Иммуноферментная тест-система для определения специфических антител к бактериям moraxella bovoculi в сыворотке крови крупного рогатого скота



Иммуноферментная тест-система для определения специфических антител к бактериям moraxella bovoculi в сыворотке крови крупного рогатого скота
Иммуноферментная тест-система для определения специфических антител к бактериям moraxella bovoculi в сыворотке крови крупного рогатого скота
Иммуноферментная тест-система для определения специфических антител к бактериям moraxella bovoculi в сыворотке крови крупного рогатого скота
Иммуноферментная тест-система для определения специфических антител к бактериям moraxella bovoculi в сыворотке крови крупного рогатого скота
Иммуноферментная тест-система для определения специфических антител к бактериям moraxella bovoculi в сыворотке крови крупного рогатого скота
Иммуноферментная тест-система для определения специфических антител к бактериям moraxella bovoculi в сыворотке крови крупного рогатого скота
Иммуноферментная тест-система для определения специфических антител к бактериям moraxella bovoculi в сыворотке крови крупного рогатого скота
G01N2800/00 - Исследование или анализ материалов путем определения их химических или физических свойств (разделение материалов вообще B01D,B01J,B03,B07; аппараты, полностью охватываемые каким-либо подклассом, см. в соответствующем подклассе, например B01L; измерение или испытание с помощью ферментов или микроорганизмов C12M,C12Q; исследование грунта основания на стройплощадке E02D 1/00;мониторинговые или диагностические устройства для оборудования для обработки выхлопных газов F01N 11/00; определение изменений влажности при компенсационных измерениях других переменных величин или для коррекции показаний приборов при изменении влажности, см. G01D или соответствующий подкласс, относящийся к измеряемой величине; испытание

Владельцы патента RU 2687747:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЙ, РАДИАЦИОННОЙ И БИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ" (ФГБНУ "ФЦТРБ-ВНИВИ") (RU)

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и касается иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета. Раскрыта иммуноферментная тест-система для определения специфических антител к бактериям Moraxella bovoculi в сыворотке крови крупного рогатого скота, которая содержит специфический антиген запатентованного штамма «СХ-Ч6 № - ДЕП» Moraxella bovoculi, полученный путем 3-кратного отмыва их 0,01 М фосфатно-буферным физиологическим раствором и последующим разрушением бактериальных клеток ультразвуком на дезинтеграторе «Bandelin GM3100» при частоте 20 kНz ± 500 Гц в течение 10 мин при 4°С, дальнейшим осаждением антигена Moraxella bovoculi трихлоруксусной кислотой при 5%-ном насыщении и диализом против водопроводной воды, представляющего собой специфический белок в концентрации 9-12 мкг/см3, адсорбированный на поверхности полистироловых лунок в карбонатно-бикарбонатном буфере. Тест-система также включает контрольную положительную сыворотку, полученную к антигену Moraxella bovoculi с титрами антител 1:6400-1:12800 в ИФА, контрольную отрицательную сыворотку, пероксидазный конъюгат против IgG быка, буферные растворы: фосфатно-буферный раствор рН 7,2-7,4 с Твином-20 (детергентом) для разведения контрольных, исследуемых сывороток и промывки панелей; фосфатно-буферный раствор рН 7,2-7,4 для разведения конъюгата; хромоген-субстратный раствор, включающий ортофенилендиамин и перекись водорода, стоп-реагент и панели для постановки реакции иммуноферментного анализа. Тест-система позволяет проводить диагностику инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота и определить напряженность поствакцинального иммунитета с высокой чувствительностью и специфичностью. 2 табл., 5 пр.

 

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии и касается иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета.

Инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота - это острое контагиозное заболевание, характеризующееся слезотечением, гиперемией сосудов конъюнктивы, светобоязнью, серозно-гнойным истечением, помутнением и изъязвлением роговицы, деформацией глазного яблока в виде кератоглобуса или кератоконуса, частичной или полной потерей зрения [1].

Разноречивость взглядов среди исследователей в отношении этиологии болезни, отсутствие методов и средств диагностики и специфической профилактики инфекционного кератоконъюнктивита, завоз племенного поголовья крупного рогатого скота из стран Западной Европы - возможного носителя возбудителя привели к появлению в отдельных регионах стационарно неблагополучных очагов и сохранению тенденции дальнейшего распространения этой болезни. В настоящее время заболевание имеет довольно широкое распространение в скотоводческих хозяйствах многих регионов Российской Федерации. Заболевание причиняет значительный экономический ущерб развитию скотоводства вследствие снижения удоев молока до 50%, прироста массы тела на 31-37%, гибели животных, а также затрат на проведение лечебно-профилактических мероприятий [2, 6].

Причиной инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота является сочетание физического фактора и биологического возбудителя. Ведущая роль при его возникновении принадлежит гемолитическим бактериям Moraxella bovis и Moraxella bovoculi на фоне солнечного ультрафиолетового облучения или других возможных предрасполагающих факторов [2, 3, 4, 7, 8, 9, 10].

Диагноз на инфекционный кератоконъюнктивит устанавливают на основании клиническо-эпизоотологического обследования поголовья крупного рогатого скота и лабораторного исследования патологического материала от больных животных [2, 6].

При подозрении на заболевание животных инфекционным кератоконъюнктивитом в ветеринарную лабораторию направляют нарочным с сопроводительными документами 10-15 проб слезной жидкости от телят в острой стадии болезни. Взятие проб слезной жидкости из пораженных глаз животных производится путем введения сухого стерильного ватного тампона в конъюнктивальный мешок. Полученные пробы доставляют в лабораторию в термосе со льдом.

Выделение чистой культуры возбудителя осуществляют путем первичного посева проб смывов из глаз больных телят на кровяной мясопептонный агар. У изолированных культур изучают морфологические, тинкториальные, культуральные, ферментативные (биохимические) свойства.

Основными критериями для идентификации возбудителя являются: бактерии неподвижны, не образуют спор, окрашиваются грамотрицательно, факультативные аэробы, не ферментируют Сахаров, не редуцируют нитраты в нитриты, не образуют индол, разжижают желатин, пептонизируют лакмусовое молоко, дают положительную реакцию на оксидазу.

Окончательный диагноз устанавливают по результатам бактериологических исследований клинического и патологического материалов, полученных от телят в острой стадии болезни. Диагноз считают подтвержденным, если:

- выделена чистая культура бактерий Moraxella bovis или Moraxella bovoculi с зоной β-гемолиза;

- определена родовая и видовая принадлежность их на основе результатов испытания морфологических, тинкториальных, культуральных и ферментативных свойств;

- подтверждена патогенность гемолитических форм бактерий Moraxella bovis и Moraxella bovoculi по отношению белых мышей.

Недостатками лабораторного метода являются:

- трудоемкость и длительность исследований, требующих для постановки диагноза до 7 рабочих дней;

- высокая себестоимость исследования (дороговизна питательных сред, реактивов, затраты на приобретение и содержание лабораторных животных).

В настоящее время для диагностики многих инфекционных заболеваний применяют серологические методы (РСК, РДП, РНГА, ИФА и др.), позволяющие по титрам специфических антител в сыворотке крови выявлять больных животных, а также определять напряженность иммунитета у вакцинированных животных.

В ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» разработана ассоциированная вакцина против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и Moraxella bovoculi [5]. Однако на сегодняшний день в РФ не разработан метод определения специфических антител к бактериям Moraxella bovoculi в сыворотке крови животных, что затрудняет контроль антигенной активности вакцины и напряженности поствакцинального иммунитета.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, состоит в определении специфических антител к бактериям Moraxella bovoculi в сыворотке крови крупного рогатого скота, обладающей высокой специфичностью и чувствительностью для диагностики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота среди невакцинированного поголовья и контроля напряженности поствакцинального иммунитета у вакцинированных животных. В качестве основного компонента в иммуноферментной тест-системе используется антиген, изготовленный из штамма «СХ-Ч6 № - ДЕП» бактерий Moraxella bovoculi.

Штамм бактерий Moraxella bovoculi «СХ-Ч6 № - ДЕП» характеризуется следующими свойствами: бактерии представляют собой грамотрицательные диплококки с редко встречающимися кокками диметром 0,7-1,3 мкм, спор не образует. На кровяном МПА формирует колонии белого цвета диаметром ≤1 мм, круглые, выпуклые, с ровными краями, зоной β-гемолиза. Факультативный аэроб, не ферментирует сахаров, не образует индол. Не разжижает желатину; дает положительную реакцию на оксидазу и отрицательную - на пробу с лакмусовым молоком. Штамм характеризуется полным набором антигенов, типичных для бактерий рода Moraxella.

Штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве под регистрационным номером: «Штамм Moraxella bovoculi «СХ-Ч6 № - ДЕП» инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота».

Для достижения названного технического результата иммуноферментная тест-система для определения специфических антител к бактериям Moraxella bovoculi в сыворотке крови крупного рогатого скота содержит специфический антиген запатентованного нами штамма «СХ-Ч6-ДЕП» бактерий Moraxella bovoculi [4], полученного путем 3-х кратного отмыва их 0,01М фосфатно-буферным физиологическим раствором, с последующим разрушением бактериальных клеток ультразвуком на дезинтеграторе «Bandelin GM3100» при частоте 20 kНz ± 500 Гц в течение 10 мин при 4°С, дальнейшим осаждением антигена Moraxella bovoculi трихлоруксусной кислотой при 5%-ном насыщении и диализом против водопроводной воды, представляющего собой специфический белок в концентрации 9-12 мкг/см3, адсорбированный на поверхности полистироловых лунок в карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,6), контрольную положительную сыворотку, полученную к антигену Moraxella bovoculi с титрами антител 1:6400 - 1:12800 в ИФА, контрольную отрицательную сыворотку, пероксидазный конъюгат против IgG быка, буферные растворы: фосфатно-буферный раствор рН 7,2-7,4 с Твином-20 (детергентом) для разведения контрольных, исследуемых сывороток и промывки панелей; фосфатно-буферный раствор рН 7,2-7,4 для разведения конъюгата; хромоген-субстратный раствор, включающий ортофенилендиамин и перекись водорода, стоп-реагент и панели для постановки реакции иммуноферментного анализа.

Предлагаемый иммуноферментный метод универсален, обладает высокой специфичностью и чувствительностью, не требует сложного оборудования и приемлем для проведения анализов в массовых количествах. Его можно использовать как для диагностики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота среди невакцинированного поголовья в стационарно неблагополучных хозяйствах, так и для определения напряженности поствакцинального иммунитета и изучения иммунного статуса у вакцинированных животных. Время исследования составляет всего 4-5 часов, тогда как существующие в настоящее время лабораторные исследования - до 7 дней.

Тест-система для выявления специфических антител к бактериям Moraxella bovoculi методом иммуноферментного анализа (ИФА) рассчитан для проведения на одном планшете одновременного анализа 46 исследуемых проб сывороток крови в одном разведении (в двух повторах) и 2 контрольных сывороток (в двух повторах) или 22 исследуемых проб сывороток крови (в четырех разведениях) и 2 контрольных сывороток (в четырех разведениях) или 10 проб сывороток крови в восьми разведениях и 2 контрольных сывороток (в восьми разведениях).

В состав предлагаемой тест-системы ИФА входят:

- планшеты для иммуноферментного анализа с адсорбированным антигеном бактерий Moraxella bovoculi - 2 шт.

-№1.-контрольная положительная сыворотка (К+), 1 см3 - 1 ампулы.

- №2.- контрольная отрицательная сыворотка (К-), 1 см3 - 1 ампулы.

- №3 - 25-кратный концентрат фосфатно-буферного раствора с Твином-20 для промывки планшетов (ФБР-Т), 20 см3 - 2 флакона.

- №4 - буфер для разведения конъюгата (БРК), 10 см3 - 1 флакон.

- №5 - антитела к иммуноглобулину G (IgG) крупного рогатого скота, меченые пероксидазой хрена (конъюгат), 0,2 см3 - 1 ампула.

- №6 - фостфатно-цитратный буфер (ФЦБ), 10 см3 - 2 флакона.

- №7 - хромоген, ортофенилендиамин (ОФД), 4 мг - 2 флакона.

- №8 - перекись водорода (Н2O2) 3% р-р, 10 см3 - 1 флакон.

- №9 - 0,1М серная кислота (стоп-реагент), 10 см3 - 2 флакона.

По внешнему виду контрольные положительная и отрицательная сыворотки - гомогенная аморфная масса светло-желтого цвета, антивидовой пероксидазный конъюгат против IgG быка - гомогенная аморфная масса серого цвета, а растворы: ФБР-Т, БРК, ФЦБ, стоп-реагент - прозрачные, бесцветные жидкости, ортофенилендиамин (ОФД) - светло-желтый кристаллический порошок.

Пример 1. Приготовление компонентов набора.

Приготовление антигена. В заявляемой тест-системе ИФА, предназначенной для выявления и количественного определения антител к бактериям Moraxella bovoculi, специфический антиген готовят используя штамм «СХ-Ч6 № - ДЕП» возбудителя инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота.

Для получения биомассы бактерий Moraxella bovoculi используют МПА, содержащий 10% дефибринированной крови барана. С этой целью указанную среду в стерильных условиях разливают в 1,5 литровые матрасы по 250-300 см3, после застывания среды делают посевы штамма «СХ-Ч6 № - ДЕП» путем внесения в каждый матрас по 10 см3 бактериальной суспензии, содержащей 1 млрд. м. к. в 1 см3. Посевы культивируют при 37°С в течение 24-36 часов.

Выросшие колонии бактерий Moraxella bovoculi смывают 0,01М фосфатно-буферным физиологическим раствором (рН 7,2) и трижды отмывают в режиме центрифугирования при 2000 об/мин в течение 20 минут. Осадок ресуспендируют фосфатно-буферным физиологическим раствором и проводят дезинтеграцию бактериальной массы на дезинтеграторе «Bandelin GM3100» при частоте 20 кНг ± 500Гц в течение 10 минут. После дезинтеграции суспензию бактерий Moraxella bovoculi осветляют центрифугированием при 2000 об/мин в течение 45 минут. В надосадочную жидкость, содержащую антиген к бактериям М. bovoculi, добавляют трихлоруксусную кислоту (ТХУ), доводя до 5% концентрации. Осадок дважды промывают в режиме центрифугирования 5% раствором ТХУ, затем осадок ресуспендирут в дистиллированной воде и проводят диализ против водопроводной воды в течение 18-20 часов. Полученный антиген ресуспендируют в карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,6), содержащем мертиолят в конечной концентрации 0,01-0,02%.

Для стандартизации в антигене определяют количество белка на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 280 нм и 235 нм с поправкой на разведение в кювете по следующей формуле:

, где:

- ОП235; ОП280 - оптическая плотность при длине волны 235 и 280 нм, соответственно;

- 30 - разведение исследуемого образца в кювете (1:30).

По результатам шахматного титрования антигена и контрольных сывороток устанавливают в ИФА оптимальную рабочую концентрацию бактериального антигена, которая в данном случае составила 9-12 мкг/см3.

Пример 2. Приготовление контрольных сывороток.

2.1. Изготовление контрольной положительной сыворотки к антигену бактерий Moraxella bovoculi осуществляют путем гипериммунизации клинически здорового молодняка крупного рогатого скота 6-7-месячного возраста. Для этой цели применяют корпускулярный антиген производственного штамма бактерий Moraxella bovoculi «СХ-Ч6-ДЕП». Корпускулярный антиген представляет собой инактивированные формалином бактерии Moraxella bovoculi, содержащий 10 млрд. м.к. в 1 см3.

Гипериммунизацию животных проводят 4-х кратно с интервалом 14 дней. При этом животным вводят корпускулярный антиген подкожно в нарастающих дозах. Для предупреждения анафилактического шока, начиная со второго цикла иммунизации, животным вводят по 2 см3 антигена подкожно за 30-40 минут до введения основной дозы антигена. Схема гиперимунизации быков-продуцентов представлена в таблице 1.

Через 20 дней после последнего введения антигена у животных из яремной вены берут пробу крови для определения титра специфических антител. Производственное взятие крови разрешается при наличии антител в сыворотке крови быков-продуцентов к Moraxella bovoculi в титрах 1:6400 - 1:12800 в ИФА и при условии, если общая температура тела животных не превышает 39,5°С, а также после предварительной выдержки животных на голодной диете в течение 12 ч при неограниченном водопое.

2.2. Приготовление отрицательной контрольной сыворотки.

Контрольную отрицательную сыворотку получают от молодняка крупного рогатого скота 6-7-месячного возраста из хозяйства, свободного от инфекционного кератоконъюнктивита, после выдерживания их в карантине в течение 2 месяцев. У клинически здоровых неиммунизированных животных, не содержащих специфических антител к бактериям Moraxella bovoculi, проводят стерильное взятие крови из яремной вены из расчета 600 см3 крови на 100 кг массы животного. Кровь выдерживают 2 ч при температуре 20-22°С, затем обводят и отстаивают при температуре 4°С. Отстоявшуюся сыворотку отсасывают во флаконы в стерильных условиях, расфасовывают в ампулы по 1 см3 и лиофилизируют.

Пример 3. Стандартизация основных условий проведения исследований, заявляемой тест-системой ИФА.

3.1. Проводят подбор концентрации антигена для адсорбции на полистироловый 96-луночный планшет. При этом оценивается интенсивность иммуноферментной реакции при следующих концентрациях антигена в растворе: 3, 6, 9, 12 мкг/см3. С целью изучения влияния температуры и времени экспозиции на сорбцию антигена в лунках планшета испытывали режимы иммобилизации в течение 18 и 24 ч при температуре 4°С и 2 и 3 ч - при 37°С. В качестве тестируемых образцов используют положительную и отрицательную контрольные сыворотки крови.

Процесс адсорбции антигена оценивали по интенсивности реакции с контрольными сыворотками в серийных разведениях.

Проводили подбор концентрации адсорбции антигена при параллельном тестировании различных разведений конъюгата (1:1000, 1:2500, 1:3000).

Результаты исследований показали, что максимальное значение коэффициента специфичности отмечается при адсорбции антигена в дозе 9-12 мкг/см3 при температуре 4°С в течение 18 ч и разведении конъюгата 1:2500. Использование других концентраций антигена приводит к снижению специфичности реакции. Таким образом, были определены оптимальные параметры антигена и разведения конъюгата, которые будут использованы для дальнейшей работы.

3.2. Определение оптимального времени экспозиции исследуемых сывороток.

Процесс образования стабильных иммунных комплексов в тест-системе ИФА является сложным процессом и требует определенного времени, для установления которого в 3-х повторностях оценивалась интенсивность реакции в зависимости от времени инкубации положительных и отрицательных сывороток в серийных разведениях при температуре 37°С.

При этом конъюгат использовался в рабочем разведении 1:2500. Установлено, что показатели оптической плотности исследуемых сывороток в диапазоне от 30 до 60 мин возрастали и стабилизировались, при этом коэффициент специфичности оставался максимальным.

На этом основании 60-минутная экспозиция сывороток оказалась оптимальной для достижения максимальной и стабильной реакции.

3.3. Определение позитивно-негативного порога тест-системы ИФА

Для учета и интерпретации результатов, полученных тест-системой ИФА, определен позитивно-негативный порог тест-системы, который находится в диапазоне <35% - >45%. В дальнейшем все пробы, значение Ксв которых было меньше позитивно-негативного порога, считали отрицательными, а пробы со значением Ксв равным или превышающим этот показатель положительными.

Пример 4. Иллюстрация применения тест-системы ИФА.

4.1. Подготовка биологического материала для исследования.

Для анализа используют сыворотку крови крупного рогатого скота. Если анализ проводят в течение 24 ч после отбора, образцы биоматериала хранят при температуре 4°С. При более длительном хранении образцы замораживают при температуре -20°С. Перед исследованием замороженные образцы быстро (в течение 5-10 мин) нагревают в водяной бане при температуре 37°С. В случае выпадения осадка эритроцитов или белка пробы обязательно осветляют центрифугированием в течение 10 мин при 2000 g. Многократное замораживание и оттаивание образцов не допускается.

4.2. Подготовка рабочих растворов и реагентов.

Перед началом работы все компоненты выдерживают не менее 30 мин при комнатной температуре и тщательно перемешивают.

Фосфатно-буферный раствор с Твином-20 (ФБР-Т), предназначенный для растворения контрольных, исследуемых сывороток крови и промывки планшет, готовят следующим образом: содержимое флакона №3 с 25-кратным концентратом фосфатно-буферного раствора с Твином-20 (детергент) доводят свежеприготовленной дистиллированной водой до 500 см. Рабочий раствор буфера представляет собой прозрачный раствор с рН 7,2-7,4. Рабочий раствор стабилен при температуре 4°С в течение 3 суток.

Буфер для разведения конъюгата представляет собой прозрачный фосфатно-буферный раствор (БРК) без Твина-20 с рН 7,2-7,4 - флакон №4. Перед использованием конъюгат 0,2 см3 (ампула №5) растворить в 10 см3 фосфатно-буферного раствора (БРК) флакон №4. Для приготовления рабочего 25-кратного разведения (1:2500) необходимо к 0,01 см3 конъюгата добавить 25 см3 фосфатно-буферного раствора с Твином-20 (ФБР-Т).

Хромоген-субстратный раствор (субстратно-индикаторная смесь) готовят непосредственно перед использованием в реакции ИФА. Для этого 4 мг ОФД содержимого флакона №7 растворяют в 10 см3 фосфатно-цитратного буфера (флакон №6) и добавляют 0,14 см3 3%-ного раствора перекиси водорода (флакон №8) и перемешивают. Раствор должен быть прозрачным и иметь светло-желтый цвет. Приготовление хромоген-субстратного раствора известно из пат. RU №2488117.

Контрольную положительную сыворотку - 1 см3 (ампула №1) растворяют в 1 см3 фосфатно-буферного раствора с Твином-20 (ФБР-Т).

Контрольную отрицательную сыворотку - 1 см3 (ампула №2) растворяют в 1 см3 фосфатно-буферного раствора с Твином-20 (ФБР-Т).

Стоп-реагент (0,1М серная кислота) флакон №9 - готов к использованию.

Все исходные компоненты тест-системы стабильны до истечения срока годности. Не переливать в другую посуду! Не смешивать компоненты из наборов разных серий!

4.3. Проведение иммуноферментного анализа.

Иммуноферментный анализ (ИФА) проводят в непрямом твердофазном варианте с использованием компонентов, входящих в состав набора препаратов для выявления специфических антител к бактериям Moraxella bovoculi методом иммуноферментного анализа (ИФА).

Перед началом работы планшет трехкратно промывают рабочим раствором ФБР-Т в объеме 0,15 см, в каждом случае полностью удаляя жидкость постукиванием перевернутого планшета по фильтровальной бумаге.

При исследовании в одном разведении исследуемые и контрольные сыворотки используют в разведении 1:200 фосфатно-буферным раствором с твином (ФБР-Т). Например, к 0,99 cм3 ФБР-Т добавляют 0,005 см3 исследуемой сыворотки.

В лунки E12-F12 вносят по 0,1 см3 К+ в рабочем разведении 1:200.

В лунки G12-H12 вносят по 0,1 см3 К- в рабочем разведении 1:200.

В остальные лунки планшета вносят по 0,1 см3 исследуемой пробы (ИП) сыворотки в разведении 1:200 (по две лунки на каждый образец сыворотки) по следующей схеме:

При исследовании в 4-х разведениях исследуемые и контрольные сыворотки используют в разведении 1:100. Например, к 0,99 см3 ФБР-Т добавляют 0,01 см3 исследуемой сыворотки.

Предварительно во все лунки планшета вносят по 0,1 см3 ФБР-Т.

В лунку E11 вносят по 0,1 см3 К+ в рабочем разведении 1:100

В лунку Е12 вносят по 0,1 см3 К- в рабочем разведении 1:100.

В остальные лунки вертикального ряда планшета (А1-А12) вносят по 0,1 см3 исследуемой сыворотки в разведении 1:100 и проводят последовательные двукратные разведения в четырех лунках по следующей схеме:

При исследовании в 8-ми разведениях исследуемые и контрольные сыворотки используют в разведении 1:50. Например, к 0,49 см3 ФБР-Т добавляют 0,01 см3 исследуемой сыворотки.

Предварительно во все лунки планшета вносят по 0,1 см3 ФБР-Т.

В лунку A11 вносят по 0,1 см3 К+ в рабочем разведении 1:50

В лунку А12 вносят по 0,1 см3 К- в рабочем разведении 1:50.

В остальные лунки вертикального ряда планшета (А1-А10) вносят по 0,1 см исследуемой сыворотки в разведении 1:50 и проводят последовательные двукратные разведения в восьми лунках от 1:100 до 1:12800.

Планшет закрывают крышкой и инкубируют при 37±0,5°С в течение 1 часа.

Планшет 3 раза промывают буфером ФБР-Т (по 0,15 см3), раствор удаляют встряхиванием, с последующим постукиванием по фильтровальной бумаге до полного удаления остатков раствора со стенок и дна лунок планшета.

Внесение иммунопероксидазного конъюгата. В каждую лунку добавляют по 0,1 см3 раствора конъюгата в рабочем разведении. Планшет закрывают крышкой и инкубируют при 37±0,5°С в течение 1 часа.

Планшет 3 раза промывают буфером ФБР-Т.

Внесение субстратно-индикаторной смеси. В каждую лунку вносят по 0,1 см3 рабочего хромоген-субстратного раствора. Планшет закрывают крышкой и инкубируют в темноте 5-15 мин при комнатной температуре.

Остановка реакции. Не сливая содержимого, во все лунки планшета добавляют 0,1 см3 стоп-реагента (0,1 М раствор серной кислоты).

4.4. Учет и интерпретация результатов реакции.

Результаты ИФА учитывают после остановки реакции по показаниям оптической плотности субстратно-индикаторной смеси на спектрофотометре при длине волны 490 нм (ОП490).

При спектрофотометрическом учете результатов исследований сывороток крови в одном разведении производят следующие расчеты:

- Вычисляют среднее арифметическое значение оптической плотности (ОП490) для проб К+ (ОП490К+ ср);

- Вычисляют среднее арифметическое значение оптической плотности (ОП490) для проб К- (ОП490К- ср);

- Вычисляют среднее арифметическое значение оптической плотности (ОП490) для каждой испытуемой пробы ИП (ОП490 ИПср);

- Вычисляют коэффициент связывания (Ксв) конъюгата сывороточными антителами по формуле:

где:

Пробу считают отрицательной, если величина Ксв менее 35%.

Если величина Ксв более 45% пробу считают положительной.

Обнаружение положительных проб сывороток крови в одном разведении (1:200) при эпизоотологическом обследовании животных, ранее не вакцинированных против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота, свидетельствует о циркуляции в стаде возбудителя болезни.

При учете результатов исследований сывороток крови в четырех или восьми разведениях производят расчет коэффициента специфичности, который равен отношению оптической плотности продукта реакции в лунках с контрольной положительной (ОП490К+) или исследуемой сывороткой (ОП490 ИП) к оптической плотности контрольной отрицательной сыворотки (ОП490 К-). Реакцию считают положительной, если коэффициент специфичности выше 2,1 и отрицательной, если ниже 2,1.

Выявление динамики роста специфических антител в парных пробах сывороток крови, при исследовании образцов в четырех разведениях с целью серологической диагностики, позволяет диагностировать инфекцию у исследованного поголовья.

По результатам исследования сывороток в восьми разведениях определяют напряженность иммунитета крупного рогатого скота через 2-3 недели после второй вакцинации путем деления количества проб с титром антител 1:800 и выше к общему количеству исследованных сывороток и выражают в процентах. Крупный рогатый скот считают иммунными к инфекционному кератоконъюнктивиту при напряженности иммунитета у 85 и более процентов животных.

Пример 5. Испытание тест-системы ИФА в производственных условиях.

При производственном испытании эффективности набора были использованы образцы крови крупного рогатого скота, доставленные из различных в эпизоотическом отношении по инфекционному кератоконъюнктивиту скотоводческих хозяйств Республики Татарстан. При этом исследовались сыворотки крови от больных, не вакцинированных и здоровых, вакцинированных животных из неблагополучных по инфекционному кератоконъюнктивиту хозяйств, а также от интактных животных из благополучных хозяйств. Результаты исследования сывороток крови представлены в таблице 2. Из таблицы видно, что компоненты набора обладают высокой специфичностью в ИФА. Они позволяют определить специфические антитела к бактериям Moraxella bovoculi у 97,3% здоровых вакцинированных животных и 95,8% больных инфекционным кератоконъюнктивитом животных.

В то же время установлено, что компоненты набора не реагируют с сыворотками крови, полученными от интактных животных из благополучных по инфекционному кератоконъюнктивиту хозяйств.

Таким образом, предлагаемая тест-система позволяет с высокой специфичностью и чувствительностью по титрам специфических антител в сыворотке крови выявлять больных животных среди невакцинированного поголовья и определить напряженность иммунитета у вакцинированных животных.

Источники информации

1. Гаффаров, Х.З. Клинико-эпизоотологические особенности инфекционных диарей новорожденных телят и основные принципы их профилактики и лечения / Х.З. Гаффаров, Г. Н. Спиридонов, Ф.В. Елисеева, М.А. Ефимова и др. // Труды первого съезда вет. врачей РТ. - Казань. - 1995. - С. 163-167.

2. Гаффаров, Х.З. Инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота / Х.З. Гаффаров, А.В. Иванов, Л.В. Валебная, Г.Н. Спиридонов, Л.Ш. Дуплева, М.А. Ефимова // Ветеринария. - М. - 2007. - №12. - С. 21-24.

3. Карайченцев, Д.В. Совершенствование лабораторной диагностики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота: автореф. дис. … к. вет. наук. / Д.В. Карайченцев. - М., 2016. - 23 с.

4. Патент Российской Федерации. Штамм бактерий Moraxella bovoculi «СХ-Ч6 № - ДЕП», используемый для изготовления диагностикумов и вакцин против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота / А.В. Иванов, Г.Н. Спиридонов, А.А. Иванов, Л.В. Валебная, Ю.В. Юсупова, А.Г. Спиридонов, А.Р. Нургалиева, Х.Н. Макаев; заявитель ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности». - №2521651; опубл. 10.07.2014, Бюл. №19.

5. Патент Российской Федерации. Вакцина против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и Moraxella bovoculi / Г. Н. Спиридонов, А.В. Иванов, А.Н. Чернов, А.Г. Спиридонов, А.А. Иванов, Л.В. Валебная, Х.Н. Макаев, Р.Х. Юсупов, Л.Ш. Дуплева; заявитель и патентообладатель ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности». - №2589819; опубл. 10.07.2016, Бюл. №19.

6. Спиридонов, Г.Н. Инфекционный кератоконьюнктивит крупного рогатого скота / Г.Н. Спиридонов // Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных. - Труды межд. научн.-произвол, конф., посвященной 50-летию ВНИИВВиМ. - том 2. - Покров. - 2008. - С. 195-197.

7. Angelos, J.A. Moraxella bovoculi sp. nov., isolated from calves with infectious bovine keratoconjunctivitis / J.A. Angelos, P.Q. Spinks, L.M. Ball, L.W. George // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. - 2007. - V. 57. - P. 789-795.

8. Angelos, J.A. Differentiation of Moraxella bovoculi sp. nov. from other coccoid moraxellae by the use of polymerase chain reaction and restriction endonuclease analysis of amplified DNA / J.A. Angelos, L.M. Ball // J. Vet. Diagn. Invest. - 2007. - V. 19 - P. 532-534.

9. K.N. Ulcerative blepharitis and conjunctivitis in adult dairy cows and association with Moraxella bovoculi / N. K. J. A. Angelos // Can Vet J. - 2010. - V. 51(4). -P. 400-402.

10. Lapper, A.W.D. Vaccination against infectious bovine keratoconjunctivitis: protective efficacy and antibody response induced by by pili of homologous und heterologous Strains of Moraxella bovis / A.W.D. Lapper. // Austr. Vet. J. - 1988. - 65-10 - P. 129-138.

Иммуноферментная тест-система для определения специфических антител к бактериям Moraxella bovoculi в сыворотке крови крупного рогатого скота, отличающаяся тем, что она содержит специфический антиген запатентованного штамма «СХ-Ч6 № - ДЕП» Moraxella bovoculi, полученный путем 3-кратного отмыва их 0,01М фосфатно-буферным физиологическим раствором и последующим разрушением бактериальных клеток ультразвуком на дезинтеграторе «Bandelin GM3100» при частоте 20 kНz ± 500 Гц в течение 10 мин при 4°С, дальнейшим осаждением антигена Moraxella bovoculi трихлоруксусной кислотой при 5%-ном насыщении и диализом против водопроводной воды, представляющего собой специфический белок в концентрации 9-12 мкг/см3, адсорбированный на поверхности полистироловых лунок в карбонатно-бикарбонатном буфере, контрольную положительную сыворотку, полученную к антигену Moraxella bovoculi с титрами антител 1:6400-1:12800 в ИФА, контрольную отрицательную сыворотку, пероксидазный конъюгат против IgG быка, буферные растворы: фосфатно-буферный раствор рН 7,2-7,4 с Твином-20 (детергентом) для разведения контрольных, исследуемых сывороток и промывки панелей; фосфатно-буферный раствор рН 7,2-7,4 для разведения конъюгата; хромоген-субстратный раствор, включающий ортофенилендиамин и перекись водорода, стоп-реагент и панели для постановки реакции иммуноферментного анализа.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть рекомендовано для селективного суммарного определения тетрациклинов в пищевых продуктах и комбинированных препаратах с помощью пьезоэлектрического иммуносенсора.

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть рекомендовано для селективного суммарного определения тетрациклинов в пищевых продуктах и комбинированных препаратах с помощью пьезоэлектрического иммуносенсора.

Изобретение относится к наборам для иммунохимического анализа антител и антигенов в препаратах крови и может быть использовано в медицинской диагностике. Раскрыт набор для мультиплексного иммунохимического анализа антител и антигенов в препаратах крови, включающий устройство в виде гребенчатой подложки с набором дискретно нанесенных на поверхности зубцов подложки реагентов захвата маркеров инфекционных заболеваний и дополнительно блокированной неспецифическими природными или синтетическими полимерами; емкость для проведения анализа, содержащую несколько рядов изолированных ячеек, выполненных с возможностью введения каждого зубца подложки в отдельную ячейку ванны; растворы для разведения образца и отмывок; конъюгат для детекции; встроенные положительный контроль и отрицательный контроль.

Изобретение относится к наборам для иммунохимического анализа антител и антигенов в препаратах крови и может быть использовано в медицинской диагностике. Раскрыт набор для мультиплексного иммунохимического анализа антител и антигенов в препаратах крови, включающий устройство в виде гребенчатой подложки с набором дискретно нанесенных на поверхности зубцов подложки реагентов захвата маркеров инфекционных заболеваний и дополнительно блокированной неспецифическими природными или синтетическими полимерами; емкость для проведения анализа, содержащую несколько рядов изолированных ячеек, выполненных с возможностью введения каждого зубца подложки в отдельную ячейку ванны; растворы для разведения образца и отмывок; конъюгат для детекции; встроенные положительный контроль и отрицательный контроль.

Группа изобретений относится к устройству для диагностики in vitro и применению этого устройства для идентификации и определения групп крови. Раскрыто устройство (10) для диагностики in vitro для детекции по меньшей мере одной реакции между антигеном эритроцитарного фенотипа и антителом, содержащее подложку (12) и гидрофобную пористую мембрану (14) толщиной от 0,05 до 1,5 мм с диаметром пор от 2 до 30 мкм, причем указанная мембрана содержит по меньшей мере одну гидрофильную область реакции (16), предназначенную для получения указанного образца, и поверхность гидрофильной области реакции (16) меньше поверхности гидрофобной пористой мембраны (14).

Изобретение относится к области ветеринарии. Предложен способ определения специфических антител к вирусу гепатита утят типа I путем проведения ИФА, включающий получение антигена.

Изобретение относится к области ветеринарии. Предложен способ определения специфических антител к вирусу гепатита утят типа I путем проведения ИФА, включающий получение антигена.

Группа изобретений относится к биотехнологии, медицине и биохимии, в частности к аналитической биохимии и иммунохимическому анализу. Раскрыт биологический микрочип для обнаружения экзосом в сыворотке крови человека, представляющий собой массив трехмерных гидрогелевых элементов полусферической формы диаметром 100 мкм на поверхности стеклянного слайда, причем гидрогелевые элементы получены путем полимеризации смеси, содержащей гелеобразующие мономеры на основе метакриламида и моноклональные антитела CD81, CD147, А33, при этом биологический микрочип включает гидрогелевые элементы, в каждом из которых иммобилизовано индивидуальное антитело, а также пустые гидрогелевые элементы, не содержащие иммобилизованных молекулярных зондов, для контроля неспецифических взаимодействий.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению конъюгатов люминесцентных наночастиц диоксида кремния с антителами, и может быть использовано в диагностике для выявления гиперэкспрессирующегося на поверхности опухолевых клеток рецептора эпидермального фактора роста человека 2 (HER2/neu).

Изобретение относится к области медицины, молекулярной биологии и микробиологии. Предложен способ определения генетических детерминант резистентности возбудителя туберкулеза к бедаквилину и линезолиду, включающий мультиплексную амплификацию генов Rv0678, atpE, 23S рРНК, rplC, обеспечение олигонуклеотидного микрочипа для установления наличия/отсутствия точечных мутаций, инсерций, делеций в указанных генах, гибридизацию амплифицированных флуоресцентно-меченных продуктов на олигонуклеотидном микрочипе и регистрацию результатов гибридизации.
Изобретение относится к ветеринарии, а именно к способу изготовления эритроцитарного диагностикума для диагностики пуллороза-тифа птиц. Способ включает получение бактериальной массы Salmonella gallinarum pullorum, выделение из нее антигенной фракции, Обработку бактериальной массы поверхностно-активным веществом с добавлением соды или щелочи в дистиллированной воде при 93-96°C с дальнейшей сенсебилизацией формалинизированных эритроцитов, их очисткой и получением целевого продукта в виде 10%-ной суспензии.

Изобретение относится к медицине, а именно к способу дифференциальной диагностики грибовидного микоза. Для этого проводят анализ взятого у пациента биологического материала из очага поражения и проведение иммуногистохимического исследования биоптатов.

Изобретение относится к области ветеринарной и медицинской гельминтологии. Способ получения чистой жизнеспособной культуры протосколексов Echinococcus multilocularis предусматривает получение чистой жизнеспособной культуры протосколексов Е.
Изобретение относится к медицине, а именно к ветеринарии, и может быть использовано для получения антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных.

Заявленное изобретение относится к области ветеринарии. Способ включает серологическое исследование крови серонегативных животных на лейкоз с применение РИД в течение 5 дней после учета и оценки реакции на ППД-туберкулин для млекопитающих.
Изобретение относится к медицине, а именно к биотехнологии, и может быть использовано при получении эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и санитарной эпидемиологии. Предложен способ получения имитаторов патогенных биологических агентов путем обработки суспензии клеток возбудителя опасного инфекционного заболевания СВЧ-облучением с частотой 2450 МГц, мощностью 6 Вт/см3 двукратно по 5 минут.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для получения диагностикума для определения концентрации лечебного рекомбинантного α-интерферона в сыворотке крови больных вирусными инфекциями.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано в технологии изготовления референс-панели сывороток, содержащих антигены и антитела к тестируемому вирусу, для контроля чувствительности, специфичности тест-систем иммуноферментных, иммунохемилюминесцентных и иммуноблотов.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована для получения эритроцитарного сибиреязвенного антигена для набора определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы.

Изобретение относится к области аналитической химии. Способ подготовки пробы мочи для определения монофталатов методом ВЭЖХ/масс-спектрометрии включает центрифугирование пробы мочи 10 мин со скоростью 2000 об/мин., затем в пробу вносят концентрированную уксусную кислоту до достижения pH смеси 4,8., далее к 5 см3 подкисленного образца добавляют 0,2 см3 водного раствора фермента β-глюкуронидазы (Helix Pomatia).

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и касается иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета. Раскрыта иммуноферментная тест-система для определения специфических антител к бактериям Moraxella bovoculi в сыворотке крови крупного рогатого скота, которая содержит специфический антиген запатентованного штамма «СХ-Ч6 № - ДЕП» Moraxella bovoculi, полученный путем 3-кратного отмыва их 0,01 М фосфатно-буферным физиологическим раствором и последующим разрушением бактериальных клеток ультразвуком на дезинтеграторе «Bandelin GM3100» при частоте 20 kНz ± 500 Гц в течение 10 мин при 4°С, дальнейшим осаждением антигена Moraxella bovoculi трихлоруксусной кислотой при 5-ном насыщении и диализом против водопроводной воды, представляющего собой специфический белок в концентрации 9-12 мкгсм3, адсорбированный на поверхности полистироловых лунок в карбонатно-бикарбонатном буфере. Тест-система также включает контрольную положительную сыворотку, полученную к антигену Moraxella bovoculi с титрами антител 1:6400-1:12800 в ИФА, контрольную отрицательную сыворотку, пероксидазный конъюгат против IgG быка, буферные растворы: фосфатно-буферный раствор рН 7,2-7,4 с Твином-20 для разведения контрольных, исследуемых сывороток и промывки панелей; фосфатно-буферный раствор рН 7,2-7,4 для разведения конъюгата; хромоген-субстратный раствор, включающий ортофенилендиамин и перекись водорода, стоп-реагент и панели для постановки реакции иммуноферментного анализа. Тест-система позволяет проводить диагностику инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота и определить напряженность поствакцинального иммунитета с высокой чувствительностью и специфичностью. 2 табл., 5 пр.

Наверх