средств диагностики и специфической профилактики инфекционного кератоконъюнктивита, завоз племенного поголовья крупного рогатого скота из стран Западной Европы - возможного носителя возбудителя привели к появлению в отдельных регионах стационарно неблагополучных очагов и сохранению тенденции дальнейшего распространения этой болезни. В настоящее время заболевание имеет довольно широкое распространение в скотоводческих хозяйствах многих регионов Российской Федерации. Заболевание причиняет значительный экономический ущерб развитию скотоводства вследствие снижения удоев молока до 50%, прироста массы тела на 31-37%, гибели животных, а также затрат на проведение лечебно-профилактических мероприятий [2, 6].

Причиной инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота является сочетание физического фактора и биологического возбудителя. Ведущая роль при его возникновении принадлежит гемолитическим бактериям Moraxella bovis и Moraxella bovoculi на фоне солнечного ультрафиолетового облучения или других возможных предрасполагающих факторов [2, 3, 4, 7, 8, 9, 10].

Диагноз на инфекционный кератоконъюнктивит устанавливают на основании клиническо-эпизоотологического обследования поголовья крупного рогатого скота и лабораторного исследования патологического материала от больных животных [2, 6].

При подозрении на заболевание животных инфекционным кератоконъюнктивитом в ветеринарную лабораторию направляют нарочным с сопроводительными документами 10-15 проб слезной жидкости от телят в острой стадии болезни. Взятие проб слезной жидкости из пораженных глаз животных производится путем введения сухого стерильного ватного тампона в конъюнктивальный мешок. Полученные пробы доставляют в лабораторию в термосе со льдом.

Выделение чистой культуры возбудителя осуществляют путем первичного посева проб смывов из глаз больных телят на кровяной мясопептонный агар. У изолированных культур изучают морфологические, тинкториальные, культуральные, ферментативные (биохимические) свойства.

Основными критериями для идентификации возбудителя являются: бактерии неподвижны, не образуют спор, окрашиваются грамотрицательно, факультативные аэробы, не ферментируют Сахаров, не редуцируют нитраты в нитриты, не образуют индол, разжижают желатин, пептонизируют лакмусовое молоко, дают положительную реакцию на оксидазу.

Окончательный диагноз устанавливают по результатам бактериологических исследований клинического и патологического материалов, полученных от телят в острой стадии болезни. Диагноз считают подтвержденным, если:

- выделена чистая культура бактерий Moraxella bovis или Moraxella bovoculi с зоной β-гемолиза;

- определена родовая и видовая принадлежность их на основе результатов испытания морфологических, тинкториальных, культуральных и ферментативных свойств;

- подтверждена патогенность гемолитических форм бактерий Moraxella bovis и Moraxella bovoculi по отношению белых мышей.

Недостатками лабораторного метода являются:

- трудоемкость и длительность исследований, требующих для постановки диагноза до 7 рабочих дней;

- высокая себестоимость исследования (дороговизна питательных сред, реактивов, затраты на приобретение и содержание лабораторных животных).

В настоящее время для диагностики многих инфекционных заболеваний применяют серологические методы (РСК, РДП, РНГА, ИФА и др.), позволяющие по титрам специфических антител в сыворотке крови выявлять больных животных, а также определять напряженность иммунитета у вакцинированных животных.

В ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» разработана ассоциированная вакцина против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и Moraxella bovoculi [5]. Однако на сегодняшний день в РФ не разработан метод определения специфических антител к бактериям Moraxella bovoculi в сыворотке крови животных, что затрудняет контроль антигенной активности вакцины и напряженности поствакцинального иммунитета.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, состоит в определении специфических антител к бактериям Moraxella bovoculi в сыворотке крови крупного рогатого скота, обладающей высокой специфичностью и чувствительностью для диагностики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота среди невакцинированного поголовья и контроля напряженности поствакцинального иммунитета у вакцинированных животных. В качестве основного компонента в иммуноферментной тест-системе используется антиген, изготовленный из штамма «СХ-Ч6 № - ДЕП» бактерий Moraxella bovoculi.

Штамм бактерий Moraxella bovoculi «СХ-Ч6 № - ДЕП» характеризуется следующими свойствами: бактерии представляют собой грамотрицательные диплококки с редко встречающимися кокками диметром 0,7-1,3 мкм, спор не образует. На кровяном МПА формирует колонии белого цвета диаметром ≤1 мм, круглые, выпуклые, с ровными краями, зоной β-гемолиза. Факультативный аэроб, не ферментирует сахаров, не образует индол. Не разжижает желатину; дает положительную реакцию на оксидазу и отрицательную - на пробу с лакмусовым молоком. Штамм характеризуется полным набором антигенов, типичных для бактерий рода Moraxella.

Штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве под регистрационным номером: «Штамм Moraxella bovoculi «СХ-Ч6 № - ДЕП» инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота».

Для достижения названного технического результата иммуноферментная тест-система для определения специфических антител к бактериям Moraxella bovoculi в сыворотке крови крупного рогатого скота содержит специфический антиген запатентованного нами штамма «СХ-Ч6-ДЕП» бактерий Moraxella bovoculi [4], полученного путем 3-х кратного отмыва их 0,01М фосфатно-буферным физиологическим раствором, с последующим разрушением бактериальных клеток ультразвуком на дезинтеграторе «Bandelin GM3100» при частоте 20 kНz ± 500 Гц в течение 10 мин при 4°С, дальнейшим осаждением антигена Moraxella bovoculi трихлоруксусной кислотой при 5%-ном насыщении и диализом против водопроводной воды, представляющего собой специфический белок в концентрации 9-12 мкг/см³, адсорбированный на поверхности полистироловых лунок в карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,6), контрольную положительную сыворотку, полученную к антигену Moraxella bovoculi с титрами антител 1:6400 - 1:12800 в ИФА, контрольную отрицательную сыворотку, пероксидазный конъюгат против IgG быка, буферные растворы: фосфатно-буферный раствор рН 7,2-7,4 с Твином-20 (детергентом) для разведения контрольных, исследуемых сывороток и промывки панелей; фосфатно-буферный раствор рН 7,2-7,4 для разведения конъюгата; хромоген-субстратный раствор, включающий ортофенилендиамин и перекись водорода, стоп-реагент и панели для постановки реакции иммуноферментного анализа.

Предлагаемый иммуноферментный метод универсален, обладает высокой специфичностью и чувствительностью, не требует сложного оборудования и приемлем для проведения анализов в массовых количествах. Его можно использовать как для диагностики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота среди невакцинированного поголовья в стационарно неблагополучных хозяйствах, так и для определения напряженности поствакцинального иммунитета и изучения иммунного статуса у вакцинированных животных. Время исследования составляет всего 4-5 часов, тогда как существующие в настоящее время лабораторные исследования - до 7 дней.

Тест-система для выявления специфических антител к бактериям Moraxella bovoculi методом иммуноферментного анализа (ИФА) рассчитан для проведения на одном планшете одновременного анализа 46 исследуемых проб сывороток крови в одном разведении (в двух повторах) и 2 контрольных сывороток (в двух повторах) или 22 исследуемых проб сывороток крови (в четырех разведениях) и 2 контрольных сывороток (в четырех разведениях) или 10 проб сывороток крови в восьми разведениях и 2 контрольных сывороток (в восьми разведениях).

В состав предлагаемой тест-системы ИФА входят:

- планшеты для иммуноферментного анализа с адсорбированным антигеном бактерий Moraxella bovoculi - 2 шт.

-№1.-контрольная положительная сыворотка (К⁺), 1 см³ - 1 ампулы.

- №2.- контрольная отрицательная сыворотка (К^-), 1 см³ - 1 ампулы.

- №3 - 25-кратный концентрат фосфатно-буферного раствора с Твином-20 для промывки планшетов (ФБР-Т), 20 см³ - 2 флакона.

- №4 - буфер для разведения конъюгата (БРК), 10 см³ - 1 флакон.

- №5 - антитела к иммуноглобулину G (IgG) крупного рогатого скота, меченые пероксидазой хрена (конъюгат), 0,2 см³ - 1 ампула.

- №6 - фостфатно-цитратный буфер (ФЦБ), 10 см³ - 2 флакона.

- №7 - хромоген, ортофенилендиамин (ОФД), 4 мг - 2 флакона.

- №8 - перекись водорода (Н₂O₂) 3% р-р, 10 см³ - 1 флакон.

- №9 - 0,1М серная кислота (стоп-реагент), 10 см³ - 2 флакона.

По внешнему виду контрольные положительная и отрицательная сыворотки - гомогенная аморфная масса светло-желтого цвета, антивидовой пероксидазный конъюгат против IgG быка - гомогенная аморфная масса серого цвета, а растворы: ФБР-Т, БРК, ФЦБ, стоп-реагент - прозрачные, бесцветные жидкости, ортофенилендиамин (ОФД) - светло-желтый кристаллический порошок.

Пример 1. Приготовление компонентов набора.

Приготовление антигена. В заявляемой тест-системе ИФА, предназначенной для выявления и количественного определения антител к бактериям Moraxella bovoculi, специфический антиген готовят используя штамм «СХ-Ч6 № - ДЕП» возбудителя инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота.

Для получения биомассы бактерий Moraxella bovoculi используют МПА, содержащий 10% дефибринированной крови барана. С этой целью указанную среду в стерильных условиях разливают в 1,5 литровые матрасы по 250-300 см³, после застывания среды делают посевы штамма «СХ-Ч6 № - ДЕП» путем внесения в каждый матрас по 10 см³ бактериальной суспензии, содержащей 1 млрд. м. к. в 1 см³. Посевы культивируют при 37°С в течение 24-36 часов.

Выросшие колонии бактерий Moraxella bovoculi смывают 0,01М фосфатно-буферным физиологическим раствором (рН 7,2) и трижды отмывают в режиме центрифугирования при 2000 об/мин в течение 20 минут. Осадок ресуспендируют фосфатно-буферным физиологическим раствором и проводят дезинтеграцию бактериальной массы на дезинтеграторе «Bandelin GM3100» при частоте 20 кНг ± 500Гц в течение 10 минут. После дезинтеграции суспензию бактерий Moraxella bovoculi осветляют центрифугированием при 2000 об/мин в течение 45 минут. В надосадочную жидкость, содержащую антиген к бактериям М. bovoculi, добавляют трихлоруксусную кислоту (ТХУ), доводя до 5% концентрации. Осадок дважды промывают в режиме центрифугирования 5% раствором ТХУ, затем осадок ресуспендирут в дистиллированной воде и проводят диализ против водопроводной воды в течение 18-20 часов. Полученный антиген ресуспендируют в карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,6), содержащем мертиолят в конечной концентрации 0,01-0,02%.

Для стандартизации в антигене определяют количество белка на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 280 нм и 235 нм с поправкой на разведение в кювете по следующей формуле:

, где:

- ОП₂₃₅; ОП₂₈₀ - оптическая плотность при длине волны 235 и 280 нм, соответственно;

- 30 - разведение исследуемого образца в кювете (1:30).

По результатам шахматного титрования антигена и контрольных сывороток устанавливают в ИФА оптимальную рабочую концентрацию бактериального антигена, которая в данном случае составила 9-12 мкг/см³.

Пример 2. Приготовление контрольных сывороток.

2.1. Изготовление контрольной положительной сыворотки к антигену бактерий Moraxella bovoculi осуществляют путем гипериммунизации клинически здорового молодняка крупного рогатого скота 6-7-месячного возраста. Для этой цели применяют корпускулярный антиген производственного штамма бактерий Moraxella bovoculi «СХ-Ч6-ДЕП». Корпускулярный антиген представляет собой инактивированные формалином бактерии Moraxella bovoculi, содержащий 10 млрд. м.к. в 1 см³.

Гипериммунизацию животных проводят 4-х кратно с интервалом 14 дней. При этом животным вводят корпускулярный антиген подкожно в нарастающих дозах. Для предупреждения анафилактического шока, начиная со второго цикла иммунизации, животным вводят по 2 см³ антигена подкожно за 30-40 минут до введения основной дозы антигена. Схема гиперимунизации быков-продуцентов представлена в таблице 1.

Через 20 дней после последнего введения антигена у животных из яремной вены берут пробу крови для определения титра специфических антител. Производственное взятие крови разрешается при наличии антител в сыворотке крови быков-продуцентов к Moraxella bovoculi в титрах 1:6400 - 1:12800 в ИФА и при условии, если общая температура тела животных не превышает 39,5°С, а также после предварительной выдержки животных на голодной диете в течение 12 ч при неограниченном водопое.

2.2. Приготовление отрицательной контрольной сыворотки.

Контрольную отрицательную сыворотку получают от молодняка крупного рогатого скота 6-7-месячного возраста из хозяйства, свободного от инфекционного кератоконъюнктивита, после выдерживания их в карантине в течение 2 месяцев. У клинически здоровых неиммунизированных животных, не содержащих специфических антител к бактериям Moraxella bovoculi, проводят стерильное взятие крови из яремной вены из расчета 600 см³ крови на 100 кг массы животного. Кровь выдерживают 2 ч при температуре 20-22°С, затем обводят и отстаивают при температуре 4°С. Отстоявшуюся сыворотку отсасывают во флаконы в стерильных условиях, расфасовывают в ампулы по 1 см³ и лиофилизируют.

Пример 3. Стандартизация основных условий проведения исследований, заявляемой тест-системой ИФА.

3.1. Проводят подбор концентрации антигена для адсорбции на полистироловый 96-луночный планшет. При этом оценивается интенсивность иммуноферментной реакции при следующих концентрациях антигена в растворе: 3, 6, 9, 12 мкг/см³. С целью изучения влияния температуры и времени экспозиции на сорбцию антигена в лунках планшета испытывали режимы иммобилизации в течение 18 и 24 ч при температуре 4°С и 2 и 3 ч - при 37°С. В качестве тестируемых образцов используют положительную и отрицательную контрольные сыворотки крови.

Процесс адсорбции антигена оценивали по интенсивности реакции с контрольными сыворотками в серийных разведениях.

Проводили подбор концентрации адсорбции антигена при параллельном тестировании различных разведений конъюгата (1:1000, 1:2500, 1:3000).

Результаты исследований показали, что максимальное значение коэффициента специфичности отмечается при адсорбции антигена в дозе 9-12 мкг/см³ при температуре 4°С в течение 18 ч и разведении конъюгата 1:2500. Использование других концентраций антигена приводит к снижению специфичности реакции. Таким образом, были определены оптимальные параметры антигена и разведения конъюгата, которые будут использованы для дальнейшей работы.

3.2. Определение оптимального времени экспозиции исследуемых сывороток.

Процесс образования стабильных иммунных комплексов в тест-системе ИФА является сложным процессом и требует определенного времени, для установления которого в 3-х повторностях оценивалась интенсивность реакции в зависимости от времени инкубации положительных и отрицательных сывороток в серийных разведениях при температуре 37°С.

При этом конъюгат использовался в рабочем разведении 1:2500. Установлено, что показатели оптической плотности исследуемых сывороток в диапазоне от 30 до 60 мин возрастали и стабилизировались, при этом коэффициент специфичности оставался максимальным.

На этом основании 60-минутная экспозиция сывороток оказалась оптимальной для достижения максимальной и стабильной реакции.

3.3. Определение позитивно-негативного порога тест-системы ИФА

Для учета и интерпретации результатов, полученных тест-системой ИФА, определен позитивно-негативный порог тест-системы, который находится в диапазоне <35% - >45%. В дальнейшем все пробы, значение Ксв которых было меньше позитивно-негативного порога, считали отрицательными, а пробы со значением Ксв равным или превышающим этот показатель положительными.

Пример 4. Иллюстрация применения тест-системы ИФА.

4.1. Подготовка биологического материала для исследования.

Для анализа используют сыворотку крови крупного рогатого скота. Если анализ проводят в течение 24 ч после отбора, образцы биоматериала хранят при температуре 4°С. При более длительном хранении образцы замораживают при температуре -20°С. Перед исследованием замороженные образцы быстро (в течение 5-10 мин) нагревают в водяной бане при температуре 37°С. В случае выпадения осадка эритроцитов или белка пробы обязательно осветляют центрифугированием в течение 10 мин при 2000 g. Многократное замораживание и оттаивание образцов не допускается.

4.2. Подготовка рабочих растворов и реагентов.

Перед началом работы все компоненты выдерживают не менее 30 мин при комнатной температуре и тщательно перемешивают.

Фосфатно-буферный раствор с Твином-20 (ФБР-Т), предназначенный для растворения контрольных, исследуемых сывороток крови и промывки планшет, готовят следующим образом: содержимое флакона №3 с 25-кратным концентратом фосфатно-буферного раствора с Твином-20 (детергент) доводят свежеприготовленной дистиллированной водой до 500 см. Рабочий раствор буфера представляет собой прозрачный раствор с рН 7,2-7,4. Рабочий раствор стабилен при температуре 4°С в течение 3 суток.

Буфер для разведения конъюгата представляет собой прозрачный фосфатно-буферный раствор (БРК) без Твина-20 с рН 7,2-7,4 - флакон №4. Перед использованием конъюгат 0,2 см³ (ампула №5) растворить в 10 см³ фосфатно-буферного раствора (БРК) флакон №4. Для приготовления рабочего 25-кратного разведения (1:2500) необходимо к 0,01 см³ конъюгата добавить 25 см³ фосфатно-буферного раствора с Твином-20 (ФБР-Т).

Хромоген-субстратный раствор (субстратно-индикаторная смесь) готовят непосредственно перед использованием в реакции ИФА. Для этого 4 мг ОФД содержимого флакона №7 растворяют в 10 см³ фосфатно-цитратного буфера (флакон №6) и добавляют 0,14 см³ 3%-ного раствора перекиси водорода (флакон №8) и перемешивают. Раствор должен быть прозрачным и иметь светло-желтый цвет. Приготовление хромоген-субстратного раствора известно из пат. RU №2488117.

Контрольную положительную сыворотку - 1 см³ (ампула №1) растворяют в 1 см³ фосфатно-буферного раствора с Твином-20 (ФБР-Т).

Контрольную отрицательную сыворотку - 1 см³ (ампула №2) растворяют в 1 см³ фосфатно-буферного раствора с Твином-20 (ФБР-Т).

Стоп-реагент (0,1М серная кислота) флакон №9 - готов к использованию.

Все исходные компоненты тест-системы стабильны до истечения срока годности. Не переливать в другую посуду! Не смешивать компоненты из наборов разных серий!

4.3. Проведение иммуноферментного анализа.

Иммуноферментный анализ (ИФА) проводят в непрямом твердофазном варианте с использованием компонентов, входящих в состав набора препаратов для выявления специфических антител к бактериям Moraxella bovoculi методом иммуноферментного анализа (ИФА).

Перед началом работы планшет трехкратно промывают рабочим раствором ФБР-Т в объеме 0,15 см, в каждом случае полностью удаляя жидкость постукиванием перевернутого планшета по фильтровальной бумаге.

При исследовании в одном разведении исследуемые и контрольные сыворотки используют в разведении 1:200 фосфатно-буферным раствором с твином (ФБР-Т). Например, к 0,99 cм³ ФБР-Т добавляют 0,005 см³ исследуемой сыворотки.

В лунки E12-F12 вносят по 0,1 см³ К⁺ в рабочем разведении 1:200.

В лунки G12-H12 вносят по 0,1 см³ К^- в рабочем разведении 1:200.

В остальные лунки планшета вносят по 0,1 см³ исследуемой пробы (ИП) сыворотки в разведении 1:200 (по две лунки на каждый образец сыворотки) по следующей схеме:

При исследовании в 4-х разведениях исследуемые и контрольные сыворотки используют в разведении 1:100. Например, к 0,99 см³ ФБР-Т добавляют 0,01 см³ исследуемой сыворотки.

Предварительно во все лунки планшета вносят по 0,1 см³ ФБР-Т.

В лунку E11 вносят по 0,1 см³ К⁺ в рабочем разведении 1:100

В лунку Е12 вносят по 0,1 см³ К^- в рабочем разведении 1:100.

В остальные лунки вертикального ряда планшета (А1-А12) вносят по 0,1 см³ исследуемой сыворотки в разведении 1:100 и проводят последовательные двукратные разведения в четырех лунках по следующей схеме:

При исследовании в 8-ми разведениях исследуемые и контрольные сыворотки используют в разведении 1:50. Например, к 0,49 см³ ФБР-Т добавляют 0,01 см³ исследуемой сыворотки.

Предварительно во все лунки планшета вносят по 0,1 см³ ФБР-Т.

В лунку A11 вносят по 0,1 см³ К⁺ в рабочем разведении 1:50

В лунку А12 вносят по 0,1 см³ К^- в рабочем разведении 1:50.

В остальные лунки вертикального ряда планшета (А1-А10) вносят по 0,1 см исследуемой сыворотки в разведении 1:50 и проводят последовательные двукратные разведения в восьми лунках от 1:100 до 1:12800.

Планшет закрывают крышкой и инкубируют при 37±0,5°С в течение 1 часа.

Планшет 3 раза промывают буфером ФБР-Т (по 0,15 см³), раствор удаляют встряхиванием, с последующим постукиванием по фильтровальной бумаге до полного удаления остатков раствора со стенок и дна лунок планшета.

Внесение иммунопероксидазного конъюгата. В каждую лунку добавляют по 0,1 см³ раствора конъюгата в рабочем разведении. Планшет закрывают крышкой и инкубируют при 37±0,5°С в течение 1 часа.

Планшет 3 раза промывают буфером ФБР-Т.

Внесение субстратно-индикаторной смеси. В каждую лунку вносят по 0,1 см³ рабочего хромоген-субстратного раствора. Планшет закрывают крышкой и инкубируют в темноте 5-15 мин при комнатной температуре.

Остановка реакции. Не сливая содержимого, во все лунки планшета добавляют 0,1 см³ стоп-реагента (0,1 М раствор серной кислоты).

4.4. Учет и интерпретация результатов реакции.

Результаты ИФА учитывают после остановки реакции по показаниям оптической плотности субстратно-индикаторной смеси на спектрофотометре при длине волны 490 нм (ОП₄₉₀).

При спектрофотометрическом учете результатов исследований сывороток крови в одном разведении производят следующие расчеты:

- Вычисляют среднее арифметическое значение оптической плотности (ОП₄₉₀) для проб К⁺ (ОП₄₉₀К⁺ ср);

- Вычисляют среднее арифметическое значение оптической плотности (ОП₄₉₀) для проб К^- (ОП₄₉₀К^- ср);

- Вычисляют среднее арифметическое значение оптической плотности (ОП₄₉₀) для каждой испытуемой пробы ИП (ОП₄₉₀ ИП_ср);

- Вычисляют коэффициент связывания (Ксв) конъюгата сывороточными антителами по формуле:

где:

Пробу считают отрицательной, если величина Ксв менее 35%.

Если величина Ксв более 45% пробу считают положительной.

Обнаружение положительных проб сывороток крови в одном разведении (1:200) при эпизоотологическом обследовании животных, ранее не вакцинированных против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота, свидетельствует о циркуляции в стаде возбудителя болезни.

При учете результатов исследований сывороток крови в четырех или восьми разведениях производят расчет коэффициента специфичности, который равен отношению оптической плотности продукта реакции в лунках с контрольной положительной (ОП₄₉₀К⁺) или исследуемой сывороткой (ОП₄₉₀ ИП) к оптической плотности контрольной отрицательной сыворотки (ОП₄₉₀ К^-). Реакцию считают положительной, если коэффициент специфичности выше 2,1 и отрицательной, если ниже 2,1.

Выявление динамики роста специфических антител в парных пробах сывороток крови, при исследовании образцов в четырех разведениях с целью серологической диагностики, позволяет диагностировать инфекцию у исследованного поголовья.

По результатам исследования сывороток в восьми разведениях определяют напряженность иммунитета крупного рогатого скота через 2-3 недели после второй вакцинации путем деления количества проб с титром антител 1:800 и выше к общему количеству исследованных сывороток и выражают в процентах. Крупный рогатый скот считают иммунными к инфекционному кератоконъюнктивиту при напряженности иммунитета у 85 и более процентов животных.

Пример 5. Испытание тест-системы ИФА в производственных условиях.

При производственном испытании эффективности набора были использованы образцы крови крупного рогатого скота, доставленные из различных в эпизоотическом отношении по инфекционному кератоконъюнктивиту скотоводческих хозяйств Республики Татарстан. При этом исследовались сыворотки крови от больных, не вакцинированных и здоровых, вакцинированных животных из неблагополучных по инфекционному кератоконъюнктивиту хозяйств, а также от интактных животных из благополучных хозяйств. Результаты исследования сывороток крови представлены в таблице 2. Из таблицы видно, что компоненты набора обладают высокой специфичностью в ИФА. Они позволяют определить специфические антитела к бактериям Moraxella bovoculi у 97,3% здоровых вакцинированных животных и 95,8% больных инфекционным кератоконъюнктивитом животных.

В то же время установлено, что компоненты набора не реагируют с сыворотками крови, полученными от интактных животных из благополучных по инфекционному кератоконъюнктивиту хозяйств.

Таким образом, предлагаемая тест-система позволяет с высокой специфичностью и чувствительностью по титрам специфических антител в сыворотке крови выявлять больных животных среди невакцинированного поголовья и определить напряженность иммунитета у вакцинированных животных.

Источники информации

1. Гаффаров, Х.З. Клинико-эпизоотологические особенности инфекционных диарей новорожденных телят и основные принципы их профилактики и лечения / Х.З. Гаффаров, Г. Н. Спиридонов, Ф.В. Елисеева, М.А. Ефимова и др. // Труды первого съезда вет. врачей РТ. - Казань. - 1995. - С. 163-167.

2. Гаффаров, Х.З. Инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота / Х.З. Гаффаров, А.В. Иванов, Л.В. Валебная, Г.Н. Спиридонов, Л.Ш. Дуплева, М.А. Ефимова // Ветеринария. - М. - 2007. - №12. - С. 21-24.

3. Карайченцев, Д.В. Совершенствование лабораторной диагностики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота: автореф. дис. … к. вет. наук. / Д.В. Карайченцев. - М., 2016. - 23 с.

4. Патент Российской Федерации. Штамм бактерий Moraxella bovoculi «СХ-Ч6 № - ДЕП», используемый для изготовления диагностикумов и вакцин против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота / А.В. Иванов, Г.Н. Спиридонов, А.А. Иванов, Л.В. Валебная, Ю.В. Юсупова, А.Г. Спиридонов, А.Р. Нургалиева, Х.Н. Макаев; заявитель ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности». - №2521651; опубл. 10.07.2014, Бюл. №19.

5. Патент Российской Федерации. Вакцина против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и Moraxella bovoculi / Г. Н. Спиридонов, А.В. Иванов, А.Н. Чернов, А.Г. Спиридонов, А.А. Иванов, Л.В. Валебная, Х.Н. Макаев, Р.Х. Юсупов, Л.Ш. Дуплева; заявитель и патентообладатель ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности». - №2589819; опубл. 10.07.2016, Бюл. №19.

6. Спиридонов, Г.Н. Инфекционный кератоконьюнктивит крупного рогатого скота / Г.Н. Спиридонов // Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных. - Труды межд. научн.-произвол, конф., посвященной 50-летию ВНИИВВиМ. - том 2. - Покров. - 2008. - С. 195-197.

7. Angelos, J.A. Moraxella bovoculi sp. nov., isolated from calves with infectious bovine keratoconjunctivitis / J.A. Angelos, P.Q. Spinks, L.M. Ball, L.W. George // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. - 2007. - V. 57. - P. 789-795.

8. Angelos, J.A. Differentiation of Moraxella bovoculi sp. nov. from other coccoid moraxellae by the use of polymerase chain reaction and restriction endonuclease analysis of amplified DNA / J.A. Angelos, L.M. Ball // J. Vet. Diagn. Invest. - 2007. - V. 19 - P. 532-534.

9. K.N. Ulcerative blepharitis and conjunctivitis in adult dairy cows and association with Moraxella bovoculi / N. K. J. A. Angelos // Can Vet J. - 2010. - V. 51(4). -P. 400-402.

10. Lapper, A.W.D. Vaccination against infectious bovine keratoconjunctivitis: protective efficacy and antibody response induced by by pili of homologous und heterologous Strains of Moraxella bovis / A.W.D. Lapper. // Austr. Vet. J. - 1988. - 65-10 - P. 129-138.

Иммуноферментная тест-система для определения специфических антител к бактериям Moraxella bovoculi в сыворотке крови крупного рогатого скота, отличающаяся тем, что она содержит специфический антиген запатентованного штамма «СХ-Ч6 № - ДЕП» Moraxella bovoculi, полученный путем 3-кратного отмыва их 0,01М фосфатно-буферным физиологическим раствором и последующим разрушением бактериальных клеток ультразвуком на дезинтеграторе «Bandelin GM3100» при частоте 20 kНz ± 500 Гц в течение 10 мин при 4°С, дальнейшим осаждением антигена Moraxella bovoculi трихлоруксусной кислотой при 5%-ном насыщении и диализом против водопроводной воды, представляющего собой специфический белок в концентрации 9-12 мкг/см³, адсорбированный на поверхности полистироловых лунок в карбонатно-бикарбонатном буфере, контрольную положительную сыворотку, полученную к антигену Moraxella bovoculi с титрами антител 1:6400-1:12800 в ИФА, контрольную отрицательную сыворотку, пероксидазный конъюгат против IgG быка, буферные растворы: фосфатно-буферный раствор рН 7,2-7,4 с Твином-20 (детергентом) для разведения контрольных, исследуемых сывороток и промывки панелей; фосфатно-буферный раствор рН 7,2-7,4 для разведения конъюгата; хромоген-субстратный раствор, включающий ортофенилендиамин и перекись водорода, стоп-реагент и панели для постановки реакции иммуноферментного анализа.